CN107847428A - 用于促进毛发生长的方法和组合物 - Google Patents

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安吉拉·克瑞斯汀雅娜
拉斐尔·克来因斯
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Abstract

目前公开的主题在某些实施方案中涉及用于抑制JAK‑STAT通路以诱导毛发生长的组合物和方法。在某些实施方案中，本公开主题涉及用JAK‑STAT通路的小分子抑制剂局部治疗以诱导毛发生长。

Description

用于促进毛发生长的方法和组合物
与相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月7日提交的美国临时专利申请No.62/157,959的优先权，该临时申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
资助信息
本发明在国立卫生研究院授予的资助号为R01AR056016和R21AR061881的政府资助下完成。政府对本发明享有一定权利。
1.简介
本公开主题在一些实施方案中涉及对JAK-STAT通路的抑制以诱导毛发生长的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开主题涉及用JAK-STAT通路的小分子抑制剂局部治疗以诱导毛发生长。
2.发明背景
有几种毛发生长障碍的特征在于不能重新进入毛发周期的成长期(毛发生长期)。这可能是由于在雄激素性脱发情况下的毛囊(hair follicle，HF)小型化或在斑秃情况下的免疫功能障碍造成的。目前针对雄激素性脱发的药物治疗，主要集中在预防进一步脱发上，却难以找到重新开始毛发周期的药物制剂，因此尚未达到令人满意的程度。
3.发明内容
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述施用发生在当所述毛囊处于中期休止期或晚期休止期时。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述受试者具有雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ的基因表达的反义RNA(antisense RNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)，微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂是OSM-Rβ抗体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述毛发位于所述受试者的头皮或脸上，或者构成受试者的眉毛或睫毛。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述毛发是鼻毛。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂为局部施用。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述抑制剂为口服施用。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，在施用所述抑制剂后，一种或多种毛发生长生物标志物的表达水平被改变。
在一些实施方案中，本公开涉及一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
在一些实施方案中，本公开涉及一种促进哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂。
在一些实施方案中，本公开涉及一种促进哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述施用发生在当所述毛囊处于早期休止期以外的时期。
在一些实施方案中，本公开涉及一种促进哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中，所述毛囊处于生长期。
在一些实施方案中，本公开涉及一种促进真皮乳头诱导的方法，所述方法包括向源自受试者毛囊的真皮乳头三维球体施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中所述施用发生在将所述真皮乳头三维球体施用于所述受试者之前。
在一些实施方案中，本公开涉及一种促进真皮乳头诱导的方法，所述方法包括向源自受试者毛囊的真皮乳头三维球体施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中所述施用发生在将所述真皮乳头三维球体施用于所述受试者以治疗雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、化疗引起的脱发或普秃之前。
在一些实施方案中，本公开更提供一种评估用于诱导或促进哺乳动物受试者的毛发生长的治疗功效的方法，所述方法包括:(a)确定从受试者获得的毛囊样品中的一种或多种毛发生长生物标志物的水平；以及(b)在所述治疗的多个时间点中的一个时间点确定从所述受试者获得的毛囊样品中的所述一种或多种毛发生长生物标志物的水平，其中当所述第二或随后样品中的所述一种或多种生物标志物的水平相对于所述第一样品发生变化时，所述治疗对于诱导或促进所述受试者的毛发生长是有效的。
在一些实施方案中，其中所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
在一些实施方案中，本公开涉及一种用于诱导或促进哺乳动物受试者的毛发生长的试剂盒，所述试剂盒包括:(a)Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR、和/或OSM-Rβ抑制剂；以及(b)药学上可接受的载体。
4.附图说明
图1A-图1E:JAK-STAT信号传导的抑制重新开始野生型小鼠的毛发生长。图1A:对7周龄野生型小鼠进行剃毛，并且每天对其进行局部施用赋形剂对照、音猬因子激动剂(SAG)、3％鲁索替尼(JAK1/2抑制剂)、托法替尼(JAK3抑制剂)其中之一的治疗。在指定的时间点收获皮肤，并用H&E染色。在治疗的D21处拍摄小鼠的图像。图1B:将8.5周龄的小鼠用鲁索替尼，托法替尼或赋形剂对照治疗5天，监测小鼠皮肤色素沉着的出现，信号传导生长期的开始。没有毛发生长(并且没有色素沉着)被赋予0的任意值。皮肤变黑的数值为0-100％，较高的数字表示皮肤较暗/可见的毛发生长。每个条件使用5只小鼠。在治疗后8-18天进行非参数纵向数据分析(Nonparametric longitudinal data analysis)，以产生对于对照对鲁索泰替尼的p＝7.6×10-34，以及对于对照对托法替尼的P＝1.5×10-10。图1C:用微阵列对赋形剂对照、鲁索替尼和托法替尼治疗4天的小鼠全皮肤进行分析。表达数据用于鉴定在三个治疗组每组中的T0和T5之间差异表达的基因。每个条件使用3只小鼠，在2个时间点进行活检。图1D:使用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)来鉴定在差异表达基因列表中过度表达的分子通路和过程。差异表达基因列表的比较揭示了由鲁索替尼和托法替尼调节的基因的子集。红色＝在药物治疗的T5对T0中上调的基因，绿色＝在药物治疗的T5对T0中下调的基因。图1E:在8.5周龄的小鼠背侧皮肤的一侧用鲁索替尼或托法替尼治疗，另一侧用赋形剂对照。治疗4小时后，将Edu注射到每只小鼠中，1小时后收获皮肤。治疗进行一次、两次和三次，并分析皮肤的Edu+细胞的存在。
图2A-图2D:JAK-STAT通路在毛囊循环期间被动态调节。图2A:用JAK抑制剂每日治疗8周龄的Rag1-/-和Tcrβ/δ-/-小鼠。小鼠接受治疗一周，在停止每日治疗7天后拍摄图像。显示的是每个基因型3只小鼠的代表性图片。图2B:在出生后第17天(退行期)、第23天(休止期)、第29天(早期生长期)和第33天(中期生长期)从小鼠收获全皮肤。使用包含参与JAK-STAT通路的基因的JAK-STAT qPCR阵列以及标准化对照(Qiagen)来分析基因表达的变化。每个时间点使用3只小鼠，每只与单独的qPCR平板杂交。基因表达中的Log2倍变化用于产生基因表达动力学分析软件(gene expression dynamics inspector，GEDI)的自组织图(SOMs)，以便可视化毛发周期中基因表达的动态变化。GEDI根据它们随着时间推移的相似表达模式，将转录产物聚类成为宏基因(metagenes)，并将它们放置在5X6的网格上。在实验样品(分别为D23，D29，D33)对对照样品(D17)中的宏基因被抑制时呈绿色至蓝色，而实验样品中宏基因过度表达时为红色。上限和下限对应于2倍变化。大于/小于2倍的变化被设置为最大颜色。图2C:表格中详细列出在A(盒装像素(boxed pixels))中突显的抑制性宏基因的基因含量。盒装像素的颜色对应于表格中的线条颜色。图2D:收获处于生长期(第30天)、退行期(第42天)和休止期(D50)的野生型小鼠的皮肤，固定并用抗磷酸STAT3和抗磷酸STAT5以及用Krt15(凸起标记)和P-钙粘蛋白(毛芽标记)染色。磷酸STAT3于生长期期间在外毛囊细胞中以及在DP细胞(白色箭头)中表达。在退行期，磷酸-STAT3在DP(红色箭头)和毛芽(橙色箭头)中表达。在早期休止期，磷酸STAT3存在于最接近DP的毛芽细胞中(绿色箭头)。在整个毛发周期中，磷酸STAT5在DP中强烈表达，在退化期间中表达峰值(黄色箭头)。磷酸-STAT5也可以在退行性毛囊(洋红色箭头)的凸起中被检测到。图像是用40倍放大率的Zeiss共焦显微镜拍摄的。
图3A-图3E:JAK-STAT的抑制促进人组织中的毛发生长。图3A:将人头皮皮肤移植到SCID小鼠上，并用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼局部治疗4周。每3-5天拍摄一次移植物的照片。为了量化赋形剂与药物治疗侧之间的差异，使用ImageJ来测量移植物中色素沉着的强度。每个直方图上的垂直线相当于赋形剂和药物治疗之间的边界。图3B:从成人头皮组织切割个别的HF，并将其放置在有赋形剂对照、鲁索替尼和托法替尼存在的培养物中。为期2周，每2天拍摄一次毛囊的照片并随着时间推移测量每个毛囊的长度。用托法替尼和鲁索替尼的治疗显著提高了生长期的生长速率(分别为P＝0.017和P＝0.025)，因此HF的总长度增加。实验图片是通过来自具有3-4个毛囊/条件的单个供体的毛囊实现的。P值是使用非参数纵向数据分析获得的。图3C:在赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼的存在下，使DP球体在悬滴中生长，然后与小鼠的新生角质形成细胞组合，并在体内(in vivo)注射。图3D:图中示出3个独立实验，由3个个体供体产生的球体。每个DP供体/条件进行一次人DP球体和小鼠角质形成细胞浆液的注射，以产生含有诱导毛囊的囊肿。图3E:为分离囊肿后诱导毛囊的数量的图，并在显微镜中人工计数毛发纤维。对照与托法替尼治疗之间的差异具有统计学意义(统计显著性)(P＝0.00013)。使用线性混合效应分析治疗供体作为随机效应来计算P值。
图4A-图4D:托法替尼增强诱导分子签名。图4A:使用微阵列对用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼治疗的DP球体进行分子分析。每个条件使用来自3个个体供体的细胞。基因表达的Log2倍变化用于产生GEDI图，用以可视化在药物治疗(Z轴和色标)中基因表达的动态变化。聚类转录产物，分组成为宏基因(metagenes)，放置在18X19的网格(X，Y)上。显示鲁索替尼对对照、托法替尼对对照、以及鲁索替尼对托法替尼的三个比较。图中突显了4个感兴趣区域，用以反映使用托法替尼治疗(区域1和2)的基因抑制和使用托法替尼治疗(区域3和4)的基因上调。图4B:表1-4中列出来自区域1-4的所选基因。图4C:基因集富集分析(Geneset enrichment analysis)显示，先前所示的基因组有助于DP诱导(由Higgins et al.(35)所鉴定的T2和T4内的基因通过托法替尼治疗而显著富集(p＝1.3X10-5))。灰色虚线显示了在这个分析中的正态分布(未富集)。x轴描述在阵列中通过调用的所有基因的等级，从最过高表达到最过低表达排名，比较使用托法替尼治疗的细胞到未治疗的细胞。y轴绘示组合基因集T2和T4在给定等级的富集得分(enrichment score，ES)。此标准化富集得分(normalized enrichment score，NES)反映了随机数据中获得所观察到的ES分布的Z得分概率，并报告了相关的p值。在T2和T4中，基因的个别基因等级在图下方的条形码中以黑色散列表示。图4D:图3和图4所得结果总结:尽管完整DP具有完全诱导性，但是当在体外(invitro)培养真皮乳头时，诱导毛囊生长的潜能会丧失。本发明人先前显示，通过调节与完整DP相关的分子签名中的基因子集，在球体培养物中生长的DP细胞恢复了一些诱导潜能(区域1和3(T1和T3))(35)。用托法替尼治疗DP球体，通过靶向一些之前未被三维培养条件改变的通路来增加培养DP的诱导性(T2和T4)。蓝色＝对应于非诱导状态区域内的基因表达，红色＝对应于诱导状态区域内的基因表达。尽管托法替尼在T2和T4内复原了基因，但与完全的完整DP(亮红色区域)相比，复原并不完全。
图5A-图5E:JAK抑制介导的毛发生长重演了内源性毛发生长，并取决于休止期的持续时间。图5A:用赋形剂对照、2％托法替尼或2％鲁索替尼治疗休止期(8.5周)的野生型小鼠4天。收获皮肤，进行切片并用Ki67(增殖标记)和P-钙粘蛋白(毛发标记)染色。图像显示3只小鼠/治疗。图5B:7周龄的野生型小鼠用赋形剂、托法替尼或鲁索替尼治疗，在指定的时间点收获皮肤。量化在这些时间点上毛囊的数量和厚度。作为对照，利用脱毛后的毛发生长，即高度刻板方式进行的过程(8)。图5C:将两组7周龄或8.5周龄的小鼠剃毛并且每天用鲁索替尼、托法替尼或赋形剂对照治疗。治疗小鼠为期一周，并在中断每日治疗后7天拍摄图像。收获皮肤并用H&E染色。为了确保所有小鼠仍处于不起反应的休止期，显示在两个年龄组中拔毛后的毛发生长都遵循相似的动力学。小鼠和H&E染色的图像是2组实验的代表，每组使用3只小鼠。图5D:7周龄小鼠(出生后第49天)用鲁索替尼、托法替尼或赋形剂对照治疗24天，在指定时间点取得活检组织。如图所示，通过用鲁索替尼治疗18天和用托法替尼治疗21天，治疗的毛囊重新开始生长毛发。图5E:8.5周龄的小鼠每日用对照(C左侧)或鲁索替尼(R右侧)治疗。每天拍摄照片，从治疗后5天开始，以皮肤变黑的程度评分皮肤。如图所示，为小鼠在治疗第8天、12天、16天后(4只小鼠/治疗组)的代表性照片。
