BR112013009196A2

BR112013009196A2 - usos de polipeptídeo para redução da aquisição de ácido graxo e da ingestão de alimento, bem como para promoção de saciedade relacionados à obesidade

Info

Publication number: BR112013009196A2
Application number: BR112013009196-7A
Authority: BR
Inventors: Jose Leonardo Walewski; Paul David BERK
Original assignee: The Trustees Of Columbia University In The City Of New York
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2020-08-25
Also published as: US20130274181A1; EP2627349A2; CN108404115A; US10912816B2; EP2627349B1; EP2627349A4; WO2012051567A2; ES2564358T3; WO2012051567A8; CN103391784A; WO2012051567A3

Abstract

USOS DE POLIPEPTÍDEO PARA REDUÇÃO DA AQUISIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO E DA INGESTÃO DE ALIMENTO, BEM COMO PARA PROMOÇÃO DE SACIEDADE RELACIONADOS À OBESIDADE. A presente invenção refere-se aos usos de polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 3 para a redução da aquisição de ácido graxo e da ingestão de alimento, bem como para a promoção de saciedade direcionados ao tratamento de obesidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USOS DE

POLIPEPTÍDEO PARA REDUÇÃO DA AQUISIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO E DA INGESTÃO DE ALIMENTO, BEM COMO PARA PROMOÇÃO DE SA- CIEDADE RELACIONADOS À OBESIDADE".

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações menciona- dos aqui são então incorporados a título de referência em sua totalidade. Os relatórios descritivos dessas publicações são incorporados ao presente pe- dido a título de referência em sua totalidade a fim de descrever mais inte- gralmente o estado da técnica como conhecido daqueles versados nela a partirda datada invenção descrita e reivindicada aqui.

A presente invenção refere-se ao material que está sujeito à pro- teção de direitos autorais. O dono dos direitos autorais não tem nenhuma objeção à reprodução de fac-símile por ninguém do documento de patente ou do relatório de patente como ele aparece no arquivo ou registros de pa- tentedo U.S. Patent and Trademark Office, mas de outra maneira reserva qualquer um e todos os direitos autorais.

APOIO DO GOVERNO O trabalho descrito aqui foi apoiado em sua totalidade, ou em parte, pelo National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant Nos. 5SROIDK052401, 3R01DK072526-04S1 e 5RO1DK072526. Desta maneira, o Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A obesidade é uma doença crônica manifestada por um excesso de massa de gordura em proporção para o tamanho do corpo. A obesidade é, de facto, a deposição aumentada de ácidos graxos de cadeia longa (LCFA) (Long Chain Fatty Acids), principalmente na forma de triglicerídeos (TG), em tecidos adiposos e outros. Os indivíduos obesos têm um excesso de gordura corporal com relação à massa corporal magra que pode contribuir para outras doenças.

A obesidade é um dos problemas de saúde pública mais sérios no século 21. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a obesidade atingiu proporções epidêmicas globalmente. Mais de 1 bilhão de adultos estão acima do peso e pelo menos 300 milhões deles são classifica-

: : 2/114 dos como clinicamente obesos. Hoje, um terço dos americanos é considera- do estar acima do peso (Índice de Massa Corporal (BM!) (Body Mass Index) > 25 kg/m). 60% de adultos nos US são obesos ou têm sobrepeso, e a obe- sidade é amplamente reconhecida como o maior mercado farmacêutico no mundo, com poucos fármacos aprovados que não funcionam bem, levando a, no máximo, uma perda de 5-10% em peso, que não é permanente. É a- creditado que predisposição genética aumente significantemente o risco de se tornar obeso, mas detalhes específicos dos cursos envolvidos não foram identificados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Um aspecto da invenção provê métodos para tratamento da o- besidade e um distúrbio associado à obesidade em um indivíduo. Os méto- dos compreendem administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de Spexin, desta maneira tratando a obesidade ou um distúrbio associado à obesidade no indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo é um humano ou animal não humano. Em outra modalidade, o animal não humano é um ca- mundongo, rato, cachorro ou gato. Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo ll, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, cân- cer, síndrome do ovário policístico (PCOS) (Polycystic Ovary Syndrome) ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, sindrome metabólica ou uma combinação de tais distúrbios. Em outras modalidades, o distúrbio relacionado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um dis- túrbio listado aqui. Em modalidades adicionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncer de mama, câncer de colo ou uma combinação de tais cânceres. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivídas tam nm Índica dae Macea Carnnral (BM mainr dae due carcra dae 260

Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duotem um Índice de Massa Corporal! (BM!) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BM!) maior do que cerca de 65 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal maior do que cerca de 70 kg/m?. Em i outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 75 kg/m?. Em uma modalidade, o indivíduo exibe uma diminuição em massa de tecido adiposo após tratamento com Spexin.

Em outramodalidade, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo me- nos cerca de 1 ng/ml no soro.

Em outra modalidade, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 3 ng/ml no soro.

Em uma mo- dalidade adicional, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 10 ng/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 30 ng/ml no soro.

Em outras modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 100 ng/ml no soro.

Em modalidades adicionais, a quan- tidade de Spexin administrada resulta em pelo menos 250 nm/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelomenos cerca de 500 ng/ml no soro.

Em uma modalidade, a Spexin é administrada pelo menos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

Em outra modalidade, Spexin é administrada por pelo menos | semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas, por pelo menos 12 sema- nas nor nelh menn<s 94 semanas 61 DOr pelo menos 48 semanas Em uma menos 1,5 ano, por pelo menos 2 anos, por pelo menos 2,5 anos, por pelo menos 5 anos, por pelo menos 7,5 anos, por pelo menos 10 anos ou por pelo menos 15 anos.

A invenção provê métodos para tratamento da obesidade ou um distúrbio associado à obesidade em um indivíduo.

Os métodos compreen- dem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo um polipeptí- deo compreendendo SEQ ID NO:1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, desta maneira tratando obesidade ou um distúrbio associado à obesidade no indivíduo.

Em uma modalidade, o indivíduo é um humano ou animal não humano.

Em outra modalidade, o animal não humano é um ca- mundongo, rato, cachorro ou gato.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo 1l, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, cân- cer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou uma combinação dos mes- mos.

Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico compreende hipergli- cemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais distúrbios.

Em outras modalidades, o distúrbio relacio- nado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença car- diaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em modalidades adicionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncer de mama, câncer de colo ou uma combinação de tais cânceres.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um —Índicede Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em moda- lidades adicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índi- ce de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice da Macea Carneral (RMh maior de due careca de 560 ko/m2 Em outras moda-

i 5/114 cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalida- des, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 65 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal maior do que cerca de 70 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 75 kg/m?,

Um aspecto da invenção provê métodos para promoção de saci- edade em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio re- lacionado à obesidade, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de Spexin, desta maneira promovendo saciedade em um indivíduo obeso.

Em uma modalidade, o indivíduo é um humano ou ani- mal não humano.

Em outra modalidade, o animal não humano é um camun- dongo, rato, cachorro ou gato.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo Il, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, cân- cer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou uma combinação dos mes- mos.

Em outras modalidades, o distúrbio relacio- nado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença car- díaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em modalidades adicionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncerde mama, câncer de colo ou uma combinação de tais cânceres.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em moda- lidades adicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m”. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índi- na da Massa finrmnaralt SBAMY nina Ao no Áaaraa da AR Laf2 1 suis que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras moda- lidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de

Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalida- des, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 65 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal maior do que cerca de 70 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví-

duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 75 kg/m? Em uma modalidade, o indivíduo mostra um aumento em massa de tecido adiposo após tratamento com Spexin.

Em outra modalidade, a quanti- dade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 1 ng/ml no soro.

Em uma modalidade adicional, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 10 ng/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quantidade de Spexin adminis- trada resulta em pelo menos cerca de 30 ng/ml no soro.

Em outras modali- dades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 100 ng/ml no soro.

Em modalidades adicionais, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 250 ng/ml no soro.

Em algu- mas modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo me-

nos cerca de 500 ng/ml no soro.

Em uma modalidade, a Spexin é adminis- trada pelo menos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

Em outra modalidade, Spexin é administrado por pelo menos 1 semana, por pelo

—menos2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas, por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 24 semanas ou por pelo menos 48 semanas.

Em uma modali- dade adicional, Spexin é administrado por pelo menos 1 ano, por pelo me-

—nos1,5ano, por pelo menos 2 anos, por pelo menos 2,5 anos, por pelo me- mm E mamma mar enmnin emamemna E anna mnmr mamnim ernamo Aff amnmo mu amar mala

A invenção provê ainda métodos para promoção de saciedade em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade, o método compreendendo administrar a um indivíduo com ne- cessidade do mesmo um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1, ou um — salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, desta maneira promovendo sa- ciedade em um indivíduo obeso.

Em uma modalidade, o indivíduo é um ani- mal humano ou não humano.

Em outra modalidade, o animal não humano é um camundongo, rato, cachorro ou gato.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hiper- tensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, dia- betes mellitus tipo Il, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, ' câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou uma combinação dos : mesmos.

Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico compreende hi- perglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais distúrbios.

Em outras modalidades, o distúrbio rela- cionado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em moda- lidades adicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Um aspecto da invenção também provê um método de promo- ção de perda em peso em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

O método compreende: a) administrar a um indivíduo de uma quantidade eficaz de Spexin; e b) determinação de se Spexin diminui a massa do corpo do indivíduo comparado com a massa do corpo do indivíduo antes do tratamento com Spexin, desta maneira promo- vendo narda em nesoe n6 indivídiio obese eu no indivíduo afliaido com 1m

: 8/114 mano ou animal não humano.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hiper- tensão, falência cardíaca congestiva, uma distúrbio relacionado a lipídeo,

diabetes mellitus tipo Il, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou combinações dos mesmos.

Em outras modalidades, o distúrbio rela-

cionado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI)

—maiordo que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal! (BM!) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em moda- lidades adicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índi-

ce de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras moda- lidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de

duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 75 kgum?. Em uma modalidade, o indivíduo exibe uma diminuição em massa de táanrido adinnen anée tratamento cenAm Shravin Em cutra modalidade 2a miiantic i 9/114 soro.

Em modalidades adicionais, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos 250 ng/ml no soro.

Em algumas moda- lidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 500 ng/ml no soro.

Em uma modalidade, Spexin é administrado pelo me- nos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

Em outra modalida- B de, Spexin é administrado por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 se- manas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelomenos 10 semanas, por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 24 semanas ou por pelo menos 48 semanas.

Em uma modalidade adicional, Spexin é administrado por pelo menos 1 ano, por pelo menos 1,5 ano, por pelo menos 2 anos, por pelo menos 2,5 anos, por pelo menos 5 anos, por pelo menos 7,5 anos, por pelo menos 10 anos ou por pelo menos 15 anos.

Um aspecto da invenção provê métodos de promoção de perda em peso em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

Os métodos compreendem: a) administrar a um in- divíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapêutica de um po- lipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1 ou um sal farmaceuticamente acei- tável do mesmo; e b) determinação de se o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1 diminuiu a massa corporal do indivíduo comparado com a massa corporal do indivíduo antes do tratamento com polipeptídeo compre- endendo SEQ ID NO:1, desta maneira promovendo perda em peso no indi- víduo obeso ou no indivíduo afligido com um distúrbio relacionado à obesi- dade.

Em uma modalidade, o indivíduo é um humano ou animal não huma- no Em autra maedalidada &- animal não humano é 11969 GamuhAAANAN rata obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardí- aca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo |, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou combinações dos mesmos.

Em algumas moda- lidades,o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insu- lina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais dis- túrbios.

Em outras modalidades, o distúrbio relacionado a lipídeo compreen- de aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipide- mia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em modalidades adi- cionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncer de mama, câncer de colo ou uma combinação de tais cânceres.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em modalidades adicionais, o in- — divíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BMI) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 65 kg/m? Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral maior do que cerca de 70 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 75 kg/m?. Um aspecto da invenção provê métodos de diminuição de níveis de Leptina no soro em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

Os métodos compreendem: a) administrar a em E Es EE a nai o AEE ai Ei AI Dia maria nm Ri AIEA As A Cima de Leptina no soro do indivíduo antes do tratamento com Spexin, desta ma-

neira diminuindo os níveis de Leptina no soro no indivíduo obeso ou no indi- víduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

Em uma modalida-

de, o indivíduo é um humano ou animal não humano.

Em outra modalidade,

oanimalnão humano é um camundongo, rato, cachorro ou gato.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo !l, doença da vesícula biliar, os- teoartrite, apneia do sono, câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais distúrbios.

Em outras modalidades, o distúrbio relacionado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por

HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um dis-

túrbio listado aqui.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 25 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em modalidades adicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo-

ral (BMI) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví-

duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo-

ral (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví-

duo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo-

ral (BMI) maior do que cerca de 65 kg/m?. Em outras modalidades, o indiví-

maior do que cerca de 75 kg/m?. Em uma modalidade, o indivíduo mostra uma diminuição em massa de tecido adiposo após tratamento com Spexin.

Em outra modalidade, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 1 ng/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quanti- dade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 30 ng/ml no soro.

Em outras modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelomenos cerca de 100 ng/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quantidade de Spexin adminis- trada resulta em pelo menos cerca de 500 ng/ml no soro.

Em uma modalida- de, Spexin é administrado pelo menos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

Em outra modalidade, Spexin é administrado por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas, por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 24 semanas ou por pelo menos 48 semanas.

A invenção provê um método de diminuição dos níveis de Lepti- nanosoroem urnm indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

O método compreende: a) administrar a um indiví- duo com necessidade do mesmo uma quantidade terapêutica de um polipep- tídeo compreendendo SEQ ID NO:1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e b) determinar se o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1 diminuiu os níveis de Leptina no soro do indivíduo comparado com os níveis soro no indivíduo obeso ou no indivíduo afligido com um distúrbio relaciona- do à obesidade.

Em uma modalidade, o indivíduo é um humano ou animal não humano.

Em outra modalidade, o animal não humano é um camundon- go, rato, cachorro ou gato.

Em uma modalidade adicional, o distúrbio associ- adoà obesidade compreende um distúrbio metabólico, hipertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo Il, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, câncer, sin- drome do ovário policístico (PCOS) ou combinações dos mesmos.

Em algu- mas modalidades, o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resis- tênciaà insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais distúrbios.

Em outras modalidades, o distúrbio relacionado a lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combinação de um distúrbio listado aqui.

Em modalida- | des adicionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncer de mama, câncer de colo ou uma combinação de tais cânceres.

Em algumas modali- dades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 25 kg/m”. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 30 kg/m?. Em modalidades a- dicionais, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 35 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 40 kg/m?. Em outras modalida- des, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 45 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BM!) maior do que cerca de 50 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 55 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- ral (BM!) maior do que cerca de 60 kg/m?. Em outras modalidades, o indivi- duo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 65 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem um Índice de Massa Corpo- —ralmaior do que cerca de 70 kg/m?. Em outras modalidades, o indivíduo tem

RR e A ERRO o eo o massa de tecido adiposo após tratamento com Spexin.

Em outra modalida- de, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 1 ng/ml no soro.

Em uma modalidade adi- cional, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de ng/ml no soro.

Em algumas modalidades, a quantidade de Spexin admi- nistrada resulta em pelo menos cerca de 30 ng/ml no soro.

Em outras moda- lidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo menos cerca de 100 ng/ml no soro.

Em modalidades adicionais, a quantidade de Spexin 10 administrada resulta em pelo menos cerca de 250 ng/ml no soro.

Em algu- mas modalidades, a quantidade de Spexin administrada resulta em pelo me- nos cerca de 500 ng/ml no soro.

Em uma modalidade, Spexin é administrado pelo menos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

Em outra modalidade, Spexin é administrado por pelo menos 1 semana, por pelo me- nos2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 se- manas, por pelo menos 10 semanas, por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 24 semanas ou por pelo menos 48 semanas.

Em uma modalidade adicional, Spexin é administrado por pelo menos 1 ano, por pelo menos 1,5 ano, por pelo menos 2 anos, por pelo menos 2,5 anos, por pelo menos 5 anos, por pelo menos 7,5 anos, por pelo menos 10 anos ou por pelo menos

15 anos.

Um aspecto da invenção provê métodos para detecção da pre- sença de ou uma predisposição à obesidade ou um distúrbio associado à — obesidade em um indivíduo humano.

Os métodos compreendem: a) obten- ção de uma amostra biológica de um indivíduo; e (b) detecção de se há ou não uma alteração na expressão do gene da Assinatura de Obesidade (OS) (Obesity-Signature) no indivíduo comparado com um indivíduo não afligido com obesidade ou um distúrbio associado à obesidade.

Em uma modalida- de, ogeneda Assinatura de Obesidade compreende qualquer gene indicado O A ER E A O E a A ds ção de tais.

Em algumas modalidades, o gene da Assinatura de Obesidade (OS) compreende qualquer gene indicado como sendo diferentemente ex- presso (por exemplo, sub-regulado ou suprarregulado) em qualquer uma das Tabelas 7-8, e/ou Spexin, ou uma combinação de tais.

Em uma modalidade, odistúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hi- pertensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, diabetes mellitus tipo Il, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou combinações dos distúrbios listados.

Em outra modalidade, o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação de tais listados.

Em algumas modalidades, o distúrbio relacionado a lipídeo compreende aterosclerose, doença cardíaca coronária, dislipidemia, lipodistrofia por HIV ou uma combinação dos distúrbios listados aqui.

Em modalidades adicionais, o câncer compreende câncer endometrial, câncerde mama, câncer de colo ou uma combinação dos cânceres listados.

Em uma modalidade, a detecção compreende determinação na amostra se expressão de pelo menos 2 genes da OS, pelo menos 3 genes da OS, pelo menos 4 genes da OS, pelo menos 5 genes da OS, pelo menos 6 genes da OS, pelo menos 7 genes da OS, pelo menos 8 genes da OS, pelo menos 9 genesda OS ou pelo menos 10 genes da OS indicados como sendo diferen- temente expressos (por exemplo, suprarregulados ou sub-regulados) em qualquer uma das Tabelas 7-8, e/ou Spexin, ou uma combinação de tais, foi diminuída comparado com expressão em uma amostra normal.

Em outra modalidade, a detecção compreende determinação na amostra de se ex- pressão de pelo menos 2 genes da OS, pelo menos 3 genes da OS, pelo menos 4 genes da OS, pelo menos 5 genes da OS, pelo menos 6 genes da OS, pelo menos 7 genes da OS, pelo menos 8 genes da OS, pelo menos 9 genes da OS ou pelo menos 10 genes da OS indicados como sendo diferen- temente expressos (por exemplo, suprarregulados ou sub-regulados) em — qualquer uma das Tabelas 7-8, ou uma combinação de tais tabelas indica- E a a a am A a a aa a ae al RA o mA na NA ama AAA aro nba a rs anca E pressão de pelo menos 2 genes da OS, pelo menos 3 genes da OS, pelo menos 4 genes da OS, pelo menos 5 genes da OS, pelo menos 6 genes da OS, pelo menos 7 genes da OS, pelo menos 8 genes da OS, pelo menos 9 genes da OS ou pelo menos 10 genes da OS indicados como sendo diferen- temente expressos (por exemplo, subrregulados ou suprarregulados) em qualquer uma das Tabelas 7-8, ou uma combinação das mesmas, é aumen- tada comparado com a expressão em uma amostra normal. Em uma moda- lidade adicional, a detecção compreende determinação na amostra de se expressão de pelo menos 2 genes da OS, pelo menos 3 genes da OS, pelo menos 4 genes da OS, pelo menos 5 genes da OS, pelo menos 6 genes da OS, pelo menos 7 genes da OS, pelo menos 8 genes da OS, pelo menos 9 genes da OS ou pelo menos 10 genes da OS indicados como sendo diferen- i temente expressos (por exemplo, subrregulados ou suprarregulados) em qualquer uma das Tabelas 7-8, e/ou Spexin, ou uma combinação das mes- mas indicadas, é diminuída comparado com expressão em uma amostra normal. Em algumas modalidades, a detecção compreende sequenciamento de gene, hibridização seletiva, amplificação seletiva, análise de expressão de gene ou uma combinação de um método indicado. Em outras modalida- des, a amostra compreende tecido adiposo subcutâneo, tecido adiposo o- mental, sangue integral, plasma, soro, células brancas sanguíneas ou tecido adiposo mesentérico.

Um aspecto da invenção provê um estojo de diagnóstico para determinação de se uma amostra de um indivíduo exibe expressão maior ou menor de pelo menos 2 ou mais genes da OS, o estojo compreendendo pri- —mers de ácido nucleico que hibridizam especificamente para um gene da OS, onde o primer vai iniciar uma reação de polimerase apenas quando um gene da OS em qualquer uma das Tabelas 7-8, e/ou Spexin, estiver presen- te.

Um aspecto da invenção provê métodos para identificação de um composto de modulação de Spexin útil para tratamento de obesidade ou O A A CR E A A RS e IR Rg de obesidade ou um distúrbio relacionado à obesidade; e (b) determinação de se o agente de teste alterou os níveis de Spexin no soro, níveis de Lepti- na no soro, um fenótipo em peso corporal, ou uma combinação dos mes- mos, comparado com um camundongo na ausência do agente de teste, des- tamaneira identificando um composto útil para tratamento de obesidade ou um distúrbio relacionado à obesidade. Em uma modalidade, os níveis de Spexin no soro são altos. Em outra modalidade, os níveis de Leptina no soro são altos. Em uma modalidade adicional, o fenótipo em peso corporal é uma diminuição em massa de tecido adiposo. Em algumas modalidades, o agen- te de teste compreende um polinucleotídeo, molécula orgânica pequena, uma molécula inorgânica pequena, um peptídeo solúvel ou um anticorpo. Em outras modalidades, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína Spexin ou um fragmento da mesma. Em modalidades adicionais, o polinu- cleotídeo é um RNA de antissentido que inibe especificamente expressão de ' 15 um gene da Spexin que codifica uma proteina Spexin. Em algumas modali- . dades, o polinucleotídeo é um siRNA que se direciona especificamente a um gene da Spexin que codifica uma proteína Spexina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Para se conformar às exigências dos pedidos de patente PCT, muitasdas figuras apresentadas aqui são representações em preto e branco de imagens originalmente criadas coloridas. Nas descrições e exemplos a- baixo, os gráficos coloridos são descritos em termos de sua aparência em preto e branco. As versões originais coloridas podem ser vistas em Walewski e outros, Obes. Surg. 20 de janeiro de 2010;20(1):93-107, cujos teores são aquiincorporados a título de referência.

A Figura 1 é um gráfico log-log de diferenças de expressão de gene entre gorduras normal e obesa. Os pontos de dados representam as razões de expressão médias (gordura de normal [n=8] vs. obesa [n=12]). Os pontos coloridos representam genes que têm diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) em valores de expressão entre conjuntos de amostra cinzas representam dados não significantes). Ch12;0rf39 é Spexin. A Figura 2 é um gráfico de expressão de gene Spexin (Ch12,0rf39) mostrando que ele é sub-regulado 14,8 vezes em gordura de obesos vs. gordura de normais. Os dados representam média mais SEM.

A Figura 3 é um alinhamento múltiplo de homólogos de Spexin de várias espécies. O Genebank foi pesquisado quanto à Spexin humana (NP 085049; SEQ ID NO:26) e homólogos relacionados [chimpanzé (XPO01144591; SEQ ID NO:27), canina (XP 853311; SEQ ID NO:28), bovi- na (NP 001068875; SEQ ID NO:29), camundongo (XP 620381; SEQ ID NO:30) e rato (XP 001076968; SEQ ID NO:31)]. O histograma na parte su- perior de cada painel indica o grau de identidade da coleção da maioria das sequências em cada posição de resíduo (barras mais altas = identidade maior). O sombreamento amarelo dentro do alinhamento indica os resíduos de aminoácido que são compatíveis com a maioria da sequência em cada | 15 posição. As sequências de aminoácido foram alinhadas usando a função Clustal W de MegAlign (DNAstar). Os parâmetros de alinhamento de se- quência foram; penalidade de lacuna (10), penalidade de comprimento de lacuna (0,20), sequências divergentes de retardo (30%) e peso de transição de DNA (0,50).

A Figura 4 mostra uma curva padrão de imunoensaio de enzima Spexin (EIA) (Enzyme Immunoassay). Uma série de diluição de padrões de Spexin conhecidos é desenhada em gráfico contra seus valores OD corres- pondentes para gerar uma curva padrão para quantificação precisa.

A Figura 5 é um gráfico de barras mostrando que as concentra- ções de Spexin no soro são menores em pacientes obesos. Os níveis de Spexin no soro foram ensaiados através de EIA de competição de antígeno em amostras de soro humano de indivíduos obesos e em peso normal; (o- beso; n = 7; 1,11 +/- 1,67) vs. (normal; n=7; 11,60 +/- 3,20), (p<0,000461, pelo teste T, bilateral com variância igual). Os dados representam média +/- — Desvios padrãoem ng/mL.

níveis de Leptina no soro foram medidos através de ELISA de captura de antígeno; obeso n=7 (0,69 +/- 0,22) vs. normal n=6 (0,15 +/- 0,15), (p=0,0099, pelo teste T, bilateral com variância igual). Os dados represen- tam ODs médias +/- Desvio padrão, respectivamente.

A Figura 7 é um gráfico mostrando a relação entre níveis de Lep- tina e Spexin no soro de pacientes obesos (n=7) e em peso normal (n=6). ODs (ordenadas) de Leptina foram representadas em gráfico contra Spexin [ng/mL] (abscissa) para cada amostra de paciente. A correlação negativa (- r1=0,9444) observada entre os dois peptídeos em circulação é bem forte, com umRºde0o,8919.

A Figura 8 é um gráfico de barras mostrando que as razões de Spexin vs. Leptina no soro distinguem pacientes Obesos vs. Peso normal. As razões de Spexin para Leptina são representadas em gráfico para cada paciente. Razões de obeso (n=7, vermelho) variam de a partir de 0 a 6,1 e ' 15 em pacientes normais (n=6, azul) as razões variam de a partir de 19 a 240, " com a maioria maior do de 150. A Figura 9 é um gráfico de barra mostrando que Spexin é sub- regulada 14,8 vezes em gordura de obesos vs. gordura de normais. Spexin é referida como "Peptídeo A".

A Figura 10 é um gráfico de barra de níveis de Leptina no soro. Os níveis de Leptina no soro foram medidos através de imunoensaio nos mesmos pacientes normais (8,53 +/- 7,55) e obesos (37,42 +/- 11,56) (p,0,01, pelo teste t, bilateral). Os dados representam média +/- Desvio pa- drão.

A Figura 11 mostra um esquema de um modelo de acúmulo de Ácido Graxo de Cadeia Longa (LCFA) (Long Chain Fatty Acid) em Adipósitos de Obesos. Nos adipócitos de indivíduos em peso normal (Figura 11A), ab- sorção de LCFA (incluindo transporte facilitado) e degradação (incluindo B- oxidação em adipócitos) estão em equilíbrio, sem nenhum ganho ou perda líquida de LCFA. Como resultado, com o tempo, a quantidade relativa de

(conforme demonstrado em estudos de absorção discutidos aqui) e B- oxidação e metabolismo de ácido graxo reduzidos (indicados pelos estudos de expressão) leva a um acúmulo de LCFAs nesses adipócitos com o tem- po, resultando em adipócitos grandes e obesidade.

