CN116688124A - 雌激素响应相关通路的抑制及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及雌激素响应相关通路的抑制及其用途。具体提供雌激素响应相关信号通路抑制剂和任选的CYP17A抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的用途，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂包括GATA2抑制剂和/或靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂。雌激素响应相关信号通路抑制剂可以治疗前列腺癌并改善CYP17A抑制剂耐受。

Description

雌激素响应相关通路的抑制及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及雌激素响应相关通路的抑制及其用途。
背景技术
我国男性前列腺癌发病率和死亡率增长迅猛。晚期前列腺癌治疗靶点和治疗药物有限，患者在CYP17A抑制剂例如阿比特龙(abiraterone)耐受后面临无药可用的境地。解析患者耐药机制、寻找新的治疗靶点和治疗策略有重要科研和应用价值。
患者接受阿比特龙治疗后，血液中黄体酮(progesterone)含量上升。由于大部分前列腺癌细胞中缺乏黄体酮受体(progesterone receptor，PR)的表达，黄体酮在前列腺癌中的功能鲜有研究。一般认为，患者体内黄体酮的升高主要是药物阿比特龙治疗的副作用，与药物响应、药物耐受无关。后续研究发现，黄体酮能够通过和突变的雄激素受体(androgen receptor，AR)结合，促使AR突变体入核、发挥转录功能。此外，高浓度的黄体酮也能够直接结合野生型AR并激活AR信号通路，促进疾病进展。需要注意的是，在患者中，能够响应黄体酮的AR突变体出现几率不高；大部分患者体内的黄体酮浓度都不能够直接激活AR信号通路。因此，黄体酮与CYP17A抑制剂耐受的关系有待进一步澄清。
发明内容
本发明首先提供雌激素响应相关信号通路抑制剂和任选的CYP17A抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的用途，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂包括GATA2抑制剂和/或靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述用途是以下物质的用途：
(I)雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂，或
(II)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂，和任选的GATA2抑制剂，或
(III)下调GATA2表达或活性的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，(I)中，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂是靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和/或GATA2抑制剂。
在一个或多个实施方案中，物质(I)是(I.1)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和CYP17A抑制剂，或(I.2)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和GATA2抑制剂，或(I.3)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂、CYP17A抑制剂和GATA2抑制剂。
在一个或多个实施方案中，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂是小分子、蛋白、核酸分子中任一或多种。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3、TRIM29。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、AGR2、MUC1、MDK。优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、MUC1、MDK。更优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、RHOD、MUC1、MDK。
在一个或多个实施方案中，所述靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂包括干扰蛋白的编码基因的转录和/或表达、或下调蛋白活性的抑制分子。所述抑制分子以蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。
在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的siRNA或其构建物。
在一个或多个实施方案中，所述抑制分子是本发明任一实施方案所述的抑制雌激素响应相关信号通路蛋白表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。优选地，所述抑制分子包含SEQ ID NO:5-24中任一项所示的siRNA序列。
在一个或多个实施方案中，(I)和(II)中，所述CYP17A抑制剂包括：
(1)抑制CYP17A的甾体药物，例如阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone中任意一种或多种，和/或
(2)抑制CYP17A的非甾体药物，例如orteronel、酮康唑、seviteronel、VT-464、CFG920中任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中，(I)和(II)中，所述GATA2抑制剂是下调GATA2的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括干扰GATA2编码基因的转录和/或表达、或下调GATA2蛋白活性的抑制分子。所述抑制分子以GATA2蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以GATA2蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的siRNA或其构建物。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括K7174。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括本发明任一实施方案所述的抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。优选地，下调GATA2的表达或活性的试剂包括SEQ ID NO:1-4中任意所示的siRNA序列。