图6A-图6C:分子通路富集在由每个JAK-STAT抑制剂差异调节的基因中。图6A:通过qPCR分析用鲁索替尼和托法替尼治疗0天(T0)或4天(T5)的全皮肤样品，用于微阵列分析鉴定所选择的基因。结果显示3组独立实验，通过成对t检验(paired t-test)确定p值>0.05。图6B:使用微阵列表达数据鉴定在DMSO、鲁索替尼和托法替尼治疗组中T0和T5之间差异表达的基因。使用IPA来鉴定在所有治疗、治疗子集或仅由每种条件下差异调节的基因。接下来，利用IPA探索在差异表达基因列表中过度表达的分子通路和过程。图中示出通过鲁索替尼治疗而富集的通路。图6C:通过托法替尼治疗而富集的通路。Red＝在药物治疗的样品中上调的基因，Green＝在药物治疗的样品中下调的基因。
图7A-图7C:JAK抑制的作用不依赖于T细胞，而是代表细胞内在特性。图7A:为了验证淋巴细胞缺陷小鼠的毛发循环是否有异常，本发明人在出生后第30天(生长期)，第42天(退化期)和第50天(早期休止期)从缺乏B细胞和T细胞的Rag1-/-小鼠、缺乏迁移T细胞和驻留T细胞的Tcrβ/δ-/-小鼠进行皮肤收获并分析，以及杂合子对照。显示了基因型3只小鼠的代表性H&E图像。图7B:将代表从退行期到后续生长期的转变的时间点上的基因表达变化对选定数目的基因作图。图7C:磷酸-STAT3和磷酸-STAT5的放大倍数较低的图像。用20倍放大率的Zeiss共焦显微镜拍摄的图像。
图8A-图8E:JAK-STAT的抑制促进人毛囊生长。图8A:将人头皮移植到SCID小鼠上，并用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼局部治疗4周，显示皮肤暗度随着时间推移的定量。图8B:用托法替尼治疗人胚胎头皮皮肤的第二个例子。在这种情况下，移植物不够大而不能进行多次治疗，因此，治疗是在来自同一个个体的两个单独的移植物上进行的。图8C:使用来自两个个体的毛囊重复器官培养实验。用托法替尼和鲁索替尼治疗增加生长期的生长速率，重复之前的观察趋势，但结果没有达到统计学意义(统计显著性)。图8D:将生长期的人HF用磷酸STAT3、磷酸STAT5或同种型对照染色。用20倍放大率的Zeiss共焦显微镜拍摄的图像。图8E:T2也通过托法替尼治疗而富集，然而统计学上的重叠仅有轻微显著性(P＝0.03)。
图9A-图9E:OSM和OSM-Rβ在休止期间的凸起中与激活的STAT3和STAT5共定位。图9A:磷酸化的STAT3和STAT5蛋白在早期和中期休止期(P46，P60)中存在于HFSC区室中，并在晚期休止期(P80)减少。在此期间，OSM免疫荧光共定位于HFSC。图9B:OSM受体(OSM-Rβ)也通过免疫组织化学共定位至HFSC凸起区室。所有的图像皆于20倍的放大倍率下拍摄。图9C:在体外培养的角质形成细胞中，在OSM治疗10分钟内，OSM激活STAT1、STAT3和STAT5转录因子，并且这被托法替尼(TOFA)有效地消除。图9D:用TOFA治疗的体内全皮肤也表现出对STAT3和STAT5激活的有效抑制。图9E:针对OSM-Rβ的中和抗体每日皮下注射到P60休止期皮肤中诱导局部生长期。PBS对照和针对IL-6及其受体的中和抗体没有显示出效果。图9F:gp130也在凸起中富集。
图10A-图10G:OSM对小鼠角质形成细胞具有生长抑制特性，并且作用于凸起中的HF干细胞区室。图10A:在休止期收获的小鼠角质形成细胞的集落形成测定(Colonyforming assay)显示OSM对角质形成细胞具有生长抑制作用，其通过添加托法替尼而被部分地逆转。图10B:单用托法替尼会增加角质形成细胞的集落数量。图10C:分离在7.5和8.5周时(P56和P60)的第二个休止期中收获的皮肤，并通过qRT-PCR分析表皮和真皮。图10D:OSM-Rβ优先由表皮表达，而OSM在真皮中产生。P53和P60之间的OSM产量也有所增加。图10E:在表皮中，OSM-Rβ在凸起区室富集。图10F:用于分离CD34+ITGA6+HFSC的小鼠表皮的细胞分选策略。图10G:在培养的小鼠角质形成细胞中，用20ng/ml的重组小鼠OSM治疗上调OSM-Rβ的表达。
图11A-11F:用JAK抑制来抑制小鼠皮肤中的OSM-Rβ表达，可能导致静止丧失。图11A：重新分析来自先前JAK抑制剂实验的微阵列数据，并且JAK抑制导致在休止期间治疗的所有小鼠皮肤OSM-Rβ的一致性下调。图11B：在体内用qRT-PCR证实OSM-Rβ的下调，其中在托法替尼或鲁索替尼治疗的5天期间内每天收集全皮肤的活检组织。图11C：体外培养的小鼠角质形成细胞中OSM-Rβ转录的下调。图11D：用鲁索替尼治疗的来自休止期小鼠皮肤分选的角质形成细胞在3天后也显示出OSM-Rβ的下调。图11E：用鲁索替尼(即JAK2抑制剂)进行的体内治疗导致早期的STAT3/5抑制之后激活Akt和ERK通路，并导致OSM-Rβ的下调。图11F：OSM在真皮区室中产生的示意图(可能是真皮乳头)，使OSM-Rβ参与在凸起中的HFSC，通过抑制生长和分化来维持休止期间的静止，同时维持OSM-Rβ的表达。
表1:本研究中使用的抗体和稀释比例列表
表2:本研究中使用的qPCR引物列表
表3:区域T2和T4内的基因列表(根据Higgins et al.，PNAS2013改编)
5.具体实施方式
为了清楚起见，将本发明的详细描述分成以下小节，但不以此为限:
5.1 定义
5.2 JAK-STAT通路基因
5.3 治疗方法
5.4 药物组合物和施用
5.5 监测治疗效果的方法
5.6 试剂盒
最近，本发明人证明了JAK-STAT通路的药理学抑制作用促进了小鼠和人(1)(Christiano，et al.的WO2013149194A1，其内容通过引用的方式并入本文)中的斑秃(AA)中的毛发快速再生。出乎意料地，在对具有AA的小鼠进行一系列研究的过程中，观察到用JAK-STAT抑制剂局部治疗会导致毛发生长异常健壮，表明对毛发周期开始的局部效应。本文所揭示的JAK-STAT信号传导的药理学抑制会启动正常小鼠的毛发周期并促进人的毛发生长。
鉴于上述内容，在某些实施方案中，本发明公开的主题涉及通过抑制JAK-STAT通路诱导来毛发生长的组合物和方法。在某些实施方案中，本公开主题涉及用JAK-STAT通路的小分子抑制剂进行局部治疗以诱导毛发生长。
5.1定义
根据本公开，“受试者”或“患者”是人或非人的动物。尽管动物受试者优选是人，但是本发明的化合物和组合物同样适用于兽医学，例如用于治疗驯化物种如犬科动物、猫科动物、鼠科动物和各种其它宠物；农畜类动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪等；以及野生动物，例如在野外或动物园的非人灵长类动物等。
本文所使用的“药物组合物”和“药物制剂”是指一种组合物，其形式使其中所含有的活性成分的生物活性为有效，并且其不含对将要施用所上述制剂的患者不可接受的毒性的附加组分。
本文所使用的“药学上可接受的”，例如“药学上可接受的载体”是指对受试者无毒的性质。药物制剂中的药学上可接受的成分可以是非毒性活性成分以外的成分。药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、赋形剂、稳定剂和/或防腐剂。
本文所使用的“Jak1抑制剂”是指与Jak1基因或Jak1蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由Jak1编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“Jak2抑制剂”是指与Jak2基因或Jak2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由Jak2编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“Jak3抑制剂”可以是与Jak3基因或Jak3蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由Jak3编码的蛋白质的活性或表达。在一个实施方案中，Jak3抑制剂可以是Jak3调节化合物。
本文所使用的“Tyk2抑制剂”可以是与Tyk2基因或Tyk2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由Tyk2编码的蛋白质的活性或表达。在一个实施方案中，Tyk2抑制剂可以是Tyk2调节化合物。
本文所使用的“STAT1抑制剂”是指与STAT1基因或STAT1蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT1编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT2抑制剂”是指与STAT2基因或STAT2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT2编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT3抑制剂”是指与STAT3基因或STAT3蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT3编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT4抑制剂”是指与STAT4基因或STAT4蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT4编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT5a抑制剂”是指与STAT5a基因或STAT5a蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT5a编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT5b抑制剂”是指与STAT5b基因或STAT5b蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT5b编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“STAT6抑制剂”是指与STAT6基因或STAT6蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由STAT6编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“OSM抑制剂”是指与OMS基因或OMS蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由OSM编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“gp130抑制剂”是指与gp130基因或gp130蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由gp130编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“LIFR抑制剂”是指与LIFR基因或LIFR蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由LIFR编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“OSM-Rβ抑制剂”是指与OSM-Rβ基因或OSM-Rβ蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由OSM-Rβ编码的蛋白质的活性或表达。
本文所使用的“Jak/STAT抑制剂”是指与Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6/OSM/gp130/LIFR/OSM-Rβ基因或Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6/OSM/gp130/LIFR/OSM-Rβ蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。所述化合物可以降低由Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6/OSM/gp130/LIFR/OSM-Rβ编码的蛋白质的活性或表达。
本发明的抑制剂可以是针对由本文公开的相应序列编码的多肽的蛋白质，例如抗体(单克隆，多克隆，人源化，嵌合或完全人)或其结合片段。抗体片段可以是不同于全长形式的抗体的形式，并且除了已被工程化的抗体片段之外，还包括存在于全长抗体内的部分或组分。抗体片段可以包括但不限于单链Fv(scFv)、双聚体(diabodies)、Fv和(Fab')2、三聚体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR's的组合、可变区、四聚体、双功能杂合抗体(bifunctional hybrid antibodies)、框架区、恒定区等(参见Maynard et al.，(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。抗体可商购获得、定制生成、或根据本领域中已确立的方法(Janeway et al.，(2001)Immunobiology，5th ed.，Garland Publishing)来针对感兴趣的抗原合成。
