JP2021090441A - 調整可能な親和性を有する免疫調節タンパク質 - Google Patents

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Abstract

【課題】様々な免疫学的および腫瘍学的状態に対する治療的有用性を有する免疫調節タンパク質を提供する。【解決手段】免疫応答に関与する免疫タンパク質リガンドである結合パートナーに対する変化した結合親和性を示す免疫調節タンパク質であって、野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメイン中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも１つの親和性が改変された非免疫グロブリンＩｇＳＦドメインを含む、免疫調節タンパク質である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月17日に出願された「Immunomodulatory Proteins with Tunable Affinities」という表題の米国仮特許出願第62/149,437号および2015年9月14日に出願された「Immunomodulatory Proteins with Tunable Affinities」という表題の米国仮特許出願第62/218,534号の恩典を主張するものであり、それらの各々の内容は、参照によってその全体が組み入れられる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に出願される。配列表は、2016年4月15日に作成された761612000140SEQLIST.TXTという表題の377キロバイトサイズのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によってその全体が組み入れられる。
分野
本発明は、がんおよび免疫疾患の治療における免疫応答を調節するための治療用タンパク質に関する。
背景
抗原提示細胞（APC）または標的細胞とリンパ球との間で形成される免疫シナプス（IS）で起こるプロセスに介入することによる免疫応答の調節に関して医学的関心が高まっている。現在のところ、免疫応答を増強または抑制するために使用される生物製剤は、一般に、免疫グロブリン（例えば、抗PD-1 mAb）または可溶性受容体（例えば、Fc-CTLA4）に限定されている。可溶性受容体は、数多くの欠陥を抱えている。可溶性受容体は、タンパク質間相互作用に拮抗するのに有用であるが、このような相互作用を刺激する能力を欠いていることが多い。抗体は、これに関する制限が少ないと証明されており、そして、アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体の両方の例が当技術分野において公知である。それにもかかわらず、可溶性受容体および抗体は共に、ISにおいて機能するのに不可欠である重要な属性を欠いている。機構的には、ISにおける細胞表面タンパク質は、複数のタンパク質標的とこれらが結合する単一タンパク質との間の協調的でありかつ同時に起こることが多い相互作用に関与することができる。IS相互作用は、2つの細胞の接着部と密接に関連して起こり、そして、この構造体中の単一タンパク質は、同じ細胞上のタンパク質（シス）および関連細胞上のタンパク質（トランス）の両方と（おそらくは同時に）相互作用することができる。したがって、免疫応答の調節のための改善された分子のニーズがある。このようなニーズを満たす態様が提供される。
概要
本明細書において、免疫応答に関与する免疫タンパク質リガンドである結合パートナーに対する変化した結合親和性を示す、免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質は、免疫タンパク質リガンドの活性を調節（例えば、強化または低減）し、それによって免疫応答を調節することができる。いくつかの態様において、例えば、免疫応答の調節により治療可能な疾患または状態の免疫療法的処置における、1つまたは複数の免疫タンパク質リガンドを発現する細胞と提供される免疫調節タンパク質とを接触させることにより免疫応答を調節するための方法および使用も提供される。
いくつかの態様において、野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む、免疫調節タンパク質が本明細書において提供され、ここで：少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有し；かつ、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する。いくつかの態様において、少なくとも2つの同族結合パートナーは、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、そして、細胞表面分子種の各々は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、リンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインの結合は、リンパ球の免疫活性を調節する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して、向上した免疫活性をもたらすことができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して低下した免疫活性をもたらすことができる。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFメンバーである。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、IgVドメイン、IgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性が改変されたIgVドメイン、親和性が改変されたIgC1ドメインもしくは親和性が改変されたIgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む。いくつかの態様において、親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は、異なる同族結合パートナーに結合し、ここで、2つの親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの異なる同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する。いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々、同じ野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、異なる野生型IgSFドメインは、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを1つだけ含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、第二の親和性が改変されたIgSFをさらに含み、ここで、第二の親和性が改変されたIgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、B7ファミリーのメンバーである。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、またはICOSLGのドメインである。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80のドメインである。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、野生型CD80 IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変されたCD80免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む、免疫調節タンパク質が本明細書において提供され、ここで、少なくとも1つの親和性が改変されたCD80 IgSFドメインは、野生型CD80 IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、同族結合パートナーは、CD28およびPD-L1である。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、IgVドメインであり、かつ／または、親和性が改変されたCD80ドメインは、親和性が改変されたIgVドメインである。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列中に含有される野生型CD80ドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1以上20以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1以上10以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1以上5以下のアミノ酸置換を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、可溶性である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを欠いている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性が改変されたIgSFドメインを含む細胞外ドメイン（ECD）またはその特異的結合断片のみを含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、多量体化ドメインに連結されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている。いくつかの態様において、Fcドメインは、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである。いくつかの態様において、Fcドメインは、哺乳動物（任意でヒト）のものであるか；または、バリアントFcドメインは、哺乳動物（任意でヒト）のものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様において、Fcドメインまたはそのバリアントは、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、リンカーを介して間接的に連結されている。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、二量体である。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
また、少なくとも2つの非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む免疫調節タンパク質も提供され、ここで：少なくとも1つは、親和性が改変されたIgSFドメインであり、そして、少なくとも2つの非免疫グロブリンIgSFドメインは、各々独立して、少なくとも1つの異なる結合パートナーに結合する。いくつかの態様において、少なくとも2つの非免疫グロブリンIgSFドメインは、異なる結合パートナーに非競合的に結合する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、第一の野生型または未改変のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様において、該IgSFドメインのその他は、野生型または未改変のIgSFドメインである。いくつかの態様において、また、該IgSFドメインのその他は、親和性が改変されたIgSFドメインである。
上の免疫調節タンパク質のいずれかに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメイン（第一の親和性が改変されたIgSFドメインおよび第二の親和性が改変されたIgSFドメイン）を含有し、その中で、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、かつ、第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、そして、第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、少なくとも2つの非免疫グロブリンIgSFドメインは、異なる結合パートナーに非競合的に結合する。いくつかの態様において、第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、その同族結合パートナーに対する変化した結合性を示すように親和性が改変されている。したがって、いくつかの態様において、第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、親和性が改変されたIgSFドメインである。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第一の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示し；かつ、第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第二の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示す。いくつかの態様において、結合性の変化は、独立して、向上または低下のいずれかである。
いくつかの態様において、異なる同族結合パートナーは、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である。いくつかの態様において、異なる細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、異なる細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、リンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。いくつかの態様において、細胞への免疫調節タンパク質の結合は、リンパ球の免疫活性を調節する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して向上した免疫活性をもたらすことができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して、低下した免疫活性をもたらすことができる。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の改変されたIgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、異なる野生型IgSFドメインは、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、第一および第二の改変されたIgSFドメインは、非野生型の組み合わせである。いくつかの態様において、第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一の改変されたIgSFドメインおよび第二の改変されたIgSFドメインは各々個別に、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、B7ファミリーのメンバーである。いくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、CD80、CD86、またはICOSLGに由来する。いくつかの態様において、第一または第二の野生型IgSFドメインはB7ファミリーのメンバーに由来し、そして、第一または第二の野生型IgSFドメインの他方は別のIgSFファミリーに由来する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは、ICOSLGおよびNKp30に由来する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは、CD80およびNKp30に由来する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、ヒトIgSFメンバーである。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは各々個別に、IgVドメイン、およびIgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはその特異的結合である。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンドメインは各々個別に、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、改変IgVドメイン、改変IgC1ドメイン、もしくは改変IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンドメインまたは第二の改変された非免疫グロブリンドメインのうちの少なくとも1つは、改変IgVドメインである。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々個別に、1以上20以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々個別に、1以上10以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々個別に、1以上5以下のアミノ酸置換を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。いくつかの態様において、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々個別に、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、可溶性である。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、多量体化ドメインに連結されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている。いくつかの態様において、Fcドメインは、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである。いくつかの態様において、Fcドメインは、哺乳動物（任意でヒト）のものであるか；または、バリアントFcドメインは、哺乳動物（任意でヒト）のものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様において、Fcドメインまたはそのバリアントは、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、バリアントCD80ポリペプチドは、リンカーを介して間接的に連結されている。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は二量体である。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインと同じまたは異なる1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインをさらに含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインは、親和性が改変されたIgSFドメインである。
上記の免疫調節タンパク質のいずれか1つに係るいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係る免疫調節ポリペプチドをコードする核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの態様において、核酸分子は合成核酸である。いくつかの態様において、核酸分子はcDNAである。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係る核酸分子を含むベクターが本明細書において提供される。いくつかの態様において、ベクターは発現ベクターである。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係るベクターを含む細胞が本明細書において提供される。いくつかの態様において、細胞は真核細胞または原核細胞である。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を生産する方法であって、上記の態様のいずれか1つに係る核酸分子または上記の態様のいずれか1つに係るベクターを、細胞において該タンパク質を発現する条件下で宿主細胞に導入する工程を含む方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、該方法は、細胞から免疫調節タンパク質を単離または精製する工程をさらに含む。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係る免疫調節タンパク質を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は滅菌されている。
いくつかの態様において、バイアル中に上記の態様のいずれか1つに係る薬学的組成物を含む製造品が本明細書において提供される。いくつかの態様において、バイアルは密閉されている。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係る薬学的組成物、および使用説明書を含むキットが本明細書において提供される。
いくつかの態様において、上記の態様のいずれか1つに係る製造品、および使用説明書を含むキットが本明細書において提供される。
いくつかの態様において、対象における免疫応答を調節する方法であって、治療有効量の上記の態様のいずれか1つに係る免疫調節タンパク質を対象に投与する工程を含む方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、免疫応答を調節することは、対象における疾患または状態を治療する。いくつかの態様において、免疫応答を向上させる。いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。いくつかの態様において、疾患または状態は、黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍から選択される。いくつかの態様において、免疫応答を低下させる。いくつかの態様において、疾患または状態は、炎症性疾患または状態である。いくつかの態様において、疾患または状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬から選択される。
いくつかの態様において、親和性が改変された免疫調節タンパク質を同定する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書において提供される：a）少なくとも1つの改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインまたはその特異的結合断片を含む改変されたタンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとを、該タンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとの結合をもたらすことができる条件下で接触させる工程（ここで、少なくとも1つの改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む）；b）野生型IgSFドメインを含むタンパク質と比較して2つの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定する工程；ならびにc）少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程であって、それによって、親和性が改変された免疫調節タンパク質が同定される、工程。いくつかの態様において、工程b）は、野生型ドメインを含むタンパク質と比較して少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定することを含む。いくつかの態様において、工程a）の前に、1つまたは複数のアミノ酸置換を野生型IgSFドメインに導入し、それによって、改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を生成する。いくつかの態様において、改変されたタンパク質は、少なくとも2つの改変されたIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片を含み、ここで、第一のIgSFドメインは、第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、そして、第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一および第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは各々、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する。
いくつかの態様において、また、少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む免疫調節タンパク質も提供される。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの細胞表面分子種に非競合的に特異的に結合する。いくつかの態様において、分子種の各々は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。いくつかの態様において、分子種は、シス配置またはトランス配置にある。いくつかの態様において、哺乳動物細胞の1つは、リンパ球であり、そして、親和性が改変されたIgSFドメインの結合は、リンパ球の免疫活性を調節する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する2つの哺乳動物細胞に特異的に結合する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含み、そして、免疫調節タンパク質は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞に特異的に結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、ここで、親和性が改変されたIgSFドメインは、同じ種のIgSFドメインではない。
いくつかの態様において、2つの哺乳動物細胞のうちの1つは、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
いくつかの態様において、IgSF細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性が改変された哺乳動物IgSFメンバーを含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、親和性が改変されたIgV、IgC1、またはIgC2ドメインである。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、その野生型IgSFドメインと1以上10以下のアミノ酸置換だけ異なる。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、その野生型IgSFドメインと1以上5以下のアミノ酸置換だけ異なる。
いくつかの態様において、親和性が改変されたヒトIgSFメンバーは、CD80、PVR、ICOSLG、またはHAVCR2のうちの少なくとも1つである。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも1つの親和性が改変されたヒトCD80ドメインを含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、ヒトCD80 IgSFドメインである。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも85％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも95％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有する免疫調節タンパク質は、第二の免疫調節タンパク質をさらに含み、ここで、第二の免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有する。
いくつかの態様において、免疫活性は増強される。他の場合には、それは抑制される。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、正確に1つのIgSFメンバーに非競合的に特異的に結合する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、直接または間接的に、抗体の結晶化可能断片（Fc）に共有結合されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、可溶性である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に埋め込まれている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、分子間ジスルフィド結合によって二量体化されている。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、薬学的に許容し得る担体中にある。
別の局面において、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。親和性が改変されたIgSFドメインは各々、それ自体の細胞表面分子種に特異的に結合する。分子種の各々は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現し、そして、哺乳動物細胞の1つは、リンパ球である。分子種は、いくつかの態様において、シス配置またはトランス配置にある。親和性が改変されたIgSFドメインの結合は、リンパ球の免疫活性を調節する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、競合的に結合する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、同じ種のIgSFドメインではない。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、非野生型の組み合わせである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインは、CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、NKp30、またはCD200R1のうちの少なくとも1つに由来する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された哺乳動物IgSFメンバーを含む。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、NKp30、またはCD200R1の少なくとも2つである。いくつかの態様において、免疫活性は増強される。いくつかの態様において、免疫活性は抑制される。いくつかの態様において、2つの哺乳動物細胞のうちの1つは、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。いくつかの態様において、2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。いくつかの態様において、2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、正確に1つの細胞表面分子種に特異的に結合する。いくつかの態様において、2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgV、IgC1、またはIgC2ドメインのうちの少なくとも1つである。いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインの各々は、その野生型IgSFドメインと1以上10以下のアミノ酸置換だけ異なる。いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインの各々は、その野生型IgSFドメインと1以上5以下のアミノ酸置換だけ異なる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、直接または間接的に、抗体の結晶化可能断片（Fc）に共有結合されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、薬学的に許容し得る担体中にある。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、可溶性である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に埋め込まれている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、分子間ジスルフィド結合によって二量体化されている。
別の局面において、本発明は、上にまとめた免疫調節タンパク質のいずれかをコードする組換え核酸に関する。
別の局面において、本発明は、上にまとめた免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
別の局面において、本発明は、上にまとめたとおりの発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
別の局面において、本発明は、上にまとめた免疫調節タンパク質のいずれかを製造する方法に関する。該方法は、組換え宿主細胞を免疫調節タンパク質発現条件下で培養する工程、組換え発現ベクターによってコードされる免疫調節タンパク質を該細胞において発現させる工程、および、それにより発現した組換え免疫調節タンパク質を精製する工程を含む。
別の局面において、本発明は、増強または抑制された免疫応答を必要とする哺乳動物患者を治療する方法であって、治療有効量の上記の態様のいずれかの免疫調節タンパク質を投与することによる方法に関する。いくつかの態様において、増強された免疫応答は、患者における黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍を治療する。いくつかの態様において、抑制された免疫応答は、患者におけるクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬を治療する。
未標識組換えヒトPD-L1-his、ヒトCTLA-4-his、またはヒトPD-L2-Fc融合タンパク質の存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えCD28 Fc融合タンパク質（rCD28.Fc）の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。 未標識組換えヒトrCD28.Fc、ヒトCTLA-4.Fc、またはヒトPD-L2.Fcの存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。
参照による組み入れ
本明細書において言及される全ての刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）は、それぞれ個々の刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）が参照によって組み入れられると具体的にかつ個別に示されたかのように同程度に、参照によってその全体が全ての目的において本明細書に組み入れられる。本明細書に示される定義が参照によって本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願および他の刊行物に示される定義に反しているかまたは他に矛盾している場合、本明細書に示される定義が参照によって本明細書に組み入れられる定義より優先される。
詳細な説明
1つまたは複数（概して2つ以上）のタンパク質リガンドに結合して免疫学的免疫応答を調節する（例えば、誘導する、増強する、または抑制する）ことができる可溶性免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。いくつかの態様において、タンパク質リガンドは、（例えば、リンパ球上の）1つまたは複数の他の免疫受容体と会合して阻害シグナルまたは活性化シグナルを誘導する、免疫細胞が発現する細胞表面タンパク質である。例えば、リンパ球上のある種の受容体とそれらの同族細胞表面リガンドとの相互作用によって抗原提示細胞（APC）または標的細胞とリンパ球との間で免疫シナプス（IS）を形成することは、免疫系を制御できる共刺激シグナルまたは阻害シグナルをもたらすことができる。いくつかの局面において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、細胞表面タンパク質リガンドとそれらの受容体との相互作用を変化させ、それによって、免疫細胞（例えば、T細胞）の活性を調節することができる。
いくつかの態様において、正常な生理学的条件下では、T細胞媒介性免疫応答は、T細胞受容体（TCR）による抗原認識によって開始され、かつ、共刺激シグナルと阻害シグナル（すなわち、免疫チェックポイントタンパク質）とのバランスによって制御される。免疫系は、自己免疫を抑制する（すなわち、自己寛容）、および、免疫応答の間（例えば、病原体感染に対する攻撃の間）の過度の損傷から組織を保護する、免疫チェックポイントに依拠する。しかしながら、いくつかの場合では、これらの免疫調節タンパク質は、腫瘍を含む疾患および状態において、免疫系を回避するための機序として脱制御されている可能性がある。
したがって、いくつかの局面において、T細胞活性のような免疫細胞活性を変化させる免疫療法は、免疫応答が脱制御されているある種の疾患および状態を治療することができる。ISにおける相互作用を調節しようとする治療アプローチは、複数のIS標的に同時にかつ時系列および空間的方向性に感受性である様式で結合する能力から恩恵を受けるだろう。現行の治療アプローチは、この目標に達していない。むしろ、可溶性受容体および抗体は、典型的には、一度にわずか1つの標的タンパク質に結合する。これは、複数の標的種が存在しないことに起因し得る。さらに、野生型受容体およびリガンドが保有する同族結合パートナーに対する親和性は低く、これは、可溶性治療薬としてのそれらの使用を妨げている。
しかしながら、大きな問題ではないが、可溶性受容体および抗体は、一般に、（例えば、一度にわずか1つの標的種に）競合的に結合し、それゆえ、複数の標的に同時に結合する能力を欠いている。そして、一方で、二重特異性抗体、および二つの抗原結合領域を含むモダリティは、複数の標的分子に同時に結合することができるが、これらのモダリティに特有の三次元配置は、しばしば、それらの時間的および空間的要件に合致するやり方でこれらがISにおいて起こる重要なプロセスに介入することを妨げる。
必要とされるものは、抗体または可溶性受容体の特異性および親和性を有するが、加えて、ISにおいて必要とされるサイズ、体積、および空間的方向性の制約を維持し、かつ、それぞれの同族結合パートナーに対して向上した親和性を保有する、全く新しいクラスの治療用分子である。さらに、このような治療薬は、それらの標的に非競合的および競合的に結合する能力を有するだろう。それゆえ、これらの特性を備えた分子は、ISにおいて多タンパク質複合体へ一体化する能力において新規機能を有し、かつ、所望の結合配置および結果としてもたらされる生物学的活性を生じさせるだろう。
この目的に向けて、新たに出現した免疫腫瘍学治療法は、腫瘍により誘導されるT細胞寛容を安全に破壊することを必要とする。現在の最先端の免疫治療薬は、T細胞エフェクター機能を制限することが知られているB7/CD28ファミリーの中心的阻害分子である、PD-1またはCTLA4をブロックする。このような単一標的に対するアンタゴニスト抗体は、免疫シナプスチェックポイントシグナル伝達複合体を崩壊させるように機能するが、同時にT細胞を活性化するには不十分である。反対に、二重特異性抗体アプローチは、T細胞を活性化するが、それと同時に、誘導されたシグナルを制御する阻害リガンドをブロックするには、不十分である。
これらの欠点に取り組むために、いくつかの態様において、T細胞活性化シグナル伝達の刺激と阻害性制御のブロックの両方を同時に行う、治療用分子が提供される。いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質は、T細胞活性化および阻害リガンドのブロックの両方における二つの役割を有することが知られている、免疫シナプスの免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）成分に関する。特定の局面において、提供される免疫調節タンパク質は、親和性が改変された天然の免疫リガンドを使用した免疫療法プラットフォームであって、様々な腫瘍学的および免疫学的適応症の治療における、調整可能な親和性でそれらの同族免疫受容体の1つまたは複数に結合する免疫療法生物製剤を生成するプラットフォームを提供する。いくつかの局面において、ヒト免疫系リガンドのような免疫系リガンドから改変されたIgSFベースの治療薬は、それ自体、免疫シナプスの重要な経路に正常に集合するそれらの能力を保持し、かつ、抗体または次世代の二重特異性試薬ができない方法で正常な相互作用および制御機能を維持する可能性がより高い。これは、抗体のその相対的に大きなサイズ、および、これらが免疫シナプスの天然成分ではないという事実に起因する。ヒト免疫系リガンドのこれらの固有の特徴は、新たなレベルの免疫療法的有効性および安全性を提供することを約束する。
本明細書において使用される項目の見出しは、単に構成を目的としたものであって、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