在一个或多个实施方案中，物质(III)中的多核苷酸包括能干扰GATA2编码基因的转录和/或表达的选自下组的多核苷酸：反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA或其组合。优选地，物质(III)包括本发明任一实施方案所述的抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。更优选地，物质(III)包括SEQ ID NO:1-4中任意所示的siRNA序列。
在一个或多个实施方案中，所述前列腺癌为雌激素响应相关信号通路活化的前列腺癌。在本发明的一些实施方案中，所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
本发明还提供抑制雌激素响应相关信号通路蛋白表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述蛋白选自ASS1、RHOD、MUC1、MDK中任一，所述多核苷酸：
(1)具有SEQ ID NO:5-24中任一项所示的序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，或
(2)含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，Seq正向为识别蛋白编码序列的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在一个或多个实施方案中，Seq正向长度为5-30bp，优选10-25bp。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。
在一个或多个实施方案中，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ IDNO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24中任一组所示的序列。
本发明还提供抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述多核苷酸：
(1)具有SEQ ID NO:1-4中任一项所示的序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，或
(2)含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，Seq正向为识别蛋白编码序列的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在一个或多个实施方案中，Seq正向长度为5-30bp，优选10-25bp。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。
在一个或多个实施方案中，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:1和2、或SEQ ID NO:3和4所示的序列。
本发明还提供药物组合物，包含活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包含雌激素响应相关信号通路抑制剂和任选的CYP17A抑制剂，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂包括GATA2抑制剂和/或靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述活性成分包含：
(I)雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂，或
(II)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂，和任选的GATA2抑制剂，或
(III)下调GATA2表达或活性的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，(I)中，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂是靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和/或GATA2抑制剂。
在一个或多个实施方案中，(I)包含(I.1)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和CYP17A抑制剂，或(I.2)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和GATA2抑制剂，或(I.3)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂、CYP17A抑制剂和GATA2抑制剂。
在一个或多个实施方案中，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂是小分子、蛋白、核酸分子中任一或多种。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3、TRIM29。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、AGR2、MUC1、MDK。优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、MUC1、MDK。更优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、RHOD、MUC1、MDK。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包括干扰蛋白的编码基因的转录和/或表达、或下调蛋白活性的抑制分子。所述抑制分子以蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。
在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的siRNA或其构建物。
在一个或多个实施方案中，所述抑制分子是本发明任一实施方案所述的抑制雌激素响应相关信号通路蛋白表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。优选地，所述抑制分子包含SEQ ID NO:5-24中任一项所示的siRNA序列。
在一个或多个实施方案中，所述CYP17A抑制剂包括：
(1)抑制CYP17A的甾体药物，例如阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone中任意一种或多种，和/或
