CN114302736A - 变体icos配体(icosl)融合蛋白的方法和用途 - Google Patents

变体icos配体(icosl)融合蛋白的方法和用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了包含ICOSL变体的免疫调节蛋白和编码此类蛋白质的核酸。所述免疫调节蛋白提供了用于各种免疫学和肿瘤学病症的治疗效用。提供了用于制备和使用此类蛋白质的组合物和方法。

Description

变体ICOS配体(ICOSL)融合蛋白的方法和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求以下专利申请的优先权：2019年4月17日提交的美国临时申请号62/835,488；2019年5月31日提交的美国临时申请号62/855,830；2019年11月5日提交的美国临时申请号62/931,212；2019年12月6日提交的美国临时申请号62/945,071；2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,832；和2020年3月10日提交的美国临时申请号62/987,854，将所述文献的每一个的内容通过引用以其整体特此并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2020年4月16日创建的名为761612003240SeqList.txt的文件提供，其大小为116,543字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及用于在癌症和免疫疾病的治疗中调节免疫应答的治疗组合物。在一些方面，本公开文本涉及ICOS配体(ICOSL)的特定变体，其展现出对同源结合配偶体蛋白ICOS或CD28中之一或二者的改善的结合，如改善的亲和力或选择性。
背景技术
通过干预由抗原呈递细胞(APC)或靶细胞与淋巴细胞形成的并且在所述抗原呈递细胞或靶细胞与淋巴细胞之间的免疫突触(IS)中发生的过程来调节免疫应答在医学上越来越受关注。从机理而言，IS中的细胞表面蛋白可以涉及多个蛋白质靶标与它们所结合的单一蛋白质的协调且通常同时的相互作用。IS相互作用的发生与两个细胞的接合密切相关，并且这种结构中的单一蛋白质可以与同一细胞上的蛋白质(顺式)以及相关细胞上的蛋白质(反式)很可能同时地相互作用。虽然可以调节IS的治疗剂是已知的，但是需要改善的治疗剂。提供了满足此类需要的免疫调节蛋白，包括能够在细胞上表达的可溶性蛋白质或跨膜免疫调节蛋白。
发明内容
在一些任何实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括在治疗期内向患有自身免疫性或炎性疾病的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约6mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约1mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约0.3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约0.1mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约6mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约1mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约0.3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约6mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约0.3mg/kg至为或约1mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约1mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约1mg/kg至为或约6mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约1mg/kg至为或约3mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约3mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约3mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约3mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约3mg/kg至为或约6mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约6mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约6mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约6mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约10mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，每个剂量是以从或从约10mg/kg至为或约15mg/kg的量施用。
在一些任何实施方案中，在治疗期内施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。在一些任何实施方案中，在治疗期内施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述多个剂量是2、3、4或5个剂量。在一些任何实施方案中，所述治疗期是至少20天。在一些任何实施方案中，所述治疗期是20-40天。
在一些任何实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白是以选自3、4和5个的多个剂量施用，持续20-40天的治疗期。在一些任何实施方案中，每个剂量是从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量。
在一些任何实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白是以多个剂量施用，持续至少20天的治疗期。在一些任何实施方案中，每个剂量是从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量。在一些任何实施方案中，每个剂量持续30天的最长治疗期。在一些任何实施方案中，每个剂量与多个剂量中的每一个彼此隔开至少5天。在一些任何实施方案中，所述治疗期持续为或约21天。在一些任何实施方案中，所述治疗期持续为或约28天。在一些任何实施方案中，所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
在一些任何实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白是以多个剂量施用，持续至少4周的治疗期。在一些任何实施方案中，每个剂量是从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量并且每周施用不超过一次。
在一些任何实施方案中，本文提供了一种预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何实施方案中，所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植的同时或之后向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植的同时向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植之后向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
在一些任何所提供的实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用单一剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。在一些任何所提供的实施方案中，所述GVHD是急性GVHD(aGVHD)。在一些任何所提供的实施方案中，所述GVHD是慢性GVHD。
在一些任何提供的实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用单一剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用，并且其中所述受试者是免疫抑制剂抗性或难治性的。在一些实施方案中，所述免疫抑制剂是皮质类固醇，如糖皮质激素。在一些实施方案中，所述免疫抑制剂是环孢素。在一些任何所提供的实施方案中，所述GVHD是急性GVHD(aGVHD)。在一些任何所提供的实施方案中，所述GVHD是慢性GVHD。
在一些任何实施方案中，所述治疗期持续为或约4周。在一些任何实施方案中，所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。在一些任何实施方案中，每个剂量是如下量：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。在一些任何实施方案中，剂量是如下量：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。在一些任何实施方案中，每个剂量是为或约0.3mg/kg的量。在一些任何实施方案中，每个剂量是为或约1mg/kg的量。在一些任何实施方案中，每个剂量是为或约3mg/kg的量。在一些任何实施方案中，每个剂量是为或约6mg/kg的量。在一些任何实施方案中，每个剂量是为或约10mg/kg的量。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是为或约0.3mg/kg的量。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是为或约1mg/kg的量。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是为或约3mg/kg的量。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是为或约6mg/kg的量。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是为或约10mg/kg的量。
在一些实施方案中，所述施用是经由皮下施用。在一些实施方案中，所述施用是经由静脉内施用。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是经由皮下施用来施用。在一些任何实施方案中，至少一个剂量是经由静脉内施用来施用。在一些任何实施方案中，重复所述治疗期。在一些任何实施方案中，重复所述治疗期直到实现缓解、直到实现部分缓解或直到所述受试者的所述疾病或病症没有进展。
本文提供了治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中关于SEQ ID NO:1中所示序列的一个或多个氨基酸取代。本文提供了减轻或预防受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中关于SEQ ID NO:1中所示序列的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白可以包含如本文所述的任一种，如具有增加与CD28和/或ICOS结合的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个氨基酸取代)并且与多聚化结构域如Fc结构域融合的变体ICOSL多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是取代N52H/N57Y/Q100R。
在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽包含关于SEQ ID NO:1的编号的氨基酸取代N52H/N57Y/Q100R。在一些任何实施方案中，与所述ICOSL参考多肽对CD28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体ICOSL多肽展现出对相同的一个或多个胞外域增加的结合亲和力。在一些任何实施方案中，与所述ICOSL参考多肽对ICOS的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体ICOSL多肽展现出对相同的一个或多个胞外域基本相同的或增加的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述结合亲和力是所述ICOSL参考多肽对相同的一个或多个胞外域的结合亲和力的为或约80％或更高。在一些任何实施方案中，与所述ICOSL参考多肽对ICOS和CD28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体ICOSL多肽展现出与相同的一个或多个胞外域增加的结合。在一些任何实施方案中，所述结合增加多于或多于约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在Cmax下大于或大于约25％的CD28靶结合饱和度；和/或所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％的CD28靶结合饱和度。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约85％的CD28靶结合饱和度。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约90％的CD28靶结合饱和度。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约95％的CD28靶结合饱和度。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的21天或28天内大于或大于约10％的CD28靶结合饱和度。在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的21天或28天内大于或大于约20％的CD28靶结合饱和度。
在一些任何实施方案中，所述CD28是人CD28。在一些任何实施方案中，所述ICOS是人ICOS。在一些任何实施方案中，所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段，或二者。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。在一些任何实施方案中，所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。在一些任何实施方案中，所述ICOSL参考多肽是截短的ICOSL胞外结构域，其包含关于SEQ ID NO:1中所示的ICOSL胞外结构域序列的含有氨基酸1-112的连续氨基酸序列和至少25个氨基酸的C末端截短。在一些任何实施方案中，所述C末端截短是至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125个氨基酸残基的截短。
在一些任何实施方案中，所述ICOSL参考多肽在如SEQ ID NO:1的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点中被改变或缺乏所述蛋白酶切割位点。在一些任何实施方案中，所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述ICOSL参考多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列或展现出与SEQ ID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代的序列。
在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列。在一些任何实施方案中，与当由细胞表达时的所述变体ICOSL多肽的全长胞外结构域相比，所述变体ICOSL多肽在由相同细胞表达时展现出减少的蛋白水解切割。在一些任何实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些任何实施方案中，所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL多肽经由接头与所述多聚化结构域连接。在一些任何实施方案中，所述接头是肽接头。在一些任何实施方案中，所述接头包含1至10个氨基酸。在一些任何实施方案中，所述接头是AAA。在一些任何实施方案中，所述接头是G4S(SEQ ID NO:52)。在一些任何实施方案中，所述接头是(G4S)2(SEQ ID NO:53)。在一些任何实施方案中，所述接头是GSGGGGS接头(SEQ ID NO:58)。
在一些实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白是多聚体，其包含与第一多聚化结构域连接的第一变体ICOSL多肽和与第二多聚化结构域连接的第二变体ICOSL多肽。在一些任何实施方案中，所述第一和第二多聚化结构域是相同的。在一些任何实施方案中，所述第一和第二多聚化结构域是免疫球蛋白的Fc区。在一些任何实施方案中，所述多聚体是二聚体。在一些任何实施方案中，所述二聚体是同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出一种或多种降低的效应子功能的变体Fc区。在一些任何实施方案中，所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1Fc区。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含展现出与SEQ ID NO:37的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。在一些任何实施方案中，所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ IDNO:39中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述Fc区包含SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所述变体ICOSL融合蛋白降低所述受试者中的免疫应答。在一些任何实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。在一些任何实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是炎性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎、银屑病关节炎或银屑病。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，所述炎性疾病或自身免疫性疾病是葡萄膜炎。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病或病症是移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方案中，所述GVHD是急性GVHD。在一些实施方案中，所述GVHD是慢性GVHD。在一些实施方案中，所述GVHD是抗性或难治性的。在一些实施方案中，所述GVHD是慢性GVHD。在一些实施方案中，所述GVHD是免疫抑制剂抗性或难治性的。在一些实施方案中，所述免疫抑制剂是皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇是糖皮质激素。在一些实施方案中，所述免疫抑制剂是环孢素。
在一些任何实施方案中，所述治疗方法包括预防性处理。在一些任何实施方案中，在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作之前给予至少一个剂量。在一些实施方案中，在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作的同时或之后施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。在一些实施方案中，在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作之前施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白，并且在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作的同时或之后施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
在一些任何实施方案中，所述受试者是人。
以下是本公开文本的示例性编号实施方案：
实施方案1.一种预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述受试者先前已经接受同种异体造血干细胞移植(HSCT)并且在接受所述同种异体HSCT之后在所述受试者中发生所述aGVHD。
实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述受试者患有II-IV级aGVHD。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者中的aGVHD是免疫抑制剂治疗抗性或难治性的。
实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括皮质类固醇。
实施方案6.根据实施方案4或实施方案5所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括环孢素。
实施方案7.一种预防或减轻继发于病毒性感染的炎症的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且所述感染是COVID-19。
实施方案10.根据实施方案7-9中任一项所述的方法，其中所述炎症与细胞因子释放综合征(CRS)相关。
实施方案11.根据实施方案10所述的方法，其中所述CRS是严重CRS或3级或更高级CRS。
实施方案12.根据实施方案7-11中任一项所述的方法，其中在所述施用时或紧接在所述施用之前，所述受试者患有与所述病毒性感染相关或归因于所述病毒性感染的严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或败血性休克。
实施方案13.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括在治疗期内向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是急性病症。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
实施方案17.根据实施方案14所述的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是慢性病症。
实施方案18.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
实施方案19.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。
实施方案20.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。
实施方案21.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
实施方案22.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。
实施方案23.根据实施方案13、实施方案14或实施方案17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是溃疡性结肠炎。
实施方案24.根据实施方案1-15和17-23中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
实施方案26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。
实施方案27.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每两周施用一次(Q2W)。
实施方案28.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每个月施用一次(Q4W)。
实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。
实施方案30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、或为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。
实施方案31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
实施方案32.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
实施方案33.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
实施方案34.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
实施方案35.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
实施方案36.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约15mg/kg的量施用。
实施方案37.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约20mg/kg的量施用。
实施方案38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中重复所述治疗期。
实施方案39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述施用是经由皮下施用。
实施方案40.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述施用是经由静脉内施用。
实施方案41.一种治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中眼部自身免疫性或炎性疾病是葡萄膜炎。
实施方案43.根据实施方案41或实施方案42所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以如下剂量施用：在约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg之间，包含端值。
实施方案44.根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以小于0.2mL、任选地小于0.1mL的体积施用。
实施方案45.根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以为或约0.05mL的体积施用。
实施方案46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含(i)SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
实施方案47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。
实施方案48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。
实施方案49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
实施方案50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。
实施方案51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列或展现出与SEQ ID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的一个或多个氨基酸取代的序列。
实施方案52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列。
实施方案53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。
实施方案54.根据实施方案53所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出降低的效应子功能的变体Fc区。
实施方案55.根据实施方案53或实施方案54所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1Fc区。
实施方案56.根据实施方案54或实施方案55所述的方法，其中所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
实施方案57.根据实施方案54-56中任一项所述的方法，其中所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
实施方案58.根据实施方案53-57中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
实施方案59.一种用于预防或减轻受试者的急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案60.变体ICOSL融合蛋白在配制用于预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案61.根据实施方案59所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案62.根据实施方案59或实施方案61所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60或实施方案61所述的用途，其中所述aGvHD是II-IV级aGVHD。
实施方案63.根据实施方案59、61和62中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61和62中任一项所述的用途，其中所述aGVHD是免疫抑制剂治疗抗性或难治性的。
实施方案64.根据实施方案59和61-63中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60和61-63中任一项所述的用途，其中所述免疫抑制剂包括皮质类固醇。
实施方案65.根据实施方案63或实施方案64所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案63或实施方案64所述的用途，其中所述免疫抑制剂包括环孢素。
实施方案66.一种用于预防或减轻受试者的继发于病毒性感染的炎症的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案67.变体ICOSL融合蛋白在配制用于预防或减轻继发于病毒性感染的炎症的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案68.根据实施方案66所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案67所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案69.根据实施方案66或实施方案68所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案67或实施方案68所述的用途，其中所述病毒是冠状病毒。
实施方案70.根据实施方案69所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案69所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且所述感染是COVID-19。
实施方案71.根据实施方案66、68和69中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案67-69中任一项所述的用途，其中所述炎症与细胞因子释放综合征(CRS)相关。
实施方案72.根据实施方案71所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案71所述的用途，其中所述CRS是严重CRS或3级或更高级CRS。
实施方案73.根据实施方案68和69-72中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案68和69-72中任一项所述的用途，其中在所述施用时或紧接在所述施用之前所述受试者患有严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、与所述病毒性感染相关或归因于所述病毒性感染的败血症或败血性休克。
实施方案74.一种用于治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案75.变体ICOSL融合蛋白在配制用于治疗自身免疫性或炎性疾病或病症的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案76.根据实施方案74所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
实施方案77.根据实施方案61-65、68-73和76中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73和76中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量。
实施方案78.根据实施方案77所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案77所述的用途，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是急性病症。
实施方案79.根据实施方案61-65、68-73和76-78中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73和76-78中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
实施方案80.根据实施方案77所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案77所述的用途，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是慢性疾病或病症。
实施方案81.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
实施方案82.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。
实施方案83.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。
实施方案84.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
实施方案85.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。
实施方案86.根据实施方案74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是溃疡性结肠炎。
实施方案87.根据实施方案61-65、68-73和76-78中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73和76-78中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
实施方案88.根据实施方案87所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案87所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
实施方案89.根据实施方案87或实施方案88所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案87或实施方案88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。
实施方案90.根据实施方案87或实施方案88所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案87或实施方案88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每两周施用一次(Q2W)。
实施方案91.根据实施方案87或实施方案88所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案87或实施方案88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每个月施用一次(Q4W)。
实施方案92.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。
实施方案93.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-92中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-92中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、或为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。
实施方案94.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
实施方案95.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
实施方案96.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
实施方案97.根据61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
实施方案98.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
实施方案99.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约15mg/kg的量施用。
实施方案100.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约20mg/kg的量施用。
实施方案101.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-100中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-100中任一项所述的用途，其中重复所述治疗期。
实施方案102.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是皮下施用。
实施方案103.根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是静脉内施用。
实施方案104.一种用于治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案105.变体ICOSL融合蛋白在配制用于治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
实施方案106.根据实施方案104所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案105所述的用途，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病是葡萄膜炎。
实施方案107.根据实施方案104或实施方案106所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案105或实施方案106所述的用途，其中所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以如下剂量施用：在约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg之间，包含端值。
实施方案108.根据实施方案107所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案107所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以小于0.2mL、任选地小于0.1mL的体积施用。
实施方案109.根据实施方案107或实施方案108所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案107或实施方案108所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以为或约0.05mL的体积施用。
实施方案110.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-109中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103、105和106、107-109中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽包含(i)SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)和/或(ii)的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
实施方案111.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-110中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-110中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。
实施方案112.根据实施方案59、61-65、66、68-73-、74、76-103、104、and 106-111中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-111中任一项所述的用途，其中所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。
实施方案113.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-112中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-112中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
实施方案114.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-113中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-113中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。
实施方案115.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-114中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-114中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列或展现出与SEQ ID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的一个或多个氨基酸取代的序列。
实施方案116.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-115中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-115中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列。
实施方案117.根据实施方案59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-116中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-116中任一项所述的用途，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。
实施方案118.根据实施方案117所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案117所述的用途，其中所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出降低的效应子功能的变体Fc区。
实施方案119.根据实施方案117或实施方案118所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案117或实施方案118所述的用途，其中所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1Fc区。
实施方案120.根据实施方案118或实施方案119所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案118或实施方案119所述的用途，其中所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
实施方案121.根据实施方案118-120中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案118-120中任一项所述的用途，其中所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
实施方案122.根据实施方案117-121中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据实施方案117-121中任一项所述的用途，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
附图说明
图1A-图1B描绘了分子的示意图。图1A描绘了含有与Fc链融合的变体IgSF结构域(vIgD)的可溶性分子。图1B描绘了在ICOSL的IgV结构域中含有经常观察到的突变的分子。
图2A-图2B经由细胞因子释放展示了当与抗CD3共固定化时野生型(WT)或变体ICOSL的共刺激能力。将10nM抗CD3湿包被至具有40nM(箭头)或10nM WT或变体ICOSL的96孔平底聚苯乙烯组织培养板的孔中。添加100,000个纯化的CD4+和CD8+(全)T细胞，72小时后收获上清液以用于针对细胞因子释放的ELISA分析。图2A显示了IFN-γ并且图2B显示了全T细胞分泌的IL-17蛋白水平。图表表示由全T细胞共刺激产生的典型IFN-γ和IL-17应答。
图3A-图3B经由增殖展示了当与抗CD3共固定化时野生型(WT)或变体ICOSL的共刺激能力。如前所述，将CFSE标记的全T细胞在抗CD3和ICOSL包被的培养板中孵育72小时。收获细胞，将其洗涤，用荧光缀合的抗CD4或抗CD8抗体染色，并通过流式细胞术分析。使用未刺激的对照CFSE标记的T细胞设定门控和细胞计数器电压。通过相比于对照的CFSE稀释度来确定增殖。图3A显示了40nM ICOSL共刺激后总增殖百分比(箭头)、CD4+(实心条)和CD8+细胞(阴影条)T细胞的百分比。图3B显示了10nM ICOSL共刺激后总全T细胞增殖的百分比。图表表示由全T细胞共刺激产生的典型增殖应答。
图4描绘了人混合淋巴细胞反应(MLR)中的ICOSL vIgD候选功能。ICOSL变体及其突变，连同野生型ICOSL、阴性对照PDL2-Fc和人IgG，以及阳性对照基准分子CTLA-Ig贝拉西普一起在x轴上列出。横跨图中的线表示在阴性对照培养物的上清液中检测到的IFN-γ的基线量。对于每种ICOSL变体候选物或对照，测试了三种不同浓度，其中箭头表示培养物中蛋白质的最高浓度40nM。与贝拉西普相比，大多数ICOSL变体候选物在测试的所有三种浓度下显示出优异的拮抗活性，如那些培养物中较低浓度的IFN-γ所反映的。
图5A-图5D描绘了在B-T共培养测定中可溶性ICOSL Fc融合蛋白对B和T细胞应答的抑制。图5A描绘了可溶性ICOSL Fc融合蛋白对T细胞驱动的B细胞增殖的抑制。将来自单个供体的纯化的CD4+T细胞和B细胞进行CFSE标记，并在存在或不存在指示的丝裂原的情况下与或不与指示的ICOSL Fc融合蛋白以1:1的比例进行共孵育。用100ng/mL的葡萄球菌B型肠毒素(SEB)、1mg/mL的商陆丝裂原(PWM)或二者刺激细胞。ICOSL Fc融合蛋白以40nM的终浓度包含在内，并将培养物孵育7天，并进行FACS分析。分裂的B细胞的数量由培养物中其CFSE被稀释的细胞的数量来确定。除野生型之外，所有测试的ICOSL Fc融合蛋白减少了B细胞增殖。图5B-图5D显示了ICOSL Fc融合蛋白在B-T共培养物中抑制细胞因子T细胞细胞因子的产生。在第7天收获来自上述培养物的上清液，并使用LEGENDplex Human Th CytokinePanel(Biolegend)分析细胞因子含量。通过包含ICOSL Fc融合蛋白减少了IL-5(图5B)、IL-13(图5C)和IL-21(图5D)的T细胞产生。
图6A-图6F描绘了移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型中的不同终点，其中人PBMC细胞被过继转移至免疫缺陷NSG鼠宿主中。图6A显示了处理的动物的存活率曲线。在盐水对照动物中观察到侵袭性疾病过程和随后的死亡，其存活率与在用野生型ICOSL-Fc以及N52H/I143T ICOSL变体处理的动物中观察到的相似。变体N52H/N57Y/Q100P具有与临床基准贝拉西普可比的改善的存活率。图6B显示了重量减轻的相似趋势，其中ICOSL变体N52H/N57Y/Q100P展示出与用贝拉西普处理的动物相似的重量维持，但所有其他组经历快速的重量减轻。图6C显示了来自标准化GVHD疾病活动指数(DAI)观察结果的临床得分，再次显示了用ICOSL变体N52H/N57Y/Q100P处理的动物的较低得分，其与临床基准贝拉西普可比，而其他动物组经历更高的DAI得分。图6D描绘了在第14天测量的来自实验动物的血液中CD4和CD8百分比的流式细胞术测量结果。实验组之间CD8细胞的百分比大致相同，然而，与其他实验组相比，用ICOSL变体N52H/N57Y/Q100P和贝拉西普处理的动物具有较低的CD4细胞百分比。
图6E描绘了来自测试另外的ICOSL变体分子的类似实验的存活率曲线。图6F描绘了来自测试另外的ICOSL变体分子的类似实验的临床得分。
图7总结了来自迟发型超敏反应(DTH)的标准模型的小鼠耳厚度的变化。用卵白蛋白致敏且随后用相同的蛋白质在耳朵中激发的PBS处理的动物显示出最高水平的测量的耳肿胀。在耳激发后用临床基准阿巴西普处理的小鼠耳肿胀略有减轻。与阿巴西普相比，所有五个ICOSL变体处理组均显示出相同或改善的耳肿胀减轻。
图8描绘了当与10nM抗CD3以及40nM Fc对照蛋白、野生型ICOSL-Fc、野生型CD80-Fc、这两种蛋白质或具有如所示突变的变体ICOSL Fc融合蛋白一起孵育时原代人T细胞的Nanostring转录特征。由收获的细胞制备来自样品的总RNA，并将RNA转移至Nanostring，并使用Cancer Immune芯片定量每个样品中750个基因的转录物。改变的转录物包括其水平高于或低于对角线的那些，包括示出的转录物。
图9描绘了在存在各种免疫调节蛋白的情况下如图8中所述孵育所示时间后的示例性转录物的转录水平。
图10A-图10G显示了含有在各种参考序列中产生的突变N52H/N57Y/Q100R/F172S的变体ICOSL Fc融合分子(如截短的ICOSL ECD Fc融合物、仅ICOSL IgV结构域的Fc融合物和/或具有关于SEQ ID NO:1中所示的参考ICOSL胞外结构域(ECD)序列的N207G/L208G处突变的ICOSL变体Fc融合蛋白)中蛋白水解的SEC分析。使用ExpiCH O-S来源的细胞表达分子。图10H显示了变体ICOSL IgV-Fc对于CD28和ICOS二者的靶结合，而对照蛋白没有靶结合。图10I显示了如通过流式细胞术和IC50水平测量的变体ICO SL IgV-Fc阻断配体与靶受体CD28和ICOS结合的能力。图10J显示了变体ICOSL IgV-Fc阻断CD28和ICOS二者共刺激。
图11A-图11E描绘了在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中示例性ICOSL IgV-Fc融合分子的预防性给药的抗炎活性，包括平均总爪得分(图11A)、检测的CII IgG(图11B)、血清细胞因子水平(图11C)、CD44+激活的T细胞或TFH细胞(图11D)和引流淋巴结中的B细胞分数(图11E)。
图12A-图12D描绘了在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中示例性ICOSL IgV-Fc融合分子的延迟给药的抗炎活性，包括平均总爪得分(图12A)和血清细胞因子水平(图12C-图12D)。
图13A-图13D描绘了在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中示例性ICOSLIgV-Fc融合分子的延迟给药的抗炎活性，包括EAE得分(图13A)、体重随时间的平均变化％(图13B)、腹股沟淋巴结T细胞的流式细胞术分析(图13C)和促炎性细胞因子(图13D)。
图14A-图14B描绘了用不同剂量(20、100或500μg)的变体ICOSL IgV-Fc分子处理的移植物抗宿主病(GvHD)小鼠的存活率和DAI得分。
图15A-图15F描绘了研究结束时在收集的血液中人细胞/小鼠细胞的移植物抗宿主病(GvHD)比率形式(图15A)或以总T细胞计数形式(图15B)的流式细胞术分析，以及用各种剂量(20、100或500μg)的变体ICOSL IgV-Fc分子处理的移植物抗宿主病(GvHD)小鼠的ICOS+CD4+或CD8+细胞(图15C-图15D)或CD28+CD4+或CD8+细胞(图15E-图15F)的评估。
图16A-图16B描绘了来自用不同剂量(20、100或500μg)的变体ICOSL IgV-Fc分子处理的移植物抗宿主病(GvHD)小鼠的T细胞的激活或耗尽标记物的表达。
图16C描绘了来自用不同剂量(20、100或500μg)的变体ICOSL IgV-Fc处理的移植物抗宿主病(GvHD)小鼠的T效应细胞(Teff)与T调节细胞(Treg)的比率。
图17A-图17D描绘了来自用不同剂量(20、100或500μg)的变体ICOSL IgV-Fc分子处理的移植物抗宿主病(GvHD)小鼠的血清促炎性细胞因子。
图17E描绘了与正常小鼠相比，在GVHD模型中变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)的血清暴露。
图18A描绘了DAI结果，并且图18B描绘了在CD4+CD45RB高诱导的结肠炎模型中用示例性变体ICOSL IgV-Fc处理关于由体重和大便得分计算的疾病活动指数(DAI)的组织学结果。
图19A-图19N描绘了在舍格伦综合征(SjS)模型中细胞因子释放的体外刺激，其涉及在存在Fc对照、普瑞鲁单抗(prez)、阿巴西普(Aba)、阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合(A+P)或ICOS-IgV Fc(N52H/N57Y/Q100R)的情况下将来自患有SjS的受试者或健康供体的PBMC与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养。图19A和图19B分别描绘了来自SjS PBMC和健康供体PBMC的IL-2的产生。图19C和图19D分别描绘了来自SjS PBMC和健康供体PBMC的IFN-γ的产生。图19E和图19F描绘了在存在Fc对照、阿巴西普或ICOS-IgV Fc(N52H/N57Y/Q100R)的情况下与人工APC共培养后分别来自SjS PBMC匹配供体的IL-2和IFN-γ。图19G至图19I描绘了细胞因子应答的示例性结果。图19J描绘了对于SjS、SLE和PsA患者群体的基因分析。图19K描绘了共培养期间如初始T细胞百分比的增加所示的T细胞增殖、CD40L+T细胞恢复和B细胞增殖以及B细胞分化。图19L描绘了关于对细胞激活/增殖的影响的IC50值。图19M描绘了人IgG1、IgG3、IgA和IgM的分泌的结果。图19N描绘了参与B-T细胞协作的基因的下一代测序结果，其依据变体ICOSL IgV-Fc的抑制水平排序，其中红色程度反映较高的表达值且蓝色程度代表每个基因的较低值。
图20A-图20H描绘了从未处理小鼠或来自抗PD-L1诱导的涎腺炎的NOD x抗PDL1小鼠模型的已用Fc对照、阿巴西普或ICOS-IgV Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理的小鼠收集的下颌下腺(SMG)的组织学结果、器官以及血清的结果。用H&E染色后的示例性组织学图像示于图20A和图20C。图20B和图20D描绘了对于处理的小鼠的0-3等级的炎症得分。图20E描绘了单独的SMG得分。图20F描绘了来自在第10天收集的血清的血清自身抗体并通过ELISA对其进行分析。图20G描绘了来自从第10天收集的SMG分离的RNA的相对基因表达水平。图20H描绘了在SLE模型中每个脾脏中的GC B和CD4+Tfh细胞水平以及与Fc对照相比减少的血清抗dsDNA，所述模型涉及通过接受者抗原呈递细胞同种激活供体CD4+T细胞从而导致具有类似于SLE的症状的cGvHD疾病。
图21A-图21E描绘了关节炎模型中细胞因子释放的体外刺激，其涉及在存在Fc对照、普瑞鲁单抗(prez)、阿巴西普(aba)、阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合(A+P)或ICOS-IgVFc(N52H/N57Y/Q100R)的情况下将来自健康供体(HD)受试者或患有类风湿性关节炎(RA)或银屑病关节炎(PA)的受试者的PBMC与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养。显示了IL-2(图21A)、IFN-γ(图21B)、TNFα(图21C)和IL-17A(图21D)的结果。图21E描绘了相对于Fc对照的细胞因子分泌抑制百分比。
图22A-图22D描绘了从关节炎模型中细胞因子释放的体外刺激分离的RNA的结果，所述体外刺激涉及在存在Fc对照、普瑞鲁单抗(prez)、阿巴西普(aba)、阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合(A+P)或ICOS-IgV Fc(N52H/N57Y/Q100R)的情况下将来自健康供体(HD)或患有类风湿性关节炎(RA)或银屑病关节炎(PA)的受试者的PBMC与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养。图22A描绘了通过ICOSL IgV-Fc下调与疾病发病机制相关的基因。显示了通过ICOSLIgV-Fc相比于比较物对Th17相关效应分子(图22B)、共刺激分子(图22C)和炎性TH1或TH2相关效应分子(图22D)的基因减少和/或调节的结果。
图23A-图23C描绘了在无偏斜(skewing)(K562/OKT3/CD80+CD86+IL-2)或Th17偏斜(K562/OKT3/ICOSL+Th17)偏斜培养基的条件下用aAPC初级刺激之下人PBMC的结果。图23A描绘了刺激后四天ICOS或CD28的流式细胞术分析。显示了T细胞增殖(图23B)和IL-17A细胞因子分泌(图23C)的结果。
图24A-图24E描绘了小鼠的胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型的结果，所述小鼠在第18天施用胶原蛋白加强之前开始用媒介物(杜氏磷酸盐缓冲盐水/DPBS)、Fc对照、阿巴西普(OrenciaTM)或半治疗性方案中的示例性变体ICOSL IgV-Fc或阿巴西普每3天腹膜内(IP)处理一次，共5个剂量(Q3Dx5)。图24A描绘了爪炎症和结构损害。图24B描绘了脱钙爪的甲苯胺蓝染色。图24C描绘了如通过CD4+或总活细胞的百分比测量的细胞因子的数量。图24D描绘了总抗小鼠II型胶原蛋白IgG抗体的浓度。图24E描绘了对于来自Fc对照、阿巴西普或示例性变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠的单独小鼠确定的相对于用媒介物(DPBS)处理的小鼠的细胞因子抑制百分比。
图25A显示了在用指示剂量的示例性ICOSL IgV-Fc处理的受试者中经28天测量的示例性ICOSL IgV-Fc的药代动力学。
图25B描绘了在用指示剂量的示例性ICOSL IgV-Fc处理的受试者中经28天测量的CD4+靶饱和度百分比。
图26A和图26B描绘了示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白在人受试者中的免疫调节活性。融合蛋白在暴露于免疫刺激剂后抑制受试者中的抗体应答(图26A)，并在离体暴露于葡萄球菌B型肠毒素时抑制受试者的细胞产生IL-2(图26B)。
图27A和图27B显示了示例性变体ICOSL IgV-Fc对从患有克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)的患者分离并在体外用人工抗原呈递细胞刺激的PBMC的细胞因子释放的影响。图27A显示了在与人工抗原呈递细胞孵育48小时并如所示处理后上清液中的TNF-α、IFNγ、IL-6和IL-12p70浓度。图27B显示了如所示处理相对于Fc对照处理的细胞因子释放的抑制百分比。
图28描述了示例性变体ICOSL IgV-Fc在结肠炎的体内T细胞转移鼠模型中的功效。图28A描绘了体重、大便得分和DAI结果。图28B显示了经由来自血液(左)和肠系膜淋巴结(右)二者的流式细胞术分析的T细胞抑制(图例与图28A中所示相同)。图28C描绘了来自用媒介物对照(无结肠炎)、Fc对照或本文所述的示例性变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠的血清促炎性细胞因子。图28D描绘了用示例性变体ICOSL IgV-Fc的处理关于结肠重量:长度比率的组织学结果和合并组织学得分。代表性结肠组织染色可以参见图28E，并且更高放大倍数参见图28F。
图29A和图29B分别显示了葡萄膜炎实验模型中处理眼和未处理眼的中值和平均未掩蔽临床得分。图29C显示了根据处理对于双眼在第14天的中值未掩蔽临床得分。图29D和图29E仅显示了右(处理)眼依据天数的中值未掩蔽临床得分。(8/10或10/12指示施用的天数)。
图30A显示了葡萄膜炎的实验模型中处理眼和未处理眼的中值掩蔽OCT得分。图30B显示了处理眼的中值掩蔽OCT得分。图30C显示了处理眼依据天数的中值掩蔽OCT得分。(8/10或10/12指示施用的天数)。
图31显示了如所示处理(右)眼和未处理(左)眼在第14天的中值掩蔽组织学得分。(8/10或10/12指示施用的天数)
图32显示了跨越天数和处理的自基线的重量变化(平均值和标准偏差)。
图33显示了在单一剂量后示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白的药代动力学。随时间绘制平均浓度。(SC＝皮下；其他为静脉内(i.v.))