I．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての専門用語、注記、ならびに他の技術および科学用語または関連用語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有することを意図する。いくつかの場合では、通常理解されている意味を有する用語は、明確化のためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義され、そして、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも一般に当技術分野において理解されているものと大きな差異をなすと解釈されるべきではない。
本明細書を通して使用される用語は、特定の事例において別段限定されない限り、以下のとおり定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その文脈が他のことを明確に指示しない限り、複数形の指示対象を含む。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語、頭字語、ならびに略称は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。別段の指示のない限り、化学名および生化学名の略称および記号は、IUPAC-IUB命名法による。別段の指示のない限り、全ての数値範囲は、その範囲を規定する値だけでなくその間の全ての整数値も含む。
用語「親和性が改変された」は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの文脈において使用される場合、野生型（すなわち、親和性が改変されていない）IgSF対照ドメインと比較してその同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する結合親和性またはアビディティが（野生型対照IgSFドメインと比べて）向上または低下するように変化したアミノ酸配列を有する哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを意味する。いくつかの態様において、IgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメイン中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上のアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換）を含有することができる。野生型IgSF対照ドメインと比較してその同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する結合親和性またはアビディティが（野生型対照IgSFドメインと比べて）向上または低下していない変化したアミノ酸配列を有するIgSFドメインは、親和性が改変されていないIgSFドメインである。結合親和性またはアビディティの向上または低下は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005)。また、Linsley et al., Immunity, 1: 7930801 (1994) も参照されたい。その同族結合パートナーに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの向上は、野生型IgSFドメイン対照よりも少なくとも10％大きい値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値よりも少なくとも20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％、または10000％大きい値になる向上である。その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの低下は、対照の90％以下であるが野生型IgSFドメイン対照値の10％以上の値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値の80％、70％、60％、50％、40％、30％、または20％以下であるが10％以上の値になる低下である。親和性が改変されたタンパク質は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。用語「親和性が改変されたIgSFドメイン」は、親和性が改変されたIgSFドメインが作製された任意の特定の出発組成物または方法のあらゆる条件を強要するものと解釈されるべきではない。したがって、本発明の親和性が改変されたIgSFドメインは、その後、任意の特定の親和性改変プロセスによって親和性が改変されたIgSFドメインへと変換される野生型IgSFドメインに限定されない。親和性が改変されたIgSFドメインポリペプチドは、例えば、野生型哺乳動物IgSFドメイン配列情報から開始して生成され、次いで、その同族結合パートナーに対する結合性についてインシリコでモデル化され、そして、最後に組換えまたは化学合成されて、主題の親和性が改変されたIgSFドメイン組成物を生成することができる。別のほんの一例として、親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメインの部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、親和性が改変されたIgSFドメインは、任意の所与のプロセスによって生産されるが必ずしもその必要はない、生成物を表す。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む様々な技術を採用してもよい。
用語「結合親和性」および「結合アビディティ」は、本明細書において使用される場合、それぞれ、特異的結合条件下での、その同族結合パートナーに対するタンパク質の特異的結合親和性および特異的結合アビディティを意味する。生化学速度論では、アビディティは、例えばIgSFドメインとその同族結合パートナーとの間の、個々の非共有結合相互作用の多重親和性の累積強度を指す。このように、アビディティは、単一の相互作用の強度を表す親和性とは異なる。結合親和性またはアビディティを決定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005) を参照されたい。
用語「生物学的半減期」は、ある物質（例えば、本発明の免疫調節ポリペプチド）が、その薬理学的または生理学的活性または濃度の半分を喪失するのに要する時間の長さを指す。生物学的半減期は、物質の排除、排出、分解（例えば、酵素的）、または体内のある種の臓器もしくは組織中の吸収および濃度によって影響を受けることができる。いくつかの態様において、生物学的半減期は、物質の血漿中濃度がその定常状態レベルの半分に達するのに要する時間（「血漿半減期」）を決定することによって評価することができる。本発明のポリペプチドを誘導体化してその生物学的半減期を増加するために使用することができるコンジュゲートは、当技術分野において公知であり、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）、XTEN（伸長組換えペプチド；国際公開公報第2013130683号を参照のこと)、ヒト血清アルブミン（HSA）、ウシ血清アルブミン（BSA）、脂質（アシル化）、およびポリ-Pro-Ala-Ser（PAS）、ポリグルタミン酸（グルタミル化）を含むがそれらに限定されない。
タンパク質（例えば、IgSFドメインまたは親和性が改変されたIgSFドメイン）に関して、用語「同族結合パートナー」は、参照タンパク質が特異的結合条件下で特異的に結合する少なくとも1つの分子（典型的には、天然の哺乳動物タンパク質）を指す。特異的結合条件下で認識されてその同族受容体に特異的に結合するリガンドの一種は、その受容体の同族結合パートナーの一例である。「同族細胞表面結合パートナー」は、哺乳動物細胞の表面に発現する同族結合パートナーである。本発明において、「細胞表面分子種」は、免疫シナプスを形成する細胞（例えば哺乳動物細胞）の表面に発現するかまたは該細胞が発現する、免疫シナプス（IS）の同族結合パートナーである。
用語「競合的結合」は、本明細書において使用される場合、あるタンパク質が、少なくとも2つの同族結合パートナーに特異的に結合することができるが、1つの同族結合パートナーの特異的結合が第二の同族結合パートナーの同時結合を阻害する（例えば、妨害するまたは妨げる）ことを意味する。したがって、いくつかの場合では、あるタンパク質が2つの同族結合パートナーに同時に結合することはできない。一般に、競合結合剤は、特異的結合のための同じまたは重複した結合部位を含有するが、これは必須要件ではない。いくつかの態様において、競合的結合は、第二の同族結合パートナーの特異的結合に起因して、その同族結合パートナーの1つへのタンパク質の特異的結合の測定可能な（部分的または完全な）阻害を引き起こす。ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイなどの競合的結合を定量する様々な方法が公知である。
用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書において使用される場合、あるアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備える側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている、アミノ酸置換を意味する。類似の化学特性を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例は、1）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；2）脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；3）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；5）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；6）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに7）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。保存的アミノ酸置換の群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
タンパク質の位置に関する「に対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が（例えば、配列表に示される）開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置「に対応する」という記述は、構造配列アライメントに基づいてまたは標準的なアライメントアルゴリズム（例えば、GAPアルゴリズム）を使用して、開示された配列とのアライメントによって同定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を規準として使用して、対応する残基を同定することができる。
用語「サイトカイン」は、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFN）、ケモカイン、造血成長因子、腫瘍壊死因子（TNF）、およびトランスフォーミング成長因子を含むが、それらに限定されない。一般に、これらは、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖、および分化を制御する、低分子量タンパク質である。
用語「低下（減少）させる」または「軽減する」または「抑制する」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量だけ低下（減少）させることを意味する。低下（減少）は、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％であることができる。
用語「誘導体」または「誘導体化されている」は、その治療的恩恵を保持または増強させながら、半減期、バイオアベイラビリティ、免疫原性、溶解性、毒性、効力、または有効性などの特性を変化させるための、免疫調節タンパク質を直接または間接的に共有結合させることによる免疫調節タンパク質の修飾を指す。誘導体は、グリコシル化、ペグ化、脂質化、またはFc融合によって製造することができる。
本明細書において使用される場合、ドメイン（典型的には、3以上、一般に5または7またはそれ以上のアミノ酸、例えば10〜200のアミノ酸残基の配列）は、分子の他の部分と構造的および／または機能的に異なりかつ同定可能な分子（例えば、タンパク質またはコーディング核酸）の一部を指す。例えば、ドメインは、1つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立して折り畳まれた構造を形成することができ、かつ／または結合活性などの機能活性によって認識される、ポリペプチド鎖の一部を含む。タンパク質は、1つまたは複数の別個のドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連ファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性、例えばモチーフに対する相同性によって、同定、定義、または識別することができる。別の例では、ドメインは、その機能（例えば、同族結合パートナーなどの生体分子と相互作用する能力）によって識別することができる。ドメインが独立してまたは別の分子に融合して、活動（例えば、結合）を遂行することができるように、ドメインは、独立して、生物学的機能または活性を示すことができる。ドメインは、線形のアミノ酸配列または非線形のアミノ酸配列であることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、公知であり、かつ、当業者が同定することができる。本明細書における例示のため、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは十分に当技術分野の技能の範囲内であると理解される。必要であれば、ドメインを同定するために適切なソフトウェアを採用することができる。IgSFドメインのドメイン構成を説明するために使用されるSEQ ID NOとして示される特定の配列を含めたアミノ酸についての言及は、説明を目的としており、提供される態様の範囲を限定することを意味していないことが理解される。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、類似の分子との相同性分析およびアライメントに基づいて理論的に導出されることが理解される。したがって、正確な遺伝子座は、変化することができ、必ずしもタンパク質毎に同じとは限らない。よって、特定のIgSFドメイン、例えば特定のIgVドメインまたはIgCドメインは、数個のアミノ酸（1、2、3または4個）長めまたは短めになることができる。
用語「エクトドメイン」は、本明細書において使用される場合、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）の、小胞膜の外側にある領域を指す。エクトドメインは、しばしば、リガンドまたは細胞表面受容体に特異的に結合する結合ドメインを含む。細胞膜貫通型タンパク質のエクトドメインは、代替的に細胞外ドメインと称される。
用語「有効量」または「治療有効量」は、単独（すなわち、単剤療法として）または追加の治療剤との組み合わせのいずれかでエクスビボ（患者由来の細胞との接触による）またはインビボ（患者への投与による）投与されたとき、例えば、疾患の症状および／または病因を改善するまたは排除することなどによって、疾患進行の統計的に有意な阻害をもたらす、本発明の治療用組成物の量および／または濃度を指す。免疫系の疾患または障害を治療するための有効量は、疾患または障害と関連する少なくとも1つの症状もしくは生物学的応答もしくは影響を緩和する、低下させる、もしくは軽減する、疾患または障害の進行を妨害する、または患者の身体機能を改善する量であり得る。いくつかの態様において、患者は、ヒト患者である。
本明細書において哺乳動物リンパ球の免疫活性を向上させる文脈で使用される場合、用語「増強された」または「向上した」は、インターフェロンγ（IFN-γ）産生を、例えば統計的に有意な量だけ増加させることを意味する。いくつかの態様において、免疫活性は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイにおいて評価することができる。MLRアッセイを実行する方法は、当技術分野において公知である。Wang et al.、Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56。いくつかの態様において、増強は、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％高い増加であることができる。
用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターによってコードされるタンパク質を発現させるために使用することができる細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（E. coli）であることができるか、または、宿主細胞は、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであることができる。宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地で成長するVeggie CHOおよび関連細胞株またはDHFR欠損であるCHO系統DX-B11を含む。
用語「免疫シナプス」は、本明細書において使用される場合、MHC（主要組織適合複合体）IまたはMHC IIを発現する哺乳動物細胞（例えば、抗原提示細胞または腫瘍細胞）と、哺乳動物リンパ球（例えば、エフェクターT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞）との間の接触面を意味する。
用語「免疫グロブリン」（「Ig」と略記される）は、本明細書において使用される場合、用語「抗体」（「Ab」と略記される）と同義であり、かつ、5種のヒトクラス：IgA（サブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG（サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、およびIgMのいずれかを含む哺乳動物免疫グロブリンタンパク質を指す。該用語はまた、完全または部分的合成（例えば、組換えまたは化学合成）であるか天然に産生されるかにかかわらず全長未満である免疫グロブリン、例えば、抗原結合断片（Fab）、VHおよびVLを含有する可変断片（Fv）、1つの鎖中で一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片（scFv）、ならびに他の抗体V領域断片（Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、dsFvダイアボディ、Fc、およびFdポリペプチド断片）を含む。ホモ二重特異性およびヘテロ二重特異性の二重特異性抗体は、該用語の範囲内に含まれる。
免疫グロブリン分子のFc（結晶性断片）領域またはドメイン（Fcポリペプチドとも呼ばれる）は、主に免疫グロブリン重鎖の定常領域に対応し、かつ、抗体のエフェクター機能を含む種々の機能に関与している。免疫グロブリンFc融合物（「Fc融合物」）は、免疫グロブリンのFc領域に機能的に連結されている1つまたは複数のポリペプチド（または1つまたは複数の低分子）を含む分子である。Fc融合物は、例えば、抗体のFc領域（薬物動態を促進する）および野生型もしくは親和性が改変された免疫グロブリンスーパーファミリードメイン（「IgSF」）のIgSFドメイン、または他のタンパク質もしくはその断片のFc領域を含み得る。いくつかの態様において、Fcは、さらに、エフェクター機能を促進する。いくつかの態様において、Fcは、エフェクター機能を促進する低下した（例えば、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上低下した）活性を示すバリアントFcである。IgSFドメインは、同族結合パートナーの認識を媒介する（抗原に対する抗体の抗体可変領域の認識に匹敵する）。免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数のポリペプチドまたは低分子（融合パートナー）に間接的または直接的に連結し得る。種々のリンカーは、当技術分野において公知であり、これを使用して、Fcを融合パートナーに連結させてFc融合物を生成することができる。本発明のFc融合タンパク質は、典型的には、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインに直接または間接的に共有結合された免疫グロブリンFc領域を含む。同一種のFc融合物は、二量体化してFc融合ホモ二量体を形成することができるか、または、非同一種を使用してFc融合ヘテロ二量体形成することができる。
用語「免疫グロブリンスーパーファミリー」または「IgSF」は、本明細書において使用される場合、細胞の、認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の群を意味する。分子は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）と共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして類別され；これらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを保有する。IgSFのメンバーは、免疫系の、細胞表面抗原受容体、共受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある種のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋タンパク質を含む。これらは、通常、免疫系における役割と関連する。免疫シナプス中のタンパク質は、IgSFのメンバーであることが多い。IgSFはまた、機能のような共通の特性に基づいて「サブファミリー」に分類することができる。このようなサブファミリーは、典型的には、4〜30のIgSFメンバーからなる。
用語「IgSFドメイン」または「免疫グロブリンドメイン」または「Igドメイン」は、本明細書において使用される場合、IgSFタンパク質の構造ドメインを指す。Igドメインは、免疫グロブリン分子に因んで命名される。これらは、約70〜110アミノ酸を含有し、かつ、それらのサイズおよび機能に従って類別される。Igドメインは、逆平行β鎖の2つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する、特徴的なIgフォールドを保有する。サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸間の相互作用ならびにBおよびF鎖中のシステイン残基間で形成される高度に保存されているジスフィルド結合は、Igフォールドを安定化させる。Igドメインの一端は、抗体のそれらのリガンドに対する特異性に重要な相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。Ig様ドメインは、IgV、IgC1、IgC2、またはIgIとして（クラスに）分類することができる。ほとんどのIgドメインは、可変（IgV）ドメインまたは定常（IgC）ドメインのいずれかである。9つのβ鎖を有するIgVドメインは、一般に、7つのβ鎖を有するIgCドメインより長い。IgSFのいくつかのメンバーのIgドメインは、アミノ酸配列中のIgVドメインと似ているが、なおIgCドメインとサイズが類似している。これらは、IgC2ドメインと呼ばれ、一方で、標準的なIgCドメインは、IgC1ドメインと呼ばれる。T細胞受容体（TCR）鎖は、細胞外部分における2つのIgドメイン（1つはN末端におけるIgVドメインおよび1つは細胞膜に隣接するIgC1ドメイン）を含有する。
用語「IgSF種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を有するIgSFメンバータンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、そのIgSFメンバーに属する全てのIgSF種にユニークの同一性を規定する。したがって、各IgSFファミリーメンバーは、他のIgSFファミリーメンバーと比べてユニークであり、したがって、特定のIgSFファミリーメンバーの各種は、別のIgSFファミリーメンバー種と比べてユニークである。それにもかかわらず、同じIgSF種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で生じ得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一のIgSF種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因のIgSF種の野生型短縮形態と同様、単一のIgSF種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面IgSF種」は、細胞（一般に哺乳動物細胞）の表面に発現するIgSF種である。
用語「免疫活性」は、哺乳動物リンパ球の文脈において本明細書で使用される場合、当該リンパ球におけるケモカインまたはインターロイキンなどのサイトカインの発現を意味する。免疫活性の増強または抑制を決定するためのアッセイは、インターフェロン-γ用のMLRアッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56）、SEB（ブドウ球菌エンテロトキシンB）T細胞刺激アッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56）、および抗CD3 T細胞刺激アッセイ（Li and Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104）を含む。免疫応答の誘導は、静止リンパ球と比べて免疫活性の向上をもたらす。本発明の免疫調節タンパク質または親和性が改変されたIgSFドメインは、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ（インターフェロン-γ）発現を、野生型IgSFメンバーまたはIgSFドメイン対照と比べて、いくつかの態様において増加させることができ、または、代わりの態様において減少させることができる。当業者は、IFN-γ発現の増加を決定するために使用される初代T細胞アッセイのフォーマットが、IFN-γ発現の減少についてアッセイするために採用されるフォーマットと異なることを認識するだろう。初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を減少させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性が改変されたIgSFドメインの能力についてアッセイする際には、混合リンパ球反応（MLR）アッセイを実施例6に記載されるとおり使用することができる。好都合には、本発明の可溶性形態の親和性が改変されたIgSFドメインを採用して、実施例6に同様に記載されるとおり、MLRにおけるIFN-γ発現と拮抗することによりその発現を減少させるその能力を決定することができる。あるいは、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性が改変されたIgSFドメインの能力についてアッセイする際に、同時固定アッセイを使用することができる。同時固定アッセイでは、T細胞受容体シグナル（いくつかの態様において、抗CD3抗体によって提供される）を同時固定された親和性が改変されたIgSFドメインと併用して、野生型IgSFドメイン対照と比べてIFN-γ発現を増加させる能力を決定する。
「免疫調節タンパク質」は、免疫活性を調節するタンパク質である。免疫応答の「調節」またはそれを「調節する」とは、免疫活性が増強されるかまたは抑制されるかのいずれかであることを意味する。免疫調節タンパク質は、単一のポリペプチド鎖、または、例えば鎖間ジスフィルド結合によって互いに共有結合された少なくとも2つのポリペプチド鎖の多量体（二量体またはより高次の多量体）であることができる。したがって、単量体、二量体、およびより高次の多量体タンパク質は、その定義された用語の範囲内である。多量体タンパク質は、（同一のポリペプチド鎖の）ホモ多量体または（異なるポリペプチド鎖の）ヘテロ多量体であることができる。
用語「向上（増加）させる」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量だけ向上（増加）させることを意味する。向上（増加）は、非ゼロ対照値より少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、またはそれより高い向上（増加）であることができる。
用語「リンパ球」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系の白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する)、T細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する)、およびB細胞（体液性の抗体駆動性獲得免疫に関する）を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球（ILC）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
用語「哺乳動物」、「対象」または「患者」は、具体的には、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも1つへの言及を含む。
用語「調節する」は、哺乳動物免疫応答のような免疫応答の文脈において本明細書で使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質の投与の結果として起こる既存のまたは潜在的な免疫応答の任意の変化（例えば、向上または低下）を指す。したがって、調節は、免疫調節タンパク質の投与の非存在下で起こるまたは存在する免疫応答と比較した免疫応答の変化（例えば、向上または低下）を指す。このような調節は、免疫細胞の免疫活性の、任意の誘導、または度合いもしくは程度の変化、または抑制を含む。免疫細胞は、B細胞、T細胞、NK（ナチュラルキラー）細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）、および非プロフェッショナル抗原提示細胞、ならびに炎症細胞（好中球、マクロファージ、単球、好酸球、および好塩基球）を含む。調節は、既存の免疫応答、発生段階にある免疫応答、潜在的な免疫応答に与えられる任意の変化、または免疫応答を、誘導する、制御する、それに影響を及ぼす、もしくは応答する能力を含む。調節は、免疫応答の一部としての、免疫細胞における、遺伝子、タンパク質および／または他の分子の、発現および／または機能の任意の変化を含む。免疫応答の調節または免疫活性の調節は、例えば、以下を含む：免疫細胞の排除、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の誘導または生成；免疫細胞における無応答状態の誘導（すなわち、アネルギー）；免疫細胞の活性または機能を増強または抑制すること（これらの細胞が発現するタンパク質のパターンを変化させることを非限定に含む）。例には、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、もしくは他の細胞表面受容体のようなある分子クラスの変化した産生および／もしくは分泌、またはこれらの調節事象の任意の組み合わせを含む。調節は、例えば、初代T細胞アッセイにおいて、野生型もしくは未改変のIgSFドメイン対照に対するまたは比較したIFN-γ（インターフェロン-γ）発現の変化によって評価することができる（Zhao and Ji, Exp Cell Res. 2016 Jan1; 340(1) 132-138 を参照のこと)。
用語「分子種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を備えたタンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、同一のまたは実質的に同一の分子種の集合体を規定する。したがって、例えば、ヒトCD80はIgSFメンバーであり、各ヒトCD80分子はCD80の一種である。同じ分子種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化のような翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一の分子種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因の単一の分子種の野生型短縮形態と同様、単一の分子種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面分子種」は、哺乳動物細胞の表面に発現する分子種である。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方のみ又はもう一方のみに存在する（しかし両方ではない）、2つ以上の異なるタンパク質種は、互いに「シス」または「シス配置」にあると言われる。第一のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第一の細胞のみに存在し、第二のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第二の細胞のみに存在する、2つの異なるタンパク質種は、「トランス」または「トランス配置」にあると言われる。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞の両方に存在する、2つの異なるタンパク質種は、これらの細胞上でシス型およびトランス型の両配置にある。
用語「非競合的結合」は、本明細書において使用される場合、少なくとも2つの同族結合パートナーに同時に特異的に結合するタンパク質の能力を意味する。いくつかの態様において、結合は、特異的結合条件下で起こる。したがって、タンパク質は、少なくとも2つの異なる同族結合パートナーに同時に結合することができるが、結合相互作用は、同じ期間である必要はないので、いくつかの場合では、タンパク質は、同族結合パートナーの1つにのみ特異的に結合される。いくつかの態様において、同時結合は、1つの同族結合パートナーの結合が第二の同族結合パートナーへの同時結合を実質的に阻害しないようなものである。いくつかの態様において、非競合的結合は、タンパク質上のその結合部位への第二の同族結合パートナーの結合が、タンパク質上のその結合部位への第一の同族結合パートナーの結合に置き換わらないことを意味する。非競合的結合を評価する方法は、Perez de La Lastra et al.， Immunology， 1999 Apr: 96(4): 663-670 に記載されている方法など、当技術分野において周知である。いくつかの場合では、非競合的相互作用において、第一の同族結合パートナーは、第二の同族結合パートナーの相互作用部位と重複しない相互作用部位で、第二の同族結合パートナーの結合が第一の同族結合パートナーの結合と直接干渉しないように、特異的に結合する。したがって、第二の同族結合パートナーの結合による同族結合パートナーの結合へのあらゆる影響は、第一の同族結合パートナーの結合との直接的な干渉以外の機序を介するものである。例えば、酵素-基質相互作用の状況では、非競合的阻害剤は、酵素の活性部位以外の部位に結合する。非競合的結合は、第二の同族結合パートナーが、第一の同族結合パートナーの結合と重複しない相互作用部位で特異的に結合するが、第一の相互作用部位が第一の同族結合パートナーに占有されているときだけ第二の相互作用部位に結合する、非競合的な結合相互作用を包含する。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の核酸残基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のポリマーを指す。別段の限定されない限り、該用語は、公知の天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸、およびそれと類似の結合特性を有する核酸、および天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で代謝される核酸を包含する。他に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的ヌクレオチド配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成してもよい。核酸またはポリヌクレオチドという用語は、遺伝子によってコードされるcDNAまたはmRNAを包含する。
用語「薬学的組成物」は、哺乳動物対象、しばしばヒトにおける、薬学的用途に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性剤（例えば、本発明の免疫調節タンパク質）と担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、それぞれ、典型的には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤である。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、かつ、ペプチド結合を介して連結されている2つ以上のアミノ酸の分子鎖を指す。該用語は、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。該用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。該用語はまた、合成するかまたは公知のタンパク質改変技術を使用して組換え発現することができるような、1つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準なもしくは非天然アミノ酸が含まれる分子も含む。加えて、タンパク質は、周知の有機化学技術によって本明細書に記載されるとおり誘導体化することができる。
用語「初代T細胞アッセイ」は、本明細書において使用される場合、インターフェロン-γ（「IFN-γ」）発現を測定するためのインビトロアッセイを指す。実施例6に記載されるアッセイのような様々なこのような初代T細胞アッセイが当技術分野において公知である。好ましい態様において、使用されるアッセイは、抗CD3同時固定アッセイである。このアッセイでは、初代T細胞が、追加の組換えタンパク質と共にまたはそれなしで固定された抗CD3によって刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。別の態様において、使用されるアッセイは、混合リンパ球反応（MLR）である。このアッセイでは、初代T細胞が、同種異系APCで刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。標準的なELISA技術によって培養上清中のヒトIFN-γレベルを測定する。市販のキットが供給業者から入手可能であり、製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。
用語「精製されている」は、本発明の核酸または免疫調節タンパク質に適用される場合、一般に、当技術分野において周知の分析技術によって決定したときに他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを表す（例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフ溶出液、および／または密度勾配遠心分離に供された媒体中で、離散バンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中で基本的に1つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。本発明の精製された核酸または免疫調節タンパク質は、少なくとも約50％純粋、通常、少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％またはそれ以上純粋（例えば、重量パーセントまたはモルベース）である。
用語「組換え」は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入によって人工的に（すなわち、非天然に）変化していることを示す。該変化は、その天然の環境もしくは状態内のまたはそこから取り出された物質に対して実施することができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、親和性改変、DNAシャッフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組換えることによって製造されるものである。「組換えDNA分子」は、このような分子生物学的技術によって一緒に接合されたDNAのセグメントから構成される。用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、組換えDNA分子を使用して発現されるタンパク質分子（例えば、免疫調節タンパク質）を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有するおよび／または発現する細胞である。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列アレイからなる。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルス中の遺伝子を含め様々な真核生物源から単離されている（類似した制御エレメント、すなわち、プロモーターはまた原核生物中にも見いだされる）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどんな細胞タイプが使用されるべきであるかに依存する。用語「機能的な組み合わせにある」、「機能的な順序にある」および「機能的に連結されている」は、本明細書において使用される場合、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子が産生される様式または配向での核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能的タンパク質が産生および／または輸送される様式でのアミノ酸配列の連結も指す。