(2)抑制CYP17A的非甾体药物，例如orteronel、酮康唑、seviteronel、VT-464、CFG920中任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中，(I)和(II)中，所述GATA2抑制剂是下调GATA2的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括干扰GATA2编码基因的转录和/或表达、或下调GATA2蛋白活性的抑制分子。所述抑制分子以GATA2蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以GATA2蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的siRNA或其构建物。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括K7174。
在一个或多个实施方案中，下调GATA2的表达或活性的试剂包括本发明任一实施方案所述的抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。优选地，下调GATA2的表达或活性的试剂包括SEQ ID NO:1-4中任意所示的siRNA序列。
在一个或多个实施方案中，活性成分(III)中的多核苷酸包括能干扰GATA2编码基因的转录和/或表达的选自下组的多核苷酸：反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA或其组合。优选地，物质(III)包括本发明任一实施方案所述的抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物。更优选地，活性成分(III)包括SEQ IDNO:1-4中任意所示的siRNA序列。
本文还提供雌激素响应相关信号通路蛋白作为靶点在筛选药物中的应用，或用作分子指标在临床上用于诊断前列腺癌的病程发展，所述药物用于治疗或预防前列腺癌。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3、TRIM29。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、AGR2、MUC1、MDK。优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、MUC1、MDK。更优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、RHOD、MUC1、MDK。
在一个或多个实施方案中，所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
附图说明
图1为高浓度黄体酮激活AR信号通路示意图。(A)为患者接受阿比特龙治疗前后血液中黄体酮变化。(B)为黄体酮促进AR阳性的前列腺癌细胞生长示意图。(C)为不同细胞系中AR丰度的变化。(D)为Dox诱导LAPC4表达AR前后，AR靶基因表达的变化。
图2显示GATA2介导黄体酮引发的药物耐受。(A)为Prog_cells生长速度。(B)为RNA-seq结果显示雌激素响应相关基因在Prog_cells的激活情况。(C)qPCR结果验证雌激素响应相关基因在Prog_cells中的激活情况。(D)为抑制雌激素响应相关基因后，Prog_cells细胞生长受到抑制示意图。(E)和(F)为GATA2在Prog_cells中表达(E，mRNA；F，蛋白)程度。(G)为靶向抑制GATA2的小分子K7174抑制Prog_cells中雌激素响应相关基因的表达(mRNA)示意图。(H)为Prog_cells基因表达(mRNA)对K7174更敏感示意图。(I)为Prog_cells细胞生长对K7174更敏感示意图。(J)为利用siRNA敲低GATA2表达后，Prog_cells中雌激素响应相关基因的表达(mRNA)受到抑制示意图。(K)为Prog_cells基因表达(mRNA)对GATA2 siRNA敏感程度。(L)为Prog_cells细胞生长对GATA2 siRNA敏感程度。(M)为K7174抑制Prog_cells相关异位瘤生长示意图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文所述的术语仅用于描述实施例，并且不应解释为对整个发明的限制。如在本发明和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”、“所述”包括它们的复数形式，除非与其语境相矛盾。
抑制雌激素响应相关信号通路的活性
前期研究指出，转录因子GATA2能够调节包括AR在内的多个固醇受体的功能，进而影响前列腺癌进展；最近有研究发现，利用小分子药物靶向抑制GATA2能够抑制前列腺癌细胞系的生长(PMID:34636746)。
本发明发现，CYP17A抑制剂(例如阿比特龙)治疗引发的黄体酮上升会导致前列腺癌细胞内GATA2丰度上升，产生药物耐受。因此GATA2是CYP17A抑制剂耐药后的新治疗靶点。进一步地，发明人发现，GATA2调节雌激素响应相关信号通路(estrogen responsepathway，Hallmark gene set(h.all.v7.2.symbols.gmt))，通过抑制雌激素响应相关信号通路的活性，能够抑制前列腺癌细胞的生长。此外，抑制GATA2和抑制雌激素响应相关信号通路特别适合对CYP17A抑制剂耐受的患者。
雌激素响应相关信号通路包括雌激素响应早期和晚期信号通路(estrogenresponse early/late pathway)。本领域已知的任何抑制雌激素响应相关信号通路的活性的方法均可以用于本发明，例如使用雌激素响应相关信号通路抑制剂。本文中，“雌激素响应相关信号通路抑制剂”可以是靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂，也可以是GATA2抑制剂。
靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂
可通过靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性来实现所述抑制，这样的蛋白可以是在前列腺癌细胞中表达或活性上调的任何雌激素响应相关信号通路相关蛋白。示例性的雌激素响应相关信号通路蛋白包括但不限于：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3、TRIM29。优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、AGR2、MUC1、MDK；或选自：ASS1、CLIC3、KRT19、RHOD、HMGCS2、MUC1、MDK；或选自：ASS1、RHOD、MUC1、MDK。
靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂包括干扰蛋白的编码基因的转录和/或表达、或下调蛋白活性的抑制分子，所述抑制分子以蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、多核苷酸、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。