本公开的抑制剂可以是与蛋白质结合并干扰其功能的小分子。小分子是一个合成物和天然物质的多元化的组，通常具有低分子量。它们可以从天然来源(例如，植物、真菌、微生物等)分离，可以商购获得、和/或作为文库或集合获得，或者也可以合成。调节蛋白质的候选小分子可以通过电脑模拟法(in silico)筛选或组合文库的高通量(high-through-put，HTP)筛选来鉴定。大多数常规药物，例如阿司匹林、青霉素和许多化学治疗剂是小分子，可以商购获得、化学合成、或者可以从随机或组合文库获得(Werner et al.，(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic 5(1):32-6)。在一些实施方案中，所述药剂是与靶蛋白或RNA结合、相互作用或缔合的小分子。当靶标是细胞内靶标时，这种小分子可以是能够穿透细胞的脂质双层与靶标相互作用的有机分子。小分子包括但不限于毒素、螯合剂、金属和非金属化合物。小分子可以连接或共轭到靶向剂上，用以将小分子特异性地引导到特定的细胞。
本文所使用的“治疗有效量”是指包含在所施用的组合物中的本公开的抑制剂的量足以达到预期的目的，例如，在这种情况下诱导或促进受试者的毛发生长。为了本公开的目的，测量毛发生长的方法在本领域中是公知的，在此不必重复。在施用抑制剂以诱导毛发生长的情况下，组合物的有效量是足以使毛囊重新进入生长期的量。在施用抑制剂以促进生长期毛发生长的情况下，抑制剂的有效量是足以增加毛发生长速率的量。例如，增加可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多的毛发生长速率。每次施用的治疗有效量可以是1ng至1ug、1ug至1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、1g或更多、或其中间量。治疗有效量可以在一次或多次施用中施用。可以局部，口服或静脉内施用治疗有效量的抑制剂。当与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合使用时，抑制剂的有效量可以是0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％或更多、或其中间量。
本文所使用的“生长期”是指毛囊的活跃生长期。通常，在生长期时，不只毛干，毛发根部的细胞也会迅速分裂。在生长期结束时，某些生物信号会使毛囊进入退化期。
本文所使用的“退化期”是指在生长期结束时发生的转变阶段。它标志着头发活跃生长的结束。
本文所使用的“休止期”是指毛囊的静止期。在休止期中，毛囊保持休眠状态。在某些生物学信号的作用下，毛囊会重新进入生长期并开始再次生长。早期休止期是指在休止期开始时间的5％-40％。晚期休止期是指休止期结束时间的5％-40％。中期休止期是指早期休止期和晚期休止期之间的时期。
本文所使用的“雄激素性脱发”(也称为男性型脱发)，是由于雄激素的作用导致毛囊收缩(shrinkage)的潜在易感性引起的脱发。
本文所使用的“休止期脱发”是一种头皮疾病，其特征为通过毛发早期进入休止期(毛囊的静止期)而使毛发变得稀疏或脱落。
本文所使用的“斑秃(alopecia areata)”(也称为斑秃(spot baldness))是一种由于身体未能识别其自身细胞并随后破坏其自身组织而从身体的部分或全部区域失去毛发的自身免疫性疾病。
本文所使用的“头癣”是头皮的皮肤真菌感染(皮肤癣菌病)。这种疾病主要是由发癣菌(Trichophyton)属和小孢子菌(Microsporum)属侵入毛干的皮肤癣菌引起的。临床表现通常是单个或多个脱发斑块，有时具有“黑点(black dot)”图案(通常伴有断发(broken-off hairs))，可能伴有炎症、结垢、脓疱和瘙痒。
本文所使用的“脱发综合征”是指所有头发的丧失。
本文所使用的“稀毛症”是指毛发模式异常的情况，主要是脱落或减少。
本文所使用的“遗传性单纯稀毛症”是指一种特征为在没有其它外胚层或全身异常的状态下，没有结构缺陷的稀疏或无头发的遗传性疾病。
本文所使用的“前额纤维化脱发”是指一种影响头皮前部毛发边缘的疤痕性脱发(scarring hair loss)形式。
本文所使用的“瘢痕性脱发(cicatricial alopecia)”也称为疤痕性脱发(scarring alopecia)，是指一组破坏毛囊的罕见疾病。毛囊被疤痕组织取代，导致永久性脱发。
本文所使用的“毛发扁平苔癣(lichen planopilaris)”是一种当称为扁平苔癣(lichen planus)的相对常见的皮肤病影响毛发皮肤区域时发生的疤痕性脱发(scarringhair loss)。毛发扁平苔癣破坏毛囊，并以疤痕取而代之。
本文使用的“环形脱发”是环绕或部分环绕头部的环状或带状脱发(ring or bandof alopecia)，其可沿着后枕部的区域延伸，在耳朵上方的头皮颞部周围或前额上延伸。
本文所使用的“化疗引起的脱发”是一种在用于治疗癌症或非癌症疾病如狼疮和类风湿性关节炎的化学治疗之后发生的脱发。
本文所使用的“普秃”是指一种特征为头皮和身体的毛发完全丧失的状态。普秃是斑秃的进化形式，会导致圆形脱发的状态。
5.2 JAK-STAT通路基因
JAK-STAT信号通路将生物信号从细胞外环境传递到细胞核，引起参与分化、凋亡、免疫、增殖和肿瘤发生的基因的DNA转录和表达。所述通路的三个主要组分是细胞表面受体、Janus激酶(JAK)、信号转导及转录激活因子(STAT)蛋白。
JAK是细胞内非受体酪氨酸激酶家族。STAT是细胞内转录因子家族。配体例如干扰素、白细胞介素和/或生长因子与细胞表面受体的结合激活相关的JAK，其使受体上的酪氨酸残基磷酸化，并产生SH2结构域的结合位点。然后，将含有SH2结构域的STAT动员到受体，由此这些STAT也被JAK酪氨酸磷酸化。激活的STAT形成异源二聚体或同源二聚体并移位至细胞核以诱导靶基因的转录。STAT也可以直接被受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体)和/或非受体酪氨酸激酶(例如c-src)酪氨酸磷酸化。
JAK家族基因包括Janus激酶1(JAK1，GenBank ID:3716)、Janus激酶2(JAK2，GenBank ID:3717)、Janus激酶3(JAK3，GenBank ID:3718)和酪氨酸激酶2(TYK2，GenBankID:7297)。
STAT家族基因包括信号转导及转录激活因子1(STAT1，GenBank ID:6772)、信号转导及转录激活因子2(STAT2，GenBank ID:6773)、信号转导及转录激活因子3(STAT3，GenBank ID:6774)，信号转导及转录激活因子4(STAT4，GenBank ID:6775)、信号转导及转录激活因子5A(STAT5A，GenBank ID:6776)、信号转导及转录激活因子5B(STAT5B，GenBankID:6777)和信号转导及转录激活因子6(STAT6，GenBank ID:6778)。
制瘤素M(OSM，GenBank ID:5008)是编码白血病抑制因子/制瘤素-M(LIF/OSM)蛋白质家族成员的基因。编码的前蛋白经蛋白水解处理产生成熟蛋白。此蛋白质是分泌的细胞因子和生长调节剂，其抑制许多肿瘤细胞系的增殖。此蛋白质还调节包括了白细胞介素6、粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的其它细胞因子在内皮细胞中的产生。OSM通过两种不同的异二聚体受体介导其生物活性。gp130受体是与白血病抑制因子受体(LIFR)或与OSM受体β(OSM-Rβ)二聚化分别产生I型和II型OSM受体的共同组分。I型和II型OSM受体均激活JAK-STAT信号通路。
糖蛋白130(gp130，GenBank ID:3572，也称为白细胞介素6信号转导物、IL6ST、IL6-β或CD130)是由许多细胞因子共享的跨膜信号转导蛋白，其包括白细胞介素6(IL6)、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)。此蛋白质作为细胞因子受体复合物的一部分起作用。此蛋白质的激活取决于细胞因子与其受体的结合。
OSM受体β(OSM-Rβ，GenBank ID:9180，也称为制瘤素M受体或OSMR)是编码I型细胞因子受体家族成员的基因。编码的蛋白质与gp130异源二聚化以形成II型制瘤素M受体，并与白细胞介素31受体A异源二聚化以形成白细胞介素31受体，从而转导由制瘤素M和白细胞介素31诱导的信号传导现象。
白血病抑制因子受体(LIFR，GenBank ID:3977，也称为白血病抑制因子受体α)是编码属于I型细胞因子受体家族的蛋白质的基因。此蛋白与高亲和力转化子亚基gp130结合，形成介导白血病抑制因子(一种多功能细胞因子)的作用的受体复合物，其中所述多功能细胞因子涉及成体和胚胎中的细胞分化、增殖和存活。
5.3治疗方法
诱导或促进毛发生长的方法
本公开涉及用于诱导或促进毛发生长的治疗有效量的一种或多种JAK/STAT蛋白(例如Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ)抑制剂(例如鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543、CEP-701、氟达拉滨(fludarabine)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、lestaurtinib、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellusextract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、贯叶金丝桃素(hyperforin))的用途。非限制性环境中，其中这种诱导或促进毛发生长理想的是包括但不限于受试者具有雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。在某些实施方案中，当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时，将抑制剂施用于受试者的毛囊。在某些实施方案中，局部或口服施用抑制剂。
在某些实施方案中，本公开涉及在需要诱导毛发生长的的受试者中诱导毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Jak/STAT抑制剂。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂是特异性结合Jak/STAT蛋白或其片段的抗体；减少编码Jak/STAT蛋白的基因表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；减少Jak/STAT蛋白表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子；或其组合。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)。在某些实施方案中，所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、巴里替尼(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、巴西替尼、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。在某些实施方案中，抑制剂是针对OSM、gp130、LIFR、OSM-Rβ或其任何组合的抗体。
递送小分子、反义RNA、反义DNA、小干扰RNA、短发夹RNA、微RNA或其任何变体或修饰体的方法可根据需要而改变。在某些实施方案中，所选药剂的组分作为DNA构建体在一个或多个质粒中递送。在某些实施方案中，组分通过病毒载体递送。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺转染(impalefection)、静水压力、连续输注、超声处理、磁转染(magnetofection)、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型、有复制能力的载体顺式和反式作用元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(例如寡核苷酸、脂质复合物、聚合物囊泡、复合物、树状聚合物、无机纳米颗粒和细胞穿透肽)。
在某些实施方案中，一种或多种毛发生长生物标志物的基因表达水平。本文所使用的毛发生长生物标志物包括表3中列出的基因，即Wnt通路、Shh通路、毛发发育通路和黑素生成通路中的任何基因，以及包括CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17组中的任何基因。在某些实施方案中，一种或多种生物标志物的表达水平选自表3中列出的基因。
在某些实施方案中，一种或多种生物标志物的表达水平选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
在某些实施方案中，一种或多种生物标志物选自Wnt通路、Shh通路、毛发发育通路、黑素生成通路或其任何组合中的基因，在施用所述抑制剂后改变。
Wnt和Shh信号传导通路是通过细胞表面受体将信号传递到细胞中的细胞信号通路。参与Wnt通路的基因包括但不限于Aes(TLE/Groucho)、Apc、Axin1、Bcl9、Csnk1a1、Csnk1d、Csnk1g1、Csnk2a1、Ctbp1、Ctbp2、Ctnnb1、Ctnnbip1(Icat)、Cxxc4、Dixdc1、Dkk1、Dvl1、Dvl2、Ep300、Frat1、Fzd1、Fzd2、Fzd3、Fzd4、Fzd5、Fzd6、Fzd7、Fzd8、Gsk3a、Gsk3b、Lef1、Lrp5、Lrp6、Nkd1、Porcn、Ppp2ca、Ppp2r1a、Pygo1、Senp2、Sfrp1、Sfrp4、Sox17、Tcf7、Tcf7l1、Wif1、Wnt1、Wnt10a、Wnt16、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、和Wnt8a。参与Wnt通路的基因包括但不限于Dhh、Hhat、Hhip、Ihh、Shh、Siah1、C18orf8、C6orf138、Npc1、Npc1l1、Ptch1、Ptch2、Ptchd1、Ptchd2、Ptchd3、Gli1、Gli2、Gli3、Gsk3b、Smo、Sufu、Cdon、Cep76(C18orf9)、Fgf9、Fkbp8、Ift52和OTX2。