用語「組換え発現ベクター」は、本明細書において使用される場合、所望のコーディング配列（例えば、免疫調節核酸）とその機能的に連結されているコーディング配列の特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸配列とを含有するDNA分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらく他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、細胞からの融合タンパク質のより簡易な単離のため、発現された融合タンパク質が組換え宿主細胞によって分泌されることができるように、分泌シグナルペプチド配列がまた、場合により、本発明の組換え融合タンパク質のコーディング配列に機能的に連結されている組換え発現ベクターによってコードされることができる。
用語「配列同一性」は、本明細書において使用される場合、遺伝子またはタンパク質間の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列同一性を指す。「配列同一性」は、タンパク質間のアミノ酸レベルでの同一性の尺度および核酸間のヌクレオチドレベルでの同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のための配列のアライメントのための方法は、当技術分野において周知であり、このような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含む。BLASTアルゴリズムは、配列同一性パーセントを計算し、かつ、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）ウェブサイトを通して公表されている。
用語「可溶性」は、タンパク質に関して本明細書において使用される場合、タンパク質が膜タンパク質ではないことを意味する。一般に、可溶性タンパク質は、1つまたは複数のIgSFドメインまたはその特異的結合断片を含有するIgSFファミリーメンバー受容体の細胞外ドメイン、またはその一部のみを含有する。
用語「種」は、核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、このような配列の同一の集合体を指す。全長種とアミノ末端またはカルボキシ末端がわずか1、2、または3アミノ酸残基だけ異なる（または差異をコードする）わずかに短縮された配列は、単一種の配列であると見なされる。このような微不均一性は、製造されたタンパク質の共通の特徴である。
用語「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、その親和性またはアビディティが、十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集合体に対する同じタンパク質の平均親和性またはアビディティの少なくとも10倍大きく、しかし場合により50、100、250または500倍大きく、またはさらに少なくとも1000倍大きくなるように、特異的結合条件下で、標的タンパク質に結合するタンパク質の能力を意味する。特異的に結合するタンパク質は、単一の標的分子（例えば、その同族結合パートナー）のみに結合する必要はないが、標的と非標的（例えば、パラログまたはオーソログ）との間の立体配置の類似性に起因して非標的分子に特異的に結合し得る。当業者は、異なる動物種における同じ機能を有する分子（すなわち、オーソログ）への特異的結合または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する非標的分子（例えば、パラログ）への特異的結合が、可能であり、かつ、固有の非標的（例えば、ランダムポリペプチド）の統計的に有効な集合体に対して決定される結合の特異性を損なわないことを認識するだろう。したがって、本発明の親和性が改変されたポリペプチドは、交差反応性に起因して、複数の別個の標的分子種に特異的に結合し得る。一般に、このようなオフ標的特異的結合は、望ましくない標的に対する親和性またはアビディティを低減することによって緩和される。固相ELISAイムノアッセイまたはビアコア（Biacore）測定を使用して、2つのタンパク質間の特異的結合を決定することができる。一般に、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-5 M未満、しばしば1×10-12 Mまでの低さの解離定数（Kd）を有する。本開示のある種の局面において、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 Mまたは1×10-11 Mの解離定数を有する。
用語「特異的結合断片」または「断片」は、成熟（すなわち、シグナルペプチドを欠いている）野生型IgSFドメインに関して本明細書において使用される場合、全長成熟IgSFドメインより短く、かつ、インビトロおよび／またはインビボで成熟野生型IgSFドメインの天然同族結合パートナーに特異的に結合するポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、特異的結合断片は、全長成熟野生型配列の配列長の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％である。特異的結合断片は、本発明の親和性が改変されたIgSFドメインを形成するために配列を変化させることができる。いくつかの態様において、特異的結合断片は、リンパ球の免疫活性を調節する。
用語「抑制された」または「低下（減少）した」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の低下（減少）を意味する。いくつかの態様において、抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の低下（減少）であることができる。
用語「標的化部分」は、本明細書において使用される場合、本発明の野生型および／または親和性が改変されたIgSFドメインを含むポリペプチドに共有的にもしくは非共有的に結合するか、またはそれを物理的にカプセル化する組成物を指す。標的化部分は、細胞表面受容体または腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原（TSA）または腫瘍関連抗原（TAA））のような所望の同族結合パートナーに対する特異的結合親和性を有する。典型的には、所望の同族結合パートナーは、特異的な組織または細胞タイプ上に局在化する。標的化部分は、抗体、抗原結合断片（Fab）、VHおよびVLを含有する可変断片（Fv）、1つの鎖中で一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片（scFv）、ならびに他の抗体V領域断片、例えばFab’、F(ab)2、F(ab’)2、dsFvダイアボディ、ナノボディ、可溶性受容体、受容体リガンド、親和性成熟された受容体もしくはリガンド、ならびに低分子（<500ダルトン）組成物（例えば、特異的結合受容体組成物）を含む。標的化部分はまた、本発明の免疫調節ポリペプチドをカプセル化するリポソームの脂質膜に共有的もしくは非共有的に結合されることができる。
疾患もしくは障害を「治療する」または疾患もしくは障害の「治療」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質の、単独または本明細書に記載されるとおりの別の化合物との組み合わせのいずれかでの投与による臨床または診断症状のいずれか低減、停止、または排除によって証明される、疾患または障害の進行を遅延、中断、または反転させることを意味する。「治療する」または「治療」は、急性もしくは慢性疾患もしくは障害における症状の重症度の低下、または再発率の低下（例えば、自己免疫疾患経過を再発するまたは寛解する場合のような）、または自己免疫疾患の炎症的側面の場合の炎症の低減も意味する。がんの文脈において本明細書で使用される場合、がんの「治療」またはがんを「阻害する」またはがんの「阻害」という用語は、限定されないが、Response Evaluation Criteria for Solid Tumors（RECIST）のような標準的な基準によって測定した場合の、腫瘍成長率の統計的に有意な低下、腫瘍成長の停止、または腫瘍の、サイズ、質量、代謝活性もしくは体積の低下、または無増悪生存率（PFS）もしくは全生存率（OS）の統計的に有意な向上のうちの少なくとも1つを指す。疾患もしくは障害を「予防する」または疾患もしくは障害の「予防」は、本発明の文脈において使用される場合、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するか、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるための、本発明の免疫調節タンパク質の単独または別の化合物との組み合わせのいずれかでの投与を指す。
用語「腫瘍特異的抗原」または「TSA」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に主に存在するが一般に哺乳動物対象の正常細胞上には見いだされない抗原を指す。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞のみに存在する必要はないが、本発明の免疫調節ポリペプチドのような抗腫瘍治療薬で標的化できかつ腫瘍の影響から哺乳動物を予防または治療することを提供できるように、腫瘍特異的抗原を有する特定の哺乳動物の細胞の割合が十分に高いかまたは腫瘍の表面の腫瘍特異的抗原のレベルが十分に高い。いくつかの態様において、腫瘍を有する哺乳動物由来の細胞のランダム統計試料では、TSAを提示する細胞の少なくとも50％ががん性である。他の態様において、TSAを提示する細胞の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％ががん性である。
本明細書において使用される場合、「スクリーニング」は、分子および／またはその部分の集合体またはライブラリーからの、分子またはその部分の活性または特性の決定に基づいた分子またはその部分の同定または選択を指す。スクリーニングは、例えば、標的タンパク質への分子の直接結合（例えば、結合親和性）を評価するアッセイによるまたは標的タンパク質の活性の調節を評価する機能的アッセイによることを含む、様々な方法のいずれかで実施することができる。
用語「野生型」または「天然」または「親」は、本明細書において使用される場合、核酸分子、タンパク質、IgSFメンバー、宿主細胞などの生物学的材料と併用され、天然に見いだされかつヒトの介入によって改変されていないものを指す。野生型IgSFドメインは、親和性が改変されていないIgSFドメインの一種である。本発明の免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性が改変されていないIgSFは、野生型IgSFドメインである。
II．親和性が改変された免疫調節タンパク質
本発明は、免疫系応答の調節が有益である疾患または障害を有する哺乳動物において免疫活性を調節することによる治療的有用性を有する免疫調節タンパク質を提供する。
本発明の免疫調節タンパク質の範囲内に含まれるIgSFファミリーメンバーは、抗体（すなわち、免疫グロブリン）、例えば哺乳動物の抗体または哺乳動物起源であり得る抗体を除外する。したがって、本発明は、非免疫グロブリン（すなわち、非抗体）IgSFドメインに関する。免疫グロブリン（すなわち、抗体）ではない野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバーは、それらの核酸およびアミノ酸配列と同様、当技術分野において公知である。全ての非免疫グロブリン哺乳動物IgSFファミリーメンバーが本発明の範囲内に含まれる。
いくつかの態様において、非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバー、およびその中に存在する対応するIgSFドメインは、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒト起源である。いくつかの態様において、IgSFファミリーメンバーは、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーなどの少なくともまたは正確に1、2、3、4、5またはそれ以上のIgSFサブファミリーに由来するメンバーである。
いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質の非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバー、およびその中に存在する対応するIgSFドメインは、哺乳動物IgSFメンバーと比較して、親和性が改変されている。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、IgSFメンバーの1つであるか、またはその任意の哺乳動物オーソログを含む表1に示されるとおりのIgSFメンバーの1つに由来するIgSFドメインを含む。オーソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オーソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。
表1の第一の列は、その特定のIgSFメンバーについての名称および場合によりいくつかの可能な別名を提供する。第二の列は、uniprot.orgでインターネットを介してアクセス可能な公表されているデータベースである、UniProtKBデータベースのタンパク質識別子を提供する。Universal Protein Resource（UniProt）は、タンパク質配列および注釈データ用の包括的リソースである。UniProtデータベースは、UniProt Knowledgebase（UniProtKB）を含む。UniProtは、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）（EMBL-EBI）、SIBスイスバイオインフォマティクス研究所（SIB Swiss Institute of Bioinformatics）とタンパク質情報リソース（Protein Information Resource）（PIR）の間の共同組織であり、米国国立保健研究所（U.S. National Institutes of Health（NIH））の助成金によって主に支援されている。第三の列は、表示のIgSFドメインが位置している領域を提供する。該領域は、ドメインが範囲を規定している残基を包含する範囲として特定される。列3はまた、特定されたIgSF領域のIgSFドメインクラスを示す。列4は、表示の追加のドメインが位置している領域を提供する（シグナルペプチド、S；細胞外ドメイン、E；膜貫通ドメイン、T；細胞質ドメイン、C）。列5は、列挙されたIgSFメンバーのいくつか、すなわちその同族細胞表面結合パートナーのいくつかを示す。
典型的には、提供される態様の親和性が改変されたIgSFドメインは、ヒトまたはネズミの親和性が改変されたIgSFドメインである。
（表１）本開示に係るIgSFメンバー
Figure 2021090441
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いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質は、少なくとも1つの親和性が改変された哺乳動物IgSFドメインを含む。親和性が改変されたIgSFドメインは、単一または複数（2、3、4またはそれ以上）の同族結合パートナー（「カウンター構造リガンド」とも呼ばれる）に特異的に結合するように親和性を改変することができる。IgSFドメインは、それが結合する複数の同族結合パートナーの各々に対する特異的結合親和性またはアビディティを独立して向上または低下させるように親和性を改変することができる。この機序によって、複数の同族結合パートナーの各々への特異的結合は、独立して、特定の親和性またはアビディティに合わせられる。
いくつかの態様において、IgSFドメインの同族結合パートナーは、表1に列挙されているもののような、野生型IgSFドメインの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つであり、時として少なくとも2つまたは3つである。哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインの配列は、少なくとも1つの置換、付加、または欠失でその配列を変化させることによって親和性が改変される。配列の変化は、同族結合パートナーの結合部位またはアロステリック部位において起こることができる。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインをコードする核酸は、特定のおよび所定のヌクレオチド部位の置換、付加、欠失、またはその組み合わせによって親和性が改変されて本発明の核酸を生成する。いくつかの対照的な態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインをコードする核酸は、核酸内のランダム部位における置換、付加、欠失、またはその組み合わせによって親和性が改変される。いくつかの態様において、2つのアプローチ（所定のおよびランダムな）の組み合わせが利用される。いくつかの態様において、本発明の親和性が改変されたIgSFドメインの設計がインシリコで実施される。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはIgVドメインもしくはIgCドメインの特異的結合断片のような、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含有する野生型もしくは未改変のポリペプチドまたはその一部に対して、1つまたは複数のアミノ酸置換（あるいは、「変異」または「交換」）を含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、アミノ酸置換のうちの少なくとも1つがIgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片中にある、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片を含有する親和性が改変されたIgSFドメインを含む。いくつかの態様において、変化した結合活性または親和性の理由で、IgVドメインまたはIgCドメインは、親和性が改変されたIgSFドメインである。
いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインのようなIgSFドメインは、少なくとも1であるが、合計2、3、4、5、6、7、8、9、または10以下のアミノ酸置換、付加、欠失、またはその組み合わせで配列の親和性が改変される。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメインなどのIgSFドメインは、少なくとも1であるが、10、9、8、7、6、5、4、3、または2以下のアミノ酸置換で配列の親和性が改変される。いくつかの態様において、置換は、保存的置換である。いくつかの態様において、置換は、非保存的である。いくつかの態様において、置換は、保存的置換と非保存的置換との組み合わせである。いくつかの態様において、配列の改変は、その同族結合パートナーに対するIgSFドメインの結合部位において行われる。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、哺乳動物IgSFドメインである。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒト、マウス、カニクイザル、またはラットのものを含むがそれらに限定されないIgSFドメインであることができる。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒトである。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有されるIgSFドメインもしくはその特異的結合断片、またはシグナル配列を欠くその成熟形態（SEQ ID NO:1〜27に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列またはその成熟形態）であるか、または、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはその特異的結合断片を含有するその一部である。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、IgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン）を含有するIgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインまたはその一部であるか、あるいはそれらを含む。いくつかの態様において、未改変または野生型のIgSFドメインは、SEQ ID NO:28〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそのオーソログを含む。例えば、未改変または野生型のIgSFドメインは、（i）SEQ ID NO:28〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列、（ii）SEQ ID NO:28〜54のいずれかに少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができるか、または（iii）IgVドメインもしくはIgCドメインを含む、SEQ ID NO:28〜54のいずれかに示されるアミノ酸配列の特異的結合断片またはSEQ ID NO:28〜54のいずれかに少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列の特異的結合断片である。
いくつかの態様において、未改変または野生型のIgSFドメインの細胞外ドメインは、複数のIgSFドメイン（例えば、IgVドメインおよびIgCドメイン）を含むことができる。しかしながら、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgVドメインおよびIgCドメインの両方を含む必要はない。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片、およびIgCドメインまたはその特異的結合断片を含む。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインの1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドドメインの任意の1つまたは複数の中に位置することができる。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドの細胞外ドメイン中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはIgVドメインの特異的結合断片中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはIgCドメインの特異的結合断片中に位置する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の哺乳動物IgSFドメインのような少なくとも1つのIgSFドメインは、独立して、限定されないがSEQ ID NO:1〜27として表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、または80％の配列同一性を有するように配列の親和性が改変される。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質のIgSFドメインは、限定されないがSEQ ID NO:1〜27で表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される野生型または未改変のIgSFドメインの特異的結合断片である。いくつかの態様において、特異的結合断片は、少なくとも50アミノ酸、例えば少なくとも60、70、80、90、100、または110アミノ酸のアミノ酸長を有することができる。いくつかの態様において、IgVドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgVドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様において、IgCドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgCドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、特異的結合断片は、免疫活性を調節する。より具体的な態様において、IgSFドメインの特異的結合断片は、免疫活性を向上させる。代わりの態様において、特異的結合断片は、免疫活性を低下させる。
2つの核酸配列または2つのアミノ酸の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較のためアライメントさせる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップが導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％=同一位置の数（#）／位置（例えば、重複位置）の総数（#）×100）。一態様において、2つの配列は、同じ長さである。配列を手動でアライメントさせて、同一の核酸またはアミノ酸の数を計数してもよい。あるいは、同一性パーセントの決定のための2つの配列のアライメントを、数学的アルゴリズムを使用して達成してもよい。このようなアルゴリズムは、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12でBLASTヌクレオチド検索を実施してもよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3でBLASTタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためにギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLASTを利用してもよい。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実施してもよい。NBLAST、XBLAST、およびGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター、例えばNCBIウェブサイトで入手可能なものを使用してもよい。あるいは、NCBIデータベースにおいて、例えばBLASTプログラムによって配列をアライメントさせた後に、配列同一性を計算してもよい。一般に、例えば「スコア行列」および「ギャップペナルティ」に関するデフォルト設定をアライメントに使用してもよい。本発明の文脈において、BLASTNおよびPSI BLAST NCBIのデフォルト設定を採用してもよい。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも1つの親和性が改変されたドメインをさらに含有し、かつ、少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメイン（例えば、未改変または野生型のIgSFドメイン）をさらに含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されたドメインを含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1、2、3、4、5、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含有することができる。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質中に存在する少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、免疫シナプス（IS）を形成する哺乳動物細胞の表面に発現する少なくとも1つの細胞表面分子種に特異的に結合する。当然ながら、いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1、2、3、4、5、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含む。これらの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの1つまたは複数は、独立して、ISを形成する哺乳動物細胞の一方または両方のいずれかに特異的に結合することができる。
しばしば、親和性が改変されたIgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、親和性が改変されている、野生型IgSFファミリーメンバーまたは野生型IgSFドメインの同族結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、哺乳動物IgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、表1に示されるとおりの同族細胞表面結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞の細胞表面のウイルスタンパク質、例えばポリオウイルスタンパク質であろう。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質のうちの少なくとも1つの親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する哺乳動物細胞上に存在する少なくとも2つまたは3つの細胞表面分子種に結合する。本発明の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方もしくは他方の表面のみにある（すなわち、シス配置にある）ことができるか、または、代替的に、細胞表面分子種は、両方上に存在することができる。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの細胞表面分子種に特異的に結合し、ここで、分子種の一方は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つに存在し、そして、他方の分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞の第二の上に存在する。このような態様において、細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞の一方または他方上に単独で存在する（すなわち、トランス配置にある）必要は必ずしもないが、いくつかの態様において、存在する。したがって、本明細書において提供される態様は、各細胞表面分子種が、ISを形成する哺乳動物細胞のうちの一方または他方のみの表面に存在するもの（シス配置）、ならびに、親和性が改変された各IgSFが結合する細胞表面分子種がISを形成する哺乳動物細胞の両方の表面に存在するもの（すなわち、シスおよびトランス配置）を含む。
当業者は、抗原提示細胞（APC）および腫瘍細胞がリンパ球と共に免疫シナプスを形成することを認識するだろう。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質のうちの少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、がん細胞上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、がん細胞は、リンパ球と連動してISを形成する。他の態様において、免疫調節タンパク質のうちの少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、リンパ球上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、リンパ球は、APCまたは腫瘍細胞と連動してISを形成する。いくつかの態様において、親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する標的細胞（またはAPC）およびリンパ球の両方上に存在する細胞表面分子種に結合する。
本発明の態様は、特異的結合条件下、本明細書において提供される免疫調節タンパク質のその同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する結合親和性（または多量体もしくは他の関連構造にある場合はアビディティ）が変化していない野生型または未改変のIgSFドメイン対照と比べて向上するかまたは低下するかのいずれかであるように、本明細書において提供される免疫調節タンパク質が、野生型または未改変のIgSFドメイン（例えば、哺乳動物IgSFドメイン）と異なるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインを含む態様を含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、例えば、固相ELISAイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたはビアコアアッセイによって決定したところ、野生型または未改変IgSF対照配列のものと異なる同族結合パートナーに対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、IgSFドメインは、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が向上している。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメインと比べて、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が低下している。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、ヒトタンパク質またはネズミタンパク質のような哺乳動物タンパク質であることができる。
同族結合パートナーの各々に対する結合親和性は、独立している；すなわち、いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型または未改変ICOSLポリペプチドと比べて、1、2または3つの異なる同族結合パートナーに対する結合親和性が向上3しており、かつ、異なる同族結合パートナーのうちの1、2または3つに対する結合親和性が低下している。
本明細書において提供される免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインの結合親和性またはアビディティは、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比べて少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、5000％、または10,000％向上する。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインと比べた結合親和性の向上は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍または50倍超である。
いくつかの態様において、結合親和性またはアビディティは、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比べて少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または最大で90％低下する。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインと比べた結合親和性の低下は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍または50倍超である。
いくつかの態様において、同族結合パートナーに対する親和性が改変されたIgSFドメインの特異的結合親和性は、少なくとも1×10-5 M、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 Mまたは1×10-11M、または1×10-12 Mであることができる。
いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも2つのIgSFドメインを含み、その中で、IgSFドメインのうちの少なくとも1つは、親和性が改変されているが、一方で、いくつかの態様では、両方が親和性が改変されており、親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、その同族結合パートナーに対する向上した親和性（またはアビディティ）を有し、かつ少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、その同族結合パートナーに対する低下した親和性（またはアビディティ）を有する。
いくつかの態様において、他のやり方で複数の細胞表面分子種に結合するIgSFドメインは、その同族細胞表面分子種の1つに実質的にもはや特異的に結合しないように、親和性が改変される。したがって、これらの態様において、その同族細胞表面分子種の1つへの特異的結合は、野生型レベルの10％以下の特異的結合まで、しばしば7％、5％、3％、1％以下、または検出不可もしくは統計的に有意でない特異的結合まで低下する。
これらの態様において、哺乳動物IgSFドメイン上の特異的結合部位は、細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに関して不活性化されるまたは実質的に不活性化される。したがって、例えば、野生型IgSFドメインが正確に2つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、そのドメインは、正確に1つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される（ここで、親和性が改変されたIgSFドメインの数の決定においては、実質的に免疫学的に不活性なその部分配列を無視する）。そして、野生型IgSFドメインが、正確に3つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、そのドメインは、正確に2つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される。その同族細胞表面分子種の1つに実質的にもはや特異的に結合しないように親和性が改変されているIgSFドメインは、他のやり方でその細胞表面分子種に競合的にまたは非競合的に特異的に結合するIgSFドメインであることができる。当業者は、2つの同族結合パートナーに競合的に結合する野生型IgSFドメインがそれでもなお正確にそれらの一方に関して不活性化されることができることを認識するだろう（例えば、それらの結合部位が厳密に同一範囲にないが、一方の特異的結合が他方の同族結合パートナーの結合を阻害するように単に重複しており、そして、なお両方の競合的結合部位が別個である場合）。
提供される免疫調節タンパク質の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、いくつかの態様において、その同族細胞表面分子種に競合的に特異的に結合することができる。他の態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、その同族細胞表面分子種に非競合的に特異的に結合する。本明細書において提供される免疫調節タンパク質中に存在する任意の数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、競合的にまたは非競合的に特異的に結合することができる。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されていないIgSFドメイン、または少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメイン、または少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、ここで、1つのIgSFドメインは、その同族細胞表面分子種に、競合的に特異的に結合し、第二のIgSFドメインは、非競合的に結合する。より一般に、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、1、2、3、4、5、もしくは6つの競合的または1、2、3、4、5、もしくは6つの非競合的に結合している親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、またはその任意の組み合わせを含むことができる。したがって、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、それぞれ：0および1、0 および2、0および3、0および4、1および0、1および1、1および2、1および3、2および0、2および1、2および2、2および3、3および0、3および1、3および2、3および3、4および0、4および1、ならびに、4および2の非競合的および競合的に結合しているIgSFドメインの数を有することができる。
本明細書において提供される免疫調節タンパク質の複数の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、互いに直接共有結合している必要はない。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基の介在範囲は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを互いに間接的に共有結合させる。その連結は、N末端からC末端の残基を介することができる。
いくつかの態様において、連結は、親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインのN末端またはC末端に位置していないアミノ酸残基の側鎖を介して行うことができる。したがって、連結は、末端もしくは内部アミノ酸残基またはその組み合わせを介して行うことができる。
親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを連結させる「ペプチドリンカー」は、単一アミノ酸残基またはそれより多い長さであることができる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を有するが、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸残基長である。いくつかの態様において、リンカーは（一文字アミノ酸コードで）：GGGGS（「4GS」）または4GSリンカーの多量体、例えば2、3、4、または5つの4GSリンカーの繰り返しである。さらなる任意の態様において、一連のアラニン残基は、4GSリンカーと免疫調節タンパク質が共有結合されたFcとの間に介在する。いくつかの態様において、一連の各々のアラニン残基の数は、2、3、4、5、または6つのアラニンである。