在示例性实施方案中，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂是以蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的抑制性多核苷酸，包括但不限于反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA。示例性地，所述抑制性多核苷酸具有SEQID NO:5和6(ASS1)、SEQ ID NO:7和8(ASS1)、SEQ ID NO:9和10(ASS1)、SEQ ID NO:11和12(RHOD)、SEQ ID NO:13和14(RHOD)、SEQ ID NO:15和16(RHOD)、SEQ ID NO:17和18(MUC1)、SEQ ID NO:19和20(MUC1)、SEQ ID NO:21和22(MUC1)SEQ ID NO:23和24(MDK)中任一组所示的siRNA序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列。
下调蛋白表达或活性的试剂还可以是能形成所述抑制性多核苷酸的前体物质。例如，含有式I所示的结构可在体内形成具有抑制蛋白表达的多核苷酸：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，Seq正向为识别蛋白编码序列的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。通常，Seq正向长度为5-30bp，优选10-25bp。示例性地，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24中任一组所示的序列。
本发明还提供包括本发明的多核苷酸(siRNA或其前体)的核酸构建物，例如重组载体，进一步包括用于在细胞内产生所述多核苷酸所需的组件，例如复制起点、启动子、终止子或转录终止信号等。作为一种优选的方式，载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子(例如35S启动子)，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性、绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。所述载体可以是表达载体或整合载体，前者用于表达基因、dsRNA、相关酶、sgRNA、LncRNA等；后者用于将所需表达的核酸序列整合到基因组中。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子等元件。
多核苷酸可以通过化学合成的方法获得，或者，可通过将核酸构建物引入宿主细胞后由细胞生产所获得。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的宿主细胞。
靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂还可以是相应蛋白的抗体或其结合片段，优选单克隆抗体。这些抗体在本领域技术人员的知识范围内。本发明包含这些抗体的编码序列及其表达载体。
此外，为了雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体。因此，雌激素响应相关信号通路抑制剂可以是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除或敲减蛋白基因的试剂，例如sgRNA。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。在这些实施方案中，所述抑制剂还包含核酸酶(例如Cas9、TALEN)、其编码序列、和/或表达所述核酸酶的核酸构建物。
此外，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂还可以是同源重组载体，其含有编码突变的无活性或活性减弱的雌激素响应相关信号通路蛋白的核苷酸序列，在宿主细胞中敲掉野生型蛋白基因而表达该突变的无活性或活性减弱的蛋白。因此，可通过同源重组技术使对象的细胞中表达这类突变的无活性或活性减弱的蛋白，从而实现其蛋白活性的抑制。
GATA2抑制剂
本发明涉及以GATA2为靶点治疗或预防前列腺癌。具体而言，本发明涉及下调GATA2表达和/或其活性的试剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的用途，以及用于治疗或预防前列腺癌的能下调GATA2表达和/或其活性的试剂。
与雌激素响应相关信号通路蛋白中所述类似，下调GATA2表达和/或其活性的试剂包括干扰GATA2编码基因的转录和/或表达、或下调GATA2蛋白活性的抑制分子。所述抑制分子以GATA2蛋白或其编码基因或转录本作为抑制靶标。在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、多核苷酸、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。
例如，抗体可以是3βHSD的抗体。抗体优选是单克隆抗体。本发明还包含这些抗体的编码序列及其表达载体。
多核苷酸可以是以蛋白编码基因或其转录本作为抑制靶标的抑制性多核苷酸，包括但不限于反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、核酶和基因编辑载体，例如具有SEQ ID NO:1和2或SEQ ID NO:3和4所示的siRNA序列或其相应DNA序列，或者CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。在基因编辑的实施方案中，所述抑制剂还包含核酸酶(例如Cas9、TALEN)、其编码序列、和/或表达所述核酸酶的核酸构建物。
多核苷酸还可以是能形成所述抑制性多核苷酸的前体物质，如式I所示。示例性地，下调GATA2表达和/或其活性的式I所示的多核苷酸中，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:1和2或SEQ ID NO:3和4所示的序列。多核苷酸可以通过化学合成的方法获得，或者，可通过将核酸构建物引入宿主细胞后由细胞生产所获得。重组载体、宿主细胞及相关制备方法如本文他处所述。
在一些实施方案中，多核苷酸是一种同源重组载体，其含有编码突变的无活性或活性减弱的GATA2的核苷酸序列，在宿主细胞中敲掉野生型GATA2基因而表达该突变的无活性或活性减弱的GATA2。因此，可通过同源重组技术使对象的细胞中表达这类突变的无活性或活性减弱的GATA2，从而实现其蛋白活性的抑制。
在本发明的一些实施方案中，下调GATA2表达和/或其活性的小分子化合物是K7174或其药学上可接受的盐。因此，在这些实施方案中，本发明涉及使用K7174或其药学上可接受的盐来治疗或预防前列腺癌，也涉及GATA2或其抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用。K7174如式I所示：
治疗和预防
在本文中，“治疗”和“处理”等是指对患有前列腺癌的患者提供益处的任何行为，包括通过减轻或抑制至少一种症状和疾病进展延迟等作用来改善病情。本文所用的“预防”是指对受到前列腺癌危险的患者提供受益的行为，包括避免不适或疾病发展或万一发病则减少该疾病的一种或多种症状。家族史可能引起该患者面临风险。