图34显示了在单一剂量的示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白之后CD4+T细胞上随时间变化的靶饱和度平均值和标准偏差。(SC＝皮下；其他为静脉内(i.v.))。
图35显示了在施用单一剂量的示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白的受试者中相对于基线的抗KLH IgG平均值和标准偏差与时间的关系。(SC＝皮下；其他为静脉内(i.v.))。
图36显示了在多个剂量(静脉内)后示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白的药代动力学。随时间绘制平均浓度。
图37显示了在多个剂量(静脉内)的示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白之后CD4+T细胞上随时间变化的靶饱和度平均值和标准偏差。
图38显示了在施用多个剂量(静脉内)的示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白的受试者中相对于基线的抗KLH IgG平均值和标准偏差与时间的关系。
具体实施方式
本文提供了免疫调节蛋白，它是ICOS配体(ICOSL)或其特异性结合片段的变体或突变体或它包含ICOS配体(ICOSL)或其特异性结合片段的变体或突变体，该变体或突变体显示出与至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构蛋白)结合的活性。在一些实施方案中，与参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽相比，所述变体ICOSL多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代、缺失或添加)位于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(例如IgV)中。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽对至少一种同源结合配偶体(如ICOS、CD28或CTLA-4中的至少一种)显示出改变的例如增加或降低的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是可溶性的。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种其他免疫调节蛋白，其是含有本文提供的变体ICOSL多肽和一种或多种其他部分或多肽的缀合物或融合物。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽和免疫调节蛋白调节免疫应答，如增加或降低免疫应答。在一些实施方案中，本文提供的变体ICOSL多肽和免疫调节蛋白可用于处理与失调的免疫应答相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，所提供的变体ICOSL多肽经由与共刺激信号传导分子的相互作用调节T细胞激活。通常，抗原特异性T-细胞激活需要两种不同的信号。第一信号通过T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上存在的主要组织相容性复合物(MHC)缔合的抗原的相互作用来提供。第二信号是对TCR参与的共刺激并且是避免T细胞凋亡或无反应性所必需的。
在一些实施方案中，在正常生理条件下，T细胞介导的免疫应答由T细胞受体(TCR)的抗原识别引起，并通过共刺激和抑制信号(例如免疫检查点受体)的平衡来调节。免疫系统依靠免疫检查点受体来预防自身免疫(即自身耐受)并在免疫应答期间例如在对病原体感染的攻击期间保护组织免受过度损伤。然而，在一些情况下，这些免疫调节蛋白可在包括肿瘤在内的疾病和病症中失调，这是一种逃避免疫系统的机制。
在一些实施方案中，已知的T细胞共刺激受体包括CD28，它是配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的T细胞共刺激受体，所述两种配体存在于APC上。与对CD28的亲和力相比，这些相同的配体也可以以更大的亲和力与抑制性T细胞受体CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)结合；与CTLA-4的结合起到下调免疫应答的作用。ICOS(诱导型共刺激分子)是另一种T-细胞共刺激受体，它与APC上的ICOS配体(ICOSL)结合。在一些情况下，已知CD28和CTLA-4在某一个结合位点与ICOSL相互作用，所述结合位点同ICOSL与T细胞共刺激受体ICOS的结合重叠(Yao等人(2011)Immunity,34:729-740)。
CD28和ICOS是密切相关的T细胞共刺激分子，并且分别与它们的配体CD80和CD86以及ICOSL的结合诱导细胞信号传导，从而导致在免疫中部分重叠的作用。因此，虽然CD28和ICOS是相关的CD28家族激活受体并且共用一些细胞内信号传导基序，但CD28与ICOS之间的共刺激作用可以在一些方面不同。例如，CD28在未激活和激活的T细胞上均表达，并且其信号传导对于IL-2产生和随后的T细胞效应子功能是重要的，并且CD28参与天然T细胞的激活。CD28途径的治疗性抑制剂(例如阿巴西普、CTLA4-Ig；和贝拉西普，第二代CTLA4-Ig)已被证明可用于治疗一些炎性关节炎病症(例如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎)和预防同种异体肾移植排斥反应(Wekerle等人Transpl.Int.,2012,25:139-50)。然而，主要用阿巴西普研究的CD28途径的治疗性阻断已被证明对其他若干种炎性疾病(例如克罗恩病、狼疮性肾炎、多发性硬化)是不成功的，即使在涉及T细胞参与疾病发病机制的此类疾病适应症中也是不成功的。即使在其批准的适应症内，用CTLA4-Ig化合物治疗也未导致大多数患者的炎症活动完全缓解和/或抑制(Masson,Cochrane Database Sys.Rev.,2014,CD010699；Singh,Cochrane Database Sys.Rev.,2017,CD012657)。这与仍未被这些治疗解决的另外的致病共刺激途径一致。
ICOS通常不在T细胞表面表达直到T细胞激活之后才表达，并且通过激活的T细胞上的ICOS的信号传导支持特化T细胞亚群分化。因此，在一些情况下，CD28和ICOS的共刺激产生重叠和互补作用。因此，ICOS可以是仅靶向CD28的治疗剂未解决的可替代致病途径。
在一些方面，T细胞表达共刺激分子CD28和ICOS，其分别与抗原称帝细胞(APC)上的CD80/CD86和ICOSL相互作用。在淋巴器官中，专职性APC(即树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)表达CD80、CD86和ICOSL，并接合CD28+/ICOS+T细胞。ICOS在初始T细胞中不表达，但在激活后迅速上调。在一些实施方案中，激活的T细胞可以随后分化成效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、分泌IL-17A/F的CD4+Th17细胞或CD4+滤泡辅助(TFH)细胞。表达CD40L的TFH接合淋巴滤泡中的B细胞并释放细胞因子(例如IL-21)，从而诱导B细胞分化为分泌抗体(Ab)的浆细胞。浆细胞可以产生破坏组织的抗体，例如人的类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸化肽抗体(ACPA)以及小鼠中的抗胶原蛋白(CII)抗体，所述抗体可以在关节和其他组织处形成免疫复合物和沉积物。ICOSL也可以在非专职性APC上表达，导致非淋巴组织中的T细胞激活并进一步损害组织和关节。
ICOS显现出在若干种激活的和/或效应T细胞亚群(如在分化型1、2和17以及滤泡辅助(Wikenheiser,Front.Immunol.,2016 7:304)中)的功能中发挥作用。实际上，激活的T细胞通常下调CD28和/或变得不太依赖CD28共刺激，并且CD28阴性T细胞在各种炎性疾病中积累，其与疾病活动相关并且缺乏对阿巴西普的反应性(Garin等人,Eur JHaematol,1996,56:119-23；Schmidt等人,J.Clin.Invest.,1996,97:2027-37；Yang等人,Chin JMicrobiol Immunol,2005,25:248-251；Scarsi等人,J.Rheumatol.,2011,38:2105-11；Mou等人,Am J Transplant,2014,14:2460-6；Zabinska等人,J Immunol Res.,2016,2016:1058165；Piantoni等人,Lupus,2018,27:143-149)。如经由本文提供的分子对CD28和ICOS的组合抑制可以提供针对自身免疫性和/或炎性疾病的改善疗法。
在一些方面，CD4+Th1、Th9和Th17细胞作为对多发性硬化(MS)的关键贡献者通过在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎中增加CNS内的炎症而参与其中，并且CD4+ICOS+CXCR5+T滤泡辅助细胞在复发缓解型中的PBMC中增加并且与继发性进展性MS中的疾病进展相关。在一些实施方案中，在继发性进展性MS中的脑脊液细胞中存在显著增加的ICOS基因表达，并且观察到总单核细胞和表达ICOSL的单核细胞的百分比增加。ICOSL也在非专职性APC上表达，导致非淋巴组织中的T细胞激活和进一步的组织损害。
所提供的变体ICOSL多肽包括如下多肽，当通过参考ICOSL多肽的IgSF结构域的一个或多个氨基酸修饰进行修饰时，展现出对CD28和/或ICOS的增强的结合亲和力。在一些情况下，所提供的变体中的ICOS结合的总体增加小于CD28结合的增加，这是因为与CD28相比，野生型ICOSL已经显示出对ICOS的显著更多的结合亲和力。还提供了所提供的变体多肽的各种形式。例如，在本文中显示了呈可溶性形式的增强的ICOSL蛋白的递送以通过抑制CD28和/或ICOS信号传导来拮抗T细胞激活。
特别地，变体ICOSL多肽以某种形式(例如，作为Fc融合蛋白)提供以拮抗或阻断其同源结合配偶体(例如ICOS和/或CD28)的活性。在一些实施方案中，阻断或抑制经由CD28或ICOS的共刺激信号传导可以用于抑制免疫应答，其可以用于治疗炎性或自身免疫性障碍(例如，多发性硬化或脑炎症)或器官移植。
在一些实施方案中，与其他治疗相比，通过所提供的变体ICOSL多肽和免疫调节多肽实现的免疫信号传导的调节提供了治疗炎性和自身免疫性障碍和其他疾病和病症的优势。在一些情况下，干预和改变两种受体的共刺激作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能不能与参与调节这些相互作用的多种靶蛋白同时相互作用。另外，单独地靶向这两种受体中的一种或另一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中难以适当地维持这种药物组合的所需血液浓度。
在一些实施方案中，所提供的变体ICOSL多肽或免疫调节蛋白调节(例如增加或减少)由共刺激受体CD28或ICOS诱导的免疫活性。因此，在一些实施方案中，所提供的多肽通过以下方式克服了这些限制：提供对CD28和ICOS以及在一些情况下对CTLA-4具有改变的(例如增加的)结合亲和力的变体ICOSL(诱导型共刺激分子配体)，从而激动或拮抗受体共刺激的互补作用。还提供了制备和使用这些变体ICOSL的方法。
在一些方面，所提供的分子也可以比其他可溶性治疗性蛋白质药剂更有效。例如，已显示出阿巴西普(CTLA-4-Fc)干扰T细胞共刺激以减弱自身免疫性疾病环境中的T细胞应答，如用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎和幼年特发性关节炎；以及贝拉西普即变体CTLA-4-Fc分子，其用于移植排斥反应。然而，这些CTLA-4-Fc蛋白与CD80和CD86结合，并且防止这些共刺激配体接合并触发CD28。在一些情况下，本文提供的变体ICOSL多肽展现出对CD28和ICOS二者的结合亲和力和增强的活性。
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本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
除非在特殊情况中另有限制，否则在本说明书中通篇使用的术语定义如下。除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语、缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非另有指示，否则用于化学和生物化学名称的缩写和符号符合IUPAC-IUB命名法。除非另有说明，否则所有数值范围都包括定义所述范围的值以及中间的所有整数值。
如在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”意指具有改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲代或未修饰的IgSF结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，使得与亲代野生型或未经修饰的(即，未亲和力修饰的)IgSF对照结构域相比，所述哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域具有对至少一种其同源结合配偶体(可替代地“反结构”)增加或降低的结合亲和力或亲合力。在该上下文中包括亲和力修饰的ICOSL IgSF结构域。在一些实施方案中，亲和力修饰的IgSF结构域可以含有参考(例如，未修饰的)或野生型IgSF结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多氨基酸差异(如氨基酸取代)。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。Larsen等人,American Journal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见Linsley等人,Immunity,第1卷:793-801(1994)。蛋白质与其一个或多个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加是达到比野生型IgSF结构域对照的结合亲和力或亲合力高至少10％的值，并且在一些实施方案中，比野生型IgSF结构域对照值高至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其同源结合配偶体中的至少一个的结合亲和力或亲合力的降低是不大于对照的90％但不小于野生型IgSF结构域对照值的10％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型IgSF结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于野生型IgSF结构域对照值的10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列。术语“亲和力修饰的IgSF结构域”被认为不会对通过其产生亲和力修饰的IgSF结构域的任何特定起始组合物或方法强加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域并不限于随后通过亲和力修饰的任何特定过程转化为亲和力修饰的IgSF结构域的野生型IgSF结构域。亲和力修饰的IgSF结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物IgSF结构域序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与其同源结合配偶体的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的IgSF结构域组合物。在仅一个可替代例子中，亲和力修饰的IgSF结构域可以通过野生型IgSF结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的IgSF结构域表示产物，而不一定是通过任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
如本文所用的术语“同种异体的”意指从一种生物体取出并随后输注或过继转移至相同物种的遗传上不同的生物体中的细胞或组织。在本发明的一些实施方案中，所述物种是鼠或人。
如本文所用的术语“自体的”意指从生物体中取出并且之后输注或过继转移的同一生物体中的细胞或组织。可以通过例如重组DNA方法改变自体同源的细胞或组织，使得其与从生物体取出的天然细胞或天然组织不再在遗传上相同。例如，天然自体同源T细胞可以通过重组DNA技术进行遗传工程化，以成为表达跨膜免疫调节蛋白和/或嵌合抗原受体(CAR)的自体同源工程化细胞，该自体同源工程化细胞在一些情况下涉及将T细胞或TIL工程化(肿瘤浸润淋巴细胞)。然后将工程化细胞输注到患者中，该患者是从中分离天然T细胞的患者。在一些实施方案中，该生物体是人或鼠。
本文所用的术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别意指蛋白质在特定结合条件下对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力是指单独非共价结合相互作用(如ICOSL与其反结构ICOS和/或CD28之间)的多个亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述单个相互作用的强度。测定了含有亲和力修饰的ICOSL IgSF结构域的变体ICOSL与其反结构的结合亲和力相对于未修饰的ICOSL(如含有天然或野生型IgSF结构域如IgV结构域的未修饰的ICOSL)的结合亲和力的增加或降低。测定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如Larsen等人,AmericanJournal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。在一些实施方案中，本发明的变体ICOSL(即含有亲和力修饰的IgSF结构域的ICOSL蛋白)以一定的结合亲和力特异性地结合至通过流式细胞术测量的CD28和/或ICOS，该结合亲和力在如实施例6中所述的结合测定中产生比野生型ICOSL对照至少大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(MFI)值。
术语“生物半衰期”是指物质(如包含本发明的变体ICOSL的免疫调节多肽)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可受到物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，可以通过测定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。可用于衍生和增加本发明多肽的生物半衰期的缀合物是本领域已知的，并且包括但不限于聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)、聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指在哺乳动物细胞上表达的人工(即人造)跨膜蛋白，其至少含有胞外域、跨膜和胞内结构域。任选地，CAR蛋白包括“间隔区”，其将胞外结构域与跨膜结构域共价连接。间隔子通常是经由肽键将胞外域与跨膜结构域连接的多肽。CAR通常在哺乳动物淋巴细胞上表达。在一些实施方案中，CAR在哺乳动物细胞，如T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达。在T细胞上表达的CAR在本文中称为“CAR T细胞”或“CAR-T”。在一些实施方案中，CAR-T是T辅助细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或γδT细胞。当在临床上用于例如过继细胞转移时，具有对患者肿瘤的抗原结合特异性的CAR-T通常被工程化为在从患者获得的天然T细胞上表达。然后将表达CAR的工程化T细胞输回患者体内。因此，CAR-T通常是自体同源CAR-T，但同种异体CAR-T也包括在本发明的范围内。CAR的胞外域包含抗原结合区，例如抗体或其抗原结合片段(例如scFv)，其在生理条件下特异性地结合至靶抗原(例如肿瘤特异性抗原)。特异性结合后，生物化学系列事件(即，信号转导)导致CAR-T的免疫活性的调节。因此，例如，CAR-T的抗原结合区与其靶抗原的特异性结合可以导致T细胞活性的免疫活性的变化，如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的。在一些实施方案中，通过参与天然哺乳动物T细胞中的信号转导的CD3-ζ链(“CD3-z”)实现CAR-T激活后的信号转导。CAR-T还可包含多个信号传导结构域，如CD28、41BB或OX40，以进一步调节T细胞的免疫调节应答。CD3-z包含称为免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的保守基序，所述保守基序参与T细胞受体信号转导。
当关于在体外测定中由两种或更多种变体ICOSL的存在诱导的细胞因子产生使用时，术语“共同地”或“共同的”意指总体细胞因子表达水平，而与由单个变体ICOSL诱导的细胞因子产生无关。在一些实施方案中，在体外原代T细胞测定中，所测定的细胞因子是IFN-γ。
关于多肽，如关于变体ICOSL的IgSF结构域的术语“同源结合配偶体”(与“反结构”可互换使用)，是指引用的多肽在特异性结合条件下特异性结合的至少一种分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。在一些方面，含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体ICOSL特异性地结合至相应的天然或野生型ICOSL的反结构，但以增加或减弱的亲和力特异性地结合。在特异性地结合条件下识别并特异性地结合其同源受体的配体种类是所述受体的反结构或同源结合配偶体的例子。“同源细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(IS)的配体的同源结合配偶体，其在细胞(如哺乳动物细胞)上且由细胞表达，从而形成免疫突触。
如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而生成的化合物。例如，直接或间接地与一个或多个化学部分或多肽连接的变体ICOSL多肽是示例性缀合物。这种缀合物包括融合蛋白、由化学缀合物产生的那些融合蛋白和通过任何其他方法产生的那些融合蛋白。
如本文所用的术语“竞争性结合”意指，蛋白质能够与至少两个同源结合配偶体特异性结合，但是一个同源结合配偶体的特异性结合抑制(如阻止或妨碍)第二同源结合配偶体的同时结合。因此，在一些情况下，蛋白质不可能同时结合两个同源结合配偶体。通常，竞争性结合物含有用于特异性结合的相同或重叠的结合位点，但该结合位点不是所需的。在一些实施方案中，由于第二同源结合配偶体的特异性结合，竞争性结合引起对蛋白质与其一种同源结合配偶体的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法用于对竞争性结合进行定量，如ELISA(酶联免疫吸附测定)测定。
如本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指如下氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基。具有化学特性相似的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。
关于蛋白质位置的术语“对应于”，如以下叙述：核苷酸或氨基酸位置“对应于”公开序列中的核苷酸或氨基酸位置，如序列表中所述，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(如GAP算法)在与公开序列比对时鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相应的残基可以通过如本文所述的结构比对方法将参考序列与SEQ ID NO:1(ECD结构域)中所示或SEQID NO:2或3(IgV结构域)中所示序列进行比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴别相应残基。
本文所用的术语“降低”或“减弱”或“抑制”意指降低统计上显著的量。减少可以是对照值(如非零对照值)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
如本文在减少哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的上下文中所用的术语“减少”或“降低”意指与对照相比，减少淋巴细胞的一种或多种活性，所述对照如未处理的对照或其中在相同条件下采用了使用未修饰或非变体对照的治疗的对照。减少的活性可以指细胞周期抑制、降低的细胞存活率、降低的细胞增殖、降低的细胞因子产生或降低的T细胞毒性中的一种或多种，如降低统计上显著的量。在一些实施方案中，对降低的免疫活性的提及意指与没有治疗的情况相比，降低干扰素γ(IFN-γ)产生，如降低统计上显著的量。在一些实施方案中，免疫活性可以在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中评估。进行MLR测定的方法是本领域中已知的。Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56。评估淋巴细胞的活性的其他方法是本领域中已知的，包括如本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是与对照值(如未处理的对照值或非零对照值)相比，减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
术语“衍生物”或“衍生化的”是指通过将蛋白质与组合物直接或间接共价连接来修饰蛋白质，以在保持或增强其治疗益处的同时改变生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性、毒性、效力、功效等特征。本发明的免疫调节多肽的衍生物在本发明的范围内，并且可以通过例如糖基化、聚乙二醇化、脂化或Fc-融合来制备。
如本文所用，结构域(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子(如蛋白质或编码核酸)的一部分，所述部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可鉴定的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，所述部分可以在蛋白质内形成由一个或多个结构基序构成的独立折叠结构，和/或借助功能活性(如结合活性)来识别。蛋白质可以具有一个或超过一个独特结构域。例如，结构域可以依据一级序列或结构与相关家族成员的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分。在另一个例子中，结构域可以通过其功能来区分，所述功能如与生物分子(如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性，使得所述结构域可以独立地或与另一分子融合地发挥活性，如例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。此类结构域是已知的，并且可由本领域技术人员来鉴定。对于本文中的示例，提供定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可采用适当软件来鉴别结构域。
如本文所用的术语“胞外结构域”是指膜蛋白(如跨膜蛋白)中位于囊泡膜外的区域。胞外域通常包含特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域，如特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域。细胞跨膜蛋白的胞外域可替代地称为胞外结构域。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗组合物(包括蛋白质组合物或细胞组合物)当单独(即作为单一疗法)或与另外治疗剂组合离体(通过与来自患者的细胞接触)或在体内(通过向患者施用)施用时，对疾病进展(例如通过改善或消除疾病症状和/或病因)产生统计上显著的降低的量和/或浓度。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或影响，防止疾病或障碍进展，或改善患者的身体功能的量。在细胞疗法的情况下，有效量是通过过继细胞疗法向患者施用的有效剂量或细胞数。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，如非人灵长类动物或人患者。
如本文所用术语“胞内结构域”是指在一些膜蛋白(如跨膜蛋白)中发现的延伸至由细胞表面膜界定的内部空间中的区域。在哺乳动物细胞中，胞内结构域是膜蛋白的细胞质区域。在细胞中，胞内结构域与细胞内成分相互作用，并且可以在信号转导中发挥作用，并且因此在一些情况下可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内结构域可替代地称为细胞质结构域，其在一些情况下可以是细胞质信号传导结构域。
如本文在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的上下文中所用的术语“增强”或“增加”意指与对照相比，增加淋巴细胞的一种或多种活性，所述对照如未处理的对照或其中在相同条件下采用了使用未修饰或非变体对照的治疗的对照。增加的活性可以是增加的细胞存活率、细胞增殖、细胞因子产生或T细胞的细胞毒性中的一种或多种，如增加统计上显著的量。在一些实施方案中，提及增加的免疫活性意指增加干扰素γ(IFN-γ)产生，如增加统计上显著的量。在一些实施方案中，免疫活性可以在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中评估。进行MLR测定的方法是本领域中已知的。Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56。评估淋巴细胞的活性的其他方法是本领域中已知的，包括如本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是大于非零对照值至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增加。
如本文所用术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预(如通过重组DNA方法或病毒转导)进行遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)或抗原呈递细胞(例如树突状细胞)。所述细胞可以是来自患者的原代细胞或可以是细胞系。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞包含本文提供的变体ICOSL。在一些实施方案中，所述变体ICOSL是在工程化细胞上表达的跨膜免疫调节蛋白(下文称为“TIP”)。在一些实施方案中，TIP含有胞外结构域或其包含与跨膜结构域(例如，ICOSL跨膜结构域)和任选的细胞内信号传导结构域连接的IgV结构域的一部分。在一些情况下，TIP被格式化为含有异源细胞质信号传导结构域或胞内域的嵌合受体。在一些实施方案中，工程化细胞能表达并分泌如本文所述的免疫调节蛋白。在提供的工程化细胞中，还有进一步含有工程化T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
如本文所用的术语“工程化T细胞”是指T细胞，如T辅助细胞、细胞毒性T细胞(或者，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、自然杀伤T细胞、调节T细胞、记忆T细胞或γδT细胞，所述T细胞已经通过人为干预(如通过重组DNA方法或病毒转导方法)进行遗传修饰。工程化T细胞包含本发明的变体ICOSL跨膜免疫调节蛋白(TIP)或分泌性免疫调节蛋白(SIP)，其在T细胞上表达并且被工程化为调节工程化T细胞自身或哺乳动物细胞的免疫活性，所述哺乳动物细胞与在T细胞上表达的变体ICOSL特异性地结合。工程化T细胞可以包含本发明的变体ICOSL分泌性免疫调节蛋白(SIP)，其由T细胞表达和/或分泌，并被工程化为调节工程化T细胞自身或哺乳动物细胞的免疫活性，所述哺乳动物细胞与由T细胞分泌的变体ICOSL特异性地结合。
术语“工程化T细胞受体”或“工程化TCR”是指被工程化为与被选择、克隆和/或随后引入T细胞群中的主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原以所需的亲和力特异性地结合的T细胞受体(TCR)，其通常用于过继免疫疗法。与工程化TCR相比，CAR被工程化为以非MHC依赖性方式结合靶抗原。
如本文所用的术语“在……上表达”是关于在细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达的蛋白质来使用。因此，蛋白质被表达为膜蛋白。在一些实施方案中，所表达蛋白质是跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质与小分子部分(如药物或可检测标记)缀合。在细胞表面上表达的蛋白质可以包括细胞表面蛋白，如在哺乳动物细胞上表达的细胞表面受体。
术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与所述部分如此缀合的蛋白质的半衰期相比，所述部分延长蛋白质在哺乳动物血清中循环的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与不含半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内施用后，半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所花费的时间长度。半衰期可例如通过使用ELISA测定或活性测定来确定。示例性半衰期延长部分包括Fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO 2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)以及聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
本文所用的术语“免疫突触(immunological synapse)”或“免疫突触(immunesynapse)”意指表达MHC I(主要组织相容性复合物)或MHC II的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应T细胞或自然杀伤(NK)细胞)之间的界面。
免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)区或结构域(也称为Fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责多种功能，包括抗体的一种或多种效应子功能。Fc结构域含有免疫球蛋白分子的部分或全部的铰链结构域以及CH2和CH3结构域。Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，Fc是变体Fc，其展现出降低(例如降低大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非参考特定的SEQ ID NO进行描述，否则提及Fc区中的氨基酸取代是依据EU编号系统。EU编号是已知的，并且按照最新更新的IMGT Scientific Chart(
Figure BDA0003407053080000271
国际ImMunoGeneTics信息系统
Figure BDA0003407053080000272
，http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和如Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of Immunologicalinterest.第5版US Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242(1991)中报告的EU索引。
免疫球蛋白Fc融合物(“Fc-融合物”)，如免疫调节性Fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的Fc区可操作地连接的一种或多种多肽(或一种或多种小分子)的分子。Fc融合物可包含例如抗体的Fc区(其促进效应子功能和药代动力学)和变体ICOSL。免疫球蛋白Fc区可以间接或直接地与一种或多种变体ICOSL或小分子(融合配偶体)连接。各种接头是本领域已知的，并且可任选地用于将Fc与融合配偶体连接以产生Fc融合物。可以将相同种类的Fc融合物二聚化以形成Fc融合同二聚体，或使用不同种类形成Fc融合异二聚体。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，如鼠或人Fc。在一些实施方案中，Fc是无效应子Fc。
术语“宿主细胞”是指可以用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系或缺乏DHFR的CHO菌株DX-B11。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”(缩写为“Ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白蛋白质，包括五种人抗体类别中的任一种：IgA(其包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。所述术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是完全或部分合成(例如，重组或化学合成)还是天然产生的，如抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有在一条链中连接在一起的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区片段，如Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFv双抗体、Fc和Fd多肽片段。双特异性抗体(同双特异性和异双特异性)包括在所述术语的含义内。
如本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面蛋白和可溶蛋白的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，将分子归类为此超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。IgSF的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与将抗原呈递给淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。其一般与免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是所述IgSF的成员。还可以基于共有特性(如功能)将IgSF分类为“亚家族”。此类亚家族通常由4至30个IgSF成员组成。
如本文所用术语“IgSF结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”是指IgSF蛋白的结构性结构域。Ig结构域是根据免疫球蛋白分子来命名。它们含有约70-110个氨基酸并根据它们的大小和功能进行归类。Ig结构域具有特征性Ig折叠，其具有由两条反平行β链形成的夹心样结构。夹心结构内侧上的疏水性氨基酸之间的相互作用以及B链和F链中的半胱氨酸残基之间形成的高保守二硫键稳定Ig折叠。Ig结构域的一个末端具有称为互补决定区的部分，它对抗体对其配体的特异性非常重要。可以将Ig样结构域分类(为多个类别)为：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大多数Ig结构域是可变的(IgV)或恒定的(IgC)。具有9条β链的IgV结构域通常比具有7条β链的IgC结构域更长。一些IgSF成员的Ig结构域的氨基酸序列与IgV结构域相似，而大小与IgC结构域相似。这些Ig结构域称为IgC2结构域，而标准IgC结构域称为IgC1结构域。T细胞受体(TCR)链含有细胞外部分中的两个Ig结构域、N末端的一个IgV结构域和与细胞膜相邻的一个IgC1结构域。ICOSL含有两个Ig结构域：IgV和IgC。
如本文所用术语“IgSF种类”意指具有相同或基本上相同的一级氨基酸序列的IgSF成员蛋白质的系综。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义属于该IgSF成员的所有IgSF种类的唯一身份。因此，每个IgSF家族成员相对于其他IgSF家族成员是唯一的，并且因此特定IgSF家族成员的每个种类相对于另一IgSF家族成员的种类是唯一的。然而，由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)中的差异，属于相同IgSF种类的分子之间可能存在变异。另外，单一IgSF种类内由于基因多态性所致的微小序列差异构成单一IgSF种类内的另一变异形式，由于例如蛋白水解切割所致的IgSF种类的野生型截短形式也是如此。“细胞表面IgSF种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表面上表达的IgSF种类。
本文在哺乳动物淋巴细胞如T细胞的上下文中使用的术语“免疫活性”是指细胞存活率、细胞增殖、细胞因子产生(例如干扰素-γ)或T细胞细胞毒性活性中的一种或多种。在一些情况下，免疫活性可意指它们的细胞因子如趋化因子或白细胞介素的表达。用于确定免疫活性的增强或抑制的测定包括测量培养物上清液中的干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)、SEB(葡萄球菌B型肠毒素)T细胞刺激测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)和抗CD3T细胞刺激测定(Li和Kurlander,J Transl Med.2010:8:104)。由于T细胞激活与IFN-γ细胞因子的分泌有关，因此可以使用商业ELISA试剂盒通过这些体外人T细胞测定来检测培养物上清液中的IFN-γ水平(Wu等人,Immunol Lett2008年4月15日；117(1):57-62)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静止淋巴细胞增加。如本文提供的免疫调节蛋白，如含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体ICOSL多肽在一些实施方案中可以在原代T细胞测定中相对于野生型IgSF成员或IgSF结构域对照增加，或者在替代实施方案中减少IFN-γ(干扰素-γ)表达。本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达增加的原代T细胞测定的形式将不同于用于测定IFN-γ表达减少的形式。在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞测定中减少IFN-γ表达的能力时，可以如实施例6中所述使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。方便地，本发明的可溶形式的亲和力修饰的IgSF结构域可同样如实施例6中所述用于测定其拮抗并因此减少MLR中IFN-γ表达的能力。或者，在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞测定中增加IFN-γ表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗CD3抗体提供的T细胞受体信号与共固定化亲和力修饰的IgSF结构域(如变体ICOSL)组合使用，以测定相对于野生型IgSF结构域对照增加IFN-γ表达的能力。测定工程化细胞的免疫活性的方法，包括评估变体ICOSL跨膜免疫调节蛋白的活性的方法，是本领域已知的，并且该活性包括但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的动物模型中维持抗癌活性的能力。测定还包括评估细胞毒性的测定，包括标准51Cr释放测定(参见例如Milone等人,(2009)Molecular Therapy 17:1453-1464)，或基于流动的细胞毒性测定，或基于阻抗的细胞毒性测定(Peper等人(2014)Journal ofImmunological Methods,405:192-198)。
“免疫调节多肽”或“免疫调节蛋白”是调节免疫活性的多肽或蛋白质分子。“调节(modulation)”或“调节(modulating)”免疫应答意味着增加或降低免疫活性。免疫调节蛋白可以是单一多肽链或通过例如链间二硫键相互共价键合的至少两条多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚和更高级多聚多肽在所定义的术语范围内。多聚多肽可以是同多聚体(具有相同多肽链)或异多聚体(具有不同多肽链)。本发明的免疫调节蛋白包含变体ICOSL。
如本文所用术语“增加”意指增加统计上显著的量。增加可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大。
ICOSL的“同种型”(诱导型共刺激分子配体；CD275)是氨基酸序列不同的多种天然存在的ICOSL多肽之一。同种型可以是由单个基因表达的RNA转录物的剪接变体的产物，或高度相似但不同的基因的表达产物，从而产生功能相似的蛋白质，如可以从基因复制中产生。如本文所用，术语ICOSL的“同种型”还指ICOSL基因的不同等位基因(例如，ICOSLG)的产物。
如本文所用术语“淋巴细胞”意指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任一种。其包括自然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。T细胞包括：T辅助细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或γδT细胞。先天淋巴样细胞(ILC)也包括在淋巴细胞的定义中。
术语“哺乳动物”或“患者”具体包括提及以下中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、犬、猫、小鼠或大鼠。
如本文所用术语“膜蛋白”意指在生理条件下直接或间接附接至脂质双层的蛋白质。形成膜的脂质双层可以是生物膜，例如真核(例如哺乳动物)细胞膜或人工(即人造)膜，例如在脂质体上发现的膜。膜蛋白附接至脂质双层可借助共价附接或借助非共价相互作用(例如疏水或静电相互作用)来实现。膜蛋白可以是膜内在蛋白或外周膜蛋白。是外周膜蛋白的膜蛋白非共价附接至脂质双层或非共价附接至膜内在蛋白。外周膜蛋白与脂质双层形成临时附接，使得在哺乳动物的生理条件范围内，外周膜蛋白可以与脂质双层缔合和/或解离。与外周膜蛋白相比，膜内在蛋白与膜的脂质双层形成基本永久性的附接，使得在哺乳动物的生理条件范围内，膜内在蛋白不从其与脂质双层的附接中解离。膜蛋白可以借助脂质双层中的一层形成与膜的附接(单面)，或者借助膜的两层来附接(多面)。仅与脂质双层中的一层相互作用的膜内在蛋白是“内在单面蛋白”。与两个脂质双层相互作用的膜内在蛋白是“内在多面蛋白”，可替代地在本文中称为“跨膜蛋白”。
本文在免疫应答(如哺乳动物免疫应答)的上下文中使用的术语“调节”(“modulating”或“modulate”)是指由于施用包含本发明的变体ICOSL的免疫调节多肽或由于施用表达免疫调节蛋白(如本发明的变体ICOSL跨膜免疫调节蛋白)的工程化细胞而发生的现有或潜在的免疫应答的任何改变，如增加或减少。因此，它指的是与在不施用包含变体ICOSL的免疫调节蛋白或表达这种免疫调节多肽的细胞的情况下发生或存在的免疫应答相比，免疫应答的改变，如增加或减少。这种调节包括免疫细胞免疫活性的程度或范围的任何诱导、激活、抑制或改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK(自然杀伤)细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞(APC)和非专职抗原呈递细胞，以及炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括对现有免疫应答、发展中的免疫应答、潜在免疫应答或者诱导、调节、影响或响应于免疫应答的能力赋予的任何变化。调节包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫应答的调节或免疫活性的调节包括例如以下内容：免疫细胞的消除、缺失或隔离；可调节其他细胞如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞的功能能力的免疫细胞的诱导或生成；在免疫细胞中诱导无反应状态(即无反应性)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子(如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体)的改变的产生和/或分泌，或者这些调节事件的任何组合。可以例如通过相对于原代T细胞测定中的野生型ICOSL对照的IFN-γ(干扰素γ)表达的改变来评估调节(参见，Zhao和Ji,Exp CellRes.2016Jan1；340(1)132-138)。例如，可以通过工程化细胞的免疫活性的改变来评估调节，如相对于用野生型ICOSL跨膜蛋白工程化的细胞，工程化细胞的细胞毒性活性的改变或工程化细胞的细胞因子分泌的改变。
如本文所用的术语“分子种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的蛋白质的系综。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义相同或基本相同的分子种类的集合。因此，例如，人ICOSL是IgSF成员，并且每个人ICOSL分子是ICOS的分子种类。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同分子种类的分子之间的变异。另外，由于基因多态性导致的单个分子种类内的微小序列差异构成单个分子种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解切割导致的野生型截短形式的单个分子种类。“细胞表面分子种类”是在哺乳动物细胞上表达的分子种类。将两个或更多个不同种类的蛋白质称为彼此呈“顺式”或“顺式构型”，其中每一种类仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个细胞上或仅存在于另一(但不是两个)细胞上。如果两个不同种类的蛋白质中的第一种类仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个细胞上，并且其中的第二种类仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的第二个细胞上，那么将所述种类的蛋白质称为彼此呈“反式”或“反式构型”。如果两个不同种类的蛋白质各自同时存在于形成IS的两个哺乳动物细胞上，那么所述种类的蛋白质在这些细胞上既呈顺式构型也呈反式构型。
术语“多聚化结构域”是指促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，所述多肽分子各自含有互补多聚化结构域(例如，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的多聚化结构域。互补多聚化结构域之间的相互作用(例如，第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用，以产生多肽分子与另外的多肽分子的多聚体。在一些情况下，多聚化结构域是相同的并且与自身相互作用，以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。通常，多肽直接或间接地与多聚化结构域接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，如例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰形式的Fc结构域或其部分。
术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用，是指呈单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，并且所述类似物具有与天然核苷酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指示，否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指示的序列(“参考序列”)。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸或多核苷酸涵盖基因编码的cDNA或mRNA。
如本文所用术语“非竞争性结合”意指蛋白质同时与至少两种同源结合配偶体特异性结合的能力。因此，蛋白质能够同时与至少两种不同的同源结合配偶体结合，但结合相互作用不需要持续相同的持续时间，使得在一些情况下，所述蛋白质仅与所述同源结合配偶体中的一种特异性结合。在一些实施方案中，结合发生在特定结合条件下。在一些实施方案中，同时结合使得一种同源结合配偶体的结合不会显著抑制与第二同源结合配偶体的同时结合。在一些实施方案中，非竞争性结合意指，第二同源结合配偶体与其在所述蛋白质上的结合位点的结合不会代替第一同源结合配偶体与其在所述蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法是本领域中熟知的，如以下文献中所述的方法：Perez de LaLastra等人,Immunology,1999年4月:96(4):663–670。在一些情况下，在非竞争性相互作用中，第一同源结合配偶体在与第二同源结合配偶体的相互作用位点不重叠的相互作用位点处特异性地结合，使得第二同源结合配偶体的结合不直接干扰第一同源结合配偶体的结合。因此，第二同源结合配偶体的结合对同源结合配偶体的结合的任何影响是通过除了直接干扰第一同源结合配偶体的结合以外的机制来实现。例如，在酶-底物相互作用的情况下，非竞争性抑制剂与酶的活性位点以外的位点结合。非竞争性结合涵盖非竞争性结合相互作用，其中第二同源结合配偶体特异性结合于与第一同源结合配偶体的结合不重叠的相互作用位点，但仅在第一相互作用位点被第一同源结合配偶体占据时与第二相互作用位点结合。
术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常为人)中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，包含变体ICOSL的免疫调节多肽或表达变体ICOSL跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。所述术语并非是指特定长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包括于多肽的定义内。所述术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述术语还包括其中包括一个或多个氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸的分子，如可合成或使用已知的蛋白质工程化技术重组表达的。另外，可以对蛋白质进行衍生化。
如本文所用术语“原代T细胞测定”是指用于测量干扰素-γ(“IFN-γ”)表达的体外测定。所使用的测定可以是抗CD3共固定化测定。在此测定中，原代T细胞是通过用或不用其他重组蛋白固定化的抗CD3刺激。在多个时间点(通常是24-72小时)收获培养物上清液。在另一个实施方案中，使用的测定是MLR。在该测定中，用同种异体APC刺激原代T细胞。在多个时间点(通常是24-72小时)收获培养物上清液。通过标准ELISA技术在培养物上清液中测量人类IFN-γ水平。商业试剂盒可从供应商获得，并且所述测定是根据制造商的推荐来进行。
如应用于核酸(如编码本发明的免疫调节蛋白的核酸)的术语“纯化的”通常表示如通过本领域熟知的分析技术所确定基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散谱带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个谱带的核酸或多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或蛋白质是至少约50％纯，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更纯(例如，重量百分比或摩尔百分比)。
术语“重组”表明，材料(例如，核酸或多肽)已通过人为干预发生人工(即非天然)改变。所述改变可以对处于其自然环境或状态内的材料进行，或者对从其自然环境或状态取出的材料进行。例如，“重组核酸”是例如在克隆、亲和力修饰、DNA改组或其他熟知的分子生物学程序期间通过重组核酸来制备的核酸。“重组DNA分子”是由借助此类分子生物学技术接合在一起的DNA区段构成。如本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或通过基因工程化以其他方式改变的细胞，如通过向细胞中引入编码重组蛋白(如本文提供的跨膜免疫调节蛋白)的核酸分子。真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离出启动子和增强子元件，所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于要使用何种细胞类型来表达目的蛋白质。如本文所用的术语“呈可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以如下方式或定向来连接：使得产生能够引导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。
如本文所用的术语“重组表达载体”是指DNA分子，其含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列。在原核生物中表达所需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，所述重组表达载体与重组蛋白(如重组融合蛋白)的编码序列可操作地连接，使得重组宿主细胞可以分泌所表达的融合蛋白，从而在需要时可以更容易地从所述细胞分离融合蛋白。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。所述载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
术语“选择性”是指与对另一种底物(如主题蛋白质的不同同源结合配偶体)的特异性结合相比，主题蛋白质或多肽对一种底物(如一种同源结合配偶体)的特异性结合的偏好。选择性可以反映为主题蛋白质和第一底物如第一同源结合配偶体(例如Kd1)的结合活性(例如结合亲和力)与相同主题蛋白质和第二同源结合配偶体(例如，Kd2)的结合活性(例如结合亲和力)的比。
如本文所用术语“序列同一性”是指基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性量度以及核酸之间在核苷酸水平上的同一性量度。蛋白质序列同一性可以通过在比对序列时比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地，核酸序列同一性可以通过在比对序列时比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。比对序列以供比较的方法为本领域所熟知，所述方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。BLAST算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计分析。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站公开获得。
如本文关于蛋白质使用的术语“可溶性的”意指所述蛋白质不是膜蛋白。一般而言，可溶性蛋白质仅含有IgSF家族成员受体的胞外结构域或其一部分，所述部分含有一个或多个IgSF结构域或其特异性结合片段，但所述可溶性蛋白质不含跨膜结构域和/或不能在细胞表面上表达。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过直接或间接地经由接头与Fc结构域连接或附接来改善，在一些情况下，Fc结构域也可以改善蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶蛋白质是Fc融合蛋白。
如本文关于多肽或核酸使用的术语“种类”意指具有相同或基本相同的序列的分子的系综。属于相同种类的多肽之间的变异可能由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异而发生。在氨基末端或羧基末端与全长种类相差(或编码相差)不超过1、2或3个氨基酸残基的略微截短的多肽序列被认为是单一种类。所述微观不均一性是制造蛋白质的常见特征。
本文所用的关于全长野生型哺乳动物ICOSL多肽或其IgV或IgC结构域的术语“特异性结合片段”意指具有IgV和/或IgC结构域的子序列，并且在体外和/或体内与哺乳动物ICOS和/或哺乳动物CD28(如人或鼠ICOS或CD28)特异性结合的多肽。在一些实施方案中，ICOSL IgV或ICOSL IgC的特异性结合片段为全长野生型序列的序列长度的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可以依次改变特异性结合片段以形成本发明的变体ICOSL。
本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质的如下的能力：在特定结合条件下与靶蛋白结合，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对足够统计学大小的随机肽或多肽的集合的平均亲和力或亲合力的至少5倍，但任选地至少10、20、30、40、50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要仅与单一靶分子结合，但可以由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性而与非靶分子特异性结合。本领域技术人员将认识到，与不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计上有效的独特非靶标(例如，随机多肽)的集合确定的结合特异性。因此，由于交叉反应性，本发明的多肽可以与超过一种不同种类的靶分子特异性结合。可使用固相ELISA免疫测定或Biacore测量来确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于1×10-5M的解离常数(Kd)，并且通常低至1×10-12M。在本公开的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用具有1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M的解离常数。
关于表达多肽的哺乳动物细胞的术语“表面表达”(“surface expresse”、“surface expression”)或“在表面上表达”意指所述多肽表达为膜蛋白。在一些实施方案中，膜蛋白是跨膜蛋白。
如本文所用，关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用的术语“靶向部分”是指共价或非共价附接于或物理上包封包含本发明变体ICOSL的多肽的组合物。在一些实施方案中，靶向部分对靶分子(如在细胞上表达的靶分子)具有特异性结合亲和力。通常，靶分子位于特定组织或细胞类型上。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有连接在一条链中的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区片段，如Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、dsFv双抗体、纳米抗体、可溶性受体、受体配体、亲和力成熟受体或配体以及小分子(<500道尔顿)组合物(例如，特异性结合受体组合物)。靶向部分也可以共价或非共价附接于包封本发明多肽的脂质体的脂质膜。
如本文所用的术语“跨膜蛋白”意指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，所述脂质双层如在生物膜(如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(如脂质体)中发现的那些脂质双层。所述跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”)，所述跨膜蛋白通过所述跨膜结构域整合至脂质双层中，并且所述整合通过所述跨膜结构域在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可通过很多的市售生物信息学软件应用，基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性，从其氨基酸序列来预测。跨膜结构域通常为跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可一次或多次穿过脂质双层的两层。跨膜蛋白包括本文所述的所提供的跨膜免疫调节蛋白。除跨膜结构域外，本发明的跨膜免疫调节蛋白还包含胞外域，并且在一些实施方案中，还包含胞内域。
本文所用的术语“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)意指通过单独施用本发明的治疗组合物(例如含有免疫调节蛋白或工程化细胞)或与本文所述的另一种化合物组合施用来减缓、停止或逆转疾病或病症进展，如通过临床或诊断症状的减少、中止或消除所证明的。“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)还意指急性或慢性疾病或病症中症状的严重性降低，或例如在复发或缓解自身免疫性疾病病程的情况下复发率的降低，或在自身免疫性疾病的炎性方面的情况下炎症的减少。如本文在癌症的背景下所用，术语癌症的“治疗”或“抑制(inhibit、inhibiting或inhibition)”是指以下各项中的至少一种：肿瘤生长速率的统计上显著的降低；肿瘤停止生长；或肿瘤的大小、质量、代谢活动或体积的减少，如通过标准准则(如但不限于实体瘤反应评价标准(RECIST))所测量的；或无进展存活期(PFS)或总存活期(OS)的统计上显著的增加。如在本发明的上下文中使用的疾病或障碍的“预防”(“Preventing”、“prophylaxis”或“prevention”)是指单独施用本发明的免疫调节多肽或工程化细胞或与另一种化合物组合施用，以预防疾病或障碍或者疾病或障碍的部分或全部症状的发生或发作，或者降低疾病或障碍发作的可能性。
如本文所用的术语“肿瘤特有抗原”或“TSA”是指主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上未发现的反结构。肿瘤特有抗原不一定是肿瘤细胞特有的，但是特定哺乳动物中具有肿瘤特有抗原的细胞的百分比足够高或肿瘤表面上肿瘤特有抗原的水平足够高，使得肿瘤特有抗原可以被抗肿瘤治疗剂(如本发明的免疫调节多肽)靶向，并且可以预防或治疗哺乳动物免受肿瘤的影响。在一些实施方案中，在来自具有肿瘤的哺乳动物的细胞的随机统计样品中，展示TSA的细胞中至少50％是癌性的。在其他实施方案中，显示出TSA的细胞的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％是癌性的。
关于变体ICOSL所用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变的”)意指ICOSL，如通过人为干预产生的哺乳动物(例如人或鼠)ICOSL。变体ICOSL是相对于参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL具有改变的氨基酸序列的多肽。变体ICOSL是与参考ICOSL(如野生型ICOSL同种型序列)相差一个或多个修饰(如一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合)的多肽。为了本文的目的，变体ICOSL含有至少一个亲和力修饰的结构域，其中一个或多个氨基酸差异发生在IgSF结构域(例如IgV结构域)中。变体ICOSL可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。变体ICOSL多肽通常展现出与相应参考(例如未修饰的ICOSL)或野生型(如与SEQ ID NO:4的序列、其成熟序列或其一部分，所述部分含有胞外结构域或其IgSF结构域)的至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽展现出与相应参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL(如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或3中所示的参考ICOSL)的至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在可允许的取代或添加的范围内。变体ICOSL不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组DNA技术或其组合。本发明的变体ICOSL与哺乳动物物种的CD28、ICOS和/或CTLA-4特异性地结合。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL蛋白相比，改变的氨基酸序列导致对ICOS和/或CD28的改变(即，增加或降低)的结合亲和力或亲合力。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。Larsen等人,American Journal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见，Linsley等人,Immunity,第1卷(9):793-801(1994)。变体ICOSL对ICOS和/或CD28的结合亲和力或亲合力的增加是比参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL的结合亲和力或亲合力大至少5％的值，并且在一些实施方案中，比参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL对照值的结合亲和力或亲合力大至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％。ICOSL对ICOS和/或CD28的结合亲和力或亲合力的降低是不大于野生型对照值的95％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型ICOS和/或CD28对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或不可检测的结合亲和力或亲合力。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变变体ICOSL的一级氨基酸序列。在变体ICOSL的上下文中的术语“变体”不应解释为对产生变体ICOSL的任何特定起始组合物或方法施加任何条件。例如，变体ICOSL可以如下产生：从参考ICOSL或野生型哺乳动物ICOSL序列信息开始，随后在计算机模拟中针对与ICOS和/或CD28的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生本发明的变体ICOSL。但在一个替代例子中，变体ICOSL可以通过参考(例如未修饰的)或野生型ICOSL的定点诱变产生。因此，变体ICOSL表示组合物，并且不必是由任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