毛发发育通路包括Wnt、Shh、Notch、BMP以及其它负责毛囊形态发生的信号传导通路。参与毛发发育通路的基因包括但不限于Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4和Gli2。
黑素生成通路包括负责黑素细胞形成和成熟的细胞信号通路。参与黑素生成通路的基因包括但不限于Sox10、p300家族、Bcl2、MAP激酶、POMC、Lef-1、Tyrp1、Trp1、Trp2、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
在某些实施方案中，本公开涉及在需要诱导毛发生长的受试者中诱导毛发生长的方法，所述方法包括当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时向受试者的毛囊施用抑制剂，即治疗有效量的Jak/STAT抑制剂。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂是特异性结合Jak/STAT蛋白或其片段的抗体；减少编码Jak/STAT蛋白的基因表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；减少Jak/STAT蛋白表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子；或其组合。当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时，将抑制剂施用于受试者的毛囊。在某些实施方案中，当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时，施用于受试者毛囊的抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)。在某些实施方案中，当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时，施用于受试者毛囊的抑制剂是托法替尼(CP690550)。在某些实施方案中，当毛囊处于中期休止期或晚期休止期时，施用于受试者毛囊的抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB 052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellusextract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
在某些实施方案中，本公开涉及在需要促进毛发生长的受试者中促进毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Jak/STAT抑制剂。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂在早期休止期以外的阶段施用。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂在生长期施用。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂是特异性结合Jak/STAT蛋白或其片段的抗体；减少编码Jak/STAT蛋白的基因表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；减少Jak/STAT蛋白表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子；或其组合。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)。在某些实施方案中，所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
促进真皮乳头诱导性的方法
本发明进一步涉及一种或多种JAK/STAT蛋白(例如例如Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ)抑制剂(例如鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨(fludarabine)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、巴多替尼(baricitinib)、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合)用于促进真皮乳头诱导性的用途。在某些实施方案中，本公开涉及促进真皮乳头诱导性的方法，所述方法包括向来自受试者毛囊的真皮乳头三维球体施用治疗有效量的Jak/STAT抑制剂。本领域已知，在毛囊中源自毛囊的真皮细胞可与局部上皮细胞相互作用，并在各种无毛受体皮肤部位诱导新生毛囊(Higgins,et,al.,Proc Natl Acad Sci U S A110,19679(Dec 3,2013)，其内容通过引用的方式并入本文)。本领域还已知，当人真皮乳头细胞作为三维球体生长时，能够在人皮肤中诱导新生毛囊(Higgins,et,al.；Y.Zheng et al.,J Invest Dermatol 124,867(May,2005)，其内容通的方式并入本文)。在某些实施方案中，随后向受试者施用真皮乳头三维球体以治疗雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。
5.4药物组合物和管理
在某些实施方案中，本公开的JAK-STAT抑制剂组合物可以通过与药学上可接受的载体或赋形剂混合而配制成药物组合物或药物制剂。在某些实施方案中，药物制剂可以包含治疗有效量的JAK-STAT抑制剂和生理上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，药物组合物可以进一步包含一种或多种额外的治疗组分和/或佐剂。
在某些实施方案中，药物制剂可以是固体剂型。在某些实施方案中，固体剂型可以是片剂或胶囊剂。
在某些实施方案中，药物制剂可以是液体制剂。在某些实施方案中，液体制剂可以是口服溶液或口服混悬液。
在某些实施方案中，药物制剂可以是经皮药物递送系统，例如贴剂、乳膏剂、凝胶剂和/或微乳剂。
在某些实施方案中，药物制剂可以包含脂质体、纳米颗粒和/或其它载体。在某些实施方案中，药物制剂可以包含佐剂或增强剂，例如酶抑制剂。
在某些实施方案中，药物制剂可以是直接输注。在某些实施方案中，药物制剂可以是可植入装置。
可以使用许多方法来引入本文所述的制剂，这些制剂包括但不限于口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下和肺内途径。所有这样的通路都适合于这些组合物的施用，并且可以由主治医师根据患者和在症状存在下待治疗的病症以及类似因素来选择。根据期望的施用途径，本公开的组合物以例如液体、粉末、气雾剂、片剂、胶囊剂、肠溶衣片剂或胶囊剂、或栓剂的形式制备。
本公开的引发组合物的适当剂量的选择可以基于哺乳动物的身体状况，尤其是包括哺乳动物的一般健康和体重。有效剂量的选择和向上或向下调整包括在本领域的技术范围内。
本公开的药物组合物任选地进一步包含无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。组合物可以进一步包含本领域已知的助剂或赋形剂。参见例如Berkow et al.,eds.,TheMerck Manual,15th edition,Merck and Co.,Rahway,N.J.(1987)；Goodman et al.,eds.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,8thedition,Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.(1990)；Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,3rdedition,ADIS Press,LTD.,Williams and Wilkins,Baltimore,Md.(1987)；Osol,A.,ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co,Easton,Pa.pp.1324-1341(1980)；Katzung,ed.Basic and Clinical Pharmacology,Fifth Edition,Appleton andLange,Norwalk,Conn.(1992)等参考文献和其中引用的参考文献，其内容通过引用的方式并入本文，以显示现有技术的状态。
在某些实施方案中，用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和/或乳液，其可以包含本领域已知的辅助剂或赋形剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。载体或封闭敷料可用于增加皮肤渗透性并增强吸收。用于口服施用的液体剂型通常可以包括含有液体剂型的脂质体溶液。适于悬浮脂质体的形式包括乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、以及含有本领域常用的惰性稀释剂如纯化水的酏剂。除了惰性稀释剂之外，这样的组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、或者甜味剂、调味剂或芳香剂。参见例如下文的Berkow、Goodman、Infra、Avery's、Infra、Osol、Infra和Katzung，其内容通过引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，用于施用给个体的本公开内容的组合物可以进一步包括盐、防腐剂、化学稳定剂、缓冲剂、佐剂或对于改善组合物功效所需的其它物质。典型地，优化稳定剂、佐剂和防腐剂,以确定确定对目标人或动物有效的最佳制剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。可以使用的合适的稳定成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸一钾、乳糖、乳清蛋白水解产物和奶粉。通常，佐剂和组合物会在给予之前混合，或是对哺乳动物中的相同部位分别给予。作为这种佐剂，包括MPL(3-O-脱酰单磷酸类脂A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Mont.)、矿物油和水、氢氧化铝、爱菲金(Amphigen)、阿夫立定(Avridine)、L121/角鲨烯、D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷、pluronicplyois、胞壁酰二肽、灭活博德特氏菌(killed Bordetella)、如Quil A或Stimulon QS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.)等的皂苷、以及霍乱毒素(野生型形式或根据国际专利申请号PCT/US99/22520(其内容通过引用的方式并入本文)，例如，其中氨基酸位置29的谷氨酸的被另一氨基酸-优选为组氨酸置换的突变形式)。Osol,A.,ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co,Easton,Pa.(1980),pp.1324-1341提供了适用于本公开内容的组合物的材料的其它实例，该参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。
5.5监测治疗效果的方法
本公开还涉及评估用于在哺乳动物受试者中诱导或促进毛发生长的治疗效果的方法。在某些实施方案中，所述方法包括:(a)确定从受试者获得的毛囊样品中的一种或多种毛发生长生物标志物的水平，以及(b)在所述治疗过程中的多个时间点中的一个时间点判断从受试者获得的毛发样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中当第二或随后样品中的所述一种或多种生物标志物相对第一样品发生变化时，所述治疗对于诱导或促进受试者的毛发生长是有效的。在某些实施方案中，生物标志物选自Wnt通路、Shh通路、毛发发育通路、黑素生成通路或其任何组合。在某些实施方案中，生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
毛发生长生物标志物可以是核酸或肽/蛋白质。用于定性和定量检测和/或确定核酸生物标志物表达水平的方法包括但不限于包含常规qPCR和数字PCR的聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交(例如但不限于荧光原位杂交(“FISH(Fluorescent In SituHybridization)”))、凝胶电泳、测序和序列分析、微阵列分析和本领域已知的其它技术。
在某些实施方案中，检测方法可以是实时PCR(RT-PCR)、定量PCR、荧光PCR、RT-MSP(RT甲基化特异性聚合酶链式反应(RT methylation specific polymerase chainreaction))、DNA的PicoGreenTM(Molecular Probes,Eugene,OR)检测、放射免疫测定或DNA的直接放射性标记。例如但不限于，聚合酶链式反应(RT-PCR)可以在核酸生物标志物逆转录为cDNA之后进行、或者单一酶可用于美国专利号5,322,770中所述的两个步骤、或者如R.L.Marshall,et al.,PCR Methods and Applications 4:80-84(1994)中所述，对称间隙连接酶链式反应(RT-AGLCR)可以在生物标志物逆转录成cDNA后进行。
在某些实施方案中，使用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)来评估生物标志物的mRNA水平。生物标志物和对照mRNA的水平可以在癌组织或细胞和邻近的良性组织中定量。在某些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平可以在生物样品中定量。