发明人发现，通过抑制雌激素响应相关信号通路，能够抑制前列腺癌细胞的生长。因此，本发明提供在有需要的患者中治疗前列腺癌的方法，其包括向患者施用治疗有效量的靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂。
发明人还发现，CYP17A抑制剂治疗引发的黄体酮上升会导致前列腺癌细胞内GATA2丰度上升，产生药物耐受。进一步研究表明，GATA2调节雌激素响应相关信号通路。结合上述发现可知，抑制GATA2蛋白和抑制雌激素响应相关信号通路可以解决患者对CYP17A抑制剂的耐受。因此，本发明还提供在有需要的患者中治疗前列腺癌的方法，其包括向患者施用治疗有效量的：雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂包括靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和/或GATA2抑制剂。
雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂的联合给药还可用于提供预防性的治疗。例如，本发明的雌激素响应相关信号通路抑制剂可以在发生前列腺癌之前预防性施用于受试者。预防性的给药可有效降低随后在受试者中发生前列腺癌的可能性，或降低随后出现的前列腺癌的严重程度。可以向发生前列腺癌的风险较高的受试者例如具有前列腺癌家族史的受试者提供预防性治疗。
“患者”、“对象”、受试者含义相同，包括人和动物。“哺乳动物”是指人和其他哺乳动物。其它动物包括宠物(例如狗，猫)和家畜(例如，牛，马，猪)等。本文中，患者患有前列腺癌，特别是雌激素响应相关信号通路活化的前列腺癌。优选地，患者对CYP17A抑制剂(优选阿比特龙)产生耐受。
本文所用的前列腺癌的治疗或预防也指治疗在其它器官或组织中发现的转移性前列腺癌。大多数前列腺癌在1至3年后变得难治。因此，在一些实施方式中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。患有去势抵抗前列腺癌的受试者对通过化学或外科手段减少可用的雄激素/睾酮/DHT的去势治疗不再发生反应。优选的前列腺癌是前列腺癌细胞LAPC4相关癌症。
在癌症治疗的病例中，治疗前列腺癌的方法还可以包括消融癌症的步骤。可以使用选自冷冻消融、热消融、放射疗法、化学疗法，射频消融、电穿孔、酒精消融、高强度聚焦超声、光动力疗法、单克隆抗体给药和免疫毒素给药的方法来完成癌症的消融。
雌激素响应相关信号通路抑制剂可以单独施用或与CYP17A抑制剂联合使用。在联合施用时，雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂可以同时施用，或者可以以各自独立的剂型和剂量在各自独立的时间点施用，例如相隔1小时内、6小时内、12小时内、24小时内、两天内、一周内、一个月内等。
CYP17A抑制剂和雌激素响应相关信号通路抑制剂可以作为一对施用，或与其它药物或营养物如在辅助治疗中同时施用。在定义本文所述化合物的用途和一种或多种其它药剂中的用途时，术语“辅助治疗”或“联合治疗”定义了本文所描述的化合物和一种或多种其它药剂的使用，旨在包括在方案中以一种序贯方式施用每种药物并将提供药物组合的有益作用，并且还旨在包含以基本上同时的方式例如具有固定比例的这些活性药物的单一配方中或在每种药物的多个分开的配方将这些药物共同给药。
许多CYP17A抑制剂是已知的并且适用于本方法。CYP17A抑制剂的实例包括阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone、orteronel、酮康唑(ketoconazole)、seviteronel、VT-464和CFG920。在一些实施方式中，CYP17A抑制剂是选自由阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A和galeterone组成的组中的甾族化合物。
药物施用和配制
本发明还提供药物组合物，其包含有效量的作为活性成分的本文所述雌激素响应相关信号通路抑制剂和/或CYP17A抑制剂，以及与活性成分相结合的药学上可接受的辅料。本发明的药物组合物包括上述任何适合于治疗前列腺癌的试剂，例如本文所述的靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂、下调GATA2的表达或活性的试剂、CYP17A抑制剂。
当所述试剂是化合物时(例如K7174、阿比特龙)，该化合物可以作为药学上可接受的盐施用。药学上可接受的盐包括无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS，氨丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。参见例如Haynes等人，J.Pharm.Sci，94，2111-2120(2005)。例如，优选的阿比特龙的盐形式是阿比特龙醋酸酯。
本发明的所述药物组合物包括一种或多种活性成分以及一种或多种药学上可接受的辅料。术语“药学上可接受的辅料”指用于治疗剂给药的辅料，包括各种赋形剂、稀释剂和运载体。这类辅料包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药学上可接受的运载体可为固体或者液体。合适的药学上可接受的载体为本领域所知，包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、香油、合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇400、氢化蓖麻油和环糊精等。药学上可接受的运载体例子和制备各种组合物的方法可参见A.Gennaro编写的Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania。通常药物制剂与给药方式匹配，例如用生理盐水或含葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。本发明的药学上可接受的辅料包括适用于核酸递送，特别是siRNA或其前体物或多核苷酸递送的辅料。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明的药物或药物组合物可以是任何合适的剂型，包括散剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂、透皮剂、注射剂、缓释剂和乳剂等。
本发明所述的活性成分可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领有普通技术人员根据各因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括(但不限于)：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
“有效量”指有效抑制GATA2或CYP17A或雌激素响应相关信号通路蛋白并因此产生所需要的治疗、改善、抑制或预防效果的本发明或组合物的量。
本发明提供雌激素响应相关信号通路抑制剂和任选的CYP17A抑制剂在制备用于预防、减缓、治疗前列腺癌或使所述疾病消退的药物中的应用。作为优选，所述疾病为雌激素响应相关信号通路活化的前列腺癌。在本发明的一些实施方案中，所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