A Figura 12 é um esquema mostrando Complexos |-V do curso de fosforilação oxidativa (Ox-Phos) (Oxidative Phosphorylation). Esses cinco complexos do curso de Ox-Phos são responsáveis pela geração de ATP da energia liberada pelo ciclo de ácido cítrico. As subunidades principais de ca- da complexo são desenhadas no diagrama e caixas indicando enzimas- chave são marcadas com o número de classificação EC apropriado. Cai- xas/números EC destacados em vermelho indicam enzimas que são diferen- | temente expressas em obesidade. Um resultado notável é que os oito genes : que são coordenadamente subrregulados são distribuídos em todos os cinco complexos (Walewski e outros; 2010). Um ponto-chave a considerar é que diferenças de 15-50% em expressão de gene (supondo que a proteína caia . uma quantidade correspondente) podem não ser consideradas tão importan- tes em termos de resultado final a menos que essas sejam enzimas de limi- tação de taxa. Embora a proteína total possa ser inferior, há geralmente ca- pacidade funcional em excesso, supondo que distribuição de enzima ou fun- ções correguladoras não sejam importantes para essas proteínas em solu- ção. No entanto, neste caso, as proteinas em questão são membros de complexos de ligação à membranas grandes, onde a estequiometria correta das proteínas indivíduais na arquitetura geral do complexo é muito importan- te. Uma redução de 15-50% na quantidade de uma proteina individual pode- riaser razoavelmente esperada afetar as propriedades estruturais e, conse- quentemente, funcionais, do complexo. Ainda mais notável é a redução co- ordenada na expressão de genes-chave em cada um dos 5 complexos da cadeia de transporte de elétron. A Figura 13 é um gráfico mostrando Curvas de Absorção de Áci- do Graxo. Absorção de ácido oleico [º*H] por adipócitos omentais foi estuda- E EE A E E a A BNAES A A a US AA DRA Ramal fama função saturável mais uma não saturável da concentração de ácido oleico não ligado. Não houve nenhuma sobreposição entre os dois grupos.

A Figura 14 mostra comparações de expressão de mRNA de gordura omental de obeso vs. normal (Coorte 1). Os níveis de expressão de aproximadamente 9.200 genes foram investigados por microdisposição. A Figura 14A mostra um gráfico Log-Log de todos os genes ensaiados neste estudo. Médias de cada ponto de dado são apresentadas como um gráfico de difração (n=3 em cada grupo, obeso vs. normal). Dados de expressão relativa para 566 genes estatisticamente significantes (p<0,05, mudança de 1,2vezou maior em expressão) são apresentados em colorido (vermelho = para cima, azul = para baixo). "Vermelho" é mostrado como círculos cinza ' escuro para a parte superior dos círculos cinza claro (acima e para a es- | querda da linha-de-identidade [45º]). "Azul" é mostrado como círculos cinza escuro para a parte inferior dos círculos cinza claro (para baixo e para a di- reitada linha-de-identidade [45º]). A Figura 14B mostra uma vista detalhada : de uma seção representativa de gráfico de difração (quadrado cinza escuro centrado na Figura 14A). Pontos de dados em vermelho (para cima em obe- so) e azul (para baixo em obeso) são estatisticamente significantes, enquan- to pontos de dados não significantes são representados como círculos cin- zas. "Vermelho" é mostrado como círculos cinza escuro para a parte superi- or dos círculos cinza claro. "Azul" é mostrado como círculos cinza escuro para a parte inferior dos círculos cinza claro. A Figura 14C mostra gráficos de caixa de quartil de médias de todos os genes em normal (N = 3) vs. obe- so (N = 3). Similaridades notáveis existem entre os dois grupos.

A Figura 15 mostra gráficos de barra da expressão de dodece- nNoil-COA isomerase (DCI) em amostras de gordura omental normal vs. obe- sa. Expressão de mRNA de DCI em gordura de obeso é reduzida versus gordura controle. No Coorte 1, mMRNA de DCI em depósitos de gordura o- mental de indivíduos normais e obesos demonstra uma subexpressão de 1,59 vez em paciente obesos (Figura 15A), enquanto no Coorte 2 (Figura so.

A Figura 16 mostra gráficos de barra mostrando que dois genes da adenilato ciclase que estão envolvidos em estimulação hormonal de lipó- lise são subexpressos em gordura omental obesa. Adenilato Ciclase 6 é uma enzima associada à membrana e catalisa a formação do monofosfato de adenosina cíclico (CAMP) (Cyclic Adenosine Monophosphate) mensageiro secundário. Este gene foi 1,78 vez subexpresso em gordura omental obesa no coorte 1 (Figura 16A) e 1,64 subexpresso em amostras do coorte 2 (Figu- ra 16B). Receptor 1 de peptídeo de ativação de Adenilato Ciclase é uma pro- teína associada à membrana e compartilha homologia significante com membros da família de receptor de glucagon/secretina. Este receptor faz a Ú mediação de diversas ações biológicas de polipeptídeo 1 de ativação de a- denilato ciclase e é positivamente acoplado à adenilato ciclase. Este gene foi 1,74 vez subexpresso em gordura omental obesa no coorte 1 (Figura 16C) e i 15 1,18 vez subexpresso nas amostras do coorte 2 (Figura 16D).

: A Figura 17 é um gráfico de barras mostrando as validações bio- lógica e técnica de resultados de expressão de gene-chave no Coorte 1 pela Microdisposição Alternativa e qRT-PCR no Coorte 2. Genes-chave que fo- ram subexpressos em gordura omental obesa no Coorte 1 foram seleciona- dos para teste de repetição nas amostras de Coorte 2. Validações biológica e técnica foram obtidas noC 2 por ambas análises de microdisposição alter- nativa e gRT-PCR. A razão de expressão de gene em gordura de obeso vs. normal nas amostras do Coorte 2 é apresentada para cada um dos 7 genes identificados como subrregulados em obesidade no estudo de Coorte 1 ori- ginalda requerente. Os novos resultados da requerente mostram que todo os 7 genes são novamente subexpressos em gordura omental de obeso nas amostras do Coorte 2 (n=7) vs. controles em peso normal (n=4). É notável que para 5 de 7 genes ensaiados por ambas as tecnologias, as razões de expressão relativa estejam dentro de 10% uma da outra. Os genes ilustrados são ECHD (Enoil Coenzima A hidratase (Enoyl Coenzyme A hydratase));

rase)); ATPSD (ATP sintase mito F1); CYCI (citocroma c-1); NDUFS7 (NADH desidrogenase Fe-S); COXA4II (Citocroma c IV).

A Figura 18 mostra gráficos do efeito de Injeção de Spexin diária sobre pesos de camundongo com Dieta-Para-Índice de Gordura Alto. Os doisgruposde camundongos com Obesidade Induzida por Dieta (DIO) (Diet Induced Obesity), alojados sob condições normais e alimentados com uma ração especial com aproximadamente 60% de calorias como gordura, foram injetados diariamente por 6 dias com 0,2 ml ou de veículo PBS 1x (n=5) ou Spexin contendo PBX 1x em uma concentração de 2500 ng/mL (n=5). A Fi- gura18Aé um gráfico mostrando os pesos corporais médios por dia de ca- mundongos DIO injetados com PBS. Os camundongos DIO injetados com PBS continuaram a ganhar peso. A Figura 18B é um gráfico mostrando pe- | sos corporais médios de camundongos injetados com Spexin. Os camun- : dongos estão perdendo aproximadamente 0,3 g em peso corporal por dia.

Deixando de lado o peso corporal do dia 2, os dias restantes mostram uma correlação negativa clara entre dia de dosagem e peso corporal (r=-0,999).

A Figura 19 é um gráfico mostrando uma comparação de 2 gru- pos de camundongos C57BL/6J obesos, alimentados com dieta com alto teor de gordura (HFD) (High Fat Dief). Um grupo, com um peso inicial médio de42 gramas, foi tratado com injeções intraperitoneais diárias de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Phosphate Buffered Saline) mais al- bumina de soro bovino (BSA) (Bovine Sorum Albumin). O segundo, com um peso inicial médio do e 46 gramas, recebeu injeções de Spexin diárias (Pep- tídeo A) em PBS 1X mais BSA 0,05% em uma dose prevista minimizar ga- nhoem peso ou manter peso corporal. O grupo de PBC continuou a ganhar peso rápido; o grupo de Spexin ganhou peso muito mais lentamente. As cur- vas em peso dos 2 grupos cruzaram em 6 semanas de tratamento. Os ani- mais foram sacrificados em 7 semanas, momento quando os pesos médios dos dois grupos não eram diferentes.

A Figura 20 é um esquema de expressão de mRNA de Spexin limitada a alguns tecidos (por exemplo, núcleos do SNC, músculo esqueletal, linfoma de Burkit [Daudi] e tecido adiposo). A expressão de Spexin é baixa na maioria dos tecidos humanos através de análise de microdisposição Affymetrix.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção provê, em parte, o encontro de genes que são dife- rentemente expressos em gorduras obeso e normal, provendo a base para Assinaturas da Obesidade (OSs) que podem ser usadas como alvos tera- pêuticos para obesidade. Esses estudos de expressão de gene em gordura de obeso humano, então, podem ser usados para identificar alvos terapêuti- cos usando modelos animais de obesidade. Uma vez identificados os alvos, as Assinaturas de Obesidade podem ser usadas para métodos de diagnósti- ' co e tratamento para obesidade e distúrbios associados à obesidade. Em uma modalidade, genes compreendendo uma Assinatura de Obesidade compreendem aqueles genes listados na Tabela 7 e na Tabela 8, Spexin, ou ' uma combinação dos mesmos.

A invenção provê métodos para administração de Spexin ou um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1, ou um derivado de Spexin, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um indivíduo obeso para tratar obesidade ou um distúrbio associado à obesidade. A invenção também provê métodos para administração de Spexin ou um polipeptídeo compreen- dendo SEQ ID NO:1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade e fim de promover perda em peso no indivíduo. A invenção provê —aindamétodos para administração de Spexin ou um polipeptídeo compreen- dendo SEQ ID NO:1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade para promover saciedade no indivíduo. A invenção também provê métodos para detecção da presença ou uma predisposição à obesidade ou um distúrbio associado à obesidade em um indivíduo humano. A invenção uma amostra de um indivíduo exibe expressão alta ou baixa de pelo menos 2 ou mais genes da Assinatura de Obesidade (OS). A invenção provê ainda métodos para identificação de compostos úteis para tratamento de obesida- de ou um distúrbio associado à obesidade em um indivíduo.

— Obesidade e Distúrbios Associados à Obesidade A obesidade é caracterizada por gordura corporal em excesso e é uma doença crônica causando um impacto significante sobre a qualidade de vida, produtividade e estado sócio-econômico. Uma pessoa de tamanho normal tem entre 30 e 35 bilhões de células de gordura. Quando uma pes- soa ganha peso, essas células de gordura aumentam primeiro de tamanho e então em número. A obesidade é, de facto, a deposição alta de ácidos gra- ' xos de cadeia longa (LCFA), principalmente na forma de triglicerídeos (TG), em tecidos adiposos e outros. Embora LCFA tenha sido uma vez acreditado entrar nas células exclusivamente através de difusão passiva através de membranas plasmáticas, o fato que TG acumula em sítios específicos indi- cou que absorção de LCFA celular envolve mecanismos reguláveis, especí- ficos.

A obesidade foi mostrada aumentar o risco de hipertensão, disli- pidemia (colesterol! total alto ou níveis altos de triglicerídeos), diabetes tipo |, doença cardíaca coronária, acidente vascular cerebral, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono e alguns cânceres (por exemplo, câncer endometrial, câncer de mama e câncer de colo). Em uma modalidade, um distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, hiper- tensão, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado a lipídeo, dia- betes mellitus tipo ll (Diabetes Mellitus Não Insulino Dependente, NIDDM (Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus)), doença da vesícula biliar, osteo- artrite, apneia do sono, câncer, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o dis-

adicional, o câncer compreende câncer endometrial, câncer de mama, cân- cer de colo ou uma combinação dos mesmos.

A obesidade ocorre quando um indivíduo tem peso e massa cor- poral, particularmente de tecido de gordura, acima de padrões atualmente aceitos.

O índice de massa corporal (BMI; kg/m?) provê uma medição de ní- vel de população útil de obesidade que pode ser usado para estimar a pre- valência de obesidade dentro de uma população e os riscos associados com ela.

Por exemplo, um indivíduo é obeso com um BMI acima do padrão atu- almente aceito.

Quando um indivíduo é um humano, os padrões atuais para ambos os homens e as mulheres aceitos como "normais" são um BMI de cerca de 20 kg/m? a cerca de 24,9 kg/Im?. Em uma modalidade, um indivíduo : obeso tem um BMI de 25 kg/m? ou maior.

Em outra modalidade, um indiví- duo obeso tem um BM! de cerca de 30 kg/m? ou maior.

Em modalidades a- dicionais, o indivíduo obeso tem um BM! de cerca de 40 kg/m? ou maior.

Em algumas modalidades, o indivíduo é obeso quando ele pesa mais de 120% do peso corporal normal para sua idade e altura.

Mesmo obesidade leve, 20% acima do peso desejável de acordo com os gráficos de altura-peso pa- drão, pode aumentar o risco de doença, tais como os distúrbios associados à obesidade descritos aqui, e morte prematura.

Pesos corporais normais variam dentre espécies e indivíduos com base na altura, constituição do cor- po, estrutura óssea e sexo.

Um indivíduo, de acordo com a invenção, inclui, mas não está limitado a, um animal humano ou não humano, tal como um primata, um cachorro, um gato, uma vaca, um cavalo, um coelho, um maca- co, um camundongo, um rato, um porco, uma ovelha ou uma cabra.

Modelos de Camundongo de Obesidade e Distúrbios Associados à Obesi- dade Vários modelos animais existem para estudar obesidade (Vide, por exemplo, Bray, G.A., 1992, Prog.

Brain Res. 93:333-341 e Bray, G.A., 1989, Amer.

J.

Clin.

Nutr. 5:891-902). Os animais que têm mutações levando a síndromes que incluem sintomas de obesidade foram também identifica-

Gen. 1:130-144; Friedman, J.M. e Liebel, R.L., 1992, Cell 69:217-220, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Os modelos de camundongo de obesidade indicaram que obesidade é uma característica complexa com um alto grau de capacidade de herança. Mutações em vários locique levam a fenótipos obesos foram identificadas e incluem (mas não estão limitadas a) mutações recessivas automossomais obesos (0b), diabe- tes (db), gordo (gordo) e atarracado (atarr). A mutação ob é encontrada no cromossomo 6, enquanto a mu- tação db está localizada no cromossomo 4. Cada mutação leva a um início de obesidade clinicamente similar, começando em cerca de um mês de vida, com um fenótipo tipificado por hiperfagia, anormalidades severas em meta- ' bolismo de glicose e insulina, termorregulação pobre e termogênese não tiritante, e torpor extremo e subdesenvolvimento da massa corporal magra.

No camundongo db, níveis de trilodotironina elevados foram também relata- | 15 dos.

O gene ob e seu homólogo humano foram clonados por Zhang, Y. e outros (1994, Nature 372:425-432). O gene ob codifica Leptina, uma proteina de 167 aminoácidos. Ela é produzida por adipócitos de tecido adi- poso branco, e o nível de Leptina em circulação é diretamente proporcional à quantidade total de gordura no corpo. Em sua forma ativa, a Leptina é um hormônio de proteína de 16 kDa envolvido na regulagem de ingestão de e- nergia e gasto de energia, incluindo apetite e metabolismo. Camundongos ob/ob têm mutações no gene para Leptina, e são responsivos a tratamento com Leptina.

O locus db codifica um receptor de alta afinidade para o produto de gene ob, Leptina (Chen, H. e outros, Cell . 9 de fevereiro de 1996;84(3):491-5). O produto do gene db, o receptor de Leptina, é um recep- tor de abrangência de membrana simples que está intimamente relacionado ao componente de transdução de sinal do receptor de citocina gp130 (Tarta- glia LA. e outros, 1995, Cell 83:1263-1271).

Ad AAA AA mai nn nba EA AussãA E AA AR RA uma capacidade normal para termogênese não tiritante, mas são muito sen- síveis ao frio.

O torpor parece ter uma grande participação na manutenção de obesidade em ratos fa/fa comparado com os camundongos ob/0ob e db/db.

Visão Geraldo Diabetes

A obesidade, um dos principais sintomas em síndrome metabóli- ca, não é apenas um fator de risco forte para o desenvolvimento de Diabetes Tipo 1! (Abate, N. e outros, J.

Diabetes Complications, 2000, 14(3):154-74), mas também um fator de risco independente de doença cardíaca coronária (Wallace, A.M. e outros, Circulation, 2001, 104(25):3052-6). O aumento de níveis de Leptina em circulação está notadamente associado com obesidade (Caro, J.F. e outros, Diabetes, 1996, 45(11):1455-62; Chu, N.F. e outros, /nt.

J.

Obes.

Relat.

Metab.

Disord., 2000, 24(9):1085-92). A função fisiológica , primária da Leptina é prevenir obesidade através da regulagem de ingestão de alimento e equilíbrio de energia através de ativação de seus receptores em centros hipotalâmicos.

Os níveis elevados de Leptina no plasma (tam- bém referidos como hiperleptinemia) associados com obesidade e diabetes implicam uma resistência à ação de Leptina.

O diabetes mellitus é um dos distúrbios crônicos mais prevalen- tes afetando a população em todo o mundo.

O diabetes mellitus é um distúr- bio de metabolismo de carboidrato, caracterizado por hiperglicemia e glico- súria, que resulta de síntese ou utilização inadequada de insulina.

Hiperlep- tinemia e hiperinsulinemia são também características de alguns tipos de diabetes, tal como diabetes Tipo Il! (ou diabetes mellitus não insulino depen- dente, NIDDM; discutido abaixo). O diabetes existe como quatro categorias: diabetes Tipo | (também referido como diabetes mellitus insulino dependente ou IDDM), diabetes Tipo Il (NIDDM), diabetes mellitus gestacional, e outros tipos específicos, onde cada tipo tem patogênese e etiologia distintas.

Na Europa, nos Estados Unidos e no Canadá, mais de 80% de casos de diabe- tes são classificados como Tipo Il e 5-10% são diagnosticados como Tipo | essencial para homeostase de glicose. Esta forma se desenvolve tipicamen- te em crianças e adolescentes, mas pode também se desenvolver mais tar- de na vida. O diabetes Tipo |l resulta da incapacidade de tecidos responsi- vos à insulina em responder apropriadamente à ação de insulina, desta ma- neira são referidos como sendo resistentes à insulina. O diabetes Tipo Il o- corre mais frequentemente em adultos, mas um aumento em adolescentes diagnosticados com diabetes Tipo II foi observado (Carulli, L. e outros, A/i- ment Pharmacol. Ther., 2005, 22, Supl. 2:16-9; Bouche, C. e outros, Endoc.

Rev., 2004, 25(5):807-830). Diabetes mellitus não insulino dependente (NIDDM), ou diabetes Tipo Il, ocorre predominantemente em adultos. Esses indivíduos produzem ' níveis adequados de insulina, mas exibem um defeito em utilização e meta- bolismo de glicose mediados por insulina em tecidos periféricos, tais como músculo esqueletal, tecido adiposo marrom e tecido adiposo branco. Indiví- i 15 duos NIDDM exibem produção em excesso de glicose pelo fígado, desta . maneira contribuindo para o estado hiperglicêmico associado com o distúr- bio; prejuízo de secreção de insulina regulada por glicose; e resistência a descarte de glicose mediada por insulina, desta maneira contribuindo para o estado hiperglicêmico do indivíduo afligido. Em NIDDM, secreção de insulina é frequentemente aumentada a fim de compensar a resistência à insulina. Conforme o distúrbio prevalece, as células B pancreáticas falham em susten- tar secreção de insulina suficiente para compensar a responsividade à insu- lina prejudicada. No entanto, mecanismos responsáveis pela falha de ação de célula B não foram ainda estabelecidos, mas talvez possam ser atribuídos a efeitos hiperglicêmicos e/ou às contínuas demandas impostas a células pela resistência à insulina periférica (Carulli, L. e outros, Aliment Pharmacol. Ther., 2005, 22 Supl. 2: 16-9; Bouche, C. e outros, Endoc. Rev., 2004, 25(5): 807-830).

Os indivíduos que exibem resistência à insulina ou são diagnos- ticados como diabéticos Tipo ll frequentemente exibem vários sintomas que nados do grupo que segue: (1) hipertrigliceridemia; (2) obesidade abdominal; (3) colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL) (High-Density Lipopro- tein) baixo; (4) níveis de glicose no soro em jejum elevados; (5) pressão sanguínea alta; e (6) hiperleptinemia. Indivíduos NIDDM podem mostrar vá- rios dos sintomas descritos. Os indivíduos com Síndrome X, diabetes meilli- tus visível se desenvolvendo ou não, têm um risco alto de desenvolver as complicações microvasculares e macrovasculares que ocorrem em indiví- duos NIDDM, tais como aterosclerose e doença cardíaca coronária (Carulli, L. e outros, Aliment Pharmacol. Ther., 2005, 22 Supl. 2:16-9).

Hiperglicemia não controlada e contínua ligada ao diabetes está associada à morbidez e mortalidade altas e prematuras. Indivíduos diabéti- cos, tais como aqueles tendo NIDDM, têm um risco alto considerável de ' complicações macrovasculares e microvasculares, tais como doença cardia- ca coronária, aterosclerose, doença vascular periférica, acidente vascular i 15 cerebral, hipertensão, retinopatia, neuropatia e nefropatia (Federici, M e R. : Lauro, Aliment Pharmacol. Therapy, 2005, 22(Supl. 2):11-15; Desai, AS. e P.T. O'Gara; Indian Heart J., 2005, 57(4):295-303; Natarajan, R. e J.L. Nad- ler, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 2004, 24:1542-48). Desta maneira, o controle terapêutico de obesidade, homeostase de glicose, hipertensão e metabolismo de lipídeo são criticamente importantes no tratamento e cuida- do clínico de diabetes mellitus, de maneira a diminuir a mortalidade devido a complicações diabéticas, tal como doença cardiovascular.

Sinalização de Insulina e Leptina Ligação de insulina a seus receptores leva à ativação de vários cursos mitogênicos e metabólicos através de substratos de receptor de insu- lina (IRS 14), Gab-1 e Cbl (Sun, X.J. e outros, Nature, 1995, 377:173-7; Sun, X.J. e outros, Nature, 1991, 352-73-7; Fantin, V.R. e outros, J. Biol. Chem., 1998, 273(17):10726-32; Berg, C.E. e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 293(3):1021-7; Holgado-Madruga, M. e outros, Nature, 1996,379:5604; Ribon, V. e A.R. Saltiel, Biochem. J., 1997, 324 (Pt3):839-

tor de insulina (tal como IRS-1). IRS subsequentemente fosforila o domínio SH2 da tirosina fosfatase, Shp2, bem como o domínio SH3 da molécula a- daptadora Grb2. Grb2 ativa por sua vez se liga a Sosl, que então ativa o cur- so de sinalização de Ras e transcrição a jusante de genes.

A proteína IRS também ativa fosfoinosítíideo 3-cinase (PI3K) através da ligação ao seu do- mínio SH7, resultando em aumentos em níveis de PIP> e PIP intracelulares que levam à ativação cinase-1 dependente de fosfatidilinositol fosfato (PDK- 1). Este evento também leva à ativação do curso de AKt/PKB, que resulta em eventos intracelulares, tal como translocação do transportador de glicose

(GLUTA4)de um grupo intracelular para a superfície celular.

Dentre os cursos mitogênicos e metabólicos iniciados pela cas- ' cata de sinalização de insulina está o curso de fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K)(Berman, D.M. e outros, J.

Clin.

Endocrinol.

Metab., 2001, 86(1):97- 103; Dennis, P.B. e outros, Mol.

Cell Biol., 1996, 16(11):6242-51). Em célu- i 15 las lisas vasculares (VSMCs) (Vascular Smooth Cells), a Leptina se liga ao . seu receptor e ativa ambos os cursos de proteína cinase ativada por mitóge- no (MAPK) e PI3K através de fosforilação de resíduos Tyr985 e Tyr1138 do receptor da Leptina (Oda, A. e outros, Kobe J.

Med.

Sci., 2001, 47(3):141- 50). O receptor de leptina ativado é conhecido regular componentes da cas- cata de sinalização de insulina, tais como ERK, Akt, IRS-1, MAP cinase e Pl3-cinase, uma ação celular referida como crosstalk (Niswender, K.D. e ou- tros, Trends Endocr.

Metab., 2004, 15(8):362-9; Myers, M.G., Recent Prog.

Horm.

Res., 2004, 59:287-304; Ahima, RS. e S.Y.

Osei, Physio Behav., 2004, 81-223-41). A ativação do curso de PI3K pode estimular a fosforilação demTOR através da ativação da Akt (proteína cinase B). Essas ligam dire- tamente os hormônios inulina e Leptina (em adipocina) ao curso mMTOR.

Ati- vação de mTOR leva à hiperfosforilação de p70%º* e da proteína de ligação elF-4E (4E-BP1) direcionando tradução do mMRNA do trato de oligopirimidina 5' terminal e liberação de elF-4E para formar o complexo de elF4F, respec- tivamente (BrunnerL. e outros, Obes.

Relat Metab.

Disord., 1997,

Thomas, Prog.

Nucleic Acid Res.

Mol.

Biol., 2001, 65:101-27; Hara, K. e ou- tros, J.

Biol.

Chem., 1997, 272(42):26457-63; Graves, L.M. e outros, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.-S.A., 1995, 92(16):7222-6). Spexin Spexin é um peptídeo com atividade Gl.

Ela foi primeiro identifi- cada usando análise de modelagem Markov com base em características comuns a hormônios de peptídeo para encontrar novos em sequências de proteoma humanas (Mirabeau e outros (2007) Genome Res., 17: 320-327). Ela demonstra efeitos contráteis em um ensaio de explante de estômago de rato, indicando uma atividade biológica.

Ch12, orf39 (Spexin; 17,333 pb em humanos) mapeia para o Jo- ' cus 12p12.1, que é também definido por marcador microssatélite (MS) D128S1042. O locus 12p12.1, que é o sítio para o qual Spexin mapeia, foi associado com vários marcadores fenotípicos de obesidade em vários estu- | 15 dos de ligação de família.

Por exemplo, 12p12.1 foi associada com BMI em . brancos, com um escore LOD máximo de 2,1 (estudo HERITAGE; Yvon e outros, 2001: Obesity Genome Map; Rankinen e outros, 2006). O marcador MS D128S1042 foi também ligado à circunferência da cintura, com um escore LOD máximo de 2,374 (Oman Family Study, Bayoumi e outros, 2008). Ainda, ligação com marcador microssatélite D12S1041 foi significante em um sub- conjunto de famílias com circunferência da cintura média alta, com um esco- re LOD máximo de 4,45, p = 0,0045 para aumento em evidência para liga- ção (Dominican Family study; Wang e outros, 2009). Em uma modalidade, um método para detecção da presença de ou uma predisposição à obesida- deouunm distúrbio associado à obesidade em um indivíduo humano com- preendendo obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo; e detecção de se o indivíduo expressa ou não Spexin em combinação com exibição de marcador(es) fenotípico de obesidade (BMI, circunferência da cintura ou uma combinação deles), comparado com um indivíduo não afligido com o- —besidade ou um distúrbio associado à obesidade.