本文所用的关于生物材料(如核酸分子、蛋白质(例如，ICOSL)、IgSF成员、宿主细胞等)使用的术语“野生型”或“天然的”(“natural”或“native”)是指那些生物材料。
此外，如下文所讨论的本发明的各个实施方案通常在如上文所公开的定义术语的含义内提供。因此，当在讨论本文所述的各个方面和属性时使用定义的术语时，以特定定义描述的实施方案将被解释为通过引用并入。因此，标题、各个方面和实施方案的呈现顺序以及每种独立属性的单独公开不意味着限制本公开文本的范围。
II.变体ICOSL多肽融合蛋白
本文提供了含有变体ICOSL多肽和多聚化结构域(如Fc结构域)的融合蛋白。在一些实施方案中，含有变体ICOSL多肽的融合蛋白展现出对一种或多种ICOSL同源结合配偶体的改变的(例如增加的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，ICOSL同源结合配偶体是CD28或ICOS中之一或二者。
A.变体ICOSL多肽
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的ICOSL多肽或野生型或未修饰的ICOSL的含有免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域或其特异性结合片段的一部分，变体ICOSL多肽含有免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(IgD)中的一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个取代(可替代地，“突变”或“替代”)、缺失或添加。因此，提供的变体ICOSL多肽是变体IgD(下文称为“vIgD”)或包含变体IgD，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于IgD中。
在一些实施方案中，IgD包含IgV结构域或IgC(例如，IgC2)结构域或者IgV结构域或IgC(例如，IgC2)结构域的特异性结合片段，或其组合。在一些实施方案中，IgD可以是单独的IgV，IgV和IgC的组合，包括整个胞外结构域(ECD)或ICOSL的Ig结构域的任何组合。表1提供了对应于ICOSL的IgV或IgC区的示例性残基。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段，其中该至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段中。在一些实施方案中，由于改变的结合活性或亲和力，IgV结构域或IgC结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。
本文提供了如下变体ICOSL多肽，所述变体ICOSL多肽含有在参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽中包含的IgSF结构域中的至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(例如，IgV或IgC)或其特异性结合片段，使得变体ICOSL多肽展现出对一种或多种配体ICOS和/或CD28的改变的(例如增加的)结合亲和力或亲合力。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽对CD28和/或ICOS的结合亲和力不同于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽对照序列的结合亲和力，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术或Biacore测定所测定的。在一些实施方案中，相对于参考(未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对CD28和/或ICOS增加的结合亲和力。所述CD28和/或ICOS可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。
对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；即，在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对CD28和/或ICOS中之一或二者增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对CD28和ICOS二者增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对CD28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对ICOS增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，变体ICOSL多肽具有对CD28和ICOS增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽对照，具有增加的或更高的对CD28和/或ICOS的结合亲和力的变体ICOSL多肽将具有对CD28和/或ICOS的结合亲和力的至少约5％，如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽，结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类例子中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽具有与变体ICOSL多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，任何前述实施方案的对CD28和/或ICOS的平衡解离常数(Kd)可以小于1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M或1×10-11M或1x10- 12M。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽对CD28具有增加的或更高的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽对照，具有增加的或更高的对CD28的结合亲和力的变体ICOSL多肽将具有对CD28的结合亲和力的至少约25％如至少约30％、40％、50％或60％增加。在一些实施方案中，具有增加的或更高的对CD28的结合亲和力的变体ICOSL多肽对CD28的平衡解离常数(Kd)小于200pM、300pM、400pM、500pM或600pM。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有对ICOS增加的或更高的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽对照，具有增加的或更大的对ICOS的结合亲和力的变体ICOSL多肽将具有对CD28的结合亲和力的至少约10％，如至少约15％、20％、25％、30％、40％、50％或60％增加。在一些实施方案中，具有增加的或更高的对ICOS的结合亲和力的变体ICOSL多肽具有小于200pM、300pM、400pM、500pM或600pM的对ICOS的平衡解离常数(Kd)。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有在参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列中的一个或多个氨基酸修饰，如取代。所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以位于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列的胞外域(胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或其特异性结合片段中。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在参考ICOSL或其特异性结合片段中具有对应于关于SEQ ID NO:1的编号的位置52、57或100的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自关于SEQ ID NO:1的编号的N52H、N57Y和/或Q100R或其保守氨基酸修饰(例如取代)的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。
保守氨基酸修饰(例如取代)是落入与取代的氨基酸具有相同的氨基酸类别中的除参考(例如，未修饰的)或野生型氨基酸之外的任何氨基酸。氨基酸的类别是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是关于SEQ ID NO:1的编号的N52H/N57Y/Q100R。
除非另外陈述，否则如本公开文本通篇所指示，一个或多个氨基酸修饰是依据对应于SEQ ID NO:1中所示的参考ECD序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名。如通过参考序列(例如SEQ ID NO:2、3、5-33)与SEQ ID NO:1的比对来鉴定ICOSL多肽(包括其含有IgSF结构域(例如IgV)的部分)中修饰(例如，氨基酸取代)的相应位置，这在技术人员的水平内。在本公开文本通篇的修饰列表中，氨基酸位置在中间指示，相应的参考(例如未修饰的野生型)的氨基酸列示于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于编号之后。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示，且相应的参考氨基酸列示于编号之前和之后，并且所鉴别的变体氨基酸插入列示于未修饰的(例如，野生型)氨基酸之后。
在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)ICOSL序列的序列，变体在一个或多个IgSF结构域中进行修饰。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)ICOSL序列是野生型ICOSL。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL具有天然ICOSL或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL是或包含ICOSL的胞外结构域(ECD)或其含有一个或多个IgSF结构域的一部分(参见表1)。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽的胞外结构域包含IgV结构域和一个或多个IgC结构域。然而，变体ICOSL多肽不需要包含IgV结构域和一个或多个IgC结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段，或基本上由IgV结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体ICOSL是可溶的并且缺乏跨膜结构域。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列是哺乳动物ICOSL序列。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列可以是哺乳动物(包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠)ICOSL。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列是人的。
表1中列出了参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列的各种特征。表1的第一栏提供了所述特定IgSF成员的名称，以及任选地一些可能的异名的名称。第二列提供了UniProtKB数据库的蛋白质标识符，UniProtKB数据库是经由互联网在uniprot.org，或者在一些情况下经由GenBank登录号可访问的公共可获得的数据库。Universal ProteinResource(UniProt)是蛋白质序列和注释数据的综合性资源。UniProt数据库包括UniProtKnowledgebase(UniProtKB)。UniProt是欧洲生物信息研究所(EMBL-EBI)、SIB瑞士生物信息研究所和蛋白质信息资源(PIR)之间的合作项目，并且主要由美国国立卫生研究院(NIH)的资助支持。GenBank是NIH基因序列数据库，是所有公共可获得的DNA序列的注释集合(Nucleic Acids Research,2013Jan；41(D1):D36-42)。第三列提供了所示IgSF结构域所在的区域。所述区域被规定为一个范围，其中结构域包含定义该范围的残基。第3列还表明规定的IgSF区的IgSF结构域类别。第4栏提供所指示其他结构域所在的区域(信号肽，S；胞外结构域，E；跨膜结构域，T；细胞质结构域，C)。应当理解，结构域的描述可以根据用于鉴定或分类结构域的方法而变化，并且可以根据不同来源而差异地鉴定。对应于表1中的结构域的残基的描述仅用于举例说明，并且可以是长或短若干个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。第5列示出了它的一些同源细胞表面结合配偶体。
Figure BDA0003407053080000371
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列具有(i)SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列或其缺乏信号序列的成熟形式，(ii)展现出与SEQ ID NO:4或其成熟形式的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，或(iii)是(i)或(ii)的一部分，所述部分含有IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
在一些实施方案中，参考ICOSL序列是或包含ICOSL的胞外结构域或其一部分。在一些实施方案中，参考或野生型ICOSL多肽包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其直系同源物。
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAAT(SEQ ID NO:1)
在一些情况下，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽可以包含(i)SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:1具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)是(i)或(ii)的序列的特异性结合片段，其包含IgV结构域或IgC结构域。
在一些实施方案中，参考ICOSL多肽包含截短的胞外结构域，其含有关于SEQ IDNO:1中所示的参考ICOSL胞外结构域的C末端截短。在一些实施方案中，所述C末端截短是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125个氨基酸残基的截短。在一些实施方案中，所述C末端截短是至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35个氨基酸残基的截短。在一些实施方案中，包含C末端截短的ICOSL多肽在截短点的C末端之外不含有野生型ICOSL的连续氨基酸残基。因此，所提供的ICOSL参考序列包括比野生型ICOSL(例如SEQ ID NO:1中所示)的完整胞外结构域更短的那些。在一些实施方案中，包含C末端截短的ICOSL多肽不含有或不融合至胞外结构域之外的ICOSL结构域的氨基酸残基。
在一些实施方案中，ICOSL参考多肽在一个或多个蛋白酶切割位点中改变，如突变或缺失。如本文中发现的，野生型ICOSL多肽含有蛋白酶切割位点，其在一些情况下导致在细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中表达后的蛋白质切割，从而产生多种种类的异质产物，包括不同长度或大小的种类。例如，ICOSL多肽的切割可以发生在SEQ ID NO:1的残基207与208之间的LQQN/LT蛋白酶切割位点处(“/”指示潜在的切割位点)。在一些实施方案中，所述ICOSL参考多肽在如SEQ ID NO:1的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点中被改变或缺乏所述蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，与野生型或非截短的ICOSL多肽相比，截短的ICOSL多肽对蛋白酶切割更具抗性。在SEQ ID NO:5-11中提供了示例性的截短的ICOSL多肽ECD截短部分，缺乏全部或部分LQQN/LT蛋白酶切割位点(命名为截短#2、#3、#4、#5、#6、#7或#8)。
截短#2：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNL(SEQ ID NO:5)
截短#3：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQ(SEQ IDNO:6)
截短#4：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQN(SEQ ID NO:7)
截短#5：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQ(SEQ ID NO:8)
截短#6：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLL(SEQ ID NO:9)
截短#7：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIEN(SEQ ID NO:10)
截短#8：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLT(SEQ ID NO:11)
在一些实施方案中，ICOSL参考多肽在对应于关于SEQ ID NO:1的氨基酸204-209的一个或多个氨基酸中改变。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在未修饰的ICOSL或其特异性结合片段中具有对应于关于SEQ ID NO:1的编号的位置207和/或208的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自N207A、N207G、L208G或其保守氨基酸修饰(例如取代)的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是N207A/L208G或N207G/L208G。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽的全长参考ECD或截短的参考ECD被修饰为含有选自N207A、N207G、L208G或保守氨基酸修饰的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。具有一个或多个修饰的示例性全长或截短的参考ECD示于SEQ ID NO:12-33中。在关于SEQ ID NO:1中所示位置的切割位点N207和/或L208处含有突变的示例性参考序列示于SEQ ID NO:29-33中。在一些情况下，所提供的修饰可以降低ICOSL多肽的蛋白酶切割，如可能在LQQN/LT蛋白酶切割位点处发生的切割。
在一些实施方案中，可以在参考ICOSL ECD序列中采用上述截短和修饰策略的组合。在一些实施方案中，所提供的修饰(例如取代)是在截短的参考ICOSL多肽(如SEQ IDNO:5-11中所示的示例性参考ICOSL序列)中做出的。在潜在蛋白酶切割位点N207和/或L208处具有修饰的示例性变体ICOSL多肽序列示于SEQ ID NO:12-33中。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽与野生型ICOSL多肽(如含有SEQ ID NO:1中所示的ECD序列)相比展现出减少的蛋白酶切割。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，包含IgV结构域的ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基19-129)或其直系同源物。
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVE(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，含有IgV结构域的参考ICOSL多肽至少含有关于SEQ ID NO:1中所示编号的氨基酸1-112、1-113、1-114、1-115、1-116、1-117、1-118、1-119、1-120、1-121、1-122。在一些实施方案中，包含IgV结构域的ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基19-140)或其直系同源物。在一些实施方案中，IgV结构域是ICOSL参考多肽的仅IgSF结构域。
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSV(SEQ ID NO:3)
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽的IgV结构域可含有(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:2具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的特异性结合片段或(i)或(ii)的序列的特异性结合片段。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)IgV结构域能够结合一种或多种ICOSL同源结合蛋白，如CD28和ICOS中之一或二者。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽的IgV结构域可以含有(i)SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:3具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的特异性结合片段或(i)或(ii)的序列的特异性结合片段。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)IgV结构域能够结合一种或多种ICOSL同源结合蛋白，如CD28和ICOS中之一或二者。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽包含ICOSL的特异性结合片段，如IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述特异性结合片段可以结合CD28和/或ICOS。所述特异性结合片段可以具有至少50个氨基酸的氨基酸长度，如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸。在一些实施方案中，IgV结构域的特异性结合片段含有氨基酸序列，其为SEQ ID NO:4的氨基酸19-129所示的IgV结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含ECD结构域、截短的ECD结构域或其部分，所述部分包含一个或多个亲和力修饰的IgSF结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽可以包含IgV结构域，其中IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段含有所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽可包含IgV结构域和IgC结构域，或IgV结构域的特异性结合片段和IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含全长IgV结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含全长IgV结构域和全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含全长IgV结构域和IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和IgC结构域的特异性结合片段。
在任何此类实施方案中，变体ICOSL多肽的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可位于任何一个或多个ICOSL多肽结构域中。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于变体ICOSL多肽(如SEQ ID NO:1中所示)的胞外结构域(ECD)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段中。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。修饰(例如，取代)可以位于IgV结构域或IgC结构域中。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在IgV结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在IgC结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽与参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽或其特异性结合片段(如与SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列)具有至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在参考ICOSL或其特异性结合片段中具有对应于关于SEQ ID NO:1的编号的位置10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、77、78、75、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽在参考ICOSL或其特异性结合片段中具有对应于关于SEQ ID NO:1的编号的位置10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、Y47H、T43A、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126T、S126R、H129P、S130G,S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140D、C140del、S142F,I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H,W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190S、T190A、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A、N227K或其保守氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20V、S25G、F27S、F27C、N30D、Y33del、Q37R、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52L、N52K、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54P、N57A、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y,R61S、R61C、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94E、H94D、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100R、Q100P、Q100S、Q100T、Q100V、G103E、L102R、V107A、V107I、S109G、S109N、V110D、V110N、V110A、E111del、T113E、H115R、H115Q、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126T、S126R、H129P、S130G,S132F、Q133H、E135K、F138L、T139S、C140D、C140del、S142F、I143V、I143T、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H,W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161P、L161M、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193M、N194D、C198R、N201S、L203P、L203F、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217V、I218T、I218N、E220G、R221G、R221I、I224V、T225A或N227K。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：M10V、M10I、V11E、S13G、E16V、S18R、A20T、A20V、S25G、R26S、F27C、F27S、N30D、Y33del、Q37R、T38P、K42E、T43A、Y47H、N52A、N52C、N52D、N52G、N52H、N52K、N52L、N52M、N52P、N52Q、N52R、N52S、N52T、N52V、N52Y、S54A、S54F、S54P、N57A、N57D、N57E、N57F、N57H、N57K、N57L、N57M、N57P、N57Q、N57S、N57T、N57V、N57W、N57Y、R61C、R61S、Y62F、L67P、A71T、G72R、L74Q、R75Q、D77G、F78L、L80P、N84Q、D89G、E90A、K92R、F93L、H94D、H94E、L96F、L96I、V97A、L98F、S99G、Q100A、Q100D、Q100E、Q100G、Q100K、Q100L、Q100M、Q100N、Q100P、Q100R、Q100S、Q100T、Q100V、L102R、G103E、V107A、V107I、S109G、S109N、V110A、V110D、V110N、E111del、T113E、H115Q、H115R、V116A、A117T、N119Q、F120I、F120S、S121G、V122A、V122M、S126R,S126T、H129P、S130G、S132F、Q133H、E135K、T137A、F138L、T139S、C140del、C140D、S142F、I143T、I143V、N144D、Y146C、V151A、Y152C、Y152H、W153R、I154F、N155H、N155Q、K156M、D158G、L161M、L161P、Q164L、L166Q、N168Q、F172S、L173S、M175T、T190A、T190S、S192G、V193A、V193M、N194D、C198R、N201S、L203F、L203P、N207Q、L208P、V210A、S212G、D217G、D217V、I218N、I218T、E220G、R221G、R221I、R221K、I224V、T225A、T225S、N227K或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/G103E、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/Q100P、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、Q100R、F138L/L203P、N57Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、L203P、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115Q/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q/N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q、N52H/N84Q/N207Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L或N57Q/Q100P。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰选自：N52Y/N57Y/F138L/L203P、N52H/N57Y/Q100P、N52S/Y146C/Y152C、N52H/C198R、N52H/C140D/T225A、N52H/C198R/T225A、N52H/K92R、N52H/S99G、N57Y/Q100P、N52S/S130G/Y152C、N52S/Y152C、N52S/C198R、N52Y/N57Y/Y152C、N52Y/N57Y/H129P/C198R、N52H/L161P/C198R、N52S/T113E、N52D/S54P、N52K/L208P、N52S/Y152H、N52D/V151A、N52H/I143T、N52S/L80P、F120S/Y152H/N201S、N52S/R75Q/L203P、N52S/D158G、N52D/Q133H、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R、N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S、N52S/G103E、N52H/F78L/Q100R、N52H/N57Y/Q100R/V110D、N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D、N52H/N57Y/Q100R、N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D、N52H/Q100R、N52H/S121G、A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G、N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S、N52H/N57Y/Q100R/V122A、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/N57Y、N52S/F120S、N52S/V97A、N52S/G72R、N52S/A71T/A117T、N52S/E220G、Y47H/N52S/V107A/F120S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R、Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R、F27S/N52H/N57Y/V110N、N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q、S18R/N52S/F93L/I143V/R221G、A20T/N52D/Y146C/Q164L、V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T、N52S/H94E/L96I/V122M、N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N、M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F、S25G/N30D/N52S/F120S/N227K、N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R、S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R、N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I、M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R、N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R、N52S/H94E/L98F/Q100R、N52S/E90A、N30D/K42E/N52S、N52S/F120S/I143V/I224V、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G、N52H/N57Y/Q100R/C198R、N52S/N194D、N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R、N52S/S54P、T38P/N52S/N57D、N52H/C140del/T225A、N52H/F78L/Q100R/C198R、N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D、N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G、N52H/S121G/C198R、N52S/F120S/N227K、N52S/A71T/A117T/T190A/C198R、T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S、N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T、N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G、N52Q/N207Q、N168Q/N207Q、N52Q/N168Q、N84Q/N207Q、N155Q/N207Q、N119Q/N168Q、N119Q/N207Q、N119Q/N155Q、N52Q/N84Q、N52Q/N119Q、N84Q/N119Q、N52Q/N84Q/N168Q、N52Q/N84Q/N207Q、N84Q/N155Q/N168Q、N84Q/N168Q/N207Q、N84Q/N155H/N207Q、N155Q/N168Q/N207Q、N119Q N155Q/N168Q、N119Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N207Q、N119Q/N155H/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N119Q/N155Q、N52H/N84Q/N119Q、N52H/N84Q、N52H/N84Q/N168Q/N207Q、N52Q/N84Q/N155Q/N168Q、N52Q/N84Q/N119Q/N168Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q、N84Q/N155Q/N168Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N207Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q、N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q、N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q、F138L/L203P、N52Y/F138L/L203P、N57Y/Q100R/C198R、N57Y/F138L/L203P、Q100R/F138L、N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R、N52H/V122A/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D、N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V、N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S、N52H/N57Y/Q100R/F172S、N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S、N52Y/N57Y/Q100P/F172S、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R、E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R、N52S/E90A/H115R、N30D/K42E N52S/H115R、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I、N30D/K42E/N52S/H115R/C198R、N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D、N52S/H115R/F120S/I143V/C198R、N52S/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100P/H115R、N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R、N52H/Q100R/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S、N52H/Q100R/F172S/C198R、N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R、N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R、N52A/N57F/Q100S、N52A/N57H/Q100S、N52A/N57Y/Q100A、N52D/N57A/Q100A、N52D/Q100S、N52G/Q100A、N52H/Q100A、N52M/N57H/Q100S、N52M/N57W/Q100P、N52Q/N57F、N52Q/N57S/Q100A、N52R/N57L/Q100A、N52R/N57Y/Q100P、N52R/N57Y/Q100S、N52S/N57A/Q100A、N52S/N57H/Q100E、N52S/N57L/Q100S、N52S/N57M/Q100S、N52S/N57Y/Q100S、N52S/N57Y/Q100M、N52S/N57Y/Q100V、N52T/N57H/Q100S、N52T/N57H/Q100A、N52T/N57Y/Q100A、N52V/N57L/Q100A、N52H/N57Y/Q100K、N52K/N57Y/Q100R、N52L/N57H/Q100R、N52R/N57F/Q100N、N52R/N57F/Q100P、N52R/N57F/Q100R、N52R/N57F/Q100T、N52R/N57H/Q100K、N52R/N57L/Q100S、N52R/N57W/Q100K、N52R/N57W、N52R/N57Y/Q100R、N52C/N57E/Q100S、N52G/N57P/Q100D、N52G/N57V/Q100G、N52G/N57V、N52L/N57V、N52P/N57P、N52P/N57S/Q100G、N52S/N57L/Q100G、N52T/N57K/Q100P、N52V/N57T/Q100L、N57Q/Q100P、S54F/V193A或R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是关于SEQ ID NO:1的编号的N52H/N57Y/Q100R。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是关于SEQ ID NO:1的编号的N52L/N57H/Q100R。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是关于SEQ ID NO:1的N52H/Q100R。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是关于SEQ ID NO:1的编号的N52D。
通常，单独公开多肽的多种属性中的每一种(例如，ICOSL对CD28和/或ICOS的亲和力、每条多肽链的变异数量、连接的多肽链的数量、每个变体ICOSL中氨基酸改变的数量和性质等)。然而，如本领域技术人员所清楚的，任何特定多肽可包含这些独立属性的组合。应理解，提及氨基酸，包括提及用于描述IgSF结构域的结构域组织的如SEQ ID NO所示的具体序列，是出于说明性目的，并不欲限制所提供实施方案的范围。应理解，多肽和对其结构域的描述在理论上是基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。因此，确切基因座可变，并且每一种蛋白质不一定相同。因此，特定IgSF结构域，如特定IgV结构域或IgC结构域，可以更长或更短，相差几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。
参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL序列不一定必须用作起始组合物以产生本文所述的变体ICOSL多肽。因此，术语“修饰”，如“取代”的使用并不意味着所提供的实施方案限于制备变体ICOSL多肽的特定方法。变体ICOSL多肽可例如通过从头肽合成来制备，因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上，不一定需要修饰，例如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体ICOSL多肽的方法不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL编码核酸是从参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL遗传物质诱变而来并针对所需的特异性结合亲和力和/或IFN-γ表达的调节或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体ICOSL多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述，UniProtKB数据库也是如此。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含表2中列出的突变。表2还提供了野生型ICOSL(即参考(例如，未修饰的))或示例性变体ICOSL多肽的胞外结构域(ECD)或IgV结构域的参考SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如IgV)的相邻N-和/或C-末端氨基酸也可以包括在变体IgSF多肽的序列中，如以确保表达时结构域的适当折叠。因此，应理解，表2中的SEQ ID NO的示例不应被视为具有限制性。例如，变体ICOSL多肽的特定结构域如ECD结构域可以比相应的SEQ ID NO所示的氨基酸序列长或短若干个氨基酸，如长或短1-10个氨基酸，如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
Figure BDA0003407053080000471
变体ICOSL多肽可以含有本文所述的任何氨基酸取代(突变)。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含表2中列出的任何突变。在一些例子中，突变是在含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的参考ICOSL、含有SEQ ID NO:2或3中所示的ICOSL的IgV结构域的参考ICOSL、或被截短和/或修饰的含有SEQ ID NO:5-33中任一个所示的氨基酸序列的参考ICOSL中做出的。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:34中所示的胞外结构域(ECD)序列。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含如下多肽序列，所述多肽序列展现出与SEQID NO:34中所示的胞外结构域(ECD)序列的至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，并且含有一个或多个氨基酸修饰，例如参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代，例如N52H/N57Y/Q100R。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:34中所示的胞外结构域(ECD)序列的特异性结合片段并且含有一个或多个氨基酸修饰，例如参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代，例如N52H/N57Y/Q100R。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:35中所示的IgV序列。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含如下多肽序列，所述多肽序列展现出与SEQ ID NO:35中所示的IgV序列的至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，并且含有一个或多个氨基酸修饰，例如参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代，例如N52H/N57Y/Q100R。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:35中所示的IgV序列的特异性结合片段并且含有参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代(例如N52H/N57Y/Q100R)。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:36中所示的IgV序列。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含如下多肽序列，所述多肽序列展现出与SEQ ID NO:36中所示的IgV序列的至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，并且含有一个或多个氨基酸修饰，例如参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代，例如N52H/N57Y/Q100R。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽包含SEQ ID NO:36中所示的IgV序列的特异性结合片段并且含有参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL中不存在的一个或多个取代(例如N52H/N57Y/Q100R)。
在一些实施方案中，与参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽相比，如与包含SEQ ID NO:1、2或3中所示序列的参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽相比，变体ICOSL多肽展现出对CD28的胞外域增加的亲和力。在一些实施方案中，与参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL相比，如与包含SEQ ID NO:1、2或3中所示序列的参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽相比，ICOSL多肽展现出对ICOS的胞外域增加的亲和力。在一些实施方案中，与参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL相比，如与包含SEQ ID NO:1、2或3中所示序列的参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL多肽相比，ICOSL多肽展现出对CD28的胞外域以及对ICOS的胞外域增加的亲和力。
B.多聚化结构域
包含本文提供的其中含有vIgD的变体ICOSL多肽的变体ICOSL多肽融合蛋白可以以多种方式被格式化为可溶性蛋白质。在一些实施方案中，变体ICOSL融合蛋白含有多聚化结构域。在一些情况下，变体ICOSL融合蛋白可以拮抗或阻断其同源结合配偶体(例如CD28和/或ICOSL)的活性。在一些实施方案中，CD28和/或ICOSL的拮抗作用可以用于治疗炎症或自身免疫。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和胞外结构域(ECD)，并且可以使用胞外结构域或其免疫活性子序列制备可溶形式的此类蛋白质。因此，在一些实施方案中，含有变体ICOSL多肽的免疫调节蛋白缺乏跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体ICOSL的免疫调节蛋白缺乏细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体ICOSL多肽的免疫调节蛋白仅含有vIgD部分，所述vIgD部分含有ECD结构域或其部分，该部分含有一个或多个IgV结构域和/或IgC(例如IgC2)结构域或其特异性结合片段，该特异性结合片段含有一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，缀合物是与另一蛋白质或多肽部分直接或经由接头连接的变体ICOSL多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是ICOSL-Fc变体融合物，其中任意两种或更多种前述变体多肽可以附接至Fc。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽具有如图1所示的可溶性蛋白质的结构。
在一些实施方案中，包含变体ICOSL的融合蛋白可以包含本发明的一种或多种变体ICOSL多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽将恰好包含1、2、3、4、5个变体ICOSL序列。在一些实施方案中，变体ICOSL序列中的至少两个是相同的变体ICOSL序列。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节多肽包含两个或更多个ICOSL的vIgD序列。多肽链内的多个变体ICOSL多肽可以是彼此相同(即，相同的种类)，或者彼此不同(即，不同的种类)的变体ICOSL序列。除了单一多肽链实施方案之外，在一些实施方案中，本发明的两个、三个、四个或更多个多肽可以彼此共价或非共价连接。因此，本文提供单体、二聚和更高级(例如，3、4、5个或更多个)多聚蛋白。例如，在一些实施方案中，本发明的两个多肽恰好可以彼此共价或非共价附接以形成二聚体。在一些实施方案中，经由链间半胱氨酸二硫键进行附接。包含两个或更多个本发明多肽的组合物可以属于相同多肽种类或基本上相同的多肽种类(例如，同二聚体)，或者属于不同多肽种类(例如，异二聚体)。如上所述，具有多个本发明的连接多肽的组合物在每条多肽链中具有本发明的一个或多个相同或不同的变体ICOSL多肽。
在一些实施方案中，含有变体ICOSL的免疫调节蛋白是多价的，如二价的。在一些方面，免疫调节蛋白与多聚化结构域直接或经由接头间接连接。在一些方面，多聚化结构域增加分子的半衰期。
两种或更多种变体ICOSL多肽的相互作用可以通过将其与任何部分或其他多肽直接或间接连接来促进，所述部分或其他多肽本身能够相互作用以形成稳定结构。例如，单独编码的变体ICOSL多肽链可以通过多聚化来接合，借此多肽的多聚化由多聚化结构域来介导。通常，所述多聚化结构域提供第一变体ICOSL多肽与第二变体ICOSL多肽之间的稳定蛋白质-蛋白质相互作用的形成。同多聚和异多聚多肽可以从单独变体ICOSL多肽的共表达来生成。第一和第二变体ICOSL多肽可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚化结构域可以通过以下来相互作用：免疫球蛋白序列(例如Fc结构域；参见例如，国际专利公开号WO 93/10151和WO 2005/063816US；美国公开号2006/0024298；美国专利号5,457,035)；亮氨酸拉链(例如，来自核转化蛋白fos和jun，或原癌基因c-myc，或来自一般氮控制(General Control of Nitrogen，GCN4))(参见例如，Busch和Sassone-Corsi(1990)Trends Genetics,6:36-40；Gentz等人,(1989)Science,243:1695-1699)；疏水区；亲水区；或者在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇。此外，多聚化结构域可以包含含有突起的氨基酸序列，其与含有孔的氨基酸序列互补，如以下文献中所述：例如，美国专利号5,731,168；国际专利公开号WO 98/50431和WO 2005/063816；Ridgway等人(1996)Protein Engineering,9:617-621。这种多聚化区域可以被工程化使得空间相互作用不仅促进稳定相互作用，而且还促进从嵌合单体的混合物形成异二聚体超过同二聚体。通常，突起是通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。任选地通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生突出部的相同或类似大小的补偿空腔。示例性多聚化结构域描述于下文中。
变体ICOSL多肽可以在任何位置(但通常经由其N末端或C末端)与多聚化结构域的N末端或C末端接合以形成嵌合多肽。连接可以是直接的或间接经由接头。同样，嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成，如通过共价或非共价相互作用来形成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码变体ICOSL多肽的全部或部分的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中变体ICOSL多肽的C末端与多聚化结构域的N末端接合。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中变体ICOSL多肽的N末端与多聚化结构域的N末端或C末端接合。
多肽多聚体含有通过将两个相同或不同的变体ICOSL多肽直接或间接连接至多聚化结构域产生的两个嵌合蛋白。在一些例子中，在多聚化结构域是多肽的情况下，将编码变体ICOSL多肽和多聚化结构域的基因融合物插入适当的表达载体中。所得嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许组装为多聚体，其中多聚化结构域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与变体ICOSL多肽的化学连接可以使用异双功能接头来实现。
所得嵌合多肽(如融合蛋白)和由其形成的多聚体可以通过任何合适的方法来纯化，如例如通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化至细胞中的情况下，将发生同二聚体和异二聚体的形成。可以调整表达条件，使得相对于同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含附接至免疫球蛋白的Fc区的变体ICOSL多肽(得到“免疫调节Fc融合物”，如“ICOSL-Fc变体融合物”，也称为ICOSL vIgD-Fc融合物)。在一些实施方案中，ICOSL-Fc变体融合物还包含一个或多个另外的IgSF结构域，如与ICOSL的vIgD连接的一个或多个另外的vIgD。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽或另外的IgSF结构域的附接位于Fc的N末端。在一些实施方案中，变体ICOSL或另外的IgSF结构域多肽的附接在Fc的C末端。在一些实施方案中，两个或更多个ICOSL或另外的IgSF结构域变体多肽(相同或不同)独立地附接在N末端和C末端。
在一些实施方案中，Fc是鼠或人Fc。在一些实施方案中，所述Fc是哺乳动物或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fc源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:37至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区含有一个或多个修饰以改变(例如减少)其正常功能中的一种或多种。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外，Fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，Fc区中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在一些实施方案中，可以在Fc中降低或改变此类功能以与提供的Fc融合蛋白一起使用。
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供ICOSL-Fc变体融合物的Fc区，从而产生Fc区变体。在一些实施方案中，Fc区变体具有降低的效应子功能。有许多可改变效应子功能的Fc序列的变化或突变的例子。例如，WO 2000/42072、WO 2006/019447、WO 2012/125850、WO 2015/107026、US 2016/0017041以及Shields等人JBiol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述了具有改善或减弱的与FcR的结合的示例性Fc变体。这些出版物的内容通过引用特别地并入本文。
在一些实施方案中，所提供的变体ICOSL-Fc融合物包含展现出降低的效应子功能的Fc区(也称为惰性Fc或无效应子Fc)，这使其成为一些应用的理想候选物，在该应用中体内ICOSL-Fc变体融合物的半衰期是重要的但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以ICOSL-Fc变体融合物缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康辛州))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型)评估目标分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实ICOSL-Fc变体融合物不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的ICOSL-Fc变体融合物包括具有依据EU编号的Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的一个或多个取代的那些ICOSL-Fc变体融合物(美国专利号6,737,056)此类Fc突变体包括依据EU编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在一些实施方案中，ICOSL-Fc变体融合物的Fc区具有这样的Fc区，其中位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329处(通过EU编号指示)的任何一个或多个氨基酸被不同于天然Fc区的氨基酸取代。Fc区的此类改变并不限于上述改变，并且包括例如：改变，如Current Opinion in Biotechnology(2009)20(6),685-691中所述的去糖基化链(N297A和N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A和IgG4-L236E；改变，如WO 2008/092117中所述的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R和N325LL328R；在位置233、234、235和237(通过EU编号指示)处的氨基酸插入；以及在WO 2000/042072中所述位点处的改变。
描述了具有改善的或减小的与FcR的结合的某些Fc变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312、WO 2006/019447以及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，提供了包含变体Fc区的ICOSL-Fc变体融合物，所述变体Fc区包含增加半衰期和/或改善与新生Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与FcRn的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)或WO2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述一个或多个取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在依据EU编号的以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
在一些实施方案中，ICOSL-Fc变体融合物的Fc区包含依据EU编号的一个或多个氨基酸取代E356D和M358L。在一些实施方案中，ICOSL-Fc变体融合物的Fc区包含依据EU编号的一个或多个氨基酸取代C220S、C226S和/或C229S。在一些实施方案中，ICOSL变体融合物的Fc区包含一个或多个氨基酸取代R292C和V302C。关于Fc区变体的其他例子的还参见Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
在一些实施方案中，野生型IgG1Fc可以是SEQ ID NO:37中所示的Fc，其具有依据EU编号在位置356和358含有残基Glu(E)和Met(M)的同种异型(例如，f同种异型)。在其他实施方案中，野生型IgG1Fc含有人G1m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358含有Asp(D)和Leu(L)的残基，例如，如SEQ ID NO:38中所示。因此，在一些情况下，本文提供的Fc可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1m1(例如，α同种异型)的残基。在一些方面，通过一个或多个氨基酸取代修饰野生型Fc以降低效应子活性或使Fc对于Fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。本文提供的构建体的Fc中可以包括的无效应子突变包括依据EU编号的L234A、L235E和G237A。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，如通过依据EU编号在位置220将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)来进一步修饰野生型Fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性Fc区显示于SEQ IDNO:39或40和SEQ ID NO:41或42中，它们分别基于SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38中所示的同种异型。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致减小的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如以下文献中所述：美国专利号6,194,551、WO 99/51642；以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一些实施方案中，提供了ICOSL-Fc变体融合物，其包含含有一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区，其中所述变体Fc区源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，变体Fc区源自SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc展现出降低的效应子功能。在一些实施方案中，Fc含有依据SEQ ID NO:37编号的至少一个氨基酸取代，即N82G(对应于依据EU编号的N297G)。在一些实施方案中，所述Fc还含有依据SEQ ID NO:37的编号的至少一个氨基酸取代，即R77C或V87C(对应于依据EU编号的R292C或V302C)。在一些实施方案中，变体Fc区还包含依据SEQ ID NO:37编号的C5S氨基酸修饰(对应于依据EU编号的C220S)。例如，在一些实施方案中，所述变体Fc区包含依据EU编号的以下氨基酸修饰：V297G和以下氨基酸修饰C220S、R292C或V302C中的一个或多个(对应于依据SEQ ID NO:37的N82G和以下氨基酸修饰C5S、R77C或V87C中的一个或多个)，例如，Fc区包含SEQ ID NO:43中所示序列。在一些实施方案中，所述变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E或G237A中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:40中所示序列。在一些实施方案中，所述变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、E233P、L234V、L235A、G236del或S267K中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ IDNO:44中所示序列。在一些实施方案中，所述变体Fc包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E、G237A、E356D或M358L中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:41中所示序列。