本发明还提供筛选药物的方法，包括：(1)使候选药物与雌激素响应相关信号通路蛋白或其编码核酸分子或含有它们的体系接触，和(2)检测所述蛋白或其编码核酸分子的表达或活性的变化，可以指示候选药物作为目标药物。若所述候选药物可提高雌激素响应相关信号通路蛋白或其编码核酸分子的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗前列腺癌(特别是CYP17A抑制剂耐受型前列腺癌)的潜在物质。在优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达雌激素响应相关信号通路蛋白的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达雌激素响应相关信号通路蛋白的体系。如果测试组中雌激素响应相关信号通路蛋白的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。所述的体系选自：细胞体系(如表达雌激素响应相关信号通路蛋白的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明还提供本文所述雌激素响应相关信号通路蛋白作为靶点在筛选药物中的应用，或用作分子指标在临床上用于诊断前列腺癌的病程发展，所述药物用于治疗或预防前列腺癌，
本发明的化合物可从市售途经获得，或者可按照已披露的方法或参照已披露的方法合成得到。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，特定实施例、材料、数量和操作步骤将根据本文所阐述的本发明的范围和精神进行更宽泛的解释。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实验方法
黄体酮长期处理LAPC4细胞
利用IMEM培养液和10％血清培养LAPC4细胞。采用无水乙醇(对照)或者5nM黄体酮处理LAPC4六个月，获得Ctrl_cells和Prog_cells。每次传代待细胞贴壁后，开始添加无水乙醇或者黄体酮。
生长潜能、生长速度测量
在实验第1天，以0.1M/ml细胞密度铺细胞(3盘)；第2天，采用5％热灭活CSS(依科赛生物公司)饥饿处理48小时；第4天，选其中1盘细胞做CCK8实验，剩余2盘细胞更换新鲜的培养基；第6天，选其中的1盘细胞做CCK8，剩余1盘细胞更换新鲜的培养基；第8天对最后1盘细胞进行CCK8实验。待最后一次CCK8测定结束后，采用之后(第6天，第8天)测定的CCK8读数分别除以第4天的CCK8读数，通过比较同一天不同组的倍数变化，进而判断细胞增殖情况。实验采用的CCK8试剂盒来自碧云天公司(C0038)。其检测的原理是试剂盒中包含的WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深。采用酶标仪(美国BioTeK公司)在450nm和600nm处测量加入CCK8试剂培养基中的吸光度，进而判断细胞的增殖能力。
转录组分析
使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取每个样本的总RNA。采用诺唯赞公司的VAHTSTM mRNA-seq V3文库制备试剂盒(NR611)进行RNA-seq文库构建。首先，采用1μg总RNA进行mRNA纯化和片段化。之后将纯化的mRNA进行第一链和第二链cDNA的合成。随后将cDNA连接到接头(VAHTSTM RNA adaptor set3-set6 for Illumina,N809/N810/N811/N812；诺唯赞公司)上，进行PCR扩增(12个循环)。之后采用Qubit荧光仪(美国Invitrogen公司)检测文库的浓度，并采用Agilent2100评估文库的质量。对于质量合格的RNA-seq文库，送至贝瑞生物采用NovaSeq 6000(双端150bp；美国Illumina公司)进行测序，测序数据量至少20M reads。
对于公司返回来的原始序列数据fastq文件，首先采用FastQC(v.0.11.7)进行质量控制，之后采用Trimmomatic(v.0.36-5)软件去除接头以及低质量的序列。随后，使用hisat2(v.2-2.1.0)将去接头的序列与GRCh38.91人类参考基因组进行比对。通过HTSeq(v.0.11.1)对基因的表达水平进行定量。若一个基因在3/4的样品中表达值都为0，那么这个基因在所有样品中默认被过滤掉。采用DESeq2(v.1.24.0)对基因表达水平的Counts数进行标准化以及差异表达分析。
对于过表达富集分析，首先利用倍数变化和FDR设定阈值寻找出差异表达基因，之后采用MSigDB数据库(网址https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)中的“Investigate Gene Sets”模块，选择“hallmark gene sets(h.all.v7.2.symbols.gmt)”基因集，进行富集分析。
对于基因集富集分析，使用GSEA 3.0软件对DESeq2标准化后的数据进行分析。主要改动的参数为，基因集选择“hallmark gene sets(h.all.v7.2.symbols.gmt)”；排序方式是“信噪比”；排列类型为“表型”；其他参数为GSEA软件默认参数。对于富集出来的信号通路，若p<0.05和FDR q<0.25，则判定该信号通路被富集。GSEA软件产生的GSEA图、标准富集得分和q值被用作呈现结果。
对于热图绘制，首先对DESeq2得到的每个基因的表达值进行Z-Score标准化，之后采用MeV4.9软件进行热图绘制。
siRNA
铺细胞后一天，利用opi-MEM和siRNA进行细胞转染。细胞转染六小时后换为正常细胞培养的培养基。转染48小时后可以进行RNA检测、蛋白质检测、靶基因实验等。
敲除GATA2、ASS1、RHOD、MUC1、MDK基因的siRNA序列正向和反向序列如下所示，由吉玛生物合成，引物3’末端带有dTdT接头。
GATA2-Homo-1189
正向序列：GGCUCGUUCCUGUUCAGAA(SEQ ID NO:1)
反向序列：UUCUGAACAGGAACGAGCC(SEQ ID NO:2)
GATA2-Homo-1521
正向序列：GGAACCGGAAGAUGUCCAA(SEQ ID NO:3)
反向序列：UUGGACAUCUUCCGGUUCC(SEQ ID NO:4)
ASS1：
ASS1-Homo-652
正向序列：CCCGCAAACAAGUGGAAAU(SEQ ID NO:5)
反向序列：AUUUCCACUUGUUUGCGGG(SEQ ID NO:6)
ASS1-Homo-793
正向序列：GGAUGCCUGAAUUCUACAA(SEQ ID NO:7)
反向序列：UUGUAGAAUUCAGGCAUCC(SEQ ID NO:8)
ASS1-Homo-895
正向序列：GCAUGGAUGAGAACCUCAU(SEQ ID NO:9)
反向序列：AUGAGGUUCUCAUCCAUGC(SEQ ID NO:10)
RHOD：
RHOD-Homo-221
正向序列：GGUCAACCUGCAAGUGAAA(SEQ ID NO:11)