Gene da Spexin humana é uma modalidade adicional, um gene no locus 12p12.1 (e a região definida pelo marcador microssatélite (D12S1042)) desempenha um papel em obesi- dade. Em outra modalidade, uma alteração genética na SEQ ID NO:1 (por exemplo, deleção, mutação de sentido errado, mutação sem sentido ou uma combinação das mesmas) altera o nível de expressão ou sequência primária de mensagem de Spexin, e/ou proteína, levando à expressão defeituosa e perda de função. Detecção dessas mudanças seria a base para ensaios de diagnóstico. A Spexin é um hormônio humano, cuja subexpressão em obesi- dade foiidentifcada em humanos obesos, não modelos de camundongo de obesidade (vide EXEMPLOS). Em uma modalidade, a Spexin pode ser usa- ' da para regulagem do apetite. Em uma modalidade adicional, a Spexin pode : ser usada para controle de dipodistrofia. Em algumas modalidades, a Spexin pode ser usada para redução de gordura da barriga. | 15 A sequência de polipeptídeo de Spexin humana é mostrada na SEQ ID NO:1. A sequência de nucleotídeo de Spexin humana é mostrada na SEQ ID NO:2. Informação de sequência com relação à Spexin é acessível em bancos de dados públicos pelo número de Acesso GenBank NM 030572 (para MRNA) e NP 085049 (para proteína).

A SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácido do tipo selvagem humana correspondendo à Spexin (resíduos 1-116), onde a sequência em negrito representa a sequência de peptídeo maduro: 1 MKGLRSLAAT TLALFLVFVF LGNSSCAPOR LLERRNWTPQ AMLYLKGAQG RRFISDOSRR 61 KDLSDRPLPE RRSPNPOLLT IPEAATILLA SLOKSPEDEE KNFDOTRFLE DSLLNW A SEQ ID NO: 2 é a sequência de nucleotídeo do tipo selvagem humana correspondendo à Spexin (nucleotídeos 1-638), onde o "ATG" em negrito e sublinhado mostra o início da estrutura de leitura aberta: 1 ctgacaagat gtccctgtgg acteccaaac tetactecag atggggaggt gcccttaaca 61 ccaagatttt aaaagcteca atttcagage aagagtegaa aactcacaga taaagttata 121 gttatttcag ggttctgaaa agacgcagaa catgaaggga ctcagaagte tggcageaao 181 aaccttggct cttttcctag tatttgtttt cctgggaaac tccagetgog ctcegeagag

301 tegecgette ateteegace agageeggag aaaggacete teegacegge cactacegga 361 aagacgaagec ccaaatecee aactactaac tattceggag geageaacea tettactage 421 gtccettorag aaatcaccag aagatgaaga aaaaaacttt gatcaaacca gattcctgga 481 agacagtctg cttaactggt gaaaatatac tggattatgt ttaattatgg ttctattcte 541 tttgaaaaca tgaaccatgt gaataaaacc tttggaccct ttttaaaaaa aaaaaaaaaa 601 aaaaaaaaaa aaaagadaada aaaaaaadãa aaaacaaa Genes de Assinatura de obesidade A presente invenção provê a constatação que vários genes hu- manos foram, pela primeira vez, identificados como um coorte de genes en- volvidos em obesidade.

Esses genes foram identificados como sendo dife- rentemente expressos em gorduras obesa e normal humanas.

Esses genes, agora que eles foram identificados, podem ser usados para uma variedade de métodos úteis; por exemplo, eles podem ser usados para determinar se um indivíduo é predisposto à obesidade ou um distúrbio associado à obesi- dade.

Os genes identificados como parte deste coorte ou grupo de gene da obesidade (isto é, genes de Assinatura de obesidade ou "Genes OS") inclu- em qualquer gene indicado como sendo diferentemente expressos em qual- quer uma das Tabelas 7-8. Em uma modalidade, a invenção provê métodos para diagnosti- car obesidade ou um distúrbio relacionado à obesidade, bem como métodos para tratar obesidade ou um distúrbio associado à obesidade, compreen- dendo uso de ácidos nucleicos, ou proteínas codificadas pelos ácidos nucle- icos, do gene Spexin.

O método diagnostica a causa de base de obesidade e/ou um distúrbio relacionado à obesidade.

Em algumas modalidades, a invenção compreende métodos pa- rauso de proteinas de OS codificadas por um ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico, DNA complementar (CDNA), DNA sintético, bem como qualquer forma de RNA correspondente). Por exemplo, uma proteína de OS pode ser codificada por um ácido nucleico recombinante de um gene de OS, tal como Spexin.

As proteínas de OS da invenção podem ser obtidas asE Am óran fantiha à made anar neari=íninoa Aa anmnrdAa anna várino YANNIPRAÇNS FPf ina de OS pode ser obtido através da avaliação das bibliotecas de DNA ou através da amplificação a partir de uma fonte natural.

Uma proteína de OS pode ser um fragmento ou porção de proteína Spexin humana.

Os ácidos nucleicos codificando as proteínas de OS da invenção podem ser produzidos — através de tecnologia de DNA recombinante e tais ácidos nucleicos recom- binantes podem ser preparados através de técnicas convencionais, incluindo síntese química, engenharia genética, técnicas enzimáticas ou uma combi- nação dos mesmos.

Exemplos não limitantes de uma proteina de OS é o polipeptídeo codificado pelo gene Spexin e/ou qualquer um dos genes lista-

dosem qualquer uma das Tabelas 7-8. Em algumas modalidades, a invenção compreende uso de vari- antes de uma proteína de OS, tal como Spexin.

Tal variante pode compre- : ender uma variante de ocorrência natural devido a variações alélicas entre indivíduos (por exemplo, polimorfismos), alelos mutados relacionados à obe- i 15 sidade ou formas de união alternativas.

Em uma modalidade, a invenção compreende métodos para uso de uma proteína ou polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico de um gene de Assinatura de Obesi- dade (OS), tal como a sequência mostrada na SEQ ID NO:1 ou uma proteí- na ou polipeptídeo de OS codificado por qualquer um dos genes listados em qualquer uma das Tabelas 7-8. Em outra modalidade, o polipeptíideo pode ser modificado, tal com através de glicosilações e/ou acetilações e/ou reação química ou acoplamento, e pode conter um ou vários aminoácidos não natu- rais ou sintéticos.

Um exemplo de um polipeptídeo de OS tem a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, a inven- ção compreende variantes de uma proteína humana codificada por um gene de Assinatura de Obesidade (OS), tal como Spexin.

Tais variantes podem incluir aquelas tendo pelo menos de a partir de cerca de 46% a cerca de 50% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 50,1% a cerca de 55% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelomenos de a partir de cerca de 55,1% a cerca de 60% de identidade com cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 70,1% a cerca de 75% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 75,1% a cerca de 80% de iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de 80,1% acerca de 85% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo me- nos de a partir de cerca de 85,1% a cerca de 90% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 90,1% a cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 95,1% a cerca de 97% de identidade de sequência com aSEQIDNO:1 ou tendo pelo menos de a partir de cerca de 97,1% a cerca de 99,9% de identidade com a SEQ ID NO:1.

DNA e Polipeptídeos, Métodos e Purificação dos Mesmos . A presente invenção utiliza técnicas de biologia molecular, mi- crobiologia e DNA recombinante convencionais disponíveis a um versado comum na técnica. Tais técnicas são bem conhecidas do versado e são ex- plicadas em sua totalidade na literatura. Vide, por exemplo, "DNA cloning: A Practical Approach", Volumes | e ll (D.N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation"(B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R.l. Freshney, ed., 1986); "Im- mobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984) e Sambrook e outros "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3a edição, 2001). Um versado na técnica pode obter uma proteína codificada por um gene de OS, tal como Spexin, ou uma vari- anteda mesma, de várias maneiras, que incluem, mas não estão limitadas a, isolamento da proteína através de meios bioquímicos ou expressão de uma sequência de nucleotídeo codificando a proteína de interesse através de métodos de engenharia genética. Por exemplo, Spexin, ou uma variante da mesma, pode ser obtida através da sua purificação a partir de células

30. expressando Spexin, ou através de síntese química direta.

expressam uma proteína codificada por um gene de OS (por exemplo, Spe- xin), podem ser identificadas através de vários procedimentos conhecidos daqueles de habilidade na técnica. Esses procedimentos incluem, mas não estão limitados a, hibridizações de DNA-DNA ou DNA-RNA e técnicas de —bioensaio ou imunoensaio de proteína que incluem tecnologias à base de membrana, solução ou chip para a detecção e/ou quantificação de ácido nu- cleico ou proteína. Por exemplo, a presença de um ácido nucleico codifican- do um polipeptídeo Spexin pode ser detectada através de hibridização ou amplificação de DNA-DNA ou DNA-RNA usando sondas ou fragmentos de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo de Spexin. Métodos de amplificação incluem, por exemplo, reações em ca- deia da polimerase, PCR (PCR Protocols, a Guide to Methods and Applicati- : ons, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990 e PCR Strategies, 1995, ed. In- nis, Academic Press, Inc., N.Y., reação em cadeia da ligase (LCR) (Ligase Chain Reaction) (vide, por exemplo, Wu, Genomics 4:560, 1989; Lander- gren, Science 241:1077, 1988; Barringer, Gene 89:117, 1990); amplificação por transcrição (vide, por exemplo, Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989); e replicação de sequência autossustentada (vide, por exem- plo, Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990); amplificação de Q Beta replicase (vide, por exemplo, Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997), ensaio de amplificação de Q-beta replicase automático (vide, por e- xemplo, Burg. Mol. Cell Probes 10:257-271, 1996) e outras técnicas media- das por polimerase de RNA (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); vide também Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987; Sam- —brook; Ausubel; Patentes U.S. Nos. 4.683.195 e 4.683.202; Sooknanan, Bio- technology 13:563-564, 1995. Todas as referências e patentes mencionadas aqui são, cada uma, aqui incorporados a título de referência em sua totalida- de.

Uma orientação para a hibridização de ácidos nucleicos é en- contrada em, por exemplo, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory

York, 1997; Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part |. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed., Elsevier, N.Y., 1993. Todas as referências mencio- nadas aqui são, cada uma, incorporadas a título de referência em sua totali- dade

Em uma modalidade, um fragmento de um ácido nucleico do ge- ne Spexin pode compreender qualquer porção de pelo menos 8 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO:2. Em outra modalidade, o fragmento pode compreender pelo menos cerca de 10 nucleotídeos consecutivos, pelo me- nos cerca de 15 nucleotídeos consecutivos, pelo menos cerca de 20 nucleo- tídeos consecutivos ou pelo menos cerca de 30 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO:2. Os fragmentos podem incluir todos os comprimentos de ' nucleotídeo possíveis entre cerca de 8 e cerca de 100 nucleotídeos, por e- xemplo, comprimentos entre cerca de 15 e cerca de 100 nucleotídeos ou entre cerca de 20 e cerca de 100 nucleotídeos.

Ensaio baseado em amplifi- cação de ácido nucleico envolve o uso de oligonucleotídeos selecionados de ' sequências codificando um polipeptídeo codificado por um gene de OS (por exemplo, Spexin), ou são complementares a ele, para detectar transforman- tes que contêm um ácido nucleico codificando uma proteína ou polipeptídeo deoOS,por exemplo, Spexin.

Métodos para detecção e quantificação de polipeptídeos de OS (por exemplo, um polipeptídeo de Spexin) e polinucleotídeos de OS (por e- xemplo, um polinucleotídeo de Spexin) em amostras biológicas são conheci- dos na técnica.

Por exemplo, protocolos para detecção e medição da ex- pressão de um polipeptídeo codificado por um gene de OS, tal como Spexin, usando anticorpos policlonais ou monocionais específicos para o polipeptí- deo são bem estabelecidos.

Exemplos não limitantes incluem ensaio imuno- absorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Um imunoensaio de base mono- —clonal, de dois sítios, usando anticorpos monoclonais reativos a dois epito-

pode ser empregado.

Em uma modalidade, expressão de, sub- ou super- expressão de um produto de gene de OS (por exemplo, um polipeptídeo Spexin ou MRNA de Spexin) pode ser determinada.

Em uma modalidade, uma amostra biológica compreende uma amostra de sangue, soro, células (incluindo células integrais, frações de célula, extratos de célula e células ou linhagens de célula culturadas), tecidos (incluindo tecidos obtidos através de biópsia), fluidos corporais (por exemplo, urina, esputo, fluido amniótico, fluido sinovial) ou de meio (de células ou linhagens de célula culturadas). Em mo- dalidades adicionais, a amostra de tecido é tecido adiposo.

Em modalidades específicas, o tecido adiposo é adiposo omental, adiposo subcutâneo ou a- diposo mesentérico.

Os métodos de detecção ou quantificação de polincule- otídeos de Spexin incluem, mas não estão limitados a, ensaios baseados em amplificação com amplificação de sinal, ensaios baseados em hibridização e combinação de ensaios de amplificação-hibridização.

Para detecção e quan- tificação de polipeptídeos de Spexin, um método exemplar é um imunoen- saio que utiliza um anticorpo ou outros agentes de ligação que se ligam es- ' pecificamente a um polipeptídeo ou epítopo de Spexin, por exemplo, ensaios

ELISA ou RIA.

Técnicas de marcação e conjugação são conhecidas daqueles de habilidade na técnica e podem ser usadas em vários ensaios de ácido nucleico e aminoácido.

Métodos para produção de sondas de hibridização ou de PCR marcadas para detecção de sequências relacionadas a sequên- cias de ácido nucleico codificando uma proteína de OS, tal como Spexin, incluem, mas não estão limitados a, oligomarcação, deslocamento do corpo (nick translation), marcação da extremidade ou amplificação por PCR usan- do um nucleotídeo marcado.

Alternativamente, uma sequência de ácido nu- cleico codificando um polipeptídeo codificado por um gene de OS pode ser clonada em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA.

Tais vetores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro através da adição de nucleotí-

estojos comercialmente disponíveis (Amersham Pharmacia Biotech, Prome- ga e US Biochemical). Moléculas repórteres ou marcadores adequados que podem ser usados para facilidade de detecção incluem radionuclíideos, en- zimas e agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogênicos, bem como substratos, cofatores, inibidores e/ou partículas magnéticas.

As células hospedeiro transformadas com uma sequência de á- cido nucleico codificando um polipeptídeo de OS, tal como Spexin, podem ser culturadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína a partir da cultura celular. O polipeptídeo produzido por uma célula transformada pode ser secretado ou contido intracelularmente dependendo da sequência e/ou do vetor usado. Vetores de expressão contendo uma se- quência de ácido nucleico codificando um polipeptíideo de OS podem ser projetados para conter sequências de sinal que direcionam a secreção de moléculas de polipeptídeo solúveis codificadas por um gene de OS, tal como Spexin, ou uma variante do mesmo, através de uma membrana celular pro- cariótica ou eucariótica, ou que direcionam a inserção em membrana de uma molécula de polipeptídeo ligada à membrana codificada por um gene de OS ou uma variante do mesmo.

Outras construções podem ser também usadas para unir uma sequência de gene codificando um polipeptídeo de OS (por exemplo, Spe- xin) a uma sequência de nucleotídeo codificando um domínio de polipeptí- deo que facilitaria purificação de proteínas solúveis. Tais domínios de facili- tação de purificação incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de que- lação de metal tais como módulos de histidina-triptofano que permitem puri- ficação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem purifi- cação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação extensão/afinidade de FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Sequências ligantes cliváveis (isto é, aquelas específicas para Fator Xa ou enterocinase (Invitrogen, San Diego, Calif.)) podem ser incluídas entre o domínio de purificação e um polipeptídeo codificado por um gene de OS pa-

OS (por exemplo, Spexin) e 6 resíduos histidina precedendo um sítio de cli- vagem de tiorredoxina ou uma enterocinase. Os resíduos histidina facilitam purificação através de cromatografia de afinidade de íon de metal imobiliza- do, enquanto o sítio de clivagem de enterocinase provê um meio para purifi- caçãodo polipeptídeo codificado por um gene de OS.

Um polipeptídeo de OS (por exemplo, Spexin) pode ser purifica- do a partir de uma célula humana ou não humana que expressa o polipeptí- deo, incluindo aquelas que foram transfectadas com construtos de expres- são que expressam uma proteína de OS. Um polipeptídeo de OS purificado (por exemplo, Spexin) pode ser separado de outros compostos que normal- mente se associam ao polipeptídeo de OS ((por exemplo, Spexin) na célula, tais como certas proteínas, carboidratos ou lipídeos, usando métodos prati- : cados na técnica. Exemplos não limitantes incluem cromatografia de exclu- são de tamanho, fracionamento de sulfato de amônio, cromatografia de troca deion, cromatografia por afinidade e eletroforese em gel preparativa.

Sequências de ácido nucleico compreendendo um gene de OS (por exemplo, Spexin) que codificam um polipeptídeo podem ser sintetiza- das, toda ou em parte, usando métodos químicos conhecidos na técnica. Alternativamente, um polipeptídeo de OS, tal como Spexin, pode ser produ- zidousando métodos químicos para sintetizar sua sequência de aminoácido, tal como através de síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sóli- da. Síntese de proteina pode ser ou realizada usando técnicas manuais ou através de automação. Síntese automática pode ser obtida, por exemplo, usando Applied Biosystems 431a Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Op- cionalmente, fragmentos de polipeptídeos de OS podem ser separadamente sintetizados e combinados usando métodos químicos para produzir uma mo- lécula de comprimento integral. Em uma modalidade, um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que compreende um gene de OS pode com- preender qualquer porção de pelo menos cerca de 8 nucleotídeos consecuti- vosdeSEQIDNO:2. Em uma modalidade, o fragmento pode compreender deos de SEQ ID NO:2. Fragmentos incluem todos os comprimentos de nu- cleotídeo possíveis entre cerca de 8 e cerca de 100 nucleotídeos, por exem- plo, comprimentos entre cerca de 15 e cerca de 100 nucleotídeos ou entre cerca de 20 e cerca de 100 nucleotídeos.

Um fragmento de OS pode ser um fragmento de uma proteina de OS, tal como a proteina Spexin. Por exemplo, o fragmento de spexin po- de compreender qualquer porção de pelo menos cerca de 8 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:1. O fragmento pode compreender pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 20 aminoáci- dos consecutivos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 40 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 50 ami- noácidos consecutivos, pelo menos cerca de 60 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 70 aminoácidos consecutivos ou pelo menos cerca de 75 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:1. Os fragmentos incluem to- dosos comprimentos de aminoácido possíveis entre cerca de 8 e cerca de 100 aminoácidos, por exemplo, comprimentos entre cerca de 10 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 15 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 20 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 35 e cerca de 100 amino- ácidos, entre cerca de 40 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 50 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 70 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 75 e cerca de 100 aminoácidos ou entre cerca de 80 e cerca de 100 aminoácidos.

Um peptídeo sintético pode ser substancialmente purificado a- través de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (High Perfor- mance Liquid Chromatography). A composição de um polipeptídeo de OS sintético pode ser confirmada através de análise ou sequenciamento de a- minoácido. Ainda, qualquer porção de uma sequência de aminoácido com- preendendo uma proteína codificada por um gene de OS (por exemplo, Spe- xin) pode ser alterada durante síntese direta e/ou combinada usando méto- dos químicos com sequências de outras proteinas para produzir um polipep-

A invenção provê métodos para identificação de compostos que podem ser usados para tratamento de obesidade ou um distúrbio relaciona- do à obesidade.

A invenção também provê métodos para identificar compos- tos que podem ser usados para promover perda em peso em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

À invenção provê ainda métodos para identificação de compostos que podem ser usados para promoção de saciedade em um indivíduo obeso ou um indi- víduo afligido com um distúrbio associado à obesidade.

Uma vez que a in- venção identificou genes que são diferentemente expressos em gorduras obesae normal (por exemplo, Spexin bem como aqueles genes de Assinatu- ra de Obesidade listados nas Tabelas 7-8), a invenção também provê méto- dos para identificação de compostos que modulam a expressão ou atividade de um gene de OS e/ou proteína de OS, tal como Spexin.

Modelos animais de obesidade, tais como camundongos o0b/0b e db/db, podem ser usados para identificar compostos (por exemplo, agentes de teste) que melhoram os sintomas de obesidade e distúrbios associados à obesidade, por exemplo, gordura corporal em excesso, níveis de Leptina no soro elevados, níveis de Spexin no soro baixos ou uma combinação dos mesmos.

Tais modelos animais podem ser usados como substratos de teste para identificação de fármacos, agentes farmacêuticos, terapias e interven- ções que podem ser eficazes no tratamento da obesidade e distúrbios asso- ciados à obesidade.

Por exemplo, modelos animais podem ser expostos a um composto, suspeitos de exibir uma habilidade em melhorar sintomas de obesidade e distúrbios associados à obesidade, por exemplo, gordura corpo- ralem excesso, níveis de Leptina no soro altos, níveis de Spexin no soro baixos, ou uma combinação dos mesmos, em uma concentração suficiente e por um tempo suficiente para elicitar tal melhora de sintomas nos animais expostos.

A resposta dos animais à exposição pode ser monitorada através da avaliação da reversão de gordura corporal em excesso, níveis de Leptina —nosoro altos, níveis de Spexin no soro baixos associados com obesidade e identificar agentes de teste que melhorem sintomas de obesidade e distúr- bios relacionados à obesidade, por exemplo, gordura corporal em excesso, níveis de Leptina no soro altos, níveis de Spexin no soro baixos ou uma combinação dos mesmos.

De acordo com Mirabeau e outros ((2007) Geno- me Res. 17:320-327), tiras de músculo do fundo do estômago podem ser coletadas de ratos e montadas em banho de órgão oxigenado, onde elas podem ser esticadas e provocadas com agentes bioativos, desta maneira servindo como um sistema de bioensaio útil.

No início de cada experimento, cloreto de acetilcolina é aplicado para obter uma contração de controle má- xima, as contrações são registradas.

Em uma modalidade, um peptídeo spe- xin amidado sintético (NWTPQAMLYLKGAQ-amida [SEQ ID NO:32]; Primm; vide, por Mirabeau e outros, (2007) Genome Res., 17:320-327) pode ser empregado.

Para identificar um agonista com propriedades similares à Spe- xin, por exemplo, doses únicas de um agente de teste podem ser aplicadas até que respostas reproduzíveis, se alguma, sejam obtidas.

Para identificar um antagonista de Spexin, por exemplo, doses únicas de um agente de teste podem então ser aplicadas até que respostas de Spexin elicitadas no ensaio de explante intestinal sejam diminuídas.

Os compostos ou agentes da invenção compreendem peptídeos (tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos ou peptídeos solúveis), moléculas pequenas (por exemplo, moléculas orgânicas pequenas e inorgâ- nicas pequenas), ácidos nucleicos (tal como siRNA ou RNA de antissentido) ou outros agentes que podem se ligar a uma molécula de polipeptídeo codi- ficada por um gene de OS (por exemplo, Spexin) e/ou têm um efeito estimu- lador ou inibidor sobre a atividade biológica de uma proteína codificada por um gene de OS ou sua expressão (por exemplo, Spexin). Será então deter- minado se os agentes de teste podem promover saciedade ou perda em pe- so em um indivíduo obeso ou indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade ou se o agente de teste pode ser usado no tratamento de obe- sidade ou um distúrbio associado à obesidade (por exemplo, através do e- xame de se há uma mudança em um fenótipo em peso corporal, tal como

Conforme aqui usado, um "composto de modulação de Spexin" se refere a um composto que interage com o gene Spexin, ou a proteína ou polipeptídeo de Spexin, e modula sua atividade e/ou sua expressão. O com- posto pode ou aumentar a atividade ou expressão da proteína Spexin. Por outrolado,o composto pode diminuir a atividade ou expressão de uma pro- teina Spexin. O composto pode ser um agonista de Spexin ou um antagonis- ta de Spexin. Alguns exemplos não limitantes de compostos de modulação de Spexin incluem peptídeos (tais como fragmentos de peptídeo compreen- dendo SEQ ID NO:1, ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos), moléculas pequenas (orgânicas ou inorgânicas) e ácidos nucleicos (tal como siRNA ou RNA antissentido específico para um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:2). Agonistas de Spexin podem ser moléculas que, quando ligadas à Spexin ou seu receptor, aumentam ou prolongam a atividade da proteína Spexin. Agonistas de Spexin podem ser compostos (por exemplo, compos- tos sintéticos ou outros peptídeos de ocorrência natural) que elicitam a mesma atividade ou similar comparado com Spexin. Agonistas de Spexin incluem, mas não estão limitados a, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequenas ou quaisquer outras moléculas que ativam a proteína Spexin. An- tagonistas de Spexin podem ser moléculas que, quando ligadas à proteína Spexin, diminuem a quantidade ou a duração da atividade de Spexin. Anta- gonistas incluem proteínas, ácidos nucleicos, anticorpos, moléculas peque- nas ou qualquer outra molécula que diminua a atividade da proteína Spexin. "Modular" se refere a uma mudança na atividade ou expressão de um gene de OS ou proteína, tal como Spexin. Por exemplo, modulação pode causar um aumento ou uma diminuição em atividade de proteína, ca- racterísticas de ligação ou qualquer outra propriedade biológica, funcional ou imunológica de uma proteína OS. Em uma modalidade, a proteína de OS é Spexin.

Em uma modalidade, um composto de modulação de Spexin pode serum fragmento de peptídeo da proteína Spexin que se liga à própria Cróvin Dar avamealae sala enmnrasanda amalatimar naArcãe de neilh mangse rarcra preender pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 30 aminoáci- dos consecutivos, pelo menos cerca de 40 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 50 aminoácidos consecutivos, pelo menos cerca de 60 ami- —noácidos consecutivos ou pelo menos cerca de 75 aminoácidos consecuti- vos de SEQ ID NO:1. Os fragmentos incluem todos os comprimentos de a- minoácido possíveis e incluindo cerca de 8 e cerca de 100 aminoácidos, por exemplo, comprimentos entre cerca de 10 e cerca de 100 aminoácidos, en- tre cerca de 15 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 20 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 35 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 40 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 50 e cerca de 100 amino- ácidos, entre cerca de 70 e cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 75 e cerca de 100 aminoácidos ou entre cerca de 80 e cerca de 100 aminoácidos. Esses fragmentos de peptídeo podem ser obtidos comercialmente ou sinteti- —zados através de métodos de síntese de fase líquida ou fase sólida (Atherton e outros, (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra). Os fragmentos de peptídeo de Spexin podem ser isolados de uma fonte natural, geneticamente engenheirados ou quimica- mente preparados. Esses métodos são bem conhecidos na técnica.

Um composto de modulação de Spexin pode ser uma proteína, tal como um anticorpo, (monoclonal, policlonal, humanizado, quimérico ou integralmente humano), ou um fragmento de ligação do mesmo, direcionado contra um polipeptídeo codificado pelo gene Spexin. Um fragmento de anti- corpo pode ser uma forma de um anticorpo outra que não a forma de com- primento integral e inclui porções ou componentes que existem dentro de anticorpos de comprimento integral. Um fragmento de anticorpo pode tam- bém ser um fragmento de anticorpo que foi engenheirado. Fragmentos de anticorpo podem incluir, mas não estão limitados a, Fv de cadeia simples (scFv), diacorpos, Fv, (Fab')2, triacorpos, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDR's, regiões variáveis, tetracorpos, anticorpos híbridos

Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Os anticorpos podem ser obtidos comer- cialmente, podem ser gerados especialmente ou podem ser sintetizados contra um antígeno de interesse de acordo com métodos estabelecidos na técnica (por exemplo, vide Beck e outros, Nat. Rev. Immunol. maio de 2010; 10(5):345-52; Chan e outros, Nat. Rev. Immunol. maio de 2010;10(5):301- 16; e Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. Abril 2010;12(2):176-83, cada um deles aqui incorporado a título de referência em suas totalidades). Inibição de RNA codificando um polipeptídeo codificado por um gene de OS, por exemplo, Spexin, pode modular eficazmente a expressão de um gene de OS a partir do qual o RNA é transcrito. Inibidores são sele- cionados do grupo compreendendo: siRNA: RNA de interferência ou RNAi; ASsRNA; DNA transcritos por Polimerase Ill de RNA; ribozimas; e ácidos nu- cleicos de antissentido, que podem ser RNA, DNA ou um ácido nucleico arti- ficial.