A．例示的な親和性が改変されたIgSFドメイン
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、上の表1に示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。1つまたは複数のアミノ酸置換は、野生型または未改変のIgSFドメインのエクトドメイン（例えば、細胞外ドメイン）中にあることができる。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはその特異的結合断片中にある。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはその特異的結合断片中にある。親和性が改変されたIgSFドメインのいくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換のいくつかは、IgVドメインまたはその特異的結合断片中にあり、そして、1つまたは複数のアミノ酸置換のいくつかは、IgCドメインまたはその特異的結合断片中にある。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。置換は、IgVドメインまたはIgCドメイン中にあることができる。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片中に最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片中に最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメインなどの、野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、B7 IgSFファミリーメンバーの野生型または未改変のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様において、B7 IgSFファミリーメンバーは、CD80、CD86またはICOSリガンド（ICOSL）である。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、SEQ ID NO:1、2または5のいずれかに示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメインのような、野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。CD80の例示的な親和性が改変されたIgSFドメインは、表2に示される。ICOSLの例示的な親和性が改変されたIgSFドメインは、表3に示される。CD86の例示的な親和性が改変されたIgSFドメインは、表4に示される。
（表２）例示的なバリアントCD80ポリペプチド
Figure 2021090441
Figure 2021090441
（表３）例示的なバリアントICOSLポリペプチド
Figure 2021090441
（表４）例示的なバリアントCD86ポリペプチド
Figure 2021090441
いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、NkP30ファミリーメンバーの野生型または未改変のIgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、SEQ ID NO:27に示されるIgSFタンパク質中に含有されるIgSFドメインのような、野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。表5は、例示的な親和性が改変されたNkP30 IgSFドメインを提供する。
（表５）例示的なバリアントNKp30ポリペプチド
Figure 2021090441
B．親和性が改変された免疫調節タンパク質のタイプ
1．二つの結合性を有する、親和性が改変されたドメイン
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、野生型哺乳動物非免疫グロブリン（すなわち、非抗体）IgSFファミリーメンバーのうちの少なくとも1つのIgSFドメインの配列を含むことができ、ここで、その中の少なくとも1つのIgSFドメインは、親和性が改変されている（「I型」免疫調節タンパク質）。いくつかの態様において、少なくとも1つの改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する、少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、野生型または未改変のIgSFドメインと比較して、同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を示す。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、少なくとも2つの異なる同族結合パートナーに対する向上した結合性を示す。
本発明のI型免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、未改変または野生型のIgSFメンバー、例えば哺乳動物IgSFメンバーは、IgSFメンバーの1つであるか、またはその任意の哺乳動物オーソログを含む表1に示されるとおりのIgSFメンバーの1つに由来するIgSFドメインを含む。
いくつかの態様において、I型免疫調節タンパク質内に存在する追加のIgSFドメイン、例えば、少なくとも2、3、4、または5つのIgSFドメイン、いくつかの態様において、正確に2、3、4、または5つのIgSFドメインは、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されていることができる。
いくつかの態様において、本明細書におけるI型免疫調節タンパク質は、野生型または未改変の免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含み、その中で、親和性が改変されたIgSFドメインは、1）野生型または未改変のIgSFドメインと比較して少なくとも2つの同族結合パートナーに対する変化した（例えば、向上または低下した）結合性を有し；かつ、2）少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する。いくつかの態様において、I型免疫調節タンパク質の親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有する。いくつかの態様において、I型免疫調節タンパク質の親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する低下した結合性を有する。いくつかの態様において、I型免疫調節タンパク質の親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも1つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有し、かつ、少なくとも1つの他の異なる同族結合パートナーに対する低下した結合性を有する。
いくつかの態様において、2つの同族結合パートナーは、少なくとも2つの異なる細胞、例えば2つの異なる哺乳動物細胞の表面に発現する。例えば、いくつかの態様において、1つの同族結合パートナーはリンパ球の表面に発現し、別の同族結合パートナーは抗原提示細胞の表面に発現する。いくつかの態様において、2つの同族結合パートナーは、同じ細胞タイプ（例えば同じ免疫細胞）の表面に発現する。いくつかの態様において、I型免疫調節タンパク質は、リンパ球、例えばT細胞の免疫活性のような免疫細胞の1つまたは複数の免疫活性を調節することができる。いくつかの態様において、免疫活性は向上する。いくつかの態様において、免疫活性は低下する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合するただ1つの親和性が改変されたIgSFドメインを含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、親和性が改変されたIgVドメインである。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、親和性が改変されたIgCドメインである。
いくつかの態様において、本明細書において提供されるI型免疫調節タンパク質は、CD28およびPDL1に非競合的に特異的に結合する親和性が改変されたCD80 IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたCD80 IgSFドメインは、IgVドメインである。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、さらなる親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
2．スタックされたまたは多ドメイン免疫調節タンパク質
本発明のいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFファミリーメンバーに見いだされない親和性が改変されたおよび／または親和性が改変されていないIgSFドメイン配列の組み合わせ（「非野生型組み合わせ」）および／または配置（「非野生型配置」または「非野生型過変異」）を含む（「II型」免疫調節タンパク質）。親和性が改変されていない（例えば、野生型）または親和性が改変されているIgSFドメインの配列は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、カニクイザル、またはヒト起源、またはそれらの組み合わせに由来することができる。II型免疫調節タンパク質（非野生型の組み合わせであるかまたは非野生型配置であるかにかかわらず）のこれらの態様において存在するこのような親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインの数は、少なくとも2、3、4、または5つ、いくつかの態様において、正確に2、3、4、または5つのIgSFドメインである（ここで、親和性が改変されたIgSFドメインの数の決定においては、非特異的結合性のその部分配列および／または実質的に免疫学的に不活性なその部分配列を無視する）。
いくつかの態様において、本発明のII型免疫調節タンパク質は、IgSFドメインの非野生型組み合わせを含み、ここで、IgSFドメインは、表1に列挙されているものからのIgSFファミリーメンバーのIgSFドメインであることができる。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、表1に示されるIgSFファミリーメンバー中に含有されるIgSFドメインと比較して、各々1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する親和性が改変されたIgSFドメインであることができる第一および第二のIgSFドメインを含有することができる。
いくつかの態様において、IgSFドメインは、各々独立して、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバー中に含有される親和性が改変されたまたは親和性が改変されていないIgSFドメインである。いくつかの態様において、IgSFドメインは、各々独立して、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD274（PD-L1、B7-H1）、PDCD1LG2（PD-L2、CD273）、ICOSLG（B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2）、CD276（B7-H3）、VTCN1（B7-H4）、CD28、CTLA4、PDCD1（PD-1）、ICOS、BTLA（CD272）、CD4、CD8A（CD8-α）、CD8B（CD8-β）、LAG3、HAVCR2（TIM-3）、CEACAM1、TIGIT、PVR（CD155）、PVRL2（CD112）、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1（CD200R）、およびNC R3（NKp30）からなる群より選択されるIgSFタンパク質に由来する。
いくつかの態様において、IgSFドメインは、独立して、表1に示されるIgSFファミリーメンバー中のIgSFドメインのような、野生型または未改変のIgSFドメイン中のIgSFドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型もしくは未改変のIgSFドメインまたはその特異的結合断片に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、IgVドメインまたはIgCドメイン、例えばIgC1またはIgC2ドメインである。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、親和性が改変されたIgVドメインまたはIgCドメインである。
本発明のII型免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、IgSFドメインの数は、少なくとも2つであり、ここで、親和性が改変されたIgSFドメインの数および親和性が改変されていないIgSFドメインの数は、各々独立して、少なくとも0、1、2、3、4、5、または6である。したがって、親和性が改変されたIgSFドメインの数および親和性が改変されていないIgSFドメインの数は、それぞれ（親和性が改変されたIgSFドメイン：親和性が改変されていないIgSFドメイン）、正確にまたは少なくとも2：0（親和性が改変された：野生型）、0：2、2：1、1：2、2：2、2：3、3：2、2：4、4：2、1：1、1：3、3：1、1：4、4：1、1：5、または5：1であることができる。
II型免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの少なくとも2つは、同一のIgSFドメインである。
いくつかの態様において、本発明のII型免疫調節タンパク質は、単一のIgSFメンバーに由来するが非野生型配置（あるいは、「過変異」）にある、少なくとも2つの親和性が改変されたおよび／または親和性が改変されていないIgSFドメインを含む。非野生型配置または過変異の1つの実例は、IgSFドメイン配列が親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの供給源として役立つ野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバー中に見いだされるものと比べて、非野生型系列の親和性が改変されたおよび／または親和性が改変されていないIgSFドメイン配列を含む本発明の免疫調節タンパク質である。先行態様における哺乳動物野生型IgSFメンバーは、具体的に、表1に列挙されているものを含む。したがって、一例では、野生型ファミリーメンバーが、細胞表面タンパク質の膜貫通ドメインの近位にあるIgC1ドメインおよび膜貫通ドメインの遠位にあるIgVドメインを含む場合、本発明の免疫調節タンパク質は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変された形態にもかかわらず、膜貫通ドメインの近位にあるIgVおよび膜貫通ドメインの遠位にあるIgC1を含むことができる。本発明の免疫調節タンパク質において、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの非野生型の組み合わせおよび非野生型配置の両方の存在もまた、本発明の範囲内である。
II型免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、非同一の（すなわち、異なる）IgSFドメインである。非同一の親和性が改変されたIgSFドメインは、特異的結合条件下で、異なる同族結合パートナーに特異的に結合し、かつ、改変される野生型IgSFドメインが同じであったか否かに関係なく「非同一」である。したがって、例えば、本発明の免疫調節タンパク質中の少なくとも2つの非同一のIgSFドメインの非野生型組み合わせは、起源が1つのIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである少なくとも1つのIgSFドメイン配列、および、起源が別のIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである第二のIgSFドメイン配列のうちの少なくとも1つを含むことができ、ここで、免疫調節タンパク質のIgSFドメインは、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変された形態である。しかしながら、代わりの態様において、2つの非同一のIgSFドメインは、同じIgSFドメイン配列が起源であるが、少なくとも1つは、これらのドメインが異なる同族結合パートナーに特異的に結合するように親和性が改変されている。
いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質中に存在する非同一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの数は、少なくとも2、3、4、または5つ、いくつかの態様において、正確に2、3、4、または5つの非同一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインである。いくつかの態様において、非同一のIgSFドメインは、表1に示される少なくとも2つのIgSFメンバー、いくつかの態様において、表1の少なくとも3つまたは4つのIgSFメンバーに由来する組み合わせである。
いくつかの具体的な態様において、本発明のII型免疫調節タンパク質は、親和性が改変されたNKp30 IgSFドメインおよび親和性が改変されたICOSLG IgSFドメイン、親和性が改変されたCD80 IgSFドメインまたは親和性が改変されたCD86 IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、II型免疫調節タンパク質は、少なくとも2つのB7ファミリーメンバーに由来する親和性が改変されたIgSFドメインを含む。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性が改変されたCD80 IgSFドメイン、親和性が改変されたICOSL IgSFドメインもしくは親和性が改変されたCD86 IgSFドメインまたはその特異的結合断片に由来する少なくとも2つの親和性が改変されたドメインを含む。いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインは、少なくともまたは正確に1、2、3、4つのG4Sドメインを介して連結されている。
スタックされた免疫調節タンパク質ポリペプチド鎖中の複数の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、互いに直接共有結合している必要はない。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基の介在範囲は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを互いに間接的に共有結合させる。その連結は、N末端からC末端の残基を介することができる。
いくつかの態様において、連結は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのN末端またはC末端に位置していないアミノ酸残基の側鎖を介して行うことができる。したがって、連結は、末端もしくは内部アミノ酸残基またはその組み合わせを介して行うことができる。
いくつかの態様において、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを連結させる「ペプチドリンカー」は、単一アミノ酸残基またはそれ以上の長さであることができる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を有するが、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸残基長である。いくつかの態様において、リンカーは（一文字アミノ酸コードで）：GGGGS（「4GS」）または4GSリンカーの多量体、例えば2、3、4、または5つの4GSリンカーの繰り返しである。さらなる任意の態様において、一連のアラニン残基は、ペプチドリンカー（例えば、4GSリンカーまたはその多量体）と免疫調節タンパク質が共有結合されたFcとの間に介在する。いくつかの態様において、一連の各々のアラニン残基の数は、2、3、4、5、または6つのアラニンである。
いくつかの態様において、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、第一および／または第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのN末端および／またはC末端に挿入された「野生型ペプチドリンカー」によって連結される。いくつかの態様において、第一のIgSFドメインのN末端に挿入されたリーディングペプチドリンカーならびに／または第一の親和性が改変されていないおよび／もしくは親和性が改変されたIgSFドメインのC末端に挿入された第一のトレーリング配列が存在する。いくつかの態様において、第二のIgSFドメインのN末端に挿入された第二のリーディングペプチドリンカーならびに／または第二の親和性が改変されていないおよび／もしくは親和性が改変されたIgSFドメインのC末端に挿入された第二のトレーリング配列が存在する。第一および第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが同じ親タンパク質に由来しかつ同じ配向で接続されるとき、第一および第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン間の野生型ペプチドリンカーが繰り返し存在することはない。例えば、第一のトレーリング野生型ペプチドリンカーおよび第二のリーディング野生型ペプチドリンカーが同じであるとき、II型免疫調節タンパク質は、第一のトレーリング野生型ペプチドリンカーも第二のリーディング野生型ペプチドリンカーのどちらかは含まない。
いくつかの態様において、II型免疫調節タンパク質は、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのN末端に挿入された第一のリーディング野生型ペプチドリンカーを含み、ここで、第一のリーディング野生型ペプチドリンカーは、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列に由来する少なくとも5つ（例えば、少なくともおよそ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上のいずれか）の連続アミノ酸を親IgSFドメインと直前のドメイン（例えば、シグナルペプチドまたはIgSFドメイン）との間に含む。いくつかの態様において、第一のリーディング野生型ペプチドリンカーは、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列全体を親IgSFドメインと直前のドメイン（例えば、シグナルペプチドまたはIgSFドメイン）との間に含む。
いくつかの態様において、II型免疫調節タンパク質は、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのC末端に挿入された第一のトレーリング野生型ペプチドリンカーをさらに含み、ここで、第一のトレーリング野生型ペプチドリンカーは、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列に由来する少なくとも5つ（例えば、少なくともおよそ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上のいずれか）の連続アミノ酸を親IgSFドメインと直後のドメイン（例えば、IgSFドメインまたは膜貫通ドメイン）との間に含む。いくつかの態様において、第一のトレーリング野生型ペプチドリンカーは、第一の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列全体を親IgSFドメインと直後のドメイン（例えば、IgSFドメインまたは膜貫通ドメイン）との間に含む。
いくつかの態様において、II型免疫調節タンパク質は、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのN末端に挿入された第二のリーディング野生型ペプチドリンカーをさらに含み、ここで、第二のリーディング野生型ペプチドリンカーは、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列に由来する少なくとも5つ（例えば、少なくともおよそ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上のいずれか）の連続アミノ酸を親IgSFドメインと直前のドメイン（例えば、シグナルペプチドまたはIgSFドメイン）との間に含む。いくつかの態様において、第二のリーディング野生型ペプチドリンカーは、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列全体を親IgSFドメインと直前のドメイン（例えば、シグナルペプチドまたはIgSFドメイン）との間に含む。
いくつかの態様において、II型免疫調節タンパク質は、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインのC末端に挿入された第二のトレーリング野生型ペプチドリンカーをさらに含み、ここで、第二のトレーリング野生型ペプチドリンカーは、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列に由来する少なくとも5つ（例えば、少なくともおよそ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上のいずれか）の連続アミノ酸を親IgSFドメインと直後のドメイン（例えば、IgSFドメインまたは膜貫通ドメイン）との間に含む。いくつかの態様において、第二のトレーリング野生型ペプチドリンカーは、第二の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが由来する野生型タンパク質中の介在配列全体を親IgSFドメインと直後のドメイン（例えば、IgSFドメインまたは膜貫通ドメイン）との間に含む。
CD80 IgSFドメインを含有するII型タンパク質についての例示的なリーディング配列およびトレーリング配列は、SEQ ID NO:231およびSEQ ID NO:232に示される。ICOSL IgSFドメインを含有するII型タンパク質についての例示的なリーディング配列およびトレーリング配列は、SEQ ID NO: 233および234に示される。CD86 IgSFドメインを含有するII型タンパク質についての例示的なリーディング配列およびトレーリング配列は、SEQ ID NO:236〜238のいずれかに示される。NKp30 IgSFドメインを含有するII型タンパク質についての例示的な野生型リンカー配列は、SEQ ID NO:235に示される。
C．親和性が改変された免疫調節タンパク質のフォーマット
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、可溶性形態である。当業者は、細胞表面タンパク質が、典型的には細胞内、膜貫通、および細胞外ドメイン（ECD）を有すること、ならびに、このような可溶性形態のタンパク質を細胞外ドメインまたは免疫学的に活性なそのサブ配列を使用して作製することができることを認識するだろう。したがって、いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質は、細胞内（細胞質）ドメインまたは細胞内ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、IgVドメインおよび／もしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片を含有するECDドメインまたはその一部のみを含有する親和性が改変されたIgSFドメインを含有する。
いくつかの態様において、本発明の可溶性形態の免疫調節タンパク質は、免疫グロブリンFcに直接または間接的に共有結合される。一般に、Fcは、免疫調節タンパク質のアミノ末端に共有結合される。免疫グロブリンFcは、いくつかの態様において、IgG1またはIgG2のような哺乳動物IgGクラス免疫グロブリンである。特定の態様において、Fcは、ヒトのIgG1またはIgG2 Fcであろう。当業者であれば、1、2、3、または4つのアミノ酸置換、欠失、付加、またはその組み合わせのような小さな変化をFcに対してその薬物動態特性を実質的に変化させることなく行うことができることを認識するだろう。行われるこのような変更は、例えば、製造性を援助するために、または抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を増強する、抑制する、もしくは排除するために行われる。用語「Fc」は、本明細書において使用される場合、このような分子を包含することを意味する。
いくつかの態様において、Fcは、ネズミまたはヒトFcである。いくつかの態様において、Fcは、ヒトIgG1のようなIgG1に由来する。いくつかの態様において、Fcは、SEQ ID NO:226に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Fcは、ヒトIgG2のようなIgG2に由来する。いくつかの態様において、Fcは、SEQ ID NO: 227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:227に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書において提供されるIgSF-Fcバリアント融合物のFc領域に導入し、それによってFc領域バリアントを生成してもよい。いくつかの態様において、Fc領域バリアントは、低下したエフェクター機能を有する。エフェクター機能を変化させることができるFc配列に対する多くの変化または変異の例がある。例えば、国際公開公報第00/42072号、国際公開公報第2006019447号およびShields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) は、FcRに対する結合性が改善されたまたは低下した例示的なFcバリアントを記載している。それらの刊行物の内容は、参照によって具体的に本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、Fc領域は、Fc融合物のインビボ半減期が重要である用途にとって望ましい候補となるエフェクター機能の全てではないが一部を保有するが、なお一定のエフェクター機能（例えば、CDCおよびADCC）は不必要であるかまたは有害である。インビトロおよび／またはインビボ細胞毒性アッセイを実行して、CDCおよび／またはADCC活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合アッセイを実行して、Fc-ICOSLバリアント融合物がFcγR結合を欠いている（よっておそらくADCC活性を欠いている）が、FcRn結合活性を保持していることを確かめることができる。ADCCを媒介するための初代細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、一方で、単球は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIII発現する。造血細胞上のFcR発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の464ページの表3にまとめられている。関心対象の分子のADCC活性を評価するインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) を参照のこと）およびHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射アッセイ法を採用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; および CytoTox 96（商標）非放射細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, Wis.）を参照のこと）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞を含む。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。また、C1q結合アッセイを行って、Fc-ICOSLバリアント融合物がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、国際公開公報第2006/029879号および国際公開公報第2005/100402号におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); および Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) を参照のこと）。また、当技術分野において公知の方法を使用してFcRn結合およびインビボクリアランス／半減期の決定を実施することもできる（例えば、Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) を参照のこと）。
エフェクター機能が低下したFc融合物は、EUナンバリングによるFc領域残基238、265、269、270、297、327および329の1つまたは複数の置換を有するもの（米国特許第6,737,056号）を含む。このようなFc変異体は、残基265および297がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、EUナンバリングによるアミノ酸位置265、269、270、297、および327のうちの2つ以上に置換を有するFc変異体を含む。
FcRに対する結合性が改善されたまたは低下したある種のFcバリアントが記載されている（例えば、米国特許第6,737,056号；国際公開公報第2004/056312号、国際公開公報第2006019447号およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと）。
いくつかの態様において、変化は、例えば、米国特許第6,194,551号、国際公開公報第99/51642号、および Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されているとおり、Fc領域で生じ、その結果、低下したC1q結合および／または補体依存性細胞毒性（CDC）をもたらす。
いくつかの態様において、半減期を増加させるおよび／または新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合性を改善する1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域を含むICOSL-Fcバリアント融合物が提供される。半減期が増加したおよびFcRnに対する結合性が改善された抗体は、US2005/0014934A1（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改善する1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。このようなFcバリアントは、EUナンバリングによるFc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434の1つまたは複数に置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するもの（米国特許第7,371,826号）を含む。
また、Fc領域バリアントの他の例に関して、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988）;米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；および国際公開公報第94/29351号も参照されたい。
いくつかの態様において、Fcは、SEQ ID NO:226のナンバリングによるN82Gである（EUナンバリングによるN297Gに対応する）少なくとも1つのアミノ酸置換を含有するIgG1バリアントである。いくつかの態様において、バリアントFc領域は、C5Sアミノ酸改変をさらに含む。例えば、いくつかの態様において、バリアントFc領域は、以下のアミノ酸改変：C5SおよびN82Gを含む。
いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質へのFcの間接的共有結合は、例えば、単一アミノ酸を介してまたはペプチド（2つ以上のアミノ酸残基長）リンカーを介して行うことができる。さらに、このようなFc融合分子の単一ポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖間ジスフィルド結合を介することを含む、様々な手段を通して二量体化することができる。二量体化形態の本発明の免疫調節タンパク質は、2つの同一もしくは実質的に同一の種の本発明のポリペプチド（ホモ二量体）、または別々の種の本発明のポリペプチド鎖（ヘテロ二量体）を含むことができる。発現もしくはタンパク質分解の小さな差異に由来するアミノ末端およびカルボキシ末端残基の小さな差異が原因で、または翻訳後修飾から生じる差異が原因で、同じ種のポリペプチド鎖間でも微不均一性が存在できることが認識されよう。それでもなお、このような実質的に同一な鎖は、ホモ二量体であると見なされる。誘導体化された免疫調節タンパク質は、本発明の範囲内であり、かつ、しばしば、例えば変化した物理化学的特性または薬物動態特性を提供するように製造される。
さらにより具体的な態様において、先行の具体的な態様は、ヒトIgG1またはIgG2ドメインのようなFcに共有結合される。さらなる具体的な態様において、Fcは、免疫調節タンパク質に、1つまたは複数のG4Sドメイン（しばしば、Fcおよび免疫調節タンパク質に直接連結される少なくともまたは正確に1、2、3、4、または5つの連続したアラニン残基を有する）を介して結合する。
他の態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合される。タンパク質をリポソーム表面に共有的にまたは非共有的に結合させる様々な方法（例えば、アミドコンジュゲーションまたはジスルフィド／チオエーテルコンジュゲーションによる方法）が当技術分野において公知である。
D．免疫調節タンパク質の機能活性
いくつかの態様において、本明細書において提供される親和性が改変されたIgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質（全長および／もしくは特異的結合断片またはスタック構築物またはその融合物）は、T細胞活性化を調節する免疫調節活性を示す。機能的に、かつ、その同族結合パートナーに対する特異的結合性が向上するか低下するかに関係なく、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、例えばMLRアッセイにおいて、適切なアッセイ対照下のリンパ球と比べて、リンパ球の免疫活性を増強または抑制するように作用する。いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、ここで、親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、免疫活性を増強するように作用し、そして、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、免疫活性を抑制するように作用する。
いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質は、野生型または未改変のIgSFドメイン対照と比べて、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を調節する。いくつかの場合では、IFN-γ発現の調節は、対照と比べてIFN-γ発現を増加または減少させることができる。特異的結合およびIFN-γ発現を決定するアッセイは、当技術分野において周知であり、かつ、培養上清中のインターフェロン-γサイトカインレベルを測定するMLR（混合リンパ球反応）アッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56)、SEB（ブドウ球菌エンテロトキシンB）T細胞刺激アッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56）、および抗CD3 T細胞刺激アッセイ（Li and Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104）を含む。
いくつかの態様において、親和性が改変されたドメインを含有する免疫調節タンパク質は、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ（インターフェロン-γ）発現を、野生型IgSFドメイン対照と比べて、いくつかの態様において増加させることができ、または、代わりの態様において減少させることができる。親和性が改変されたIgSFドメインを含有する提供されるポリペプチドのいくつかの態様において、該ポリペプチドは、野生型ICOSL対照と比べて、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させることができ、代わりの態様において、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を減少させることができる。複数の親和性が改変されたIgSFドメインを含有する提供されるポリペプチドのいくつかの態様において、該ポリペプチドは、野生型IgSFドメイン対照と比べて、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させることができ、代わりの態様において、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を減少させることができる。