反向序列：UUUCACUUGCAGGUUGACC(SEQ ID NO:12)
RHOD-Homo-355
正向序列：GCCCGAACAGCUUUGACAA(SEQ ID NO:13)
反向序列：UUGUCAAAGCUGUUCGGGC(SEQ ID NO:14)
RHOD-Homo-457
正向序列：GCAAGGACAAAUCACUGGU(SEQ ID NO:15)
反向序列：ACCAGUGAUUUGUCCUUGC(SEQ ID NO:16)
MUC1：
MUC1-Homo-725
正向序列：GGGAUACCUACCAUCCUAU(SEQ ID NO:17)
反向序列：AUAGGAUGGUAGGUAUCCC(SEQ ID NO:18)
MUC1-Homo-184
正向序列：UCGGCUACCCAGAGAAGUU(SEQ ID NO:19)
反向序列：AACUUCUCUGGGUAGCCGA(SEQ ID NO:20)
MUC1-Homo-842
正向序列：GCAGCCUCUCUUACACAAA(SEQ ID NO:21)
反向序列：UUUGUGUAAGAGAGGCUGC(SEQ ID NO:22)
MDK：
MDK-Homo-543
正向序列：GAAGAAGGCGCGCUACAAU(SEQ ID NO:23)
反向序列：AUUGUAGCGCGCCUUCUUC(SEQ ID NO:24)
K7174处理细胞
在实验第1天，以0.1M/ml细胞密度铺细胞(3盘)；第2天，选其中1盘细胞做CCK8实验，剩余2盘细胞添加指定浓度的K7174；第4天，选其中的1盘细胞做CCK8，剩余1盘细胞继续添加指定浓度的K7174；第6天对最后1盘细胞进行CCK8实验。待最后一次CCK8测定结束后，采用之后(第4天，第6天)测定的的CCK8读数分别除以第一天的CCK8读数，通过比较同一天不同组的倍数变化，进而判断细胞增殖情况。补充说明：1.其中CCK8测定采用碧云天的CCK8试剂盒，检测到波长为450nm和600nm。其中600nm用于做背景矫正，背景矫正方法为450nm的读数减去600nm的读数。得到的差值即记做当天的CCK8读数，用作前面提到的倍数分析。K7174购买自MCE公司，由DMEM所配置。以上实验K7174的添加采用配置10ul药物和培养基混合液，然后加入到含有100ul培养基的细胞中。前面提到的K7174浓度均为最终培养基中的药物浓度。
小鼠异位瘤实验
小鼠实验经中科院分子与细胞科学卓越创新中心动物管理委员会批准。6-8周龄的雄性NOD-SCID小鼠购买自灵畅生物公司。分别将10x106个Prog_cells和Ctrl_cells的PBS和Matrigel(#354234,Corning公司)混合液皮下注射到不同的20只小鼠右侧腋下。待小鼠异位瘤长到250mm3(长×宽×宽×0.52)时，对小鼠进行手术去势处理，并随机分配到四组(A-D)，每组10只小鼠。其中A组注射的是Prog_cells，同时腹腔注射生理盐水；B组注射的是Prog_cells，同时腹腔注射25mg/kg的K7174；C组注射的是Ctrl_cells，同时腹腔注射生理盐水；D组注射的是Ctrl_cells，同时腹腔注射25mg/kg的K7174。入组后的小鼠，每2天采用游标卡尺测量一次小鼠异位瘤。
实施例1：高浓度黄体酮激活AR信号通路
本实施例发现前列腺癌患者接受阿比特龙治疗后血液中黄体酮含量明显上升(图1，A)。高浓度黄体酮(>10nM)能够促进表达AR的前列腺癌细胞系生长(图1，B)。在LAPC4中诱导表达AR，能够使得不响应黄体酮刺激的细胞系响应黄体酮刺激(图1，C和D)。
上述结果说明，高浓度黄体酮能够通过AR促进前列腺癌细胞生长，引起阿比特龙治疗效果下降。
实施例2：GATA2介导黄体酮引发的药物耐受
在大部分患者中，即便在阿比特龙治疗后，血液中黄体酮含量仍低于10nM(图1，A)。这些患者同样会产生药物耐受。因此本实施例进一步探索了黄体酮是否能够通过新的机制导致前列腺癌药物耐受。本实施例中，利用5nM黄体酮长期处理AR丰度较低的LAPC4细胞系(>3个月)，得到细胞系Prog_cells，其生长潜能高于对照株(利用酒精处理3个月以上的LAPC4细胞)，生长速度增加30％以上(图2，A)。
转录组分析发现，Prog_cells中雌激素响应相关信号通路被激活(图2，B和C)。如图2，C所示，我们发现prog_cells中雌激素响应相关信号通路中的基因KRT19、HMGCS2、MDK高表达。此外，如图2，D所示，在Prog_cell中利用siRNA敲除ASS1、RHOD等基因后，细胞生长受到抑制。因此，抑制雌激素响应相关基因的表达，能够抑制Prog_cells细胞的生长。
生物信息学分析(图2，G和J)表明，GATA2可能是潜在的调节这些雌激素响应相关基因的转录因子。发明人发现，黄体酮长期处理形成的Prog_cells细胞中，GATA2的表达上调(图2，E(mRNA)和F(western))。为验证GATA2的作用，本实施例利用靶向GATA2的小分子抑制剂K7174处理Prog_cells，雌激素响应相关基因表达下降(图2，G)。与对照组细胞相比，Prog_cells中雌激素响应相关基因的表达对K7174更敏感(图2，H)。因此，利用K7174能够抑制Prog_cells细胞生长，但是对对照组的影响有限(图2，I)。
为进一步验证，本实施例利用siRNA特异敲除GATA2的表达，同样发现，Prog_cells中雌激素响应相关的基因表达和细胞生长更依赖于GATA2(图2，J-L)。
此外，在小鼠异位瘤实验中，K7174能够特异地、有效地抑制Prog_cells相关异位瘤生长，而对对照组没有明显效果(图2，M)。
因此，GATA2能够作为阿比特龙耐受后的新靶点，用于晚期前列腺癌的治疗。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
<120> 雌激素响应相关通路的抑制及其用途
<130> 220195
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)

1.以下物质在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的用途：
(I)雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂是靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和/或GATA2抑制剂，或
(II)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂，和任选的GATA2抑制剂，或
(III)下调GATA2表达或活性的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，
优选地，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂是小分子、蛋白、核酸分子中任一或多种，
优选地，所述前列腺癌为雌激素响应相关信号通路活化的前列腺癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3，和/或