在一些实施方案中，所述Fc区缺少对应于SEQ ID NO:45中所示的参考(例如，未修饰的)或野生型Fc的位置232的C末端赖氨酸(对应于依据EU编号的K447del)。在一些实施方案中，因为在生物合成期间C末端赖氨酸可能被不同地去除，所以当蛋白质在细胞中表达时C末端赖氨酸残基的去除导致更均质的产物。在一些方面，这种Fc区可以另外包括一个或多个另外的修饰，例如，氨基酸取代，例如所述的任一种。这种Fc区的例子示于SEQ ID NO:46、39、47或42中。
在一些实施方案中，提供了一种包含变体Fc区的ICOSL-Fc变体融合物，其中变体Fc包含SEQ ID NO:41、43、40、44、48、46、39、47或42中任一个中所示的氨基酸序列，或者展现出与SEQ ID NO:41、43、40、44、48、46、39、47或42中任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc展现出降低的效应子功能。
在一些实施方案中，Fc源自IgG2，如人IgG2。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:49中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:49的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ IDNO:50的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG4Fc是稳定的Fc，其中人IgG4的CH3结构域被人IgG1的CH3结构域取代并且显示出抑制的聚集体形成；抗体，其中人IgG4的CH3和CH2结构域分别被人IgG1的CH3和CH2结构域取代；或抗体，其中由Kabat等人提出的EU指数表示的人IgG4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代并且显示出抑制的聚集体形成(参见例如美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，Fc是含有S228P突变的IgG4，其已经显示通过Fab-臂交换防止治疗性抗体与内源性IgG4之间的重组(参见例如，Labrijin等人(2009)Nat.Biotechnol.,27(8)767-71)。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO:51至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变体ICOSL多肽与Fc序列直接连接。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽与Fc序列间接连接，如经由接头。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接变体ICOSL多肽和Fc结构域。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头为三个丙氨酸(AAA)。在一些实施方案中，接头为(以单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”；SEQ IDNO:52)或4GS接头的多聚体，例如2、3、4、5或6个4GS接头的重复，例如SEQ ID NO:53(2xGGGGS)或SEQ ID NO:54(3xGGGGS)中所述。在一些实施方案中，接头是刚性接头。例如，接头是α螺旋接头。在一些实施方案中，所述接头是(按单字母氨基酸代码)：EAAAK或EAAAK接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复，如SEQ ID NO:55(EAAAK)、或SEQ ID NO:56(3xEAAAK)或SEQ ID NO:57(5xEAAAK)中所示。在一些实施方案中，所述接头以一个或多个EAAAK单元开始并且可以通过添加A、AA、AAA、AAAA、EAAAA和EAAAK序列来延长。在一些实施方案中，所述接头还可以包括通过克隆引入和/或来自限制位点的氨基酸，例如接头可以包括如通过使用限制位点BAMHI引入的氨基酸GS(按单字母氨基酸代码)。在一些实施方案中，所述接头(以单字母氨基酸代码)是GSGGGGS(SEQ ID NO:58)。在一些例子中，所述接头是2xGGGGS，之后是三个丙氨酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO:59)。
在一些实施方案中，变体ICOSL-Fc融合蛋白是由与Fc结构域连接的两个变体ICOSL Fc多肽形成的二聚体。在一些具体的实施方案中，ICOSL-Fc变体融合多肽的相同或基本相同的种类(允许3个或更少的N-末端或C-末端氨基酸序列差异)将会被二聚化以产生同型二聚体。在一些实施方案中，二聚体是同型二聚体，其中该两个变体ICOSL Fc多肽相同。可替代地，可以将不同种类的ICOSL-Fc变体融合多肽二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，二聚体是异二聚体，其中该两个变体ICOSL Fc多肽不同。
在一些实施方案中，提供了含有变体ICOSL多肽的变体ICOSL-Fc融合蛋白，所述变体ICOSL多肽在如本文所述的与Fc区直接或间接连接的参考ICOSL中包含一个或多个氨基酸修饰。在一些情况下，变体ICOSL多肽的C末端与Fc区的N末端连接。在一些实施方案中，ICOSL-Fc融合物的变体ICOSL在SEQ ID NO:3中所示的参考IgV结构域的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸修饰。在特定情况下，这种免疫调节蛋白包含含有IgV结构域的变体ICOSL多肽，所述IgV结构域如SEQ ID NO:35中所示的IgV结构域，或与SEQ ID NO:35具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％且含有相应SEQ ID NO的一个或多个氨基酸修饰(例如N52H/N57Y/Q100R)的IgV结构域。在特定情况下，这种免疫调节蛋白包含含有IgV结构域的变体ICOSL多肽，所述IgV结构域如SEQ ID NO:36中所示的IgV结构域，或与SEQ ID NO:36具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％且含有相应SEQ ID NO的一个或多个氨基酸修饰(例如N52H/N57Y/Q100R)的IgV结构域。在一些实施方案中，变体ICOSL多肽含有氨基酸修饰N52H/N57Y/Q100R(例如，是或包含SEQ ID NO:36中所示的IgV结构域)。
在此类变体ICOSL-Fc融合蛋白的特定实施方案中，Fc多肽是人IgG1Fc区的变体，其展现出降低的效应子功能，例如任何所述的。在一些实施方案中，Fc区是含有氨基酸修饰N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的人IgG1，其中残基根据Kabat的EU索引编号。在一些实施方案中，所述变体IgG1Fc区还含有氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。在一些实施方案中，所述Fc区含有K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。在一些方面，Fc区含有SEQ ID NO:41、43、40、44、39或42中任一个中所示的氨基酸序列的序列或展现出与SEQ ID NO:41、43、40、44、39或42中任一个的至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性且含有相应SEQ ID NO的氨基酸取代的氨基酸序列。变体ICOSL IgSF(例如IgV)多肽与Fc之间的连接可以经由肽接头，如任何所述的。在一些实施方案中，接头是GGGGS(“4GS”；SEQ ID NO:52)、SEQ ID NO:53(2xGGGGS)或SEQ ID NO:54(3xGGGGS)。在特定例子中，变体ICOSL多肽的C末端与Fc区的N末端连接，使得组分的顺序是变体ICOSL-接头-Fc。
在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:52中所示的接头和SEQ ID NO:42中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:52中所示的接头和SEQ ID NO:41中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSLIgV结构域、SEQ ID NO:52中所示的接头和SEQ ID NO:40中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:52中所示的接头和SEQ ID NO:39中所示的Fc多肽。
在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:53中所示的接头和SEQ ID NO:42中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:53中所示的接头和SEQ ID NO:41中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSLIgV结构域、SEQ ID NO:53中所示的接头和SEQ ID NO:40中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:53中所示的接头和SEQ ID NO:39中所示的Fc多肽。
在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:54中所示的接头和SEQ ID NO:42中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:54中所示的接头和SEQ ID NO:41中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSLIgV结构域、SEQ ID NO:54中所示的接头和SEQ ID NO:40中所示的Fc多肽。在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL-Fc融合蛋白，例如变体ICOSL-接头-Fc，其含有SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV结构域、SEQ ID NO:54中所示的接头和SEQ ID NO:39中所示的Fc多肽。
在一些实施方案中，提供了一种变体ICOSL IgSF Fc融合蛋白，其具有SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:60的至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体ICOSL IgSF Fc融合蛋白与CD28和ICOS结合，如与参考(野生型)ICOSL-Fc融合蛋白相比以增加的结合亲和力结合。在一些实施方案中，与具有野生型人IgG1的Fc的融合物相比，变体ICOSL IgSF Fc融合物展现出降低的Fc效应子功能。
III.用于产生所述多肽或细胞的核酸、载体和方法
本文提供了分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的变体ICOSL多肽或免疫调节融合多肽的各种提供的实施方案中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于重组生产(例如表达)本文提供的变体ICOSL多肽或免疫调节融合多肽。本文提供的核酸可呈RNA形式或呈DNA形式，并且包括mRNA、cRNA、重组或合成RNA和DNA，以及cDNA。本文提供的核酸通常是DNA分子，并且通常是双链DNA分子。然而，还提供包含本发明的任何核苷酸序列的单链DNA、单链RNA、双链RNA和杂合DNA/RNA核酸或其组合。
本文还提供了重组表达载体和重组宿主细胞，其可用于产生本文提供的变体ICOSL多肽或免疫调节融合多肽。
在任何上述提供的实施方案中，可以使用重组DNA和克隆技术将编码本文提供的变体多肽或免疫调节融合多肽的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域中熟知的。例如，可以使用合适的限制性酶从DNA切除肽的编码序列。可替代地，可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成DNA分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来生成重组或合成核酸。在一些实施方案中，可以根据所提供的描述产生编码含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域的一种或多种变体ICOSL多肽的DNA插入物。如本领域技术人员已知的，可将此DNA插入物克隆至适当的转导/转染载体中。还提供含有核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体能在适当细胞中在适于表达蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白。在一些方面中，核酸分子或表达载体包含与适当表达控制序列可操作连接的编码免疫调节蛋白的DNA分子。在将DNA分子插入载体中之前或之后实现这种操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制，以控制或调节表达。所述启动子与核酸分子中编码变体多肽或免疫调节蛋白的部分可操作地连接。在一些实施方案中，诱导型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接，使得通过控制合适的转录诱导物的存在或不存在来控制核酸的表达。例如，启动子可以是经调节启动子和转录因子表达系统，例如已公开的四环素调节系统或其他可调节系统(参见例如已公开国际PCT申请案第WO 01/30843号)，以容许所编码多肽的调节表达。示例性可调节启动子系统是例如可从Clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得的Tet-On(和Tet-Off)系统。此启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的经调节表达。其他可调节启动子系统是已知的(参见例如，已公开的美国申请号2002-0168714，标题为“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain,Monomeric,Ligand Dependent Polypeptide Switches”，其描述含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些)的基因开关)。
使用其上具有DNA分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码分泌或信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质回收所得的可溶性免疫调节多肽。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
在一些实施方案中，使用其上具有DNA分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可以使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，所述表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
大量公众可获得且熟知的哺乳动物宿主细胞中的任何一种均可用于制备所述多肽。细胞的选择取决于本领域中公认的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须深入理解，并非所有细胞都可以同等有效地用于特定DNA序列的表达。
在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是多种真核细胞，如酵母细胞，或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是悬浮细胞，并且多肽是在培养悬浮液中，如在培养的悬浮CHO细胞(例如，CHO-S细胞)中进行工程化或产生。在一些例子中，所述细胞系是缺乏DHFR(DHFR-)CHO细胞系，如DG44和DUXB11。在一些实施方案中，所述细胞缺乏谷氨酰胺合酶(GS)，例如，CHO-S细胞、CHOK1SV细胞和CHOZN((R))GS-/-细胞。在一些实施方案中，所述CHO细胞(如悬浮CHO细胞)可以是CHO-S-2H2细胞、CHO-S-克隆14细胞或ExpiCHO-S细胞。
在一些实施方案中，从CHO细胞表达所提供的ICOSL多肽导致产生的蛋白质的更均质组合物。在一些实施方案中，当从CHO细胞表达蛋白质时，与含有完整ECD参考序列和/或含有蛋白酶切割位点(例如，LQQN/LT)的ICOSL多肽相比，所提供的ICOSL多肽产生更均质的产物。在一些实施方案中，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的含有本文产生的ICOSL变体多肽的所产生的蛋白质的组合物具有相同的氨基酸长度或大小相同。评估大小均质性的技术包括高效液相色谱(HPLC)、尺寸排阻色谱、SDS page或测序。
在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。将转化的重组宿主在多肽表达条件下培养，然后将其纯化以获得可溶蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需多肽。此类发酵条件是本领域熟知的。最后，可以通过本领域公知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收和纯化本文提供的多肽，该方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。在完成成熟蛋白质的构型时，可以视需要使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最终纯化步骤中采用高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方案中，所述重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(缺陷性)、有复制能力的病毒载体，和/或被修饰以表达异源基因产物，例如，本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的减毒，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
可以使用的示例性病毒载体包括修饰的痘苗病毒载体(参见例如，Guerra等人,J.Virol.80:985-98(2006)；Tartaglia等人,AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47(1992)；Gheradi等人,J.Gen.Virol.86:2925-36(2005)；Mayr等人,Infection 3:6-14(1975)；Hu等人,J.Virol.75:10300-308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体腺病毒相关病毒载体(参见例如，Molin等人,J.Virol.72:8358-61(1998)；Narumi等人,Am J.Respir.Cell Mol.Biol.19:936-41(1998)；Mercier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:6188-93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的那些以及组合(参见例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-39(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-40(1992)；Sommerfelt等人,Virology 176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-78(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-24(1991)；Miller等人,Mol.Cell Biol.10:4239(1990)；Kolberg,NIHRes.4:43 1992；Cornetta等人,Hum.Gene Ther.2:215(1991))；慢病毒载体，包括基于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)以及梅迪―维斯纳病毒的那些(参见例如，Pfeifer等人,Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2:177-211(2001)；Zufferey等人,J.Virol.72:9873,1998；Miyoshi等人,J.Virol.72:8150,1998；Philpott和Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007；Engelman等人,J.Virol.69:2729,1995；Nightingale等人,Mol.Therapy,13:1121,2006；Brown等人,J.Virol.73:9011(1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams等人,J.Virol.77:11150,2003；Powell等人,J.Virol.70:5288,1996)，或其任何变体和/或可用于产生上述任何病毒的载体。在一些实施方案中，重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，该调节序列可以调节病毒基因组(如在RNA病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如美国专利号5,385,839和5,168,062)。
在一些实施方案中，本文提供的多肽还可以通过合成方法来制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，公知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持体的使用以及特定的保护和去保护反应条件、接头裂解条件、清除剂的使用以及固相肽合成的其他方面。然后可以将肽组装成如本文所提供的多肽。
IV.评估变体ICOSL多肽和免疫调节蛋白的活性免疫调节的方法
在一些实施方案中，本文提供的变体ICOSL多肽(例如全长和/或其特异性结合片段或免疫调节融合物)展现出调节T细胞激活的免疫调节活性。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL对照，ICOSL多肽在原代T细胞测定中调节IFN-γ表达。在一些情况下，相对于对照，对IFN-γ表达的调节可以增加或减少IFN-γ表达。用于确定特异性结合和IFN-γ表达的测定是本领域熟知的并且包括测量培养物上清液中的干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)、SEB(葡萄球菌B型肠毒素)T细胞刺激测定(Wang等人,CancerImmunol Res.2014年9月:2(9):846-56)和抗CD3T细胞刺激测定(Li和Kurlander,JTranslMed.2010:8:104)。
在一些实施方案中，相对于野生型ICOSL对照，变体ICOSL多肽在一些实施方案中可以增加或在替代实施方案中降低原代T细胞测定中的IFN-γ(干扰素-γ)表达。在所提供的含有可溶性变体ICOSL序列的多肽的一些实施方案中，该多肽可以在原代T细胞测定中相对于野生型ICOSL对照增加IFN-γ表达，并且在替代实施方案中降低IFN-γ表达。在所提供的含有多个变体ICOSL序列的多肽的一些实施方案中，该多肽可以在原代T细胞测定中相对于野生型ICOSL对照增加IFN-γ表达，并且在替代实施方案中降低IFN-γ表达。
本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达增加的原代T细胞测定的形式可不同于用于测定IFN-γ表达减少的形式。在原代T细胞测定中，在测定变体ICOSL减少IFN-γ表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。在一些情况下，可以使用可溶性形式的变体ICOSL来确定变体ICOSL拮抗并因此降低MLR中IFN-γ表达的能力。可替代地，在原代T细胞测定中，在测定变体ICOSL增加IFN-γ表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗CD3抗体提供的TCR信号与共固定化变体ICOSL组合使用，以测定相对于ICOSL对照增加IFN-γ表达的能力。
在一些实施方案中，在测定变体ICOSL调节、增加或减少IFN-γ表达的能力时，可以使用T细胞报告物测定。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat T细胞系，或者源自Jurkat T细胞系。在报告物测定中，也产生报告细胞系(例如，Jurkat报告细胞)以过表达变体IgSF结构域多肽的同源结合配偶体。在一些实施方案中，所述报告T细胞还含有报告构建体，其含有与报告物可操作连接的响应于T细胞激活的诱导型启动子。在一些实施方案中，所述报告物是荧光或发光报告物。在一些实施方案中，所述报告物是萤光素酶。在一些实施方案中，所述启动子响应于CD3信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是NFAT启动子。在一些实施方案中，所述启动子响应于共刺激信号传导，例如，CD28共刺激信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是IL-2启动子。
在报告物测定的方面中，例如通过与表达抑制性受体的野生型配体(例如ICOSL)的抗原呈递细胞(APC)共孵育来刺激报告细胞系。在一些实施方案中，所述APC是人工APC。人工APC是技术人员熟知的。在一些实施方案中，人工APC源自一种或多种哺乳动物细胞系，如K562、CHO或293细胞。
在一些实施方案中，将Jurkat报告细胞与过表达配体的人工APC在存在变体IgSF结构域分子或免疫调节蛋白(例如，变体ICOSL多肽或免疫调节蛋白)的情况下共孵育。在一些实施方案中，例如通过测定细胞的发光或荧光，监测报告物表达。在一些实施方案中，例如与对照(例如，通过其中不存在受体与配体相互作用的对照T细胞与APC(例如不会过表达ICOSL的APC)的共孵育实现的报告物表达)相比，其受体与配体之间的正常相互作用导致报告信号的阻遏或减少。在一些实施方案中，例如当以可溶性形式作为变体ICOSL-Fc提供时，本文提供的变体ICOSL多肽或免疫调节蛋白拮抗相互作用，导致与不存在变体ICOSL多肽或免疫调节蛋白的情况相比，报告信号增加。
合适的对照的使用是本领域技术人员已知的，然而，在前述实施方案中，对照通常涉及使用参考ICOSL，如来自相同哺乳动物物种的野生型天然ICOSL同种型(由其衍生或形成变体ICOSL)。不管对ICOS和CD28中的一种或两种的结合亲和力是增加还是减少，在一些实施方案中，变体ICOSL将在原代T细胞测定中相对于野生型ICOSL对照增加IFN-γ表达，并且在替代实施方案中减少IFN-γ表达。
在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的)或野生型ICOSL对照，变体ICOSL使IFN-γ表达(即蛋白质表达)增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其他实施方案中，相对于野生型或未修饰的ICOSL对照，变体ICOSL使IFN-γ表达(即蛋白质表达)减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，野生型ICOSL对照是鼠ICOSL，如通常针对变体ICOSL来使用，该变体ICOSL的序列与野生型鼠ICOSL序列的序列相比有所改变。在一些实施方案中，野生型ICOSL对照是人ICOSL，如通常针对变体ICOSL来使用，该变体ICOSL的序列与野生型人ICOSL序列的序列(如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的ICOSL序列)相比有所改变。
V.药物配制品
本文提供了含有任何变体ICOSL多肽的组合物，如本文所述的免疫调节融合蛋白。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如，所述药物组合物可以含有一种或多种赋形剂，用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解，含有细胞的药物组合物可以与含有蛋白质的药物组合物不同。
在一些实施方案中，所述药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，所述药物组合物的组分可以是冻干的。在一些实施方案中，在施用之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。
在一些实施方案中，药物组合物是液体，例如溶解在水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的变体ICOSL多肽。在一些实施方案中，药物组合物的pH在约4.0与约8.5之间(如在约4.0与约5.0之间、在约4.5与约5.5之间、在约5.0与约6.0之间、在约5.5与约6.5之间、在约6.0与约7.0之间、在约6.5与约7.5之间、在约7.0与约8.0之间或在约7.5与约8.5之间)。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于产物的受控释放或持续释放的药剂，如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体。
在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤或辐射来完成。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中，例如，静脉内输液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
这种配制品可以例如呈适于静脉内输注的形式。药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒剂，其参与将所关注细胞从身体的一个组织、器官或部分携带或运送至身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的一些组合。载剂的每一组分必须是“药学上可接受的”，因为其必须与配制品中的其他成分相容。它还必须适于与它可能遇到的身体的任何组织、器官或部分接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、变态反应、免疫原性或过多超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。
在一些实施方案中，药物组合物被配制成含有如下量的变体ICOSL多肽，例如变体ICOSL IgSF-Fc：从为或约1mg至为或约100mg，如从为或约1mg至为或约75mg、从为或约1mg至为或约50mg、从为或约1mg至为或约25mg、从为或约1mg至为或约10mg、从为或约1mg至为或约5mg、从为或约5mg至为或约100mg、从为或约5mg至为或约75mg、从为或约5mg至为或约50mg、从为或约5mg至为或约25mg、从为或约5mg至为或约10mg、从为或约10mg至为或约100mg、从为或约10mg至为或约75mg、从为或约10mg至为或约50mg、从为或约10mg至为或约25mg、从为或约25mg至为或约100mg、从为或约25mg至为或约75mg、从为或约25mg至为或约50mg、从为或约50mg至为或约100mg、从为或约50mg至为或约75mg或从为或约75mg至为或约100mg。在一些实施方案中，药物组合物被配制成含有如下量的变体ICOSL多肽，例如变体ICOSL IgSF-Fc：为或约10mg、为或约25mg、为或约50mg、为或约75mg或为或约100mg。
在一些实施方案中，药物组合物被配制在如下体积中：从为或约0.5mL至为或约10mL，如从为或约0.5mL至为或约5mL、从为或约0.5mL至为或约2mL、从为或约0.5mL至为或约1mL、从为或约1mL至为或约10mL、从为或约1mL至为或约5mL或从为或约5mL至为或约10mL。在一些实施方案中，药物组合物被配制在如下体积中：为或约0.5mL、为或约1mL、为或约2mL、为或约2.5mL、为或约3mL、为或约4mL、为或约5mL、为或约6mL、为或约7mL、为或约8mL、为或约9mL或为或约10mL。在一些实施方案中，组合物的浓度为从为或约1mg/mL至为或约50mg/mL，如从为或约1mg/mL至为或约25mg/mL、从为或约1mg/mL至为或约15mg/mL、从为或约1mg mL至为或约5mg/mL、从为或约5mg/mL至为或约50mg/mL、从为或约5mg/mL至为或约25mg/mL、从为或约5mg/mL至为或约15mg/mL、从为或约15mg/mL至为或约50mg/mL、从为或约15mg/mL至为或约25mg/mL或从为或约25mg/mL至为或约50mg/mL。在一些实施方案中，组合物的浓度是为或约1mg/mL、为或约5mg/mL、为或约10mg/mL、为或约15mg/mL、为或约20mg/mL、为或约25mg/mL、为或约30mg/mL、为或约40mg/mL或为或约50mg/mL。本文提供了包含在容器(如小瓶)中的任何此类组合物。在特定方面，容器(如小瓶)是无菌的。
在一些实施方案中，将药物组合物施用至受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。这种信息随后可用于确定在人中的有用剂量和施用途径。确切剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。
长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周施用一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单一剂量的方式施用，或随时间以多个剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用，或以连续输注的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。可以监测治疗效果的多种生物标记或生理学标记，包括T细胞激活或增殖、细胞因子合成或产生(例如，TNF-α、IFN-γ、IL-2的产生)、多种激活标记(例如，CD25、IL-2受体)的诱导、炎症、关节肿胀或压痛、C反应蛋白的血清水平、抗胶原蛋白抗体产生和/或一种或多种T细胞依赖性抗体应答。
在一些实施方案中，通过任何途径向受试者施用所述药物组合物，包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接应用于伤口部位、应用于外科手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。在一些实施方案中，将药物组合物玻璃体内施用至受试者。
在一些实施方案中，所述药物组合物的剂量是单一剂量或重复剂量。在一些实施方案中，向受试者施用所述剂量为每天一次、每天两次、每天三次或者每天四次或更多次。在一些实施方案中，在一周内施用约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多个剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
在一些实施方案中，所施用的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约0.3mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约1mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约3mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约6mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约10mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约15mg蛋白质/kg受试者体重。在一些实施方案中，药物组合物的施用剂量为或为约20mg蛋白质/kg受试者体重。
已知多种手段用于确定施用本发明的治疗组合物通过如下方式是否充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效应的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗响应于信号的增殖或分裂(如用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3H-胸苷掺入的T细胞增殖测定和肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记物(例如蛋白质印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分析；DNA转录、使用DNA阵列或消减杂交的分析)；通过细胞凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，Northern印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结局，如自身免疫性疾病、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病的改善(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如，在多发性硬化的情况下通过测量复发率或者疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床评分)，在I型糖尿病的情况下测量血糖，或在类风湿性关节炎的情况下测量关节炎症。
VI.制品和试剂盒
本文还提供了制品，其包含在合适的包装中的本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)。制品的合适的包装包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料以及在所述一个或多个容器和/或包装上或与所述容器和/或包装相连的标签或包装插页，通常包括将组合物施用至受试者的说明书。用于包装本文所述组合物的合适的容器是本领域中已知的，并且包括例如小瓶(如密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
制品还可以包括具有一条或多条识别信息和/或使用说明书的包装插页或标签。在一些实施方案中，所述信息或说明表明内容物可以或应当用于治疗特定病症或疾病，和/或为此提供说明书。标签或包装插页可以表明，制品的内容物要用于治疗疾病或病症。在一些实施方案中，标签或包装插页提供例如根据所提供方法的任何实施方案治疗受试者的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定向受试者施用一个或多个单位剂量。
还提供试剂盒，其包含本文所述的药物组合物(或制品)，所述试剂盒还可以包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的用途)的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可以包括商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。
VII.治疗性应用
本文提供了所提供的韩由本文所述的变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的分子以及含有所述分子的药物组合物的使用方法和用途。此类方法和用途包括调节免疫应答的方法，其包括与治疗受试者(如人患者)的疾病或病症结合。本文的使用方法和用途中的此类分子包括如下免疫调节融合蛋白形式，其中含有亲和力修饰的IgSF结构域(例如IgV)的ICOSL变体多肽的胞外结构域或其部分与多聚化结构域(例如，Fc结构域或Fc区)直接或间接连接。在一些实施方案中，这种治疗剂是变体ICOSL-Fc融合蛋白，如变体ICOSL IgV-Fv融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物用于在哺乳动物中治疗炎性或自身免疫性障碍或其使用与器官移植有关。
在一些方面，药物组合物可以调节(例如减少)免疫应答以治疗疾病。已知多种手段用于确定施用本发明的治疗组合物是否通过减少或降低免疫细胞的活性；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些作用的组合来充分调节免疫活性。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或对所述增殖或分裂的抗性(如在用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3H-胸苷并入的T细胞增殖测定和肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀伤或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记(例如，酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离的蛋白质印迹和免疫沉淀分析；蛋白质阵列分析；使用DNA阵列或消减杂交的DNA转录剖析)；测量通过细胞凋亡、坏死或其他机制发生的细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度化的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，Northern印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结局，例如，通过测量复发率或疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床得分)。
所提供的方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其涉及将所述分子或含有所述分子的组合物施用至需要治疗的患有疾病、病症或障碍的受试者。在一些实施方案中，所提供的方法还包括预防性处理，涉及在疾病、病症或障碍发作或可能发作之前向受试者施用所述分子或含有所述分子的组合物。本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)可以用于如所述的多种治疗性或预防性处理应用，包括治疗自身免疫性或炎性疾病或障碍的应用。在一些实施方案中，以实现所述疾病或障碍的治疗的有效量施用所述分子。用途包括含有变体ICOSL多肽(如免疫调节融合蛋白)的分子在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗性方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有疾病或病症的受试者施用变体ICOSL多肽(如免疫调节融合蛋白)或包含其的组合物来实施所述方法。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的所述疾病或病症或障碍。
在一些实施方案中，所提供的方法适用于治疗性施用变体ICOSL多肽，如本文所述的免疫调节融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物阻抑免疫应答，其可用于治疗炎性或自身免疫性障碍或器官移植。在一些实施方案中，药物组合物含有某种形式的变体ICOSL多肽，其显示出其同源结合配偶体CD28或ICOS的拮抗剂活性和/或经由CD28或ICOS阻断或抑制共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用有关的用途的ICOSL多肽的示例性形式包括例如可溶性变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL-Fc融合蛋白)。
所提供的方法和用途包括治疗涉及CD28和/或ICOS途径的疾病或病症。在一些实施方案中，所提供的方法和用途包括治疗涉及CD28和ICOS途径的疾病或病症。CD28和ICOS在与其各自的配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)以及ICOSL结合时提供对于最佳T细胞激活所需的共刺激信号。CD28参与某些炎性疾病(如移植物抗宿主病(GVHD))的致病过程。在一些方面，通过使用CD28途径抑制剂靶向CD28可以提供针对此类疾病和病症的治疗效用，包括用于预防和/或治疗。然而，在一些情况下，单独的CD28途径抑制可能不足以控制许多患者中的既定疾病。在这种情境下，认识到在初始激活后，CD28通常被下调，而其最密切相关的家族成员ICOS被上调，提供了另外的T细胞共刺激，这可能维持疾病，如GVHD，包括胃肠道临床表现(Adom等人Blood 2018；132-355)。所提供的实施方案是基于与展现出仅单独阻断CD28或ICOS途径的药剂相比，变体ICOSL分子(例如变体ICOSL vIgD-Fc融合蛋白)展现出对CD28和ICOS的组合阻断的优越效用。如本文所述，提供了如下变体ICOSL分子(例如变体ICOSL vIgD-Fc融合蛋白)，其在各种炎症动物模型(如小鼠中的GVHD人异种模型等等)中展现出与CD28和ICOS的高亲和力结合、有效的T细胞激活以及对疾病活动的抑制。在此类例子中，在仅单一剂量的变体ICOSL分子之后即可看到此类效果。
A.疾病或病症
在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗炎性或自身免疫性障碍，如本文所述任一种。在一些实施方案中，治疗是在或大约在所述障碍的症状发作时施用。在一些实施方案中，治疗是在相对于所述疾病发作和/或症状发作延迟的时间施用。应当理解，治疗施用的延迟也可以是相对于移植，例如本文所述的移植。在一些实施方案中，延迟的量是、是约或是至少自疾病和/或症状发作起1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更长时间。在一些实施方案中，延迟的量是自疾病和/或症状发作起2周。在一些实施方案中，延迟的量是、是约或是至少自疾病和/或症状发作起3个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在一些实施方案中，在例如如本文所述的任何时间延迟后施用的治疗是根据本文所述的任何治疗方案、给药量或给药计划施用的。
1.炎性或自身免疫性障碍
在一些实施方案中，所提供的方法包括对可能或怀疑患上炎性或自身免疫性障碍(如本文所述的任一种)的受试者进行预防性处理。例如，某些自身免疫性或炎性疾病(如急性GVHD)的发展与造血细胞移植相关或可能在造血细胞移植后发展。在一些情况下，如本文所述的预防性处理最小化或降低受试者患上炎性或自身免疫性障碍的风险。
在一些实施方案中，该炎性或自身免疫性病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。
在一些实施方案中，可通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍是艾迪生(Addison’s)病、过敏、斑秃、阿尔茨海默症、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(休斯(Hughes)综合征)、哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞病、伯杰病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、口炎性腹泻/乳糜泻、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘、多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性神经病(格林-巴利(Guillain-Barré)综合征)、查格-施特劳斯(Churg-Strauss)综合征(CSS)、瘢痕性类天疱疮、冷凝激素病(CAD)、COPD(慢性阻塞性肺病)、CREST综合征、克罗恩病、皮炎、疱疹、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文综合征、眼球突出、纤维肌痛、古德帕斯丘(Goodpasture)综合征、格雷夫斯(Graves’)病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫增殖性疾病或障碍、炎性肠病(IBD)、间质性肺病、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎(JIA)、川崎病、莱伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎、梅尼埃(Ménière)病、米勒鱼(Miller Fish)综合征/急性播散性脑脊髓神经病变、混合性结缔组织病、多发性硬化(MS)、肌肉风湿病、肌痛性脑脊髓炎(ME)、重症肌无力、眼部炎症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(惠特克(Whitaker)综合征)、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自身免疫性胆管病、银屑病、银屑病关节炎、雷诺(Raynaud’s)现象、赖特(Reiter’s)综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、结节病、施密特(Schmidt’s)综合征、硬皮病、舍格伦
Figure BDA0003407053080000631
综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬皮病、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、间质性肠病或韦格纳肉芽肿病(Wegener’sGranulomatosis)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍选自间质性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎和银屑病。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病或病症是结缔组织病。结缔组织病包括具有结缔组织的共同广泛免疫学和炎性改变。常见发现包括关节炎或滑膜炎、胸膜炎、心肌炎、心内膜炎、心包炎、腹膜炎、血管炎、肌炎、皮炎、肾炎以及结缔组织的改变。结缔组织病几乎涉及任何器官系统。特别地，所提供的方法包括用于治疗涉及由于免疫调节模式改变而导致的皮肤、关节和软组织炎症的结缔组织病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化、舍格伦综合征、皮肌炎和混合性结缔组织病)的方法。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是继发于感染的障碍。在一些实施方案中，感染是病毒性感染。在一些实施方案中，感染是细菌性感染。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是响应于药物或疗法的治疗而发生的障碍。在一些实施方案中，治疗是免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是被工程化以表达嵌合抗原受体的自体T细胞的过继细胞转移，例如CAR-T细胞疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是用检查点抑制剂的治疗。继发于感染(例如，病毒性感染)或药物治疗或疗法的炎性或自身免疫性障碍的例子包括但不限于细胞因子风暴、细胞因子释放综合征、全身性炎性反应综合征、巨噬细胞激活综合征(MAS)和噬血细胞淋巴组织细胞增生症(例如，继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症)。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是细胞因子风暴。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是细胞因子释放综合征(CRS)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是全身性炎性反应综合征。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是巨噬细胞激活综合征(MAS)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是噬血细胞淋巴组织细胞增生症。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症。在一些实施方案中，细胞因子释放综合征、全身性炎性反应综合征、巨噬细胞激活综合征(MAS)和噬血细胞淋巴组织细胞增生症(例如，继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症)是细胞因子风暴的子集。
与细胞因子风暴(例如，细胞因子释放综合征(CRS))相关的示例性结局包括发热、寒颤、恶寒、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫样活动、意识模糊、找词困难、失语和/或变得迟钝。其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，细胞因子风暴(例如，CRS)与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、氨基转移酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。与细胞因子风暴(例如CRS)相关的其他示例性体征或症状包括血流动力学不稳定、发热性嗜中性粒细胞减少症、血清C反应蛋白(CRP)增加、凝血参数(例如，国际标准化比值(INR)、凝血酶原时间(PTI)和/或纤维蛋白原)的变化、心脏和其他器官功能和/或绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)的变化。
在一些实施方案中，与细胞因子风暴(例如，CRS)相关的结局包括以下一种或多种：持续发热例如指定温度的发热(例如大于或大于约38摄氏度)两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；与至少两种细胞因子(例如，下组中的至少两种，该组由以下各项组成：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比细胞因子升高，如最大倍数变化例如至少或至少约75倍，或至少一种这样的细胞因子的最大倍数变化例如至少或至少约250倍；和/或至少一种毒性临床体征如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压器测量的)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病症(包括精神状态改变、迟钝和癫痫)。
示例性细胞因子风暴相关的(例如CRS相关的)结局包括一种或多种因子的增加的或高血清水平，所述一种或多种因子包括细胞因子和趋化因子以及与细胞因子风暴相关的其他因子。示例性结局进一步包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以通过T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)。
在一些实施方案中，细胞因子风暴相关的(例如，CRS)血清因子或有关结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子，所述炎性细胞因子和/或趋化因子包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，测量具有高水平CRP(如≥15mg/dL)的受试者患有细胞因子风暴，例如CRS。在一些实施方案中，测量为具有高水平CRP的受试者不患有细胞因子风暴，例如CRS。在一些实施方案中，细胞因子风暴的量度包括CRP和指示细胞因子风暴(例如CRS)的其他因素的量度。
在一些实施方案中，监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子以评估细胞因子风暴。在一些方面，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是CRS。在一些实施方案中，炎症与CRS相关。已经研发CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有风险患上CRS。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子血清水平，如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、曲动蛋白和GM-CSF)。在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表A中详述的那些。
Figure BDA0003407053080000651
在一些实施方案中，CRS是严重CRS或3级或更高级CRS。在一些实施方案中，与严重CRS或3级或更高级(如4级或更高级)CRS相关的结局包括以下一种或多种：持续发热例如指定温度的发热(例如大于或大于约38摄氏度)两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；与至少两种细胞因子(例如，下组中的至少两种，该组由以下各项组成：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的基线水平相比细胞因子升高，如最大倍数变化例如至少或至少约75倍，或至少一种这样的细胞因子的最大倍数变化例如至少或至少约250倍；和/或至少一种毒性临床体征如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压器测量的)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病症(包括精神状态改变、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，严重CRS或3级CRS涵盖丙氨酸氨基转移酶的增加、天冬氨酸氨基转移酶的增加、恶寒、发热型嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能障碍、脑病、脑积水和/或震颤。
在一些实施方案中，细胞因子风暴(例如CRS)响应于感染或继发于感染而发生。在一些实施方案中，所述感染是病毒性感染或细菌性感染。在一些实施方案中，病毒性感染是冠状病毒性感染。在一些实施方案中，病毒性感染是SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，病毒性感染是SARS-CoV感染。在一些实施方案中，病毒性感染是MERS-CoV感染。
在一些实施方案中，细胞因子风暴发生于或继发于感染、病症或疾病。例如，细胞因子风暴(例如CRS)可能在感染、病症或疾病期间发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴(例如，CRS)在2019冠状病毒中发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在肺炎中发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在休克中发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在败血症中发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在多器官系统功能障碍中发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中发生。
在一些实施方案中，细胞因子风暴响应于用药物或疗法的治疗而发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴响应于用免疫疗法的治疗而发生。例如，在一些情况下，细胞因子风暴在被工程化以表达嵌合抗原受体的自体T细胞的过继细胞转移(例如CAR-T细胞疗法)后发生。在一些实施方案中，细胞因子风暴在用检查点抑制剂治疗后发生。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗细胞因子风暴。在一些实施方案中，待治疗的细胞因子风暴继发于SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，SARS-CoV-2的感染通过阳性RT-PCR测试来确认。在一些实施方案中，待治疗的SARS-CoV-2阳性受试者还展现出严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、败血性休克或归因于SARS-CoV-2感染的多器官系统功能障碍。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是慢性自身免疫性疾病。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是舍格伦综合征(pSS)或系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，IBD是慢性IBD。在一些例子中，炎性或自身免疫性障碍是克罗恩病。在一些实例中，炎性或自身免疫性障碍是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是IBD相关疾病或障碍，例如间质性肺病(ILD)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是银屑病关节炎或类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，施用所述药物组合物以调节自身免疫性病症。例如，抑制免疫应答在用于抑制接受者对供体的组织、细胞或器官移植的排斥的方法中是有益的。因此，在一些实施方案中，本文所述的药物组合物用于限制或预防移植物相关或移植相关的疾病或病症，如移植物抗宿主病(GvHD)。在一些实施方案中，药物组合物用于抑制移植(transplant或graft)的骨髓、器官、皮肤、肌肉、神经元、胰岛或实质细胞的自身免疫排斥。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍与涎腺炎有关。在一些情况下，涎腺炎是由病毒或细菌引起的唾液腺感染。在一些实施方案中，腮腺或下颌下腺受涎腺炎累影响。在一些实施方案中，涎腺炎与受影响区域的疼痛、压痛、发红和逐渐局部肿胀(sqelling)有关。
在一些实施方案中，炎性或免疫障碍与胰岛炎有关。在一些实施方案中，胰岛炎涉及胰腺中胰岛或Langerhans的炎症。在一些实施方案中，含有胰腺β细胞的胰岛被B和T淋巴细胞、巨噬细胞或树突状细胞浸润。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗银屑病关节炎(PsA)。在一些情况下，PsA影响一个或多个关节，如手指、脚趾、手臂或腿，包括肘部、手腕、手和脚或骶髂关节。在一些情况下，PsA是轻度的和/或影响四个或更少关节。在一些情况下，PsA是中度的和/或影响四个或更多关节。在一些情况下，患有PsA的受试者可能在脊柱或颈部中或一个或多个关节中展现出疼痛、僵硬或炎症。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗类风湿性关节炎(RA)。在一些情况下，RA影响身体的关节、关节内衬(lining)和/或非关节结构(例如，皮肤、眼睛、肺、心脏、肾脏、唾液腺、神经组织、骨髓或血管)。在一些实施方案中，RA或RA症状是慢性的。
在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是慢性障碍。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性障碍是急性障碍。
在一些情况下，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以用于治疗慢性炎性或自身免疫性障碍。在一些实施方案中，用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗慢性炎性或自身免疫性障碍包括向受试者连续施用。在一些实施方案中，连续施用是重复施用。在一些情况下，重复包括治疗方案在内的治疗期。如本文所述，在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复的治疗期紧接在先前治疗期之后发生。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，重复施用直至任何时间。例如，慢性炎性或自身免疫性障碍的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括无限期地向受试者施用治疗。
在一些情况下，用本文提供的药物组合物(例如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗慢性炎性或自身免疫性障碍包括间歇施用。例如，慢性炎性或自身免疫性障碍的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括以循环方式施用治疗，使得可以向受试者以任意次数重复施用特定的治疗方案(例如治疗期中的治疗方案)。在一些实施方案中，重复治疗期和治疗方案，且治疗期之间具有延迟。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，向受试者以任意次数施用治疗。
在一些实施方案中，向受试者施用治疗以维持所需的效果。例如，在一些实施方案中，当炎性或自身免疫性障碍是慢性炎性或自身免疫性疾病时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述慢性炎性或自身免疫性障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后继续用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，可以继续治疗以防止症状的复发和/或维持慢性炎性或自身免疫性障碍的症状的缓解或减轻。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，继续施用直至任何时间。在一些实施方案中，继续施用是以本文所述的重复治疗期的形式进行。
本文所述的任何慢性炎性或自身免疫性障碍(例如慢性GvHD、慢性炎性肠病、舍格伦综合征(pSS))或系统性红斑狼疮(SLE)、COPD、克罗恩病、溃疡性结肠炎、间质性肺病(ILD)、银屑病关节炎、类风湿性关节炎或本文所述的任何慢性形式的炎性或自身免疫性疾病或障碍)可以通过根据上述长期治疗施用治疗进行治疗。
在一些情况下，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以用于治疗急性炎性或自身免疫性障碍。例如，急性炎性或自身免疫性障碍的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括在限定或有限的时间段内向受试者施用治疗。在一些实施方案中，施用持续不重复的单个治疗期。在一些实施方案中，施用是单一剂量。在一些实施方案中，持续时间或治疗期是根据熟练从业者的需要设定的。
在一些实施方案中，当炎性或自身免疫性障碍是急性炎性或自身免疫性障碍时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述急性炎性或自身免疫性障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后停止用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，在任何时间停止施用。
本文所述的任何急性炎性或自身免疫性障碍(例如，急性GvHD)或本文所述的任何急性形式的炎性或自身免疫性障碍可以通过根据上述施用治疗来进行治疗。在一些实施方案中，细胞因子风暴是急性炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，CRS是急性炎性或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗GVHD。
在一些实施方案中，GVHD是慢性GVHD。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗GVHD。在一些实施方案中，GVHD是慢性GVHD。在一些情况下，慢性GVHD在同种异体造血干细胞移植(HSCT)和/或供体免疫细胞对宿主组织的反应之后发生。在一些情况下，慢性GVHD表现在皮肤、肝脏或胃肠道中。在一些实施方案中，GVHD是抗性或难治性的。在一些实施方案中，GVHD是免疫抑制剂抗性或难治性的。在一些情况下，免疫抑制剂是皮质类固醇和/或环孢素。在一些实施方案中，皮质类固醇是糖皮质激素。