当業者は、IFN-γ発現の増加を決定するために使用される初代T細胞アッセイのフォーマットがIFN-γ発現の減少についてアッセイするために採用されるものと異なることができることを認識するだろう。初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を減少させる免疫調節タンパク質の能力についてアッセイする際に、混合リンパ球反応（MLR）アッセイを、実施例6に記載されるとおり使用することができる。いくつかの場合では、可溶性形態の免疫調節タンパク質を採用して、IFN-γ発現に拮抗することによりその発現を減少させる親和性が改変されたIgSFドメインの能力を、同じく実施例6に記載されるとおりMLRにおいて決定することができる。
あるいは、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させる免疫調節タンパク質の能力についてアッセイする際に、同時固定アッセイを実施例6に記載されるとおり使用することができる。同時固定アッセイでは、TCRシグナル（いくつかの態様において抗CD3抗体によって提供される）を親和性が改変されたIgSFドメインを含有する同時固定された免疫調節タンパク質と併用して、IgSFドメイン対照と比べてIFN-γ発現を増加させる能力を決定する。いくつかの場合では、多価結合を提供する程度に多量体化されている可溶性形態の免疫調節タンパク質を採用して、IFN-γ発現を刺激することによりその発現を増加させる免疫調節タンパク質の能力を同じく実施例6に記載されるとおりMLRにおいて決定することができる。
適切な対照の使用は、当業者に公知であるが、前述の態様において、対照は、典型的には、未改変のIgSFドメイン、例えば、IgSFドメインが由来または発生した同じ哺乳動物種に由来する天然のIgSFアイソフォームの野生型の使用を含む。同族結合パートナーのいずれか一方または両方に対する結合親和性が向上するか低下するかに関係なく、特定の免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメイン対照と比べて、初代T細胞アッセイにおいて、いくつかの態様においてIFN-γ発現を増加させ、代わりの態様においてIFN-γ発現を減少させるだろう。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質（例えば、親和性が改変されたIgSFドメインを含有する）は、IFN-γ発現（すなわち、タンパク質発現）を野生型または未改変のIgSFドメイン対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上増加させる。他の態様において、免疫調節タンパク質（例えば、親和性が改変されたIgSFドメインを含有する）は、IFN-γ発現（すなわち、タンパク質発現）を野生型または未改変のIgSFドメイン対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上減少させる。いくつかの態様において、免疫活性の増強は、例えばMLRアッセイにおいて、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％高い増加であることができる。Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56。いくつかの態様において、免疫活性の抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の低下であることができる。
III．核酸およびタンパク質を製造する方法
本発明は、本発明の免疫調節タンパク質（I型およびII型）の種々の態様のいずれかをコードする、「本発明の核酸」とまとめて呼ばれる単離または組換え核酸を提供する。下記の全てを含む本発明の核酸は、本発明のポリペプチドの組換え生産（例えば、発現）において有用である。本発明の核酸は、RNAの形態またはDNAの形態であることができ、かつ、mRNA、cRNA、組換えもしくは合成RNAおよびDNA、ならびにcDNAを含むことができる。本発明の核酸は、典型的にはDNA分子であり、通常は二本鎖DNA分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のいずれかを含む一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびハイブリッドDNA/RNA核酸またはその組み合わせも提供される。
本発明はまた、本発明の免疫調節タンパク質を生産する際に有用な発現ベクターおよび宿主細胞に関する。本発明の免疫調節タンパク質を、組換えDNA技術を使用して形質転換宿主細胞中で製造することができる。そのために、免疫調節タンパク質をコードする組換えDNA分子が調製される。このようなDNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例として、該ペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してDNAから切除することもできる。あるいは、ホスホロアミダイト法のような化学合成技術を使用してDNA分子を合成することもできる。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。いくつかの例では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通して組換えまたは合成核酸を生成させてもよい。
本発明はまた、適切な宿主細胞中、免疫調節タンパク質の発現に適する条件下で免疫調節タンパク質を発現させることが可能な発現ベクターを含む。組換え発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結された免疫調節タンパク質をコードするDNA分子を含む。DNA分子がベクターに挿入される前後のいずれかにこの機能的連結を行う方法が周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。DNA分子をその上に有する得られた組換え発現ベクターを使用して、適切な宿主を形質転換する。この形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる。いくつかの態様において、本発明の核酸は、免疫調節タンパク質が培養培地、宿主細胞、または宿主細胞ペリプラズムから回収されるように、本発明の免疫調節タンパク質をコードする核酸に機能的に連結されている分泌またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
多数の利用可能および周知の宿主細胞のいずれかを本発明の実施において使用することができる。好適な宿主の選択は、当技術分野に認識される多数の要因に依存する。これらは、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性およびコストを含む。全ての宿主が特定のDNA配列の発現に同等に効率的であるとは限らないことを理解して、これらの要因のバランスを取らなければならない。宿主細胞は、様々な真核細胞、例えば酵母細胞、または哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）もしくはHEK293細胞であることができる。宿主細胞はまた、大腸菌（E. coli）のような原核細胞であることができる。形質転換宿主は、免疫調節タンパク質発現条件下で培養され、次いで精製される。組換え宿主細胞を、所望の免疫調節タンパク質を発現するように従来の発酵条件下で培養することができる。このような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを含む当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から免疫調節タンパク質が回収および精製される。所望であれば、成熟タンパク質の配置の完成にタンパク質リフォールディング工程を使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に採用することができる。本発明の免疫調節タンパク質はまた、合成法によっても製造することができる。固相合成は、低分子ペプチドを製造する最も費用効率の高い方法であるので、個々のペプチドを製造する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術は、保護基、リンカー、および固相支持体の使用だけでなく、特定の保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、捕捉剤の使用、ならびに固相ペプチド合成の他の側面を含む。次いで、ペプチドを本発明の免疫調節タンパク質へアセンブルすることができる。
本発明の免疫調節性の親和性が改変されたIgSFドメインが設計または作製される手段は、任意の特定の方法に限定されない。しかしながら、いくつかの態様において、野生型IgSFドメインが野生型IgSF遺伝物質から変異誘発され（部位特異的、ランダム、またはその組み合わせ）、実施例に開示される方法に従って結合性の変化についてスクリーニングされる。核酸を変異誘発するための方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、多数の公表されているデータベースで入手可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、その後スクリーニングされる。National Center for Biotechnology Informationは、このような情報を提供し、そして、そのウェブサイトは、先に考察したとおりのUniProtKBデータベースと同様にインターネットを介して公的にアクセス可能である。
IV．親和性が改変されたIgSFドメインをスクリーニングまたは同定する方法
2つ以上の同族結合パートナーに同時にまたは非競合的に結合することができる親和性が改変された免疫調節タンパク質を同定する方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、該方法は、以下の工程を含む：a）少なくとも1つの改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインまたはその特異的結合断片を含む改変されたタンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとを、該タンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとの結合をもたらすことができる条件下で接触させる工程（ここで、少なくとも1つの改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む）；b）野生型IgSFドメインを含むタンパク質と比較して、2つの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定する工程；ならびにc）少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程であって、それによって、親和性が改変された免疫調節タンパク質が同定される、工程。いくつかの態様において、選択される親和性が改変されたタンパク質は、2つの同族結合パートナーに共に同時に結合することができる。もう2つの異なるリガンドに対するタンパク質の非競合的な結合相互作用の存在を評価または決定することは当業者のレベルの範囲内である。例示的なこのような方法は、実施例7に記載される。
いくつかの態様において、IgSFドメインは、非免疫グロブリンIgSFドメインである。いくつかの態様において、改変されたまたはバリアントタンパク質は、非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバーのいずれか（例えば、表1に示されるいずれか）のIgSFドメイン中で1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が行われたものである。いくつかの態様において、改変されたもしくはバリアントIgSFドメイン、または改変されたもしくはバリアントIgSFドメインを含有する改変されたタンパク質は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のアミノ酸変化、例えばアミノ酸置換を含有する。
いくつかの態様において、当技術分野において一般的に公知の任意の方法を使用して、非免疫グロブリンIgSFドメインを含有することが公知のタンパク質の任意の1つまたは複数のアミノ酸残基を変異させることによって、改変されたまたはバリアントタンパク質のライブラリーが生成される。本明細書における改変されたIgSFドメインを生成する際に、結合分子を生成、改変または多様化させるための当技術分野において採用される方法のいずれかを使用することができる。結合分子を生成、改変または多様化させるための例示的なこのような方法は、米国特許第5,223,409号；第5,571,698号、第5,750,373号、第5,821,047号；第5,837,500号；第5,733,743号；第5,871,907号；第5,969,108号；第6,040,136号；第6,172,197号；第6,291,159号；第6,955,877号；第6,979,538号；第6,831,161号；第7,063,943号；第7,118,879号；第7,208,293号；第7,332,571号；第7,385,028号；第7,696,312号；第7,638,299号；第7,888,533号；第7,642,044号；米国特許出願第US20080300163号；第US20090208454号；第US20090155843号；第US20080113412号；第US20100035812号；第US20100093608号；第US20110015345号に記載されている方法を非限定的に含み；例えば、生体分子の多様化または改変の方法において、他の結合分子の代わりにIgSF-コンチアイン（contiain）を方法に使用することができる。
結合分子のライブラリーを生成するための方法およびライブラリーの多様性を作製するための方法は、当技術分野において周知であり、これを採用してタンパク質バリアントのライブラリーを生成することができる。多様性を生成するためのアプローチは、当技術分野において周知の標的化および非標的化アプローチを含む。例えば、多様な核酸およびポリペプチドライブラリーを生成するための公知のアプローチは、エラープローンPCR、カセット変異誘発；相互プライマー伸長法；鋳型支援ライゲーションおよび伸長法；コドンカセット変異誘発；オリゴヌクレオチド指向変異誘発；オーバーラップおよび2工程PCRを含む、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用した増幅；ならびに組み合わせアプローチ、例えばコンビナトリアル多重カセット変異誘発（CMCM）および関連技術を含むが、それらに限定されない。当業者は、これらの技術を熟知している。
候補改変されたタンパク質分子のライブラリーを生成するためのタンパク質を変異させる方法の例は、タンパク質配列全体にわたってランダム変異誘発をもたらす方法またはタンパク質の選択領域またはドメインの変異誘発をもたらす方法を含む。タンパク質のランダム変異誘発をもたらす方法を使用して、またはより体系的には、標的化位置に単一もしくは複数のアミノ酸変化を特異的に作製する方法を使用して、変異をランダムに導入することができる。両方のランダム変異誘発および体系的な部位特異的変異誘発を使用して、1つまたは複数の変異をタンパク質に導入することができる。バリアントタンパク質は、ライブラリーを生成するための骨格として使用される野生型または未改変のタンパク質と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を内部に持つことができる。置換または挿入は、任意の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸によることができる。
提供される方法に従う非免疫グロブリンIgSFドメインを含有するバリアントまたは改変されたタンパク質を同定または生成するための方法において、タンパク質の1つまたは複数の領域、例えばタンパク質の1つまたは複数のIgSFドメインを、領域のランダム変異誘発を使用して改変して、1つまたは複数の改変されたタンパク質分子を生成することができる。例えば、IgSFドメインを含有する対応する未改変または野生型のタンパク質と比較して、IgSFドメイン中に少なくとも1つのアミノ酸交換（すなわち、置換）、欠失または挿入だけ各々異なる複数の改変分子を含有するバリアントのライブラリーを生成することができる。アミノ酸置換は、未改変または野生型のタンパク質と比較した、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸の置換であることができる。一般に、本明細書において提供されるライブラリーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、102、103、104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、105、106、107、108、109またはそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。複数の改変されたタンパク質を含有する生成されるライブラリーは、バリアントのディスプレイが、例えば、ファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、ビーズディスプレイ、リボソームディスプレイ、または他のものによるコンビナトリアルライブラリーを含む、ディスプレイライブラリーとして生成することができる。このライブラリーを使用して、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する非免疫グロブリンIgSFドメインを含有する改変されたまたはバリアントタンパク質についてスクリーニングすることができる。
いくつかの態様において、少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程の前に、前記方法は、工程（b）で同定された2つ以上の改変されたIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片を組み合わせて、複数の異なる改変されたIgSFドメインを含有するスタックされた分子構築物を生成する工程を含む。
したがって、いくつかの態様において、親和性が改変された免疫調節タンパク質を同定する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書において提供される：a）少なくとも1つの改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインまたはその特異的結合断片を含む改変されたタンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとを、該タンパク質と少なくとも2つの同族結合パートナーとの結合をもたらすことができる条件下で接触させる工程（ここで、少なくとも1つの改変されたIgSFドメインは、野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む）；b）野生型IgSFドメインを含むタンパク質と比較して、2つの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定する工程；c）2つ以上の同定されたタンパク質中に存在する2つ以上の改変されたIgSFドメインを組み合わせて、第二のIgSFドメインに連結された第一の改変されたIgSFドメインを含む融合（スタックされた）タンパク質を生成する工程；ならびにd）少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程であって、それによって、親和性が改変された免疫調節タンパク質が同定される、工程。
いくつかの態様において、少なくとも2つの同族結合パートナーは、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、細胞表面分子種の各々は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、NK細胞またはT細胞であることができるリンパ球である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは、抗原提示細胞である。
いくつかの態様において、2つ以上の同族結合パートナーは、独立して、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーのリガンドである。いくつかの態様において、2つ以上の同族結合パートナーは、独立して、B7ファミリーメンバーのリガンドである。いくつかの態様において、2つ以上の同族結合パートナーは、CD28、CTLA-4、ICOS、またはPD-L1のうちの2つ以上から選択される。
V．薬学的組成物および製剤
本発明の治療用組成物を含む薬学的組成物は、例えば、組成物の、pH、浸透圧、粘性、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出率、吸着性、または浸透性を改変、維持または保存するための製剤材料を含有してもよい。薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、性質が水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく非経口投与用の組成物に共通の他の材料を補充した、注射用水または生理食塩水であってよい。中性の緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水がさらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、ソルビトールまたは好適なその代用物をさらに含み得る、pH約7.0〜8.5のトリス緩衝液、またはpH約4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含む。本発明の一態様において、結合剤組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を任意の配合剤と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で貯蔵用に調製してもよい。さらに、結合剤生成物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化してもよい。
製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で存在する。例えば、生理学的pHまたはわずかに低いpH、典型的には約5〜約8のpH範囲内で組成物を維持するために、緩衝液が使用される。非経口投与のための特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、その中で適切に保存される滅菌等張液として結合剤が製剤化される。なお別の調製物は、その後デポー注射を介して送達され得る生成物の制御または持続放出を提供する、注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの作用物質との所望の分子の製剤を含むことができる。
別の局面において、非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液で、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝食塩水で製剤化してもよい。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘性を増加させる物質を含有してもよい。結合剤分子を持続または制御送達製剤中に含めた製剤を含む追加の薬学的組成物は、当業者にとって明らかであろう。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射のような様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技術も当業者に公知である。インビボ投与に使用されるべき薬学的組成物は、典型的には滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜に通す濾過によって達成してもよい。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に実行してもその後に実行してもいずれでもよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で貯蔵しても溶液で貯蔵してもよい。加えて、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル中に入れられる。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、滅菌されている。滅菌は、滅菌濾過膜に通す濾過または照射によって達成し得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に実行してもその後に実行してもいずれでもよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で貯蔵しても溶液で貯蔵してもよい。加えて、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル中に入れられる。
薬学的組成物が製剤化されたら、薬学的組成物は、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として貯蔵し得る。このような製剤は、すぐに使える形態または投与の前に再構成を要する形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで貯蔵し得る。治療的に採用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景および目的に依存するだろう。したがって、当業者は、治療のための適切な投与量レベルが送達される分子、結合剤分子が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および状態（年齢および総体的な健康）に部分的に依存するだろうことを認識するだろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を設定し、かつ、投与経路を変更してもよい。本発明の治療用組成物は、非経口、皮下、もしくは静脈内に、または本明細書の他の箇所に記載のとおり投与することができる。本発明の治療用組成物は、治療有効量で、1ヶ月に1、2、3もしくは4回、1週間に2回、隔週（2週間毎）、または隔月（2ヶ月毎）投与してもよい。投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月またはそれ以上の期間（例えば、1、2、3、4年またはそれ以上、対象の一生にわたる期間を含む）にわたり続けてよい。
一般に、薬学的組成物の投与量および投与経路は、標準的な薬務に従って、対象のサイズおよび状態に従って決定される。例えば、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかで治療有効用量を推定することができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。正確な投与量は、処置（治療）を必要とする対象に関連する要因に照らして決定されるだろう。投与量および投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するようにまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の総体的な健康、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物併用、反応感度、ならびに治療への応答を含む。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、経口、経皮、吸入によって、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐剤によって、皮下、皮内、経皮、噴霧によって、胸膜内、脳室内、関節腔内、眼内、または髄腔内を含む任意の経路を通して対象に投与される。
いくつかの態様において、薬学的組成物の投与量は、単回用量または反復用量である。いくつかの態様において、用量は、対象に1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回またはそれ以上与えられる。いくつかの態様において、1週間に約1以上（例えば、約2以上、約3以上、約4以上、約5以上、約6以上、または約7以上）の用量が与えられる。いくつかの態様において、多回用量が数日、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたって与えられる。いくつかの態様において、一連の処置（治療）は、約1以上の用量（例えば、約2以上の用量、約3以上の用量、約4以上の用量、約5以上の用量、約7以上の用量、約10以上の用量、約15以上の用量、約25以上の用量、約40以上の用量、約50以上の用量、または約100以上の用量）である。
いくつかの態様において、薬学的組成物の投与される用量は、対象の体重1kg当たりタンパク質約1μg以上（例えば、対象の体重1kg当たりタンパク質約2μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約5μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約10μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約25μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約50μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約100μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約250μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約500μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約1mg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約2mg以上、または対象の体重1kg当たりタンパク質約5mg以上）である。
任意の化合物について、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかで治療有効用量を推定することができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。正確な投与量は、処置（治療）を必要とする対象に関連する要因に照らして決定されるだろう。投与量および投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するようにまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の総体的な健康、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物併用、反応感度、ならびに治療への応答を含む。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、長期作用薬学的組成物を3〜4日毎、毎週、または隔週で投与してもよい。投薬頻度は、使用される製剤中の分子の薬物動態パラメーターに依存するだろう。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投与量に達するまで投与される。それゆえ、単回用量としてもしくは多回用量（同じまたは異なる濃度／投与量で）として経時的に、または持続注入として、該組成物を投与してもよい。適切な投与量のさらなる改良が日常的に行われる。適切な用量-応答データの使用によって適切な投与量を突き止めてもよい。
いくつかの態様において、T細胞活性化もしくは増殖、サイトカイン合成もしくは産生（例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2の産生）、種々の活性化マーカー（例えば、CD25、IL-2受容体）の誘導、炎症、関節の腫脹もしくは圧痛、C-反応性タンパク質の血清中レベル、抗コラーゲン抗体産生、および／またはT細胞依存性抗体応答を含む、治療効果についての1つまたは複数のバイオマーカーまたは生理学的マーカーをモニタリングすることができる。
好適な薬学的に許容し得る賦形剤または担体（例えば、PBS）と有効量の本発明の治療用組成物とを含む注射用薬学的組成物を、哺乳動物患者に、非経口、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、皮下、または皮内投与することができる。リポソームを介して投与を容易にすることができる。皮膚および筋肉は、任意の好適な技術による本発明の治療用組成物の投与の一般に好ましい標的である。したがって、哺乳動物対象（例えば、ヒト）の皮膚へのまたは皮膚を介した本発明の治療用組成物の送達が本発明の特徴である。このような本発明の分子を、薬学的に許容し得る注射液で、皮膚へまたは皮膚を介して、例えば、筋肉内、または腹腔内に投与することができる。投与はまた、対象の皮膚へのもしくは皮膚を介したまたは哺乳動物対象の曝露された筋肉への本発明の治療用組成物の経皮デバイス、または、より典型的には、微粒子銃（biolistic）送達によっても達成できる。
望ましくない免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を排除、隔離、もしくは不活性化すること；防御免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を誘導、生成、もしくは刺激すること；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変化させること；またはこれらの効果の組み合わせによって、本発明の治療用組成物の投与が免疫活性を十分に調節するかどうかを決定するための様々な手段が公知である。免疫活性の調節の測定例は、免疫細胞集団の有無の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する）；シグナルに応答して増殖もしくは分裂する能力または増殖もしくは分裂への抵抗性を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、T細胞増殖アッセイ、および抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA、ペプチドまたはタンパク質抗原を負荷した抗原提示細胞で刺激した後の3H-チミジン取込に基づいたpepscan分析；B細胞増殖アッセイを使用する）；他の細胞を殺傷または溶解する能力の測定（例えば、細胞傷害性T細胞アッセイ）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および細胞の他の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成または解離の、ウェスタンブロットおよび免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用するDNA転写プロファイリング）； アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダリングを測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質、および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、2次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに自己タンパク質または自己ポリペプチドが関与する自己免疫疾患、神経変性性疾患、および他の疾患の臨床症状または改善のような臨床転帰の、例えば、多発性硬化症の場合には再発率または疾患重症度を測定することによる（当業者に公知の臨床スコアを使用する）、I型糖尿病の場合には血糖を、または関節リウマチの場合には関節の炎症を測定することよる、測定（臨床スコア、追加の治療法を使用する必要性、機能的状態、画像研究）を含むが、それらに限定されない。
また、本明細書に記載される薬学的組成物を好適な包装で含む製造品が本明細書において提供される。本明細書に記載される組成物（眼科用組成物など）用の好適な包装は、当技術分野において公知であり、かつ、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、広口瓶、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラー（Mylar）またはプラスチック袋）などを含む。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封してもよい。
さらに、本明細書に記載される薬学的組成物（または製造品）を含むキットが提供され、該キットは、本明細書に記載される用途のような該組成物を使用する方法に関する説明書をさらに含んでもよい。本明細書に記載されるキットはまた、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載される任意の方法を実施するための説明書を含む添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料も含んでもよい。
VI．治療用途
本発明の免疫調節タンパク質は、例えば、免疫系および免疫系応答の調節または制御が有益である哺乳動物における様々な免疫系の疾患または状態を治療するための予防的または治療的方法（まとめて、「本発明の治療用組成物」）を非限定に含む、様々な用途に有用性を有すると考えられる。例えば、免疫応答を抑制することは、レシピエントによるドナーからの組織、細胞、または臓器移植の拒絶反応を阻害するための予防的および／または治療的方法において有益であることができる。治療的状況において、哺乳動物対象は、典型的には、免疫系の疾患または状態を有するものであり、そして、投与は、疾患または状態の進行をさらに予防するように実行される。例えば、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患）に罹患している対象への本発明の治療用組成物の投与は、このような免疫系の攻撃またはそれに関連する生物学的応答の抑制または阻害をもたらすることができる。健康な体組織に対するこの免疫系の攻撃を抑制することによって、健康な組織に対するこのような攻撃から生じるまたはそれと関連する得られた身体的症状（例えば、疼痛、関節炎症、関節の腫脹または圧痛）は、減少または軽減されることができ、そして、免疫系の攻撃から生じるまたはそれと関連する生物学的および身体的損傷は、減少、遅延、または停止されることができる。予防的状況において、対象は、免疫系の疾患、障害または状態を有する、それに罹り易い、またはそれを呈すると考えてもよく、そして、投与は、典型的には、疾患、障害もしくは状態の進行を予防する、それと関連する症状、徴候、もしくは生物学的応答を阻害もしくは軽減する、そこから潜在的に生じる肉体的損傷を予防する、および／または対象の身体機能を維持もしくは改善するように実行される。
患者の免疫系の疾患または障害は、例えば、限定されないが、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ANCA）-関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、自己免疫疾患（例えば、ループス、RA、MS、グレーブス病など）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、ベルガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病／シリアック病、慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経根障害（Chronic Inflammatory Demyelinating, Polyradicalneuropathy）（CIPD）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（CSS）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（CAD）、COPD、CREST症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎（Dermatitis, Herpetiformus）、皮膚筋炎、糖尿病、円板状ループス、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、眼球突出（Exopthalmos）、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、移植関連疾患または障害、グレーブス病、GVHD、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenia Purpura）（ITP）、IgA腎症、免疫増殖性疾患または障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（IBD）、インスリン依存性糖尿病（IDDM）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（JIA）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Lymphoscytic Lypophisitis）、メニエール病、ミラーフィッシャー症候群（Miller Fish Syndrome）／急性散在性脳脊髄神経根障害（acute disseminated encephalomyeloradiculopathy）、混合性結合組織病、多発性硬化症（MS）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ME）、重症筋無力症、眼炎症、落葉性天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ウィテカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫性胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植拒絶反応（腎臓、心臓、肝臓、肺など）、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（SLE）、全身性強皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症であっても、またはそれを含んでもよく、ならびにレシピエント対象によるドナー組織、細胞、移植片、もしくは臓器移植の拒絶反応と関連する免疫応答を予防または抑制すること。移植関連疾患または障害は、移植片対宿主病（GVDH）（例えば、骨髄移植と関連する）、および、例えば、皮膚、筋肉、神経細胞、膵島、臓器の移植片、肝臓の実質細胞などを含む、臓器、組織、もしくは細胞移植片移植（例えば、組織または細胞同種移植片または異種移植片）の拒絶反応から生じるまたはそれと関連する免疫障害を含む。レシピエント対象におけるドナー組織、細胞、移植片または固形臓器移植に関して、本明細書に開示される本発明の治療用組成物がレシピエントにおけるこのような移植の急性拒絶反応を予防する際におよび／またはレシピエントにおけるこのような移植の拒絶反応を予防するための長期維持療法（例えば、糖尿病に罹患している対象レシピエントにおけるドナーからのインスリン産生膵島細胞移植の拒絶反応を阻害する）に効果的であり得ると考えられる。