在一个非限制性实施方案中，本发明的检测方法可以在不依赖于扩增的情况下进行，例如可以在不产生任何靶序列的拷贝或复制、不涉及任何聚合酶、或者不需要任何热量循环的情况下进行。在某些实施方案中，本发明的检测可以使用于2006年6月19日提交的美国专利申请号11/471，025(其内容通过引用的方式并入本文)中描述的QuantiGeneTM方法中阐述的原理来完成。
在某些实施方案中，可以采用原位杂交可视化，其中将放射性标记的反义RNA探针与生物样品(例如活检样品)的薄切片杂交、洗涤、用RNase切割并暴露于感光乳剂中进行放射性自显影。样品可以用苏木精染色以显示样品的组织学组成，并且用合适的滤光片进行暗场成像来显示显影的乳剂。也可以使用如地高辛配基的非放射性标记。
在某些非限制性实施方案中，对核酸生物标志物表达的评估可以通过荧光原位杂交(FISH)进行。由于FISH是一种可以直接鉴定细胞中DNA或RNA特定区域的技术，因此可以直观地确定组织样品中生物标志物的表达。FISH方法的优点在于具有更客观的评分系统以及由同一样品中存在于所有非肿瘤细胞中的生物标志物基因信号组成的内在对照。FISH是一种直接的原位技术，可以相对快速、灵敏，也可以自动化。当单独使用FISH难以确定生物标志物的表达水平时，可以将免疫组织化学与FISH方法结合使用。
在某些实施方案中，可以在qPCR阵列、DNA阵列、芯片或微阵列上检测核酸生物标志物的表达。将对应于生物标志物(或多个生物标志物)的寡核苷酸固定在芯片上，然后将其与从受试者获得的生物样品(例如肿瘤样品)的标记核酸杂交。用含有生物标志物转录物的样品获得阳性杂交信号。制备DNA阵列的方法及其用途在本领域是公知的(参见例如美国专利号6,618,6796、美国专利号6,379,897、美国专利号6,664,377、美国专利号6,451,536、美国专利号548,257、美国专利申请号20030157485和Schena et al.1995Science 20:467-470；Gerhold et al.1999Trends in Biochem.Sci.24,168-173；and Lennon etal.2000Drug discovery Today 5:59-65，其内容通过引用的方式并入本文)。此外，也可以进行基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)(参见例如美国专利申请号20030215858)。
在某些实施方案中，为了监测核酸生物标志物，可以从待测试的生物样品中提取mRNA并逆转录，以产生荧光标记的cDNA探针。之后，可以将标记的cDNA探针应用于能够与生物标志物杂交的微阵列，使得探针与微阵列杂交，并扫描载玻片以测量荧光强度。此强度与生物标志物的杂交强度和表达水平相关。
用于检测核酸生物标志物的探针类型包括cDNA、核糖探针、合成寡核苷酸和基因组探针。所用探针的类型通常取决于具体情况，例如用于原位杂交的核糖体探针和用于Northern印迹的cDNA。在某些非限制性实施方案中，探针针对特定生物标志物RNA所特有的核苷酸区域。探针可以与差异性识别特定生物标志物mRNA转录物所需的一样短，并且可以短至例如15个碱基。此外，也可以使用至少17个碱基，18个碱基和20个碱基的探针。在某些实施方案中，引物和探针在严格条件下与具有对应于靶基因的核苷酸序列的核酸片段特异性杂交。本文所使用的术语“严格条件”是指仅当序列之间存在至少95％或至少97％同一性时才发生杂交。
探针的标记形式可以是任何合适的形式，可以使用放射性同位素如32P和35S或荧光团(fluorophores)。无论探针是化学合成的还是生物合成的，都可以通过使用适当标记的碱基来实现用放射性同位素标记。
用于检测和/或确定蛋白质生物标志物水平的方法是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于质谱技术、基于1-D或2-D凝胶的分析系统、色谱法(chromatography)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫组化法。这些方法使用抗体或抗体等同物来检测蛋白质，或使用生物物理学技术。此外，也可以采用抗体阵列或蛋白质芯片，参见例如美国专利申请号2003/0013208、美国专利申请号2002/0155493、美国专利申请号2003/0017515、美国专利号6,329,209和美国专利号6,365,418，其全部内容通过引用的方式并入本文。
在某些非限制性实施方案中，用于测量蛋白质生物标志物表达的检测方法包括以下步骤:使生物样品(例如组织样品)与选择性结合生物标志物的抗体或其变体(例如片段)接触；以及检测抗体或其变体是否与样品结合。此方法可以进一步包括使样品与第二抗体(例如标记的抗体)接触。此方法可以进一步包括一个或多个洗涤步骤，例如去除一种或多种试剂。
在某些非限制性实施方案中，Western印迹可用于检测和定量生物标志物蛋白质表达水平。可以将细胞在裂解缓冲液中均化以形成裂解物，然后进行SDS-PAGE并印迹至膜(例如硝酸纤维素滤膜)。接着，可以使抗体(未标记的)与膜接触，并通过第二免疫试剂如标记的蛋白A或抗免疫球蛋白(合适的标记包括125I、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)进行测定。此外，也可以使用色谱检测。在某些实施方案中，可使用增强的化学发光系统(例如，来自PerkinElmer Life Sciences,Boston,Mass.)并借助生物标志物的抗体进行免疫检测。之后，可以将膜剥离并用对照蛋白例如肌动蛋白特异的对照抗体重新印迹。
免疫组化法可用于检测例如在活检样品中的生物标志物的表达和/或存在。可以使合适的抗体与例如细胞薄层接触后，将其洗涤以去除未结合的抗体，然后与第二标记的抗体接触。标记可以通过荧光标记、酶如过氧化物酶、抗生物素蛋白或放射性标记来实现。可以使用显微镜对上述测定进行目视评分，并且可以对结果进行定量。也可以使用机械系统或自动成像系统来测量生物标志物的免疫染色结果。
本领域可以使用各种适用于免疫组织化学的自动化样品处理、扫描和分析系统。这样的系统可以包括自动染色(参见例如Ventana Medical Systems，Inc.的Benchmark系统)和显微扫描、计算机图像分析、连续切片比较(控制样品的方向和大小的变化)、数字报告生成、以及样品归档和追踪(如放置组织切片的幻灯片)。细胞成像系统可商购获得，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统组合，以对细胞和组织(包括免疫染色的样品)进行定量分析。参见例如CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。
针对生物标志物的标记抗体也可用于成像目的，例如用以检测受试者细胞中生物标志物的存在。合适的标记包括碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)、荧光标记物(如荧光素和罗丹明)和生物素。可以使用不同的酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶或不同的色原如DAB、AEC或Fast Red来使免疫酶的相互作用可视化。标记的抗体或抗体片段将优先积聚在含有生物标志物的细胞的位置。然后，可以使用已知技术检测标记的抗体或其变体，例如抗体片段。
抗体包括可与待检测的生物标志物充分强烈且特异性结合的任何抗体，无论是天然的还是合成的、全长或其片段、单克隆或多克隆的。抗体可以具有至多约10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M和10-12M的Kd。短语“特异性结合”是指例如抗体与表位、抗原或抗原决定簇的结合，是能够被相同或相似的表位、抗原或抗原决定簇的第二制剂置换或竞争的结合。
可以使用的抗体及其衍生物包括多克隆抗体或单克隆抗体、合成抗体和工程化抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长化(CDR移植)抗体、饰面抗体或单链抗体、相产生的抗体(phase produced antibodies)(例如来自噬菌体展示文库)以及抗体的功能性结合片段。例如，可以使用能够与生物标志物或其部分(包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2的片段)结合的抗体片段。这样的片段可以通过酶裂解或通过重组技术产生。
在某些非限制性实施方案中，使用与抗体以外的多肽(例如肽)特异性结合的药剂。可以通过本领域已知的任何方式鉴定特异性结合的肽，例如肽噬菌体展示文库。通常，可以使用能够检测生物标志物多肽的药剂，从而检测和/或定量生物标志物的存在。本文所定义的“药剂”是指能够鉴定或检测生物样品中的生物标志物(例如鉴定或检测生物标志物的mRNA、生物标志物的DNA、生物标志物的蛋白质)的物质。
另外，可以使用诸如MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)、毛细管电泳-联用技术、核磁共振光谱测定法、或串联质谱法(例如MS/MS,MS/MS/MS,ESI-MS/MS等)等质谱法来检测生物标志物。参见例如美国专利申请号2003/0199001、美国专利申请号2003/0134304、美国专利申请号2003/0077616，其全部内容通过引用的方式并入本文。
质谱法在本领域中是公知的，并且已经用于定量和/或鉴定生物分子如蛋白质(参见例如Li et al.(2000)Tibtech 18:151-160；Rowley et al.(2000)Methods 20:383-397；和Kuster and Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8:393-400)。此外，已经开发了允许分离的蛋白质的至少部分从头测序的质谱技术。Chait et al.,Science 262:89-92(1993)；Keough et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6(1999)；在Bergman,EXS 88:133-44(2000)中进行了综述。
生物标志物或其它物质的存在的检测通常涉及信号强度的检测。这也可以相应地反映与底物结合的多肽的量和特性。例如，在某些实施方案中，可以比较第一样品和第二样品的光谱的峰值信号强度(例如，目视或通过计算机分析)以确定特定生物标志物的相对量。诸如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems，Inc.，Fremont，Calif)的软件程序可用于帮助分析质谱。
用于确定样品中的核酸和/或蛋白质生物标志物表达的其它方法描述于例如美国专利号6，271，002；美国专利号6，218，122；美国专利号6，218，114；和美国专利号6，004，755；和Wang et al,J.Clin.Oncol.,22(9):1564-1671(2004)；和Schena et al,Science,270:467-470(1995)；其全部内容通过引用的方式并入本文。
5.5试剂盒
本公开还涉及用于诱导或促进哺乳动物受试者的毛发生长的试剂盒。在某些实施方案中，上述试剂盒包括:(a)Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR、和/或OSM-Rβ抑制剂；以及(b)药学上可接受的载体。在某些实施方案中，Jak/STAT抑制剂是特异性结合Jak/STAT蛋白或其片段的抗体；减少编码Jak/STAT蛋白的基因表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA、短发夹RNA、微RNA或其变体或修饰体；减少Jak/STAT蛋白表达的反义RNA、反义DNA、小干扰RNA、短发夹RNA、微RNA或其变体或修饰体；或小分子；或其组合。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)。在某些实施方案中，所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。在某些实施方案中，所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、巴里替尼(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、巴西替尼、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
6.实施例
以下实施例用以向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本公开主题的完整公开和描述，包括但不限于用于通过施用JAK-STAT通路的抑制剂来诱导毛发生长的组合物和方法。以下实施例并不意在限制本发明中公开的主题的范围。应该理解的是，鉴于以上提供的一般描述，可以实践各种其它实施例。
6.1实施例1:JAK-STAT信号传导的药理学抑制促进毛发生长
结果
JAK-STAT抑制导致小鼠毛发生长迅速。首先，在休止期中的C57/B6小鼠的背部的一半用赋形剂对照(阴性对照，左侧)、先前显示促进生长期开始的(2)音猬因子(Shh)激动剂(阳性对照)、或JAK-STAT通路的几种小分子抑制剂，包含托法替尼(JAK1/3>JAK2>TYK2)(3)和鲁索替尼(JAK1/2>Tyk2>JAK3)(4-7)(右侧)治疗三周(图1A)。正如预期的，在用Shh激动剂治疗的7天内明显进入生长期，而赋形剂治疗的小鼠在实验期间仍然停留在休止期。有趣的是，用JAK抑制剂治疗导致与Shh激动剂类似的动力学而快速重新进入毛发周期(图1A)。为了检验对干细胞激活的直接作用，将休止期的小鼠用托法替尼或鲁索替尼短期治疗4天。注意到药物治疗的HF的毛芽区室(P-cad+)内的显著增殖(图5A)，显示了祖细胞群的激活。药物治疗对皮肤动态平衡的影响的定量证明了药物诱导的毛发生长重现了正常的毛发生长(图5B)。总之，这些数据表明JAK-STAT通路的局部抑制导致毛发生长的快速开始。