在一些实施方案中，GVHD是急性GVHD(aGVHD)。在一些情况下，aGVHD在同种异体造血干细胞移植(HSCT)和/或供体免疫细胞对宿主组织的反应之后发生。在一些实施方案中，aGVHD是抗性或难治性的。在一些实施方案中，aGVHD是免疫抑制剂抗性或难治性的。在一些情况下，aGVHD表现在皮肤、肝脏或胃肠道中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗GVHD。在一些实施方案中，GVHD是急性GVHD(aGVHD)。在一些情况下，aGVHD在同种异体造血干细胞移植(HSCT)和/或供体免疫细胞对宿主组织的反应之后发生。在一些情况下，aGVHD表现在皮肤、肝脏或胃肠道中。在一些实施方案中，aGVHD是抗性或难治性的。在一些实施方案中，aGVHD是免疫抑制剂抗性或难治性的。在一些情况下，免疫抑制剂是皮质类固醇和/或环孢素。在一些实施方案中，皮质类固醇是糖皮质激素。
在一些实施方案中，抗性或难治性aGvHD包括在开始用≥2mg/kg/天的泼尼松或其等同物治疗后5天内aGVHD进展。在一些实施方案中，进展是或包括在有或没有任何器官的改善的情况下在至少一个器官中GVHD恶化。在一些实施方案中，抗性或难治性aGVHD包括在开始用≥2mg/kg/天的泼尼松或其等同物治疗后7天内未能改善。在一些实施方案中，未能改善是或包括在有或没有任何器官的改善的情况下在至少一个器官中GVHD恶化、或维持相同等级的GVHD、或在任何器官中GVHD进展、或死亡、或在计划的挽救疗法之外添加二级GVHD疗法。在一些实施方案中，抗性或难治性aGVHD包括在28天的包括类固醇在内的免疫抑制治疗(例如用≥2mg/kg/天的泼尼松或其等同物治疗)之后不完全反应。在一些实施方案中，不完全反应是或包括在计划的挽救疗法之外不存在二级GVHD疗法的情况下未能在所有器官中达到aGVHD症状的完全消退。在一些实施方案中，抗性或难治性aGVHD包括本文所述的任何病症。
在一些情况下，根据西奈山急性GVHD国际联合会(MAGIC)指南对aGVHD进行分级或分期。表B提供了示例性GVHD靶器官分期。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗II-IV级aGVHD。
表B：GVHD靶器官分期。
Figure BDA0003407053080000691
总体临床等级(基于最严重的靶器官受累)：
·0级：无任何器官处于1-4期
·I级：1-2期皮肤，无肝脏、上GI或下GI受累
·II级：3期皮疹和/或1期肝脏和/或1期上GI和/或1期下GI
·III级：2-3期肝脏和/或2-3期下GI，且0-3期皮肤和/或0-1期上GI
·IV级：4期皮肤，肝脏或下GI受累，且0-1期上GI
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗患有在治疗开始时Karnofsky等级为40或更高的aGVHD的受试者。表C显示了Karnofsky分级方案。
表C：Karnofsky状态。
Figure BDA0003407053080000692
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗患有在治疗开始(例如，第一剂量)时Karnofsky等级为40或更高的如本文所述的II-IV级抗性或难治性aGvHD的受试者。在一些实施方案中，受试者必须至少18岁或更大。在一些实施方案中，可以用挽救疗法进一步治疗受试者。在一些实施方案中，挽救疗法在施用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)之前至少2天开始。在一些实施方案中，接受挽救疗法的受试者必须在施用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)之前以稳定剂量施用至少两天。在一些实施方案中，挽救疗法可以不在施用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)之后开始。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于如通过预防性处理来预防或降低与干细胞移植(例如，造血干细胞移植，如来自同种异体供体)相关的炎性或自身免疫性病症的风险。在一些实施方案中，预防性处理包括在受试者接受干细胞移植之前施用至少一个剂量的本文提供的变体ICOSLIgSF(例如IgV)Fc融合蛋白。在一些实施方案中，预防性处理包括在受试者接受干细胞移植之前施用至少一个剂量的本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白以及在受试者接受干细胞移植的同时施用至少一个剂量。在一些实施方案中，与干细胞移植相关的炎性或自身免疫性病症是急性GVHD。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于预防性处理中度aGVHD。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于预防性处理或预防严重aGVHD。在一些实施方案中，用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)预防性处理预防或限制中度或严重aGVHD。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物用于限制或预防移植物相关或移植相关疾病或障碍，如免疫抑制剂(如皮质类固醇(例如糖皮质激素)或环孢素)抗性或难治性的aGVHD。
在一些实施方案中，治疗与干细胞移植(例如，造血干细胞移植，如来自同种异体供体)相关的炎性或自身免疫性病症包括预防性处理(例如预防)所述病症。在一些实施方案中，预防性处理包括围移植期治疗。在一些情况下，围移植期治疗预防或降低与干细胞移植相关的GVHD风险。在一些实施方案中，围移植期治疗包括在干细胞移植之前施用治疗以及在干细胞移植的同时或之后施用治疗。在一些实施方案中，治疗施用是相对于移植延迟的。在一些实施方案中，延迟的量是、是约或是至少自移植之时起1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更长时间。在一些实施方案中，延迟的量是小于自移植起100天。在一些实施方案中，GVHD是急性移植物抗宿主病(aGVHD)。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗与器官移植相关的自身免疫性病症。在一些情况下，治疗与器官移植相关的自身免疫性病症可以延长宿主和移植器官的存活期。在一些实施方案中，治疗与器官移植相关的自身免疫性病症包括受试者的移植排斥反应的预防或抑制或防止受试者的移植排斥反应，所述受试者是器官移植的接受者。
在一些实施方案中，治疗与器官移植相关的炎性或自身免疫性病症包括围移植期治疗。在一些情况下，围移植期治疗预防或降低作为器官移植接受者的受试者的移植排斥反应的风险。在一些实施方案中，围移植期治疗包括在移植之前施用治疗以及在移植的同时或之后施用治疗。在一些实施方案中，治疗施用是相对于移植延迟的。在一些实施方案中，延迟的量是、是约或是至少自移植之时起1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更长时间。在一些实施方案中，延迟的量是小于自移植起100天。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，IBD是慢性IBD。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗克罗恩病。在一些实施方案中，克罗恩病可以包括来自克罗恩结肠炎、克罗恩肠炎、克罗恩回肠炎或克罗恩小肠结肠炎的亚型。
在一些实施方案中，有待用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSLIgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗的炎性或自身免疫性疾病是炎性肠病(IBD)。在一些情况下，IBD包括涉及全部或部分消化道的慢性炎症的病症。在一些实施方案中，IBD是慢性IBD。在一些实施方案中，IBD的类型(例如，慢性IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。在一些实施方案中，慢性IBD包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，IBD(例如，慢性IBD)的症状包括腹泻、发热和疲劳、腹部疼痛和痉挛、便血、食欲降低和非故意的体重减轻。在一些实施方案中，IBD的症状是克罗恩病和溃疡性结肠炎二者共有的。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗克罗恩病(CD)。在一些情况下，CD导致从口腔到肛门的任何或全部胃肠道的炎症。在一些情况下，CD是影响消化道内壁的慢性炎性肠病。在一些情况下，CD影响排便，包括持续性腹泻、紧急排便、排便不完全的感觉和/或便秘。在一些情况下，患有CD的患者经历腹部痉挛和疼痛。在一些情况下，患有CD的患者经历直肠出血。在一些情况下，CD的症状因患者而异。在一些情况下，患有CD的患者出现并发症，如裂隙、瘘和狭窄。在一些情况下，CD的全身性症状包括眼睛发红或疼痛、视力改变、口腔溃疡、关节肿胀和/或疼痛、皮肤并发症(例如皮疹、肿块、疮)、发热、食欲不振、体重减轻、贫血、疲劳、盗汗、正常月经周期丧失、骨质疏松症、肾结石和肝脏并发症(例如，原发性硬化性胆管炎、肝硬化)。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗溃疡性结肠炎(UC)。在一些情况下，UC导致消化道中的长期炎症和/或溃疡。在一些情况下，UC影响大肠(结肠)和直肠的最内层内壁。在一些情况下，UC的症状随着时间而发展。在一些情况下，UC影响排便，包括带血或脓液的腹泻、紧急排便和/或尽管紧急但无法排便。在一些情况下，患有UC的患者经历直肠出血、体重减轻、疲劳、发热以及儿童无法生长。在一些情况下，症状按强烈程度从轻度到中度。在一些情况下，患有UC的患者经历长时间的缓解。在一些实施方案中，UC是溃疡性直肠炎。在一些实施方案中，溃疡性直肠炎局限于最靠近肛门(直肠)的区域。在一些情况下，患有溃疡性直肠炎的患者经历直肠出血。在一些实施方案中，UC是直肠乙状结肠炎。在一些情况下，直肠乙状结肠炎影响直肠和乙状结肠。在一些情况下，患有直肠乙状结肠炎的患者经历血性腹泻、腹部痉挛和疼痛以及尽管紧急(里急后重)但无法排便。在一些情况下，UC是左侧结肠炎。在一些实施方案中，左侧结肠炎导致炎症从直肠延伸至乙状结肠和降结肠。在一些情况下，患有左侧结肠炎的患者经历血性腹泻、左侧腹部疼痛和痉挛以及非故意的体重减轻。在一些情况下，UC是全结肠炎。在一些实施方案中，全结肠炎影响整个结肠。在一些情况下，患有全结肠炎的患者经历血性腹泻、腹部痉挛和疼痛、疲劳和明显体重减轻。在一些情况下，UC是急性严重UC。在一些实施方案中，急性严重UC是影响整个结肠的罕见形式的UC。在一些情况下，患有急性严重UC的患者经历剧烈疼痛、大量腹泻、出血、发热和无法进食。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗舍格伦综合征。
剂量和施用
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)施用至受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。在一些实施方案中，受试者的病症包括所治疗的障碍是慢性或急性障碍。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。这种信息随后可用于确定在人中的有用剂量和施用途径。可以根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定确切剂量。可以调整剂量和施用以提供足够的活性化合物水平或维持所需作用。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。
在一些实施方案中，可以使用在对照动物和疾病的动物模型(例如，癌症模型)中观察到的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)概况的建模和模拟来预测或确定患者给药。例如，可以使用来自非人灵长类动物(例如，食蟹猴)的PK数据来估计人PK。类似地，可以使用小鼠PK和PD数据来预测人给药。可以使用观察到的动物数据来为计算模型提供信息，所述计算模型可以用于模拟人剂量反应。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括以对于治疗效果而言足够的量施用本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)，其中已知或预测剂量可实现与其同源配体(例如CD28和/或ICOS)的靶结合饱和度。与同源配体结合的靶结合饱和度可以通过实验或根据经验来确定。在一些实施方案中，可以从与表达同源配体(如人CD28或人ICOS)的哺乳动物细胞的体外结合数据确定靶结合饱和度。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下大于或大于约25％，如Cmax下大于或大于约30％、如在Cmax下大于或大于约35％、如在Cmax下大于或大于约40％、如在Cmax下大于或大于约50％或更大。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下为、为至少或为约85％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％，如大于或大于约15％、大于或大于约20％、大于或大于约25％、大于或大于约30％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的2天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的7天(一周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的14天(2周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的21天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的28天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下大于或大于约25％，如Cmax下大于或大于约30％、如在Cmax下大于或大于约35％、如在Cmax下大于或大于约40％、如在Cmax下大于或大于约50％或更大。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％，如大于或大于约15％、大于或大于约20％、大于或大于约25％、大于或大于约30％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的2天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的7天(一周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的14天(2周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的21天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的28天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在至少或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长持续时间内大于或大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在至少或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长持续时间内大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在为或约24小时的持续时间内大于或大于约50％。
可以每3至4天、每周、每两周、每三周、一个月一次等施用本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)，这取决于特定配制品的半衰期和清除速率。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单一剂量的方式施用，或随时间以多个剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用，或以连续输注的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。在一些情况下，例如当用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗慢性炎性或自身免疫性障碍时，随着时间或间歇地随着时间连续地(例如重复地)施用所述组合物。例如，慢性炎性或自身免疫性障碍(例如用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)的治疗可以包括向受试者无限期地施用治疗。在一些实施方案中，当炎性或自身免疫性障碍是慢性炎性或自身免疫性障碍时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述慢性炎性或自身免疫性障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后继续用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，继续施用直至任何时间。在一些情况下，例如当用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗急性炎性或自身免疫性障碍时，在限定或有限的时间段内施用所述组合物。在一些实施方案中，当炎性或自身免疫性障碍是急性炎性或自身免疫性障碍时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述急性炎性或自身免疫性障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后停止用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，在任何时间停止施用。
通常，待施用的本文提供的组合物的精确量可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异后确定。在一些实施方案中，在基于mg/kg受试者提及剂量时，认为普通人受试者具有约70kg-75kg(如70kg)的质量以及1.73m2的体表面积(BSA)。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的剂量(如为了实现治疗有效量)在治疗期内是单一剂量或重复剂量，如经由在治疗期内施用多个剂量。在一些实施方案中，在治疗期内施用单一剂量的含有变体ICOSLIgSF结构域融合蛋白的本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，在治疗期内施用多个重复剂量的含有变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的本文提供的药物组合物。
在一些实施方案中，重复治疗期。例如，在待治疗的障碍是慢性炎性或自身免疫性障碍的情况下，包括特定治疗方案(例如如本文所述)在内的治疗期可以重复任何次数。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约2、3、4、5、6年或更多年。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约6年。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约3年。在一些实施方案中，治疗期的重复次数是熟练从业者所需的任何次数。在一些实施方案中，重复的治疗期可以被认为是连续治疗。例如，当在4周的治疗期内每周施用一次且在先前治疗期结束后立即重复治疗期，并且无限期地重复治疗期时，重复的治疗可以是连续的。在一些实施方案中，重复的治疗期可以被认为是间歇治疗。例如，当在4周的治疗期内每周施用一次且在第一治疗期结束后两周重复治疗期，并且例如无限期地重复该循环时，重复的治疗可以是间歇的。在一些实施方案中，间歇治疗是连续治疗。
在一些实施方案中，在治疗期内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，治疗期持续大于20天，如20至40天，如持续为或约21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天或40天。在一些实施方案中，治疗期是、是至少、或是约41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天。在一些实施方案中，治疗期是从为或约28至为或约42天。在一些实施方案中，治疗期是为或约42天(为或约6周)。在一些实施方案中，治疗期是从为或约21天至为或约28天。在一些实施方案中，治疗期是为或约21天。在一些实施方案中，治疗期是为或约28天(4周)。在一些实施方案中，治疗期是6个月或更长时间。在一些实施方案中，治疗期是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。在一些实施方案中，治疗期是约1年至约3年。在一些实施方案中，治疗期是约3年至约6年。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。例如，无限期治疗可以用于治疗慢性炎性或自身免疫性障碍。在一些实施方案中，在先前治疗期之后立即重复治疗期。在一些实施方案中，在先前治疗期之后重复治疗期且具有一定的时间延迟。在一些实施方案中，延迟是、是约或是至少1、2、3、4、5、6、7、8周。在一些实施方案中，延迟是、是约或是至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或长达一年。
在一些实施方案中，可以组合多于一个治疗期和/或方案。例如，在一些情况下，初始治疗期可以是四周并且包括每两周施用一次，并且第二治疗期可以是四周且每四周施用一次。在一些实施方案中，可以重复第一或第二治疗期。例如，在一些实施方案中，每四周施用一次的四周的第二治疗期可以例如根据熟练从业者的需要重复多次。
在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用两次。在特定实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用不超过一次。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用一次(Q1W)。在一些实施方案中，给药方案包括在4周内每周给予一次的4个剂量的施用。在一些实施方案中，给药方案包括初始施用、在初始施用后2周和4周施用以及此后每4周一次。
在一些实施方案中，每天施用多个剂量中的每个剂量。例如，这可能发生在炎性或自身免疫性疾病是急性疾病并且受试者在医院或其他医疗保健机构接受治疗的情况下。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约10mg/kg的量。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约20mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约20mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约6mg/kg至为或约20mg/kg、为或约6mg/kg至为或约10mg/kg或为或约10mg/kg至为或约20mg/kg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：为或约0.3mg/kg、为或约1mg/kg或、为或约3mg/kg或为或约6mg/kg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以为或约10mg/kg的量。
在一些实施方案中，将药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)通过任何途径施用至受试者，包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接施加至伤口部位、施加至手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内、脊柱内、瘤内或经全身。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是肠胃外施用。本文提供的例子显示，特别合适的施用途径包括静脉内、皮下或瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物呈适合于通过注射(如通过推注注射)施用的形式。在一些实施方案中，药物组合物呈适合于输注注射(例如，通过静脉内注射)的形式。在一些实施方案中，输注持续时间为、为至少或为约30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与6小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与5小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与4小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与3小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与2小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与1小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间为或为约30分钟。
在一些实施方案中，施用如本文所述的剂量方案以实现治疗有效量。
考虑到给药(例如，多个剂量)可以持续直到如熟练从业者所需的任何时间。例如，给药可以持续直到在受试者中获得期望的疾病反应，如疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状的减轻或改善，如炎症的一种或多种体征的减轻。在一些实施方案中，在受试者中疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善，如炎症的一种或多种体征减轻之后继续给药。
在所述方法的一些实施方案中，治疗可以导致临床缓解。在一些方面，治疗可以导致在自第一剂量起约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约9周、约10周、约11周、约12周、约14周、约16周、约18周、约20周、约22周、约24周、约26周、约28周、约30周、约32周、约34周、约36周、约38周、约40周、约42周、约44周、约46周、约48周、约50周、约52周、约54周、约56周、约58周、约60周、约62周、约64周、约66周、约68周、约70周、约72周、约74周、约76周、约78周、或约80周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致自第一剂量起约10周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致自第一剂量起约6周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致在自第一剂量起约6周时和在自第一剂量起约10周时临床缓解。
在任何前述方法的一些实施方案中，临床缓解是持续缓解。例如，在一些实施方案中，持续缓解是在自第一剂量起约10周、约15周、约20周、约25周、约30周、约35周、约40周、约45周、约50周、约52周、约55周、约60周、约65周、约70周、约72周、约75周、约80周、约85周、约90周、约95周、约100周、约102周、约105周或约110周时临床缓解。在一些实施方案中，持续缓解是在自第一剂量起约十周时和在自第一剂量起约30周时临床缓解。在一些实施方案中，持续缓解具有至少约30周或至少约7、约8、约9、约10、约11或约12个月的长度。在任何前述方面的一些实施方案中，疾病或病症的一种或多种症状的改善、临床缓解和/或临床反应在治疗结束后维持至少一个月(例如，至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少十二个月或更长时间)。
2.眼部炎性或自身免疫性疾病
在一些实施方案中，所提供的组合物和方法用于治疗影响眼睛的炎性或自身免疫性障碍。在一些实施方案中，全身性自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、舍格伦综合征、肠病性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、巨细胞动脉炎、格雷夫斯病、重症肌无力、结节病、高安氏动脉炎、皮肌炎、系统性红斑狼疮、结节性多动脉炎、复发性多软骨炎、伴多血管炎的肉芽肿病(以前称为韦格纳肉芽肿病)、硬皮病、白塞病、反应性关节炎(以前称为莱特尔综合征)、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病)、舍格伦综合征和强直性脊柱炎，包括眼睛作为例如白细胞免疫炎性攻击的靶标。在一些情况下，全身性炎性或自身免疫性疾病的眼部临床表现是干燥性角膜结膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、角膜炎、溃疡性角膜炎、脉络膜炎、视网膜血管炎、巩膜外结节、视网膜脱离、黄斑水肿性葡萄膜炎、巩膜外层炎、外周溃疡性角膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、视网膜出血、增殖性视网膜病变、缺血性视神经病变、偏盲、黑朦、核间性眼肌麻痹、瞳孔异常、动眼神经异常、视幻觉、球后神经炎、视野缺损、核间性眼肌麻痹、辨距不良、眼球震颤、颅神经麻痹、一时性黑朦、复视、视力丧失、前垂/眼球突出、眼睑滞后和退缩、视敏度下降、视野缩小、相对性瞳孔传入缺陷、色觉丧失、复视、眼下垂、结膜结节、颅神经麻痹、泪腺增大、眼眶蜂窝织炎、角膜溃疡、眼前房积脓、血管闭塞性视网膜病变、白内障和/或眼睑/结膜水肿。在一些情况下，眼部临床表现是全身性炎性或自身免疫性疾病所特有的。
在一些情况下，眼睛是受自身免疫性疾病影响的特定且唯一的靶标，例如眼特异性的。眼特异性自身免疫性疾病的例子包括但不限于眼部瘢痕性类天疱疮、蚕蚀性角膜溃疡和葡萄膜炎。
皮质类固醇例如通过玻璃体内注射的局部眼部施用通常被认为是影响眼睛的炎性或自身免疫性疾病(如葡萄膜炎)的护理标准。然而，使用皮质类固醇会带来副作用的风险，包括例如白内障和青光眼。本文提供的组合物和方法预期用于治疗影响眼睛的炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法治疗影响眼睛的全身性自身免疫性疾病或眼特异性自身免疫性疾病而没有与使用类固醇相关的副作用。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法作为预防剂施用，例如以预防眼特异性炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法作为预防剂施用，例如以预防全身性炎性或自身免疫性疾病的眼部临床表现。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法作为治疗性处理施用，例如以治疗眼特异性炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法作为治疗性处理施用，例如以治疗全身性炎性或自身免疫性疾病的眼部临床表现。在一些实施方案中，治疗包括减轻或改善影响眼睛的自身免疫性或炎性疾病的症状。
在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛例如导致眼部临床表现的全身性自身免疫性疾病。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的类风湿性关节炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的幼年型类风湿性关节炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的舍格伦综合征。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的银屑病关节炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的结节病。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的皮肌炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的结节性多动脉炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的复发性多软骨炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的伴多血管炎的肉芽肿病。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的硬皮病。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的白塞病。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的反应性关节炎。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病)。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是影响眼睛的强直性脊柱炎。在一些实施方案中，全身性自身免疫性或炎性疾病影响眼睛，导致眼部临床表现，例如如上所述。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病通过在眼睛中产生炎性反应来影响眼睛。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病通过导致免疫细胞浸润到眼睛中来影响眼睛。在一些实施方案中，治疗是预防性处理。例如，患有全身性自身免疫性或炎性疾病的受试者可以在显示出眼睛炎症的症状(例如，眼部临床表现)之前用本文提供的组合物进行治疗。在一些实施方案中，患有全身性自身免疫性或炎性疾病的受试者可能被怀疑出现眼部临床表现，例如炎性反应。在一些实施方案中，治疗是治疗性处理，其在眼睛症状发作后递送。
在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是眼部瘢痕性类天疱疮。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是蚕蚀性角膜溃疡。在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是葡萄膜炎或其特定类型。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病通过在眼睛中产生炎性反应来影响眼睛。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病通过导致免疫细胞浸润到眼睛中来影响眼睛。在一些实施方案中，治疗是预防性处理。例如，怀疑患有眼特异性自身免疫性或炎性疾病(例如对眼特异性自身免疫性或炎性疾病的一种或多种生物标记物呈阳性)的受试者可以在显示出症状(例如，眼睛炎症)之前用本文提供的组合物进行治疗。在一些实施方案中，治疗是治疗性处理，其在眼睛症状(例如，炎症)发作后递送。
在一些实施方案中，待治疗的炎性或自身免疫性疾病是葡萄膜炎。在一些情况下，葡萄膜炎导致眼壁中的中层组织(葡萄膜)的炎症。在一些情况下，葡萄膜炎涉及虹膜的炎症。在一些实施方案中，葡萄膜炎涉及睫状体的炎症。在一些实施方案中，葡萄膜炎涉及脉络膜的炎症。在一些实施方案中，葡萄膜炎涉及视网膜的炎症。在一些实施方案中，葡萄膜炎涉及葡萄膜所有层的炎症。在一些实施方案中，葡萄膜炎与发炎的玻璃体和/或玻璃体被炎性细胞浸润有关。在一些实施方案中，葡萄膜炎影响一只或两只眼睛。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)用于治疗葡萄膜炎。在一些实施方案中，葡萄膜炎是虹膜炎(前葡萄膜炎)。在一些实施方案中，葡萄膜炎是睫状体炎(中间葡萄膜炎)。在一些实施方案中，葡萄膜炎是脉络膜炎。在一些实施方案中，葡萄膜炎是视网膜炎。在一些实施方案中，葡萄膜炎是弥漫性葡萄膜炎(全葡萄膜炎)。在一些实施方案中，葡萄膜炎与发炎的玻璃体有关。在一些实施方案中，葡萄膜炎与炎性细胞浸润到玻璃体内有关。在一些实施方案中，葡萄膜炎影响一只或两只眼睛。在一些实施方案中，葡萄膜炎与眼睛发红、眼睛疼痛、光敏性、视力模糊、视野中出现黑斑和/或漂浮斑点和/或视力下降有关。在一些实施方案中，葡萄膜炎由结节病引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由强直性脊柱炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由克罗恩病引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由溃疡性结肠炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由类风湿性关节炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由幼年型类风湿性关节炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由反应性关节炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由肠病性关节炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由银屑病关节炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由系统性红斑狼疮引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由贝赫切特综合征引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由皮肌炎引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由伴多血管炎的肉芽肿病引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由感染(如猫抓病、带状疱疹、梅毒、弓形体病、结核病、莱姆病或西尼罗河病毒)引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎由影响眼睛的癌症(如淋巴瘤)引起。在一些实施方案中，葡萄膜炎是眼特异性自身免疫性或炎性疾病，例如，不是由全身性自身免疫性或炎性疾病引起的。
在一些情况下，眼部炎性或自身免疫性疾病是慢性疾病。例如，当眼部炎性或自身免疫性疾病是慢性炎性或自身免疫性障碍的眼部临床表现，例如如本文所述(参见例如，章节VII-A-1)，或者是上述眼特异性炎性疾病的慢性形式时，所述疾病可以被认为是慢性疾病。在一些情况下，眼部炎性或自身免疫性疾病是急性疾病。例如，当眼部炎性或自身免疫性疾病是急性炎性或自身免疫性障碍的眼部临床表现，例如如本文所述(参见例如，章节VII-A-1)，或者是上述眼特异性炎性疾病的急性形式时，所述疾病可以被认为是急性疾病。
在一些情况下，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以用于治疗慢性眼部炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗慢性眼部炎性或自身免疫性疾病包括向受试者连续施用。在一些实施方案中，连续施用是重复施用。在一些情况下，重复包括治疗方案在内的治疗期。如本文所述，在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复的治疗期紧接在先前治疗期之后发生。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，重复施用直至任何时间。例如，慢性眼部炎性或自身免疫性疾病的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括无限期地向受试者施用治疗。
在一些情况下，用本文提供的药物组合物(例如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗慢性眼部炎性或自身免疫性疾病包括间歇施用。例如，慢性眼部炎性或自身免疫性疾病的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括以循环方式施用治疗，使得可以向受试者以任意次数重复施用特定的治疗方案(例如治疗期中的治疗方案)。在一些实施方案中，重复治疗期和治疗方案，且治疗期之间具有延迟。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，向受试者以任意次数施用治疗。
在一些实施方案中，向受试者施用治疗以维持所需的效果。例如，在一些实施方案中，当眼部炎性或自身免疫性疾病是慢性眼部炎性或自身免疫性疾病时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述慢性眼部炎性或自身免疫性障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后继续用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，可以继续治疗以防止症状的复发和/或维持慢性眼部炎性或自身免疫性障碍的症状的缓解或减轻。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，继续施用直至任何时间。在一些实施方案中，继续施用是以本文所述的重复治疗期的形式进行。
在一些情况下，本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以用于治疗急性眼部炎性或自身免疫性疾病。例如，急性眼部炎性或自身免疫性疾病的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括在限定或有限的时间段内向受试者施用治疗。在一些实施方案中，施用持续不重复的单个治疗期。在一些实施方案中，持续时间或治疗期是根据熟练从业者的需要设定的。
在一些实施方案中，当炎性或自身免疫性障碍是急性眼部炎性或自身免疫性疾病时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述急性疾病或障碍的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后停止用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，在任何时间停止施用。
剂量和施用
用于治疗眼部炎性和自身免疫性疾病(如本文所述)的方法可以包括全身性施用、局部施用或二者。从呈现的症状和/或眼病的潜在原因可以知道施用方法。在一些实施方案中，从呈现的症状和/或眼病的潜在原因可以知道施用急性治疗还是长期治疗。
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)全身性地施用至患有眼部炎性或自身免疫性疾病的受试者。例如，可以根据本文所述的任何实施方案进行全身性施用。在一些实施方案中，全身性施用根据章节VII-A-1中描述的方法来完成。在一些实施方案中，当受试者患有(例如如上所述)全身性自身免疫性或炎性疾病时使用全身性施用，所述全身性自身免疫性或炎性疾病可以具有或呈现眼部临床表现(例如眼睛炎症)。在一些实施方案中，当受试者患有眼特异性自身免疫性或炎性疾病(例如如上所述)时使用全身性施用。
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)局部(例如，眼内)施用至患有眼部炎性或自身免疫性疾病的受试者。在一些实施方案中，施用是玻璃体内的。
在一些实施方案中，可以使用在对照动物和疾病的动物模型(例如，葡萄膜炎模型)中在玻璃体内施用后观察到的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)概况的建模和模拟来预测或确定患者给药。例如，可以使用来自非人灵长类动物(例如，食蟹猴)的PK数据来估计人PK。类似地，可以使用小鼠和/或大鼠PK和PD数据来预测人给药。可以使用观察到的动物数据来为计算模型提供信息，所述计算模型可以用于模拟人剂量反应。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括以对于治疗效果而言足够的量施用本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)，其中已知或预测剂量可实现与其同源配体(例如CD28和/或ICOS)的靶结合饱和度。与同源配体结合的靶结合饱和度可以通过实验或根据经验来确定。在一些实施方案中，可以从与表达同源配体(如人CD28或人ICOS)的哺乳动物细胞的体外结合数据确定靶结合饱和度。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下大于或大于约25％，如Cmax下大于或大于约30％、如在Cmax下大于或大于约35％、如在Cmax下大于或大于约40％、如在Cmax下大于或大于约50％或更大。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下至少或约85％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％，如大于或大于约15％、大于或大于约20％、大于或大于约25％、大于或大于约30％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的2天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的7天(一周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的14天(2周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的21天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与CD28结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的28天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在Cmax下大于或大于约25％，如Cmax下大于或大于约30％、如在Cmax下大于或大于约35％、如在Cmax下大于或大于约40％、如在Cmax下大于或大于约50％或更大。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％，如大于或大于约15％、大于或大于约20％、大于或大于约25％、大于或大于约30％、大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的2天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的7天(一周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的14天(2周)内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的21天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在施用所述剂量的28天内大于或大于约50％，如大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％、或为或约100％。
在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在至少或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长持续时间内大于或大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在至少或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长持续时间内大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，所施用的变体ICOSL IgSF融合蛋白的剂量是以可展现出或预测展现出如下与ICOS结合的靶结合饱和度的量：在为或约24小时的持续时间内大于或大于约50％。
可以每3至4天、每周、每两周、每三周、一个月一次等施用本文所述的药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)，这取决于特定配制品的半衰期和清除速率。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单一剂量的方式施用，或随时间以多个剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。在一些情况下，例如当用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗慢性眼部炎性或自身免疫性疾病时，随着时间或间歇地随着时间连续地(例如重复地)施用所述组合物。例如，慢性眼部炎性或自身免疫性疾病的治疗(例如，用本文提供的药物组合物，如本文提供的变体ICOSLIgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)可以包括无限期地向受试者施用治疗。在一些实施方案中，当眼部炎性或自身免疫性疾病是慢性眼部炎性或自身免疫性疾病时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述慢性眼部炎性或自身免疫性疾病的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后继续用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，继续施用直至任何时间。在一些情况下，例如当用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白)治疗急性眼部炎性或自身免疫性疾病时，在限定或有限的时间段内施用所述组合物。在一些实施方案中，当眼部炎性或自身免疫性疾病是急性疾病时，在所述疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善(如患有所述急性疾病的受试者中的一种或多种炎症体征减轻)之后停止用本文提供的药物组合物(如本文提供的变体ICOSL IgSF(例如IgV)Fc融合蛋白治疗。在一些实施方案中，根据熟练从业者的需要，在任何时间停止施用。
通常，待施用的本文提供的组合物的精确量可由医师例如眼科医师在考虑患者(受试者)状况的个体差异的情况下确定。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的剂量(如为了实现治疗有效量)在治疗期内是单一剂量或重复剂量，如经由在治疗期内施用多个剂量。在一些实施方案中，在治疗期内施用单一剂量的含有变体ICOSLIgSF结构域融合蛋白的本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，在治疗期内施用多个重复剂量的含有变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的本文提供的药物组合物。
在一些实施方案中，重复治疗期。例如，在待治疗的障碍是慢性眼部炎性或自身免疫性疾病的情况下，包括特定治疗方案(例如如本文所述)在内的治疗期可以重复任何次数。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约2、3、4、5、6年或更多年。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约6年。在一些实施方案中，重复治疗期持续或持续约3年。在一些实施方案中，治疗期的重复次数是熟练从业者所需的任何次数。在一些实施方案中，重复的治疗期可以被认为是连续治疗。例如，当在4周的治疗期内每周施用一次且在先前治疗期结束后立即重复治疗期，并且无限期地重复治疗期时，重复的治疗可以是连续的。在一些实施方案中，重复的治疗期可以被认为是间歇治疗。例如，当在4周的治疗期内每周施用一次且在第一治疗期结束后两周重复治疗期，并且例如无限期地重复该循环时，重复的治疗可以是间歇的。在一些实施方案中，间歇治疗是连续治疗。
在一些实施方案中，在治疗期内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，治疗期持续大于20天，如20至40天，如持续为或约21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天或40天。在一些实施方案中，治疗期是、是至少、或是约41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天。在一些实施方案中，治疗期是从为或约28至为或约42天。在一些实施方案中，治疗期是为或约42天(为或约6周)。在一些实施方案中，治疗期是从为或约21天至为或约28天。在一些实施方案中，治疗期是为或约21天。在一些实施方案中，治疗期是为或约28天(4周)。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用两次。在特定实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用不超过一次。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用一次(Q1W)。在一些实施方案中，给药方案包括在4周内每周给予一次的4个剂量的施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量每周施用两次(BIW)。在一些实施方案中，治疗期是6个月或更长时间。在一些实施方案中，治疗期是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。在一些实施方案中，治疗期是约1年至约3年。在一些实施方案中，治疗期是约3年至约6年。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，重复治疗期。在一些实施方案中，无限期地重复治疗期。例如，无限期治疗可以用于治疗慢性眼部炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，在先前治疗期之后立即重复治疗期。在一些实施方案中，在先前治疗期之后重复治疗期且具有一定的时间延迟。在一些实施方案中，延迟是、是约或是至少1、2、3、4、5、6、7、8周。在一些实施方案中，延迟是、是约或是至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或长达一年。
在一些实施方案中，可以组合多于一个治疗期和/或方案。例如，在一些情况下，初始治疗期可以是四周并且包括每两周施用一次，并且第二治疗期可以是四周且每四周施用一次。在一些实施方案中，可以重复第一或第二治疗期。例如，在一些实施方案中，每四周施用一次的四周的第二治疗期可以例如根据熟练从业者的需要重复多次。
在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用两次。在特定实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用不超过一次。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量是在治疗期内每周施用一次(Q1W)。在一些实施方案中，给药方案包括在4周内每周给予一次的4个剂量的施用。在一些实施方案中，给药方案包括初始施用、在初始施用后2周和4周施用以及此后每4周一次。
在一些实施方案中，每天施用多个剂量中的每个剂量。例如，这可能发生在炎性或自身免疫性疾病是急性疾病并且受试者在医院或其他医疗保健机构接受治疗的情况下。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.1mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约20mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约20mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约6mg/kg至为或约20mg/kg、为或约6mg/kg至为或约10mg/kg或为或约10mg/kg至为或约20mg/kg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：为或约0.3mg/kg、为或约1mg/kg或、为或约3mg/kg或为或约6mg/kg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以为或约10mg/kg的量。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：为、约、或至少0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15、20、30、40或50mg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：从为或约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的施用剂量是以如下量：为、约、或至少0.5、1、2、3、4或5mg。
在一些实施方案中，施用的剂量与眼睛的体积直接或间接相关。在一些实施方案中，施用的剂量与眼睛的表面积(例如内表面积)直接或间接相关。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体ICOSL IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的剂量是以最小和/或暂时影响眼内压的体积施用。在一些实施方案中，施用的体积由眼睛的体积决定。在一些实施方案中，施用的体积是或是约0.05mL。在一些实施方案中，施用的体积是或是约0.1mL或更小。在一些实施方案中，施用的体积是或是约0.2mL或更小。
在一些实施方案中，施用如本文所述的剂量方案以实现治疗有效量。在一些实施方案中，施用如本文所述的剂量方案以实现预防有效量。
考虑到给药(例如，多个剂量)可以持续直到如熟练从业者所需的任何时间。例如，给药可以持续直到在受试者中获得期望的疾病反应，如疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状的减轻或改善，如炎症的一种或多种体征的减轻。在一些实施方案中，在受试者中疾病缓解或部分缓解和/或疾病的体征和/或症状减轻或改善，如炎症的一种或多种体征减轻之后继续给药。
在所述方法的一些实施方案中，治疗可以导致临床缓解。在一些方面，治疗可以导致在自第一剂量起约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约9周、约10周、约11周、约12周、约14周、约16周、约18周、约20周、约22周、约24周、约26周、约28周、约30周、约32周、约34周、约36周、约38周、约40周、约42周、约44周、约46周、约48周、约50周、约52周、约54周、约56周、约58周、约60周、约62周、约64周、约66周、约68周、约70周、约72周、约74周、约76周、约78周、或约80周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致自第一剂量起约10周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致自第一剂量起约6周内临床缓解。在一些实施方案中，治疗导致在自第一剂量起约6周时和在自第一剂量起约10周时临床缓解。
在任何前述方法的一些实施方案中，临床缓解是持续缓解。例如，在一些实施方案中，持续缓解是在自第一剂量起约10周、约15周、约20周、约25周、约30周、约35周、约40周、约45周、约50周、约52周、约55周、约60周、约65周、约70周、约72周、约75周、约80周、约85周、约90周、约95周、约100周、约102周、约105周或约110周时临床缓解。在一些实施方案中，持续缓解是在自第一剂量起约十周时和在自第一剂量起约30周时临床缓解。在一些实施方案中，持续缓解具有至少约30周或至少约7、约8、约9、约10、约11或约12个月的长度。在任何前述方面的一些实施方案中，疾病或病症的一种或多种症状的改善、临床缓解和/或临床反应在治疗结束后维持至少一个月(例如，至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少十二个月或更长时间)。
B.测定或预测治疗的有效性
在一些实施方案中，所述方法包括测定患有疾病或病症的受试者以预测反应和/或结局。特定实施方案考虑到，样品的一种或多种基因产物(例如基因表达谱)的表达预测对变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)的反应的有效性、与之相关联和/或与之有关。
在一些实施方案中，所述方法包括评估与所提供的变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)抑制或降低ICOS和CD28活性的活性相关的一种或多种生物标记物。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标记物是如下基因产物：CCL17、CXCR5、GATA3、IL12RB2、IL18R1、IL18RAP、KITLG、TTA、PVR、SOCS3、TFRC、TNFRSF8、BATF3、CTLA4、FLT1、FOSL1、IL12、IL17F、IL1R2、IL23R、IL4、IL5或VEGFA、CCL20、CD40LG、CSF2、ICOS、ID2、IFNG、IGSF3、IL17A、IL1R1、IL2、IL21、IL24、IL3、IL31、IL6、IL9、LIF、NFKBID、PDCD1或TNF或前述任何一项的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标记物是如下基因产物：CCL17、CXCR5、GATA3、IL12RB2、IL18R1、IL18RAP、KITLG、TTA、PVR、SOCS3、TFRC或TNFRSF8或任何前述项的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标记物是如下基因产物：BATF3、CTLA4、FLT1、FOSL1、IL12、IL17F、IL1R2、IL23R、IL4、IL5或VEGFA或任何前述项的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标记物是如下基因产物：CCL20、CD40LG、CSF2、ICOS、ID2、IFNG、IGSF3、IL17A、IL1R1、IL2、IL21、IL24、IL3、IL31、IL6、IL9、LIF、NFKBID、PDCD1或TNF或任何前述项的组合。在一些任何实施方案中，生物标记物是蛋白质。在一些实施方案中，生物标记物是核酸(如RNA，例如mRNA)。
在一些实施方案中，评估、测量、检测和/或定量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、25种或更多种任何上述基因产物。在一些实施方案中，本文提供了用于测量、评估和/或测定样品中一种任何一种或多种上述基因产物的检测套组、谱和/或阵列。在特定实施方案中，检测套组、谱和/或阵列包括测量、评估和/或定量至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、多于十种或多于二十种基因产物。
在某些实施方案中，测量、评估和/或测定样品中一种或多种生物标记物或基因的表达。在一些实施方案中，基因产物是用基因编码的信息组装、产生和/或合成的任何生物分子，并且可以包括多核苷酸和/或多肽。在特定实施方案中，评估、测量和/或测定基因表达是或包括测定或测量基因产物的水平、量或浓度。在某些实施方案中，基因产物的水平、量或浓度可以进行转化(例如，归一化)或直接分析(例如，原始的)。在一些实施方案中，基因产物是由基因编码的蛋白质。在某些实施方案中，基因产物是多核苷酸(例如mRNA)或由基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，基因产物是由基因表达和/或由基因编码的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，基因产物是信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA、小核RNA、小核仁RNA、反义RNA、长链非编码RNA、微小RNA、Piwi相互作用RNA、小干扰RNA和/或短发夹RNA。在特定实施方案中，基因产物是mRNA。
在特定实施方案中，样品中多核苷酸的量或水平可以通过本领域已知的任何合适的方式来评估、测量、测定和/或定量。例如，在一些实施方案中，多核苷酸基因产物的量或水平可以通过以下方式来评估、测量、测定和/或定量：聚合酶链式反应(PCR)，包括逆转录酶(rt)PCR、微滴式数字PCR、实时和定量PCR(qPCR)方法(包括例如，
Figure BDA0003407053080000851
分子信标、LIGHTUPTM、SCORPIONTM、
Figure BDA0003407053080000856
参见例如，美国专利号5,538,848；5,925,517；6,174,670；6,329,144；6,326,145和6,635,427)；northern印迹、Southern印迹，例如逆转录产物和衍生物的所述印迹法；基于阵列的方法，包括印迹阵列、微阵列或原位合成阵列；以及测序(例如，合成测序、焦磷酸测序、双脱氧测序或连接测序)或本领域已知的任何其他方法，如Shendure等人,Nat.Rev.Genet.5:335-44(2004)或Nowrousian,Euk.Cell 9(9):1300-1310(2010)中所讨论的，包括特定平台如
Figure BDA0003407053080000857
454,
Figure BDA0003407053080000855
ABI
Figure BDA0003407053080000853
和
Figure BDA0003407053080000854
测序。在特定实施方案中，核酸基因产物的水平通过定量PCR(qPCR)方法(如qRT-PCR)来测量。在一些实施方案中，qRT-PCR对每个基因使用三个核酸组，其中三个核酸包含引物对以及在引物所结合的靶核酸区域之间结合的探针——商业上称为
Figure BDA0003407053080000852
测定。
在特定实施方案中，评估、测量、测定和/或定量RNA基因产物的量或水平包括从RNA基因产物产生、聚合和/或衍生cDNA多核苷酸和/或cDNA寡核苷酸的步骤。在某些实施方案中，通过直接评估、测量、测定和/或定量源自RNA基因产物的cDNA多核苷酸和/或cDNA寡核苷酸来评估、测量、测定和/或定量RNA基因产物。
在一些实施方案中，一种或多种基因产物(例如多核苷酸基因产物)的表达通过对基因产物测序和/或通过对源自基因产物的cDNA多核苷酸测序来测定。在一些实施方案中，测序通过非桑格测序方法和/或下一代测序(NGS)技术进行。下一代测序技术的例子包括但不限于大规模并行签名测序(MPSS)、聚合酶克隆测序、焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、单分子实时(RNAP)测序和Nanopore DNA测序。
在一些实施方案中，NGS技术是RNA测序(RNA-Seq)。在特定实施方案中，一种或多种多核苷酸基因产物的表达通过RNA-测量、测定和/或定量。RNA-Seq也称为全转录组鸟枪法测序，其测定样品中RNA的存在和数量。RNA测序方法已适用于最常见的DNA测序平台[HiSeq系统(Illumina)、454基因组测序仪FLX系统(Roche)、Applied Biosystems SOLiD(Life Technologies)、IonTorrent(Life Technologies)]。这些平台需要将RNA初始逆转录为cDNA。相比之下，单分子测序仪HeliScope(Helicos BioSciences)能够使用RNA作为模板进行测序。在PacBio RS平台上进行直接RNA测序的原理的证据也已得到证明(PacificBioscience)。在一些实施方案中，所述一种或多种RNA基因产物通过RNA-seq来评估、测量、测定和/或定量。
在一些实施方案中，基因产物是或包括由基因编码和/或表达的蛋白质，即多肽。在特定实施方案中，基因产物编码位于细胞表面和/或暴露于细胞表面的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是可溶性蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质由细胞分泌。
在特定实施方案中，基因表达是由基因编码的蛋白质的量、水平和/或浓度。在某些实施方案中，一种或多种蛋白质基因产物通过本领域已知的任何合适的手段来测量。用于评估、测量、测定和/或定量越来越多的蛋白质基因产物的水平、量或浓度包括但不限于用免疫测定、基于核酸或基于蛋白质的适体技术、HPLC(高精度液相色谱)、肽测序(如Edman降解测序或质谱法(如MS/MS)，任选地与HPLC耦合)以及任何前述项的微阵列改造(包括核酸、抗体或蛋白质-蛋白质(即，非抗体)阵列)。在一些实施方案中，免疫测定是或包括基于免疫反应例如通过检测抗体或抗原结合抗体片段与基因产物的结合检测蛋白质的方法或测定。免疫测定包括但不限于定量免疫细胞化学或免疫组织化学、ELISA(包括直接、间接、夹心、竞争、多重和便携式ELISA(参见例如，美国专利号7,510,687)、蛋白质印迹(包括一维、二维或更多维印迹或其他色谱手段，任选地包括肽测序)、酶免疫测定(EIA)、RIA(放射免疫测定)和SPR(表面等离子体共振)。
在所提供的实施方案中，样品是从已经接受、将接受或者作为候选者接受变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)的施用的受试者采集、收集和/或获得的生物样品。在一些实施方案中，受试者已经接受或被施用变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)。在特定实施方案中，样品是血液或血清样品。在特定实施方案中，样品是血液样品。在特定实施方案中，在用所述疗法治疗或施用所述疗法之前采集、收集和/或获得样品。在一些实施方案中，在用所述疗法治疗或施用所述疗法后采集、收集和/或获得样品。在一些实施方案中，在开始施用变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)后在或在约1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、一个月或更长时间内或在所述这些时间点处收集样品。