また、本発明の治療用組成物を、単剤療法として（すなわち、単剤として）使用して、少なくとも1つの化学療法剤と併用して（すなわち、組み合わせ療法）、がんワクチンと併用して、免疫チェックポイント阻害剤と併用して、および／または放射線療法と併用して、哺乳動物、特定するとヒトのがん細胞の成長を阻害することができる。本開示のいくつかの局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブなどである。本発明の免疫調節タンパク質による免疫活性の調節に感受性であるがんの進行を阻害、停止、または反転させるために、有効量の治療用組成物が投与される。ヒトがん細胞を、インビボまたはエクスビボで処置することができる。ヒト患者のエクスビボ処置（治療）では、がん細胞を含有する組織または体液を体外で処置し、次いで、その組織または体液を患者に再導入する。いくつかの態様において、がんは、患者への治療用組成物の投与によって、ヒト患者でインビボ処置（治療）される。したがって、本発明は、腫瘍の進行を阻害、停止、または反転させる、またはそうでなければ、対照での処置（治療）と比べて、無増悪生存率（すなわち、患者ががんを悪化させることなく生存している処置（治療）中および処置（治療）後の長さ）、または全生存率（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、がんと診断されたまたは処置（治療）された後にある一定期間生存している研究または処置群中の人の割合）の統計的に有意な向上をもたらす、エクスビボおよびインビボ法を提供する。本発明の方法によって処置（治療）できるがんは、黒色腫、膀胱がん、血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がん、乳がん、膵臓がん（腺がん）、大腸がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、脾臓がん、胸腺もしくは血球のがん（すなわち、白血病）、前立腺がん、精巣がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、またはユーイング肉腫を含むが、それらに限定されない。
VII.例示的態様
提供される態様としては、以下の態様が挙げられる。
態様1．いくつかの態様において、野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、該少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、該野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有し；かつ該少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、該少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する、前記免疫調節タンパク質が提供される。
態様2．態様1のいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの同族結合パートナーは、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である。
態様3．態様2のいくつかのさらなる態様において、前記細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。
態様4．態様2または態様3のいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、前記細胞表面分子種の各々は、該ISを形成する該2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。
態様5．態様2〜4のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つはリンパ球である。
態様6．態様5のいくつかのさらなる態様において、前記リンパ球はNK細胞またはT細胞である。
態様7．態様5〜6のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインの結合は、前記リンパ球の免疫活性を調節する。
態様8．態様7のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して向上した免疫活性をもたらすことができる。
態様9．態様7のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して低下した免疫活性をもたらすことができる。
態様10．態様2〜9のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは腫瘍細胞である。
態様11．態様2〜10のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。
態様12．態様4〜11のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる。
態様13．態様1〜12のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。
態様14．態様1〜13のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する。
態様15．態様1〜14のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインはヒトIgSFメンバーである。
態様16．態様1〜15のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインは、IgVドメイン、IgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。
態様17．態様1〜16のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性が改変されたIgVドメイン、親和性が改変されたIgC1ドメイン、もしくは親和性が改変されたIgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。
態様18．態様1〜17のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む。
態様19．態様18のいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は、同じ野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む。
態様20．態様19のいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
態様21．態様20のいくつかのさらなる態様において、前記異なる野生型IgSFドメインは、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する。
態様22．態様1〜17のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを1つだけ含む。
態様23．態様1〜22のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFは、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
態様24．態様23のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む第二の親和性が改変されたIgSFをさらに含む。
態様25．態様1〜24のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインはB7ファミリーのメンバーである。
態様26．態様1〜25のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、またはICOSLGのドメインである。
態様27．態様1〜26のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインはCD80のドメインである。
態様28．いくつかの態様において、野生型CD80免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変されたCD80 IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質であって、該少なくとも1つの親和性が改変されたCD80 IgSFドメインが、該野生型CD80 IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有する、前記免疫調節タンパク質が提供される。
態様29．態様27または態様28のいくつかのさらなる態様において、前記同族結合パートナーはCD28およびPD-L1である。
態様30．態様27〜29のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記野生型IgSFドメインはIgVドメインであり、かつ／または、前記親和性が改変されたCD80ドメインは、親和性が改変されたIgVドメインである。
態様31．態様27〜30のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列中に含有される野生型CD80ドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
態様32．態様1〜31のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、前記野生型IgSFドメイン中に1以上20以下のアミノ酸置換を含む。
態様33．態様1〜32のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、前記野生型IgSFドメイン中に1以上10以下のアミノ酸置換を含む。
態様34．態様1〜33のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、前記野生型IgSFドメイン中に1以上5以下のアミノ酸置換を含む。
態様35．態様1〜34のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、前記少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
態様36．態様1〜35のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
態様37．態様1〜36のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は可溶性である。
態様38．態様1〜37のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを欠いている。
態様39．態様1〜38のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、親和性が改変されたIgSFドメインを含む細胞外ドメイン（ECD）またはその特異的結合断片のみを含む。
態様40．態様1〜39のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
態様41．態様1〜40のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、多量体化ドメインに連結されている。
態様42．態様1〜41のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている。
態様43．態様42のいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインは、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである。
態様44．態様39〜41のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものであるか；または前記バリアントFcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
態様45．態様42〜44のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインまたはそのバリアントは、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
態様46．態様38〜41のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、リンカーを介して間接的に連結されている。
態様47．態様41〜46のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は二量体である。
態様48．態様1〜47のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
態様49．いくつかの態様において、少なくとも2つの非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーに対する変化した結合性を示すように親和性が改変されており；かつ該少なくとも2つの改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が独立して、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する、前記免疫調節タンパク質が提供される。
態様50．態様49のいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は、親和性が改変されたIgSFドメインであり、ここで、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、かつ、第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
態様51．態様50のいくつかのさらなる態様において、前記第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第一の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示し；かつ前記第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第二の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示す、。
態様52．態様49〜51のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記異なる同族結合パートナーは、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である。
態様53．態様52のいくつかのさらなる態様において、前記異なる細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。
態様54．態様52または態様53のいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞は、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、かつ、前記異なる細胞表面分子種は、該ISを形成する該2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する。
態様55．態様52〜54のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つはリンパ球である。
態様56．態様55のいくつかのさらなる態様において、前記リンパ球はNK細胞またはT細胞である。
態様57．態様55または態様56のいくつかのさらなる態様において、前記細胞への免疫調節タンパク質の結合は、前記リンパ球の免疫活性を調節する。
態様58．態様57のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して向上した免疫活性をもたらすことができる。
態様59．態様57のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して低下した免疫活性をもたらすことができる。
態様60．態様52〜59のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つは腫瘍細胞である。
態様61．態様52〜60のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。
態様62．態様54〜61のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる。
態様63．態様49〜62のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の改変されたIgSFドメインの各々は、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
態様64．態様63のいくつかのさらなる態様において、前記異なる野生型IgSFドメインは、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する。
態様65．態様49〜64のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の改変されたIgSFドメインは、非野生型の組み合わせである。
態様66．態様49〜65のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。
態様67．態様49〜66のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する。
態様68．態様49〜67のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変されたIgSFドメインおよび第二の改変されたIgSFドメインの各々は個別に、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む。
態様69．態様49〜68のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、B7ファミリーのメンバーである。
態様70．態様69のいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、CD80、CD86、またはICOSLGに由来する。
態様71．態様49〜68のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一または第二の野生型IgSFドメインはB7ファミリーのメンバーに由来し、かつ、第一または第二の野生型IgSFドメインの他方は別のIgSFファミリーに由来する。
態様72．態様49〜68および71のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは、ICOSLGおよびNKp30に由来する。
態様73．態様49〜68および71のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインは、CD80およびNKp30に由来する。
態様74．態様49〜73のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、ヒトIgSFメンバーである。
態様75．態様49〜74のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の野生型IgSFドメインの各々は個別に、IgVドメイン、およびIgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合である。
態様76．態様49〜75のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変された非免疫グロブリンドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンドメインの各々は個別に、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、改変IgVドメイン、改変IgC1ドメイン、もしくは改変IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である。
態様77．態様49〜76のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変された非免疫グロブリンドメインまたは第二の改変された非免疫グロブリンドメインのうちの少なくとも1つは、改変IgVドメインである。
態様78．態様49〜77のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は個別に、1以上20以下のアミノ酸置換を含む。
態様79．態様49〜78のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は個別に、1以上10以下のアミノ酸置換を含む。
態様80．態様49〜79のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は個別に、1以上5以下のアミノ酸置換を含む。
態様81．態様49〜80のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。
態様82．態様49〜81のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
態様83．態様49〜80および82のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は個別に、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
態様84．態様49〜83のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は可溶性である。
態様85．態様49〜84のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
態様86．態様49〜85のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、多量体化ドメインに連結されている。
態様87．態様49〜86のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている。
態様88．態様87のいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインは、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである。
態様89．態様87または態様88のいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものであるか；または前記バリアントFcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
態様90．態様87〜89のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記Fcドメインまたはそのバリアントは、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
態様91．態様86〜90のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、バリアントCD80ポリペプチドは、リンカーを介して間接的に連結されている。
態様92．態様86〜91のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は二量体である。
態様93．態様49〜92のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインと同じまたは異なる1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインをさらに含む。
態様94．態様93のいくつかのさらなる態様において、前記1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインは、親和性が改変されたIgSFドメインである。
態様95．態様49〜94のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
態様96．いくつかの態様において、態様1〜95のいずれか1つの免疫調節ポリペプチドをコードする、核酸分子が提供される。
態様97．態様96のいくつかのさらなる態様において、前記核酸分子は合成核酸である。
態様98．態様96または態様97のいくつかのさらなる態様において、前記核酸分子はcDNAである。
態様99．いくつかの態様において、態様96〜98のいずれか1つの核酸分子を含むベクターが提供される。
態様100．態様99のいくつかのさらなる態様において、前記ベクターは発現ベクターである。
態様101．いくつかの態様において、態様99または態様100のベクターを含む細胞が提供される。
態様102．態様101のいくつかのさらなる態様において、細胞は真核細胞または原核細胞である。
態様103．いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を生産する方法であって、態様96〜98のいずれか1つの核酸分子または態様99もしくは態様100のベクターを、細胞において該タンパク質を発現する条件下で宿主細胞に導入する工程を含む、前記方法が提供される。
態様104．態様103のいくつかのさらなる態様において、前記方法は、前記細胞から前記免疫調節タンパク質を単離または精製する工程をさらに含む。
態様105．いくつかの態様において、態様1〜95のいずれか1つの免疫調節タンパク質を含む、薬学的組成物が提供される。
態様106．態様105のいくつかのさらなる態様において、前記薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤を含む。
態様107．態様105または態様106のいくつかのさらなる態様において、前記薬学的組成物は、滅菌されている。
態様108．いくつかの態様において、バイアル中に態様105〜107のいずれか1つの薬学的組成物を含む製造品が提供される。
態様109．態様108のいくつかのさらなる態様において、前記バイアルは密閉されている。
態様110．いくつかの態様において、態様105〜107のいずれか1つの薬学的組成物、および使用説明書を含む、キットが提供される。
態様111．いくつかの態様において、態様108または態様109の製造品、および使用説明書を含む、キットが提供される。
態様112．いくつかの態様において、対象における免疫応答を調節する方法であって、該対象に治療有効量の態様1〜95のいずれか1つの免疫調節タンパク質を投与する工程を含む、前記方法が提供される。
態様113．態様112のいくつかのさらなる態様において、前記免疫応答の調節により前記対象における疾患または状態が治療される。
態様114．態様112または態様113のいくつかのさらなる態様において、前記免疫応答が向上する。
態様115．態様114のいくつかのさらなる態様において、前記疾患または状態は、腫瘍またはがんである。
態様116．態様114または態様115のいくつかのさらなる態様において、前記疾患または状態は、黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍から選択される。
態様117．態様112または態様113のいくつかのさらなる態様において、前記免疫応答が低下する。
態様118．態様117のいくつかのさらなる態様において、前記疾患または状態は、炎症性疾患または状態である。
態様119．態様117または態様118のいくつかのさらなる態様において、前記疾患または状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬から選択される。
態様120．いくつかの態様において、以下の工程を含む、親和性が改変された免疫調節タンパク質を同定する方法が提供される：
a）少なくとも1つの改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインまたはその特異的結合断片を含む改変されたタンパク質と、少なくとも2つの同族結合パートナーとを、該タンパク質と該少なくとも2つの同族結合パートナーとの結合をもたらすことができる条件下で接触させる工程であって、該少なくとも1つの改変されたIgSFドメインが、野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、工程；
b）該野生型IgSFドメインを含むタンパク質と比較して該2つの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を有する該改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定する工程；および
c）該少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する該改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程であって、それによって、該親和性が改変された免疫調節タンパク質が同定される、工程。
態様121．態様120のいくつかのさらなる態様において、工程b）は、前記野生型ドメインを含むタンパク質と比較して前記少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定することを含む。
態様122．態様120または態様121のいくつかのさらなる態様において、工程a）の前に、前記野生型IgSFドメインに1つまたは複数のアミノ酸置換を導入し、それによって、前記改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を生成する。
態様123．態様120〜122のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記改変されたタンパク質は、少なくとも2つの改変されたIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片を含み、ここで、第一のIgSFドメインは、第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、かつ、第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインは、第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
態様124．態様123のいくつかのさらなる態様において、前記第一および第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々は、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する。
態様125．いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む免疫調節タンパク質であって、該親和性が改変されたIgSFドメインが、少なくとも2つの細胞表面分子種に非競合的に特異的に結合し、該分子種の各々が、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現し、該哺乳動物細胞の1つがリンパ球であり、該親和性が改変されたIgSFドメインの結合が、該リンパ球の免疫活性を調節する、前記免疫調節タンパク質が提供される。
態様126．態様125のいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合する。
態様127．態様125または態様126のいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含み、該免疫調節タンパク質は、前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合する。
態様128．態様125〜127のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、IgSF細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。
態様129．態様125〜128のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、少なくとも1つの親和性が改変されたヒトCD80ドメインを含む。
態様130．態様125〜129のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、親和性が改変された哺乳動物IgSFメンバーを含む。
態様131．態様125〜130のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、親和性が改変された哺乳動物IgSFメンバーは、CD80、PVR、ICOSLG、またはHAVCR2のうちの少なくとも1つである。
態様132．態様125〜131のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、免疫活性は増強される。
態様133．態様125〜132のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、免疫活性は抑制される。
態様134．態様125〜133のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記2つの哺乳動物細胞のうちの1つは、腫瘍細胞である。
態様135．態様125〜134のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。
態様136．態様125〜135のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
態様137．態様125〜136のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、前記2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。
態様138．態様125〜137のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、正確に1つのIgSFメンバーに非競合的に特異的に結合する。
態様139．態様125〜138のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、前記2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
態様140．態様125〜139のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、親和性が改変されたIgV、IgC1、またはIgC2ドメインである。
態様141．態様125〜140のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、その野生型IgSFドメインと1以上10以下のアミノ酸置換だけ異なる。
態様142．態様125〜141のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、その野生型IgSFドメインと1以上5以下のアミノ酸置換だけ異なる。
態様143．態様125〜142のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、ヒトCD80 IgSFドメインである。
態様144．態様125〜143のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、該親和性が改変されたIgSFドメインは、同じ種のIgSFドメインではない。
態様145．態様125〜144のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、直接または間接的に、抗体の結晶化可能断片（Fc）に共有結合されている。
態様146．態様125〜145のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、薬学的に許容し得る担体中にある。
態様147．態様125〜146のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
態様148．態様125〜147のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、可溶性である。
態様149．態様125〜148のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
態様150．態様125〜149のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、分子間ジスルフィド結合によって二量体化されている。
態様151．態様125〜150のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。
態様152．いくつかの態様において、少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む免疫調節タンパク質であって、該親和性が改変されたIgSFドメインの各々が、異なる細胞表面分子種に特異的に結合し、該分子種の各々が、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現し、該哺乳動物細胞の1つがリンパ球であり、該親和性が改変されたIgSFドメインの結合が、該リンパ球の免疫活性を調節する、前記免疫調節タンパク質が提供される。
態様153．態様125〜152のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、競合的に結合する。
態様154．態様125〜153のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、同じ種のIgSFドメインではない。
態様155．態様125〜154のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、非野生型の組み合わせである。
態様156．態様125〜155のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。
態様157．態様125〜156のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインは、CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、またはCD200R1のうちの少なくとも1つに由来する。
態様158．態様125〜157のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変された哺乳動物IgSFメンバーを含む。
態様159．態様125〜158のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、ヒトIgSFメンバーである。
態様160．態様125〜159のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、CD80、CD86、CD274、PDCD1LG2、ICOSLG、CD276、VTCN1、CD28、CTLA4、PDCD1、ICOS、BTLA、CD4、CD8A、CD8B、LAG3、HAVCR2、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、またはCD200R1の少なくとも2つである。
態様161．態様125〜160のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、免疫活性は増強される。
態様38．態様125〜1のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、免疫活性は抑制される。
態様162．態様125〜161のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記2つの哺乳動物細胞のうちの1つは、腫瘍細胞である。
態様163．態様125〜162のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記リンパ球は、NK細胞またはT細胞である。
態様164．態様125〜163のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
態様165．態様125〜164のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、前記細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する。
態様166．態様125〜165のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、正確に1つの細胞表面分子種に特異的に結合する。