JAK-STAT抑制的作用取决于休止期的持续时间。C57/B6小鼠出生后的第一次毛发循环遵循精确的时间进展。之后的再生(重新进入生长期)从约12-13周龄(8，9)开始以稀疏的波浪自发地发生。用JAK抑制剂对休止期的小鼠进行治疗则始终可取得早期和均匀的毛发生长(图1A)，但恢复生长期所需的治疗持续时间以意想不到的方式变化。为了解决这个问题，对处于早期休止期(7周)或中期休止期(8.5周)的小鼠进行治疗。治疗在7周龄小鼠中并未造成毛发生长，而在8.5周龄小鼠中显示生长期快速启动(图5C)。为确保在8.5周龄治疗的小鼠仍处于阻止重新进入生长期而繁殖的休止期的难治性阶段(9，10)，以，在7和8.5周时将小鼠拔毛，拔毛后的毛发生长在两个时间点遵循相似的动力学(图5C)。值得注意的是，对7周龄的小鼠进行了更长时间(18-21天)的治疗并最终诱导了毛发生长，但是仅在治疗的小鼠达到8.5周龄之后(图5D)。这一发现表明JAK抑制不能忽略在休止期早期阶段促进静止的微环境(9，10)，但足以促进休止期后期阶段的毛发生长。
为了证明JAK抑制剂治疗在8.5周龄引起的毛发生长的稳健性和再现性，将皮肤变黑作为C57/B6小鼠毛发生长的指标(11)。事实上，用鲁索替尼或托法替尼治疗5天的8.5周龄小鼠中约90％在开始治疗后的10天内显示皮肤变黑和毛发生长，而在对照治疗的小鼠中毛发生长不明显(对于鲁索替尼治疗P<0.0001和对于托法替尼治疗p＝0.04)(图1B和图5E)。
JAK-STAT抑制后的毛发生长通过激活Wnt和Shh信号传导通路模拟正常的生长期开始。为了检验使用JAK抑制剂进行治疗后的生长期开始是否与正常生长期开始分子相似，在用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼治疗的8.5周龄小鼠上进行微阵列实验4天，在毛芽已经开始增殖的时间点，但毛发生长尚不明显(图5A)。在治疗的第0天(T0)和第4天(T5)收获的全皮肤之间差异表达的基因列表的比较揭示了由两种JAK抑制剂调节的基因子集(图1C)。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件的通路分析显示，在鲁索替尼和托法替尼治疗中黑素生成和Wnt通路都富集，但是在对照治疗中没有。对两种药物治疗中差异表达基因的进一步分析确定了其它重要的毛发周期调节剂，如Shh和Prom1(2,12-16)在JAK抑制剂治疗的皮肤中显著上调(图1D)。关键基因的差异调节通过qPCR验证(图6A)。由于Wnt和Shh通路的上调是生长期开始和黑素细胞干细胞激活的中心(16，17)，这些发现表明JAK-STAT信号传导的阻断使得毛发周期的正常进展。对仅由一种药物治疗调节的基因的进一步分析揭示了另一个分子签名(图6B和图6C)。鲁索替尼治疗中mTOR和NfkB通路的富集先前显示参与了毛发周期调节(12，18-20)，而托法替尼治疗中通路的富集则参与了细胞运动和迁移，如Rho和整合素信号传导。有趣的是，STAT3-/-角质形成细胞先前被证明在刺激反应中迁移不足(21，22)，这表明JAK-STAT通路对于在休止期和生长期之间的转变中的细胞运动是必需的。
JAK-STAT抑制引起毛囊祖细胞的激活。为了研究在JAK-STAT抑制后负责HF激活的细胞机制，用鲁索替尼、托法替尼或赋形剂对照和治疗处于休止期的小鼠，并且在第一、第二和第三治疗5小时后收获皮肤(图1E，示意图)。每天在进行收获的每个时间点前1小时注射EDU，并分析皮肤样品中EDU+(增殖)细胞的存在。在鲁索替尼和托法替尼进行治疗三次后的皮肤中，Edu+细胞在毛芽(P-cadherin+)区室内清晰可见，但在对照治疗的皮肤中没有(图1E)。这一发现表明JAK-STAT抑制后HF的激活遵循毛芽生长先于凸起干细胞增殖的正常生长期开始的动力学(23)。综上所述，上述数据表明JAK-STAT信号传导通常起到防止重新进入生长期的作用，并且JAK阻断解除了这种抑制，以允许正常的毛发周期进展。
JAK抑制的毛发诱导作用不依赖于淋巴细胞的活性。已知JAK-STAT通路在T细胞生物学中发挥重要作用(24)，并且HF微环境含有大量的驻留T细胞和迁移T细胞。最近的研究显示，除了毛发周期性方面，γδT细胞还分泌调节小鼠HF新生的因子(25，26)。此外，本发明人先前已证明，在AA中JAK-STAT抑制剂起到从HF微环境清除细胞毒性T细胞的作用，即开始毛发再生长的基本过程。
为了评估用JAK抑制剂治疗后的正常毛发生长是否由T细胞介导，在两种不同的淋巴细胞缺陷小鼠模型上检验局部药物治疗的效果。B细胞和T细胞缺陷的Rag1-/-小鼠以及迁移T细胞和驻留T细胞缺陷的Tcrβ/δ-/-小鼠进入毛发周期的能力(图7A)以及对药物治疗的反应(图2A)，与对照基本上没有区别。这表明JAK抑制剂在正常皮肤中的毛发诱导作用不依赖于淋巴细胞的活性。尽管发明人不排除JAK-STAT抑制剂对已知影响毛发周期的其它免疫细胞(如巨噬细胞(27))、或受JAK抑制干扰的如髓样树突状细胞(28)的效果，但这个结果表明JAK-STAT抑制的生长期诱导效果可能代表毛发固有性质。
JAK-STAT通路在整个毛发周期内被动态调节。为了检验在HF发育和循环过程中的JAK-STAT通路的动力学，检验了从生长期到休止期的转变期间内全皮肤中基因表达的变化(29)。使用qPCR阵列来测量与JAK-STAT通路有关的基因表达。用基因表达动力学分析软件(GEDI)使基因表达的动态变化可视化，算法是将qPCR阵列上的每个基因的表达值聚类为基于其时间表达谱中的相似性的宏基因类别，将它们放置在5x6网格上的30个位置之一中。退行期(第17天)和早期生长期(第29天)之间的比较揭示了随着毛发周期进展而变得被抑制的宏基因簇(图2B的盒装像素)。研究被抑制的宏基因的含量显示，JAK-STAT通路的关键成员如STAT5A/B、STAT3、Jak1、Jak3和Socs2/3等在退行期和休止期高水平表达，并在早期生长期受到抑制(图2B、图2C和图7B)。
在生长期、退行期和休止期中的HF的免疫荧光研究证实激活(磷酸化)STAT3在真皮乳头(DP)、一些外毛囊细胞和在基底表皮的增殖细胞中表达(图2D和7C)。在退行期和休止期，也可以在毛芽细胞中检测到磷酸-STAT3。在整个毛发周期中，激活的磷酸-STAT5在DP中强烈表达，在退化期间中表达峰值，也可以在凸起中被检测到(图2D)。在处于休止期的关键的HF干细胞区室中磷酸-STAT5的显著表达模式强调在静止的调节中潜在的重要作用。
托法替尼治疗促进人毛囊的生长。在人体组织中检查了JAK抑制对毛发生长的影响。与小鼠相比，人头皮HF异步生长，其中90％的HF在任何给定时间处于毛发周期的生长阶段(34)。因此，要评估人从休止期到成长期之间的转变是非常困难的，并且分析仅限于测量毛发纤维生长的速度。将人胎儿头皮皮肤移植到Scid小鼠上，并使其恢复至少6周。之后，在每个移植物的一侧用赋形剂对照、另一侧则使用托法替尼(图3A)或鲁索替尼(图8A)进行每日局部施用来治疗。由于移植物中已经存在小的多个HF，因此发明人测试了JAK抑制对正在发展的胎儿HF至终毛(terminal hairs)的作用，而不是对HF新生的作用。与对照相比，托法替尼治疗导致更密集的HF生长，这表明托法替尼治疗增加了毛发伸长的速度。为了量化这一结果，发明人测量了，作为移植到白色小鼠的深色毛的密度的替代指标的色素沉着强度，并且显示托法替尼/对照的比率随治疗天数而增加。用源自不同供体的皮肤进行实验，结果相似(图8B)。
使用广泛应用的人HF器官培养模型进一步分析了JAK抑制对毛干伸长的影响。从成人头皮组织中显微切割个别的HF，并用赋形剂对照、鲁索替尼和托法替尼培养(图3B)。当用鲁索替尼和托法替尼治疗时，使用JAK抑制剂的治疗显著增加毛干长度，这显示对毛发伸长率有积极影响(托法替尼鲁和索替尼治疗分别为P＝0.023和P＝0.025)。来自2个额外供体的HF实验产生了类似的趋势(图8C)。综上所述，数据显示JAK-STAT抑制促进器官培养模型中毛发纤维更快的生长。
托法替尼治疗促进真皮乳头的诱导。由于磷酸-STAT5在退行期和休止期的小鼠DP中强烈表达(图2D)，磷酸STAT3被证实存在于生长期的真皮鞘和人HF的DP中，而磷酸STAT5表达虽弱，但其存在于DP的顶部(图8D)。
本发明人最近证明在三维球体中培养人DP细胞提高了其诱导HF生长的能力(35)。为了检验JAK抑制对HF诱导效力的影响，用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼培养人DP球体，然后与新生小鼠角质形成细胞合并并注射到裸鼠中。这种贴片测定法(patch assay)显示了重演HF形态发生，并且用于评估毛发生成(trichogenic)能力(36)。用托法替尼治疗的人DP球体诱导更大且显著更多的HF总数(P＝0.00013)(图3D)，这表明通过抑制JAK1/3信号传导来增强人DP的诱导性。
托法替尼治疗通过富集完全诱导性真皮乳头的靶向基因来促进毛发生长。为了研究托法替尼治疗改善DP诱导的机制，在用对照、鲁索替尼和托法替尼治疗的DP球体上进行微阵列实验。基因表达中的Log2倍变化用于产生GEDI图。为了分析基因表达的相关变化，本发明人进行了鲁索利替尼治疗(其不赋予增强的诱导性)与对照、托法替尼治疗(其增强了诱导性)与对照、以及鲁索替尼和托法替尼治疗的比较。这使得可以检验由两种药物提供的JAK抑制引起的基因表达改变，并关注于托法替尼治疗特有的变化。GEDI算法基于其在所有微阵列中的类似表达模式，将差异表达的转录物聚类成为宏基因。数据以三维形式呈现，其中Z轴和颜色对应于基因表达的变化，并且X轴、Y轴对应于GEDI宏像素(metapixels)的坐标，绘制在18x19的网格上(图4A)。基于上述图表的地形，选择了四个感兴趣区域(区域1-4)。
有趣的是，在两种治疗中被抑制但在托法替尼治疗(区域1)中更低的基因中，已知涉及调节DP诱导性的受体如FGFR1、ACVRL1、IGFR1、OSMR和PTGFR(32，37-41)。在包括通过鲁索替尼治疗上调但通过托法替尼治疗下调的基因的区域中鉴定出促凋亡基因，如BAX、BCL2L11和CASP12(区域2)。通过托法替尼治疗上调的基因(区域3和4)包括TGFβ通路和BMP通路的成员，先前显示其在真皮乳头诱导中发挥关键作用(40-44)。已知用于调节真皮-表皮相互作用的WNT通路的关键调节因子(如LEF1)(45，46)，以及已知用于控制HF命运的NOTCH通路的成员(47，48)在托法替尼治疗中过度表达。总之，这表明托法替尼治疗通过调节所培养的真皮乳头的诱导功能和存活双方来促进诱导性。
为了直接比较托法替尼治疗与已公布的关于DP诱导性的研究，发明人转向之前的研究，其调查了新鲜分离的人DP(维持其诱导毛发生长的能力)、培养的DP(失去诱导潜能)和培养的真皮球体(已恢复诱导潜能)之间的分子差异，并鉴定与每种状况相关的特有基因签名(35)。这些基因通过共表达被分成四类，称为区域(T1-T4)。发现T1和T3含有在培养中表达失调并通过球体生长恢复的基因，而T2和T4包含其表达未被球体培养所恢复的基因(35)。T2(在培养细胞中上调而不是通过球体形成所恢复)和T4(在培养细胞中下调而不是通过球形成所恢复)内的基因代表被认为是完全诱导性DP所需的分子签名。
由于托法替尼治疗增强了毛发生长，当比较托法替尼治疗的样品与未治疗的样品时，本发明人测定T1-T4内的基因表达是否以统计学上显著的方式富集。对在这些治疗组中差异表达的基因进行基因集富集分析(49)，根据p值从最高表达到最低表达进行排序，揭示了在托法替尼治疗的球体中区域T4显著富集(P＝2x10-6，表3中提供的基因列表)(图4C和图4D)。T2也通过托法替尼治疗而富集，但是统计学上的重叠仅有轻微显著(P＝0.03)(图8E)。在T2和T4内的所有基因并非皆按照先前研究所预测的方式改变，这表明通过托法替尼治疗引起的诱导性的复原可能不完全。托法替尼治疗确实上调了所有已知的毛发生长调节因子(如LEF1、WIF1和CD133)基因的表达(40，41)，提供了托法替尼治疗为何能成功改善诱导性的机制解释。有趣的是，在T2和T4内利用图2B所用的qPCR微阵列鉴定的所有JAK STAT基因的富集得分的分析揭示了高度统计学上的显著重叠(1.45×10-7，表1中提供的基因列表)，这表明对于T2和T4的诱导签名(inductive signature)存在主要的JAK-STAT组分。
讨论
本文中所呈现的发现证明JAK-STAT信号传导的抑制促进毛发生长。这些发现与JAK-STAT和抗毛发生长模式之间的关联(29)一致，并且证据表明了STAT3在成年小鼠正常毛发周期中的作用(21，22)。此外，最近的研究显示老年小鼠中JAK-STAT信号传导的增加抑制体外HF干细胞功能(50)，并且STAT5信号传导控制妊娠和哺乳期中HF干细胞的静止(51)。
对JAK-STAT信号的抑制可以促进干细胞/祖细胞的激活或分化的观察并不是HF所特有的。造血干细胞中STAT5的喪失诱导从静止状态退出，导致辐射后骨髓再生能力增加(52)。JAK-STAT信号传导的抑制通过促进对称的卫星细胞扩增和减少参与肌生成的作用，来改善老年小鼠的骨骼肌再生(53，54)。因此，JAK-STAT信号传导在促进静止中的作用可能代表了成体干细胞群中的一种广义机制。
在本研究中，发明人观察到JAK抑制剂介导的毛发生长不依赖于T淋巴细胞功能，并且可能代表毛发固有性质。本发明人最近证明了用JAK抑制剂治疗AA患者会导致毛发再生，其部分归因于CD8+NKG2D+细胞毒性T细胞浸润的清除，但不排除对HF的直接作用(1)。当考虑到AA患者的毛发生长作为两步机制时，以下两个发现是一致的:首先必须消除T细胞介导对上皮细胞的免疫攻击，其次必须重新开始生长期的生长(55)。本发明人观察到用JAK抑制剂进行的局部治疗会导致比AA中的全身治疗更稳健的毛发生长，尤其是因为它增加了HF微环境中药物的局部浓度，使得两种作用发生。在未受影响的个体或正常小鼠中，用JAK抑制剂治疗可足以重新开始毛发周期(在小鼠中)或促进毛发生长(在人中)。
在小鼠中，JAK信号传导的抑制在休止期间激活促生长/抗静止信号(9，56，57)，从而允许重新进入生长期。本发明人观察到含有祖细胞的毛芽区室的激活是JAK-抑制介导的毛发生长的早期现象，并且指出在JAK抑制后，在早期生长期中激活的通路被上调。这些结果表明JAK抑制介导的毛发生长遵循正常的稳态毛发周期增殖模式(16，23)。