在一些实施方案中，所述方法包括评估样品中一种或多种基因产物的水平、量或浓度至基因产物的阈值。在一些实施方案中，阈值是健康受试者中基因产物的水平、量或浓度，或者是多个健康受试者中基因产物的中值或平均水平、量或浓度，其中此类健康受试者没有进行过治疗。在一些实施方案中，阈值是患病受试者中基因产物的水平、量或浓度，或者是多个患病受试者中基因产物的中值或平均水平、量或浓度，如患有相同疾病但未对此类受试者进行过治疗的受试者。在一些实施方案中，基因产物的水平、量或浓度与阈值相比的降低指示或预测用变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)的治疗是有效的。
在一些实施方案中，将基因产物的水平、量或浓度的评估与基线值进行比较。在一些实施方案中，基线值源自治疗前的1天、2天、3天、4天或5天的同一患者。在一些实施方案中，基线值源自开始治疗前的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或24小时。在一些实施方案中，基因产物的水平、量或浓度与基线相比的降低指示或预测用变体ICOSL多肽(例如变体ICOSL IgV-Fc)的治疗是有效的。
在一些实施方案中，如果确定存在基因产物的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或多于10倍降低，则预测反应是有效。在一些实施方案中，如果确定存在基因表达的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或多于10倍降低，则预测反应是有效的。
VIII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括在治疗期内向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中每个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
2.根据实施方案1所述的方法，其中每个剂量是以如下量施用：从或从约0.001mg/kg至为或约20mg/kg、从约0.001mg/kg至为或约10mg/kg、从约0.001mg/kg至为或约6mg/kg、从约0.001mg/kg至为或约3mg/kg、从约0.001mg/kg至为或约1mg/kg、从约0.001mg/kg至为或约0.1mg/kg、从约0.1mg/kg至为或约20mg/kg、从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg、从或从约0.1mg/kg至为或约6mg/kg、从约0.1mg/kg至为或约3mg/kg、从约0.1mg/kg至为或约1mg/kg、从约1mg/kg至为或约20mg/kg、从或从约1mg/kg至为或约10mg/kg、从或从约1mg/kg至为或约6mg/kg、从约1mg/kg至为或约3mg/kg、从约3mg/kg至为或约20mg/kg、从或从约3mg/kg至为或约10mg/kg、从或从约3mg/kg至为或约6mg/kg、从约6mg/kg至为或约20mg/kg、从或从约6mg/kg至为或约10mg/kg、或从或从约10mg/kg至为或约20mg/kg。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
4根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中在治疗期内施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
6.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中在治疗期内施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白，任选地其中所述多个剂量是2、3、4或5个剂量。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述治疗期是至少20天。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述治疗期是20-40天。
9.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，
其中所述变体ICOSL融合蛋白是在20-40天的治疗期内以选自3、4和5个的多个剂量施用，其中每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
10.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，
其中所述变体ICOSL融合蛋白是在至少20天的治疗期内以多个剂量施用，其中每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用，任选地最长治疗期为30天，并且进一步任选地其中所述多个剂量中的每一个彼此间隔至少5天。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述治疗期是为或约21天。
12.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述治疗期是为或约28天。
13.根据实施方案6-12中任一项所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
14.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，
其中所述变体ICOSL融合蛋白是在至少4周的治疗期内以多个剂量施用，其中每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用并且每周施用不超过一次。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述治疗期是为或约4周。
16.根据实施方案6-15中任一项所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。
17.一种预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
19.根据实施方案17或实施方案18所述的方法，其中所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植的同时或之后向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
20.根据实施方案17-19中任一项所述的方法，其中所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植的同时向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
21.根据实施方案17-19中任一项所述的方法，其中所述aGVHD与干细胞移植相关并且在所述受试者接受所述干细胞移植之前向所述受试者施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白并且在所述受试者接受所述干细胞移植之后向所述受试者给予至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
22.一种治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用单一剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
23.一种治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用单一剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用，并且其中所述受试者是免疫抑制剂、任选皮质类固醇和/或环孢素抗性或难治性的。
24.根据实施方案22或实施方案23所述的方法，其中所述GVHD是急性GVHD(aGVHD)。
25.根据实施方案22或实施方案23所述的方法，其中所述GVHD是慢性GVHD。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、或为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中每个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
29.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中每个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
30.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中每个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
31.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中每个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
32.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中每个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
33.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
34.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
35.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
36.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
37.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是经由皮下施用来施用的。
39.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中至少一个剂量是经由静脉内施用来施用的。
40.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述施用是经由皮下施用。
41.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述施用是经由静脉内施用。
42.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病是眼部自身免疫性或炎性病症。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述施用是经由玻璃体内施用。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中重复所述治疗期，任选地其中重复所述治疗期直到实现缓解、直到实现部分缓解或直到所述受试者的所述疾病或病症没有进展。
45.一种治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中关于SEQ ID NO:1中所示序列的一个或多个氨基酸取代。
46.一种减轻或预防受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中关于SEQ ID NO:1中所示序列的一个或多个氨基酸取代。
47.根据实施方案42或44所述的方法，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病是葡萄膜炎。
48.根据实施方案42-47中任一项所述的方法，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病由全身性自身免疫性或炎性疾病引起。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述全身性自身免疫性或炎性疾病是强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、贝赫切特综合征、皮肌炎或伴多血管炎的肉芽肿病。
50.根据实施方案42-47中任一项所述的方法，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病是眼特异性自身免疫性或炎性疾病。
51.根据实施方案42-47和50中任一项所述的方法，其中所述眼特异性自身免疫性或炎性疾病是眼部瘢痕性类天疱疮、蚕蚀性角膜溃疡或葡萄膜炎。
52.根据实施方案42-51中任一项所述的方法，其中所述ICOSL融合蛋白是以至少0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15、20、30、40或50mg，任选1、2、3、4或5mg的剂量施用。
53.根据实施方案42-51中任一项所述的方法，其中所述ICOSL融合蛋白是以如下剂量施用：在约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg之间，包含端值。
54.根据实施方案42-53中任一项所述的方法，其中所述ICOSL融合蛋白是以小于0.2mL、任选地小于0.1mL的体积施用。
55.根据实施方案42-54中任一项所述的方法，其中所述ICOSL融合蛋白是以约0.05mL的体积施用。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽包含关于SEQ ID NO:1的编号的氨基酸取代N52H/N57Y/Q100R。
57.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，其中与所述ICOSL参考多肽对CD28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体ICOSL多肽展现出对相同的一个或多个胞外域增加的结合亲和力。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽展现出的与ICOS的一个或多个胞外域的结合亲和力是与所述ICOSL参考多肽对相同的一个或多个胞外域的结合相比相同或增加的，任选地其中所述结合亲和力是所述ICOSL参考多肽对相同的一个或多个胞外域的结合亲和力的为或约80％或更多。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中与所述ICOSL参考多肽对ICOS和CD28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体ICOSL多肽展现出与相同的一个或多个胞外域增加的结合。
60.根据实施方案58或实施方案59所述的方法，其中所述结合增加多于或多于约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中：
所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在Cmax下大于或大于约25％的CD28靶结合饱和度；和/或
所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内大于或大于约10％的CD28靶结合饱和度。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约85％的CD28靶结合饱和度。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约90％的CD28靶结合饱和度。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的24小时内、2天内或7天内大于或大于约95％的CD28靶结合饱和度。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的21天或28天内大于或大于约10％的CD28靶结合饱和度。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白的每个剂量实现或预测实现在施用所述剂量的21天或28天内大于或大于约20％的CD28靶结合饱和度。
67.根据实施方案57-66中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
68.根据实施方案58-67中任一项所述的方法，其中所述ICOS是人ICOS。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含(i)SEQID NO:32中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)和/或(ii)的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽是截短的ICOSL胞外结构域，其包含关于SEQ ID NO:1中所示的ICOSL胞外结构域序列的含有氨基酸1-112的连续氨基酸序列和至少25个氨基酸的C末端截短。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述C末端截短是至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、或至少125个氨基酸残基的截短。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽在如SEQ IDNO:1的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点中被改变或缺乏所述蛋白酶切割位点。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含SEQ IDNO:3中所示的氨基酸序列。
76.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽由SEQ IDNO:3中所示的氨基酸序列组成。
77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ IDNO:36中所示序列或展现出与SEQ ID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的一个或多个氨基酸取代的序列。
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ IDNO:36中所示序列。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中与当由细胞表达时的所述变体ICOSL多肽的全长胞外结构域相比，所述变体ICOSL多肽在由相同细胞表达时展现出减少的蛋白水解切割，任选地其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
80.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽是经由接头与多聚化结构域连接，任选地其中所述接头是肽接头。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述接头包含1至10个氨基酸。
83.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述接头是AAA。
84.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述接头是G4S(SEQ ID NO:52)。
85.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述接头是(G4S)2(SEQ IDNO:53)。
86.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述接头是GSGGGGS接头(SEQID NO:58)。
87.根据实施方案1-86中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是多聚体，其包含与第一多聚化结构域连接的第一变体ICOSL多肽和与第二多聚化结构域连接的第二变体ICOSL多肽，任选地其中所述第一和第二多聚化结构域是相同的，任选地其中所述第一和第二多聚化结构域是免疫球蛋白的Fc区。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述多聚体是二聚体。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述二聚体是同二聚体。
90.根据实施方案80-89中任一项所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出降低的效应子功能的变体Fc区。
91.根据实施方案80-90中任一项所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1Fc区。
92.根据实施方案80-91中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含展现出与SEQ IDNO:37的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
93.根据实施方案80-92中任一项所述的方法，其中所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
95.根据实施方案93或实施方案94所述的方法，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
96.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。
97.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列。
98.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
99.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列。
100.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列。
101.根据实施方案93-95中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
102.根据实施方案1-101中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白降低所述受试者中的免疫应答。
103.根据实施方案1-16、26-41和56-102中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。
104.根据实施方案1-16、26-41和56-103中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是炎性肠病，任选克罗恩病或溃疡性结肠炎；移植；多发性硬化；哮喘；类风湿性关节炎；银屑病关节炎或银屑病。
105.根据实施方案104所述的方法，其中所述炎性肠病是慢性炎性肠病。
106.根据实施方案1-16、26-41和56-104中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。
107.根据实施方案1-16、26-41和56-104中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
108.根据实施方案1-16、26-41和56-105中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。
109.根据实施方案1-16、26-41和56-105中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是溃疡性结肠炎。
110.根据实施方案1-15、26-41和56-102中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是眼部炎性疾病、任选葡萄膜炎。
111.根据实施方案1-16、26-41和56-103中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
112.根据实施方案1-16、26-41和56-103中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。
113.根据实施方案1-16、26-41和56-103中任一项所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是移植物抗宿主病(GVHD)。
114.根据实施方案113所述的方法，其中所述GVHD是急性GVHD(aGVHD)。
115.根据实施方案113所述的方法，其中所述GVHD是慢性GVHD。
116.根据实施方案113-115中任一项所述的方法，其中所述GVHD是免疫抑制剂、任选皮质类固醇和/或环孢素抗性或难治性的。
117.根据实施方案1-114中任一项所述的方法，其中所述治疗方法包括预防性处理。
118.根据实施方案1-16、26-103、116和117中任一项所述的方法，其中在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作之前施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
119.根据实施方案1-16和26-118中任一项所述的方法，其中在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作的同时或之后施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
120.根据实施方案1-16、26-114和116-119中任一项所述的方法，其中在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作之前施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白，并且在所述炎性或自身免疫性疾病或病症发作的同时或之后施用至少一个剂量的所述ICOSL融合蛋白。
121.根据实施方案1-120中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
IX.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
ICOSL IgSF结构域变体的结合和活性的评估
选择具有与结合配偶体ICOSL、CD28和/或CTLA-4的改变的结合的变体ICOSL多肽。变体ICOSL多肽通过筛选基于含有如下ECD结构域的SEQ ID NO:1中所示的野生型人ICOSL序列产生的简并酵母展示文库来选择：
DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAAT
通过电穿孔将编码突变文库成员的载体DNA引入酵母感受态细胞中。将来自文库的酵母细胞解冻，然后在存在诱导培养基(5.4克Na2HPO4、8.56克NaH2PO4·H20、20克半乳糖、2.0克右旋糖、6.7克Difco酵母氮源基础和1.6克未补充亮氨酸的酵母合成缺陷型培养基溶解于水中并通过0.22μm膜过滤装置灭菌)的情况下生长，并使培养物在20℃下生长两天以诱导酵母细胞表面上文库蛋白的表达。用磁珠(新英格兰生物实验室，美国)处理细胞以减少非结合物并针对具有与其外源重组反结构蛋白结合的能力的ICOSL变体进行富集。靶配体蛋白来源于R&D Systems(美国)，如下：人rCD28.Fc(即重组CD28-Fc融合蛋白)、rCTLA4.Fc和rICOS.Fc。此后使用外源反结构蛋白染色进行两至三轮流式细胞术分选，以富集展示改善的结合物的酵母细胞部分。通过流式细胞术进行的磁珠富集和选择基本上如Miller,K.D.Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30,2008年7月中所述。
针对较高特异性结合亲和力测定来自流式细胞术分选的酵母输出。对分选输出酵母进行扩增和重诱导，以表达其编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。然后通过流式细胞术将此群体与亲代野生型酵母株系或在一些情况下其他选择的输出(如珠粒输出酵母群体)进行比较。
将选择的变体ICOSL ECD结构域进一步格式化为融合蛋白，并如下所述测试结合和功能活性。使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymo Research，美国)分离来自流式细胞术分选的每一输出细胞的质粒DNA。对于Fc融合物，使用具有适合于克隆至Fc融合载体中的添加的限制位点的PCR引物，由质粒DNA制剂(即用于突变体靶ECD的编码DNA的制剂)中批量扩增。在限制性消化后，将PCR产物连接至合适的Fc融合载体中，然后按供应商的指示化学转化至菌株大肠杆菌XL1蓝色(Agilent，美国)或NEB5α(新英格兰生物实验室，美国)中。将转化的样品的等分试样提交用于ECD插入物的DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。在一些情况下，进行重测序以验证突变。在分析Genewiz产生的DNA测序数据后，从主培养板回收目的克隆。然后使用以下准则鉴别所关注克隆：1.)相同克隆在比对中出现至少两次，和2.)突变在比对中出现至少两次，并且优选地出现在不同克隆中。满足这些准则中的至少一项的克隆是最可能由于改善的结合而通过分选过程被富集的克隆。
为了产生重组免疫调节蛋白(即含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的ICOSL的ECD的Fc融合蛋白)，生成编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：信号肽，接着是变体(突变体)ICOSL ECD，接着是三个丙氨酸的接头(AAA)，接着是含有关于SEQ ID NO:37所示的野生型人IgG1Fc的突变N82G(对应于依据EU编号的N297G)的人IgG1Fc。该示例性Fc还含有稳定半胱氨酸突变R77C和V87C以及依据EU编号在位置220处半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)(对应于关于SEQ ID NO:37中所示的野生型人IgG1Fc的位置5(C5S))(依据EU编号，分别对应于R292C、V302C和C220S)。在一些情况下，缺失促成AAA接头序列的NotI克隆位点以生成ICOSL ECD和Fc的起点的直接融合物。由于构建体不包括可与半胱氨酸形成共价键的任何抗体轻链，与SEQ ID NO:37中所述的野生型或未修饰的Fc相比，人类IgG1Fc还含有在位置5将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C5S)。
重组变体Fc融合蛋白是使用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(HEK)293细胞产生。使用高通量96孔蛋白质A纯化试剂盒，使用制造商的方案(目录号45202,Life Technologies，美国)，从上清液纯化蛋白质。示例性重组变体Fc融合蛋白的示意图示于图1A。
A.结合和功能表征
进行结合研究以评估ICOSL结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。对使用瞬时转染系统(Life Technologies，美国)产生以表达全长哺乳动物(人)表面配体CD28、ICOS或CTLA-4的转染的HEK293细胞进行结合研究。作为对照，还评估与模拟(未转染)细胞的结合。对于通过流式细胞术染色，将200,000个适当瞬时转染或阴性对照(模拟)的细胞铺板在96孔圆底板中，然后在染色缓冲液(PBS、磷酸盐缓冲盐水；1％BSA、牛血清白蛋白；和0.1％叠氮化钠)中孵育20分钟以阻断非特异性结合。将细胞重悬于50μL中含有100nM至1nM变体免疫调节蛋白的染色缓冲液中。使用Cell Quest Pro软件(BectonDickinson，美国)或Hypercyt流式细胞仪(Intellicyte，美国)计算每种转染子和阴性亲本系的平均荧光强度(MFI)。
也在抗CD3共固定化测定或人混合淋巴细胞反应(MLR)中对ECD ICOSL变体的生物活性进行了评估，对于MLR测定，将约10,000个成熟原代人树突状细胞与100,000个纯化的同种异体CD4+T细胞(BenTech Bio，美国)在存在ICOSL变体Fc融合蛋白和对照的情况下在96孔圆底板中在终体积为200μl的Ex-Vivo 15培养基中共培养。在第4-5天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)分析培养物上清液中的IFN-γ分泌。
对于抗CD3共固定化测定，将10nM小鼠抗人CD3(OKT3，Biolegends，美国)在具有40nM rICOSL.Fc变体蛋白的PBS中稀释。将该混合物添加至组织培养处理的平底96孔板(Corning，美国)中过夜，以促进刺激蛋白附着至所述板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从培养板上洗掉，并将100,000个纯化的人全T细胞(BenTech Bio，美国)或人T细胞克隆BC3(Astarte Biologics，美国)加入每个孔中至最终体积为200μl的离体15培养基(Lonza，瑞士)。在一些情况下，用0.25μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，ThermoFisher Scientific，美国)标记人全T细胞。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并用Duoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)测量人类IFN-γ水平。细胞增殖由进入分裂的输入细胞的百分比来确定，如在用荧光缀合的抗CD4、抗CD8抗体(BD，美国)染色的细胞上的CFSE稀释或通过总T细胞经由LSR II(BD，美国)上的流式细胞术分析测得。
表3描绘了选择的ICOSL IgSF结构域变体与细胞表达的反结构的结合和在抗CD3共固定化测定或MLR测定中的生物活性的示例性结果。表3所述的示例性氨基酸取代如下由对应于SEQ ID NO:1所示的相应参考(例如，未修饰的)ICOSL ECD序列的氨基酸位置编号来命名。氨基酸位置指示于中间，相应的未修饰(例如野生型)氨基酸列示于所述编号之前，并且所鉴别的变体氨基酸取代列示于所述编号之后。
表3中的结果描绘了通过平均荧光强度(MFI)值测量的对于每个变体Fc-融合分子与工程化以表达同源抗体结构配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应参考(例如，未修饰的)ECD-Fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比MFI的比率。还基于培养物上清液中IFN-γ的计算水平(pg/mL)显示变体Fc融合分子调节性T细胞活性的功能活性，所述IFN-γ的计算水平是用以下方式生成：i)用抗CD3共固定化的所指示变体ECD-Fc融合分子，或ii)MLR测定中的所指示变体ECD-Fc融合分子。该表还描绘了在两种功能测定中每种变体ECD-Fc产生的IFN-γ与相应的未修饰的(亲本)ECD-Fc的比率。
结果显示亲和力修饰的ICOSL IgSF结构域变体对至少一种同源反结构配体的改变的(包括增加的)结合亲和力和/或改善的免疫活性。所述选择导致鉴定了许多ICOSLIgSF结构域变体，所述ICOSL IgSF结构域变体经亲和力修饰以显示出对至少一种，并且在一些情况下多于一种同源反结构配体的增加的结合。由于与天然ICOSL对CD28的亲和力相比，天然ICOSL对ICOS的亲和力相对较高，因此每轮选择的增加的结合亲和力的差异比CD28结合的增加更小，后者初始结合的野生型ICOSL极差。对升高的CD28结合的选择也随之产生了升高的与CTLA4的结合，尽管事实上没有有利于这种相互作用的特定选择。这一观察结果表明选择了与CTLA4和CD28中负责结合ICOSL相关蛋白CD80和CD86的高度保守序列更有效地相互作用的变体。
Figure BDA0003407053080000961
Figure BDA0003407053080000971
Figure BDA0003407053080000981
Figure BDA0003407053080000991
B.具有突变的ICOSL蛋白结构
选择对ICOS和CD28二者均具有增加的亲和力的ICOSL变体(例如如表3所示)揭示了若干个氨基酸取代，这些氨基酸取代显现出在多个克隆中是保守的，并且显现出存在于ICOSL的ICOS/CD28结合IgV结构域中。为了进一步阐明这些残基的作用，将重复发生的突变映射到ICOSL的结构上。使用CD80-CTLA4X射线晶体结构(PDB 1D:1l8L)作为同源建模的模板使用SWISS-MODEL服务器对ICOSL-ICOS复合物的结构进行建模(Biasini等人,2014Nucleic Acids Res.42:p.W252-8)。ICOSL和ICOS的序列分别与CD80和CTLA4结构比对。两个模型是独立产生的：(1)ICOSL的同二聚体模型，以及(2)单个ICOSL单元与ICOS之间的结合的异质复合物。接着，通过使用PyMOL Molecular Graphics System将异质复合物的ICOSL叠加到同二聚体ICOSL模型的每个单体单元来构建完整的同源模型。这产生了与ICOS结合的完整ICOSL同二聚体，然后对其进行最后一轮能量最小化以使用Swiss-PDB查看器产生最终同源模型。
如图1B中所示，除了C198外，经常观察到的突变仅限于ICOSL的IgV结构域(CTLA4的位置作为ICOS的位置的代表参见左侧小图，并与右侧小图进行比较)。相比之下，在选择的变体中发现突变频率较低的残基分布在ICOSL IgV和IgC结构域中，且对IgC结构域有一些偏倚。这些结果与以下观察结果一致：IgV结构域中反复突变的残基影响ICOSL/ICOS界面，而IgC结构域中的突变在不同克隆中的频率较低，因此可能更有可能是非功能性“旁观者”突变，其是通过随机诱变产生的文库的产物。只有位置98处的反复突变影响与ICOS相互作用的预测ICOS位点的5埃以内的ICOSL氨基酸残基。ICOS结合位点的5埃以内的另一个突变残基在位置96处，并且在克隆中很少观察到。然而，残基96和98的接近表明残基96可能是另一个残基，其是结合界面的一部分。与此概念一致，在结构上与残基96和98等同的CD80残基是CTLA4的接触残基(Peach等人1994J Exp Med,180:2049-58)。在ICOSL中除位置96(也可能是位置98)以外的位置处的强选择突变预测不在所预测的ICOS结合界面中。不希望受理论束缚，结合界面之外的突变可以通过变构效应间接调节配体结合，如从建模结构预测的那样，所述变构效应通过IgV结构域传递并进入与ICOS的界面。值得注意的是，残基52预测会被糖基化，并且通过天冬酰胺的突变去除聚糖可能通过改变ICOSL三级结构来影响结合。
结果与强选择的突变直接或间接影响ICOS界面的观察结果一致。该界面类似于CD80/CTLA4界面(Chattopadhyay等人2006J Immunol,177:3920-9e)，其中CD80上的CD28结合表位与CTLA4结合表位重叠，并且两种配体利用相似的序列特征来接触CD80(Peach等人1994)。该结构/功能分析的结果确定了为什么改善的ICOS结合可能与改善的与CD28的结合相关，即使突变体是用ICOS-Fc或CD28-Fc作为选择剂来选择的。B.抗CD3共刺激测定中的细胞因子产生
进一步评估了上述示例性变体ECD ICOSL Fc融合分子在上述抗CD3共刺激(共固定化)生物活性测定中对细胞因子IL-17的刺激。将10nM培养板结合的抗CD3和40nM ICOSLFc变体蛋白的混合物与人T细胞一起培养。收集上清液并通过ELISA测定IL-17水平。测量了用所示变体ECD-Fc融合分子和用抗CD3共固定化的相应未修饰(亲本)ECD-Fc生成的培养物上清液中IL-17的量(pg/mL)。为了比较，该表中还示出了在与表3中所示对于示例性变体的相同测定中产生IFN-γ的结果。
结果示于表4中，该表描述了测定的上清液中的IL-17(pg/mL)以及每种变体ECD-Fc与相应的未修饰(野生型)的ECD-Fc所产生的IL-17的比(增加倍数)。示出了IFN-γ的类似结果。还显示了细胞产生的总IL-17或IFN-γ细胞因子百分比。结果表明，在共刺激测定中变体分子的亲和力修饰显示出改变的功能性T细胞活性以增加IL-17以及IFN-γ。
Figure BDA0003407053080001001
Figure BDA0003407053080001011
实施例2
ICOSL IgSF结构域变体的纯化和评估
纯化策略用于上述示例性候选命中。用表达构建体瞬时转染源自293细胞系(Expi293)的人细胞，并在细胞中表达ECD ICOSL Fc融合分子。然后通过亲和力色谱法(MabSelect SuRe)从具有蛋白A的上清液纯化Fc融合蛋白。然后在该初始纯化步骤之后进行制备型尺寸排阻色谱(SEC)步骤以进一步纯化蛋白质(Superdex200 16x60)。保留来自两个纯化步骤的样品并通过分析型SEC进行比较。在蛋白A纯化后测定蛋白质的浓度。还通过高效液相色谱(HPLC)上的分析型SEC来分析所得纯化蛋白质以评估纯度。
测定纯化样品中的主峰百分比，并与在初始蛋白A步骤(主峰Prot A池％)中纯化的蛋白质以及用蛋白A纯化的蛋白质进行比较，然后进行制备型SEC(主峰SEC池％，T＝D0)。如表5所示，另外的SEC步骤显著提高了纯化蛋白质的蛋白质纯度。为了进一步评估蛋白质的稳定性，将通过制备型SEC纯化的蛋白质在室温下放置24小时，然后通过HPLC评估主峰％(主峰SEC池％，T＝D24)并与D0样品比较。测定D0与D24的主峰％的变化(▲主峰SEC池％)。如表5中所示，此时大多数测试的示例性变体ECD ICOSL Fc融合分子显示出主峰％的少许变化，这表明发生了蛋白质变体的最小聚集。
Figure BDA0003407053080001012
Figure BDA0003407053080001021
实施例3
纯化的ICOSL IgSF结构域变体命中物的共刺激生物活性的评估
基本上如实施例1中所述通过MLR评估如实施例2中所述纯化的示例性ECD ICOSLFc融合分子的生物活性。在存在10nM抗CD3的情况下，将10nM或40nM ICOSL Fc变体蛋白的混合物过夜结合至96孔板。洗涤培养板并加入100,000个CFSE标记的全T细胞，持续96小时。收集上清液，并通过ELISA测量IFN-γ和IL-17水平。
通过用示例性测试变体(10nM和40nM ICOSL Fc)与抗CD3共刺激诱导的细胞因子分泌的结果示于图2A和图2B中，该图指示了ICOSL的ECD中的示例性IgSF结构域氨基酸取代(替代)。图2A和图2B中的条形图分别描绘了通过ELISA得到的在上清液中分泌的IFN-γ和IL-17的量(pg/mL)。用水平线表示与用WT ICOSL与抗CD3共刺激诱导的水平相比，用测试变体与抗CD3共刺激诱导的细胞因子释放水平。结果表明，变体分子的亲和力修饰显示出调节功能性T细胞活性(包括在共刺激测定中显著增加IFN-γ和IL-17分泌)的活性。对于一些变体观察到增加的免疫活性。
实施例4
纯化的ICOSL IgSF结构域变体命中物的增殖的评估
评估如实施例2中所述纯化的示例性变体ECD ICOSL Fc融合分子共刺激抗CD3诱导的T细胞增殖的能力。
用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记原代T细胞。在10nM抗CD3的存在下将10nM或40nM变体ECD ICOSL Fc或野生型ECD ICOSL蛋白的混合物过夜结合至96孔板，然后添加标记的T细胞并孵育3天。作为对照，还在结合的抗CD3和IgG或单独IgG存在的情况下评估增殖。对细胞进行CD4或CD8表面标志物染色，并通过流式细胞术评估CFSE稀释度来测定总T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。
对于在40nM和10nM ICOSL下测试的示例性变体的结果分别示于图3A和图3B。如图3A所示，几乎所有测试的变体ECD ICOSL Fc融合分子诱导了高于WT对照的增殖。如图3B所示，增殖的差异在10nM下更明显，某些变体即使在该较低浓度下也提供最大增殖。
实施例5
纯化的ICOSL IgSF结构域变体命中物的结合和活性的评估
使用基本上如实施例1中所述的方法评估如实施例2中所述纯化的示例性变体ECDICOSL Fc融合分子的结合和功能活性。
A.流式细胞术结合测定
将源自293细胞系(Expi293)的人细胞用CD28、CTLA-4或ICOS转染或用模拟物转染。然后将细胞与从100,000pM滴定至46pM的ECD ICOSL Fc融合分子或野生型ECD ICOSL-Fc分子一起孵育，并如实施例1中所述通过流式细胞术观察结合。通过流式细胞术评估结合，并使用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，美国)测定平均荧光强度(MFI)和对于信号呈阳性的细胞百分比(％)。测定产生半数最大MFI应答(MFI EC50)或阳性细胞％(％(+)EC50)的ICOSL-Fc浓度。
表6示出了结果。表6所述的ICOSL氨基酸取代如下由对应于SEQ ID NO:1所示的相应参考(例如，未修饰的)ICOSL ECD序列的氨基酸位置编号来命名。对于一些值(例如WT与CD28的结合)，不可能获得EC50，因此为了数据格式化目的，任意地选择1000000pM。类似于以上实施例1中所述的先前结合测定所获得的结果，观察到变体ICOSL ECD-Fc融合分子对至少一种同源反结构配体的结合亲和力改变。
Figure BDA0003407053080001031
B.ForteBio结合测定
使用ForteBio结合测定法进一步评估受体与ICOSL结构域变体免疫调节蛋白之间的蛋白质间相互作用。将ICOS、CD28和CTLA-4受体分别加载至抗人捕获传感器(ForteBioOctet AHC)上，并将野生型未修饰的ICOSL ECD-Fc融合分子、野生型PD-L2ED-Fc融合分子或变体ICOSL Fc-融合分子结合至4点滴定的受体。每次滴定全局地适合于计算每种蛋白质的缔合(kon)和解离(Kdis)。测定用变体ICOSL ECD-Fc融合分子测试的每种受体的抗人捕获传感器的加载响应。计算解离常数(KD)并与野生型比较以确定倍数提高值(提高倍数)。
表7示出了与ICOS的结合结果，表8示出了与CD28的结合结果，表9示出了与CTLA-4的结合结果。表7-9所述的示例性氨基酸取代如下由对应于SEQ ID NO:1所示的相应参考未修饰的ICOSL ECD序列的氨基酸位置编号来命名。
Figure BDA0003407053080001041
Figure BDA0003407053080001042
Figure BDA0003407053080001051
Figure BDA0003407053080001052
Figure BDA0003407053080001061
C.共固定化测定
在基本上如实施例1所述的抗CD3共固定化测定中测定ICOSL融合变体的共刺激生物活性。将约0.37nM、1.3nM或10nM小鼠抗人CD3(OKT3，Biolegend，美国)和10nM或40nM变体ICOSL ECD Fc或野生型ICOSL ECD-Fc稀释于PBS中。将该混合物加入组织培养物处理的平底96孔板以促进刺激蛋白附着至培养板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从培养板上洗掉，并向每个孔中加入100,000个纯化的人全T细胞。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并用ELISA试剂盒测量人IFN-γ水平。
表10示出了在抗CD3共固定化测定中各种条件下由细胞产生的IFN-γ(pg/mL)的量。在表中，示例性变体ECD ICOSL-Fc融合物的氨基酸取代由对应于SEQ ID NO:1中所示的未修饰的ICOSL ECD序列的氨基酸位置编号来命名。示出了在功能测定中在每种变体ICOSLECD-Fc的存在下产生的IFN-γ与在相应的未修饰(野生型)ECD-Fc的存在下产生的IFN-γ的比(倍数↑WT)。如所示，与野生型ICOSL相比，变体ICOSL-ECD-Fc分子的共刺激信号传导显著更高。
Figure BDA0003407053080001062
Figure BDA0003407053080001071
D.混合淋巴细胞反应用于评估生物反应性抑制
在基本上如实施例1中所述的混合淋巴细胞反应(MLR)中测定融合变体对T细胞活性的调节。将人单核细胞在IL-4和GM-CSF的存在下孵育6天，并在最后24小时用另外的LPS成熟为树突状细胞。每孔铺板1x104个树突状细胞和1x105个人CFSE标记的T细胞，并在PBS中稀释的三种不同浓度(40nM、13.3nM或4.4nM)的野生型或重组变体ICOSL ECD-Fc分子的存在下孵育4天。相同浓度的人IgG、PD-L2-Fc或贝拉西普(含有L104E和A29Y突变的CTLA4-Fc)用作对照。收获上清液并通过ELISA表征IFN-γ应答。
图4描绘了在各种条件下的IFN-γ产生。由水平线表示在野生型ICOSL的存在下由细胞产生的IFN-γ的水平。在阴性对照蛋白PD-L2-Fc的存在下未观察到对IFN-γ产生的抑制。相反，大多数测试的ICOSL变体在MLR中显示出一定程度的对IFN-γ产生的抑制。某些变体显示出对IFN-γ的显著抑制，即使在测试的4.4nM的最低浓度下，培养物中产生的IFN-γ也为非常低至不可检测。在4.4nM变体ECD ICOSL-Fc的变体的存在下MLR抑制百分比示于表11中。在该表中，负值表示测定中的炎症效应。
Figure BDA0003407053080001072
Figure BDA0003407053080001081
E.通过流式细胞术评估增殖和细胞内细胞因子标记物
来自如上所述的MLR研究的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的全T细胞已经在野生型或重组变体ICOSL ECD-Fc分子的存在下孵育4天，将该全T细胞在高尔基抑制剂(Golgi/Block/Plug)的存在下通过用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)/离子霉素再刺激6小时进一步测试细胞因子水平。还再刺激来自MLR研究的已与人IgG、抗CD28、抗ICOSL、PD-L2-Fc或贝拉西普(含有L104E和A29Y突变的CTLA4-Fc)一起孵育的T细胞。将T细胞针对CD4或CD8表面标志物进行染色、固定、透化处理以及针对如表12和表13所示的各种细胞因子进行细胞内染色。
对于特定细胞内细胞因子呈阳性的CD4+和CD8+T细胞的百分比(％)分别示于表12和表13中。结果表明，许多变体ICOSL ECD-Fc分子能够抑制一种或多种细胞因子，在一些情况下，包括大多数细胞因子。计算总得分和平均得分以评估测试的各个分子对该测定中检查的参数的总和效应。还评估了增殖，并且通过CFSE稀释测定的分裂细胞百分比也示于表12和表13中。在提供的结果中，结果表明某些变体显示出与贝拉西普可比或比贝拉西普更好的活性，特别是来自CD8+细胞的变体。
Figure BDA0003407053080001082
Figure BDA0003407053080001091
Figure BDA0003407053080001101
Figure BDA0003407053080001102
Figure BDA0003407053080001111
实施例6
B-T细胞共培养中的细胞因子产生的评估
从相同供体纯化B细胞和CD4+T细胞且用CSFE标记，并以1:1细胞比例铺板于96孔板中，每孔5×104个细胞。加入变体ICOSL ECD-Fc融合分子或贝拉西普，终浓度为每孔40nM。细胞未受刺激，或将细胞与100ng/mL的葡萄球菌B型肠毒素(SEB)、1μg/mL的商陆丝裂原(PWM)或二者一起在37℃下在200μl/孔的最终体积中孵育7天。
收获细胞并针对以下B和T细胞系标志物(IgM、IgD、CD38、CD138、CD27、CD19、CD4、CD3)进行表面染色。通过流式细胞术评估增殖，并使用LEGENDplex人Th细胞因子检测试剂盒(Biolegend，美国)分析培养物上清液的IL-5、IL-13或IL-21细胞因子。
如图5A所示，与无蛋白质对照相比，当在变体ICOSL ECD Fc融合分子的存在下孵育时，B/T细胞共培养物中分裂型B细胞的数量减少。测试的示例性变体的拮抗作用程度类似于CTLA-4-Ig贝拉西普(L104E，A29Y)。同样地，如图5B-图5D所示，与无蛋白质对照以及含有野生型ICOSL对照的培养物相比，变体ICOSL ECD Fc融合分子在体外抑制原代人B细胞/T细胞共培养物中的细胞因子产生。在一些情况下，与贝拉西普相比，示例性测试的变体ICOSL ECD Fc融合分子在阻断细胞因子产生方面更有效。
实施例7
移植物抗宿主病(GvHD)模型中的存活率和疾病活动的评估
评估示例性ICOSL变体ECD-Fc蛋白在移植物抗宿主病(GvHD)模型中的活性。照射(100rad)雌性NSG小鼠(每组n＝10)并在第-1天皮下施用10mg丙种球蛋白。在第0天，小鼠接受1000万个人外周血单核细胞(PBMC)并腹膜内注射给予100μgWT-ICOSL ECD Fc、变体ICOSL ECD Fc分子N52H/I143T(SEQ ID NO:61所示的ECD)、变体ICOSL ECD Fc分子N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:62所示的ECD)、75μg贝拉西普(CTLA-4-Ig L104E/A29Y；美国专利申请公开号US 20160271218)或盐水作为对照。在第15天，通过流式细胞术对移植的人CD45+细胞进行表型分析。在第35天终止研究后，评估存活率、体重减轻和疾病活动的终点测量结果。
图6A显示了用盐水、WT ICOSL-ECD Fc、变体ICOSL ECD-Fc分子或贝拉西普处理的GVHD小鼠的存活率。观察了与施用盐水或WT ICSOL ECD-Fc的小鼠相比，施用变体ICOSLECD-Fc N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:62所示的ECD)的小鼠的存活率的显著差异(根据Mantel-Cox和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验，p<0.0001)。图6B显示了在研究过程中用盐水、WT ICOSL ECD-Fc、变体ICOSL ECD-Fc分子或贝拉西普处理的小鼠的体重减轻之间的类似差异。
在研究期间每周测定三次疾病活动指数(DAI)，并评价小鼠的体重减轻、姿势、活动、毛发外观和皮肤的评分。研究过程中的疾病等级示于图6C中。接受ICOSL Fc变体N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:62所示的ECD)或贝拉西普的处理组显示出显著改善的DAI得分。还通过流式细胞术评估研究第14天外周血中人T细胞的百分比。对处理组的测量结果求平均值，且误差条表示平均值的标准误差(SEM)。图6D显示了血液中活CD3+/CD4+或CD3+/CD8+细胞的百分比。接受具有N52H/N57Y/Q100P的变体ICOSL ECD Fc(SEQ ID NO:62所示的ECD)或贝拉西普的处理组显示出与盐水处理组相比显著不同的CD4+T细胞水平(根据未配对t检验，分别为p＝0.008和0.006)。该研究表明了变体ICOSL Fc变体蛋白在体内建模期间对人原代T细胞和GVHD的治疗效果。
使用另外的变体ICOSL ECD-Fc融合分子进行了类似研究，包括变体ICOSL ECD-FcN52H/N57Y/Q100R/C198R(SEQ ID NO:63中所示的ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S(SEQ IDNO:64中所示的ECD)和N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:65中所示的ECD)。N52H/Q100R(SEQ IDNO:66中所示的ECD)，其在如上所示的体外ML R研究中的活性降低。如上所述处理NSG小鼠(n＝9/组)。在这项研究中，用ICOSL-Fc或贝拉西普给药从第0天持续到第37天每周3次，并且存活的小鼠在第49天终止。为了确定组间存活比例的统计差异，使用Mantel-Cox(对数秩)检验分析数据。所得存活率曲线示于图6E。与盐水和WT ICOSL-Fc相比，贝拉西普和ICOSL-Fc变体N52H/N57Y/Q100R/C198R(SEQ ID NO:63中所示的ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S(SEQ ID NO:64中所示的ECD)和N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:65中所示的ECD)显著延长了存活期(p<0.001)。针对实验的时间过程绘制平均DAI得分，其中在最后一个计划研究日(第49天)之前终止的那些组的最后一次观察(即在终止日收集的平均得分)在图上进行结转。使用针对“处理”效果的双因素重复测量方差分析确定随时间变化的数据(即DAI得分)组间显著差异。所得的DAI得分示于图6F。与盐水和WT ICOSL-Fc相比，贝拉西普和ICOSL-Fc变体N52H/N57Y/Q100R/C198R(SEQ ID NO:63中所示的ECD)、N52H/N57Y/Q100R/F172S(SEQ ID NO:64中所示的ECD)和N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:65中所示的ECD)显著降低了DAI得分(p<0.001)，并且在贝拉西普与具有N52H/N57Y/Q100R/C198R的ICOSL-Fc变体之间通过针对DAI得分的双因素方差分析(p＝0.035)。
在一些情况下，与用贝拉西普的处理相比，变体ICOSL-Fc的活性有所改善。ICOSL-Fc变体的施用在一定程度上保护免受GVHD的影响，如通过增加的存活率和减弱的疾病发展所证明的，所述程度与贝拉西普可比或更好。该模型中的活性与体外活性相关联，因为WTICOSL-Fc和具有突变N52H/Q100R(SEQ ID NO:66中所示的ECD)的变体ICOSL-Fc在该模型中不那么有效。
实施例8
评估体内迟发型超敏反应
在小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型中评估变体ICOSL ECD-Fc融合分子的体内抗炎活性。在卵白蛋白(OVA)致敏的小鼠中引发迟发型超敏免疫反应，并评估刺激后的应答。测试的变体ICOSL ECD-Fc融合分子含有具有以下氨基酸取代的变体ECD：N52H/N57Y/Q100P(SEQ ID NO:62所示的ECD)、N52H/Q100R(SEQ ID NO:66所示的ECD)或N52H/N57Y/Q100R/F172S(SEQ ID NO:64所示的ECD)。在有或没有G4S(GGGGS；SEQ ID NO:52)接头的情况下将变体与含有依据EU编号的突变C220S/L234A/L235E/G237A的Fc骨架(命名为Fc#1，如SEQ IDNO:40中所示)或含有根据EU编号的突变C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的Fc骨架(命名为Fc#2，如SEQ ID NO:44中所示)融合。表14示出了测试构建体：
Figure BDA0003407053080001131
为了致敏，在第0天，给8周龄雌性BALB/c小鼠在尾根部皮下注射在Sigma佐剂(100μL；目录S6322-1VL)中乳化的100μg OVA。在第1天和第4天，通过腹膜内注射向小鼠施用变体ICOSL ECD-Fc融合蛋白、75μg CTLA-4Fc(阿巴西普)或PBS作为阴性对照。在第7天，在OVA刺激前两至三小时，通过腹膜内注射向小鼠进一步施用PBS作为对照、75μg CTLA-4Fc(来自Orencia的阿巴西普)或指示的变体ICOSL多肽。将阿巴西普和变体ICOSL-Fc融合分子以摩尔当量给药。
对于OVA激发，在治疗处理后2-3小时，在气体异氟烷麻醉下在左耳耳廓中皮内注射10μL体积的PBS中的10μg OVA。在OVA激发之前测量基线耳厚度。
在第8天，使用Mitutoyo卡尺在异氟烷麻醉下测量耳厚度，并测定OVA激发前后耳厚度的变化。如图7所示，与PBS对照相比，用所示变体ICOSL ECD-Fc融合分子处理的小鼠显示出显著更小的OVA诱导的耳肿胀(通过单因素方差分析，<0.0001)。对于用阿巴西普处理的小鼠与用任何测试的所示变体ICOSL ECD-Fc融合分子处理的小鼠相比，耳厚度没有显著差异，或者变体ICOSL处理之间没有显著差异。这些结果表明变体ICOSL分子可以降低体内免疫应答。
实施例9
原代人T细胞的Nanostring转录特征
用10nM抗CD3与40nM Fc对照蛋白、野生型ICOSL-Fc、野生CD80-Fc、这两种蛋白或具有突变的变体ICOSL Fc融合蛋白包被组织培养板。然后将纯化的人T细胞铺板在蛋白质包被的培养板上并在37℃下孵育。在24、48和72小时收获来自上述每个处理组的培养物，并由每个细胞样品制备总RNA。将RNA转移至Nanostring，并使用Cancer Immune芯片定量每个样品中750个基因的转录物。使用Nanostring的专有软件对转录值进行归一化，从而比较处理组之间和不同时间点的转录水平。如图8和图9所示，与野生型CD80 ECD-Fc、野生型ICOSLECD-Fc或二者的组合相比，测试的变体ICOSL ECD-Fc多肽显示出改变的炎性活性。
实施例10
Fc融合免疫调节蛋白的产生和评估
除了使用各种接头和Fc分子之外，含有变体ICOSL IgSF(例如ECD)结构域的分子基本上如实施例1中所述被格式化为Fc融合蛋白。为了产生免疫调节蛋白，即含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的ICOSL ECD的Fc融合蛋白(例如变体ICOSL ECD-Fc)，产生编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：直接或经由接头间接与惰性人IgG1Fc连接的变体(突变体)ECD。具体地，产生的免疫调节蛋白不含有接头(无)或含有AAA或G4S(SEQ ID NO:52)接头。惰性人IgG1Fc含有如下依据EU编号的突变：C220S/R292C/N297G/V302C(SEQ ID NO:43)、C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K(SEQ ID NO:44)、C220S/L234A/L235E/G237A(SEQ ID NO:40)或其同种异型。包含替代C220S是因为所得蛋白质不包含可与半胱氨酸形成共价键的抗体轻链。重组变体Fc融合蛋白在293细胞中产生并且基本上如实施例1中所述用蛋白A纯化。
在结合研究中评估变体ICOSL Fc融合免疫调节蛋白，以评估对同源结合配偶体的结合。用同源结合配偶体、人CD28、ICOS和CTLA4转染的Expi293细胞用作结合研究中的靶细胞。测定变体ICOSL Fc融合免疫调节蛋白与表达每种结合配偶体的靶细胞的结合的MFI，并与相应的未修饰的(野生型)ICOSL ECD-Fc与相同靶细胞的结合进行比较。还基本上如实施例1中所述使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定变体ICOSL Fc融合免疫调节蛋白对T细胞活性的调节。
含有各种接头和Fc区的示例性变体ICOSL ECD-Fc融合免疫调节蛋白的结合结果示于表15。所述表指示了变体ICOSL的ECD中的氨基酸取代，其由对应于SEQ ID NO:1中所示的相应参考(例如，未修饰的)ICOSL胞外结构域(ECD)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号来命名。第2列指示Fc融合蛋白中使用的接头和接头的SEQ ID NO标识符。第3列示出了Fc中依据EU编号的突变以及包含在变体ICOSL Fc融合蛋白中的Fc的SEQ ID NO标识符。
如表15所示，在测试的变体ICOSL Fc融合蛋白之间观察到对于与同源结合配偶体结合的相似结果。这些结果表明，具有不同Fc分子或不同接头的Fc融合物的形式不影响ICOSL IgSF结构域变体与其同源结合配偶体的结合。另外，与不含氨基酸取代的参考(例如未修饰的或野生型)ECD-Fc分子相比，所有Fc融合形式当在MLR反应中作为溶液中的二价Fc分子提供时，展现出降低T细胞激活的拮抗剂活性。在一些情况下，在上清液中没有测量到可检测的IFN-γ，这与完全阻断共刺激配体同源结合配偶体与其配体的相互作用以诱导IFN-γ分泌一致。
Figure BDA0003407053080001141
Figure BDA0003407053080001151
Figure BDA0003407053080001161
实施例11
变体ICOSL分子在CHO细胞中的表达
作为如实施例2中所述在Expi293细胞中表达变体ICOSL Fc融合蛋白的替代方案，使用中国仓鼠卵巢细胞(ExpiCHO-S)细胞悬浮液来产生各种ICOSL分子。使用示例性变体ICOSL IgSF(例如ECD)Fc融合蛋白的DNA构建体转染细胞，所述融合蛋白包含与含有依据EU编号的突变C220S/L234A/L235E/G237A的SEQ ID NO:40中所示惰性Fc或SEQ ID NO:42中所示的其同种异型用GSGGGGS接头(SEQ ID NO:58)连接的变体(突变体)ECD N52H/N57Y/Q100R/F172S(SEQ ID NO:64)。
ExpiCHO-S细胞和使用ExpiCHOTM表达系统转染的试剂购自ThermoFisherScientific(目录号A29133)。将细胞解冻并按照制造商的推荐方案进行扩增。至少2次传代后，将细胞在转染前分裂24小时并使其扩增至高密度。然后将细胞稀释至用于转染的细胞数量，与ExpiFectamineTM CHO试剂形成DNA复合物并添加至细胞中。添加DNA复合物后一天，将ExpiCHOTM饲料和ExpiFectamineTM CHO增强剂添加至培养物中，然后将其置于32摄氏度的培养箱中。监测细胞活力和细胞质量，并且当活力低于80％时收获培养物。然后将培养物低速离心以去除细胞沉淀，并使澄清的上清液进行0.2μm无菌过滤。如实施例1中所述纯化蛋白质。
A.蛋白质分析
使纯化的变体ICOSL Fc融合蛋白在SDS-PAGE上跑胶并通过蛋白质染色进行分析。在由CHO细胞产生的细胞中观察到多个条带，但来自的293细胞的细胞中未观察到，这与在CHO细胞中表达时发生ICOSL的蛋白水解剪切的观察结果一致。表16描述了基于如通过SDS-PAGE观察到的氨基酸序列和潜在碳水化合物计算的完整、单剪和双剪蛋白质的分子量。观察到在ExpiCHO-S来源的细胞中表达的ICOSL Fc融合蛋白的蛋白水解，如具有较低分子量的还原/非还原剪切种类(单剪切和双剪切)的存在所示。根据观察到的条带大小和质谱分析，这些结果与ICOSL ECD中对应于序列LQQN/LT(“/”指示潜在切割位点)的潜在切割位点一致，从而导致在ECD的茎区之前切割以及在Fc融合蛋白的一个链或两个链中序列的Fc部分的去除。当在CHO细胞中产生时，观察到的蛋白酶切割可能会产生异质蛋白质产物。此外，对于表达为跨膜免疫调节蛋白的形式，在某些细胞中发生的蛋白酶切割可能导致从细胞释放可溶性蛋白质，从而减少工程化细胞上变体蛋白的细胞表面表达形式。
Figure BDA0003407053080001162
Figure BDA0003407053080001171
实施例12
含有ICOSL IgSF结构域的分子的蛋白水解抗性变体的产生
为了使变体ICOSL多肽在细胞(如CHO细胞)中表达时对蛋白水解具有抗性，产生了各种另外形式的变体ICOSL多肽。产生了ICOSL ECD的以下另外的修饰的参考序列：(1)缺乏全部或部分LQQN/LT蛋白酶切割位点的各种ECD截短(命名为截短#4、#5、#6、#7或#8)；(2)在关于SEQ ID NO:1中所示位置的切割位点N207和/或L208处含有突变的ICOSL变体参考序列；或包含作为分子唯一IgSF结构域的IgV结构域的ICOSL单独IgV参考序列(如SEQ ID NO:3中所示，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-122)。在一些情况下，在ICOSL ECD参考序列中采用了上述策略的组合。下表17示出了各种产生的参考序列。
将参考SEQ ID NO:1中所示的编号的示例性突变N52H/N57Y/Q100R/F172S引入各种参考序列中。因为SEQ ID NO:3中所示的参考ICOSL IgV不包含对应于F172S的位置，所以变体ICOSL IgV不包含突变F172S。产生的变体ICOSL多肽被格式化为Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含与含有依据EU编号的突变C220S/L234A/L235E/G237A/K447del的SEQ ID NO:39中所示的惰性Fc或SEQ ID NO:42中所示的其同种异型经由(G4S)2接头(SEQ ID NO:53)连接的产生的参考ICOSL IgSF结构域。
Figure BDA0003407053080001172
Figure BDA0003407053080001181
A.蛋白水解评估
将编码上述变体ICOSL Fc融合分子的DNA构建体转染至中国仓鼠卵巢细胞(ExpiCHO-S)中。然后如实施例2中所述通过亲和色谱从具有蛋白A的上清液纯化ICOSL Fc融合蛋白。通过分析型SEC分析纯化的蛋白质。
通过SEC，完整蛋白质显示为单峰，而剪切的蛋白质显示为多个峰，包括较低分子量种类。与实施例11中描述的SDS-PAGE结果一致，当变体ICOSL ECD Fc融合蛋白在ExpiCHO-S来源的细胞中表达时观察到通过SEC评估的蛋白水解，如图10A中所示的多个峰所指示的。如图10B-图10G中所示，通过对使用修饰的参考ICOSL多肽(其中推定的ECD蛋白酶切割位点被去除或发生突变)产生的变体ICOSL Fc融合蛋白的SEC分析观察到单峰，表明发生了减少的蛋白质切割。然而，在一个纯化批次中，通过对使用SEQ ID NO:9中所示的参考ICOSL多肽(截短#5)产生的变体ICOSL Fc融合蛋白的SEC分析观察到较低分子量种类，但尚不清楚该批次中存在这些种类的原因。如图10G中所示，通过对使用仅ICOSL IgV参考序列产生的变体ICOSL Fc-融合蛋白的SEC分析也未观察到较低分子量种类的产生以及因此未观察到蛋白水解。
B.结合和活性
比较了在CHO细胞中转染编码上述各种参考序列中的变体ICOSL Fc融合免疫调节蛋白的DNA构建体后产生和纯化的蛋白质的结合和活性。在一些情况下，下文评估的纯化的克隆后来发现含有上述突变之外的另外的突变，这些突变被认为不影响测试蛋白质的免疫调节活性。