態様167．態様125〜166のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記2つの親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つは、前記2つの細胞表面分子種のうちの少なくとも1つに対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する。
態様168．態様125〜167のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記親和性が改変されたIgSFドメインは、IgV、IgC1、またはIgC2ドメインのうちの少なくとも1つである。
態様169．態様125〜168のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインの各々は、その野生型IgSFドメインと1以上10以下のアミノ酸置換だけ異なる。
態様170．態様125〜169のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインの各々は、その野生型IgSFドメインと1以上5以下のアミノ酸置換だけ異なる。
態様171．態様125〜170のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、直接または間接的に、抗体の結晶化可能断片（Fc）に共有結合されている。
態様172．態様125〜171のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、薬学的に許容し得る担体中にある。
態様173．態様125〜172のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記タンパク質は、グリコシル化またはペグ化されている。
態様174．態様125〜173のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記タンパク質は、可溶性である。
態様175．態様125〜174のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記タンパク質は、リポソーム膜に結合されている。
態様176．態様125〜175のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記タンパク質は、分子間ジスルフィド結合によって二量体化されている。
態様177．態様125〜176のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記細胞表面分子種は、シス配置またはトランス配置で発現する。
態様178．態様125〜177のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列、その組み合わせ、または断片と少なくとも85％の配列同一性を有する。
態様179．態様125〜178のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列、その組み合わせ、または断片と少なくとも90％の配列同一性を有する。
態様180．態様125〜179のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列、その組み合わせ、または断片と少なくとも95％の配列同一性を有する。
態様181．態様125〜180のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列、その組み合わせ、または断片と少なくとも99％の配列同一性を有する。
態様182．態様125〜181のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、第二の免疫調節タンパク質をさらに含み、該第二の免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも85％の配列同一性を有する。
態様183．態様125〜182のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、第二の免疫調節タンパク質をさらに含み、該第二の免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも90％の配列同一性を有する。
態様184．態様125〜183のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、第二の免疫調節タンパク質をさらに含み、該第二の免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも95％の配列同一性を有する。
態様185．態様125〜184のいずれか1つのいくつかのさらなる態様において、前記免疫調節タンパク質は、第二の免疫調節タンパク質をさらに含み、該第二の免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:1〜26から選択されるアミノ酸配列またはその断片と少なくとも99％の配列同一性を有する。
態様186．いくつかの態様において、態様125〜185の免疫調節タンパク質のいずれか1つをコードする組換え核酸が提供される。
態様187．いくつかの態様において、態様186の核酸を含む組換え発現ベクターが提供される。
態様188．いくつかの態様において、態様187の発現ベクターを含む組換え宿主細胞が提供される。
態様189．いくつかの態様において、態様125〜185のいずれか1つの免疫調節タンパク質を製造する方法であって、免疫調節タンパク質発現条件下で組換え宿主細胞を培養する工程、組換え発現ベクターによってコードされる該免疫調節タンパク質を該細胞において発現させる工程、および、それにより発現した該組換え免疫調節タンパク質を精製する工程を含む、前記方法が提供される。
態様190．いくつかの態様において、増強または抑制された免疫応答を必要とする哺乳動物患者を治療する方法であって、治療有効量の態様125〜185のいずれか1つの免疫調節タンパク質を投与することによる方法が提供される。
態様191．態様190のいくつかのさらなる態様において、増強された免疫応答は、患者における黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍を治療する。
態様192．態様190のいくつかのさらなる態様において、抑制された免疫応答は、患者におけるクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬を治療する。
VIII．実施例
以下の実施例は、単に例示を目的に含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1〜8は、免疫活性化および阻害の両方における実証された二つの役割を有する免疫シナプス（IS）の成分である、親和性が改変されたCD80（B7-1）、CD86（B7-2）、ICOSL、およびNKp30免疫調節タンパク質の設計、作製、およびスクリーニングを記載する。これらの実施例は、IgSFドメインの親和性改変が、免疫活性を向上および低下させるように作用できるタンパク質を生成することを実証する。本研究はまた、II型免疫調節タンパク質を形成して免疫調節活性を達成する、対になって融合された（すなわち、スタックされた）これらのドメインの種々の組み合わせも記載する。
実施例1
IgSFドメインの変異体DNA構築物の生成
実施例1は、酵母ディスプレイライブラリーとしての酵母の表面上での翻訳および発現のための、ヒトCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 IgSFドメインの変異体DNA構築物の生成を記載する。
A．縮重ライブラリー
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化のための標的タンパク質の特異的残基を標的化するライブラリーについて、ヒトCD80（SEQ ID NO:28）、ICOSL（SEQ ID NO:32）、およびNKp30（SEQ ID NO:54）の細胞外ドメイン（ECD）のコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。各ECDの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/におけるアルゴリズムを使用して、縮重コドンを生成した。
概して、変異させる位置および縮重コドンを以下のとおり選択した：関心対象の標的-リガンド対の結晶構造（CD80、NKp30）または相同性モデル（ICOSL）を使用して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。この分析を、URL:spdbv.vital-it.ch）で利用可能な構造ビューア（structure viewer）を使用して実施した。例えば、CTLA4に結合しているCD80についての結晶構造は、URL:www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8L）に公表されており、そして、CTLA4への改善された結合剤の選択のためにCD80::CTLA4界面に基づいて標的化ライブラリーを設計した。しかしながら、リガンドCD28およびPDL1との入手可能なCD80構造はなく、そのためまた同じライブラリーを使用して、CD28（CD80上のCTLA4と同じ領域に結合する）およびPDL1（PDL1がCTLA4と同じ部位に結合するか公知ではない）の結合剤について選択した。
ライブラリー設計における次の工程は、保存されている残基を同定するためのヒト、マウス、ラットおよびサルCD80、ICOSLまたはNKp30配列のアライメントであった。この分析に基づいて、保存されている標的残基を縮重コドンで変異させたところ、保存的アミノ酸変化＋野生型残基を特定しただけであった。保存されていない残基を、より積極的に変異させたが、これも野生型残基を含んでいた。野生型残基をまたコードする縮重コドンを配置して、標的タンパク質の過度の変異誘発を回避した。同じ理由で、変異誘発のため最大20の位置までしか一度に標的化できなかった。これらの残基は、接触残基と非接触界面残基との組み合わせであった。
オリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解させ、等モル比で混合し、95℃に5分間加熱し、そして、アニーリングのためゆっくり室温まで冷ました。次いで、ECDの開始点および終点にアニーリングするECD特異的オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ使用して、PCR産物を生成した。次いで、改変バージョンのpBYDS03クローニングベクター（Life Technologies USA）とBamH1およびKpn1クローニング部位以外および以内で40〜50bpだけ重複するECD特異的オリゴヌクレオチドを使用して、前工程からのPCR産物100ngを増幅させ、合計5μgのDNAを生成した。両方のPCRは、OneTaq 2×PCR master mix（New England Biolabs, USA）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものであった。PCR精製キット（Qiagen, Germany）を使用して第二のPCR産物を精製し、滅菌脱イオン水に再懸濁した。
ライブラリー挿入を準備するために、改変された酵母ディスプレイバージョンのベクターpBYDS03をBamH1およびKpn1制限酵素（New England Biolabs, USA）で消化し、そして、大きなベクター断片をゲル精製して、滅菌脱イオン水に溶解させた。ライブラリーDNA 12μgと線状ベクター4μgを総容量50μlの脱イオンおよび滅菌水中で混合することによって、次の工程のためのエレクトロポレーション可能なDNAを生成した。標的化ライブラリーを生成するための代わりの方法は、縮重コドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いて標的ECDの部位特異的変異誘発（Multisite kit, Agilent, USA）を行うことであった。このアプローチを使用して、変異誘発のための標的タンパク質の特異的なストレッチのみを標的化するサブライブラリーを生成した。これらの場合、選択工程に進む前にサブライブラリーを混合した。一般に、ライブラリーサイズは、107〜108個のクローンの範囲であったが、ただし、サブライブラリーは、104〜105個の範囲でしかなかった。大きなライブラリーをCD80、ICOSL、CD86およびNKp30について生成した。サブライブラリーをCD80、ICOSLおよびNKp30について生成した。
B．ランダムライブラリー
また、ランダムライブラリーを構築して、CD80（SEQ ID NO:28）、CD86（SEQ ID NO: 29）、ICOSL（SEQ ID NO:32）およびNKp30（SEQ ID NO:54）のECDのバリアントを同定した。野生型ECDをコードするDNAを、改変された酵母ディスプレイベクターpBYDS03のBamH1部位とKpn1部位との間にクローニングし、次いで、同じ制限酵素を使用して切り離した。次いで、ライブラリーバリアント当たり平均3〜5つのアミノ酸変化を生成するために、切り離したDNAをGenemorph II kit（Agilent, USA）で変異誘発させた。次いで、変異誘発させたDNAを2工程PCRによって増幅させ、標的化ライブラリーについて上記のとおりさらに処理した。
実施例2
酵母へのDNAライブラリーの導入
実施例2は、酵母へのCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 DNAライブラリーの導入を記載する。
縮重およびランダムライブラリーDNAを酵母に導入するために、酵母BJ5464系統（ATCC.org；ATCC number 208288）のエレクトロポレーションコンピテントセルを調製し、そして、上の工程からのエレクトロポレーション可能なDNAを用いてGene Pulser II（Biorad, USA）で基本的には記載のとおりエレクトロポレーションした（Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358）。唯一の例外は、改変プラスミドpBYDS03によって担持されるLEU2選択マーカーに対応するために形質転換細胞を非誘導最小選択SCD-Leu培地中で成長させたことであった。
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。エレクトロポレーションした培養物の残りを飽和まで成長させ、そして、この培養物に由来する細胞を同じ培地中でもう一度継代培養して、非形質転換細胞の画分を最小限に抑えた。ライブラリーの多様性を維持するために、計算したライブラリーサイズよりも少なくとも10×以上の細胞を含有した接種源を使用してこの継代培養工程を行った。第二の飽和培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量/体積）グリセロールを含有する新鮮培地に1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
SCD-Leu培地1リットルは、クエン酸ナトリウム14.7グラム、クエン酸一水和物4.29グラム、デキストロース20グラム、Difcoブランドの酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。0.2μMの真空濾過装置を使用して、使用前に培地を滅菌濾過した。
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。
2つ以上の異なるライブラリークローンを含有する細胞からプラスミドを分離するために、ライブラリーサイズの10倍に相当する数の細胞をSCD-Leu一晩培養物から採取し、新鮮SCD-Leu培地中に1/100に継代培養し、そして、一晩成長させた。この一晩培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量／体積）グリセロールに1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
実施例3
酵母の選択
実施例3は、CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30の親和性が改変されたバリアントを発現する酵母の選択を記載する。
ライブラリーサイズの少なくとも10倍に等しい数の細胞を、個々のライブラリーストックから解凍し、非誘導SCD-Leu培地中0.1×106個の細胞/mlに懸濁し、そして、一晩成長させた。翌日、ライブラリーサイズの10倍に等しい数の細胞を2000 RPMで2分間遠心分離し、誘導SCDG-Leu培地中0.5×106個の細胞/mlに再懸濁した。SCDG-Leu誘導培地1リットルは、水に溶解させて0.22μmの膜濾過装置に通して滅菌した、Na2HPO4 5.4グラム、NaH2PO4*H20 8.56グラム、ガラクトース20グラム、デキストロース2.0グラム、Difco酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。培養物を20℃で2日間成長させて、酵母細胞表面でライブラリータンパク質の発現を誘導した。
細胞を磁気ビーズで処理して、非結合剤を還元し、外因性組換えカウンター構造タンパク質に結合する能力を有する全てのCD80、CD86、ICOSL、またはNKp30バリアントを富化させた。例えば、酵母にディスプレイされた標的化またはランダムCD80ライブラリーをCD28、CTL-4、PD-L1、ICOS、およびB7-H6の各々に対して別々に選択した。これに続いて、外因性カウンター構造タンパク質染色を使用した2〜3ラウンドのフローサイトメトリーソーティングを行って、改善された結合剤をディスプレイする酵母細胞の画分を富化させた。磁気ビーズ富化およびフローサイトメトリーによる選択は、基本的には、Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 and Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008 に記載のとおりである。
CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30ライブラリーと共に、標的リガンドタンパク質は、以下のとおりR&D Systems（USA）から供給された：ヒトrCD28.Fc（すなわち、組換えCD28-Fc融合タンパク質）、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc、rICOS.Fc、およびrB7H6.Fc。磁気ストレプトアビジンビーズをNew England Biolabs, USAから得た。カウンター構造タンパク質のビオチン化のために、ビオチン化キット（cat# 21955, Life Technologies, USA）を使用した。2色フローサイトメトリーソーティングのために、Becton Dickinson FACS Aria II sorterを使用した。CD80、CD86、ICOSL、またはNKp30ディスプレイレベルを、Alexafluor 488（Life Technologies, USA）で標識した抗ヘマグルチニン抗体でモニタリングした。リガンド結合Fc融合タンパク質rCD28.Fc、rCTLA4.Fc、rPDL1.Fc、rICOS.Fc、またはrB7-H6.Fcを、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）／側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲーティングし、そして、ソートゲートは、FL4で検出されたより高いリガンド結合に基づいており、FL1でより限定されたタグ発現結合を保有した。
フローサイトメトリーソートからの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性についてアッセイした。ソートアウトプット酵母を増殖および再誘導して、これらがコードする特定のIgSF親和性が改変されたドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親の野生型酵母系統、またはビーズアウトプット酵母集団のような任意の他の選択されたアウトプットと比較することができる。
ICOSLについて、各集団を、抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、各rICOS.Fc、rCD28.Fc、およびrCTLA4.Fcの結合について第二のソートアウトプット（F2）を親ICOSL酵母と比較した。
ICOSに対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、5.6nM rICOS.Fcで染色したとき平均蛍光強度（MFI）値997を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrICOS.Fcで染色したとき397と測定された。これは、このF2で選択されたクローンのプールでおおまかに3倍の平均結合の改善を表し、そして、個別に試験したときに、そのプールからの個々のクローンがはるかに良好な改善されたMFI/親和性を有すると予測される。
CD28に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCD28.Fcで染色したときMFI値640を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCD28.Fcで染色したとき29と測定された（22倍改善）。CTLA4に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCTLA4.Fcで染色したときMFI値949を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCTLA4.Fcで染色したとき29と測定された（32倍改善）。
B7-H6に対する結合性について選択されたNKp30酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、16.6nM rB7H6.Fcで染色したときMFI値533を与えたが、一方で、親NKp30系統のMFIは、同じ濃度のrB7H6.Fcで染色したとき90と測定された（6倍改善）。
重要なことに、上記の全てのF2アウトプットのMFIは、FL1にて抗HAタグ抗体を用いて測定したとき、野生型系統と比較して増加することなく、時に低下した場合もあったが、このことは、向上した結合性が選択されたバリアントの酵母の表面での増加した発現の関数ではなかったことを示しており、そして、高いリガンド結合を有する中から低エクスプレッサーのみを選択するゲーティング戦略を検証した。
実施例4
Fc融合物としてのおよび種々の免疫調節タンパク質タイプにおける選択アウトプットの再編成
実施例4は、Fc分子に融合されたCD80またはICOSLの親和性が改変された（バリアント）細胞外ドメイン（ECD）（バリアントECD-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質としての選択アウトプットの再編成を記載する。
最終フローサイトメトリーCD80およびICOSLソートからのアウトプット細胞をSCD-Leu培地中末端密度まで成長させた。各アウトプットからのプラスミドDNAを、酵母プラスミドDNA単離キット（Zymoresearch, USA）を使用して単離した。Fc融合物について、選択したFc融合ベクターへのクローニングに好適な制限部位を付加したPCRプライマーを使用して、プラスミドDNAプレップから変異体標的ECDのコーディングDNAをバッチ増幅させた。制限消化後、PCR産物を、適切なFc融合ベクターにライゲーションし、続いて、XL1 Blue系統大腸菌（Agilent, USA）またはNEB5α（New England Biolabs）に供給者の指示どおり化学形質転換した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
形質転換反応の希釈物を、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有するLB-寒天上にプレーティングして、単一コロニーを生成した。次いで、各形質転換からの最大96個のコロニーを、96ウェルプレート内、LB-ブロス（Teknova cat # L8112）中37℃で一晩飽和まで成長させ、そして、全てのクローン中の変異を同定するために各ウェルからの小アリコートをECDインサートのDNAシークエンシングに送った。サービス提供会社（Genewiz；South Plainfield, NJ）によって提供されるプロトコールを使用して、DNAシークエンシング用の試料調製を行った。DNAシークエンシング用の試料を取り出した後、次いで残りの培養物にグリセロールを最終グリセロール含量25％まで加え、そして、後で使用するためプレートをマスタープレート（以下参照）として-20℃で貯蔵した。あるいは、DNAシークエンシング用の試料を、成長させた液体培養物から固体寒天プレートへのディスポーザブル96ウェルレプリケーター（VWR, USA）を使用したレプリカプレーティングによって生成した。これらのプレートを一晩インキュベートして成長パッチを生成し、そして、プレートをGenewizに規定されているとおりGenewizに送った。
Genewizで生成されたDNAシークエンシングデータの分析からの関心対象のクローンの同定後、関心対象のクローンをマスタープレートから回収し、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有する液体LB-ブロス5ml中で密度まで個々に成長させ、次いで、各培養物2mlを、Pureyield kit（Promega）のような標準キットを使用する各クローンの約10μgのミニプレッププラスミドDNAの調製に使用した。関心対象のクローンの同定は、一般に、以下の工程を包含した。最初に、DNA配列データファイルをGenewizウェブサイトからダウンロードした。次いで、ECDコーディング領域の開始点で始まるように全ての配列を手動で処理した。次いで、URL:www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/.で利用可能な好適なプログラムを使用して、処理した配列をバッチ翻訳した。次いで、翻訳した配列を、URL:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlで利用可能な好適なプログラムを使用してアライメントさせた。
次いで、関心対象のクローンを以下の基準を使用して同定した：1.）同一のクローンがアライメント中に少なくとも2回生じる、および2.）変異がアライメント中に少なくとも2回、好ましくは別個のクローンで生じる。これらの基準のうちの少なくとも1つを満たしたクローンは、改善された結合に起因して本発明者らのソーティングプロセスによって富化されたクローンであった。
少なくとも1つの親和性が改変されたドメインと共にCD80またはICOSLのECDを含有する免疫調節タンパク質を生成するために、以下のとおり設計されたタンパク質をコードするコーディング核酸分子を生成した：シグナルペプチド、続いてバリアント（変異体）ECD、続いて3つのアラニン（AAA）のリンカー、続いてSEQ ID NO:226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに対して変異N82Gを含有するヒトIgG1 Fc。その構築物は、システインと共有結合を形成することができる抗体軽鎖を含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、SEQ ID NO:226に示される野生型または未改変のFcと比較して、5位（C5S）にシステイン残基のセリン残基への置換を含有する。
加えて、以下の実施例8は、一緒に連結されFcに縮合された同定バリアントCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30分子由来の少なくとも2つの異なる親和性が改変されたドメインを含有するスタック構築物として生成されたさらなる免疫調節タンパク質を記載する。
実施例5
Fc融合物の発現および精製
実施例5は、バリアントECD CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30を含有するFc融合タンパク質のハイスループット発現および精製を記載する。
組換えバリアントFc融合タンパク質をExpi293発現系（Invitrogen, USA）で生産した。先の工程からの各プラスミドDNA 4μgをOpti-MEM（Invitrogen, USA）200μlに加え、同時に、ExpiFectamine 10.8μlを別のOpti-MEM 200μlに別々に加えた。5分後、プラスミドDNA 200μlをExpiFectamine 200μlと混合し、この混合物を細胞に加える前に追加で20分間さらにインキュベートした。1000万個のExpi293細胞を、10mlの滅菌円錐底ディープ24ウェル成長プレート（Thomson Instrument Company, USA）の別々のウェルのExpi293培地（Invitrogen, USA）容量3.4ml中に分注した。プレートを、湿度95％および8％CO2に設定された哺乳動物細胞培養インキュベーター内、120RPMで5日間振盪した。5日間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、培養上清を取り出した。
ハイスループット96ウェルタンパク質A精製キット（Catalog number 45202, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、上清からタンパク質を精製した。得られた溶出分画を、Zeba 96 well spin desalting plate（Catalog number 89807, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、PBSに緩衝液交換した。Nanodrop instrument（Thermo Fisher Scientific, USA）によって測定した280nmの吸光度を使用して、精製したタンパク質を定量し、そして、タンパク質5μgを変性および還元条件下のNUPAGEプレキャストポリアクリルアミドゲル（Life Technologies, USA）上にロードし、その後ゲル電気泳動することによってタンパク質純度を評価した。標準的なクマシー染色を使用してゲル中でタンパク質を可視化した。
実施例6
親和性成熟されたIgSFドメイン含有分子の結合および活性の評価
A．細胞が発現したカウンター構造に対する結合性
この実施例は、同族結合パートナーに対するCD80およびICOSLドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性および親和性を示すFc融合物結合研究を記載する。
同族結合パートナーを発現する細胞を生産するため、ヒトCD28、CTLA4、PD-L1、ICOS、およびB7-H6の各々についての全長哺乳動物表面発現構築物は、pcDNA3.1発現ベクター（Life Technologies）中で設計されており、これはGenscript, USAから供給された。上記のExpi293F一過性トランスフェクション系（Life Technologies, USA）を使用して結合研究を行った。実験に必要な細胞数を決定し、そして、製造業者の推奨プロトコールを使用して、適切な30mlスケールのトランスフェクションを実施した。CD28、CTLA-4、PD-L1、ICOS、B7-H6または偽の30mlトランスフェクション毎に、7500万個のExpi293F細胞を発現構築物DNA 30μgおよび希釈したExpiFectamine 293試薬1.5mlと48時間インキュベートし、その時点で染色用に細胞を収集した。
フローサイトメトリーによる染色のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照の200,000個の細胞を96ウェル丸底プレート中にプレーティングした。細胞をスピンダウンし、染色緩衝液（PBS（リン酸緩衝食塩水）、1％BSA（ウシ血清アルブミン）、および0.1％アジ化ナトリウム）中に20分間再懸濁して、非特異的結合をブロッキングした。その後、細胞を再度遠心分離し、これを、50μlの各候補CD80バリアントFc、ICOSLバリアントFc、またはスタックされたIgSFバリアントFc融合タンパク質の実験に応じて、100nM〜1nMのバリアント免疫調節タンパク質を含有する染色緩衝液に再懸濁した。一次染色を氷上で45分間実施した後、染色緩衝液中で細胞を2回洗浄した。PEコンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を染色緩衝液50μl中1:150に希釈し、細胞に加えて氷上でさらに30分間インキュベートした。二次抗体を2回洗い流し、細胞を4％ホルムアルデヒド／PBS中で固定し、そして、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson, USA）で試料を分析した。
トランスフェクタントおよび陰性親系統毎に、Cell Quest Pro software（Becton Dickinson, USA）で平均蛍光強度（MFI）を計算した。
B．生物活性の特性決定
この実施例は、ヒト初代T細胞インビトロアッセイにおけるFc融合バリアントタンパク質の生物活性の特性決定をさらに記載する。
1．混合リンパ球反応（MLR）
可溶性rICOSL.FcまたはrCD80.Fcの生物活性をヒト混合リンパ球反応（MLR）で試験した。PBMC（BenTech Bio, USA）から単離された単球をEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）中500U/ml rIL-4（R&D Systems, USA）および250U/ml rGM-CSF（R&D Systems, USA）とインビトロで7日間培養することによって、ヒト初代樹状細胞（DC）を生成した。10,000個の成熟DCおよび100,000個の精製同種CD4+T細胞（BenTech Bio, USA）を、96ウェル丸底プレート内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地中でICOSLまたはCD80バリアントFc融合タンパク質および対照と共培養した。5日目に、Human IFN-gamma Duoset ELISA kit（R&D Systems, USA）を使用して培養上清中のIFN-γ分泌を分析した。VMax ELISA Microplate Reader（Molecular Devices, USA）によって光学密度を測定し、IFN-gamma Duo-set kit（R&D Systems, USA）に含まれる用量設定したrIFN-γ標準に対して定量した。
2．抗CD3同時固定アッセイ
ICOSLおよびCD80 Fc融合バリアントの共刺激生物活性を抗CD3同時固定アッセイで決定した。1nMまたは4nMのマウス抗ヒトCD3（OKT3, Biolegends, USA）を、PBS中1nM〜80nM rICOSL.FcまたはrCD80.Fcバリアントタンパク質で希釈した。この混合物を、組織培養処理平底96ウェルプレート（Corning, USA）に一晩加え、プレートのウェルへの刺激タンパク質の結合を促進した。翌日、未結合のタンパク質をプレートから洗い出し、100,000個の精製ヒトpan T細胞（BenTech Bio, US）またはヒトT細胞クローンBC3（Astarte Biologics, USA）を、各ウェル内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）に加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
C．結果
例示的な試験バリアントについての結合および活性研究の結果を表6〜8に示す。特に、表6は、それぞれの同族構造CD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表7は、それぞれの同族構造PD-L1に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表8は、それぞれの同族構造ICOSおよびCD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたICOSLのECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表毎に、例示的なアミノ酸置換は、以下のとおり、それぞれの参照未改変ECD配列に対応するアミノ酸位置番号によって表示される。例えば、表6および7中の参照未改変ECD配列は、SEQ ID NO:28に示される未改変のCD80 ECD配列であり、そして、表8中の参照未改変ECD配列は、未改変ICOSL ECD配列（SEQ ID NO:32）である。アミノ酸位置は中央に示され、ここで、対応する未改変（例えば、野生型）のアミノ酸は番号の前に列挙され、そして、同定されたバリアントアミノ酸置換は、番号の後に列挙される。列2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントECDについてのSEQ ID NO識別子を示す。
また、同族カウンター構造リガンドを発現するように改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現するカウンター構造リガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、i）抗CD3と同時固定された表示のバリアントECD-Fc融合分子またはii）MLRアッセイ中の表示のバリアントECD-Fc融合分子のいずれかで生成された、培養上清中のIFN-γの計算値（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントFc融合分子の機能活性も示される。また、表は、両方の機能性アッセイにおいて対応する未改変のECD-Fcと比較した、各バリアントECD-Fcによって生産されたIFN-γの比も示す。
示されるとおり、選択は、少なくとも1つ、いくつかの場合では複数の同族カウンター構造リガンドに対して向上した結合性を示すように親和性が改変された多数のCD80またはICOSL IgSFドメインバリアントの同定をもたらした。加えて、その結果は、バリアント分子の親和性改変がまた、当該分子のフォーマットに応じて免疫活性を向上および低下させる改善された活性を示したことを示した。例えば、リガンドの同時固定は、おそらく、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fc分子と比較して、細胞との多価相互作用を提供してクラスター化するか、またはアゴニスト活性を有利にするアビディティを向上させて、T細胞活性化を向上させる。しかしながら、分子が溶液で二価Fc分子として提供されるとき、同じIgSFドメインバリアントは、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fv分子と比較して、T細胞活性化を低下させるアンタゴニスト活性を示した。
（表６）CD28に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
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（表７）PD-L1に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
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（表８）CD28またはICOSに対して選択されたICOSLバリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
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*:親に対する比率は、WT ICOSLについての346pg/ml IFN-γを使用して計算された
実施例7
リガンド結合競合アッセイ
実施例6に示されるとおり、いくつかのCD80バリアント分子は、CD28およびPD-L1の一方または両方に対する改善された結合性を示した。リガンドCD28およびPD-L1へのCD80の結合活性をさらに評価するため、この実施例は、CD28およびPD-L1の両方に結合する例示的なCD80バリアントの非競合性を評価するリガンド競合アッセイを記載する。
CD28およびPD-L1に同時に結合するCD80の能力を評価するために、プレートに結合したCD80バリアントA91G ECD-Fcを組み込んだELISAベースの結合アッセイを設定した。PBS中の100nMヒト組換えCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質でMaxisorp 96ウェルELISAプレート（Nunc, USA）を一晩コートした。翌日、未結合タンパク質を洗い流し、そして、1％ウシ血清アルブミン（Millipore, USA）/PBSを用いて室温で1時間プレートをブロッキングした。このブロッキング試薬をPBS/0.05％Tweenで3回洗い流した。洗浄毎にプラットフォーム振盪器上での2分間のインキュベーションを含めた。
競合アッセイの一方のアームでは、CD80をCD28とインキュベートした後、次いで、他の公知のCD80リガンドカウンター構造PD-L1もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下でCD28結合CD80を競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトCD28 Fc融合タンパク質（rCD28.Fc；R&D Systems）を、ウェル内、25μl容量中10nMで開始して、1:2希釈で8点希釈することで用量漸増した。ビオチン化rCD28.Fcを加えた直後に、未標識競合結合剤の組換えヒトPD-L1単量体hisタグ化タンパク質、組換えヒトCTLA-4単量体hisタグ化タンパク質、または陰性対照ヒト組換えPD-L2 Fc融合タンパク質（R&D Systems）を、それぞれ25μl容量中2000/1000/500nMで、最終容量50μlでウェルに加えた。これらのタンパク質を一緒に1時間インキュベートした後、上記のとおりの3回の洗浄工程を繰り返した。