上述数据显示，药物治疗后的生长期重新进入发生在小鼠处于中期休止期而不是发生在早期休止期，这表明JAK抑制不能忽略早期休止期中的促进静止的微环境。几个重要的分子现象区分了早期和中晚期休止期。BMP抑制剂和Wnt激动剂在休止期上升，降低了HF干细胞激活所需的阈值(9)。在静止/激活步骤中，真皮乳头中的Tgfβ2和Fgf7/10上调减弱了BMP信号传导，并且有助于早期生长期的开始(23，44)。随着休止期进展，毛芽上调参与进入细胞周期和信号转导的基因(23)。因此，HF干细胞的激活取决于在微环境中达到整体反应状态。
托法替尼治疗上调人DP球体中TGFβ2、BMP6和LEF1的表达，提供JAK抑制激活DP的潜在机制。也就是说，毛发周期的明确激活可能受激活信号和抑制信号的平衡支配，而不受单个细胞类型或输入支配。因此，DP(或毛芽)的JAK抑制可能在休止期的早期阶段被相反的信号缓冲，但是随着环境变得更宽容，信号可以诱导激活。
上述数据表明在人中通过托法替尼治疗的JAK3抑制增加生长期毛干(皮肤移植物和器官培养物测定)的生长速度并且增强人DP球体的诱导性(新生测定)。对托法替尼治疗的分子效应的调查显示，治疗可能导致在培养物中被破坏但存在于完全诱导的DP细胞中的基因子集的分子恢复(图4C，4D)。这一发现表明，托法替尼治疗可以增强如自体细胞移植方法等在脱发治疗中的应用。
材料和方法
研究计划。假设JAK-STAT信号传导的抑制促进进入小鼠的毛发周期。为了确定生长期的启动，用电动剃须刀修整背部皮肤的毛，并通过变黑皮肤的出现和毛发再生来观察HF进入生长期。
对于图1A中描述的毛发周期实验，在每个时间点从2只小鼠取得活检组织，并对3组同窝出生的小鼠重复实验。如图5E所示，通过观察治疗后随着时间推移的皮肤变黑而产生图1B中的图表所呈现的数据。对于补充图1C和图1D中描述的实验，每组使用3-4只小鼠(7周对8.5周)，并且实验重复3次。对于图1B和图5E中描述的实验，用对照(背部皮肤的一半)和鲁索替尼(背部皮肤的一半)治疗4只小鼠，并用对照(背部皮肤的一半)和托法替尼(背部皮肤的一半)治疗4只小鼠。图1E中呈现的实验独立地重复一次，每个条件使用3只小鼠。在图2A中描述的实验中，每个基因型使用3只小鼠，并将实验重复在2组同窝出生的小鼠中。
对来自12只8.5周龄的B6/C57雌性小鼠的全皮肤活体组织进行基因表达谱分析(Gene expression profiling)。在实验的第0天(T0)从背部皮肤取得活体组织。在第1天到第4天每天用DMSO、鲁索替尼和托法替尼治疗小鼠，在第5天(T5)从治疗过的小鼠取得第二次活体组织。质量控制使用来自http://arrayanalysis.org/的affy analysisQC包进行。由于质量控制失败，从进一步的下游分析中去除了两个样品DMSO1T5和RUXO3T5。使用在affyAnalysisQC中执行的GCRMA方法将数据标准化。LIMMA被用于多层次模型，用以鉴定对于每个治疗组(DMSO、RUXO和TOFA)在T5和T0的样品之间差异表达的基因，使用倍数变化＝1.5且P<0.05的阈值。将差异表达分析的结果上载到Ingenuity Pathway Analysis(IPA)中，以鉴定在每个治疗组的差异表达基因的每个列表中过度表达的分子通路。
对于DP球体微阵列分析，从三个不同供体制备细胞，并将Affymetrix人HG-U133PLUS 2.0阵列在CUMC基因组学设施中杂交。如上所述进行质量控制和数据标准化。对于器官培养实验，进行3组重复，每次使用来自单个个体的HF。
小鼠。本研究中的所有野生型小鼠(成鼠和新生鼠)均具有C57/B6背景，在实验室繁殖或者购自杰克逊实验室。用于移植实验的ICR-SCID小鼠(IcrTac:ICR-Prkdcscid)购自Taconic。用于毛发贴片测定的无胸腺裸小鼠购自Charles River。Rag1-/-和Tcrβ/δ-/-小鼠购自杰克逊实验室(编号分别为002216和002122)。所有的动物都保存在哥伦比亚大学AAALAC比较医学研究院。程序通过使用机构动物护理和使用委员会批准的协议而实现。
人标本。从Advanced Bioscience Resources(ABR)Inc.获得用于移植实验的头皮皮肤。收到哥伦比亚大学伦理审查委员会依据45CFR46的豁免后，依照赫尔辛基宣言，从毛发移植手术期间废弃的组织中获得枕部头皮毛囊。
JAK-STAT的药理学抑制剂和本研究中使用的其它药物。鲁索替尼(INCB018424)购自ChemieTek(目录号CT-INCB)。托法替尼购自AbMole BioScience(目录号477600-75-2)。音猬因子激动剂(SAG)购自EMD Millipore(目录号566660)。将JAK-STAT抑制剂溶解于DMSO中，并如所示以2-3％用于体内实验，400nM用于体外实验。如Paladini et al(2)所述，使用120uM的SAG。
抗体和免疫荧光。如前所述(1)进行小鼠皮肤的新鲜冷冻切片的免疫荧光。所有的荧光图像由蔡司(Zeiss)LSR激发共聚焦显微镜拍摄。所有的荧光图像由蔡司Axioplan 2系统拍摄。使用的一级抗体和稀释比例见表1。使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色。
用qPCR阵列分析差异基因表达。根据制造商的说明，通过使用RNeasy Minikit(Qiagen)在指定的时间点从小鼠背部皮肤分离总RNA。每个时间点从3只小鼠收获皮肤，并测试4个时间点(将12只个体小鼠用于分析)。用寡(dT)引物和SuperScript III(Invitrogen)反转录总RNA(2μg)。将来自每个样品所得的cDNA等分成单个JAK-STAT信号传导qPCR阵列(Qiagen/SABioscience目录号PAMM-039，在线提供的基因列表)。该阵列包括与JAK-STAT通路相关的84个基因，加上5个看家基因和质量控制。实时PCR在ABI 7300(Applied Biosystems)上进行。使用由SABioscience提供的RT2Profiler PCR Array数据分析软件进行数据分析。使用ΔΔCt方法确定表达中的倍数变化，并且通过采取每个时间点的3个生物重复中的倍数变化的手段来推导下游分析中使用的值。
GEDI。为了可视化自组织映射算法(self-organizing map algorithm)鉴定的“宏基因(metagenes)”如何跨样品变化，使用相对于出生后第17天(早期休止期)的DDCt执行基因表达动态指数(GEDI)分析，计算平均log2FC的值。宏基因(metagenes)是基因簇，跨样品显示相似的时间表达模式(61)，并被分配到二维网格中的单个像素。相邻的像素表现出彼此相似的表达模式。然后使用R中的格包(lattice package)中的水平图函数渲染自组织图。
增殖实验。在8.5周龄的C57/B6小鼠背部的一半用局部赋形剂对照(左侧)或JAK抑制剂(右侧)治疗。治疗4小时后，每只小鼠接受单次注射20mg/kg的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)(Invitrogen)。注射1小时后，收获皮肤，固定并按照制造商的说明使用Click-iT EdUAlexa Fluor 488成像试剂盒(Life Technologies)染色，且对P-钙粘蛋白进行共染色。实验重复一次，每时间点对1只小鼠进行。
微阵列分析。使用Qiagen RNAeasy显微试剂盒提取总RNA。使用Ovation RNA扩增试剂盒(Nugen)产生用于微阵列分析的扩增cDNA。使用的阵列是在CUMC微阵列设备中杂交的Affymetrix mouse 430 2.0。在ABI 7300循环仪上进行qPCR分析。引物序列见表2。
对于DP球体微阵列分析，使用Qiagen RNAeasy显微试剂盒从三个供体分别在DMSO、鲁索替尼或托法替尼中培养的DP球体中提取总RNA。使用Ovation RNA扩增试剂盒(Nugen)产生用于微阵列分析的扩增cDNA。作为固定效应，LIMMA被用于线性模型，用以治疗治疗和阻断因子(供体)。治疗之间的感兴趣对比用于鉴定DMSO治疗、RUXO治疗和TOFA治疗的治疗对中差异表达的基因。采用绝对倍数变化＝1.5且P<0.05的阈值。对于GSEA，使用从ftp.broad.mit.edu//pub/gsea/annotations/下载的HG_U133_Plus_2.0芯片注释文件来注释Affymetrix ProbeSets，并移除给定基因符号(Gene Symbol)的重复ProbeSets。基于每个基因符号所观察到的最大绝对倍数变化来移除重复。利用LIMMA返回的调整后t统计量(moderated t-statistics)，为每个感兴趣的治疗对比生成预先排序的基因列表。在这些列表上进行GSEA，以识别(鉴定)每个列表中过度表达的KEGG通路(ES p值0.01)。
基因组富集分析。通过产生由差异表达(p值)和倍数变化方向(上或下)排列的所有检测的转录物的列表来进行基因组富集分析(gene set enrichment analysis)，用以比较托法替尼治疗的细胞和对照细胞。如前所述(35)，对此分级表进行了如前所述的区域2和区域4(表3中提供的基因列表)的联合的富集的测试。计算标准化富集得分(NES)及其关联的p值的零分布通过标签改组获得，以随机化基因排序。然后，使用这些随机集来计算5000次迭代中的零富集得分，用以生成零分布。将观察到的前沿富集得分标准化为该分布，并且为该NES产生双尾p值。
人毛囊器官培养分析。如前所述，在无菌条件下从枕部皮肤显微切割成年人毛囊。在补充有氢化可的松、胰岛素和谷氨酰胺的Williams E培养基中(62)，在DMSO、鲁索替尼或托法替尼(400nM)存在下，将各个毛囊置于24孔组织培养板中。每两天更换一次培养基，并且每两天取一个单个毛囊的图像。使用Image J.分析每个毛囊的生长速率。
通过真皮乳头球体进行的贴片测定。如前所述，DP细胞在球体中生长(35)。将DMSO、鲁索替尼或托法替尼加入到培养基(400nM)中。每个悬滴含有1000个细胞，24小时后聚集形成DP球状体。在铺板48小时后，收集每种条件下的500个球体并用于贴片测定。每组实验用源自单个个体的细胞进行，并且进行四个单独的实验。根据Lichti et al(63)概述的方案，从新生小鼠分离角质形成细胞。细胞在dkSFM中培养2-4天，然后收获以用于贴片测定。之后，在每种条件下将1×106个新生小鼠角质形成细胞与500个人DP球体混合在一起，并将其皮下注射到裸鼠的背部皮肤中。注射后12天，在真皮中形成囊肿，其中一些含有HF和毛发纤维。收集这些囊肿并照相，然后在0.35％胶原酶中消化。将消化的浆液涂布在显微镜载玻片上，并在立体显微镜下人工进行毛发纤维计数。
人皮肤移植测定。将直径约2×2cm的人胚胎头皮皮肤(16周龄)移植到SCID小鼠的背部。包扎小鼠，使移植物恢复6周。6周后，可以在移植物上观察到小毛发。每天通过局部施用赋形剂对照、鲁索替尼或托法替尼来治疗移植物。治疗持续4周，每3-5天拍照一次。用来自3个独立供体的皮肤进行实验。
使用ImageJ进行毛发生长的定量。利用供体毛发变黑且移植的小鼠是白色的事实，测量了色素沉着强度以作为HF密度的代表。由于对照和实验性治疗是在同一个移植物上进行的，因此每个图像都可以直接比较赋形剂治疗的皮肤和药物治疗的皮肤。强度在每个图像的三条线上得分并平均以产生图3A和图8A所示的直方图。较暗的区域被赋予比亮区域更低的值。通过平均对照治疗侧的强度值以及通过药物治疗侧的强度值来计算比率，并说明在移植物上毛发生长的预治疗差异和随时间发生的毛发密度的变化。
统计分析。所有测试均使用p＝0.05的显着性水平。对于器官培养纵向研究(图3B和图3C)和皮肤色素沉着研究(图1B)，皆使用R包(package)nparLD进行非参数纵向数据分析，以测试存在时间相互作用的治疗的假设，即时间分布(time profiles)用于比较治疗对是不平行的。在器官培养研究中，采用F1-LD-F1设计。在皮肤色素沉着研究中，在Ruxo对对照和Tofa对对照的比较上使用LD-F2模型，以说明配对设计，而由于数据未配对，因此在Tofa对Ruxo比较上使用F1-LD-F1模型。ANOVA型统计(ANOVA-Type statistic)被测试在α＝0.05时的显著性(随机化完全区组设计(randomized complete block design)用于分析人真皮乳头球体贴片测定法(图3E))。三种治疗方法分别应用于来自三个供体的每个DP球体。供体被视为是一个固定的阻断因子。统计分析的单位是观察到的毛囊的数量。使用线性混合效应模型对数据进行分析，治疗阻断因子供体作为随机效应。使用R包lme4和lmerTest来测试固定因子治疗是否对观察到的数量有显着贡献，并对治疗方式进行事后比较。lmerTest包采用Satterthwaite近似来获得p值和分母自由度。
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6.2实施例2:制瘤素M通过JAK-STAT信号传导促进毛囊干细胞的静止
介绍
JAK-STAT信号传导参与维持小鼠毛发周期的休止期(静止期)中的毛囊干细胞(HFSC)的静止。已经证实，JAK抑制能够在野生型小鼠休止期皮肤中启动毛发生长(1)。利用基因表达和细胞动力学分析显示，在与真皮乳头相邻的次级毛芽(secondary hair germ)中观察到了第一个增生迹象，此过程重现了原生毛发周期的早期现象。表明JAK-STAT信号传导与细胞因子信号传导错综复杂地相关。尤其，细胞因子IL-6家族已经显示出拮抗生长期并促进小老皮肤中的退行期/休止期。在细胞因子IL-6家族中，制瘤素M(OSM)与其它系统中，即肌肉干细胞中维持干细胞的静止有关。使用免疫荧光研究，本发明人发现OSM及其受体(OSM-Rβ)在鼠科毛囊的次级毛芽中的共表达，处于与激活(磷酸化)STAT3和STAT5信号传导分子互补的模式中，表明对OSM在这个区室维持静止方面具有自分泌作用。这些观察结果已经在培养的小鼠角质形成细胞的体外实验中得到证实。通过使用JAK-STAT信号传导组分的时间和空间条件性敲除(spatial conditional knock-outs)以及OSM和OSM-Rβ，本发明人测试了OSM及其受体是否为必需并且足以使次级毛芽和可能的其它HF干细胞中的HFSC维持静止。激活的JAK-STAT信号传导在HFSC促进静止的意外作用，与维持休止期的BMP信号传导和Wnt抑制的通路一致。
结果