基本上如上所述使用混合淋巴细胞反应(MLR)评估所得的纯化的变体ICOSL Fc融合免疫调节蛋白与同源结合配偶体的结合以及T细胞活性的调节。表18指示了ICOSL参考序列中的氨基酸取代，其由对应于SEQ ID NO:1中所示的相应参考(例如，未修饰的)ICOSL胞外结构域(ECD)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号来命名，并示出了每个ICOSL参考序列的SEQ ID NO标识符。如所示，所有测试形式的结合和MLR拮抗剂活性大体相似。
Figure BDA0003407053080001182
Figure BDA0003407053080001191
C.在293(Expi293)或CHO细胞中表达的蛋白质的结合和活性
评估基于上述ICOSL参考序列产生的变体ICOSL Fc融合蛋白在293(Expi293)或CHO细胞中表达后的结合和活性。另外，编码在如表19A中示出的示例性ICOSL参考序列中的示例性IgSF结构域ICOSL变体N52H/N57Y/Q100R/C198R或N52H/Q100R的DNA构建体还与含有依据EU编号的突变C220S/L234A/L235E/G237A的SEQ ID NO:40中所示惰性Fc连接，并且所述变体在用所述DNA构建体转染293或CHO细胞后产生和纯化。另外，示例性变体免疫调节蛋白作为单体产生，其中细胞用编码变体ICOSL ECD参考序列但不与Fc序列融合的DNA构建体转染。
基本上如上所述使用混合淋巴细胞反应(MLR)评估所得的纯化的变体ICOSL Fc融合蛋白或变体ICOSL单体与同源结合配偶体的结合以及T细胞活性的调节。表19A指示了变体ICOSL的参考序列中的氨基酸取代，其由对应于SEQ ID NO:1中所示的相应参考(例如，未修饰的)ICOSL胞外结构域(ECD)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号来命名，并示出了每个参考ICOSL序列的SEQ ID NO标识符。第3列指示用于产生ICOSL蛋白的细胞类型(ExpiCHO-S或Expi293)。如表19A所示，结果表明基本上相似的结合和活性，无论变体ICOSL免疫调节蛋白是否在CHO或293细胞中产生。
Figure BDA0003407053080001192
Figure BDA0003407053080001201
D.配体结合和阻断
使用表达CD28或ICOS的CHO细胞与固定量的用AlexaFluor-647标记的CD86或ICOSL并且在存在递增浓度(100pM至1,000,000pM)的野生型ICOSL-Fc、变体ICOSL IgV-Fc(含有如SEQ ID NO:36中所示的具有N52H/N57Y/Q100R的变体ICOSL IgV，其与例如含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A的惰性Fc(例如SEQ ID NO:42中所示)融合)、或出于比较仅CD28抑制剂、阿巴西普、ICOS途径抑制剂、普瑞鲁单抗(AMG-557；抗ICOSL，CreativeBiolabs)或贝拉西普的情况下一起孵育来评估配体结合。结合的蛋白质用抗人IgG-PE进行检测并通过流式细胞术来测量(图10H)，其显示变体ICOSL IgV-Fc对CD28和ICOS二者的高靶结合，但对照蛋白质并非如此。配体结合的IC50示于表19B.1。证实变体ICOSL IgV-Fc阻断配体与靶受体CD28和ICOS二者的结合，如通过流式细胞术和用Graphpad Prism测定的IC50水平所测量的(图10I)。
为了评估对共刺激活性的作用，将来自健康供体和来自患有舍格伦综合征(SjS)的受试者的PBMC用人工抗原呈递细胞(表达CD80、CD86、ICOS配体和抗CD3(OKT3)的K562细胞)以20:1的细胞与人工APC比率在存在100nM变体ICOSL IgV-Fc或出于比较仅CD28抑制剂、阿巴西普、ICOS途径抑制剂、普瑞鲁单抗(AMG-557；抗ICOSL，Creative Biolabs)或阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合的情况下进行刺激。单独Fc用作对照。
为了评价对CD28共刺激活性的影响，将表达源自IL-2启动子(Promega)的IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat效应细胞与表达抗CD3OKT3+人CD86的人工APC(aAPC)共培养(CD28共刺激阻断)。为了评价对ICOS共刺激活性的作用，将Jurkat/IL-2报告细胞进一步用人ICOS的胞外结构域和CD28的细胞内结构域转导，并与表达抗CD3OKT3+人ICOSL(ICOS共刺激阻断)的aAPC共培养。将滴定量(100pM至1,000,000pM)的变体ICOSL IgV-Fc添加至共培养物中。为了比较对CD28共刺激活性的阻断作用，添加了阿巴西普或贝拉西普作为对照。为了比较对ICOS共刺激活性的阻断作用，添加了普瑞鲁单抗作为对照。通过在孵育开始后监测相对发光信号来评估共刺激活性。如图10J中所示，变体ICOSL IgV-Fc阻断CD28和ICOS二者共刺激。
Figure BDA0003407053080001211
E.靶结合的比较
跨越不同物种评估了示例性变体ICOSL vIgD-Fc融合分子的靶结合，所述融合分子含有具有N52H/N57Y/Q100R的如SEQ ID NO:36中所示的变体ICOSL IgV，其与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、G235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合。基本上如实施例1中所述评估在产生以表达来自人、食蟹猴、大鼠或小鼠的全长表面配体CD28、ICOS或CTLA-4的转染的HEK293细胞上的结合。使用瞬时转染系统(Life Technologies，美国)进行转染。作为对照，还评估与模拟(未转染)细胞的结合。结果示于表19B.2。如所示，示例性变体ICOSL vIgD-Fc融合分子展现出以高亲和力与人ICOS和CD28二者结合。对食蟹猴观察到了可比的结合，但观察到对啮齿动物对应物的较低亲和力。关于CTLA-4结合，食蟹猴和大鼠与人是可比的，而小鼠具有较低亲和力。相比之下，野生型ICOSL-Fc展现出可检测的与ICOS的结合，但观察到很少的可检测或可定量的与CD28的结合(数据未显示)。
Figure BDA0003407053080001212
实施例13
在CIA模型中ICOSL IgV-Fc融合分子的给药和体内作用的评估
在使用预防性或治疗性给药的胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中，评估变体ICOSL IgV-Fc融合分子的抗炎活性。变体ICOSL IgV-Fc融合分子在疾病发作之前或刚好在疾病发作之后给药最多4次。所测试的变体ICOSL IgV-Fc融合分子含有具有N52H/N57Y/Q100P(如SEQ ID NO:67中所示)或N52H/N57Y/Q100R(如SEQ ID NO:36中所示)的变体ICOSLIgV，其与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合。
为了诱导关节炎症，在第-18或-21天向小鼠尾部注射小鸡或牛胶原蛋白II/CFA乳液，并在第0天注射小鸡或牛胶原蛋白II/IFA乳液(“加强”)。对于预防性给药，在疾病发作之前从加强当天开始，以四个剂量向小鼠给药变体ICOSL IgV-Fc融合分子(N52H/N57Y/Q100P)。对于治疗性/延迟处理，当观察到的爪得分大于一时，小鼠开始用变体ICOSL IgV-Fc融合分子(N52H/N57Y/Q100R)给药，并且每两天给药一次，总共四个剂量。作为对照，还测试了仅Fc分子和CTLA-4-Fc(阿巴西普)分子。测定了基于发红或肿胀的爪得分。还收集血清以测量抗胶原蛋白(CII IgG)抗体以及IL-6和TNFα促炎性细胞因子。收集来自引流淋巴结的细胞，对CD4、CD8、CD44或T滤泡辅助(TFH)细胞标记物(CD25-CD4+PD-1+CXCR5+)进行染色。图11A-图11D显示了预防性给药的结果。在预防性给药处理中用变体ICOSL IgV-Fc融合分子处理的小鼠在类风湿性关节炎的CIA小鼠模型中显示出抑制的疾病，如较低的平均总爪得分(图11A)和减小的检测到的CII IgG(图11B)所示。ICOSL IgV-Fc相比于阿巴西普，*p<0.05；ICOSL IgV-Fc相比于PBS，**p<0.001(通过双因素重复测量方差分析)。与Fc对照相比，还观察到在用变体ICOSL IgV-Fc融合分子处理的小鼠中较低水平的血清细胞因子(图11C)和CD44+激活的T细胞或TFH细胞(图11D)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(通过单因素方差分析)。在ICOSL IgV-Fc处理组相比于Fc对照组中，引流淋巴结中B细胞的分数也显著降低(p<0.05)(图11E)。
图12A-图12D显示了延迟给药的结果。与包括阿巴西普对照在内的其他组相比，变体ICOSL-IgV Fc导致最低的平均总爪得分(图12A)和最大的体重变化百分比(图12B)。如图12C和图12D所示，在用变体ICOS IgV-Fc处理的小鼠的治疗性CIA模型中，血清细胞因子也受到抑制。组间统计显著性：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，通过学生未配对t检验。在图12C和图12D中，水平虚线指示每种细胞因子的测定定量下限(LLOQ)。
总之，这些数据证明CD28和ICOS途径在炎性关节炎中起重要作用。特别地，变体ICOSL双重CD28/ICOS拮抗剂的优异活性与如下观察结果一致，即两种途径的阻断是必要的，并且通过单个途径阻断仅实现部分益处。
实施例14
ICOSL IgV-Fc融合分子在EAE模型中的体内作用的评估
评估了变体ICOSL IgV-Fc融合分子在过继转移实验性自身免疫性脑膜炎(EAE)模型中的抗炎活性。测试的变体ICOSL IgV-Fc融合分子含有变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)，其与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A)融合。
向雌性C57BL/6小鼠皮下注射MOG35-55/CFA乳液。11天后，获得脾细胞并用MOG35-55肽、IL-12和抗IFNγ培养。培养后三天，经由腹膜内注射(第0天)递送致脑炎T细胞。从第0天开始，小鼠每隔一天用变体ICOSL IgV-Fc融合分子给药，总共五个剂量。作为对照，还测试了仅Fc分子和CTLA-4-Fc分子(阿巴西普)。在注射T细胞后20天，对小鼠进行称重、监测并评估如表20所述的EAE得分。在研究结束时，收集血清以分析促炎性细胞因子，并收集来自引流淋巴结的细胞以供流式细胞术分析。
Figure BDA0003407053080001221
Figure BDA0003407053080001231
如图13A所示，用变体ICOSL IgV-FC融合分子处理小鼠抑制了EAE小鼠模型中的疾病，如通过较低的EAE得分所示，通过单因素方差分析曲线下面积(AUC)，*p<0.0001；变体ICOSL IgV-Fc融合分子相比于对照。图13B显示了随时间的平均体重的变化。
对于腹股沟淋巴结T细胞的流式细胞术分析，用活性染料染色细胞，并用抗CD44、抗CD62L、抗CD4、抗CD8抗体进行分析，并评估活的初始(CD62L+CD44-)和T效应记忆(Tem)(CD62L-CD44+)CD4+和CD8+T细胞的百分比。如图13C所示，用变体ICOSL IgV-Fc融合分子处理减少了CD4+和CD8+Tem细胞(****p<0.0001；***p<0.001，通过单因素方差分析)。
在第0天(第一个剂量后2小时)和第6天(第4个剂量前1小时)评估血清细胞因子。如图13D所示，测试变体ICOSL IgV-Fc融合分子导致在第0天减少血清中的促炎性细胞因子，包括IL-5、IL-10、IL-12P70和TNFα。与Fc对照相比，在第6天，通过用变体ICOSL IgV-Fc融合分子处理，降低了IFN-γ和IL-6的血清水平。
实施例15
移植物抗宿主病(GvHD)模型中变体ICOSL-IgV Fc的剂量范围研究
在移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型中用20、100或500μg的变体ICOSL IgV-Fc分子进行剂量范围研究，所述分子含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)。将变体ICOSL IgV-Fc分子的活性与贝拉西普(CTLA-4-FcL104E/A29Y；美国专利申请公开号US2016/0271218)进行比较。
向雌性NSG小鼠(第1组每组n＝5，未处理；第2-7处理组每组n＝10)皮下施用10mg丙种球蛋白，然后在第-1天进行辐照(100cGy/rad)。在第0天(辐照后24小时内)，第2-7组的小鼠用表21中所示的测试品给药，然后所有小鼠在给药后经由尾静脉接受IV注射1x107个人PBMC。
通过在研究期间每周评价小鼠三次并根据小鼠的体重减轻、姿势、活动、毛皮和皮肤外观对疾病进行评分来测定疾病活动指数(DAI)。在第42天终止研究后，评估存活率、体重减轻和疾病活动的终点测量结果。生成代表存活至研究终点的动物百分比的Kaplan-Meier存活率图，并通过Mantel-Cox和Gehan-Breslow-Wilcox检验(95％CI)分析存活率曲线比较。在研究结束时(第42天)从存活小鼠收集血液/血清样品，并通过流式细胞术评估细胞的T细胞标记物，包括小鼠或人标记物即CD4、CD8、CD28、ICOS，激活或耗尽标记物(PD-1、Ki67)以及FoxP3(Treg的标记物)。还评估了血清促炎性细胞因子(例如IFN-γ、IL-10、IL-12(p70)、IL-17A、IL-4、IL-5和TNFα)的水平。
Figure BDA0003407053080001232
Figure BDA0003407053080001241
图14A-图14B显示了按照每个给药方案处理的GVHD小鼠的存活率和DAI得分。如所示，与用贝拉西普处理的小鼠相比，所有测试的剂量水平下的测试变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)显著增强了存活率(图14A)并降低了疾病得分(图14B)(即在第42天，分别为100％相比于40％存活率；p<0.01，通过Mantel-Cox对数秩检验)。值得注意的是，变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)的单一剂量(100μg)施用导致与重复给药100μg贝拉西普相似的疾病保护。
研究结束时收集的血液的流式细胞术分析证明，测试的变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)有效抑制了转移的人T细胞的扩增，如通过降低的人细胞/小鼠细胞比率(图15A)和极大降低的总T细胞计数(图15B)所观察到的。如图15C-图15F所示，在针对ICOS(图15C-图15D)和CD28(图15E-图15F)共染色的CD4+和CD8+T细胞的研究结束时收集的血液的流式细胞术染色证明，在用变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理的组中基本上无染色，但在贝拉西普处理的小鼠中容易地检测到表达ICOS的CD4+和CD8+T细胞。这些结果与ICOSL IgV-Fc处理的小鼠中缺乏T细胞是一致的，并且也与变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)结合其靶分子CD28和ICOS并阻断其被流式细胞术抗体检测到的能力是一致的。变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)在少数剩余的人T细胞上的结合通过使用抗人IgG Fc的检测来证实。值得注意的是，虽然大多数转移的人T细胞最初表达CD28且仅10％-20％是ICOS+，但在研究终止/结束时，盐水或贝拉西普处理的小鼠中剩余的激活的T细胞中>80％呈ICOS+。
在用变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理的组中，T细胞的激活或耗尽标记物的存在也受到抑制，如通过CD4+和CD8+T细胞中PD1的较低表达以及CD4+T细胞中减少的Ki67表达所证明(图16A-图16B)。与贝拉西普相比，效应T细胞与Treg的比率在用变体ICOSLIgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理的组中保持稳定(图16C)。与贝拉西普相比，用变体ICOSLIgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理的组中血清促炎性细胞因子也受到抑制(图17A-图17D)。
还进行了药代动力学(PK)分析以监测变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)的血清暴露。使用定量PK ELISA，利用抗人ICOSL mAb捕获抗体和Fc特异性小鼠抗人IgG作为检测试剂来测量小鼠血清样品中的测试品浓度。
在单独的研究中确定，在GVHD模型中观察到的变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)的血清暴露比正常小鼠的所述血清暴露低45％(图17E)。GVHD模型中变体ICOSLIgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)的较长终末半衰期可能是由于在GVHD中的后期时间点减少的靶标(CD28，ICOS)(因为人T细胞消失)导致的和/或由于正常小鼠中抗药抗体(ADA)形成导致的，这可能干扰药物暴露。与正常小鼠相比，变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)具有较低血清暴露的观察结果可能是由于GVHD模型中的靶介导的药物处置(TMDD)(即，与小鼠直系同源物相比，其对于人CD28和ICOS的较高亲和力)和/或在该模型中使用的NOD/SCID(NSG)小鼠中缺乏FcRn。
总之，这些结果与如下观察结果一致，即变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)即使仅用单一剂量也展现出有效的拮抗剂活性，并且活性优于贝拉西普。这一观察结果可能归因于变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)展现出对ICOS+T细胞的优异控制，所述细胞原本逃脱了单一ICOS或CD28途径阻断，例如使用CD28途径拮抗剂贝拉西普实现的阻断。
实施例16
CD4+CD45RB高诱导的结肠炎模型中ICOSL-IgV Fc变体的评估
评价了含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ IDNO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc对CD4+CD45RB高诱导的结肠炎模型中疾病发展的作用。
CD4+CD45RB高供体细胞是通过从15只雄性BALB/C供体小鼠获得的脾细胞悬浮液进行阴性选择而富集。在第0天，将30万个CD4+CD25-CD45RB高(Treg耗尽)供体细胞静脉内注射到免疫缺陷C.B17(SCID)小鼠(每组n＝12或21)以诱导结肠炎。作为对照，将30万个CD4+细胞(含有Treg细胞)注射到SCID小鼠接受者(n＝12)中，所述细胞在该模型中不诱导结肠炎的发展。在细胞转移当天，每组中的小鼠用变体ICOSL-IgV Fc或仅Fc或媒介物对照给药。表22总结了测试组的处理方案。
Figure BDA0003407053080001251
评价体重(从第0天开始采集)和大便硬度得分(从第10天开始采集)，每周三次。从体重和大便得分计算每日疾病活动指数(DAI)。在第42天研究结束后，收集结肠用于长度和重量的测定以及组织学分析。使用双尾学生t检验评估变体ICOSL-IgV Fc处理组与媒介物组的最终体重和最终结肠重量和长度的统计分析。使用Wilcoxon非参数T检验比较大便得分和DAI得分。
DAI结果示于表23(DAI)和图18A，结肠测量结果示于表24，并且结肠组织学结果示于表25和图18B。如所示，测试变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)在该模型中展现出显著减少的结肠炎发展，这与这种双重CD28/ICOS拮抗剂有效治疗炎性肠病(IBD)的效用一致。
Figure BDA0003407053080001252
Figure BDA0003407053080001261
^与未诱导结肠炎/媒介物相比
*与媒介物相比
～与Fc对照，300μg相比
Figure BDA0003407053080001262
～与Fc对照，300μg相比
*与媒介物相比
～与Fc对照，300μg相比
Figure BDA0003407053080001263
Figure BDA0003407053080001271
Figure BDA0003407053080001281
实施例17
ICOSL IgV-fc融合蛋白毒理学和毒物动力学特征的体内评估
在4-5周的时间内以重复剂量静脉内(IV)或皮下(SC)注射示例性ICOSL IgV-Fc融合蛋白的大鼠和食蟹猴中评价毒理学和毒物动力学特征(TK)。还监测了4个月内动物的恢复。
示例性重组ICOSL vIgD-Fc融合蛋白基本上如实施例11中所述从悬浮液适应的中国仓鼠卵巢细胞(ExpiCHO-S)细胞产生。用编码示例性变体ICOSL vIgD-Fc融合分子的DNA构建体转染ExpiCHO-S细胞，所述融合分子含有具有N52H/N57Y/Q100P(如SEQ ID NO:67中所示)或N52H/N57Y/Q100R(如SEQ ID NO:36中所示)的变体ICOSL IgV，其与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合。
向Sprague-Dawley大鼠每周一次以10、100或200mg/kg皮下(SC)或以200mg/kg通过静脉内(IV)推注施用示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白，持续一个月(5个剂量，例如第1、8、15、22和29天)，接着是4个月恢复期。
向食蟹猴每周一次以10、100或150mg/kg SC或150mg/kg IV推注施用示例性ICOSLvIgD-Fc融合蛋白，持续一个月(5个剂量，例如第1、8、15、22和29天)，接着是4个月恢复期。
对包括临床体征(如由笼侧、详细和给药后观察结果确定的)、体重、定性食物评价、临床病理学参数(血液学、凝血、临床化学和尿分析)、肉眼尸检发现、器官重量和组织病理学检查在内的标准毒理学评估以及毒物动力学(TK)评价和抗体分析进行评价，直到给药期结束(第30天)。在食蟹猴中，另外的评估包括眼科检查、心电图、流式细胞术免疫表型分型、离体葡萄球菌B型肠毒素(SEB)和血清细胞因子分析测定。毒物动力学(TK)参数(如Tmax、Cmax、AUC0-7d和t1/2)使用非隔室分析方法进行估计。
A.Sprague Dawley大鼠
在Sprague Dawley大鼠的研究中，每周一次以100和200mg/kg SC和200mg/kg IV推注施用后，暴露维持到第30天(表26)。在10mg/kg剂量水平下，在许多动物中重复给药后，ICOSL vIgD-Fc融合蛋白暴露减少或消失。SC给药后，基于平均Cmax和AUC0-7天的ICOSLvIgD-Fc融合蛋白暴露在10、100和200mg/kg剂量水平之间以小于成剂量比例的方式增加。200mg/kg剂量水平下的生物利用度为约18％。第22天平均ARCmax和ARAUC值范围为0.856至1.52。每周重复一次SC和IV给药的情况下，几乎没有观察到ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的积累。在可以测量的情况下，在给药间隔内ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的估计t1/2为约1至3天。
ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的施用在所有剂量水平下均具有良好耐受性。我们没有观察到与ICOSL vIgD-Fc融合蛋白相关的体征或体重、定量食物消耗、眼科或器官重量的变化。相关发现包括在所有剂量水平下淋巴结中淋巴细胞的细胞性减少，这与预期的药理学一致；以及轻度的、非不利的注射部位变化(变红症、显微镜检出血、混合细胞浸润)。注意到轻度、短暂和非不利的临床病理学变化，包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和大的未染色细胞、胆红素和纤维蛋白原的微小增加；以及白蛋白的微小减少。注意到微小减少的尿量和增加的尿比重，但没有临床化学或显微镜检相关性。
无明显损害作用水平(NOAEL)被确定为在200mg/kg SC和IV ICOSL vIgD-Fc融合蛋白下评价的最高剂量，分别对应于219μg·天/mL的AUC0-7d和53.4μg/mL的Cmax；以及1250μg·h/mL的AUC0-7d以及4120μg/mL的Cmax。
Figure BDA0003407053080001291
B.食蟹猴
在食蟹猴的研究中，每周一次以10mg/kg、100和150mg/kg SC和150mg/kg IV推注施用后，暴露维持到第30天(表27)。SC施用后，基于平均最大观察浓度的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白暴露在10、100和150mg/kg剂量之间以成近似剂量比例的方式增加。平均Cmax值以1:9.33:16.8的比率增加，平均AUC0-7天值以1:7.36:10.4的比率增加。150mg/kg下的SC生物利用度为约39％。在每周重复一次SC或IV给药的情况下，几乎没有积累。对于所有剂量水平，在给药间隔内ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的估计表观终末消除半衰期(t1/2)为约2天。
在食蟹猴中，所有动物都存活直到研究第30天的预定尸检。ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的施用在所有剂量水平下均具有良好耐受性。ICOSL vIgD-Fc融合蛋白相关变化包括在所有剂量下淋巴结和脾脏中减少的淋巴细胞细胞性，这在一些动物中与减少的脾脏重量相关。未观察到对死亡、临床观察结果、体重、食物消耗、眼科检查、心电学、生命体征、临床病理参数、宏观评价或血清细胞因子(IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12/23(p40)、IL-13、IL-17A、MCP-1、MIP-1β、IFN-γ、TNF-α、G-CSF和GM-CSF)的其他与ICOSLvIgD-Fc融合蛋白相关的影响。
NOAEL被认为是评价的最高剂量，即150mg/kg SC和IV，分别对应于480μg·h/mL的AUC0-7d和204μg/mL的Cmax；以及1320μg·h/mL的AUC0-7d和3040μg/mL的Cmax。
Figure BDA0003407053080001301
C.总结
总之，这些数据与血清浓度随时间的双相消除曲线一致，这与单克隆抗体或抗体样药物的曲线一致。
实施例18
通过人药代动力学建模确定ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的剂量和处理
含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的如SEQ ID NO:36中所示的N52H/N57Y/Q100R的示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的人药代动力学模型(PK)是基于来自如实施例17中所述的食蟹猴研究和SpragueDawley大鼠研究的建模PK数据和异速比例构建的。假设不同剂量水平的线性PK以预测人暴露。选择的剂量水平是基于ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的体外结合数据建模的，所述数据与CD28受体占有率与免疫抑制活性正相关的观察结果一致。
A.PK建模
基于在Cmax下26％的预测靶饱和度(其在给药后24小时迅速降低至低于10％)确定0.001mg/kg的较低起始剂量水平为最低预期生物效应水平(MABEL)。通过比较在食蟹猴中150mg/kg和在大鼠中200mg/kg的NOAEL剂量下的暴露基于安全边际量，最大剂量水平被确定为10mg/kg。所预测的在10mg/mkg IV剂量下的人Cmax和AUC被预测为比在食蟹猴NOAEL剂量150mg/kg下观察到的Cmax和AUC低9倍和18倍。所预测的在10mg/kg IV下的人Cmax和AUC被预测为比在大鼠NOAEL剂量200mg/kg下观察到的Cmax和AUC低9倍和26倍。
表28示出了在单一剂量的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白后的预测的靶饱和度。表29示出了在单一IV剂量的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白后的预测的人暴露和安全边际量。在假设生物利用度为70％的情况下，SC剂量(单一剂量和多个剂量)的靶饱和度和预测暴露被预测为在IV剂量水平的范围内。
Figure BDA0003407053080001302
Figure BDA0003407053080001311
a.靶饱和度是基于人CD28结合亲和力EC50＝648pM(52ng/mL)来计算的。
b.预测PK和靶饱和度是基于30min内IV输注。
EC50-50％有效浓度
Figure BDA0003407053080001312
1.作为保守方法，假设线性PK用于预测人暴露
2.食蟹猴NOAEL(150mg/kg IV，每周一次，持续1个月)：AUC0-7d＝1310μg·天/mL,Cmax＝2950μg/mL
3.大鼠NOAEL(200mg/kg IV，每周一次，持续1个月)：AUC0-7d＝1250μg·天/mL,Cmax＝4120μg/mL缩写：NOAEL-无明显损害作用水平；AUC-曲线下面积；AUC0-7d-从第零至7天的曲线下面积；Cmax-观察到的最大药物浓度
B.人给药
考虑到如上所述的CD28靶饱和度和NOAEL安全边际量的示例性人单一递增剂量(SAD)和多个递增剂量(MAD)被设计用于向人受试者进行静脉内和皮下施用。将向人受试者施用1和6mg/kg的两种单一SC剂量，以检查SC给药的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白在人体中的吸收。
在单一递增剂量方案中，根据表30中例示的给药方案，将向人受试者以单一剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用含有与惰性Fc(例如含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的如SEQ ID NO:36中所示的N52H/N57Y/Q100R的示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白或安慰剂。在高于1mg/kg的剂量水平下，添加单一SC剂量的钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)以评估示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白对免疫应答的影响。
Figure BDA0003407053080001321
对于多个递增剂量方案，受试者将接受4个每周一次剂量的安慰剂或示例性ICOSLvIgD-Fc融合蛋白，持续4周(总共4个剂量)，如表31中所概括。建议在第2天使用单一剂量的KLH以评估示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白对免疫应答的影响。
Figure BDA0003407053080001322
实施例19
在结缔组织疾病的模型例如舍格伦综合征模型中评估变体ICOSL-IgV Fc
在评估潜藏在舍格伦综合征(SjS)和其他结缔组织病(包括系统性红斑狼疮(SLE))之下的效应子机制的模型中，评估含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc的活性。
A.PBMC刺激测定
对于体外原代细胞测定，将来自健康供体和来自患有SjS的受试者的PBMC用人工抗原呈递细胞(表达CD80、CD86、ICOS配体和抗CD3(OKT3)的K562细胞)以20:1的细胞与人工APC比率在存在100nM变体ICOSL IgV-Fc或出于比较仅CD28抑制剂、阿巴西普、ICOS途径抑制剂、普瑞鲁单抗(AMG-557；抗ICOSL，Creative Biolabs)或阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合的情况下进行刺激。单独Fc用作对照。孵育48小时后收集上清液，并测定促炎性细胞因子(包括IFN-γ和IL-2)的产生。与阿巴西普、普瑞鲁单抗或阿巴西普+普瑞鲁单抗组合相比，变体ICOSL IgV-Fc显示出对从受刺激的健康供体或SjS患者PBMC释放促炎性细胞因子(例如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17A、GM-CSF)的优越抑制。IL-2应答的示例性结果示于图19A(SjS PBMC)和图19B(健康供体)，并且IFN-γ应答的示例性结果示于图19C(SjSPBMC)和图19D(健康供体)。如图19E(IFN-γ)和图19F(IL-2)所示，匹配供体的结果表明，变体ICOSL IgV-Fc始终比阿巴西普更大程度地抑制细胞因子产生。
在上述类似的研究中，将来自健康供体和患有SjS或SLE的受试者的PBMC在一般如上描述的条件下(包括在存在100nM的变体ICOSL IgV-Fc或出于比较仅CD28抑制剂阿巴西普、ICOS途径抑制剂普瑞鲁单抗或阿巴西普+普瑞鲁单抗的组合的情况下)用人工抗原呈递细胞(表达CD80、CD86、ICOS配体和抗CD3(OKT3)的K562细胞)刺激，并测定促炎性细胞因子(包括IFN-γ、IL-6和IL-17A)的产生。IFN-γ、IL-6和IL-17A应答的示例性结果示于图19G，但对于所有测量的细胞因子观察到相似的趋势(图19H和图19I，健康供体PBMC示于图19H和图19I的右侧小图中)。总之，对于测试的大多数供体和分析物而言，结果显示出与普瑞鲁单抗、阿巴西普或普瑞鲁单抗+阿巴西普的组合相比的显著优越性。总之，结果表明变体ICOSLIgV-Fc比单一CD28或ICOS途径抑制剂更有效地抑制在体外从人SjS和SLE患者PBMC产生细胞因子。
从在上述测定中产生的患者PBMC样品分离RNA，并评估基因表达。为了比较，还从患有银屑病关节炎(PsA；参见实施例20)的患者的PBMC样品分离RNA。在SjS、SLE和PsA中显著下调的基因示于图19J中。在PsA、SjS和SLE刺激的患者群体中对ICOSL IgV-Fc的基因分析表明，ICOSL IgV-Fc可以显著下调与许多自身免疫性疾病有关的致病基因和/或途径。在PsA、SjS和SLE刺激的患者群体中，响应于变体ICOSL IgV-Fc而显著下调的基因为变体分子的活性提供了基因特征。
B.人滤泡B辅助T(B-Tfh)细胞共培养
针对在人B和Tfh细胞中抑制增殖和抗体应答的能力，进一步评价了示例性变体ICOSL IgV-Fc的作用。将从健康供体的PBMC分离的自体循环人B和Tfh细胞与人工APC(K562/CD80)和可溶性OKT3并且在存在变体ICOSL IgV-Fc或出于比较阿巴西普、普瑞鲁单抗、阿巴西普+普瑞鲁单抗的组合或贝拉西普的滴定的情况下混合。在第7天评估共培养物的细胞激活/增殖。
如图19K所示，变体ICOSL IgV-Fc抑制T细胞增殖、CD40L+T细胞恢复和B细胞增殖，并参与B细胞分化，如在共培养期间初始B细胞百分比的增加和激活的B细胞的并行减少所反映的。对细胞激活/增殖的影响的IC50值总结在图19L中。
在与上述类似的研究中，在第8天收集来自共培养物的上清液，将其稀释至1:10并分析免疫球蛋白分泌。在存在示例性变体ICOSL IgV-Fc的情况下，人IgG1、IgG3、IgA和IgM的分泌显著减少(图19M)。数据代表来自8个供体的结果。
通常如上所述从B和Tfh细胞共培养物分离的RNA通过下一代测序分析参与B-T细胞协作的基因的相对基因表达水平。在处理组之间每种基因以每百万映射读段中每千个碱基的转录物的读段(RPKM)计的表达值绘制在从0到1的相对标度上，其中红色程度反映较高表达值且蓝色程度代表每种基因的较低值(图19N)。在图19N中，基因列表按变体ICOSLIgV-Fc的抑制水平排序(从左到右)。
C.舍格伦综合征的体内模型
在小鼠免疫模型中施用后，将示例性变体ICOSL IgV-Fc与阿巴西普对抑制体内抗体应答的作用进行比较，其中将钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或绵羊红细胞(SRBC)腹膜(IP)内施用至小鼠。对于KLH免疫，在第1天和第13天施用0.25mg KLH作为加强。对于SRBC免疫，在第0天施用100μL洗涤过的柠檬酸化SRBC，并在第14天再次施用加强组。还在人B细胞/T细胞共培养物中比较了在存在变体ICOSL IgV-Fc或阿巴西普的情况下的抗体产生。变体ICOSLIgV-Fc在两种小鼠免疫模型中抑制抗体产生。在人B细胞/T细胞共培养物中也观察到增殖和抗体产生受到抑制。
还在SjS小鼠模型中评估了示例性变体ICOSL IgV-Fc的作用，所述小鼠模型涉及在NOD小鼠中抗PD-L1抗体介导的涎腺炎加速。PD-L1阻断加速了下颌下腺(SMG)中的白细胞浸润和半胱天冬酶-3激活、抗核和抗M3毒蕈碱乙酰胆碱受体(M3R)自身抗体的产生以及唾液分泌受损，这表明SjS的加速发展和发作，参见例如Zhou等人(2016)Sci.Rep.6:39105。在第0、2、4和6天用0.1mg阻断性抗小鼠PD-L1抗体(以诱导唾液腺中的炎症，如Zhou等人所述)以及Fc对照(0.3mg)、阿巴西普(0.5mg)或变体ICOSL IgV-Fc(0.5mg)测试品腹膜内处理六周龄NOD/ShiLtJ小鼠。在第8天，将下颌下腺收集、切片并用苏木精和伊红(H&E)染色剂染色，并在0到3的等级上对炎症进行评分。在该研究中抗PD-L1处理的NOD小鼠中，如通过SMG组织学评估的，变体ICOSL IgV-Fc对涎腺炎的抑制大于单独的阿巴西普(图20A-图20B)。
如上所述，使用抗PD-L1mAb诱导的舍格伦综合征NOD小鼠模型进行了类似的研究，不同的是在第10天收获下颌下腺、胰腺和血液/血清。在该研究中，还施用了野生型ICOSL-Fc(0.5mg)作为测试品以用于比较。代表性的组织学H&E图像示于图20C。涎腺炎的发生率百分比示于图20D，其表明变体ICOSL IgV-Fc降低了涎腺炎的发生率和严重程度。单独SMG得分示于图20E(使用Kruskal-Wallis检验确定统计显著性(*p.05，**p<0.01，****p.0001。未处理组未进行统计比较)。所述变体在该模型中还降低了胰岛炎的严重程度，如通过第10天收集的胰腺的组织学所证明的。在第10天收集的血液/血清中的葡萄糖测量的结果显示变体ICOSL IgV-Fc降低血糖水平。结果表明，变体ICOSL IgV-Fc降低了涎腺炎和胰岛炎的发生率和严重程度。
在第10天收集的稀释血清中，通过ELISA(Signosis，Santa Clara，CA)评估抗Ro-52和抗La抗体。如图20F所示，变体ICOSL IgV-Fc抑制了血清自身抗体抗RO 52和抗La的产生。如使用未校正的非参数Dunn检验所确定，在变体ICOSL IgV-Fc组与比较物处理之间观察到统计上显著的差异。
从第10天收集的SMG分离RNA，并通过下一代测序分析其相对基因表达水平。图20G示出了示例性基因的RPKM。如使用非参数Kruskal-Wallis检验所确定，在变体ICOSL IgV-Fc与Fc对照组之间注意到基因的RNA表达的统计差异(*p<0.05，**p<0.01)。
D.系统性红斑狼疮(SLE)的体内模型
还在SLE小鼠模型中评估了示例性变体ICOSL IgV-Fc的作用，所述小鼠模型涉及通过接受者抗原呈递细胞同种激活供体CD4+T细胞从而导致具有类似于SLE的症状的cGvHD疾病(Klarquist和Jansse,2015,J.Vis.Exp.(105):e53319)。在第0天，将来自雌性I-Abm12B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ(“bm12”)小鼠的脾细胞悬浮液IP注射到相同数量(1:1)的9周龄雌性C57BL/6NJ接受者小鼠中。H2-Ab1bm12与H2-Ab1b相差3个核苷酸，导致MHC I-A分子的β链中的三个氨基酸发生改变。从第0天开始，接受者小鼠每周使用400μg变体ICOSL IgV-或阿巴西普或摩尔匹配量(250μg)的Fc对照蛋白处理两次，持续11周。在第82天研究终止时，通过流式细胞术计数生发中心(B220+CD19+GL7+CD95+)B细胞和滤泡辅助(CD4+CD45+CD3+PD1+CD185+)T细胞。使用来自Chondrex(Redmond WA)的小鼠抗dsDNA IgG抗体测定试剂盒在第14天测量抗双链DNA IgG滴度。
如图20H所示，与Fc对照相比，示例性变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠显示出每个脾脏中降低的GC B和CD4+Tfh细胞水平以及降低的血清抗dsDNA。在变体ICOSL IgV-Fc与Fc对照组之间使用未配对t检验观察到GC B和Tfh的统计上显著的差异，并且使用未校正的Fisher最小显著性差异检验观察到抗dsDNA浓度的统计上显著的差异(*p<0.05，**p<0.01，和****p<0.0001)。
这些结果进一步支持如下观察结果：在人体外和/或小鼠体内转化研究中双重CD28/ICOS拮抗剂(如示例性测试变体ICOSL IgV-Fc)优于单独或组合施用的CD28或ICOS共刺激途径抑制剂。
实施例20
在关节炎模型中变体ICOSL-IgV Fc的评估
在评估潜藏类风湿性关节炎(RA)或银屑病关节炎(PsA)之下的效应子机制的模型中，评估含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc的活性。
A.PBMC刺激测定
对于体外原代细胞测定，将来自健康供体(HD)、RA和PsA受试者的PBMC或Th17偏斜T细胞培养物用人工抗原呈递细胞(表达CD80、CD86、ICOSL和抗CD3(OKT3)的K562细胞)以20:1的细胞与人工APC比率在存在100nM变体ICOSL IgV-Fc或出于比较仅CD28抑制剂、阿巴西普、ICOS途径抑制剂、普瑞鲁单抗(AMG-557；抗ICOSL，Creative Biolabs)以及阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合的情况下进行刺激。单独Fc用作对照。
孵育48小时后收集上清液以评估细胞因子产生。与阿巴西普、普瑞鲁单抗以及阿巴西普和普瑞鲁单抗的组合相比，变体ICOSL IgV-Fc显示出对从刺激的健康和患者PBMC的促炎性细胞因子(例如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17A、GM-CSF、RANKL)释放的优越抑制，并且抑制Th17偏斜培养物中的T细胞增殖。显示了具有来自RA、PsA或HD的PBMC的共培养物的细胞对于IFN-γ(图21A)、IL-2(图21B)、TNF-α(图21C)和IL-17A(图21D)的示例性结果。细胞因子分泌相对于Fc对照的抑制百分比由下式来确定：((Fc对照值–实验值)/Fc对照值))*100，并示于图21E。结果表明，变体ICOSL IgV-Fc显示出比单独或组合使用阿巴西普或普瑞鲁单抗观察到的细胞因子抑制更大的细胞因子抑制。
从在上述测定中产生的患者PBMC样品分离RNA，并通过RNA测序评估基因RNA表达。对于评估由变体ICOSL IgV-Fc不同地降低的基因，截断标准是FDR<0.05，LOG FC<-0.5。对于评估阿巴西普不同地降低的基因，截断标准是FDR≤0.3，LOG FC<-0.5。如图22A所示，ICOSL IgV-Fc比单独阿巴西普或与普瑞鲁单抗的组合显著下调更多与疾病发病机制相关的基因。IL-17A和IL-17F的下调需要ICOS抑制(ICOSL IgV-Fc或阿巴西普加普瑞鲁单抗)。在该研究中，观察到通过ICOSL IgV-Fc相比于比较物对于Th17相关效应分子(图22B)、共刺激分子(图22C)和炎性TH1或TH2相关效应分子(图22D)的显著基因降低和/或调节。
B.TH17偏斜活性
进一步评价了ICOSL IgV-Fc对Th17偏斜细胞的抑制，并与仅CD28或ICOS抑制剂进行比较。人PBMC经历了一般如上所述的aAPC的初级刺激，不同之处是在无偏斜(K562/OKT3/CD80+CD86+IL-2)或Th17偏斜(K562/OKT3/ICOSL+Th17偏斜培养基(Cat#CDK003,R&DSystems))的条件下，然后重新用细胞因子进料并使其静息约10-14天。然后静息的细胞在使用多达100,000个T细胞与10,000个同种异体LPS激活的单核细胞来源的树突状细胞和3,200pM变体ICOSL IgV-Fc或比较蛋白的混合淋巴细胞反应(MLR)中经历二级刺激。
在刺激后四天，包括再刺激后，如(图23A)所示通过流式细胞术分析细胞的ICOS或CD28表达，其显示出TH17偏斜细胞中改变的CD28和ICOS表达。在刺激的细胞中细胞增殖的评估(图23B)和通过ELISA测量的IL-17A细胞因子分泌(图23C)显示，变体ICOSL IgV-Fc相比于仅CD218或ICOS抑制剂展现出对TH17偏斜细胞的更大抑制。
C.胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的体内模型
在第0和18天用弗氏佐剂中的牛胶原蛋白对雄性DBA/1小鼠进行免疫的胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中，将示例性变体ICOSL IgV-Fc与阿巴西普在体内施用后的作用进行了比较。在第18天胶原蛋白增强时或之后开始施用变体ICOSL IgV-Fc始终导致小鼠CIA模型中的显著疾病减轻(包括爪炎症、血清细胞因子和抗胶原蛋白抗体)，其匹配或超过阿巴西普的活性。
在相似的研究中，小鼠在第18天施用胶原蛋白加强之前开始用媒介物(杜氏磷酸盐缓冲盐水/DPBS)、Fc对照、阿巴西普(OrenciaTM)或半治疗性方案中的示例性变体ICOSLIgV-Fc或阿巴西普每3天腹膜内(IP)处理一次，共5个剂量(Q3Dx5)。PBS和单独Fc用作对照。ICOSL IgV-Fc的施用显著减轻了爪炎症和结构损害(图24A)。脱钙爪的甲苯胺蓝染色证明当用示例性变体ICOSL IgV-Fc处理时没有炎症、血管翳、软骨损害和骨吸收(图24B)。具体地，在PBS处理的动物(左上方小图)中，染色显示PBS处理的动物中严重的弥漫性炎性浸润伴严重水肿伴关节结构完全或接近完全破坏伴多灶性软骨细胞损失以及皮质骨全层缺损伴关节结构破坏。在Fc对照处理的动物(右上方小图)中，染色显示严重的弥漫性炎性浸润伴严重水肿伴关节结构广泛破坏伴明显的软骨细胞损失以及皮质骨全层缺损伴皮质表面变形。在阿巴西普处理的动物(左下方小图)中，染色显示阿巴西普处理的动物中的中度至严重炎性浸润伴关节结构明显破坏、极小至轻度结构破坏以及部分骨吸收区域。在用变体ICOSL IgV-Fc处理的动物(右下方小图)中，染色显示没有炎症、血管翳、软骨损害或骨吸收。
收获腘窝LN并将其处理成单细胞悬浮液，并针对各种标记物进行表面染色，所述各种标记物包括：TFH细胞(CD3、CD4、CXCR5和PD-1)；生发中心(GC)B细胞(CD19、GL-7、CD95)。对于细胞内细胞因子染色，在存在Golgi Stop和Golgi Plug的情况下用PMA/离子霉素刺激细胞5小时。然后将细胞针对CD3、CD4进行表面染色、固定、透化处理并针对IFN-γ或IL-17A进行染色，并通过流式细胞术进行分析。如通过CD4+或总活细胞的百分比所测量，示例性变体ICOSL IgV-Fc的施用显著降低了细胞因子的数量(图24C)。如通过ELISA(Chondrex，目录号2036T)所测定，总抗小鼠II型胶原蛋白IgG抗体的浓度在用示例性变体ICOSL IgV-Fc免疫的小鼠的血清中显著降低(图24D)。
使用下式确定Fc对照、阿巴西普或示例性变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠相对于用媒介物(DPBS)处理的小鼠的单独小鼠的细胞因子抑制百分比：((Ave DPBS–实验动物)/AveDPBS))*100。在用示例性变体ICOSL IgV-Fc免疫的小鼠中，血清中存在的细胞因子的数量显著降低(图24E)。
这些结果与如下观察结果一致：在人体外和/或小鼠体内转化研究中双重CD28/ICOS拮抗剂(如测试变体ICOSL IgV-Fc)优于单独或组合施用的CD28或ICOS共刺激途径抑制剂，并且支持其用于治疗包括类风湿、银屑病和幼年特发性关节炎在内的炎性疾病的用途。
实施例21
在健康受试者中施用变体ICOSL-IgV Fc
向健康成年受试者施用含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的如SEQ ID NO:36中所示的N52H/N57Y/Q100R的示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白。进行了单一递增剂量研究(SAD)和多个递增剂量(MAD)研究。分析了安全性、耐受性、药代动力学(PK)和药效动力学(PD)。
A.单一递增剂量研究(SAD)
受试者(n＝72)被分为十个静脉内(IV)群组和两个皮下(SC)群组。IV群组中的受试者在第1天通过单一静脉内输注接受单一剂量的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白(以1μg/kg、3μg/kg、6μg/kg、12μg/kg、30μg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg给药)或安慰剂，并再监测28天。SC群组中的受试者在第1天通过皮下注射接受单一剂量的融合蛋白(1mg/kg或3mg/kg)或安慰剂，并再监测28天。
通过在28天内的不同时间点监测血清中变体ICOSL vIgD-Fc的浓度，在所有群组中评估ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的PK。使用抗人ICOSL捕获抗体和小鼠抗人IgG-HRP抗体缀合物来检测捕获的抗原，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清中ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的浓度。对于所有剂量群组，测定每个时间点的示例性融合蛋白的平均浓度并随时间进行绘制(IV群组示于图25A；所有群组示于图33)。1-10mg/kg内的平均估计半衰期为4.3-8.6天并且3mg/kg下SC生物利用度为约60％。
还在28天内在所有群组中评估了CD4+靶饱和度。
在给药前和给药后即施用结束后10min、2h、24h(1天)、3、7、14、21和28天，收集系列全血样品(1mL)。使全血样品裂解并将细胞沉淀分成3个等分试样。将饱和浓度(400ng/mL)的示例性变体ICOSL IgV-Fc添加至其中一个等分试样中，接着与人Fc模块(block)一起孵育以减少非特异性结合。使用流式细胞术定量循环淋巴细胞的靶标参与和亚群。
为了计算靶饱和度，报告了针对抗人IgG(相比于FMO对照)阳性染色的CD4+细胞的中值荧光强度(MFI)。使用下式确定靶饱和度：
Figure BDA0003407053080001371
在接受示例性变体ICOSL IgV-Fc的所有受试者中，示例性变体ICOSL IgV-Fc在来自每个血液样品的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的靶饱和度在SAD剂量组之间始终相似。
变体ICOSL vIgD-Fc与CD4+细胞的结合通过用抗CD4抗体和抗人IgG Fc抗体对细胞进行共染色来检测(IV群组示于图25B；所有SAD群组示于图34)。
在示例性变体ICOSL IgV-Fc的单一IV剂量施用后，CD4+T细胞中变体ICOSL IgV-Fc的靶饱和度在输注结束时达到峰值。平均最大靶饱和度从0.001mg/kg下的22.9％增加到0.1mg/kg下的99.2％。
高靶饱和度(>95％)的平均持续时间以剂量依赖性方式从0.03mg/kg下的1.39天增加到10mg/kg下的至少28天。28天后，低于1mg/kg的剂量下的平均靶饱和度较低(<10％)，并且范围是从1mg/kg下的58.1％到10mg/kg下的99.4％。
1和3mg/kg皮下剂量施用后，达到高靶饱和度(>95％)的平均时间分别为1天和0.083天。高靶饱和度(>95％)平均维持14.7天和至少28天，其中1和3mg/kg下给药后28天的平均靶饱和度分别计算为35.8％和97.7％。
结果表明，ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的IV输注实现了持续的高水平靶饱和度。
评估了ICOSL vIgD-Fc融合蛋白在健康受试者中发挥剂量依赖性免疫调节的能力。为了测量受试者的体液应答，在研究的第1天(IV群组)或第2天(SC群组)向受试者给予1mg钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)(一种强免疫刺激剂)的单一皮下(SC)注射。在接触KLH之前和之后，通过测量血清中抗KLH IgG和IgM抗体的比率来评估抗体应答。在给药前、给药后14、21和28天收集用于检测抗KLH抗体的血液样品。使用可捕获抗KLH抗体的KLH以及对IgG或IgM具有特异性的HRP缀合二抗，通过ELISA定量地测量IgG和IgM抗体的血清水平。抗KLHIgG和IgM应答率(计算为表现出抗体浓度增加>基线水平2倍的受试者的百分比)在安慰剂组中分别为100％和69％。
变体ICOSL vIgD-Fc处理组比安慰剂组的抗KLH IgG应答率低。在变体ICOSLvIgD-Fc处理组中，抗KLH IgM应答率也降低。以下表34显示了处理引起的抗KLH抗体应答升高的发生率。如图35所示，所有变体ICOSL IgV-Fc处理组中抗KLH IgG或IgM的变化均低于安慰剂组，表明示例性变体ICOSL IgV-Fc对抗原特异性抗体应答的抑制。
表34：SAD处理引起的抗KLH抗体应答升高(>基线的2倍)的发生率。
Figure BDA0003407053080001381
结果表明，在IV和SC群组中，ICOSL vIgD-Fc融合蛋白能够以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量抑制对KLH的抗体应答(IV群组示于图26A)。
进行了单独的测定以测量受试者的抗原依赖性T细胞应答。
在给药前和给药后即施用结束后2h、24h(1天)、3、7、14和28天，收集用于离体葡萄球菌B型肠毒素刺激的系列全血样品。在暴露于葡萄球菌B型肠毒素(SEB)并用示例性融合蛋白处理后3天内，对受试者的T细胞进行离体培养并测量细胞的IL-2产生。
结果表明，T细胞的IL-2产生被0.03mg/kg和更高剂量的融合蛋白抑制(图26B)。基线调整的SEB诱导的IL-2早在给药后2h就被示例性变体ICOSL IgV-Fc处理降低，且恢复时间随着示例性变体ICOSL IgV-Fc剂量的增加而增加。示例性变体ICOSL IgV-Fc抑制的持续时间和幅度是剂量依赖性的。示例性变体ICOSL IgV-Fc对IL-2的最大抑制随着剂量增加而增加，从0.001mg/kg(-13％)到0.03mg/kg(-49.5％)，并且在剂量高于0.03mg/kg时保持大约-50％。同样，抑制持续时间(定义为≤-25％的时间)也随着剂量增加而增加，从0.003mg/kg下的1.08天到10mg/kg下的19.9天。这些结果与如下观察结果一致：变体ICOSL vIgD-Fc在向人受试者单一剂量IV施用后介导了剂量依赖性免疫调节。
结果表明，ICOSL vIgD-Fc融合蛋白在所有剂量(包括高达最高10mg/kg剂量水平)水平下在受试者中均具有良好耐受性。没有发生3级或4级不良事件。另外，研究中未观察到与剂量相关的实验室变化、输注反应、细胞因子释放综合征(CRS)或过敏性反应。
这些结果与如下观察结果一致：示例性ICOSL vIgD-Fc融合蛋白在健康受试者中具有良好耐受性，展现出剂量依赖性免疫调节活性，并且在测试剂量下不导致CRS或免疫原性。
B.多个递增剂量研究(MAD)
MAD研究包括2个重复的每周IV剂量群组(0.3或1mg/kg Q1W，总共4个剂量)和1个重复的每两周IV剂量群组(1mg/kg Q2W，总共2个剂量)。总共24名受试者(每个剂量群组8名受试者)以6:2的比率被随机化为接受示例性变体ICOSL IgV-Fc或安慰剂。
对受试者随访49天(MAD)以评估安全性、PK、T细胞上的靶饱和度、循环细胞因子和PD，后者基于对钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的IgG应答的抑制。
通过在28或49天内的不同时间点监测血清中变体ICOSL vIgD-Fc的浓度，在所有MAD群组中评估ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的PK。使用抗人ICOSL捕获抗体和小鼠抗人IgG-HRP抗体缀合物来检测捕获的抗原，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清中ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的浓度。图36显示了每个MAD群组的药效动力学。在重复IV给药的情况下观察到极小到适度的积累。
为了评估示例性变体ICOSL IgV-Fc的靶饱和度，根据上述用于SAD研究的方法测定了循环CD4+和CD8+T细胞上的示例性变体ICOSL IgV-Fc的量，不同之处在于在给药前和给药后即在每个剂量输注结束后4h、24h(1天)、2天，以及对于Q1W群组在第四个剂量输注结束后7和28天，以及对于Q2W群组在第二个剂量输注结束后8、9、14和35天采集系列全血样品(1mL)。
在接受示例性变体ICOSL IgV-Fc的所有受试者中，示例性变体ICOSL IgV-Fc在来自每个血液样品的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的靶饱和度在剂量组之间始终相似。图37总结了CD4+T细胞中随时间变化的靶饱和度。
在以0.3和1mg/kg静脉内剂量施用4次(Q1W，持续4周)或以1mg/kg施用2次(Q2W，持续4周)后，实现了剂量施用后的高靶饱和度(＞95％)，并且其通常维持26.8至39天。在最后一个排定时间点(第一个剂量后49天)，0.3mg/kg Q1W、1mg/kg Q2W和1mg/kg Q1W的平均靶饱和度分别降至19.5％、26.6％和91.7％。
这些结果表明，ICOSL vIgD-Fc融合蛋白的多个IV输注实现了持续的高水平靶饱和度。
评估了ICOSL vIgD-Fc融合蛋白在接受多个剂量的融合蛋白的健康受试者中发挥剂量依赖性免疫调节的能力。
所有MAD群组在第1天施用变体ICOSL IgV-Fc或安慰剂后2小时内接受了1mg钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的皮下施用。在给药前、第一个剂量后7、14、21、28和49天收集抗KLH抗体的血液样品。
如图38所示，所有变体ICOSL IgV-Fc处理组中抗KLH IgG或IgM的变化均低于安慰剂组，表明示例性变体ICOSL IgV-Fc对抗原特异性抗体应答的抑制。以下表35显示了处理引起的抗KLH抗体应答升高的发生率。
表35：MAD处理引起的抗KLH抗体应答升高(＞基线的2倍)的发生率。
Figure BDA0003407053080001391
注释：4名受试者(在0.3mg/kg Q1W中的1名、在1mg/kg Q1w中的2名以及在1mg/kgQ2W中的1名)被排除，因为这些受试者未接受全部的许划剂量。
结果揭示，多个剂量的ICOSL vIgD-Fc融合蛋白能够抑制对KLH的抗体应答。
进行了一项测定以测量MAD群组中的抗原依赖性T细胞应答。
在给药前即每个剂量之前(0、7、14、21天)、第一和第四个剂量之后2天(3天和23天)、28和49天收集用于离体葡萄球菌B型肠毒素(SEB)刺激的系列全血样品。在暴露于葡萄球菌B型肠毒素(SEB)并用示例性融合蛋白处理后3天内，对受试者的T细胞进行离体培养并测量细胞的IL-2产生。
在示例性变体ICOSL IgV-Fc的4个每周剂量后，抑制持续时间从0.3mg/kg下的25.1天增加至1mg/kg下的44.5天。这些结果与如下观察结果一致：变体ICOSL vIgD-Fc在向人受试者多个IV施用后介导了剂量依赖性免疫调节。
总之，这些结果与如下观察结果一致：示例性变体ICOSL IgV-Fc融合蛋白在健康受试者中具有良好耐受性，展现出剂量依赖性免疫调节活性，并且在作为多个剂量施用时不导致CRS或免疫原性。
实施例22
在患有类固醇抗性或类固醇难治性急性移植物抗宿主病(aGVHD)的受试者中施用变体ICOSL-IgV Fc
患有根据西奈山急性GVHD国际联合会(MAGIC)标准(Harris等人2016)的II-IV级aGVHD的接受同种异体干细胞移植(例如，首次同种异体干细胞移植)的免疫抑制剂(如皮质类固醇(例如糖皮质激素)或环孢素)抗性或难治性成年人被施用单一静脉内剂量的变体ICOSL vIgD-Fc融合蛋白与挽救疗法的组合，所述融合蛋白含有与惰性Fc(例如含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的如SEQ ID NO:36中所示的N52H/N57Y/Q100R。施用是临床研究的一部分，所述临床研究分两部分进行，包括剂量递增和剂量扩展。通过使用加速的滴定设计进行剂量递增。受试者接受以下剂量之一的单一静脉内输注并作为剂量递增研究的一部分进行评价：1μg/kg、10μg/kg、30μg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。此后，在10名受试者的扩展群组中评价选择的一个或多个剂量水平；如果≥25％(n＝3)受试者实现反应，则招募另外15名受试者(西蒙两阶段设计)。在一些情况下，受试者可以继续进行针对预防而施用的疗法、继续或增加糖皮质激素和/或增加另一种挽救疗法。考虑到了糖皮质激素逐渐减量的反应者。
上述给药方案基于非临床数据中预测的人PK特征和CD28靶饱和度，并且预测的人暴露的安全边际量基于NOAEL毒理学研究。
其他给药方案是基于如实施例21中描述的在健康人受试者中的研究而设计的。根据在实施例21中的研究中健康受试者中单一或多个IV剂量后观察到的临床安全性数据、PK和靶饱和度，0.3mg/kg的起始剂量被认为是可行的。如上所述使用加速的滴定设计进行剂量递增。向受试者施用以下剂量之一或以下任一剂量之间的中间剂量(最高20mg/kg)的单一静脉内输注，并作为剂量递增研究的一部分进行评价：0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和20mg/kg。此后，在10名受试者的扩展群组中评价选择的一个或多个剂量水平；如果≥25％(n＝3)受试者实现反应，则招募另外15名受试者(西蒙两阶段设计)。在一些情况下，受试者可以继续进行针对预防而施用的疗法、继续或增加糖皮质激素和/或增加另一种挽救疗法。考虑到了糖皮质激素逐渐减量的反应者。
根据不良事件的发生率、严重程度和严重性，在28天内评估安全性。评估功效的终点，包括客观反应率、反应持续时间、无复发存活期、无失败存活期、无事件存活期、非复发死亡、恶性肿瘤复发/进展、总存活期和糖皮质激素使用。
评估抗药物抗体的发生率和滴度。测量变体ICOSL vIgD-Fc的血清浓度并估计药代动力学(PK)参数。评估药效动力学(PD)终点，并且其包括循环白细胞的靶饱和度和免疫表型分型，并且可以包括循环细胞因子、免疫球蛋白、急性期反应物和靶向途径受体的可溶性形式的定量，循环白细胞中mRNA表达的变化的评价，风险等位基因的评价以及反应的相关性。
实施例23
经由患者来源的PBMC对变体ICOSL-IgV Fc进行体外评估
评价了含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ IDNO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc对细胞因子释放的作用。
在存在100nM的示例性变体ICOSL IgV-Fc、单一途径拮抗剂普瑞鲁单抗或阿巴西普或者普瑞鲁单抗和阿巴西普二者的组合的情况下，将从克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)患者分离的PBMC以20:1的比率用人工抗原呈递细胞(表达细胞表面抗CD3(OKT3)、CD80、CD86和ICOSL的K562细胞)进行刺激。48小时后收集上清液并分析细胞因子浓度，如图27A所示。与用单一途径拮抗剂、二者的组合或Fc对照抗体处理的细胞相比，从用示例性变体ICOSL IgV-Fc处理的患者细胞的TNF-α、IFNγ、IL-6和IL-12p70释放被下调。
使用下式计算相对于Fc对照处理的细胞因子释放的抑制百分比：((Fc对照值–实验值)/Fc对照值))*100。如图27B所示，示例性变体ICOSL IgV-Fc显示出比用阿巴西普或普瑞鲁单抗处理后所观察到的细胞因子抑制更大的细胞因子抑制。
实施例24
在T细胞诱导的结肠炎小鼠模型中变体ICOSL-IgV Fc的评估的多次给药
评价了含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ IDNO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc对CD4+CD45RB高T细胞诱导的鼠结肠炎模型中疾病进展和严重程度的作用。
CD4+CD45RB高供体细胞是通过从雄性BALB/C供体小鼠获得的脾细胞悬浮液进行阴性选择而富集。在第0天，将30万个CD4+CD45RB高Treg耗尽的供体细胞或CD4+细胞静脉内注射至免疫缺陷C.B17(SCID)雄性小鼠中以分别诱导结肠炎或用作对照组。如表32所示，将小鼠分成六个处理组并在第0天和/或整个研究中用示例性变体ICOSL-IgV Fc、仅Fc或媒介物对照处理。
Figure BDA0003407053080001411
从第0天开始每天进行体重和大便得分测量。在第13、20和27天收集血液用于分析。在第42或43天研究终止后，收集肠系膜淋巴结、结肠和小肠用于细胞计数分析、长度和重量的测定以及组织学分析。将结肠远端1/3保持为离体培养物以评估细胞因子分泌以及从血清进行细胞因子测量。如先前在实施例16中所述，根据体重和大便得分(体重得分+大便得分)计算疾病活动指数(DAI)。使用双因素方差分析评估示例性变体ICOSL-IgV Fc处理组与Fc对照组的DAI的统计分析。
体重、大便得分和DAI结果的变化示于图28A，在用示例性变体ICOSL IgV-Fc(N52H/N57Y/Q100R)处理(包括在第0天或第14天用单一剂量处理)的情况下观察到总体DAI以及体重和大便得分的改善。
图28B显示了T细胞计数的流式细胞术分析的结果。如所示，使用示例性变体ICOSLIgV-Fc的处理也显示有助于抑制血液和肠系膜淋巴结中的效应记忆T细胞(Tem)。
在用示例性变体ICOSL-IgV-Fc处理后，还观察到促炎性细胞因子TNFα、IL-6、IFNγ和IL-12p70的血清浓度降低(图28C)。
结肠的宏观和显微镜评估可以分别参见图28D和图28E-图28F。如图28D所示，分析表明，与Fc对照处理组相比，所有治疗性处理条件都显示出降低的重量:长度比率并且具有更低的合并组织学得分。组织学分析证实了示例性变体ICOSL IgV-Fc在减轻结肠炎方面的功效。与仅媒介物、无结肠炎处理组(左上方小图)或Fc对照处理组(左下方小图)相比，用重复剂量的变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠的组织学分析示于图28E的两个右侧小图中。从第0天到研究结束通过重复剂量处理的小鼠没有病理性结肠发现(右上方小图)，从第14天到研究结束通过延迟重复剂量处理的4/12只小鼠没有结肠炎体征(右下方小图)。图28F显示了图28E中那些的更高放大倍数的组织学图像。处理组中没有一只小鼠的结肠肌层受到炎症影响。这些结果与变体ICOSL IgV-Fc完全预防结肠炎发展的发现一致，即使在延迟重复剂量施用的情况下也是如此。在第0天或第14天用单一剂量变体ICOSL IgV-Fc处理的小鼠也展现出比Fc对照处理的小鼠更轻微的结肠炎。
这些数据支持示例性变体ICOSL IgV-Fc作为治疗炎性肠病(如结肠炎)的治疗性候选物。
实施例25
在实验性自身免疫性葡萄膜炎中评估变体ICOSL-IgV Fc的玻璃体内施用
评价了含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ IDNO:42中所示)融合的变体ICOSL IgV(N52H/N57Y/Q100R；SEQ ID NO:36)的示例性变体ICOSL IgV-Fc的玻璃体内注射对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的作用。
二十(20)只雌性Lewis大鼠被分成5个处理组，每组4只动物。进行两(2)轮实验，每轮每次处理2只动物。在第0天，经由皮下注射在200μl完全弗氏佐剂(每个臀部100μl)中的30μg牛光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)肽R16在所有动物中诱导EAU。在第10和12天，第1-4组中的动物(每组n＝4只动物，总共n＝16)用PBS、Fc对照、类固醇或示例性变体ICOSLIgV-Fc通过眼内注射到右侧玻璃体内进行处理。在第8和10天，第5组中的动物(n＝4)用示例性变体ICOSL IgV-Fc进行处理。处理方案总结在表33中。
Figure BDA0003407053080001421
在麻醉下(腹膜内氯胺酮/赛拉嗪和局部丁卡因)进行注射。用5％必妥碘清洗眼睛，并用2.5％苯肾上腺素散瞳。使用玻璃针和解剖显微镜在直接可视化的情况下进行注射。每次注射都验证研究化合物的玻璃体内放置。
在基线和施用麻醉的所有日子将动物称重。在第0、7、8、9、10、11、12、13和14天获得双眼的未掩蔽临床得分。使用已建立的得分系统(Agarwal和Caspi,2004)通过观察未麻醉的动物来分配得分。在第7、11和14天获得了光学相干断层扫描(OCT)图像。由对处理和日子不知情的评分者对图像评分。使用改编自(Pepple和Wang 2016)的图像分析方案分配得分。在第14天，将大鼠安乐死并收集眼睛以用于组织学。由对眼睛和处理条件不知情的评分者使用已建立的得分系统(Dick和Forrester，1994)对组织切片(每只眼睛，n＝3)评分。确定每个处理组的处理眼(右)和未处理眼(左)的中值或平均临床得分(隐蔽或未隐蔽)、隐蔽OCT得分和组织学得分。
与Fc对照处理相比，从第8天开始使用示例性变体ICOSL IgV-Fc处理显示出依据第10、11、12天(p<0.05)和13天(p<0.01)的每日未掩蔽临床得分的显著炎症抑制(图29A-图29E)。在第8/10天用变体ICOSL IgV-Fc处理延迟了疾病的发作，如通过除最后时间点(第14天)即最后一个剂量后4天之外的所有日子的临床得分的差异所见。