Oligonucleotídeos de antissentido, incluindo moléculas de DNA, RNA e DNA/RNA de antissentido, agem para bloquear diretamente a tradu- ção de mRNA através de ligação ao mRNA direcionado e prevenção de tra- dução de proteína. Por exemplo, oligonucleotídeos de antissentido de pelo menos cerca de 15 bases e complementares a regiões únicas da sequência de DNA codificando um polipeptídeo de Spexin podem ser sintetizados, por exemplo, através de técnicas de fosfodiéster convencionais (Dallas e outros (2006) Med. Sci. Monit. 12(4):RA67-74; Kalota e outros (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburguer e outros (2006) Handb. Expe. Phar- macol. 173:243-59). Sequências de nucleotídeo de antissentido incluem, mas não estão limitadas a: morfolinos, polinucleotídeos de 2'-O-metila, DNA, RNA e similar.

SiRNA compreende uma estrutura de filamento duplo contendo de a partir de cerca de 15 a cerca de 50 pares de base, por exemplo, de a partir de cerca de 21 a cerca de 25 pares de base, e tendo uma sequência de nucleotídeo idêntica ou quase idêntica a um gene ou RNA alvo dentro da mad dA TINA ITA mansa mesim 14155 Fm anEa nl PIAIA lo mammblcm sm mm Fila ma mm ções de emparelhamento de base Watson-Crick.

O filamento de sentido compreende uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idên- tica a uma sequência de ácido nucleico contida dentro da molécula de miR- NA alvo. "Substancialmente idêntica" a uma sequência alvo contida dentro —domRNA alvo se refere a uma sequência de ácido nucleico que difere da sequência alvo em cerca de 3% ou menos.

Os filamentos de sentido e antis- sentido do siRNA podem compreender duas moléculas de RNA de filamento simples, complementares, ou podem compreender uma molécula simples onde duas porções complementares são emparelhadas na base e são cova- lentemente ligadas por uma área "grampo-de-cabelo" de filamento simples.

Vide também McMnaus e Sharp (2002) Nat.

Rev.

Genetics, 3:737-47 e Sem e Blau (2006) FASEB J., 20:1293-99, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.

O siRNA pode ser RNA alterado que difere de RNA de ocorrên- i 15 cia natural através da adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos.

Tal alteração inclui adição de material não nucleotídeo, tal como à extremidade(s) do siRNA ou a um ou mais nucleotídeos internos do siRNA, ou modificações que tornam o siRNA resistente à digestão por nuclease, ou a substituição de um ou mais nucleotídeos no siRNA com de- — soxirribonucleotídeos.

Um ou ambos os filamentos do siRNA podem também compreender uma sobreposição 3'. Conforme aqui usado, uma sobreposição 3' se refere a pelo menos um nucleotídeo não emparelhado se estendendo da extremidade 3' de um filamento de RNA duplex.

Por exemplo, o siRNA pode compreender pelo menos uma sobreposição 3' de a partir de 1 a cerca de6 nucleotídeos (que inclui ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos) em comprimento ou de a partir de 1 a cerca de 5 nucleotídeos de compri- mento ou de a partir de 1 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento ou de a partir de cerca de 2 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento.

Por exemplo, cada filamento do siRNA pode compreender sobreposições 3' de ácido diti-

—miídílico ("TT") ou ácido diuridílico ("uu").

(por exemplo, vide Patente U.S.

No. 7.294.504, Patente Norte-americana No. 7.148.342 e Patente U.S.

No. 7.422.896, cujos conteúdos em sua totali- dade são aqui incorporados a título de referência). Métodos exemplares para produção e teste de moléculas de dsRNA ou siRNA são descritos na Publi- cação do Pedido de Patente Norte-americana No. 2002/0173478 para Ge- wirtz e na Publicação do Pedido de Patente Norte-americana No. 2007/0072204 para Hannon e outros, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.

DNAs transcritos pela polimerase Il! de RNA contêm promotores, tal como o promotor U6. Esses DNAs podem ser transcritos para produzir RNAs grampo-de-cabelo pequenos na célula que podem funcionar como ' SIiRNA ou RNAs lineares que podem funcionar como RNA de antissentido.

O composto de modulação de Spexin pode conter ribonucleotídeos, desoxir- ribonucleotídeos, nucleotídeos sintéticos ou qualquer combinação adequada de maneira que o RNA e/ou gene alvo seja inibido.

Ainda, essas formas de . ácidos nucleicos podem ser de filamento simples, duplo, triplo ou quádruplo (vide, por exemplo, Bass (2000) Nature, 411, 428-429; Elbashir e outros (2001) Nature, 411, 494-498; e Publicações PCT Nos.

WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409, WO 00/44914). Em uma modalidade, RNAs grampo-de-cabelo curtos podem ser sintetizados exogenamente ou podem ser formados através de transcrição a partir dos promotores de polimerase Ill de RNA in vivo.

Exemplos de fabrica- ção e uso de tais ShRNAs para silenciamento de gene em células de mamí- fero são descritos em, por exemplo, Paddison e outros, 2002, Genes Dev., 16:948-58; McCaffrey e outros, 2002, Nature, 418:38-9; McManus e outros, 2002, RNA, 8:842-50; Yu e outros, 2002, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 99:6047-52). ShRNAs são engenheirados em células ou em um animal para assegurar supressão contínua e estável de um gene desejado.

É conhecido na técnica que SiRNAs podem ser produzidos através do processamento de

—RNA grampo-de-cabelo na célula.

outro lado, aumenta seu funcionamento.

Moléculas pequenas são um grupo diverso de substâncias sintéticas e naturais geralmente tendo pesos molecu- lares baixos.

Elas podem ser isoladas de fontes naturais (por exemplo, plan- tas, fungos, micróbios e similar), são obtidas comercialmente, estão disponí- veiscomo bibliotecas ou coleções ou podem ser sintetizadas.

Moléculas pe- quenas candidatas que modulam Spexin podem ser identificadas através de avaliação in silico ou avaliação de alto rendimento (HTPS) (High-Through- Put) ou bibliotecas combinatórias.

A maioria dos agentes farmacêuticos con- vencionais, tais como aspirina, penicilina e muitos quimioterapêuticos, são moléculas pequenas, podem ser obtidos comercialmente, podem ser quimi- camente sintetizados ou podem ser obtidos de bibliotecas aleatórias ou ' combinatoriais conforme descrito abaixo (Werner e outros (2006), Brief.

Funct.

Genomic Proteomic 5(1):32-6). Conhecimento da sequência primária de uma molécula de inte- : 15 —resse, tal como um polipeptídeo codificado pelo gene Spexin, e similaridade : desta sequência com proteínas de função conhecida, pode prover informa- ção de inibidores ou antagonistas da proteína de interesse, em adição a a- gonistas.

Identificação e avaliação de agonistas e antagonistas são faciíilita- das mais através da determinação de características estruturais da proteina, por exemplo, usando cristalografia de raio X, difração de nêutron, espectros de cópia de ressonância magnética nuclear e outras técnicas para determi- nação de estrutura.

Essas técnicas proveem o projeto racional ou identifica- ção de agonistas e antagonistas.

Agentes de teste, por exemplo, compostos de modulação de Spexin, podem ser avaliados a partir de bibliotecas grandes de compostos sintéticos ou naturais (vide Wang e outros (2007), Curr.

Med.

Chem,, 14(2):133-55; Mannhold (2006) Curr.

Top Med.

Chem., 6(10):1031-47; e Hensen (2006) Curr.

Med.

Chem. 13(4):361-76). Vários meios são atualmen- te usados para síntese aleatória e direcionada de compostos à base de sa- carídeo, peptídeo e ácido nucleico.

Bibliotecas de composto sintético estão PA mem A Inammtis Alleammmtinmio nlm RAm.h cisma filhmenimnal fim fTominhhot Timsmamh ylordsville, CT). Uma biblioteca química rara está disponível da Aldrich (Mil- waukee, Wis.). Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, de planta e animal estão disponíveis do, por exemplo, Pan Laboratories (Bothell, Wash.) ou MycoSearch (N.C.) ou podem ser prontamente produzidas. Ainda, bibliotecas e compostos naturais e sinteticamente produzidos são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais (Blondelle e outros (1996) Tib. Tech. 14:60).

Métodos para preparação de bibliotecas de moléculas são bem conhecidos na técnica e muitas bibliotecas estão comercialmente disponí- veis. Exemplos de bibliotecas quimicamente sintetizadas são descritos em ' Fodor e outros (1991), Science 251:767-773; Houghten e outros (1991) Na- ture 354:84-86; Lam e outros (1991) Nature 354:82-84; Medynski (1994), BioTechnology 12:709-710; Gallop e outros (1994) J. Medicinal Chemistry 37(9)1233-1251; Ohlmeyer e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 90:10922-10926; Erb e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422- 11426; Houghten e outros (1992) Biotechniques 13:412; Jayawickreme e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; Publicação PCT No. WO 93/20241, datada de 14 de outubro, 1993; e Brenner e outros (1992), Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.

Bibliotecas combinatoriais de molécula pequena podem ser tam- bém geradas e avaliadas. Uma biblioteca combinatorial de compostos orgâ- nicos pequenos é uma coleção de análogos intimamente relacionados que diferem um do outro em um ou mais pontos de diversidade e são sintetiza- dos por técnicas orgânicas usando processos multietapas. Bibliotecas com- binatoriais incluem um grande número de compostos orgânicos pequenos. Um tipo de biblioteca combinatorial é preparado por meio de métodos de síntese paralela para produzir uma disposição de composto. Uma disposição de composto pode ser uma coleção de compostos identificáveis pelos seus E O RE RE a di a Ai dan da enARiA mentos de diversidade estrutural variáveis. Os compostos em tal disposição de composto são produzidos em paralelo em recipientes de reação separa- dos, com cada composto identificado e rastreado pelo seu endereço espaci- al. Exemplos de misturas de síntese paralela e métodos de síntese paralela são providos na U.S. No. de Série 08/177.496 depositada em 5 de janeiro de 1994 e seu pedido de patente publicado PCT correspondente WO95/18972 publicado em 13 de julho de 1995 e Patente U.S. No. 5.712.171 concedida em 27 de janeiro de 1998 e seu pedido de patente publicado PCT corres- pondente WO 96/22529, que são aqui incorporados a título de referência.

Tratamento de Obesidade e Distúrbios Associados à Obesidade Vários tratamentos para obesidade bem estabelecidos variando : de intervenção não farmacêutica à farmacêutica são conhecidos na técnica. : Intervenções não farmacêuticas incluem, mas não estão limitadas a, restri- ção alimentar, exercício, tratamento psiquiátrico e tratamentos cirúrgicos pa- i 15 rareduzir consumo de alimento (por exemplo, cirurgia bariátrica) ou remover gordura (por exemplo, lipossucção). As presentes intervenções farmacológi- cas podem induzir uma perda em peso entre 5 a 15 kg. Supressores de ape- tite e agentes de gasto de energia ou de modificação de nutrientes são o principal foco de intervenção farmacológica. Dexfenfluramina (Redux), sibu- tramina (Meridia), agonistas beta-3-adrenérgicos, agentes adrenérgicos sim- patomiméticos (tal como anfetaminas (dextroanfetamina), fentermina, benz- fetamina, fendimetrazina, mazindol, dietilpropiona, fenilpropanolamina, inibi- dores de reabsorção de serotonina (5-HT) (tal como sibutramina) e lipases gastrintestinais (tal como orlistate) são exemplos de tais intervenções farma- —cológicas. Vide também Bays (2004) Obesity Research 12(8):1197-1211 e Klonoff e outros, J. Diabetes Sci. Technol. Set. 2008;2(5):913-8, cujos conte- údos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. No en- tanto, se a medicação for descontinuada, ganho em peso renovado pode acontecer. Tratamentos cirúrgicos são comparativamente bem sucedidos, mas são complicados, caros e têm riscos significantes. Os tratamentos cirúr-

Em uma modalidade, Spexin é administrada a um indivíduo obe- so para tratar obesidade ou um distúrbio associado à obesidade. Em outra modalidade, um polipeptideo compreendendo SEQ ID NO:1 ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo é administrado a um indivíduo obeso paratratar obesidade ou um distúrbio associado à obesidade. Em uma mo- dalidade, Spexin é administrada a um indivíduo obeso ou um indivíduo afligi- do com um distúrbio associado à obesidade para promover perda em peso no indivíduo. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado a um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade para promover perda em peso no indivíduo. Em uma modalidade, : Spexin é administrada a um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade para promover saciedade no indivíduo. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado a um indivíduo . obeso ou um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade para promover saciedade no indivíduo.

Spexin, um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um agente de teste da in- venção (por exemplo, uma molécula orgânica pequena, uma molécula inor- gânica pequena, um peptídeo solúvel ou um anticorpo) pode ser administra- do em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por exemplo, uma quanti- dade que é suficiente para tratar obesidade ou o distúrbio associado à obe- sidade, tal como através da melhora dos sintomas associados com obesida- deouo distúrbio associado à obesidade (por exemplo, níveis de Leptina al- tos, níveis de spexin baixos e massa corporal alta), prevenção ou retardo do início de obesidade ou do distúrbio associado à obesidade e/ou também di- minuição da severidade ou frequência de sintomas de obesidade ou do dis- túrbio relacionado à obesidade (por exemplo, níveis de Leptina altos, níveis de spexinbaixose massa corporal alta).

severidade da doença e pode ser determinada através de técnicas clínicas padrão. Ensaios in vitro ou in vivo podem ser também usados para identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a ser usada na formulação vai também depender da via de administração e da severidade da obesidade ou do distúrbio associado à obesidade, e deve ser decidida de acordo com o julgamento de um praticante e cada circunstância do paciente. Doses efica- zes podem ser extrapoladas das curvas de dose-resposta derivadas de sis- temas de teste de modelo in vitro ou animal, tais como camundongos db/db, um camundongo ob/ob ou um modelo de camundongo alimentado com dieta com altoteor de gordura (por exemplo, o modelo de camundongo de Obesi- dade Induzida por Dieta (DIO)).

' Spexin é um hormônio de peptídeo que tem atividade biológica no intestino, mas é notadamente subexpressa por ambas as gorduras omen- tal e subcutânea em pacientes obesos (vide EXEMPLOS). Em uma modali- dade, Spexin é um fator de saciedade. Spexin, ou uma molécula pequena ; agindo através do mesmo sistema de receptor/sinalização, pode ser usada para inibir ânsias por alimento e regular a ingestão calórica. Um fator de saciedade é um sinal de feedback relacionado a gasto de energia e ingestão de alimento. Um fator de saciedade está envol- vido na regulagem de apetite, ingestão de alimento, ingestão ou gasto de energia ou age como um sinal de saciedade. O fator de saciedade mais es- tudado até agora é o hormônio Leptina, que é sintetizado e secretado pre- dominantemente por células de gordura. Em uma modalidade, Spexin é um fator de saciedade. Em uma modalidade adicional, Spexin como um fator de saciedade pode ser usada para o tratamento de obesidade. Em outra moda- lidade, Spexin pode ser uma alternativa e/ou complemento para tratamentos cirúrgicos para reduzir consumo de alimento (por exemplo, cirurgia bariátri- ca) ou remover gordura (por exemplo, lipossucção). Tratamento de outros distúrbios em peso corporal A obesidade é o distúrbio em peso corporal mais prevalente. Ou-

peso corporal como anorexia, lipodistrofia e caquexia (consumo) são tam- bém características proeminentes de outras doenças tais como câncer, fi- brose cística, tuberculose, falência cardíaca congestiva e AIDS. Um aspecto da invenção provê um método de diagnóstico de um distúrbio em peso cor- poralem um indivíduo. Em uma modalidade, excesso de produção de Spe- xin ou circulação de Spexin é responsável por anorexia nervosa ou outros distúrbios alimentares. Em uma modalidade, o método para diagnóstico de um distúrbio em peso corporal em um indivíduo humano compreende: (a) obtenção de uma amostra biológica a partir de um indivíduo; (b) detecção de se há ou não uma alteração na expressão do gene Spexin no indivíduo comparado com um indivíduo não afligido com um distúrbio em peso corpo- : ral. Consumo é uma síndrome caracterizada por perda em peso, a- trofia muscular, fadiga, fraqueza e perda significante de apetite em um indi- — víduo que não está ativamente tentando perder peso.

: Lipodistrofia é uma condição médica caracterizada por condi- ções anormais ou degenerativas do tecido adiposo do corpo. Ela é caracteri- zada por uma perda de Leptina em circulação que pode levar à osteoescle- rose.

A Spexin pode desempenhar um papel na patogênese de, ou tratamento de, lipodistrofia em pacientes infectados por HIV. Desta maneira, os níveis de Spexin no soro podem ser regulados em pacientes HIV+. Em uma modalidade, um antagonista de Spexin é administrado a um indivíduo para tratar lipodistrofia. Em outra modalidade, um polipeptídeo direcionado ao aminoácido compreendendo SEQ ID NO:1 (por exemplo, um anticorpo para Spexin) é administrado a um indivíduo para tratar lipodistrofia. Em uma modalidade, um antagonista para Spexin é administrado a um indivíduo para promover ganho em peso no indivíduo. Em outra modalidade, um polipeptí- deo direcionado ao aminoácido compreendendo SEQ ID NO:1 (por exemplo, um anticorpo para Spexin) é administrado a um indivíduo para promover ga- BA O Ras gi por um fenótipo em peso corporal menor do que o normal (por exemplo, ca- quexia ou lipodistrofia) podem ser melhorados pela diminuição do nível de expressão do gene Spexin e/ou atividade de produto de gene Spexin. Por exemplo, sequências do gene Spexin (por exemplo, SEQ ID NO:2) podem ser utilizadas em conjunto com um método de antissentido, "inativação" de gene, ribozima e/ou siRNA para diminuir o nível de expressão de gene Spe- xin. Em uma modalidade, um anticorpo direcionado à proteina Spexin pode neutralizar atividade de Spexin através de ligação à proteína Spexin. Administração e Dosagem A Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode ser administrado ao indivíduo uma vez (por exemplo, como uma injeção ou de- posição única). Alternativamente, Spexin ou um composto de modulação de Spexin da invenção pode ser administrado uma vez ou duas vezes por se- mana a um indivíduo com necessidade do mesmo por um período de a partir de cercade2 a cerca de 28 dias ou de a partir de cerca de 7 a cerca de 10 , dias ou de a partir de cerca de 7 a cerca de 15 dias. Ele pode ser também administrado uma ou duas vezes por dia a um indivíduo por um período de 1,2, 3,4, 5,6,7,8, 9, 10, 11, 12 vezes por ano ou uma combinação dos mesmos. Ainda, Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode ser co-administrado com outro agente terapêutico, tal como desfenfluramina (Redux), sibutramina (Meridia) e agonista beta3-adrenérgico, uma gente a- grenérgico simpatomimético (tais como anfetaminas (dextroanfetamina)), fentermina, benzfetamina, fentimetrazina, mazindol, dietilpropiom, fenilpro- panolamina, um inibidor de reabsorção de serotonina (5-HT) (tal como sibu- tramina), uma lipase gastrintestinal (tal como orlistate), um fator de sacieda- de ou uma combinação dos mesmos.

Spexin ou um composto de modulação de Spexin da invenção pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer meio adequado para aplicação de Spexin ou um composto de modulação de Spexin a célu- las do indivíduo, tais como células adiposas omentais ou células adiposas mal midAanaDA Das maiscaneaasailoa Cimnasim mir mma mamaeanaatia ala mam aAdioianf=a Ala Cn células. Métodos de transfecção para células eucarióticas são bem conheci- dos na técnica e incluem injeção direta do ácido nucleico no núcleo ou pró- núcleo de uma célula; eletroporação; transferência de lipossoma ou transfe- rência mediada por materiais lipofílicos; aplicação de ácido nucleico mediada porreceptor, biobalística ou aceleração de partícula; precipitação de fosfato de cálcio e transfecção mediada por vetores virais.

As composições da presente invenção podem ser formuladas e administradas para reduzir os sintomas associados com obesidade ou um distúrbio associado à obesidade através de qualquer meio que produza con- tatodo ingrediente ativo com o sítio de ação do agente no corpo de um indi- víduo humano ou não humano. Elas podem ser administradas através de qualquer meio convencional disponível para uso em conjunto com agentes farmacêuticos, ou como ingredientes terapêuticos ativos individuais ou em uma combinação com ingredientes terapêuticos ativos. Elas podem ser ad- ministradas sozinhas, mas são geralmente administradas com um carreador . farmacêutico selecionado com base na via de administração escolhida e prá- tica farmacêutica padrão.

As composições farmacêuticas para uso de acordo com a inven- ção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais carreadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. As composições te- rapêuticas da invenção podem ser formuladas para uma variedade de vias de administração, incluindo administrações sistêmica e tópica ou localizada. Técnicas e formulações geralmente podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa (20º ed., 2000), cujorelatório descritivo em sua totalidade é aqui incorporado a título de refe- rência. Para administração sistêmica, uma injeção é útil, incluindo intramus- cular, intravenosa, intraperitoneal e subcutânea. Para injeção, as composi- ções terapêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções líquidas, por exemplo, em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como PBS, solu- çãode Hank ou solução de Ringer. Ainda, as composições terapêuticas po-

E II AI RO A E A posições farmacêuticas da presente invenção são caracterizadas como sen- do pelo menos estéreis e livres de pirógeno. Essas formulações farmacêuti- cas incluem formulações para usos humano e veterinário. As formulações farmacêuticas da invenção podem compreender — Spexinouum composto de modulação de Spexin (por exemplo, 0,1 a 90% em peso), ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, misturado com um carreador farmaceuticamente aceitável. As formulações farmacêuticas da invenção podem também compreender Spexin ou um composto de mo- dulação de Spexin da invenção que são encapsulados por lipossomas e um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente a- ceitáveis úteis são água, água tamponada, solução salina normal, solução salina 0,4%, glicina 0,3% ou ácido hialurônico.

As composições farmacêuticas da invenção podem também compreender excipientes e/ou aditivos farmacêuticos convencionais. Excipi- entes farmacêuticos adequados incluem estabilizadores, antioxidantes, a- gentes de ajuste da osmolalidade, tampões e agentes de ajuste do pH. Aditi- vos adequados incluem tampões fisiologicamente biocompatíveis (por e- xemplo, cloridrato de trometamina), adições de quelantes (tal como, por e- xemplo, DTPA ou DTPA-bisamida) ou complexos de quelato de cálcio (co- mo, porexemplo, DTPA de cálcio, CaNaDTPA-bisamida) ou, opcionalmente, adições de sais de cálcio ou sódio (por exemplo, cloreto de cálcio, ascorbato de cálcio, gluconato de cálcio ou lactato de cálcio). As composições farma- cêuticas da invenção podem ser embaladas para uso em forma líquida ou podem ser liofilizadas.

Para composições farmacêuticas sólidas da invenção, carreado- res farmaceuticamente aceitáveis sólidos não tóxicos convencionais podem ser usados; por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose ou carbonato de magnésio.

As formulações sólidas podem ser usadas para administração não tóxicos convencionais podem ser usados, os quais incluem, por exem- plo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose ou carbonato de mag- nésio. Para administração oral, uma composição não tóxica farmaceutica- mente aceitável é formada através da incorporação de qualquer um dos ex- cipientes normalmente empregados, tais como aqueles carreadores anteri- ormente listados, e geralmente 10% a 95% de ingrediente ativo (por exem- plo, peptídeo). Uma formulação não sólida pode também ser usada para administração enteral. O carreador pode ser selecionado de vários óleos incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral ou óleo de sésamo. Excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, celulo- se, talco, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato glicerol, clo- retode sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol.

i Ácidos nucleicos, peptídeos, moléculas pequenas ou polipepti- deos da invenção, quando administrados oralmente, podem ser protegidos de digestão. Isso pode ser realizado ou através de complexação do ácido nucleico, peptídeo ou polipeptídeo com uma composição para torna-lo resis- tente a hidrólises ácida e enzimática ou através do empacotamento do ácido nucleico, peptídeo ou polipeptídeo em um carreador apropriadamente resis- tente tal como um lipossoma. Meios de proteção de compostos contra diges- tão são bem conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Fix, Pharm. Res. 13:1760-1764, 1996; Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135, 1996; Pat US. No 5.391.377, descrevendo composições de lipídeo para aplica- ção oral de agentes terapêuticos (por exemplo, aplicação lipossomal). Em uma modalidade, Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode ser aplicado ao canal alimentar ou intestino do indivíduo através de administra- ção oral que pode suportar digestão e degradação.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lacto- se, celulose microcristalina ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exem- plo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem conhecidos na técnica. Preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comes- tíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acá- | 15 cia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo ationd, ésteres oleosos, álco- : ol de etila ou óleos vegetais fracionados); e preservativos (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem tam- bém conter sais de tamponamento, agentes de saborização, coloração e adoçantes conforme apropriado.

Preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para permitir liberação controlada do agente ativo. Para adminis- tração bucal as composições farmacêuticas podem tomar a forma de com- primidos ou pastilhas formulados de uma maneira convencional. Para admi- nistração através de inalação, as composições para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente aplicadas na forma de uma apre- sentação de spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodi- fluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através da provisão de uma válvula para mm im TEA a a rm mm mao a a AE a a nd mam a o AA a a a A a na a a o a a ra ma Dm do uma mistura de pó dos agentes terapêuticos e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode ser apli- cado em um sistema de liberação controlada.

Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado usando infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, um emplastro transdermal, lipossomas ou outros modos de ad- ministração.

Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra; Sefton, CRC Crit.

Ref.

Biomed.

Eng. 14:201 (1987); Buchwald e ou- tros, Surgery 88:507 (1980); Saudek e outros, N.

Engl.

J.

Med. 321:574 (1989)). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (vide Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds), CRC Press, Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova York (1984); | Ranger e Peppas, J.

Macromol.

Sci.

Rev.

Macromol.

Chem. 23:61 (1983); vide também Levy e outros, Science 228:190 (1985); During e outros, Ann. ; Neurol. 23:351 (1989); Howard e outros, J.

Neurosurg. 71:105 (1989)). Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser posto em proximidade do alvo terapêutico, então requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão de Langer (Science 249:1527- 1533 (1990). As composições terapêuticas podem ser formuladas para admi- nistração parenteral através de injeção, por exemplo, através de injeção de bolo ou infusão contínua.

Formulações para injeção podem ser apresenta- das em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipi- entes multidose, com um preservativo adicionado.