在早期和中期休止期(P46、P60)中于HFSC区室检测到磷酸化的STAT3和STAT5蛋白，其在晚期休止期(P80)减少(图9A)。在此期间OSM免疫荧光共定位于HFSC。还发现OSM受体(OSM-Rβ)通过免疫组织化学共定位至HFSC凸起区室(图9B)。所有的图像都以20倍的放大倍率拍摄。在体外培养的角质形成细胞中，在OSM治疗10分钟内，OSM激活STAT1、STAT3和STAT5转录因子，并且这被托法替尼(TOFA)有效地消除(图9C)。用TOFA治疗的体内全皮肤也显示出对STAT3和STAT5激活的有效抑制(图9D)。针对OSM-Rβ的中和抗体每日皮下注射到P60休止期皮肤中诱导局部生长，表明在HFSC区室中的OSM-Rβ激活是必需的，用以在休止期期间维持静止(图9E)。PBS对照和针对IL-6及其受体的中和抗体没有效果(图9E)。图9F显示gp130也在凸起中富集。
在休止期收获的小鼠角质形成细胞的集落形成测定显示OSM对角质形成细胞具有生长抑制作用，其通过添加托法替尼而被部分地逆转(图10A)。此外，注意到单用托法替尼会增加角质形成细胞集落的数量(图10B)，与之前的发现一致(4)。分离在7.5和8.5周时(P56和P60)的第二个休止期中收获的皮肤，并通过qRT-PCR分析表皮和真皮。OSM-Rβ优先由表皮表达，而OSM在真皮中产生(图10C)。OSM产量在P53和P60之间也有所增加。在表皮中，OSM-Rβ在凸起区室富集。进一步表明在休止期间OSM信号传导在这个群维持静止(图10E)。图10F显示了从(5)改编的用于分离CD34+ITGA6+HFSC的小鼠表皮细胞分选策略。在培养的小鼠角质形成细胞中，用20ng/ml的重组小鼠OSM治疗上调OSM-Rβ的表达(图10G)。这表明积极反馈机制维持了HFSC的静止。
重新分析来自先前JAK抑制剂实验(1,2)的微阵列数据，并且JAK抑制剂导致在休止期间治疗的所有小鼠皮肤OSM-Rβ的一致性下调(图11A)。在体内用qRT-PCR证实OSM-Rβ的下调，其中在托法替尼或鲁索替尼治疗的5天期间每天收集所有皮肤的活检组织(图11B)。此外，也在体外培养的小鼠角质形成细胞中发现OSM-Rβ转录的下调(图11C)。用鲁索替尼治疗的来自休止期小鼠皮肤的分选的角质形成细胞也在3天后显示出OSM-Rβ的下调(图11D)。用鲁索替尼(JAK2抑制剂)进行的体内治疗导致早期的STAT3/5抑制之后激活Akt和ERK通路，导致OSM-Rβ的下调(图11E)。上述数据表明在真皮区室中产生的OSM，可能是真皮乳头，使OSM-Rβ参与在凸起中的HFSC，通过抑制生长和分化维持休止期间的静止，同时维持OSM-Rβ表达。JAK抑制可能破坏这个正反馈回路并将毛囊送入生长期。
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Claims (61)

1.一种诱导哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用发生在当所述毛囊处于中期休止期或晚期休止期时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ的基因表达的反义RNA(antisense RNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)，微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述小分子是鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述抑制剂是OSM-Rβ抗体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛发位于所述受试者的头皮或脸上，或者构成受试者的眉毛或睫毛。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛发是鼻毛。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂为局部施用。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂为口服施用。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述抑制剂后，一种或多种毛发生长生物标志物的表达水平被改变。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种毛发生长生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
16.根据权利要求14所述的方法，其中通过定量PCR或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
17.根据权利要求14所述的方法，其中通过酶联免疫吸附测定或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
18.一种促进哺乳动物受试者的毛发生长的方法，所述方法包括向所述受试者的毛囊施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述施用发生在当所述毛囊处于早期休止期以外的时期。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述毛囊处于生长期。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者具有雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ的基因表达的反义RNA(antisense RNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)，微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述小分子是鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述抑制剂是OSM-Rβ抗体。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者是人。
28.根据权利要求18所述的方法，其中所述毛发位于所述受试者的头皮或脸上，或者构成受试者的眉毛或睫毛。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述毛发是鼻毛。
30.根据权利要求18所述的方法，其中所述抑制剂为局部施用。
31.根据权利要求18所述的方法，其中所述抑制剂为口服施用。
32.根据权利要求18所述的方法，其中在施用所述抑制剂后，一种或多种毛发生长生物标志物的表达水平被改变。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
34.根据权利要求32所述的方法，其中通过定量PCR或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
35.根据权利要求32所述的方法，其中通过酶联免疫吸附测定或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
36.一种促进真皮乳头的诱导性的方法，所述方法包括向源自受试者毛囊的真皮乳头三维球体施用治疗有效量的Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR和/或OSM-Rβ抑制剂，其中所述施用发生在将所述真皮乳头三维球体施用于所述受试者之前。
37.根据权利要求36所述的方法，其中随后向所述受试者施用所述真皮乳头三维球体以治疗雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃、头癣、全秃、少毛症、遗传性单纯稀毛症、前额纤维化脱发、瘢痕性脱发、毛发扁平苔癣、环形脱发、疤痕性脱发、非瘢痕性脱发、普秃或化疗引起的脱发。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ的基因表达的反义RNA(antisense RNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)，微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抑制剂是鲁索替尼(INCB018424)。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述小分子是鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述抑制剂是OSM-Rβ抗体。
43.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者是人。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述毛发位于所述受试者的头皮或脸上，或者构成受试者的眉毛或睫毛。
45.根据权利要求36所述的方法，其中所述毛发是鼻毛。
46.根据权利要求36所述的方法，其中所述抑制剂为局部施用。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述抑制剂为口服施用。
48.根据权利要求36所述的方法，其中在施用所述抑制剂后，一种或多种毛发生长生物标志物的表达水平被改变。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
50.根据权利要求48所述的方法，其中通过定量PCR或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
51.根据权利要求48所述的方法，其中通过酶联免疫吸附测定或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
52.一种评估用于诱导或促进哺乳动物受试者的毛发生长的治疗功效的方法，所述方法包括:
(a)确定从受试者获得的毛囊样品中的一种或多种毛发生长生物标志物的水平；以及
(b)在所述治疗的多个时间点中的一个时间点确定从所述受试者获得的毛囊样品中的所述一种或多种毛发生长生物标志物的水平，
其中当所述第二或随后样品中的所述一种或多种生物标志物相对于所述第一样品发生变化时，所述治疗对于诱导或促进所述受试者的毛发生长是有效的。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组:CD34、Lhx2、NFATc1、Axin2、FoxC1、OSMR、OSM、Jak3、FAS、Irf1、Ifnar1、Nr3c1、Stat5A、Il6st、Ptprc、Ghr、IL10ra、Il2rg、Pdgfra、Spfi1、Socs2、Stat5b、Crp、Il4、Prlr、Insr、IL2ra、Cebpd、Stat3、Jak1、Acvr2a、Sfrp4、Sox5、Cdh2、Fzd5、Wif1、Wnt2、Fzd8、Apc、Sox9、Ilk、Shh、Krt25、Dlx2、Prom1、S100a9、Vegfc、Ptgfr、Pdgfrl、Igfbp4、Gli2、Tyrp1、Syt4、Mlana、Pmel、Dct、Tyr、Sos1、Dbf4、Pax3、PIK3ca、Rps6kb1、Mlph和Stx17。
54.根据权利要求52所述的方法，其中通过定量PCR或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
55.根据权利要求52所述的方法，其中通过酶联免疫吸附测定或其变异来检测一种或多种生物标志物的基因表达的改变。
56.一种用于诱导或促进哺乳动物受试者的毛发生长的试剂盒，所述试剂盒包括:
(a)Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR、和/或OSM-Rβ抑制剂；以及
(b)药学上可接受的载体。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、OSM、gp130、LIFR或OSM-Rβ的基因表达的反义RNA(antisense RNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)，微RNA(microRNA)或其变体或修饰体；或小分子。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述抑制剂是鲁索替尼(INCB 018424)。
59.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述抑制剂是托法替尼(CP690550)。
60.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述小分子是鲁索替尼(INCB 018424)、托法替尼(CP690550)、AG490、momelotinib(CYT387)、partcitinib(SB1518)、baricitinib(LY3009104)、fedratinib(TG101348)、BMS-911543、lestaurtinib(CEP-701)、氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、baricitinib、momelotinib、pacritinib、peficitinib、ABT494、AT9283、decernmotinib、filgotinib、gandotinib、INCB39110、PF4965842、R348、AZD1480、BMS911543、cerdulatinib、INCB052793、NS018、C410、CT1578、JTE052、PF6263276、R548、TG02、粉正蚓提取物(lumbricus rebellus extract)、ARN4079、AR13154、UR67767、CS510、VR588、DNX04042、或贯叶金丝桃素(hyperforin)或其组合。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述抑制剂是OSM-Rβ抗体。
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