所述靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂包括干扰蛋白的编码基因的转录和/或表达、或下调蛋白活性的抑制分子；优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物；更优选地，所述抑制分子包括SEQ IDNO:5-24中任意所示的siRNA序列。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，
所述CYP17A抑制剂包括：(1)抑制CYP17A的甾体药物，例如阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone中任意一种或多种，和/或(2)抑制CYP17A的非甾体药物，例如orteronel、酮康唑、seviteronel、VT-464、CFG920中任意一种或多种，和/或
(I)和(II)中，所述GATA2抑制剂是干扰GATA2编码基因的转录和/或表达、或下调GATA2蛋白活性的抑制分子；优选地，所述GATA2抑制剂选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物；更优选地，所述GATA2抑制剂包括K7174和/或SEQ ID NO:1-4中任意所示的siRNA序列。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，(III)中，所述多核苷酸包括能干扰GATA2编码基因的转录和/或表达的选自下组的多核苷酸：反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA或其组合；优选地，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:1-4中任意所示的siRNA序列。
5.一种抑制雌激素响应相关信号通路蛋白表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述蛋白选自ASS1、RHOD、MUC1、MDK中任一，所述多核苷酸：
(1)具有SEQ ID NO:5-24中任一项所示的序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，或
(2)含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，Seq正向为识别蛋白编码序列的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸，X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
优选地，Seq正向长度为5-30bp，
更优选地，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ IDNO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24中任一组所示的序列。
6.一种抑制GATA2表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述多核苷酸：
(1)具有SEQ ID NO:1-4中任一项所示的序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，或
(2)含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，Seq正向为识别蛋白编码序列的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸，X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，
优选地，Seq正向长度为5-30bp，
更优选地，Seq正向和Seq反向分别为SEQ ID NO:1和2、或SEQ ID NO:3和4所示的序列。
7.一种药物组合物，包含活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包含：
(I)雌激素响应相关信号通路抑制剂和CYP17A抑制剂，所述雌激素响应相关信号通路抑制剂是靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂和/或GATA2抑制剂，或
(II)靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂，和任选的GATA2抑制剂，或
(III)下调GATA2表达或活性的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，
优选地，靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂是小分子、蛋白、核酸分子中任一或多种。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，
所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3，
所述靶向抑制雌激素响应相关信号通路蛋白的表达或活性的试剂包括干扰蛋白的编码基因的转录和/或表达、或下调蛋白活性的抑制分子；优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物；更优选地，所述抑制分子包括权利要求5所述的多核苷酸或核酸构建物。
9.如权利要求7或8所述的药物组合物，其特征在于，
所述CYP17A抑制剂包括：(1)抑制CYP17A的甾体药物，例如阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone中任意一种或多种，和/或(2)抑制CYP17A的非甾体药物，例如orteronel、酮康唑、seviteronel、VT-464、CFG920中任意一种或多种，和/或
(I)和(II)中，所述GATA2抑制剂包括干扰GATA2编码基因的转录和/或表达、或下调GATA2蛋白活性的抑制分子；优选地，所述GATA2抑制剂选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物；更优选地，所述GATA2抑制剂包括K7174和/或权利要求6所述的多核苷酸或核酸构建物，和/或
(III)中，所述多核苷酸包括能干扰GATA2编码基因的转录和/或表达的选自下组的多核苷酸：反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、LncRNA或其组合；优选地，(III)包括本发明权利要求6所述的多核苷酸或核酸构建物。
10.雌激素响应相关信号通路蛋白作为靶点在筛选药物中的应用，或用作分子指标在临床上用于诊断前列腺癌的病程发展，所述药物用于治疗或预防前列腺癌，
优选地，所述雌激素响应相关信号通路蛋白选自以下的任意一种或多种或全部：ASS1、FGFR3、HMGCS2、AGR2、MDK、CLIC3、KRT19、NBL1、TFF1、MUC1、RHOD、SYT12、P2RY2、DHRS3、TRIM29。
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