As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos o- leosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agen- tesde suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Alternativamente, o ingredi- Ada ANA RA ad aa Emma AA RA ARA AAA ARA AAA IA ammfantia ads

Vias de administração enterais adequadas para os presentes métodos incluem aplicação oral, retal ou intranasal. Vias de administração parenterais adequadas incluem administração intravascular (por exemplo, injeção de bolo intravenosa, infusão intravenosa, injeção de bolo intra- arterial, infusão intra-arterial e instilação por cateter na vasculatura); injeção peri- e intra-tecido (por exemplo, injeção peri-tumoral e intra-tumoral, injeção intra-retinal ou injeção subretinal); injeção subcutânea ou deposição incluin- do infusão subcutânea (tal como através de bombas osmóticas); aplicação direta ao tecido de interesse, por exemplo, através de um cateter ou outro dispositivo de colocação (por exemplo, um pelete retinal ou um supositório ou um implante compreendendo um material poroso, não poroso ou gelati- noso); e inalação. Por exemplo, Spexin ou um composto de modulação de Spexin da invenção pode ser administrado através de injeção, infusão ou | aplicação oral.

: 15 Em adição às formulações descritas anteriormente, as composi- . ções terapêuticas podem ser também formuladas como uma preparação depósito. Tais formulações de ação longa podem ser administradas através de implante (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou a- través de injeção intramuscular. Por exemplo, as composições terapêuticas — podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de jon, ou como derivados levemente solúveis, por exemplo, como um sal levemente solúvel.

Administração sistêmica pode ser também através de meio transmucosal ou transdermal. Para administração transmucosal ou trans- dermal, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal sais de bile e deri- vados de ácido fúsico. Ainda, detergentes podem ser usados para facilitar permeação. Administração transmucosal pode ser através de sprays nasais

O IR E A E RS A mente conhecido na técnica. Uma solução de lavagem pode ser usada lo- calmente para tratar uma lesão ou inflamação para acelerar cicatrização. Para administração oral, as composições terapêuticas são formuladas em formas de administração oral convencionais tais como cápsulas, comprimi- dosetônicos.

Uma composição da presente invenção pode ser também formu- lada como uma formulação de liberação sustentada e/ou cronometrada. Tais formulações de liberação sustentada e/ou cronometrada podem ser feitas através de meios de liberação ou dispositivos de aplicação sustentada que são bem conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica, tais como aqueles descritos nas Patentes Norte-americana Nos. 3.845.770; 3.916.899;

3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 4.710.384; 5.674.533; 5.059.595;

5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; e 5.733.566, cujos i relatórios descritivos são aqui incorporados a título de referência. As compo- ] 15 sições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para prover : liberação lenta ou sustentada de um ou mais dos ingredientes ativos usando, por exemplo, hidroxipropilmetil celulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos multicamada, micropartículas, lipossomas, microesferas, ou similar, ou uma combinação dosmesmos para prover o perfil de liberação desejado em proporções vari- áveis. Formulações de liberação sustentada adequadas conhecidas daque- les de habilidade comum na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, podem ser prontamente selecionadas para uso com as composições farmacêuticas da invenção. Formas adequadas de dosagem unitária simples para adminis- tração oral, tal como, mas não limitado a, comprimidos, cápsulas, cápsulas em gel, cápsulas ou pós que são adaptados para liberação sustentada, são compreendidas pela presente invenção.

Nos presentes métodos, Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode ser administrado ao indivíduo ou como um RNA, em conjun- tocomum reagente de aplicação, ou como um ácido nucleico (por exemplo, mA uaitnr na niaeonmísas A adeal eeanmmbinantat anna DIANaAMAM an Ansinaa administração de Spexin ou um composto de modulação de Spexin incluem o reagente lipofílico Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; ou policátions (por exemplo, polilisina) ou lipossomas.

A dosagem administrada pode ser uma quantidade terapeutica- mente eficaz da composição suficiente para resultar em melhora de sinto- mas de obesidade ou um distúrbio associado à obesidade em um indivíduo e pode variar dependendo de fatores tais como as características farmacodi- nâmicas do ingrediente ativo e seu modo e via de administração; momento de administração de ingrediente ativo; idade, sexo, saúde e peso do recipi- ente; natureza e extensão de sintomas; tipo de tratamento concomitante, frequência de tratamento e o efeito desejado; e taxa de excreção. . Em uma modalidade, Spexin é administrada em uma dose de , maneira a atingir uma concentração no plasma de cerca de 10 ng/ml a cerca de 20 ng/ml em pacientes obesos ou pacientes afligidos com um distúrbio associado à obesidade.

Em algumas modalidades, a quantidade eficaz da ' Spexin administrada é pelo menos cerca de 1 ng/ml, pelo menos cerca de 2 ng/ml, pelo menos cerca de 3 ng/ml, pelo menos cerca de 4 ng/ml, pelo me- nos cerca de 5 ng/ml, pelo menos cerca de 7,5 ng/ml, pelo menos cerca de 10 ng/ml, pelo menos cerca de 15 ng/ml, pelo menos cerca de 20 ng/ml, pelo menos cerca de 25 ng/ml, pelo menos cerca de 30 ng/ml, pelo menos cerca de 35 ng/ml, pelo menos cerca de 40 ng/ml, pelo menos cerca de 45 ng/ml, pelo menos cerca de 50 ng/ml, pelo menos cerca de 60 ng/ml, pelo menos cerca de 70 ng/ml, pelo menos cerca de 80 ng/ml, pelo menos cerca de 90 ng/ml, pelo menos cerca de 100 ng/ml, pelo menos cerca de 125 ng/ml, pelo menos cerca de 150 ng/ml, pelo menos cerca de 175 ng/ml, pelo menos cer- ca de 200 ng/ml, pelo menos cerca de 250 ng/ml, pelo menos cerca de 300 ng/ml, pelo menos cerca de 350 ng/ml, pelo menos cerca de 400 ng/ml, pelo menos cerca de 450 ng/ml, pelo menos cerca de 500 ng/ml, pelo menos cer- ca de 600 ng/ml, pelo menos cerca de 700 ng/ml, pelo menos cerca de 800 ng/ml, pelo menos cerca de 900 ng/ml, pelo menos cerca de 1000 ng/ml, RA E ASA ado A asaHAR AasRR da ABRA anta an oaia ca de 2500 ng/ml, pelo menos cerca de 2750 ng/ml, pelo menos cerca de 3000 ng/ml, pelo menos cerca de 3500 ng/ml, pelo menos cerca de 3750 ng/ml, pelo menos cerca de 5000 ng/ml, pelo menos cerca de 7500 ng/ml ou pelo menos cerca de 10.000 ng/ml.

Em uma modalidade, Spexin é adminis- tradaem uma dose de 0,2 ml de Spexin por dia (2500 ng/mL). Em outra mo- dalidade, Spexin é administrada através de injeção intraperitoneal (IP) diária.

Em outras modalidades, a quantidade eficaz do composto de modulação de Spexin administrada é pelo menos cerca de 0,01 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,025 pg/kg em peso corporal, pelo me- nos cerca de 0,05 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,075 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,1 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,25 pg/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,5 p- 9/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 0,75 ug/kg em peso corporal, | pelo menos cerca de 1 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 5 yp- ' 15 g/kgem peso corporal, pelo menos cerca de 10 ug/kg em peso corporal, pe- lo menos cerca de 25 pg/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 50 yp- 9g/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 75 pug/kg em peso corporal, pe- lo menos cerca de 100 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 150 Vv9g/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 200 upg/kg em peso corporal, pelomenos cerca de 250 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 300 Vvg/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 350 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 400 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 450 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 500 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 550 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 600 ug/kgem peso corporal, pelo menos cerca de 650 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 700 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 750 uvg/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 800 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 850 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 900 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de 950 ug/kg em peso corporal, pelomenos cerca de 1000 ug/kg em peso corporal, pelo menos cerca de RO A A RE AE E AB AA EA go ug/Kkg em peso corporal.

Em uma modalidade, Spexin ou composto de modulação de Spexin é administrado pelo menos uma vez por dia. Em outra modalidade, Spexin ou composto de modulação de Spexin é administrado pelo menos duas vezes por dia. Em algumas modalidades, Spexin ou um composto de modulação de Spexin é administrado por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas ou por pelo menos 12 semanas. Em modalidades adicionais, Spexin /ou um composto de modulação de Spexin é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

Toxidez e eficácia terapêutica de composições terapêuticas da presente invenção podem ser determinadas através de procedimentos far- macêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por e- í 15 xemplo, para determinação da LDs, (a dose letal para 50% da população) e . da EDs, (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LDsY/EDso. Agentes terapêuticos que exibem índices terapêuticos grandes são úteis. As composições terapêuticas que exibem alguns efeitos colaterais tóxicos podem ser usadas.

Uma dose terapeuticamente eficaz de Spexin ou um composto de modulação de Spexin pode depender de vários fatores conhecidos da- queles de habilidade comum na técnica. A dose(s) de Spexin ou um com- posto de modulação de Spexin pode variar, por exemplo, dependendo da identidade, tamanho e condição do indivíduo ou amostra sendo tratado, de- pendendo ainda da via através da qual a composição deve ser administrada, se aplicável, e do efeito que o praticante deseja que a Spexin ou um com- posto de modulação de Spexin tenha sobre o ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção. Essas quantidades podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica.

E ma ia ni fianm nm EREA£A Ima nm foshatiftuínasan Aa Drafeínsn distúrbio associado à obesidade em um indivíduo. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao indivíduo Spexin ou um composto de modulação de Spexin, o qual pode ser um polipeptídeo, molécula pequena, anticorpo ou um ácido nucleico.

Várias abordagens podem ser realizadas para restaurar a ativi- dade ou função de um gene de Assinatura de Obesidade (OS) (por exemplo, Spexin) em um indivíduo, tais como aqueles carregando um locus de gene Spexin alterado. Por exemplo, fornecimento de função da Spexin do tipo sel- vagem a tais indivíduos pode suprimir expressão fenotípica de obesidade ou um distúrbio relacionado à obesidade em um indivíduo. Níveis de expressão ou atividade de Spexin altos podem ser obtidos através de terapia de gene ou proteína.

Um ácido nucleico codificando um gene de OS, ou uma parte funcional do mesmo (tal como Spexin), pode ser introduzido nas células de ; 15 um indivíduo. Por exemplo, o gene Spexin do tipo selvagem (ou uma parte ; funcional do mesmo) pode ser também introduzido nas células do indivíduo com necessidade do mesmo usando um vetor conforme aqui descrito. O ve- tor pode ser um vetor viral ou um plasmídeo. O gene pode ser também intro- duzido como DNA nu. O gene pode também ser provido de maneira a inte- grarno genoma das células hospedeiro recipientes ou permanecer extra- cromossomal. Integração pode ocorrer aleatoriamente ou em sítios precisa- mente definidos, tal como através de recombinação homóloga. Por exemplo, uma cópia funcional do gene Spexin pode ser inserida em substituição a uma versão alterada em uma célula, através de recombinação homóloga.

Técnicas adicionais incluem pistola de gene, transfecção mediada por lipos- soma ou transfecção mediada por lipídeo catiônico. Terapia de gene pode ser obtida através de injeção de gene direta ou através da administração ex vivo de células geneticamente modificadas preparadas expressando um po- lipeptídeo funcional.

Aplicação de ácidos nucleicos a células viáveis pode ser realiza- A At As fm noi da adm atração Na mm ne aosiareo E mais AcnAmifiRA ciado ou um retrovírus) ou ex vivo através do uso de métodos de transferên- cia de DNA físicos (por exemplo, lipossomas ou tratamentos químicos). Téc- nicas não limitantes adequadas para a transferência de ácido nucleico a cé- lulas de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, mi- croinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano e o método de precipitação de fos- fato de cálcio (vide, por exemplo, Anderson, Nature, suplemento do vol. 392, no. 6679, pp. 25-20 (1998)). Introdução de um ácido nucleico ou um gene codificando um polipeptídeo da invenção pode também ser obtida com subs- tratos extracromossomais (expressão transiente) ou cromossomos artificiais (expressão estável). As células podem também ser culturadas ex vivo na presença de composições terapêuticas da presente invenção a fim de proli- ferar ou produzir um efeito desejado sobre ou atividade em tais células. As células tratadas podem então ser introduzidas in vivo para propósitos tera- | pêuticos.

: 15 Os ácidos nucleicos podem ser inseridos em vetores e usados R como vetores de terapia de gene. Vários vírus têm sido usados como veto- res de transferência de gene, incluindo papovavírus, por exemplo, SV40 (Madzak e outros, 1992), adenovírus (Berkner, 1992; Berkner e outros, 1988; Gorziglia e Kapikian, 1992; Quantin e outros, 1992; Rosenfeld e outros, 1992; Wilkinson e outros, 1992; Stratford-Perricaudet e outros, 1990), vírus vaccínia (Moss, 1992), vírus adenoassociado (Muzyczka, 1992; Ohi e outros, 1990), herpesvírus incluindo HSV e EBV (Margolskee, 1992; Johnson e ou- tros, 1992; Fink e outros, 1992; Breakfield e Geller, 1987; Freese e outros, 1990) e retrovírus de ave (Biandyopadhyay e Temin, 1984; Petropoulos e outros, 1992), murino (Miller, 1992; Miller e outros, 1985; Sorge e outros, 1984; Mann e Baltimore, 1985; Miller e outros (1988) e origem humana (Shimada e outros, 1991; Helseth e outros, 1990; Page e outros, 1990; Bu- chschacher e Panganiban, 1992). Exemplos não limitantes de técnicas de transferência de gene in vivo incluem transfecção com vetores virais (por exemplo, retrovirais) (vide Patente U.S. No. 5.252.479, que é aqui incorpora- da 2 título de referência em sua totalidade) e transfeccão mediada por orofe-

11:205-210 (1993), incorporado aqui a título de referência). Por exemplo, vacinas de DNA nu são geralmente conhecidas na técnica; vide Browner, Nature Biotechnology, 16:1304-1305 (1998), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Vetores de terapia de gene podem ser apli- cadosaunm indivíduo através de, por exemplo, injeção intravenosa, adminis- tração local (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.328.470) ou através de injeção estereotática (vide, por exemplo, Chen e outros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). A preparação farmacêutica do vetor de tera- pia de gene pode incluir o vetor de terapia de gene em um diluente aceitável ou pode compreender uma matriz de liberação lenta onde o veículo de apli- cação de gene é incrustrado. Alternativamente, onde o vetor de aplicação de gene completo pode ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de aplicação de gene.

Para revisões de protocolos e métodos de terapia de gene vide * Anderson e outros, Science 256: 808-813 (1992); Patentes U.S. Nos.

5.252.479; 5.747.469; 6.017.524, 6.143.290,6.410.010, 6.511.847; e Publi- cações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2002/0077313 e 2002/00069, que são todos aqui incorporados a a título de referência em suas totalidades. Para revisões adicionais de tecnologia de terapia de gene vide Friedmann, Science, 244:1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); Miller, Nature, 357:455-460 (1992); Kikuchi e outros, J. Dermatol. Sci. Maio de 2008;50(2):87-89; Isaka e outros, Expert Opin Drug Deliv. Setembro 2007;4(5):561-71; Jager e outros, Curr. Gene Ther. Agosto 2007;7(4):272- 83; Waehler e outros, Nat. Rev. Genet. Agosto 2007;8(8):573-87; Jensen e outros, Ann. Med. 2007;39(2):108-15; Herweijer e outros, Gene Ther. Janeiro 2007;14(2):99-107; Eliyahu e outros, Molecules, 31 de janeiro 2005;10(1):34- 64; e Altaras e outros, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2005;99:193-260, to- dos aqui incorporados a título de referência em suas totalidades. Terapia de substituição de proteína pode aumentar a quantidade A mn e aa E a ma ia mn Ar a a ama Um mae rm ia dr am an a Fam A EE a nen a am a amo mana AE Em de ser sintetizado de acordo com técnicas químicas conhecidas ou pode ser produzido e purificado através de técnicas de biologia molecular conhecidas. Terapia de substituição de proteína foi desenvolvida para vários distúrbios.

Por exemplo, uma proteína do tipo selvagem pode ser purificada a partir de um sistema de expressão celular recombinante (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto — vide Patente U.S. No. 5.580.757 para Des- nick e outros; Patentes U.S. Nos. 6.395.884 e 6.458.574 para Selden e ou- tros; Patente U.S. No. 6.461.609 para Calhoun e outros, Patente U.S. No.

6.210.666 para Miyamura e outros; Patente U.S. No. 6.083.725 para Selden e outros; Patente US. No. 6.451.600 para Rasmussen e outros; Patente U.S. No. 5.236.838 para Rasmussen e outros e Patente U.S. No. 5.879.680 para Ginns e outros), placenta humana ou leite animal (vide Patente U.S.

No. 6.188.045 para Reuser e outros) ou outras fontes conhecidas na técnica.

. | Após a infusão, a proteina exógena pode ser absorvida por tecidos através | 15 demecanismo não específico ou mediado por receptor.

] Esses métodos descritos aqui não são de maneira alguma ple- namente abrangentes, e métodos adicionais para se adequar à aplicação específica são compreendidos pelo versado comum na técnica. Além disso, a quantidade eficaz das composições pode ser ainda aproximada através de —analogiaa compostos conhecidos exercer o efeito desejado.

A menos que de outra maneira definido, todos os termos técni- cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente compre- endido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção per- tence. Métodos e materiais exemplares são descritos abaixo, embora méto- dose materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser também usados na prática ou teste da presente invenção.

Todas as publicações e outras referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade, como se cada pu- blicação ou referência individual fosse especificamente e individualmente indicada ser incorporada a título de referência. Publicações e referências meancrinhadas aci não cão admitidas car tárnicra antarionr

São providos aqui exemplos para facilitar uma compreensão mais completa da invenção. Os exemplos que seguem ilustram os modos exemplares de realização e prática da invenção. No entanto, o escopo da invenção não é limitado às modalidades específicas reveladas nesses E- — xemplos, que são para propósitos de ilustração apenas, uma vez que méto- dos alternativos podem ser utilizados para obter resultados similares. Exemplo 1 — IDENTIFICAÇÃO DE SPEXIN COMO UM FATOR DE SACIE- DADE POTENCIAL QUE É APROXIMADAMENTE 15 VEZES SUBEX-

PRESSA EM GORDURAS OMENTAL E SUBCUTÂNEA EM PACIENTES

OBESOS Modelos humanos e de camundongo de obesidade para níveis de Spexin no soro através de radioimunoensaio (RIA) estão sendo testados para verificar se níveis de Spexin em circulação se relacionam com níveis de ' expressão de depósito em tecido. Também, Westem blot de tecidos huma- nos estão sendo realizados para medir níveis de expressão e determinar ' pesos moleculares de peptídeos expressos. A sequência genômica e o mR- NA expresso de Spexin de fontes humanas (ambos obesos e normais) estão sendo caracterizados para verificar se variantes de sequência (por exemplo, SNPs, inserções, deleções, etc) são responsáveis pela expressão diferencial de Spexin, ou se variantes de união desconhecidas de Spexin existem, que não são reconhecidas pela sonda nas disposições Codelink usadas nesses estudos. Usando análise de microdisposição de genoma integral de a- mostras de gordura humana de dois depósitos diferentes, níveis de expres- sãode gene entre pacientes obesos vs. peso normal foram comparados (Fi- gura 1). Vários milhares de genes que são significantemente diferencialmen- te expressos entre os dois grupos foram identificados (p<0,05, sem nenhu- ma correção para teste múltiplo). Desses, o gene com a subexpressão maior (mudança de 14,9 vezes) em gordura de obeso foi Spexin (nor = 24,95 vs obeso=1,68;p=0,00292; "Peptídeo A" na Figura 9), um hormônio de pep- tíden serretado recentemente identificado aue induz contrações no estôma-

Uma vez que Spexin é significantemente subexpressa por am- bas as gorduras omental e subcutânea em pacientes obesos, e tem ativida- de biológica no intestino, sem ser limitado pela teoria, ela é um fator expres- so por tecidos de gordura de normal para indicar saciedade. Sem ser limita- do pelateoria, a falta quase que completa de expressão de Spexin em gor- dura de obeso pode contribuir para a perda de alça de feedback que nor- malmente inibe ingestão de alimento e armazenamento de energia/lipídeo, levando à obesidade. Sem ser limitado pela teoria, Spexin é expressa por adipócitos sob condições normais para indicar um estado saciado ou saturado de ener- gia. Desta maneira, sob condições normais, esta sinalização teria um efeito de amortecimento sobre comportamento de procura por energia.

MATERIAIS E MÉTODOS . Pacientes. A população de estudo consistia em 11 pacientes so- frendo procedimentos cirúrgicos laparoscópicos abdominais clinicamente indicados, que consentiram em remoção de uma amostra de gordura omen- tal durante a cirurgia para estudos de transporte de LCFA e uma amostra de sangue venoso para a medição de níveis no plasma de insulina e Leptina. Sete dos pacientes (todos do sexo feminino) eram obesos e estavam so- frendo procedimentos de cirurgia bariátrica relacionados à sua obesidade. Os outros quatro pacientes (todos do sexo feminino) eram não obesos e es- tavam sofrendo uma variedade de outros procedimentos laparoscópicos cli- nicamente indicados. Estudos de Expressão de Gene Coleta de tecido: Amostras de gordura foram coletadas no mo- mento da cirurgia bariátrica. Um a dois gramas de tecido foram postos em RNaAlater a -80ºC para armazenamento a longo prazo. Isolamento de RNA total: As amostras de gordura foram des- congeladas, então homogeneizadas em 5 ml de TRizol (Invitrogen). Após separação por fase padrão e isolamento de RNA, o pelete foi ressuspenso em águia tampão de lise RET e etanol nara limpeza de RNA e tratamento

A2Z60/A280 > 2,0. A integridade do RNA total foi verificada pela presença de picos 188 e 288 robustos no eletroferograma BioAnalyzer. Marcação e hibridização direcionadas de microdisposição: cRNA marcado com biotina foram gerados através de procedimentos estabeleci- dos. Em suma, 2 ug de RNA total foram usados para síntese cDNA ds. Este foi incubado com 11-UTP marcado com biotina em uma reação de transcri- ção in vitro. cRNA foi purificado através de colunas Nreasy (Qiagen) e quan- tificado através de espectrometria UV a 260 nm. A distribuição de tamanho do cRNA marcado com biotina foi verificada em um Bioanalyzer (Agilent). 10 ugdeckRNA fragmentado foram hibridizados da noite para o dia em micro- disposições CodeLink Human 10K. cRNAs hibridizados foram detectados através de Streptavidina- Cy5 flur (GE Healthcare). Análise de dados: Detecção de ponto foi realizada com o scan- . ner GenePix Series B (Axon Instruments) e quantificação de ponto foi reali- zada usando CodeLinkº Expression Analysis v5.0. Parâmetros de quantifi- : cação-chave são descritos rapidamente aqui. Subtração de base local é rea- lizada nas intensidades de ponto individuais, seguido por uma escala de ca- da disposição individualmente com base na intensidade de disposição geral. Após normalização média, os conjuntos de dados individuais foram enviados parao suite de análise de dados de microdisposição GenesSifeter para análi- se adicional.

RESULTADOS Identificação de Ch12; orf39 (Spexin) como significantemen- te subexpressa em gordura de obeso. O ponto de dado de tenomodulina é identificado para validar o conjunto de dados, uma vez que esse gene foi recentemente relatado ser superexpresso em amostras de gordura de obeso (Figura 1; Tolppanen, 2007; Saki, 2009). Outro biomarcador é quitinase, que indica ativação de macrófago, refletindo um estado inflamatório que é bem conhecido em obesidade (Figura 1). Ambas a Spexin e a anidrase carbônica são significantemente superexpressas em gordura de normal comparado com anrdura de nhbeso (Figura 1)

(Mirabeau, 2007; Rucinski, 2010) e um fator de saciedade potencial que é subexpresso em gordura de obeso (Figura 1). A Tabela 1 mostra dados de expressão de mRNA para Spexin. Tabela 1. Dados de Expressão de mRNA de Spexin, amostra poramostra | Grupo | Condição | N | Média | SEM | SEM/Média | 8 | 24,9532 Por Alvo | Grupo || Amostra Expressão Normalizada Média Subcu 11212 :

0.239 Omental Normal De todos os genes que são subexpressos em gordura de obeso, Spexin demonstra a maior mudança de vezes entre amostras obesas (1,687) e normais (24,95) (p<0,00292) (Figura 2, Tabela 2).

por grupo [obeso vs. normal]). Análise estatística através do Teste t bilateral, supondo variância desigual nos 2 conjuntos de amostra (p=0,00292). o Obeso o — Normal = 2,1212 22,1529 5,5443 45,335 1,8812 16,7751 1,2796 29,0327 0,4901 19,6793 1,5738 8,5981 0,2394 10,3961 2,6547 47,6567 2,6115 0,6285 0,3092 0,909 — 1686875 2495824 A Spexin é um peptídeo recém-identificado com atividade GI. Mi- . rabeau e outros (2007) foi o primeiro relatório descrevendo Spexin, e eles usaram análise de modelagem Markov com base em características comuns a hormônios de peptídeo, para encontrar novos em sequências de proteoma humanas. Um dos hormônios identificados foi Spexin, que demonstrou ativi- dade contrátil em ensaio de explante de estômago de rato, indicando uma atividade biológica. Spexin é secretada. Wan e outros (2010) descreveram secreção sensível à brefeldina A (BFA) de Spexin a partir de células trans- fectadas, indicando um mecanismo dependente de golgi e que ela desem- penha um papel na função biológica da placenta. A Spexin é conservada dentre várias espécies conforme indicado no alinhamento de sequência múl- tiplo de homólogos de Spexin mostrados na Figura 3.

REFERÊNCIAS 1: Mirabeau O, Perlas E, Severini C, Audero E, Gascuel O, Pos- senti R, Birney E, Rosenthal N, Gross C. Identification of novel peptide hor- mones in the human proteome by hidden Markov model screening. Genome Res. 2007 Mar;17(3):320-7. Epub 2007 Feb 6. 2: Rucinski M, Porzionato A, Ziolkowska A, Szyszka M, Macchi V, De Caro R, Malendowicz LK. Expression of the spexin gene in the rat ad-

3: Saiki A, Olsson M, Jernas M, Gummesson A, McTernan PG, Andersson J, Jacobson P, Sjoholm K, Olsson B, Yamamura S, Walley A, Froguel P, Carlisson B, Sjostom L, Svensson PA, Carisson LM. Tenomodulin is highly expressed in adipose tissue, increased in obesity, and down-regulated during diet-induced weight loss. J Clin Endocrinol Metab. 2009 Oct; 94(10): 3987-94.

4: Tolppanen AM, Pulkkinen L, Kolehmainen M, Schwab U, Lindstrom J, Tuomilehto J, Uusitupa M; Finnish Diabetes Prevention Study Group. Tenomodulin is associated with obesity and diabetes risk: the Finnish diabetes prevention study. Obesity (Silver Spring). 2007 Exemplo 2 —- EXPRESSÃO DE SPEXIN EM AMOSTRAS DE SORO DE O-

BESOS E NORMAIS O Exemplo 1 discute a subexpressão significante de Spexin em | amostras de gordura omental e subcutânea de pacientes obesos. Desta ma- neira, foi decidido ensaiar Spexin em amostras de soro de pacientes obesos e em peso normal, para verificar se as diferenças em expressão de gene de gordura de obeso resultaram em diferenças significantes em níveis de Spe- xin em circulação. Os níveis de Leptina foram também medidos uma vez que a Leptina é conhecida ser uma adipocina em circulação que é elevada no estado obeso. Sem ser limitado pela teoria, Spexin e Leptina em circulação podem ser hormônios "antagonísticos"/adipocinas que estão envolvidos na regulagem de saciedade, ingestão de alimento e peso corporal.