另外，在第11(p<0.05)和14天(p<0.01)(图30A-图30C)，与Fc对照眼睛相比，在变体ICOSL IgV-Fc处理的眼睛中通过掩蔽OCT评分的临床炎症显著更低。在变体ICOSL IgV-Fc处理的眼睛中炎症的组织学得分也显著低于Fc对照处理的眼睛(p<0.01)(图31)。
当与PBS和对照处理相比时，从第10天开始用变体ICOSL IgV-Fc的处理预防葡萄膜炎得分的进展并降低最终炎症得分(图29A-31)。在玻璃体内注射后的第二天，在ICOSLIgV-Fc第10/12天处理的眼睛中未掩蔽临床得分降低。
在变体ICOSL IgV-Fc第8/10天和第10/12天处理的动物中还观察到了未处理的同伴眼睛(左眼)中的全身性效应。在类固醇处理的动物的未处理的同伴眼睛中也观察到类似的全身性效应(图29A-图29B、图30A和图31)。在第8/10天用变体ICOSL IgV-Fc处理在抑制EAU方面比Fc对照更有效。
类固醇处理的动物在第14天显示出12.7％的平均重量减轻(图32)。用变体ICOSLIgV-Fc或对照(媒介物，Fc对照)处理没有导致重量减轻(分别为3％和2％平均重量增加)。
用双重CD28/ICOS拮抗剂变体ICOSL IgV-Fc进行局部处理在Lewis大鼠中抑制EAU。此外，变体ICOSL IgV-Fc的玻璃体内注射具有良好耐受性，而没有用类固醇处理所观察到的重量减轻。这些数据支持变体ICOSL IgV-Fc作为处理炎性眼睛障碍病(如葡萄膜炎)的治疗性候选物。
实施例26
在患有SARS-CoV-2感染(COVID-19)的受试者中施用变体ICOSL-IgV Fc
患有确认的SAR-CoV-2感染(COVID-19)和严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或因COVID-19感染而引起的败血性休克的13岁或更大的受试者被施用一个或多个静脉内剂量的变体ICOSL vIgD-Fc融合蛋白，其含有与惰性Fc(含有人IgG1Fc中的突变L234A、L235E和G237A，例如SEQ ID NO:42中所示)融合的如SEQ ID NO:36中所示的N52H/N57Y/Q100R。向受试者施用每个剂量多达10mg/kg的一次或多次静脉内输注，并在最后一次给药后观察长达56天。
记录临床结局和评估，包括但不限于：(1)基于七类顺序等级的状态(7-死亡；6-住院，需要ECMO、有创机械通气或二者；5-住院，需要经鼻高流量O2疗法、无创机械通气或二者；4-住院，需要补充氧气；3-住院，不需要补充氧气；2-未住院，但无法恢复正常活动；1-未住院，且恢复正常活动)；(2)呼吸状态(氧气补充水平(L/min)；PaO2(氧气分压)/FiO2(吸入氧气分数)比率；SaO2(外周血氧饱和度)；影像学异常)；(3)总体状态(根据SOFA(败血症相关器官衰竭)得分、NEWS2(国家预警得分2)、血管活性剂的使用和/或器官特异性实验室异常进行评估)；(4)可能与疾病严重程度相关的实验室值，包括例如血清铁蛋白、降钙素原、D-二聚体、C反应蛋白(CRP)、总白细胞计数、分类淋巴细胞计数和嗜中性粒细胞与淋巴细胞比率；以及(5)与用示例性变体ICOSL IgV-Fc融合蛋白处理相关的严重不良事件。在可行的情况下每隔一段时间收集血液样品以评估药代动力学(PK)和药效动力学(PD)。PD可以包括但不限于循环细胞因子和/或针对SARS-CoV-2的抗体水平。
本发明在范围上并不旨在限于具体公开的实施方案，提供具体公开的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列表
Figure BDA0003407053080001451
Figure BDA0003407053080001461
Figure BDA0003407053080001471
Figure BDA0003407053080001481
Figure BDA0003407053080001491
Figure BDA0003407053080001501
Figure BDA0003407053080001511
Figure BDA0003407053080001521
Figure BDA0003407053080001531
Figure BDA0003407053080001541
Figure BDA0003407053080001551
序列表
<110> 高山免疫科学股份有限公司
<120> 变体ICOS配体（ICOSL）融合蛋白的方法和用途
<130> 76161-20032.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 62/835,488
<151> 2019-04-17
<150> 62/855,830
<151> 2019-05-31
<150> 62/931,212
<151> 2019-11-05
<150> 62/945,071
<151> 2019-12-06
<150> 62/962,832
<151> 2020-01-17
<150> 62/987,854
<151> 2020-03-10
<160> 68
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2) ECD
<400> 1
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT IGV
<400> 2
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu
100 105 110
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgV 结构域
<400> 3
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val
115 120
<210> 4
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2)
<400> 4
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
20 25 30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn
35 40 45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr
50 55 60
Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe
85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His
100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val
115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
130 135 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser
145 150 155 160
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp
165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn
180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr
195 200 205
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
245 250 255
Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala
260 265 270
Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly
275 280 285
Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val
290 295 300
<210> 5
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 2
<400> 5
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 3
<400> 6
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln
210
<210> 7
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 4
<400> 7
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn
195 200 205
<210> 8
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 5
<400> 8
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
195 200 205
<210> 9
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 6
<400> 9
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu
195 200
<210> 10
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 7
<400> 10
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn
195 200
<210> 11
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL WT ECD 截短 8
<400> 11
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr
<210> 12
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A ECD 截短 2
<400> 12
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Ala Leu
195 200 205
<210> 13
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G ECD 截短 2
<400> 13
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Gly Leu
195 200 205
<210> 14
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL L208G ECD 截短 2
<400> 14
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Gly
195 200 205
<210> 15
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A ECD 截短 3
<400> 15
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1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
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195 200 205
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210
<210> 16
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G ECD 截短 3
<400> 16
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL L208G ECD 截短 3
<400> 17
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1 5 10 15
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35 40 45
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G ECD 截短 4
<400> 19
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1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A ECD 截短 8
<400> 20
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1 5 10 15
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<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G ECD 截短 8
<400> 21
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
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Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL L208G ECD 截短 8
<400> 22
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
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195 200 205
Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A/L208G ECD 截短 2
<400> 23
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
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180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Ala Gly
195 200 205
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<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G/L208G ECD 截短 2
<400> 24
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
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Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
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Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
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195 200 205
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A/L208G ECD 截短 3
<400> 25
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
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195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln
210
<210> 26
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G/L208G ECD 截短 3
<400> 26
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
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Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
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195 200 205
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210
<210> 27
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A/L208G ECD 截短 8
<400> 27
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
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Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Ala Gly
195 200 205
Thr
<210> 28
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G/L208G ECD 截短 8
<400> 28
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
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115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
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Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Gly Gly
195 200 205
Thr
<210> 29
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A 完整 ECD
<400> 29
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
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Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
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225 230 235
<210> 30
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G 完整 ECD
<400> 30
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
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50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Gly Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 31
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL L208G 完整 ECD
<400> 31
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
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Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Gly
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 32
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207A/L208G 完整 ECD
<400> 32
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Ala Gly
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 33
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL N207G/L208G 完整 ECD
<400> 33
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Gly Gly
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 34
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V39 ECD
<400> 34
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V39 IGV
<400> 35
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu
100 105 110
<210> 36
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V39 IGV
<400> 36
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val
115 120
<210> 37
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGG1 FC
<400> 37
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 38
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 C220S/E356D/M358L/K447DEL的FC
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 39
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 C220S/L234A/L235E/G237A/K447DEL的FC
<400> 39
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 40
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 C220S/L234A/L235E/G237A的FC
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 41
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FC 区
<400> 41
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 42
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FC 区
<400> 42
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 43
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FC (C5S (C220S), R77C, (R292C), N82G (N297G),
V87C (V302C))
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 44
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 C220S/E233P/L234V/L235A/G236DEL/S267K的FC
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 45
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD80 V2 ECD
<400> 45
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Gln Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Gly Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Ala Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
<210> 46
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FC (C5S (C220S), R77C, (R292C), N82G (N297G),
V87C (V302C), L232DEL (K447DEL))
<400> 46
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 47
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有
C220S/E233P/L234V/L235A/G236DEL/S267K/K447DEL的FC
<400> 47
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 48
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGG1 FC C220S
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 49
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGG2 FC
<400> 49
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 50
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGG4 FC
<400> 50
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 51
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGG4 FC S228P
<400> 51
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4GS 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGV-FC 接头 1
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGV-IGV 接头
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EAAAK 接头
<400> 55
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3X EAAAK 接头
<400> 56
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 57
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5X EAAAK 接头
<400> 57
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
20 25
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 58
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGV-FC 接头 2
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 ICOSL IGV-FC
<400> 60
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
145 150 155 160
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
165 170 175
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
180 185 190
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
195 200 205
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
210 215 220
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
225 230 235 240
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
245 250 255
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
260 265 270
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
275 280 285
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
290 295 300
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
305 310 315 320
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
325 330 335
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
340 345 350
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360
<210> 61
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V27 ECD
<400> 61
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Thr Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 62
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V5 ECD
<400> 62
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Pro Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 63
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V82 ECD
<400> 63
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Arg Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 64
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V47 ECD
<400> 64
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Ser Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 65
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V44 ECD
<400> 65
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Pro Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 66
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL V41 ECD
<400> 66
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Arg Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
225 230 235
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOSL v44 IgV
<400> 67
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln His Ser Ser Leu Glu Tyr Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Pro Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val
115 120
<210> 68
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2)
<400> 68
Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His
35 40 45
Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn
50 55 60
Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val
100 105 110
Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn
130 135 140
Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser
180 185 190
Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu
195 200 205
Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser
225 230 235 240
Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala Ile Gly
245 250 255
Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly Ala Trp
260 265 270
Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val
275 280

Claims (122)

1.一种预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经接受同种异体造血干细胞移植(HSCT)并且在接受所述同种异体HSCT之后在所述受试者中发生所述aGVHD。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有II-IV级aGVHD。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者中的aGVHD是免疫抑制剂治疗抗性或难治性的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括皮质类固醇。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括环孢素。
7.一种预防或减轻继发于病毒性感染的炎症的方法，所述方法包括在治疗期内向所述受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且所述感染是COVID-19。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述炎症与细胞因子释放综合征(CRS)相关。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CRS是严重CRS或3级或更高级CRS。
12.据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中在所述施用时或紧接在所述施用之前，所述受试者患有与所述病毒性感染相关或归因于所述病毒性感染的严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或败血性休克。
13.一种治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括在治疗期内向患有自身免疫性或炎性疾病或病症的受试者施用一个或多个剂量的变体ICOSL融合蛋白，所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分，并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是急性病症。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是慢性病症。
18.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
19.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。
20.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。
21.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
22.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。
23.根据权利要求13、权利要求14或权利要求17所述的方法，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是溃疡性结肠炎。
24.根据权利要求1-15和17-23中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。
27.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每两周施用一次(Q2W)。
28.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述多个剂量中的每一个每个月施用一次(Q4W)。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、或为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
32.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
34.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
35.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
36.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约15mg/kg的量施用。
37.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约20mg/kg的量施用。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中重复所述治疗期。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述施用是经由皮下施用。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述施用是经由静脉内施用。
41.一种治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用一定剂量的包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽的变体ICOSL融合蛋白，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病是葡萄膜炎。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以如下剂量施用：在约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg之间，包含端值。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以小于0.2mL、任选地小于0.1mL的体积施用。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以为或约0.05mL的体积施用。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含(i)SEQ IDNO:32中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)和/或(ii)的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述ICOSL参考多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列或展现出与SEQ ID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的一个或多个氨基酸取代的序列。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出降低的效应子功能的变体Fc区。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1 Fc区。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
59.一种用于预防或减轻受试者的急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
60.变体ICOSL融合蛋白在配制用于预防或减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
61.根据权利要求59所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
62.根据权利要求59或权利要求61所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60或权利要求61所述的用途，其中所述aGvHD是II-IV级aGVHD。
63.根据权利要求59、61和62中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61和62中任一项所述的用途，其中所述aGVHD是免疫抑制剂治疗抗性或难治性的。
64.根据权利要求59和61-63中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60和61-63中任一项所述的用途，其中所述免疫抑制剂包括皮质类固醇。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求63或权利要求64所述的用途，其中所述免疫抑制剂包括环孢素。
66.一种用于预防或减轻受试者的继发于病毒性感染的炎症的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
67.变体ICOSL融合蛋白在配制用于预防或减轻继发于病毒性感染的炎症的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
68.根据权利要求66所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求67所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.1mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
69.根据权利要求66或权利要求68所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求67或权利要求68所述的用途，其中所述病毒是冠状病毒。
70.根据权利要求69所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求69所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且所述感染是COVID-19。
71.根据权利要求66、68和69中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求67-69中任一项所述的用途，其中所述炎症与细胞因子释放综合征(CRS)相关。
72.根据权利要求71所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求71所述的用途，其中所述CRS是严重CRS或3级或更高级CRS。
73.根据权利要求68和69-72中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求68和69-72中任一项所述的用途，其中在所述施用时或紧接在所述施用之前，所述受试者患有与所述病毒性感染相关或归因于所述病毒性感染的严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症或败血性休克。
74.一种用于治疗受试者的自身免疫性或炎性疾病或病症的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
75.变体ICOSL融合蛋白在配制用于治疗自身免疫性或炎性疾病或病症的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
76.根据权利要求74所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75所述的用途，其中所述方法包括在治疗期内向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以从为或约0.001mg/kg至为或约20mg/kg的量施用。
77.根据权利要求61-65、68-73和76中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73和76中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以从或从约0.1mg/kg至为或约10mg/kg的量施用。
78.根据权利要求77所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求77所述的用途，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是急性病症。
79.根据权利要求61-65、68-73和76-78中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73和76-78中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用仅单一剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
80.根据权利要求77所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求77所述的用途，其中所述自身免疫性或炎性疾病或病症是慢性疾病或病症。
81.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
82.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是舍格伦综合征。
83.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是银屑病关节炎。
84.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
85.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是克罗恩病。
86.根据权利要求74、77和80中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求75、77和80中任一项所述的用途，其中所述炎性或自身免疫性疾病或病症是溃疡性结肠炎。
87.根据权利要求61-65、68-73和76-78中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73和76-78中任一项所述的用途，其中向所述受试者施用多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白。
88.根据权利要求87所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求87所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每周施用不超过一次。
89.根据权利要求87或权利要求88所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求87或权利要求88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每周施用一次(Q1W)。
90.根据权利要求87或权利要求88所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求87或权利要求88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每两周施用一次(Q2W)。
91.根据权利要求87或权利要求88所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求87或权利要求88所述的用途，其中所述多个剂量中的每一个每个月施用一次(Q4W)。
92.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约10mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、为或约3mg/kg至为或约10mg/kg、为或约3mg/kg至为或约6mg/kg、或为或约6mg/kg至为或约10mg/kg。
93.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-92中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-92中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以如下量施用：从为或约0.3mg/kg至为或约6mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约3mg/kg、为或约0.3mg/kg至为或约1mg/kg、为或约1mg/kg至为或约6mg/kg、为或约1mg/kg至为或约3mg/kg、或为或约3mg/kg至为或约6mg/kg。
94.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约0.3mg/kg的量施用。
95.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约1mg/kg的量施用。
96.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约3mg/kg的量施用。
97.根据61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约6mg/kg的量施用。
98.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-93中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约10mg/kg的量施用。
99.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约15mg/kg的量施用。
100.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-91中任一项所述的用途，其中所述一个或多个剂量中的每个剂量是以为或约20mg/kg的量施用。
101.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-100中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-100中任一项所述的用途，其中重复所述治疗期。
102.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是皮下施用。
103.根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求61-65、68-73、76-78和87-101中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是静脉内施用。
104.一种用于治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法中的包含变体ICOSL融合蛋白的药物组合物，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
105.变体ICOSL融合蛋白在配制用于治疗受试者的眼部自身免疫性或炎性疾病的方法中的药物中的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白包含与多聚化结构域连接的变体ICOSL多肽，其中所述变体ICOSL多肽是ICOSL胞外结构域或其包含IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段的部分并且包含参考ICOSL多肽中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代对应于选自关于SEQ ID NO:1中所示序列的N52H、N57Y和Q100R的氨基酸取代。
106.根据权利要求104所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求105所述的用途，其中所述眼部自身免疫性或炎性疾病是葡萄膜炎。
107.根据权利要求104或权利要求106所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求105或权利要求106所述的用途，其中所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白的步骤，其中所述一个或多个剂量的所述变体ICOSL融合蛋白中的每个剂量是以如下剂量施用：在约0.01mg至10mg、为或约0.05mg至10mg、为或约0.1mg至10mg、为或约0.5mg至10mg、为或约1mg至10mg、为或约1.5mg至10mg、为或约2mg至10mg、为或约3mg至10mg、为或约4mg至10mg、为或约5mg至10mg、为或约6mg至10mg、为或约7mg至10mg、为或约8mg至10mg、为或约9mg至10mg之间，包含端值。
108.根据权利要求107所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求107所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以小于0.2mL、任选地小于0.1mL的体积施用。
109.根据权利要求107或权利要求108所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求107或权利要求108所述的用途，其中所述变体ICOSL融合蛋白是以为或约0.05mL的体积施用。
110.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-109中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103、105和106、107-109中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽包含(i)SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，(ii)与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)和/或(ii)的一部分，所述部分包含IgV结构域或IgC结构域或所述IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。
111.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-110中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-110中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽包含所述IgV结构域或其特异性结合片段。
112.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-111中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-111中任一项所述的用途，其中所述IgV结构域或其特异性结合片段是所述变体ICOSL多肽或所述变体ICOSL融合蛋白的仅ICOSL部分。
113.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-112中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-112中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
114.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-113中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-113中任一项所述的用途，其中所述ICOSL参考多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。
115.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-114中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-114中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列或展现出与SEQID NO:36中所示序列的至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列同一性并且包含选自N52H、N57Y和Q100R的一个或多个氨基酸取代的序列。
116.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-115中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-115中任一项所述的用途，其中所述变体ICOSL多肽具有SEQ ID NO:36中所示序列。
117.根据权利要求59、61-65、66、68-73、74、76-103、104和106-116中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求60、61-65、67、68-73、75、76-103和105-116中任一项所述的用途，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的Fc区。
118.根据权利要求117所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求117所述的用途，其中所述Fc区是与野生型人免疫球蛋白的Fc相比展现出降低的效应子功能的变体Fc区。
119.根据权利要求117或权利要求118所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求117或权利要求118所述的用途，其中所述Fc区是与野生型人IgG1相比包含一个或多个氨基酸取代的变体IgG1 Fc区。
120.根据权利要求118或权利要求119所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求118或权利要求119所述的用途，其中所述变体Fc区包含选自N297G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K或L234A/L235E/G237A的一个或多个氨基酸取代，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
121.根据权利要求118-120中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求118-120中任一项所述的用途，其中所述变体Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
122.根据权利要求117-121中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求117-121中任一项所述的用途，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基根据Kabat的EU索引编号。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017250358B2 (en) 2016-04-15 2023-06-01 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
TW202208414A (zh) 2020-05-08 2022-03-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 April及baff抑制性免疫調節蛋白及其使用方法
WO2022103797A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineered protein for rapid, efficient capture of pathogen-specific antibodies
WO2023214705A1 (ko) * 2022-05-03 2023-11-09 고려대학교 산학협력단 Icos와의 결합력이 향상된 icos-l 변이체

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5443964A (en) 1987-08-10 1995-08-22 Duke University Poxvirus insertion/expression vector
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
AU674492B2 (en) 1991-05-06 1997-01-02 United States of America, as represented by the Department of Health and Human Services, The Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6361770B1 (en) 1994-09-23 2002-03-26 University Of British Columbia Method of enhancing expression of MHC class I molecules bearing endogenous peptides
DE69519521T2 (de) 1994-10-03 2001-06-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institute Of Health Zusammensetzung enthaltend ein antigen exprimierendes rekombinantes virus und ein immunstimulierendes molekül exprimierendes rekombinantes virus
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
AU726501B2 (en) 1996-06-04 2000-11-09 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during PCR
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
GB2337755B (en) 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
EP2272859B1 (en) 1998-08-07 2014-10-22 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
DK1916258T3 (da) 1999-08-09 2014-07-28 Genzyme Corp Forøgelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
WO2002014555A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
US7247615B2 (en) 2001-11-30 2007-07-24 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Peptide agonists of prostate-specific antigen and uses therefor
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
ITCZ20020002A1 (it) 2002-04-11 2003-10-13 Parco Scient E Tecnologico Del Dispositivo e metodo per il rilevamento simultaneo di differenti anticorpi e antigeni in campioni clinici, alimentari ed ambientali
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2301966A1 (en) 2002-12-16 2011-03-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
ZA200604864B (en) 2003-12-19 2007-10-31 Genentech Inc Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
EP2357201B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JP4958555B2 (ja) 2004-09-22 2012-06-20 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ４抗体
WO2006060314A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
MX348071B (es) 2011-03-16 2017-05-26 Amgen Inc Variantes de fc.
JP6054942B2 (ja) 2011-04-08 2016-12-27 イミューン デザイン コーポレイション 免疫原性組成物、ならびに体液性および細胞性免疫応答を誘発するための該組成物の使用方法
WO2013130684A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
EA201591806A1 (ru) 2013-03-15 2016-01-29 Байоджен Ма Инк. Лечение и профилактика острой почечной недостаточности с применением анти-альфа-v-бета-5 антител
WO2014207748A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Alexander Biro Soluble ctla-4 molecules and derivatives thereof for treatment of minimal change disease
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
JP2017522312A (ja) 2014-07-15 2017-08-10 イミューン デザイン コーポレイション Ｔｌｒ４アゴニストアジュバント及びレンチウイルスベクターを用いたプライム・ブーストレジメン
WO2016168771A2 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
AU2017250358B2 (en) * 2016-04-15 2023-06-01 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) * 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法

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