Amostras de Soro: Amostras de soro de 7 pacientes do sexo feminino humanos obesos e 7 em peso normal foram ensaiadas nesses es- tudosiniciais.

Ensaio de Spexin: Os níveis de Spexin em circulação no soro foram ensaiados usando o EIA kit Spexin / NPQ (humano, camundongo, bo- vino) da Phoenix Pharmaceuticals, Inc., No. Catálogo EK-023-81, No. Lote

601716. Este estojo mede o que é acreditado ser o peptídeo bioativo, pro- cessado: Dm A o RE AD RA A ES E ASA Ad ZM ADS

A natureza (sequência e estrutura primárias) de spexina em cir- culação em soro humano não foi confirmada, nem foi relatada em qualquer literatura até agora. O ensaio usado foi projetado para detectar o peptídeo SEQ ID NO:3.

A faixa de detecção de spexin em circulação é 0-100 ng/mL. Uma vez que este EIA é um ensaio de competição, a densidade óptica me- dida (OD) a 450 nm é inversamente proporcional à quantidade de antígeno livre na amostra (vide Figura 4).

Com a constatação de subexpressão significante de Spexin em amostras de gorduras omental e subcutânea de pacientes obesos (vide Fi- gura 5), as concentrações de Spexin foram ensaiadas em amostras de soro de pacientes obesos e com peso normal para verificar se a expressão de gene reduzida em gordura de obeso resultou em diferenças significantes em níveis de Spexin em circulação. A Spexin em circulação é aproximadamente 1/10º menor em concentração em soro de obeso, que está em concordância plausível com a diferença de 15 vezes em expressão de gene Spexin relata- da acima (Figura 5). A Leptina é conhecida ser elevada no estado obeso. Sem dese- jar ser limitado pela teoria, Spexin e Leptina em circulação podem ser hor- —mônios/adipocinas "antagonísticos" ou de contrabalanceamento que estão envolvidos na regulagem de saciedade, ingestão de alimento e peso do cor- po. A magnitude da diferença relatada na Figura 6 (0,69/0,15 = aumento de 4,6 vezes em Leptina em circulação em soro de obeso) é equivalente àquela relatada por Considine e outros (1996), onde a magnitude de aumento em Leptina em circulação em pacientes obesos foi 4,17 vezes usando um RIA recém-desenvolvido. Considine e outros ensaiaram Leptina humana em cir- culação em homens e mulheres obesos (n=139 homens e mulheres) vs. pe- so normal (n=136). Os níveis de Leptina médios (+/- SD) foram 31,3 +/- 24,1 ng/mL em pacientes obesos e 7,5 +/- 9,3 ng/mL em pacientes em peso nor- mal Os níveis de Leptina em circulação são significantemente maiores em 25 o a bia ira da a rm a o A aa ano AM RA soro de pacientes obesos e controles em peso normal apoia a ideia que es- ses dois peptídeos desempenham papéis antagonísticos na regulagem nor- mal de fome, saciedade, peso corporal e adiposidade (Figura 7). Sem ser limitado pela teoria, cada hormônio pode servir como parte de uma alça de feedback negativa, onde um aumento em um leva a uma diminuição do outro (e vice versa). Na ausência de Spexin em circulação, Leptina é superexpres- sa na gordura, e é subproduzida no soro. Desta maneira, quando Spexin é subexpressa em gordura, levando a uma diminuição significante de Spexin em circulação, a Leptina é superexpressa na gordura de pacientes obesos, resultando em níveis patofisiológicos de Leptina no soro.

O cálculo das razões de valores negativamente correlacionados pode aumentar as diferenças em expressão de gene entre os grupos, e ser- ve como marcadores de diagnóstico sensíveis e confiáveis (Gordon e outros, 2002, 2002) para distinguir grupos. Uma extensão desta ideia é apresentada na Figura8, onde razões de expressão de proteína confirmam as classifica- ções baseadas em BMls. Embora isso possa não parecer adicionar nenhu- ma informação nova neste momento, pode ser possível no futuro, uma vez mais amostras sendo analisadas, distinguir subclasses (síndrome metabóli- ca, pré-diabética, obeso mórbido, hiperlipidêmico, etc) de pacientes em cada grupo com «este algoritmo.

Referências: 1 : Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, Kriauciunas A, Ste- phens TW, Nyce MR, Ohannesian JP, Marco CC, McKee LJ, Bauer TL, et al. Serum immunoreactive-Leptin concentrations in normal- weight and obese humans. NEnglJ Med. 1996 Feb |;334(5):292-5.

2: Gordon GJ, Jensen RV, Hsiao LL, Gullans SR, Blumenstock JE, Richards WG, Jaklitsch MT, Sugarbaker DJ, Bueno R. Using gene ex- pression ratios to predict outcome among patients with mesothelioma. J Nat! Cancer Inst. 2003 Apr 16;95(8):598-605. PubMed PMID: 12697852.

3: Gordon GJ, Jensen RV, Hsiao LL, Gullans SR, Blumenstock JE, A A AA dA ISA a ARTES AN dana IR E ASIA EA ERA AE AREAS ratios in lung cancer and mesothelioma. Cancer Res. 2002 Sep |; 62(17):4963-7. Exemplo 3 — INFUSÃO DE SPEXIN PARA DETERMINAR O PAPEL DA

SPEXIN EM SACIEDADE Experimentos de determinação de dose inicial. Ambos os ca- mundongos em peso normal e com dieta com alto teor de gordura obesos serão testados quanto aos níveis de circulação de Leptina, insulina e Spexin. O Nível de Spexin em soro humano é aproximadamente 10 ng/ml em indiví- duos normais (por exemplo, indivíduos não obesos), desta maneira, as qua- tro doses que seguem serão testadas nos estudos iniciais: cerca de 3 ng, cercade 10 ng,cerca de 30 ng, cerca de 100 ng, cerca de 1 ug, cerca de 10 ug e cerca de 100 ug.

A Spexin de grau farmacêutico (um peptídeo de 14 aminoácidos normalmente circulando em camundongos e humanos) foi sintetizada atra- vés de química de estado sólido convencional e purificada para >95% de identidade pela Phoenix Pharmaceuticals (Burlingame, CA). Este agente se- rá solubilizado em solução salina estéril 1X (pH 7,4) em quatro concentra- ções diferentes, de maneira que doses de 1,5 ua/kg/QD, 5 ug/kg/QD, 15 yp- 9/k9g/QD ou 50 ug/kg/QD podem ser administradas a 5 camundongos em cada grupo de dose. As doses finais de 3 ug/kg/dia, 10 upg/kg/dia, 30 yp- g/kgldia, 100 ug/kg/dia ou 250 upg/Kkg/dia serão aplicadas em volumes de 0,2 mil/dose/dia através de injeções IP. Por exemplo, para aplicar 10 ug total por dia, duas injeções diárias de 5 ug cada serão administradas IP (concentra- ções de estoque de Spexin serão 25 ug/ml). Alternativamente, para aplicar 10 ug por dia, uma injeção diária de 10 ug pode ser também administrada IP (concentrações de estoque de Spexin serão 50 pg/ml). Em um exemplo adi- cional, para aplicar 50 ug por dia, uma injeção diária de 50 ug pode ser tam- bém administrada IP (concentrações de estoque de Spexin serão 2500 yu- g/ml).

Alternativamente, cinco doses de Spexin (3 ng, 10 ng, 30 ng, 100 nge 500 ng) serão administradas por 30 dias através de infusões de arm tr db mama Bra: mean Atinaç aii, Ens nn O ,/ Nite Catammnhra daquelas calculadas para imitar concentrações de Spexin vistas em animais em peso normal. Amostras de sangue serão obtidas semanalmente através da veia caudal para confirmar níveis de circulação de Spexin, Leptina e insu- lina. Os pesos corporais, dieta e consumo de água serão também monitora- doseregistrados diariamente.

Administração de Dose Eficaz de Spexin em Vários Modelos de Obesidade de Murino.

Uma vez uma dose eficaz e segura de Spexin sendo identifica- da, esta será usada para testar os efeitos de Spexin em vários modelos de —murinobem conhecidos de obesidade.

Linhagens de camundongo a serem usadas incluem: (1) base C57BL/6J como controles; (2) camundongos DIO (Obesidade Induzida por Dieta), também conhecidos como Camundongos Alimentados com Dieta com Alto Teor de Gordura; (3) ob/ob; (4) ob/ob tratado com Leptina como um controle positivo; (5) db/db (camundongo diabético); (5) Gordo; e (6) Atarra- cado.

Amostras de sangue serão obtidas semanalmente para confir- mar níveis em circulação de Spexin, Leptina e insulina. Os pesos corporais, dieta e consumo de água serão monitorados e registrados diariamente.

Ajustes de dose de Spexin (se necessário para uma linhagem ou modelo específico) serão iniciados em novos conjuntos de animais.

No final do experimento, camadas de gordura experimental, do coração, fígado e epididimal serão coletadas para análise de absorção de ácido graxo, aRT-PCR e Western blot de transportadores de ácido graxo e enzimas-chave do curso de fosforilação oxidativo. Exemplo 4 — EXPRESSÃO DE LEPTINA É SELETIVAMENTE SUPRARRE-

GULADA EM GORDURA OMENTAL OBESA Introdução: A Leptina é uma adipocina que é expressa por vá- rios depósitos de gordura. Embora estudos anteriores tenham relatado que a expressão de Leptina varia entre tecidos omental, subcutâneo e mesentéri- E O A E A A dE E ao

Métodos: Amostras cirúrgicas foram coletadas e armazenadas a -80ºC em RNAlater. RNAs totais de depósitos de gorduras omental (7 obe- sos, 4 controle) e subcutânea (5 obesos, 4 controle) foram coletados dos mesmos pacientes. cRNAs foram gerados usando protocolos padrão e hibri- dizados da noite para o dia para microdisposições Codelink Human Whole Genome. Dados de expressão normalizados médios (unidades de expressão arbitrárias) foram analisados pelo pacote GenesSifter Data. Os resultados são apresentados como média +/- SEM. Resultados: Expressão de Leptina total não foi significantemen- temaiorem gordura de obeso vs. normal (90,7 +/- 15,1 vs. 77,7 +/- 24,9). Há uma grande diferença em expressão de Leptina entre gorduras subcutânea e omental de normais (130,5 +/- 30,8 vs. 24,9 +/- 8,6), enquanto em amos- tras de obesos, a diferença em expressão de Leptina entre os depósitos foi menos pronunciada (118,4 +/- 30,0 vs. 71,0 +/- 11,6. sub. vs. omental). À expressão de Leptina não muda entre obesos e normais no depósito subcu- tâneo (130,5 +/- 30,8 vs. 118,4 +/- 30,0). No entanto, um aumento drástico em expressão de Leptina foi visto em amostras de gordura omental de obe- so vs. normal (71,0 +/- 11,6 vs. 24,9 +/- 8,6). Conclusões: O estado obeso altera a expressão de Leptina no depósito omental, enquanto expressão não é modificada em gordura subcu- tânea dos mesmos pacientes. Exemplo 5 — ACÚMULO DE ADIPÓCITO DE ÁCIDOS GRAXOS DE CA- DEIA LONGA EM OBESIDADE É MULTIFATORIAL, RESULTANDO DE

ABSORÇÃO DE ÁCIDO GRAXO ALTA E ATIVIDADE BAIXA DE GENES

ENVOLVIDOS EM UTILIZAÇÃO DE GORDURA Visão geral. A epidemia de obesidade causa morbidez e morta- lidade significantes. Conhecimento do funcionamento celular e expressão de gene em tecido adiposo vai permitir compreensão de patogênese de obesi- dade e indicar alvos terapêuticos. Este Exemplo é direcionado ao estudo dos processos que determinam acúmulo de gordura em tecido adiposo de paci- amina mhaamsa entes de cirurgia bariátrica obesos e doadores em peso normal de sexo compatível.

Adipócitos isolados foram comparados quanto ao tamanho de célula, volume e absorção de ácido graxo de cadeia longa (LCFA). RNAs de gordura omental foram avaliados através de microdisposição de 10K (coorte 1:3 obesos, 3 normais) ou microdisposição de Genoma Integral (coorte 2: 7 obesos, 4 normais). Diferenças estatísticas em expressão de gene e curso foram identificadas no Coorte 1 usando GeneSifter Software (Geospiza) com resultados-chave confirmados nas amostras do Coorte 2 por análise de mi- crodisposição, gRT-PCR e curso.

Adipócitos omentais de obesos tinham área de superfície, volu- me e Vnmax altos para absorção de LCFA saturável.

A Dodecenoil-co-enzima A delta isomerase (DCI), central para metabolismo de LCFA, foi aproxima- damente 1,6 vez subexpressa em gordura de obeso nos Coortes 1 e 2. Ain- da, análise de curso da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics (KEGG) identificou os cursos de Fosforilação Oxidativa e Metabolismo de Ácido Graxo como tendo sub-regulagem não aleatória, coordenada, de ex- pressão de genes em ambos os coortes.

Em gordura omental de obeso, absorção de LCFA de adipócito saturável foi maior do que em controles, e expressão de genes-chave envol- vidosem|lipólisee B-oxidação e metabolismo de ácidos graxos foi reduzida.

Desta maneira, ambos a absorção alta e o metabolismo reduzido de LCFAs contribuem para o acúmulo de LCFAs em adipócitos obesos.

Introdução.

Os estudos (A1-A15) mostraram que absorção de LCFA celular ocorre através de dois processos distintos, dos quais difusão é o componente secundário.

Nas concentrações de LCFA tipicamente encon- tradas entre as refeições, 80-95% de absorção de LCFA celular total são através de um processo de transporte facilitado, regulável, saturável (A7, AB). Estudos em animais e pacientes indicam que regulagem de absorção de LCFA de adipócito é um ponto de controle importante para adiposidade do corpo (A16-21). No entanto, como no fígado (A22-24), muitos processos portante definir o padrão global de expressão de gene em tecido adiposo. Dados publicados indicam que pelo menos 50 genes distintos estão potenci- almente envolvidos no estabelecimento e manutenção de obesidade (A22). Este Exemplo discute processos múltiplos para determinação do acúmulo de gordura em tecido adiposo de pacientes obesos. Tecido adiposo omental foi coletado de pacientes sofrendo cirurgia bariátrica para o trata- mento de obesidade mórbida, e foi analisado como parte de um coorte pe- queno, inicial, de amostras. O estudo forneceu uma constatação patofisioló- gica e uma ilustração valiosa da pesquisa traducional que pode ser realizada através dos esforços combinados de cirurgiões bariátricos e cientistas bási- cos. Ambas as validações técnica e biológica dos resultados originais foram obtidas em um estudo em andamento de um segundo coorte maior de amos- tras de paciente. Também, as mudanças observadas em genes-chave do o primeiro coorte foram validadas usando ambos uma plataforma de microdis- posição alternativa e um gRT-PCR em amostras do segundo coorte.

MATERIAIS E MÉTODOS Pacientes A população de estudo inicial (Coorte 1) consistia em 6 pacien- tes sofrendo procedimentos cirúrgicos laparoscópicos abdominais clinica- mente indicados que consentiram em remover uma amostra de gordura o- mental durante a cirurgia para estudos de transporte de LCFA. Três dos pa- cientes (dois do sexo masculino, um do sexo feminino) eram obesos, e esta- vam passando por procedimentos cirúrgicos bariátricos relacionados à sua obesidade. Apesar da obesidade e do fato que nenhum estava com medica- ções que influenciassem metabolismo de glicose, nenhum dos indivíduos tinha concentrações de glicose no sangue em jejum elevadas. Os três outros pacientes (dois do sexo masculino, um do sexo feminino) eram não obesos, e estavam passando por outros procedimentos laparoscópicos clinicamente indicados. Nenhum era diabético, tinha uma doença inflamatória crônica sig- —nificante ou malignidade ou estava tomando medicações que pudessem in- fluenciar o metabolismo de glicose e — novamente — nenhum tinha glicose no bariátrica do sexo feminino obesos e 4 controles do sexo feminino não obe- sos, todos sofrendo procedimentos cirúrgicos laparoscópicos.

Estudos Fisiológicos Materiais: Ácido oleico 9,10-[H] (OA) (Oleic Acid) foi comprado daNEN Life Science Products, colagenase tipo | para isolamento de adipóci- to da Sigma (St. Louis, MO), albumina de soro bovino livre de ácido graxo (BSA) (Bovine Serum Albumin) da Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN) e estojos RIA específicos de insulina humana e Leptina humana da Linco Re- search, Inc. (St. Charles, MO).

Isolamento de adipócitos: Suspensões de adipócitos humanos foram preparadas através de digestão com colagenase de amostras de gor- dura omental (A2, A9, A16). As suspensões foram mantidas em temperatura ambiente em meio da Eagle modificado com da Dulbecco (DMEM) por até 3 | horas até serem aquecidas para 37ºC para uso (A16) e satisfizeram critérios de viabilidade estabelecidos (A2, A9, A16). Adipócitos isolados foram dimen- sionados para microscopia de luz direta a 100X usando um retículo ocular com o qual os diâmetros celulares foram medidos em unidades arbitrárias (1 U=96 yu). As áreas de superfície (SA) (Surface Areas) de célula médias correspondentes e os volumes de célula (Vol) foram calculados conforme descrito (A25).

Estudos de absorção de LCFA: A taxa inicial de absorção de [?H]- OA pelos adipócitos omentais foi determinada através de filtragem rápi- da conforme descrito (A1, A2, A16). Em suma, suspensões de célula com contagens de célula conhecidas, em 100 ul de DMEM, foram adicionadas a 240 uldeDMEM contendo 500 UM de BSA e concentrações de [º*H]-OA va- riáveis e incubadas por 0-30 s a 37ºC. Em quatro pontos de tempo especifi- cados, a absorção foi parada (A1, A2), as células foram filtradas e lavadas nos filtros e os filtros com as células foram contados através de espectrome- tria de cintilação líquida (A2, A16). Absorção de [H]- OA de adipócito é line- —ardurante os 30 se iniciais de incubação (A2, A16). As inclinações das cur- uvas doa abkbomrnrarãma vareno tamnasa Aim niatiaoso ranracantanaAs ualtninradAaoa Aa em triplicata nesta porção da curva através de regressão linear.

Computações e Ajuste de Dados Cinéticos: A concentração de oleato não ligado ([OA,]) em cada solução de teste foi calculada a partir da razão molar de OA:BSA (v) (A26), usando as constantes de ligação LC- —FA:BSA de Spector e outros (A27). A base lógica para o uso dessas cons- tantes de ligação particulares ao invés de várias alternativas (A28-30) foi relatada em detalhes anteriormente (A8). Com base em análises anteriores (por exemplo, A5-8), medições de velocidade de absorção de oleato iniciais em valores de v de a partir de 0,25-2,0 foram ajustadas para a soma de uma função saturável e uma não saturável do [OA,] correspondente, de acordo com a equação [A1]: UTI(OA.)) = (Vmax * [OAu]) / (Km + [OAJ]) + k + [OA], onde UTI(OA,]) é a medição experimental de absorção, em pmol/seg/50.000 células, na [(OA,]) estipulada; Vmax € Km São a velocidade de absorção máxima do componente de absorção de ácido oleico saturável e o valor de [(OA,]) na metade da velocidade de absorção máxima; e ké a taxa constante para absorção não saturável (A2, A7, A8, A19, A21). Ajuste de dados foi através da versão SAAM Il do programa Simulation, Analysis and Modeling (SAAM) (A31), modificado para execução em um computador PC Lap-top(A32). Estudos anteriores documentaram que, sob as condições específicas empregadas nos presentes estudos, Vo e parâmetros derivados tal como Vmax São medidas de transporte de transmembrana, amplamente sem modificação por fenômenos de transmembrana tal como dissociação limitante de taxa de BSA e os efeitos da camada de água não agitada peri- celular sobre disponibilidade de substrato na superfície celular (A33) ou de ligação intracelular ou metabolismo (A1). Estudos onde um aumento em Vmax foi precedido por um aumento em tamanho de adipócito no início do desen- volvimento de obesidade (A19) e uma diminuição em Vmax precedeu uma redução em tamanho de adipócito durante perda em peso induzida por Lep- tina (A17) estabeleceram que mudanças em Vmax Simplesmente não refleti- ram quaisquer mudanças em volume de célula.

são relatados como média + SD, calculados de acordo com métodos padrão de estatística descritiva (A34). A significância de diferenças entre grupos foi avaliada com teste t de Student bilateral, com a < 0,05 sendo considerado significante. —Estudosde Expressão de Gene Coleta de tecido: Amostras de gordura omental foram coletadas no momento de cirurgia laparoscópica. As amostras foram divididas e 1-2 gramas de tecido de cada biópsia foram postos em RNAlater (Invitrogen, Carilsbad, CA) a -80ºC para armazenamento a longo prazo.

Isolamento de RNA total: As amostras de gordura foram des- congeladas e então homogeneizadas em 15 ml de TRizol (Invitrogen). Após separação de fase padrão e isolamento de RNA, o pelete foi ressuspenso em água, tampão de lise RLT e etanol para limpeza de RNA e tratamento de i DNase em coluna (Qiagen). RNA eluído tinha consistentemente razões AZ60/A280>2,0.A integridade do RNA total foi verificada pela presença de picos de 188 e 288 robustos em eletroferogramas BioAnalyzer (Agilent). Marcação e hibridização direcionada de microdisposição: CRNAs marcados com biotina foram gerados por procedimentos estabeleci- dos. Em suma, 2 ug de RNA total foram usados para síntese de cDNA. Este foi incubado com 11-UTP marcado com biotina em uma reação de transcri- ção in vitro. cRNA foi purificado através de colunas Rneasy (Qiagen) e quan- tificado através de espectrometria UV a 260 nm. A distribuição de tamanho do cRNA marcado com biotina foi verificada através de eletroforese capilar (Bioanalyzer, Agilent). 10 ug de cRNA fragmentado foram hibridizados da noite para o dia em microdisposições CodeLing Human 10K (Coorte 1) ou microdisposições Human Whole Genome (Coorte 2). cRNAs hibridizados foram detectados através de Estreptavidina-Cy56 fluor (GE Healthcare).

Validação de gqRT-PCR: Expressão de sete genes verificados ser subexpressos através de análise de microdisposição no Coorte 2 foi e- xaminadanasmesmas amostras através de gqRT-PCR. Primers de PCR de gene individuais foram projetados usando software Primer 3 (v.0.4.0) em

Tabela 3. Sequências de primer para estudos de qRT-PCR Gene Primer Tm Sequencia (5' 3) SEQID Tamanho NO: do Produto (nt) Controle (interno genes BBS4 Avançado 59,93 RlCCCABEICABRAgCACCAL 4 157 Reverso 59,97 gacdigiaaacigesTaist 5 MT1IF2 Avançado 59,99 tengaangoccataagmaçt 6 171 Reverso 59,93 alsgoctoaacavaaecnto 7 PGBD3 Avançado 59,99 coacelgieteseciacat 8 211 Reverso 59,93 Eortealgtosoartreact 9 PAICS Avançado 59,96 Clagesesticaggelgtet 10 183 Reverso 59,96 tcngoctecticangaanat Eb genes-alvo DCI-SP1 Avançado 59,82 BCACCCLEZESSACECEIE 12 185 Reverso 62,55 Clgtegagoategtoigasat 13 ECHD Avançado 59,99 cageniciceceagacicao 14 218 Reverso 59,70 atuticogcaanetotenal 15 - ADHI1A.

Avançado 60,13 gigcoacigaalscatoaaor 16 195 Reverso 60,17 Egttltezgeaatoagegazel 17 ATP5D Avançado 59,85 Caaggcauactiegasanes 18 175 : Reverso 60,06 ESGCamticatocagaçer 19 COX411 Avançado 59,53 ESCaCIgaageaguag gaga 20 204 Reverso 60,02 ERGOCRISCERCAtaAfTROH 21 cYc1 Avançado 59,95 coagetacratetecensat 22 166 Reverso 59,87 Icegeacigacocao tiago 23 NDUFS7 Avançado 60,12 Bgltetetetageceateao 24 197 Reverso 59,17 gecatcigetogtagaco 25 Critérios de seleção incluíam Tms de aproximadamente 60ºC e comprimentos de produto de PCR entre 150 e 250 pb. cDNAs de primeiro filamento foram sintetizados a partir das amostras de RNA total usando o TagMan Reverse Transcription Reagent kit (Applied Biosystems), com oligo dT como primers.

PCRs foram realizadas no sistema de PCR de tempo real 7300 (Applied Biosystems), com o SYBRº GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems) em um volume total de 50 ul contendo 500 ng de cDNA confor- me detalhado nas orientações do fabricante.

As condições de PCR foram: ciclo1a50,0ºC por 2 min, ciclo 2 a 95,0ºC por 10 min, seguido por 40 ciclos (duas etapas; 95,0ºC por 0,15 min, então 60,0ºC por 1,00 min). Cada PCR dos como genes controle com base em sua expressão robusta, com diferen- ças mínimas entre as amostras de gorduras omentais de normal e de obeso na análise do Coorte 1. As médias de seus níveis de expressão foram usa- das para normalizar a expressão de genes alvo DCI-SP1, ECHD, ADH1A, —ATPSD, COX4!1, CYC1 e NDUFS7 em todas as amostras.

A mudança em vezes média (AFC) (Average Fold Change) foi computada usando a diferen- ça média no ACt entre cada gene de teste e a média dos 4 genes controle para cada amostra, isto é, AFC = 2-(médianci). Análise de dados: Detecção de ponto de microdisposição foi realizada com o scanner GenePix Series B (Axon Instruments) e quantifica- ção de ponto foi realizada usando CodeLink? Expression Analysis v4.1 (Co- orte 1) ou CodeLinkº Expression Analysis v5.0 (Coorte 2). Parâmetros de quantificação-chave são descritos rapidamente abaixo.

Subtração de base local é realizada nas intensidades de ponto individuais, seguido por um au- mento de cada disposição individualmente com base na intensidade de dis- posição geral.

Após normalização mediana, o limiar de controle negativo é calculado usando um conjunto de sondas de controle negativo conforme descrito (A35). Ontologia de gene e análise de curso de KEGG: Valores de expressão de gene de normalização mediana foram então importados para o suíte de análise de expressão de gene GeneSifter (Geospiza, Seattle, WA). Dados de disposição para genes significantemente diferentemente expres- sos foram sobrepostos em cursos ontológicos (http://www.geneontology.org/) (A36) e cursos KEGG (www.genome.jp/kegg/) (A37) usando software Gene- Sifter As análises ontológica e de curso de KEGG proveem dados sobre genes individuais no contexto do papel deste gene em cursos biológi- cos/bioquímicos descritos.

Um curso foi considerado significantemente alte- rado do perfil de expressão de gene controle se seu escore z tiver sido me- nos do que -2 ou maior do que 2. Escores z foram calculados em GeneSifeter como: Escore z f Ri iron)

EE = ' e onde R = número total de genes satisfazendo crité- rios de seleção, N = número total de genes medido, r = número de genes satisfazendo critérios de seleção com o termo de ontologia de gene (GO) (Gene Ontology) especificado e n = número total de genes medido com o termo de GO específico (38). Escores z com um valor absoluto 2 2,0 são considerados indicar regulagem significantemente alterada do curso compa- rado com controles. O significado do escore z depende do contexto do esco- re relatado. Quando relatado como um escore superior z, um escore z positi- vo igual a ou maior do que 2 indica que um número significante de genes na lista de genes diferentemente expressos é suprarregulado no grupo experi- mental neste curso particular. Por outro lado, um escore superior z negativo de -2 ou menos é também significante, e indica que menos do que os genes esperados são superexpressos no curso. Para escores inferiores z, a inter- pretação é como segue: um escore inferior z positivo indica que mais genes do que esperado são subexpressos, e um escore inferior z negativo indica que menos do que os genes esperados são subexpressos no curso.

RESULTADOS Pacientes: As características demográficas e clínicas dos paci- entes são sumarizadas na Tabela 4. Tabela 4. Características demográficas e clínicas de pacientes de estudo — Grupo se- Ida- BMI (kg/m” Insulina Leptina Glicose Colesterol TG xo de(anos) BSA) (ng/ml (ng/ml) (mg/dL) mg/dL (mg/dL) Coor- te1 Obeso 2M, 537+78 427X57º 97+ 220Ht 8B3X — 23738 213+44 1 1F 15 497 7,59 Contro- 2M, 50,7+126 237:04 86+ 22+ 630t 17619 14617 le 1 1F 3,8 1,0 5,8 Coorte 2 Obeso —7F 516:60º 486:26"* ND ND —920+3, 19620 130:23 2 1 Contro- 4F 30,0+6,0 22,1+2,3 ND ND 87,3+ 161+6 79+24 le2 10,3 im o AAA RR ARO ADA RARA A aa A AE Amen ana mama mnmmbnmia Al mnmmaçiom

A população de estudo inicial (Coorte 1) consistia em três indiví- duos obesos e três não obesos, com dois homens e duas mulheres em cada grupo. O Coorte 2 consistia em 7 pacientes mulheres obesas e 4 não obe- sas. As idades médias dos pacientes obesos em ambos os coortes e pacien- tes controle no Coorte | eram similares. Os pacientes não obesos no Coorte 2 eram mais jovens. Virtualmente por definição, o BM! foi significantemente maior nos pacientes obesos do que nos pacientes controle em ambos os Coortes. Valores para indivíduos obesos e não obesos nos dois coortes fo- ram muito similares. Em estudos adicionais no Coorte 1, a concentração de Leptina no plasma em jejum foi significantemente maior em indivíduos obe- sos do que em controle. Embora glicose no sangue em jejum média, insulina no plasma e colesterol e triglicerídeos no soro fossem todos maiores nos pacientes obesos do que nos controles, apenas a diferença em níveis de glicose entre os pacientes obesos e não obesos do Coorte 1 obtiveram signi- ficância estatística.

Tamanhos de adipócito: Medições de tamanho de adipócito e os resultados de estudos de absorção de LCFA de adipócito (Coorte 1 ape- nas) são apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5. Medições de adipócito e cinética de absorção de ácido graxo e e e o Grupo Diametro — Área de superficial por Volume por célula Via: (um) célula (um)? (PL) (pmol/s/50,000 células) Coorte 1 Obeso 94,7+6,8"" 32,717+9,492"*** 486+191 19,6+4,7* Controle 53,4:+4,4 9,953+1,659 81+18 4,8+2,0 Coorte 2 Obeso 2 101,6+4,4** 32,799 +2,784** 568 +71** ND Controle 2 —58,1+5,8 10,910+2,630 112 +42 ND Groupo Km (OM) K (ml/s/50,000 célula) Vmar/SA X 10º (pmovs/p? Coorte 1 Obeso 149+15 0,0105 +0,0055 1,20+0,45 Controle 142+49 0,0068 +0,0018 0,96+0,43 Coorte 2 Obeso 2 ND ND ND

Coortes Adipócitos de pacientes obesos eram apreciavelmente maiores do que aqueles de controles não obesos em ambos os Coortes. Diâmetros de célula médios foram 1,7-1,8 vezes maiores, áreas de superfície 3,0-3,3 vezes maiores e volumes de célula 5,1-6,0 vezes maiores em pacientes o- besos do que não obesos de ambos os Coortes.

Cinética de Absorção de LCFA: Ajustes de computador das curvas de absorção de LCFA nos indivíduos dos seis estudos no Coorte 1 são ilustrados na Figura 13. Como em uma série previamente relatada (A16), não houve nenhuma sobreposição qualquer que seja nas curvas de indivíduos obesos, comparado com não obesos. Ambos o Vmax para absor- ção de LCFA saturável e a constante de taxa (k) para absorção não saturá- vel foram altos em adipócitos dos pacientes obesos. O aumento em Vmax foi estatisticamente significante; aumentos em k e na razão de Vmax para área de superfície celular não. Como com alguns dos valores bioquímicos e me- dições de tamanho de adipócito, as comparações entre indivíduos obesos e não obesos eram paralelas àquelas relatadas na série anterior, maior (A16). Falha de diferenças entre grupos para alguns parâmetros para obter signifi- cância estatística no presente estudo resulta principalmente dos tamanhos pequenos dos grupos compreendendo o Coorte 1.

Análise de Microdisposição: No Coorte 1, a expressão de a- proximadamente 10.000 genes humanos e marcadores de sequência ex- pressos (ESTs) (Expressed Sequence Tags) foi medida usando microdispo- sição Codelink Human 10K em cada amostra de gordura omental de indiví- duos obesos (n=3) e doadores em peso normal (n=3). No Coorte 2, micro- disposições Codelink Human Whole Genoma investigaram expressão de —50.000 genes em ESTs em cada amostra. Desta maneira, as amostras no Coorte 2 foram avaliadas quanto à expressão de —5 vezes tantos genes e ESTs quanto aqueles no Coorte 1. Valores de expressão de normalização mediana foram analisados usando o suite de software GenesSifter (Geospiza, Caattla WAY nara 2 idantificarão dao nonoc difarantamenta avnraoaccene on do

Medições de controle de qualidade de dados de expressão: Nos estudos de Coorte 1, um gráfico log-log das médias de valores de ex- pressão de obesos (ordenada) versus normais (abscissa) para cada ponto de dados é visto na Figura 14A (conjunto de dados completo) e na Figura —14B (seção ampliada compreendida pelo quadrado magenta). A difração de dados limitada em cada lado da linha de identidade indica a equivalência geral dos dois conjuntos de dados, enquanto os genes estatisticamente sig- nificantes (teste T, nenhuma correção para teste múltiplo) indica a estreiteza da difração de dados para genes individuais. Uma segunda indicação desta equivalência geral é uma comparação dos quatro genes ribossomais mito- condriais (L12, L38, L42 ou S7) nos chips. Nenhum desses quatro "genes reguladores" demonstra diferenças significantes em expressão entre os dois conjuntos de amostra, mostrando a equivalência metabólica geral entre os | depósitos de gorduras de obesos e normais. Uma terceira medição da equi- valência geral pode ser vista nos gráficos de quartil correspondentes (Figura 14C: obeso, esquerda, e normal, direita), que não revelam quaisquer dife- renças sistemáticas entre os conjuntos de dados. Essas três medições glo- bais de expressão de gene indicam que não há quaisquer diferenças sis- temáticas entre os dois conjuntos de dados, indicando que conclusões biológicas válidas podem ser tiradas em diferenças em expressão que são detectadas para genes individuais particulares. Comparações de con- trole de qualidade altamente similares foram obtidas das amostras do Co- orte 2.

Identificação de genes individuais que são diferentemente expressos em gordura de obeso: Comparações em pares entre as três amostras de obesos e as três amostras de normais no Coorte 1 foram reali- zadas com mudanças de vezes mínimas em expressão, seguido por testes t padrão e correções para teste múltiplo. Usando critérios de uma diferença de expressão de > 1,5 vez e um valor p de < 0,05, 166 genes diferentemente expressose ESTs foram identificados nas Análises de Coorte 1. No entanto, mA ana da Rana Patti a ANA aaa dent nn FIA, KARL

(2,3-trans-enoil-Co-enzima A isomerase) (DCI), demonstrou uma diferença estatisticamente significante entre os dois grupos no Coorte 1, sendo subex- presso em 1,6 vez em gordura de obeso (Figura 15A). Este gene codifica um membro da superfamília hidratase/isomerase. A proteína codificada é uma enzima mitocondrial-chave envolvida em beta-oxidação de ácidos graxos insaturados. Ela catalisa a transformação de 3-cis e 3-trans-enoil-CoA éste- res que surgem durante a degradação em etapas de ácidos graxos cis-, mo- no- e poli-insaturados nos intermediários 2-trans-enoil-CoA. Para amostras do Coorte 2, os resultados foram quase idênticos para diferenças de expres- são de DCI entre amostras de gorduras omentais de obesos e normais (Fi- gura 15B).

Expressão de Gene Relacionada à Lipólise em Gordura de Obeso: A etapa inicial na liberação de ácidos graxos a partir de armazena- mentos de triacilgliceróis é sua hidrólise através de lipólise hormonalmente regulada. Dois genes-chave neste processo, adenilato ciclase 6 (Figura 16A e Figura 16B) e receptor | de peptídeo de ativação de adenilato ciclase (Fi- gura 16C e Figura 16D), são ambos subexpressos nas amostras de gordura de obeso em ambos os coortes. Adenilato ciclase 6 codifica uma enzima associada à membrana que catalisa a formação do segundo mensageiro monofosfato de adenosina cíclica (CAMP). Receptor 1 de polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase tipo | codifica uma proteína receptora associa- da à membrana que faz a mediação de ações biológicas diversas de poli- peptídeo 1 de ativação de adenilato, e é positivamente acoplada à adenilato ciclase. O fato que ambos esses genes-chave na cascata de sinalização de —adenilato ciclase são subexpressos em gordura omental de obesos indica que este tecido pode demonstrar respostas reduzidas a estímulo fisiológico por hormônios lipolíticos. Análise de Curso de KEGG: Para identificar um grupo maior de genes diferentemente expressos para inclusão na análise de curso, todos os genesem uma comparação em pares foram selecionados com um valor p não AArriaida ECON NnNKE aanm aAAPrARNAA mara tinta málltinia 16mas vaz mA à amnáalbio critério de valor p não corrigido, 612 genes diferentemente expressos e ESTs entre gorduras de obesos e normais foram identificados da lista de

10.000 que foram investigados no Coorte 1. Esta lista de genes diferente- mente expressos foi submetida à análise de curso KEGG para a identifica- —çãode cursos biológicos com expressão de gene significantemente alterada em gordura de obesos versus normais, conforme indicado por escores supe- riores z e inferiores z. O conjunto completo de cursos de KEGG subrregula- dos encontrados no Coorte 1 é apresentado na Tabela 6. Quaisquer cursos com escores superiores z tiveram genes diferentemente expressos suficien- tes para serem considerados biologicamente significantes. Tabela 6. Cursos de KEGG com escores inferiores z significan- tes Cursos de KEGG Genes em Genes Superior Inferior je inferiores z grande regulados | — quantidade Coorte1 | Coorte2 = 7 51 " 8 | | 422 3,67 Oxidativa “Síntese e degradação ! 5 2 3,99 de corpos de cetona Metabolismo de ácido 37 o 6 2,31 ES o . Dos cursos com escores z inferiores significantes e um núme- ro suficiente de genes envolvidos para indicar relevância biológica, Fosfo- rilação Oxidativa e Metabolismo de Ácido Graxo, ambos diretamente rela- cionados ao metabolismo de energia e biossíntese e degeneração de áci- do graxo (A37), se destacaram. Dos genes em cada curso que demons- tram expressão diferencial no Coorte 1, todos são subexpressos em a- mostras de gordura de obeso com relação às amostras de indivíduos em peso normal (oito genes no curso de Fosforilação Oxidativa e seis genes no curso de Metabolismo de Ácido Graxo), em 12 de 14 casos com uma mudança de vez de 2 1,2. Os resultados para esses 12 genes no Coorte 2 foram geralmente muito similares àqueles descritos abaixo (Tabelas 7 e 8).

tiva o o Gene ID EC Comple troca de xo —invólucroinfe- rior Coorte Coorte 1 2 Fe-S protein desidrogenase NADH (ubiqui- NDUFS7 1,6,5,31, | 148 1,31 nona) 7,20 kDa 6,99,3 (NADH-coenzima Q reductase) Complexo de desidrogenase de succinato, SDHA 1,3,5,1 1" 140 116 subunidade A, flavoproteina (Fp) Citocromo c-1 CYc1 1,10,2,2 mm 148 137 Subunidade de oxidase de Citocromo c IV COX411 1,9,3,1 NV 1581 111 isoforma 1 ATPase, transporte de H+, isossomal 50/5677 ATP6VIH 36,314 Vv 155 1,24 kDa, VI subunidade H síntese de ATP , transporte de H+, comple- ATP5L 3,6,1,14 A 135 1,37 xo mitocondrial FO, subunidade G síntese de ATP, transporte de H+, complexo ATPSD 3,6,1,14 Vv 1,51 112 mitocondrial FI, subunidade delta Tabela 8. Genes subrregulados em curso de metabolismo de á- cido graxo Gene ID EC troca de invólucro inferior Corte 1 Coorte2 Aciltcoenzima A oxidase 1,palmítila ——ACOXT 1,336 1,36 1,02 Desidrogenase de álcool 1A (classe |), alfa polir ADHIA — 11,11 2,21 1,91 peptídio Isomerase dodecenoil-coenzima A delta (3,2- DCI 5,3,3,8 1,59 1,64 trans-enoil-coenzima A isomerase) Desidroxigenase 3-hidroxiacil-coenzima A ECHD 1,1,1,35 1,59 1,54 Peroxissomal D3, isomerase D2-enoil-CoA PECI 5,3,3,8 1,25 1,08 Os genes individuais que foram subexpressos no curso de Fos- forilação Oxidativa no Coorte 1 com uma mudança de vezes 2 1,2 são apre- sentados na Tabela 7. Eles incluem duas ATP sintases de transporte mito- condrial H+, uma ATPase de transporte lisossomal H+, dois genes c de cito- croma e duas desidrogenases (ubiquinona e flavoproteína). Das centenas de proteínas que formam os vários complexos enzimáticos e de transporte de elétron encontrados na membrana mitocondrial interna, a expressão dos ge- nes codificando sete dessas proteinas é subregulada em gordura omental de obesos.

Cinco desses genes codificam proteínas que são enzimas regulado- ras ou moléculas de transporte, e essas são espalhadas em todos os 5 econmnÓnlavos arandas enmhbPreeandandao 2 cadaia de tranennrte do alétraop On quando fatoradas juntas, pode resultar em uma diferença funcional importan- te em produção de ATP pelo Complexo V. A organização funcional desses genes subrregulados e sua regulagem coordenada foram trazidas para o foco pela nova análise de curso empregada neste estudo.

No complexo |, NADH desidrogenase (1.6.5.3/1.6.99.3) é a pri- meira enzima do complexo que catalisa a transferência de elétrons de NADH para coenzima Q. No Complexo Il, succinato desidrogenase (1.3.5.1) reduz succinato em fumarato. No Complexo Ill, ubiquinol-citocroma-c redutase (1.10.2.2) é o componente contendo heme do complexo de citocroma b-c1, que aceita elétrons da proteina Rieske e transfere elétrons para citocroma c na cadeia respiratória mitocondrial. No Complexo IV, Cox411 (1.9.3.1) é uma ' das cadeias de polipeptídeo nuclear-codificadas de citocroma c oxidase, a oxidase terminal no transporte de elétron mitocondrial. No Complexo V, AT- Pase, transporte de H+, complexo F1 mitocondrial, subunidade delta (ATP6VIH, 3.6.3.14) ativa a atividade de ATPase da enzima e acopla ativi- dade de APTase a fluxo de próton. Genes subexpressos com uma mudança de vezes 2 1,2 em amostras de gordura de obeso do Coorte 1 que são com- ponentes do curso de Metabolismo de Ácido Graxo são apresentados na Tabela 77. Esses genes incluem acilCo-enzima A oxidase, álcool desidroge- nase1A,DCI, outra isomerase (peroxissomal D3,D2-enoil-CoA isomerase) e hidroxiacil-Co-enzima A desidrogenase.

qRT-PCR: Expressão de sete genes ou do curso de Fosforilação Oxidativa ou Metabolismo de Ácido Graxo que foram verificados ser subex- pressos por análise de microdisposição no Coorte 1 foi examinada nas a- mostras do Coorte 2 através de gRT-PCR. Os genes são ECHD (3- Hidroxiacil-Co-enzima A desidrogenase); ADH1a (Álcool desidrogenase 1A); DCI (Dodecenoil-Co-enzima A delta isomerase); ATP5SD (ATP sintase, mito F1); CYC1 (citocroma c-1); NDUFS7 (NADH desidrogenase Fe-S); COX411 (Citocroma c oxidase IV) (Figura 17). Sete desses genes foram subexpres- sos no Coorte 2 conforme avaliado com a microdisposição de Genoma Hu-

de expressão desses 7 genes. Também, para os sete genes investigados, a direção de diferença em expressão entre obesos e controles é também con- sistente entre os dois conjuntos de amostra (Coorte 1 e Coorte 2), uma vez que esses sete genes são todos subexpressos nas amostras de gordura de obeso. Essas constatações estão de acordo com um metabolismo de ener- gia geralmente reduzido em gordura de obeso.

DISCUSSÃO A obesidade é a deposição grande de LCFA, principalmente na forma de TG, em tecidos adiposos e outros. Que esta deposição é altamente seletiva, e que seu grau e mudança diferem mesmo entre depósitos de teci- do adiposo diferentes (por exemplo, A40-43), indica que há uma patofisiolo- gia de base complexa que envolve muito mais do que a difusão não regula- da, passiva, de LCF — os blocos de formação essenciais de TG — em todas as membranas celulares. Muitos processos podem contribuir para o acúmulo deTG: absorção ou síntese de LCFA alta, conversão de LCFA em TG alta ou absorção alta de TG pré-formado a partir de lipoproteínas; ou remoção de TG ou LCFA alternativamente menor através da diminuição de lipólise de TG, excreção de LCFA e TG menor como componentes de VLDL ou oxida- ção de LCFA menor (A18, A22-24, A44-46). Esses processos múltiplos en- volvem genes múltiplos, por exemplo, para transportadores de LCFA da membrana plasmática e intracelulares; para enzimas de síntese de ácido graxo ou triglicerídeos; para receptores; enzimas e outras proteínas associa- das com a importação e/ou hidrólise de lipoproteíina-triglicerídeo pré- formado, tal como o receptor de LDL, lipase hepática e lipoproteína lipase (LPL); genes associados com síntese, montagem e exportação de VLDL; e proteínas e enzimas de oxidação de ácido graxo; sem mencionar vários fato- res de transição e outros genes reguladores. Seria desejável ensaiar esses processos simultaneamente. Embora os genes-chave envolvidos em muitos desses processos tivessem sido identificados, para outros processos, inclu- indo absorção de LCFA celular, genes-chave são desconhecidos (A47, A48).

mais difícil, uma aproximação de primeira ordem pode ser obtida através de estudos de expressão de RNA. Análise de Expressão de Microdisposição: Sem desejar ser limitado pela teoria, o número de genes conhecidos potencialmente envolvi- dosem patogênese de obesidade é pelo menos 50 (A22). Tecnologia de microdisposição de expressão de RNA é uma abordagem eficaz para análise de um grande número de genes, e também para identificação de genes cujo papel! no processo de interesse — neste caso, obesidade — é desconhecido. Microdisposições monitoram simultaneamente expressão de milhares de mMRNAs de amostras individuais. Em adição à provisão de informação com relação à expressão de genes candidatos pré-selecionados, a natureza de alto rendimento de análise de microdisposição é ideal para a identificação de genes candidatos e/ou cursos responsáveis pela patofisiologia de doenças complexas tal como obesidade.

Os dados discutidos aqui foram analisados usando uma aborda- gem de dois estágios. O primeiro estágio foi identificar genes individuais cuja expressão era significantemente diferente entre amostras de gorduras omen- tais de obesos e normais. Usando um corte padrão de diferença de 1,5 vez em expressão, junto com correção Benjamin e Hochberg para teste múltiplo (39), um gene único, Dodecenoil-Co-enzima A delta isomerase (DCI) ou 3,2- trans-enoil-Co-enzima A isomerase, foi identificado no Coorte 1 como sendo subexpresso em gordura omental de obesos. Sua subexpressão foi confir- mada no Coorte 2 ambos através de análises de expressão de microdisposi- ção e gRT-PCR, provendo validação ambos biológica e técnica deste resul- tado. Este gene é uma enzima mitocondrial envolvida na B-oxidação de áci- dos graxos insaturados. Intermediários metabólicos produzidos durante a degradação em etapas de LCFA insaturado entram no Ciclo de Ácido Citri- co, onde eles contribuem para produção de ATP através de fosforilação oxi- dativa. Obesidade central foi positivamente associada com um aumento em ácidos graxos insaturados n-6 e inversamente associada com ácidos graxos locus cromossomal 16 p13.3, codificando uma proteína prevista de 302 ami- noácidos (ENTREZ [NM 001919]). O locus 16p13.3 foi ligado duas vezes a fatores relacionados à obesidade, incluindo BMI, ambos através de logaritmo do escore de probabilidade (LOD score) de marcador microssatélite D1I6S510 em um estudo de famílias Old Order Amish (A50) e em uma varre- dura de genoma de famílias African Americans enriquecidas em neuropatia não diabética (A51). Esses relatórios e a redução de expressão de DC! des- crita aqui fazem desse gene candidato para estudo adicional sobre obesida- de.

A perda de -50% de expressão de DCI está de acordo com a perda fun- cionalde um alelo de DCI, o que poderia refletir microdeleções nesta região de gene ou polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) (Single Nucleotide Polymorphisms) afetando de modo adverso a união ou estabilidade da men-

sagem de DCI.

Análise de Curso de KEGG.

O poder da análise de microdispo- sição é que ela permite a avaliação simultânea de milhares de genes em cada amostra, sem a tendência à pré-seleção de gene candidato.

Avanços recentes em software permitem que mudanças em expressão de gene sejam consideradas no contexto de cursos biológicos.

O Kyoto Encyclopeia of Ge- nes and Genomics (KEGG) consortium (www.genome.jp/kegg; 37) estabele- ceu uma coleção de cursos de gene cujos genes membros são conhecidos interagir como partes de um todo maior.

Mudanças significantes em expres- são de gene de membro de curso, especialmente quando as mudanças são coordenadas (por exemplo, envolvendo vários membros sequenciais de um curso de sinalização) indicam que alterações biologicamente significantes de regulagem de curso e/ou função são prováveis.

Além disso, mudanças rela- tivamente pequenas em expressão de genes múltiplos em um curso, cada uma muito pequena para obter significância individualmente, podem levar a alterações biologicamente significantes em resultado ao longo de um curso.

Por exemplo, usando um modelo simplista, subregulagem de 10% de 7 ge- —nesem um curso, onde cada um pode ser omitido por análise de gene sim-

Curso de KEGG de Fosforilação Oxidativa.

O curso de Fosfo- rilação Oxidativa captura a energia liberada pela oxidação de NADH e succi- nato no ciclo de ácido cítrico, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) atra- vés de ATP sintase.

Dos 51 genes neste curso que estão incluídos nas dis- — posições usadas neste estudo, sete são diferentemente expressos, e esses sete são todos subexpressos em gordura de obeso.

Os dados discutidos aqui mostram que dois componentes de proteína do complexo de ATP sinta- se são subrregulados em gordura de obeso: a subunidade G com complexo de ATP sintase FO e as subunidades deltas do complexo F1). Esses resulta- dos mostram ainda que componentes da cadeia de transporte de elétron, incluindo citocroma c oxidase, e citocroma c-1, mais NADH desidrogenase e ' succinato desidrogenase (subunidade A), são também subexpressos.

Sem | ser limitado pela teoria, produção de ATP pode ser baixa em tecidos de gor- dura de obeso se os níveis das proteínas correspondentes forem também baixos.

É importante reconhecer que cada um dos cinco complexos é forma- do de muitas subunidades, que dependem de uma macroestrutura delicada.

Os dados discutidos aqui mostrando subexpressão de todos os 7 dos 7 genes diferentemente expressos envolvidos em fosforilação oxidati- va estão de acordo com constatações similares em gêmeos monozigóticos que eram discordantes para obesidade (A52). Análise de microdisposição de biópsias de obesos identificou 30 genes no curso de fosforilação oxidativa que eram subexpressos nos indivíduos obesos comparado com seus gê- meos não obesos.

Vários desses genes foram também subexpressos, inclu- indo ATP5L, ATPSB, ATPV1IH e CYC1. Mustelin e outros também verifica- ram membros do complexo da NADH desidrogenase subexpressos em gor- dura de obeso.

Dados similares foram relatados por Patti e outros (A53), que verificaram uma redução coordenada em expressão de gene de metabolis- mo oxidativo em músculo esqueletal de Mexicanos-Americanos diabéticos tipo Il, com relação à expressão reduzida de dois fatores de transcrição, fator respiratório nuclear 1 (NRF-1) e co-ativador 1 PPARy, que são conhecidos posições 10K usadas nos estudos originais. Nas amostras do Coorte 2, N- RF-1 e co-ativador 1 PPARy foram essencialmente não modificados, indi- cando que outro mecanismo pode ser responsável pela subregulagem con- sistente dos genes de curso de fosforilação oxidativa em gordura omental de obesos.

Curso de KEGG de Metabolismo de Ácido Graxo. O curso de metabolismo de ácido graxo inclui as enzimas responsáveis pela biossíntese e degradação de LCFAs, levando à produção de Acetil-CoA, que é então direcionada ao ciclo de TCA. A partir daí, oxidação de NADH e succinato produz ATP através de ATP sintase no curso de Fosforilação Oxidativa. Dos 37 genes sondados pelas disposições, seis de seis com expressão diferen- cial foram todos subexpressos em gordura de obeso. Cada um desses ge- nes subexpressos desempenha um papel no metabolismo de LCFA e vários já foram relatados desempenhar um papel em obesidade. Expressão de acil- Coenzima A oxidase (1.3.3.6) em gordura omental prevê declaradamente resultado de perda em peso após cirurgia de by-pass gástrico (A54). DCI (5.3.3.8), agrupado com 3-Hidroxiacil-Co-enzima A desidrogenase (1.1.1.35) na Figura 12, desempenha um papel-chave em degradação de LCFA. Uma incidência maior de obesidade infantil foi relatada em crianças com deficiên- ciaem 3-Hidroxiacil-Coenzima A desidrogenase (LCHAD) de cadeia longa ou proteína trifuncional (TFP) (Trifunctional Protein). Colocação dessas cri- anças sob dietas de pouca gordura, alto teor de proteína e baixo teor de car- boidrato resultou em ingestão de energia menor e gasto de energia maior (A55). Expressão de Gene Relacionado à Lipólise. Os resultados discutidos aqui mostrando expressão reduzida de genes-chave na sinaliza- ção mediada por cAMP de lipólise hormonalmente estimulada estão de a- cordo com relatórios mostrando uma resposta lipolítica embotada para esti- mulação de catecolamina em indivíduos obesos, especialmente em gordura abdominal (A5S6) e adipócitos de indivíduos obesos, devido em parte à ex-

transcriptoma em andamento. Curso de KEGG de Transportadores de ABC: Um dos genes neste curso codifica cassete de ligação de ATP, subfamília D (ALD), membro 3 (ABCD3), um membro da superfamília de transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC) (ATP-Binding Cassete). As proteínas de ABC trans- portam várias moléculas através de membranas extra- e intra-celulares. ABCD3 é um membro da subfamília ALD, que está envolvido em importação peroxissomal de ácidos graxos e/ou acil-CoA graxa na organela. Embora pouco seja conhecido sobre este gene em obesidade humana, sua suprar- regulagem discutida aqui é interessante à luz de seu papel conhecido em transporte de LCFA intracelular. Sem ser limitado pela teoria, importação de + LCFA peroxissomal alta e subsequente oxidação que podem substituir par- : cialmente B-oxidação mitocondrial menor indicada por outras constatações merece mais estudo.

Validação de Resultados. É amplamente aceito que análise de resultados de microdisposição requer validação. Isso pode envolver valida- ção biológica em um segundo conjunto, independentemente coletado, de amostras, e validação tecnológica usando uma plataforma de microdisposi- ção alternativa ou uma tecnologia totalmente diferente tal como gRT-PCR.

Validação pode também ser realizada através de medições das proteínas codificadas por genes regulados ou de atividade biológica. No presente es- tudo, validação biológica foi obtida através do estudo de dois conjuntos de amostra independentemente coletados e validação técnica através do uso de duas plataformas de microdisposição diferentes e qRT-PCR.

Nos primeiros dias de análise de microdisposição, tamanhos de amostra muito grandes foram considerados essenciais devido a preocupa- ções sobre as questões estatísticas envolvidas na produção de milhares de comparações simultâneas em uma dada amostra. Como a teoria estatística se desenvolveu para esta questão, os números requeridos caíram drastica- mente. O relatório de consenso de uma grande conferência patrocinada por microdisposição (A58). Desde esta conferência os números caíram mais. Um número apreciável de documentos de microdisposição foi publicado em jornais de reputação com base em estudos em coortes ainda menores, inclu- indo aqueles onde n=3 por grupo (por exemplo, A59-61). O presente estudo —estádentro das orientações de 2006 publicadas.

Devido ao fato de que populações de célula diferentes dentro de um tecido são capazes de expressar genes particulares em taxas diferentes, foi uma vez considerado importante fracionar tecidos em populações de cé- lula purificadas antes da realização de análise de microdisposição. Isso pode ser ainda útil em casos específicos, mas estudos de disposição de expres- são de gene tenderam a se distanciar disto uma vez que procedimentos de : isolamento de célula em si podem introduzir mudanças artifatuais grandes . em expressão de gene. Isso foi especialmente bem estudado em compara- ções de sangue integral vs. PBMC, onde mudanças em expressão de RNA devido à manipulação experimental podem mascarar seriamente o que esta- va acontecendo in vivo (A62). Muitos atualmente acreditam que fraciona- mento celular é essencial apenas em situações específicas. Os presentes estudos foram realizados em amostras de tecido adiposo não fracionadas. Sem ser limitado pela teoria, infiltração de macrófago alta em gordura de — obeso influenciando comparações com resultados em gordura de não obe- sos parece muito improvável em um estudo, tal como esse, onde os resulta- dos-chave são sub-regulagems de genes biologicamente relevantes múlti- plos nas amostras de gordura de obeso. Ainda, a razão de expressão de 23 genes específicos de macrófago em gordura omental de obesos não fracio- —nadavs.omental de não obesos foi em média 1,1 + 0,06, argumentando for- temente contra a possibilidade de que a subregulagem observada de DCI e genes relacionados refletiu infiltração de macrófago. Modelo de Trabalho de Acúmulo de Ácidos Graxos de Cadeia Longa em A- dipócitos de Obesos. Muitos laboratórios examinaram o equilíbrio entre absorção de

46). Considerações similares se aplicam a adipócitos e à patofisiologia de obesidade. Em adipócitos de indivíduos em peso normal, permitindo varia- ção diurna relacionada à refeição, absorção (incluindo transporte facilitado) e degradação (incluindo B-oxidação) ou eliminação (por exemplo, lipólise) de LCFA estão em equilíbrio. Consequentemente, a quantidade líquida de gor- dura em cada célula é essencialmente constante com o tempo, resultando nos pesos relativamente estáveis vistos em indivíduos não obesos. Em con- traste, em adipócitos de indivíduos obesos, a combinação de absorção de LCFA facilitada alta, mostrada nos estudos de absorção discutidos aqui, e B- oxidação, lipólise e metabolismo de LCFA reduzidos, indicados por análise de expressão de gene, leva ao acúmulo de LCFAs e TG com o tempo. " O resultado das mudanças observadas em cinética de LCFA e . expressão de genes metabólicos será acúmulo crônico de LCFA e TG, resul- tando em adipócitos grandes e ganho em peso significante com o tempo. À : 15 resistência deste estudo é a combinação do primeiro estágio de alto rendi- mento, onde milhares de genes são investigados; e a abordagem de biologia de sistemas do segundo estágio, onde cursos estabelecidos que contêm número estatisticamente significante de genes com expressão alterada são identificados. A combinação de análise de microdisposição com filtragem de curso extensiva de genes identificados é considerada cada vez mais uma abordagem de estado da técnica, que deve guiar validação de experimenta- ção futura. Sem ser limitado pela teoria, efeitos sinérgicos de coquetéis de fármaco cujos componentes são objetivados em vários alvos nesses cursos podem funcionar em doses individuais menores, com menos toxidez, e em mais pacientes, do que fármacos que se direcionam apenas a um dos mui- tos componentes de gene do curso. A interface entre cirurgia bariátrica e ciência básica pode provar ser o lugar ótimo para realizar pesquisa traducio- nal criticamente importante.

REFERÊNCIA A1 . Stremmel W, Berk PD. Hepatocellular influx of [14C]oleate

A2. Schwieterman W, Sorrentino D, Potter BJ, et al. Uptake of oleate by isolated rat adipocytes is mediated by a 40-kDa plasma membrane fatty acid binding protein closely related to that in liver and gut. Proc Natl Acad Sci USA. Jan 1988;85(2):359-363.

A3. Sorrentino D, Stump D, Potter BJ, et al. Oleate uptake by cardiac myocytes is carrier mediated and involves a 40-kD plasma mem- brane fatty acid binding protein similar to that in liver, adipose tissue, and gut. J Clin Invest. Sep 1988;82(3):928-935.

AA4. Stremmel! W. Uptake of fatty acids by jejunal mucosal cells is mediated by a fatty acid binding membrane protein. J Clin Invest. Dec 1988;82(6):2001-2010. . A5. Nunes RM IL, Sorrentino D, Berk PD. Oleate uptake by iso- : lated hepatocytes consists of two components, each driven by the unbound oleate concentration: Proceedings, 3rd International Congress, Mathematical , 15 Modelling of Liver Excretory Process, Juntendo University Press, Tokyo, 1990;312-316. A6. Stump DD, Nunes RM, Sorrentino D, Isola LM, Berk PD. Characteristics of oleate binding to liver plasma membranes and its uptake by isolated hepatocytes. J Hepatol. 1992;16(3):304-315. A7. Berk PD, Stump DD. Mechanisms of cellular uptake of long chain free fatty acids. Mol Cell Biochem. Feb 1999; 192(1 -2): 17-31. A8. Stump DD, Fan X, Berk PD. Oleic acid uptake and binding by rat adipocytes define dual pathways for cellular fatty acid uptake. J Lipid Res. Apr 2001 ;42(4):509-520. A9. Abumrad NA, Perkins RC, Park JH, Park CR. Mechanism of long chain fatty acid permeation in the isolated adipocyte. J Biol Chem. Sep 10 1981;256(17):9183-9191. A10. Abumrad NA, Park JH, Park CR. Permeation of long-chain fatty acid into adipocytes. Kinetics, specificity, and evidence for involvement ofamembrane protein. J Biol Chem. Jul 25 1984;259(14):8945-8953.

binding proteins in cellular fatty acid metabolism. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. Oct 1997;57(4-5):373-378.

A12. Luiken JJ, Turcotte LP, Bonen A. Protein-mediated palmitate uptake and expression of fatty acid transport proteins in heart giant — vesicles.JLipid Res. 1999;40(6): 1007-1016.

A13. Luiken JJ, Glatz JF, Bonen A. Fatty acid transport proteins facilitate fatty acid uptake in skeletal muscle. Can J Appl Physiol. Oct 2000;25(5):333-352.

A14. Kampf JP, Kleinfeld AM. Fatty acid transport in adipocytes monitored by imaging intracellular free fatty acid levels. J Biol Chem. Aug 20 2004;279(34):35775-35780.

A15. Kleinfeld AM, Kampf JP, Lechene C. Transport of 13C- . oleate in adipocytes measured using multi-imaging mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. Nov 2004; 15(11): 1572-1580. A16. Petrescu O, Fan X, Gentileschi P, et al. Long-chain fatty ac- id uptake is upregulated in omental adipocytes from patients undergoing bar- iatric surgery for obesity. Int J Obes (Lond). 2005; 29(2): 196-203.

A17. Fan X, Bradbury MW, Berk PD. Leptin and insulin modulate nutrient partitioning and weight loss in ob/ob mice through regulation of long- chainfatty acid uptake by adipocytes. J Nutr. 2003; 133(9): 2707-2715.

A18. Bradbury MW, Berk PD. Lipid metabolism in hepatic steatosis. Clin Liver Dis. 2004; 8(3): 639-671.

A19. Berk PD, Zhou SL, Kiang CL, Stump D, Bradbury M, Isola LM. Uptake of long chain free fatty acids is selectively up-regulated in adipo- cytes of Zucker rats with genetic obesity and non-insulindependent diabetes mellitus. J Biol Chem.1997; 272(13): 8830-8835.

A20. Berk PD, Zhou SL, Bradbury M, Stump D, Kiang CL, Isola LM. Regulated membrane transport of free fatty acids in adipocytes: role in obesity and non-insulin dependent diabetes mellitus. Trans Am Clin Climatol —Assoc.1997;108:26-40.

both genetic and diet-induced obesity in rodents. J Biol Chem. 1999; 274(40):28626-28631.

A22. Berk PD. The Master's Perspective: Regulatable fatty acid transport mechanisms are central to the pathophysiology of obesity, fatty liv- er, &metabolic syndrome. Hepatol 2008; 48: 1362-1376.

A23. Verna EC, Berk PD. Role of fatty acids in the pathogenesis of obesity and fatty liver: Impact of bariatric surgery. Semin Liver Dis 2008; 28(4): 407-426.

A2Z4. Goldberg 1J, Ginsberg FIN. Ins and outs modulating hepatic triglyceride and development of nonalcoholic fatty liver disease. Gastroent 2006; 130(4): 1343- 1346.

A25. Di Girolamo M, Mendlinger S & Fertig JW. A simple method : to determine fat cell size and number in four mammalian species. Am J Physiol 1971 ; 221: 850-858.

A26. Wosilait WD & Nagy P. A method of computing drug distri- bution in plasma using stepwise association constants: clofibrate acid as an illustrative example. Comput Programs Biomed 1976; 6: 142-148.

A27. Spector AA, Fletcher JE & Ashbrook JD. Analysis of long- chain free fatty acid binding to bovine serum albumin by determination of stepwise equilibrium constants. Biochemistry 1971 ; 10: 3229-3232.

A28. Bojesen IN & Bojesen E. Binding of arachidonate and oleate to bovine serum albumin. J Lipid Res 1994; 35: 770-778.

A29. Richieri GV, Anel A & Kleinfeld AM. Interactions of long- chain fatty acids and albumin: determination of free fatty acid levels using the fluorescent probe ADIFAB. Biochemistry 1993; 32: 7574-7580.

A3O0. Rose H, Conventz M, Fischer Y, Jungling E, Hennecke T & Kammermeier H. Long-chain fatty acid-binding to albumin: re-evaluation with directly measured concentrations. Biochim Biophys Acta 1994; 1215: 321-

326. A31. Berman M & Weiss MF. Users' manual for SAAM US Gov-

A32. SAAM Il user guide, SAAM Institute: Seattle, WA 1998. A33. Sorrentino D, Robinson RB, Kiang CL & Berk PD.

At phys- iologic albumin/oleate concentrations oleate uptake by isolated hepatocytes, cardiac myocytes, and adipocytes is a saturable function of the unbound oleate concentration.

Uptake kinetics are consistent with the conventional theory.

J Clin Invest 1989; 84: 1325-1333. A34. Snedecor GW & Cochran WG.

Statistical methods 6th edn. lowa State University Press: Ames, lowa 1967. A35. Ramakrishian R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Prokhorova A, Gieser L, Touma E, Lockner R, Tata M, Zhu X, Patterson M, Shippy R, Sendera TJ, Mazumder A.

An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling ap- . plications.

Nucleic Acids Res. 2002;30(7):e30. A36. Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cher- rmdJM, Davis AP, Dolinski K, Dwight SS, Eppig JT, Harris MA, Hill DP, Issel- Tarver L, Kasarskis A,Lewis S, Matese JC, Richardson JE, Ringwald M, Ru- bin GM, Sherlock G.

Gene ontology: tool for the unification of biology.

The Gene Ontology Consortium.

Nat Genet. 2000; 25(1):25-29. A37. Kanehisa M, Goto S, Kawashima S, Okuno Y, Hattori M.

The KEGG resource for deciphering the genome.

Nucleic Acids Res. 2004; 32 D277-280. A38. Doniger SW, Salomonis N, Dahlquist KD, Vranizan K, Lawlor SC, Conklin BR.

MAPPFinder: using Gene Ontology and GenMAPP to create a global gene-expression profile from microarray data.

Genome Biol. 2003; 4(1):R7. A3S9. Benjamini, Y. and Hochberg, Y. (1995). "Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing " Journal of theRoyal Statistical Society B, 1995; 57, 289-300.

tients. Int J Obes 1987; 1 1(2): 129-140. A41. Edens, N. K,, Fried, S. K., Krai, J. G., Hirsch, J., and Leibel, R. L. In vitro lipid synthesis in human adipose tissue from three abdominal sites. Am J Physiol 1993; 265(3 Pt 1): ES74-379.

A42. Ostman, J., Arner, P., Engfeldt, P., and Kager, L. Regional differences in the control of lipolysis in human adipose tissue. Metabolism 1979; 28(12): 1198-1205.

A43. Russell, C. D., Petersen, R. N., Rao, S. P., Ricci, MÓ R., Prasad, A., Zhang, Y., Brolin, R. E., and Fisher, F. M., McTernan, P. G., Valsamakis, G., Chetty, R., Harte, A. L., Anwar, A. J., Starcynski, J., Crocker, J., Barnett, A. H., McTernan, C. L., and Kumar, S. Differences in adiponectin protein expression: effect of fat depots and type 2 diabetic status. Horm . Metab Res 2002; 34: 650-654. A44. Chirieac DV, Chirieac LR, Corsetti JP, Cianci J, Sparks CE, Sparks JD. Glucose-stimulated insulin secretion suppresses hepatic triglycer- ide-rich lipoprotein and apoB production. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000;279(5): E1003- 101 1.

A45. Diehl AM. Lessons from animal models of NASH. Hepatol Res. 2005;33(2): 138-144.

A46. Yamaguchi K, Yang L, McCall S, et al. Inhibiting triglyceride synthesis improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fi- brosis in obese mice with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. Jun 2007; 45(6): 1366-1374.

A47. Kampf JP, Parmley D, Kleinfeld AM. Free fatty acid transport across adipocytes is mediated by an unknown membrane protein pump. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2007; 293(5): E1207- 1214.

A48. Su X, Abumrad NA. Cellular fatty acid uptake: a pathway under construction. Trends Endocriwo/ Metab. 2009 Mar; 20(2): 72- 7. A49. Garaulet M, Perez-Llamas F, Perez-Ayala M, Martinez P, de MedinaFS,TebarFJ, Zamora S. Site-specific differences in the fatty acid insulin, and central obesity. Am J Clin Nutr. 2001 ;74:585-591. A5O. Hsueh WC, Mitchell BD, Schneider JL, et al. Genomewide scan of obesity in the Old Order Amish. J Clin Endocrinol Metab. 2001 ;86: 1 199 -205.

A51. Freedman Bl, Langefeld CD, Rich SS, Valis CJ, Sale MM, Williams AH, Brown WM, Beck SR, Hicks PJ, Bowden DW. A genome scan for ESRD in black families enriched for nondiabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2004; 15(10):2719-2127.

A52. Mustelin L, Pietilainen KH, Rissanen A, Sovijarvi AR, Piírila P, Naukkarinen J, Peltonen L, Kaprio J, Yki-Jarvinen H. Acquired obesity and poor physical fitness impair expression of genes of mitochondrial oxidative phosphorylation in monozygotic twins discordant for obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 295(1): E148-54.

A53. Patti ME, Butte AJ, Crunkhorn S, Cusi K, Berria R, Kashyap S, Miyazaki Y, Kohane |, Costello M, Saccone R, Landaker EJ, Goldfine AB, Mun E, DeFronzo R, Finlayson J, Kahn CR, Mandarino LJ. Coordinated re- duction of genes of oxidative metabolism in humans with insulin resistance and diabetes: Potential role of PGC1 and NRFI . Proc Natl Acad Sci US A. 2003; 100(14):8466-71.

ASA. Kim K, Perroud B, Espinal G, Kachinskas D, Austrheim- Smith |, Wolfe B M, Warden, CH. Genes and networks expressed in periop- erative omental adipose tissue are correlated with weight loss from Roux-en- Y gastric bypass. International Journal of Obesity (2008) 32: 1395-1406.

A55. Gillingham MB, Purnell JQ, Jordan J, Stadler D, Hagq AM, Harding CO. Effects of higher dietary protein intake on energy balance and metabolic control in children with long-chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydro- genase (LCHAD) or trifunctional protein (TFP) deficiency. Mol Genet Metab. 2007; 90(1):64-69.

AB56. Buiis M M, Burggraaf J, Wijbrandts C, de Kam M L, Frolich M,CohenAF,RomijnJA, Sauenvein H P, Meinders A E, and Pijl H. Blunted

A57. Langin D, Dicker A, Tavernier G, Hoffstedt J, Mairal A, Ryden M, Arner E, Sicard A, Jenkins CM, Viguerie N, van Harmelen V, Gross RW, Holm C, Arner P. Adipocyte lipases and defect of lipolysis in human obesity. Diabetes. 2005;54(11):3190-3197.

AS58. Shi, L., Reid, L.H., Jones, W.D., Shippy, R., Warrington, J.A., Baker, S.C., Collins, P.J., de Longueville, F., Kawasaki, E.S., Lee, K.Y,., et al. 2006. The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol 24: 1151-1161.

A59. Bardag-Gorce F, Oliva J, Dedes J, Li J, French BA, French SW. Chronic ethanol feeding alters hepatocyte memory which is not altered by acute feeding.Alcohol Clin Exp Res. 2009;33(4):684-692.

AGO. Trentin L, Giordan M, Dingermann T, Basso G, Te Kronnie G, Marschalek R. Two independent gene signatures in pediatric t(4;1 1) acute Iymphoblastic leukemia patients. Eur J] Haematol. 2009 Jun 25.

A61. Ukena SN, Koenecke C, Geffers R, Fuehner T, Welte T, Ganser A, Buer J, Franzke A. T helper type 2 differentiation is associated with induction of antibacterial defense mechanisms in blood Iymphocytes of patients with sarcoidosis. Immunol Invest. 2009;38(1):49-66.

A62. Kennedy L, Vass JK, Haggart DR, Moore S, Burczynski ME, Crowther D, Miele G.

Exemplo 6 - EXPERIMENTO DE RESPOSTA DE DOSE DE SPEXIN EM CAMUNDONGOS C57BL/6J DIO O efeito de Spexin sobre perda em peso será investigado atra- vés de injeções |P diárias de Spexin (cerca de 3 ug/kg/dia, cerca de 10 p- g/kg/dia, cerca de 30 upg/kg/dia e cerca de 100 ug/kg/dia) em camundongos de Obesidade-Induzida-por-Dieta (DIO), onde todos os sistemas de sinaliza- ção conhecidos estão intactos. Ambos os camundongos em peso normal e DIO serão testados quanto a níveis em circulação de Leptina, insulina e Spexin vés de química de estado sólido convencional e o purificada para >95% de identidade pela Phoenix Pharmaceuticals (Burlingame, CA). Este agente se- rá solubilizado em solução salina estéril 1X (pH 7,4) em quatro concentra- ções diferentes, de maneira que doses de 10 pg/kg/dia/QD, 50 po/kg/dia/QD, 250 upo/kg/dia/QD ou 500 upo/kg/dia/QD podem ser administradas a 5 ca- mundongos em cada grupo de dose.

Doses finais de 10 ng/dia, 50 ng/dia, 250 ng/dia ou 50 ng/dia serão aplicadas em volumes de 0,2 mi/dose/dia a- través de injeções IP.

Por exemplo, para aplicar 10 ng total por dia, duas injeções diárias de 5 ng cada serão administradas IP (concentrações de es- toque de Spexin serão 25 ng/ml). Alternativamente, para aplicar 10 ng por dia, uma injeção diária de 10 ng pode também ser administrada IP (concen- : trações de estoque de Spexin serão 50 ng/ml). As doses são calculadas pa- ' ra resultar em níveis fisiológicos de Spexin com alguma latitude introduzida para permitir as estimativas aproximadas com base nos presentes dados disponíveis e na caracterização preliminar de parâmetros farmacológicos básicos de Spexin.

Camundongos C57BL/6J DIO da Jackson Labs, cujo peso médio é aproximadamente 30% maior do que seus controles de idade compatível em 17 semanas, serão aclimatados para condições de laboratório antes do iníciodos estudos de dosagem de Spexin.

Esboços Experimentais Experimento de Dose-Resposta de Spexin.

O objetivo do pre- sente experimento será determinar dose(s) de Spexin para serem usadas em estudos subsequentes.

Os efeitos da Spexin serão seguidos por monito- ramento diário em pesos corporais, consumo de alimento e água e seu plasma será ensaiado quanto à Leptina, insulina e Spexin periodicamente. [DloMED ED Controles nes ieção solo sair) DIO/HFD 60% (controles neg. injeção solução salina) Pos | (doses = 10, 50, 250 e 500 ng Spexin/injeção/QD) C57BL/6J (controles neg. injeção solução salina) 5

Dosagem de Spexin em Vários Modelos de Murino de Obesidade Linhagem de Camundongo Solução Leptina salina as + controle) Base CS57BL/6J como controles | 66 DIOMFDEO 6 [6 ob/ob BB ob/ob tratado com leptina como 6 6 6 controle positivo

LB BB Gordo CB BO SG Atarracado BB Animais adicionais para experi- 6 6 mentos de dose ajustada o

BR o . ) 6 | 6 | e 6 6 o EB Subtotais 2 42 j 6 Total e O Totai Final = 130 animais e Os estudos descritos aqui serão explicados através da medição e/ou análise de Spexin e suas ações sobre o hipotálamo através de técnicas de neurociência tradicionais, tal como imunoistoquímica, e através de ima- gem funcional, tais como varreaduras PET, de animais vivos na ausência ou presença de Spexin, bem como na ausência ou presença de Spexin sob uma variedade de condições fisiológicas. Exemplo 7 — EXPERIMENTO DE SPEXIN EM CAMUNDONGOS C57BJ/6J

DIO A obesidade atingiu proporções epidêmicas em adultos e crian- ças nos Estados Unidos e está ligada a miríades de co-morbidezes, incluin- do resistência à insulina, a síndrome metabólica, diabetes tipo 2 e doença do fígado gorduroso. Microdisposições de genoma humano integral foram usa- das para identificar genes individuais e cursos biológicos cuja expressão é alterada em amostras de gorduras omental e subcutânea de pacientes obe- sos. O gene com a subexpressão mais drástica em gordura de obeso foi Spexin, um peptídeo recentemente identificado de função desconhecida,

tânea de indivíduos humanos em peso normal, mas é drasticamente reduzi- da (-15 vezes) em amostras de gordura de obeso (p<0,00292). Os níveis de peptídeo de Spexin no soro são aproximadamente 10X menores em pacien- tes obesos do que em pacientes não obesos (p<0,0002) e níveis de Spexin eleptinano soro de pacientes obesos e controles em peso normal demons- tram uma correlação negativa forte (r=-0,92). Esses resultados em pacientes humanos e constatações paralelas em camundongos obesos alimentados com dieta-de-alto-teor-de-gordura (HFD) indicaram que a Spexin desempe- nha umpapel na regulagem de consumo de alimento, metabolismo de ener- giae peso corporal.

A Spexin foi administrada a 10 ug/kg em peso corporal/dia IP a camundongos C57BL/6J alimentados HFD. As injeções reduziram o consu- , mo de alimento e o peso do corpo em camundongos com obesidade induzi- da por HFD, enquanto os camundongos HFD controle correspondentes, re- cebendo apenas veículo, continuaram a ganhar peso. Foi anteriormente mostrado que regulagem de absorção de LCFA por adipócito é um ponto de controle para adiposidade do corpo. A Spexin foi subsequentemente admi- nistrada por 7 semanas em uma dose para manter o peso do corpo em ca- mundongos alimentados com HFD obesos (Figura 19).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para a redução da aquisição de ácido graxo em tecido de adipócito de um indivíduo obeso ou de um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade, tratando assim a obesidade ou o distúrbio associado à obesidade.

2. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para a redução da ingestão de alimento em um indivíduo obeso ou em um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obesidade, tratando assim a obesidade ou o distúrbio associado à obesidade.

3. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para a redução da aquisição de ácido graxo em tecido de adipócito de um indivíduo.

4. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de serparaa preparação de uma composição farmacêutica para a redução da ingestão de alimento em um indivíduo.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é obeso ou afligido com um distúrbio associado à obesidade.

6. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para a redução da aquisição de ácido graxo em tecido cardíaco ou tecido hepático de um indi- víduo obeso ou de um indivíduo afligido com um distúrbio associado à obe- sidade, tratando assim a obesidade ou o distúrbio associado à obesidade.

7. Uso de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para a promoção de saciedade em um indivíduo obeso ou um indivíduo afligido com um dis- túrbio associado à obesidade, tratando assim a obesidade ou o distúrbio as- sociado à obesidade.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de alimento consumido por dia pelo indivíduo é reduzida.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano ou animal não hu- mano.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 5 a 9, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado à obesidade compreende um distúrbio metabólico, doença hepática gordurosa, hiperten- são, falência cardíaca congestiva, um distúrbio relacionado com lipídeo, dia- betes mellitus tipo Il, doença da vesícula, osteoartrite, apneia do sono, um câncer selecionado dentre endometrial, câncer de mama e câncer de colo, síndrome do ovário policístico (PCOS) ou uma combinação dos mesmos.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fa- to de que o distúrbio metabólico compreende hiperglicemia, resistência à insulina, hiperinsulinemia, síndrome metabólica ou uma combinação dos mesmos.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fa- to de que o distúrbio relacionado com lipídeo compreende aterosclerose, lipodistrofia por HIV, doença cardíaca coronária, dislipidemia ou uma combi- —naçãodos mesmos.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um Índice de Massa Corporal (BMI) maior do que cerca de 25 kg/m?.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mostra uma diminuição em massa de tecido adiposo após tratamento com o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade formulada para administração resulta em pelo menos cerca de 1 ng/mL no soro.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade formulada para administração resulta em pelo menos cerca de 10 ng/mL no soro.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade formulada para administração resulta em pelo menos cerca de 100 ng/mL no soro.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade formulada para administração resulta em pelo menos cerca de 500 ng/mL no soro.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3 é formulado para administração pelo menos uma vez por dia ou pelo menos duas vezes por dia.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3 é formulado para administração por pelo menos | semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 5 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas, por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 24 semanas ou por pelo menos 48 semanas.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:3 é formulado para administração por pelo menos 1 ano, por pelo menos 1,5 ano, por pelo menos 2 anos, por pelo menos 2,5 anos ou por pelo menos 5 anos.

22. Invenção, caracterizada por quaisquer formas de suas con- cretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exem- plo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.