洗浄後、1ウェル当たり2.5ngのHRPコンジュゲートストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch, USA）を1％BSA/PBS中で希釈してウェルに加え、結合したビオチン化rCD28.Fcを検出した。1時間のインキュベーション後、ウェルを再度上記のとおり3回洗浄した。シグナルを検出するために、洗浄に続いてTMB基質（Pierce, USA）50μlをウェルに加え、7分間インキュベートした後に2M硫酸停止溶液50ulを加えた。光学密度をEmax Plus microplate reader（Molecular Devices, USA）で決定した。光学密度値をPrism（Graphpad, USA）でグラフ化した。
結果を図1Aに示す。結果は、rCD28.Fcの用量漸増に伴うCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質へのビオチン化rCD28.Fcの低下した結合性を示した。rCD28.Fc結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するCD28結合の減少はなかった（黒三角）。対照的に、競合対照タンパク質rCTLA-4は、CD28.Fcとインキュベートしたとき、予想のとおりCD80に対して減少したCD28結合をもたらした（x線）。組換えPD-L1をCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのCD28結合の減少は観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。CD80へのCD28競合アッセイにおいて使用された組換えPD-L1タンパク質の結合は、ビオチン化PD-L1を非ビオチン化rCD28.Fcの存在下でインキュベートすることによって確認された（四角）。
また、CD80をPD-L1とインキュベートした逆競合を設定した後、次いで、PD-L1結合CD80を、他の公知のCD80リガンドカウンター構造CD28もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下での競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質を組換えCD80バリアントを含有するウェルに用量漸増することによってアッセイを実施した。このリガンドとは結合が弱いので、用量漸増を、25μL中5000nMで開始して同様の8点の1:2希釈を行った。結合を検出するためにrPD-L1-hisを使用したとき、競合リガンドヒトrCD28.Fc、ヒトrCTLA-4.Fc、またはヒトrPD-L2.Fc対照を、総容量50μlで25μl中2.5nMの最終濃度で加えた。その後の洗浄、検出、およびOD測定は、上記と同じであった。
結果を図1Bに示す。用量漸増したPD-L1-his結合単独は、プレート上に固定されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子にPD-L1が結合したことを確認した（四角）。PD-L1-his結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するPD-L1結合の減少はなかった（三角）。CD28競合対照タンパク質rCTLA-4は、PD-L1-hisとインキュベートしたとき、CTLA-4はCD28に対して競合的であるにもかかわらず、CD80に対して減少したPD-L1結合をもたらさなかった（x線）。この結果は、CD80結合に対してのCD28とPD-L1との間の競合の欠如をさらに実証した。最後に、PD-L1-hisをCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのPD-L1結合の減少が観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。
したがって、結果は、CTLA-4はCD80へのCD28の結合に対して競合したが、PD-L1または陰性対照PD-L2は競合しなかったこと（図1A）、およびCD28、CTLA-4、およびPD-L2は、CD80へのPD-L1の結合に対して競合しなかったこと（図1B）を示した。したがって、これらの結果は、CD28およびPD-L1がCD80の非競合結合剤であること、および、リガンドがELISAで検出されるかに関係なくこの非競合的結合を実証できることを実証した。
実施例8
異なる親和性が改変されたドメインを含有するスタックされた分子の生成および評価
1つまたは複数のカウンター構造リガンドについて親和性が改変された上記の選択されたバリアント分子を使用して、2つ以上の親和性が改変されたIgSFドメインを含有する「スタック」分子（すなわち、II型免疫調節タンパク質）を生成した。Gibson assembly kit（New England Biolabs）を使用した標準的なGibsonアセンブリによってFcへのその融合を可能にするフォーマットで該スタックをコードする遺伝子ブロック（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）としてスタック構築物を得た。
以下のとおり設計されたタンパク質をコードする全てのスタックのコーディング核酸分子を生成した：シグナルペプチド、続いて関心対象の第一のバリアントIgV、続いて3つのGGGGS（G4S）モチーフから構成される15アミノ酸リンカー（SEQ ID NO:228）、続いて関心対象の第二のIgV、続いて2つのGGGGSリンカー（SEQ ID NO: 229）、続いて3つのアラニン（AAA）、続いて上記のとおりのヒトIgG1 Fc。各スタックにおけるIgVドメインの正確なホールディングの可能性を最大限にするため、第一のIgVの前に、通常野生型タンパク質で生じる全ての残基をこのIgVとシグナルペプチド（リーディング配列）との間に置く。同様に、第一のIgVの後に、通常該IgVを野生型タンパク質中で次のIgドメイン（典型的には、IgCドメイン）またはこのような第二のIgVドメインが存在しない場合は該IgVを膜貫通ドメイン（トレーリング配列）に接続する残基のいずれかに接続する全ての残基が続く。両方のIgVドメインが同じ親タンパク質由来であった（例えば、別のCD80 IgVでスタックされたCD80 IgV）場合は両方の間のリンカーが繰り返し存在しなかったこと以外は、同じ設計原理を第二のIgVドメインに適用した。
表9は、例示的なスタックされた構築物の設計を示す。表9に示される例示的なスタック分子は、表示のとおりのIgVドメインおよびさらに上記のとおりのリーディングまたはトレーリング配列を含有する。表には、以下の成分が次の順序で存在する：シグナルペプチド（SP; SEQ ID NO:225）、IgVドメイン1（IgV1）、トレーリング配列1（TS1）、リンカー1（LR1; SEQ ID NO:228）、IgVドメイン2（IgV2）、トレーリング配列2（TS2）、リンカー2（LR2; SEQ ID NO:230）およびFcドメイン（C5S/N82Gアミノ酸置換を含有するSEQ ID NO:226）。いくつかの場合では、リーディング配列1（LS1）は、シグナルペプチドとIgV1の間に存在し、いくつかの場合では、リーディング配列2（LS2）は、リンカーとIgV2の間に存在する。
（表９）例示的なスタックされた構築物の成分のアミノ酸配列（SEQ ID NO）
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少なくとも1つの親和性が改変されたIgVドメインを含有するCD80、CD86、ICOSLまたはNkp30由来のバリアントIgVドメインの種々の組み合わせを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のハイスループット発現および精製を、実施例5に記載のとおり行った。また、バリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のそれぞれのカウンター構造に対する結合性および抗CD3同時固定アッセイによる機能活性を実施例6に記載されるとおり評価した。例えば、スタックされたIgSF Fc融合タンパク質の共刺激生物活性を上記と同様の固定化抗CD3アッセイで決定した。この場合、4nMの抗CD3（OKT3, Biolegend, USA）を、組織培養処理96ウェルプレート（Corning, USA）上で4nM〜120nMのヒトrB7-H6.Fc（R&D Systems, USA）またはヒトrPD-L1.Fc（R&D Systems, USA）と一晩同時固定した。翌日、未結合タンパク質をPBSで洗い出し、そして、100,000個の精製したpan T細胞を各ウェルのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）100ulに加えた。その後、スタックされたIgSFドメインを100ulの容量中8nM〜40nMの濃度で合計200ulの容量で加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
結果を表10〜14に示す。具体的には、表10は、NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表11は、NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFv融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表12は、バリアントCD80 IgVドメインおよびCD80、CD86またはICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表13は、2つのバリアントCD80 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表14は、バリアントCD80またはCD86 IgVドメインおよびバリアントICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結果を示す。
表10〜14の各々について、列1は、アミノ末端（N末端）ドメインから始まり、続いてC末端ヒトIgG1 Fcドメインの前に中央のWTまたは親和性が改変されたドメインが位置する、スタックされた、親和性が改変されたまたは野生型（WT）ドメインの構造的構成および配向を示す。列2は、それぞれの「スタック」分子中に含有される各IgVドメインの配列についてのSEQ ID NO識別子を示す。列3は結合パートナーを示しており、当該結合パートナーに対して、列1に表示されている親和性が改変されたスタックされたドメインが選択された。
また、種々のカウンター構造リガンドを発現するように改変された細胞への各スタック分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現するカウンター構造リガンドへのアミノ酸置換を含有しない未改変IgVドメインを含有する対応するスタック分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、溶液の表示のバリアントスタック分子および実施例6に記載されるとおりの抗CD3と同時固定された適切なリガンドで生成された培養上清中のIFN-γの計算レベル（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントスタック分子の機能活性も示される。また、表は、同時固定アッセイにおいて対応する未改変のスタック分子と比較した、各バリアントスタック分子によって生産されたIFN-γの比も示す。
示されるとおり、結果は、それぞれの未改変（例えば、野生型）のIgVドメインを含有する対応するスタック分子と比較して、少なくとも1つの同族カウンター構造リガンドに対して親和性が改変された向上した結合活性を示した少なくとも1つのバリアントIgSFドメインを含有するスタック分子を生成することが可能であったことを示した。いくつかの場合では、分子中の両方のバリアントIgSFドメインの一方または組み合わせのいずれかに由来するスタック分子は、複数の同族カウンター構造リガンドに対して向上した結合性を示した。結果はまた、スタックされた分子中のIgVドメインの順序が、いくつかの場合では、改善された結合活性の程度も変化させうることを示した。いくつかの場合では、標的化同時固定アッセイで評価したときに機能的T細胞活性もまた変化した。
（表１０）NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2021090441
（表１１）NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
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（表１２）CD80 IgVドメインおよびCD80、CD86、またはICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
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（表１３）2つのCD80 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
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（表１４）CD80またはCD86 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
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本明細書において本発明の好ましい態様が示されかつ記載されているが、このような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載される本発明の態様の種々の代替物を、本発明を実施する際に用いてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、ならびに、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構成物がそれによって網羅されることが意図される。

Claims (136)

  1. 野生型免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、
    該少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、該野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有し；かつ
    該少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、該少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する、
    前記免疫調節タンパク質。
  2. 前記少なくとも2つの同族結合パートナーが、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である、請求項1記載の免疫調節タンパク質。
  3. 前記細胞表面分子種が、シス配置またはトランス配置で発現する、請求項2記載の免疫調節タンパク質。
  4. 前記哺乳動物細胞が、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、前記細胞表面分子種の各々が、該ISを形成する該2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する、請求項2または請求項3記載の免疫調節タンパク質。
  5. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つがリンパ球である、請求項2〜4のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  6. 前記リンパ球がNK細胞またはT細胞である、請求項5記載の免疫調節タンパク質。
  7. 前記親和性が改変されたIgSFドメインの結合が、前記リンパ球の免疫活性を調節する、請求項5〜6のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  8. 前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して向上した免疫活性をもたらすことができる、請求項7記載の免疫調節タンパク質。
  9. 前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して低下した免疫活性をもたらすことができる、請求項7記載の免疫調節タンパク質。
  10. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つが腫瘍細胞である、請求項2〜9のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  11. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項2〜10のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  12. 前記親和性が改変されたIgSFドメインが、前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる、請求項4〜11のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  13. 前記野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項1〜12のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  14. 前記野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、請求項1〜13のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  15. 前記野生型IgSFドメインがヒトIgSFメンバーである、請求項1〜14のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  16. 前記野生型IgSFドメインが、IgVドメイン、IgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である、請求項1〜15のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  17. 前記親和性が改変されたIgSFドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性が改変されたIgVドメイン、親和性が改変されたIgC1ドメイン、もしくは親和性が改変されたIgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である、請求項1〜16のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  18. 少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  19. 前記少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が、同じ野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、請求項18記載の免疫調節タンパク質。
  20. 前記少なくとも2つの親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項19記載の免疫調節タンパク質。
  21. 前記異なる野生型IgSFドメインが、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項20記載の免疫調節タンパク質。
  22. 親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインを1つだけ含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  23. 前記親和性が改変されたIgSFが、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  24. SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む第二の親和性が改変されたIgSFをさらに含む、請求項23記載の免疫調節タンパク質。
  25. 前記野生型IgSFドメインがB7ファミリーのメンバーである、請求項1〜24のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  26. 前記野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、またはICOSLGのドメインである、請求項1〜25のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  27. 前記野生型IgSFドメインがCD80のドメインである、請求項1〜26のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  28. 野生型CD80免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの親和性が改変されたCD80 IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質であって、該少なくとも1つの親和性が改変されたCD80 IgSFドメインが、該野生型CD80 IgSFドメインと比較して、少なくとも2つの同族結合パートナーに対する向上した結合性を有する、前記免疫調節タンパク質。
  29. 前記同族結合パートナーがCD28およびPD-L1である、請求項27または請求項28記載の免疫調節タンパク質。
  30. 前記野生型IgSFドメインがIgVドメインであり、かつ／または、前記親和性が改変されたCD80ドメインが、親和性が改変されたIgVドメインである、請求項27〜29のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  31. 前記親和性が改変されたドメインが、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列中に含有される野生型CD80ドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む、請求項27〜30のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  32. 前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、前記野生型IgSFドメイン中に1以上20以下のアミノ酸置換を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  33. 前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、前記野生型IgSFドメイン中に1以上10以下のアミノ酸置換を含む、請求項1〜32のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  34. 前記少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインが、前記野生型IgSFドメイン中に1以上5以下のアミノ酸置換を含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  35. 前記親和性が改変されたIgSFドメインが、前記少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対するその野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する、請求項1〜34のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  36. 親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  37. 可溶性である、請求項1〜36のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  38. 膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを欠いている、請求項1〜37のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  39. 親和性が改変されたIgSFドメインを含む細胞外ドメイン（ECD）またはその特異的結合断片のみを含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  40. グリコシル化またはペグ化されている、請求項1〜39のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  41. 多量体化ドメインに連結されている、請求項1〜40のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  42. エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている、請求項1〜41のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  43. 前記Fcドメインが、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである、請求項42記載の免疫調節タンパク質。
  44. 前記Fcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものであるか；または
    前記バリアントFcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、
    請求項39〜41のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  45. 前記Fcドメインまたはそのバリアントが、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項42〜44のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  46. リンカーを介して間接的に連結されている、請求項38〜41のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  47. 二量体である、請求項41〜46のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  48. リポソーム膜に結合されている、請求項1〜47のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  49. 少なくとも2つの非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、
    改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーに対する変化した結合性を示すように親和性が改変されており；かつ
    該少なくとも2つの改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が独立して、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する、
    前記免疫調節タンパク質。
  50. 前記少なくとも2つの非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が、親和性が改変されたIgSFドメインであり、ここで、第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインが第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、かつ、第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインが第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項49記載の免疫調節タンパク質。
  51. 前記第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインが、第一の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示し；かつ
    前記第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインが、第二の野生型IgSFドメインと比較して、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する変化した結合性を示す、
    請求項50記載の免疫調節タンパク質。
  52. 前記異なる同族結合パートナーが、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である、請求項49〜51のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  53. 前記異なる細胞表面分子種が、シス配置またはトランス配置で発現する、請求項52記載の免疫調節タンパク質。
  54. 前記哺乳動物細胞が、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、かつ、前記異なる細胞表面分子種が、該ISを形成する該2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する、請求項52または請求項53記載の免疫調節タンパク質。
  55. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つがリンパ球である、請求項52〜54のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  56. 前記リンパ球がNK細胞またはT細胞である、請求項55記載の免疫調節タンパク質。
  57. 前記細胞への免疫調節タンパク質の結合が、前記リンパ球の免疫活性を調節する、請求項55または請求項56記載の免疫調節タンパク質。
  58. 前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して向上した免疫活性をもたらすことができる、請求項57記載の免疫調節タンパク質。
  59. 前記野生型IgSFドメインを含む野生型タンパク質と比較して低下した免疫活性をもたらすことができる、請求項57記載の免疫調節タンパク質。
  60. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つが腫瘍細胞である、請求項52〜59のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  61. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項52〜60のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  62. 前記ISを形成する前記2つの哺乳動物細胞に特異的に結合することができる、請求項54〜61のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  63. 第一および第二の改変されたIgSFドメインの各々が、異なる野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項49〜62のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  64. 前記異なる野生型IgSFドメインが、異なるIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項63記載の免疫調節タンパク質。
  65. 第一および第二の改変されたIgSFドメインが、非野生型の組み合わせである、請求項49〜64のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  66. 第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、シグナル制御タンパク質（Signal-Regulatory Protein：SIRP）ファミリー、骨髄細胞上に発現される誘発受容体様（Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells Like：TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule：CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（Sialic Acid Binding Ig-Like Lectin：SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセット免疫グロブリンドメイン含有（V-set and Immunoglobulin Domain Containing：VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（V-set transmembrane Domain：VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（Major Histocompatibility Complex：MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocytic activation molecule：SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（Leukocyte immunoglobulin-like receptor：LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（Poliovirus receptor related：PVR）ファミリー、細胞傷害誘発受容体（Natural cytotoxicity triggering receptor：NCR）ファミリー、T細胞免疫グロブリンムチン（T cell immunoglobulin and mucin：TIM）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor：KIR）ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項49〜65のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  67. 第一の野生型IgSFドメインおよび第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、請求項49〜66のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  68. 第一の改変されたIgSFドメインおよび第二の改変されたIgSFドメインの各々が個別に、SEQ ID NO:1〜27のいずれかに示されるアミノ酸配列中に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片と少なくとも85％の配列同一性を含む、請求項49〜67のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  69. 第一および第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、B7ファミリーのメンバーである、請求項49〜68のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  70. 第一および第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、CD80、CD86、またはICOSLGに由来する、請求項69記載の免疫調節タンパク質。
  71. 第一または第二の野生型IgSFドメインがB7ファミリーのメンバーに由来し、かつ、第一または第二の野生型IgSFドメインの他方が別のIgSFファミリーに由来する、請求項49〜68のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  72. 第一および第二の野生型IgSFドメインが、ICOSLGおよびNKp30に由来する、請求項49〜68および71のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  73. 第一および第二の野生型IgSFドメインが、CD80およびNKp30に由来する、請求項49〜68および71のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  74. 第一および第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、ヒトIgSFメンバーである、請求項49〜73のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  75. 第一および第二の野生型IgSFドメインの各々が個別に、IgVドメイン、およびIgC1ドメイン、IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合である、請求項49〜74のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  76. 第一の改変された非免疫グロブリンドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンドメインの各々が個別に、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、改変IgVドメイン、改変IgC1ドメイン、もしくは改変IgC2ドメイン、またはそれらの特異的結合断片である、請求項49〜75のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  77. 第一の改変された非免疫グロブリンドメインまたは第二の改変された非免疫グロブリンドメインのうちの少なくとも1つが、改変IgVドメインである、請求項49〜76のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  78. 第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が個別に、1以上20以下のアミノ酸置換を含む、請求項49〜77のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  79. 第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が個別に、1以上10以下のアミノ酸置換を含む、請求項49〜78のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  80. 第一の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインおよび第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が個別に、1以上5以下のアミノ酸置換を含む、請求項49〜79のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  81. 第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の10％〜90％を有する、請求項49〜80のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  82. 第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する、請求項49〜81のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  83. 第一および第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が個別に、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する野生型IgSFドメインの結合親和性の少なくとも120％を有する、請求項49〜80および82のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  84. 可溶性である、請求項49〜83のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  85. グリコシル化またはペグ化されている、請求項49〜84のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  86. 多量体化ドメインに連結されている、請求項49〜85のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  87. エフェクター機能が低下したFcドメインまたはそのバリアントに連結されている、請求項49〜86のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  88. 前記Fcドメインが、エフェクター機能が低下した、IgG1ドメイン、IgG2ドメイン、またはそれらのバリアントである、請求項87記載の免疫調節タンパク質。
  89. 前記Fcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものであるか；または
    前記バリアントFcドメインが、哺乳動物のもの、任意でヒトのものである未改変のFcドメインと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、
    請求項87または請求項88記載の免疫調節タンパク質。
  90. 前記Fcドメインまたはそのバリアントが、SEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:226もしくはSEQ ID NO:227と少なくとも85％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項87〜89のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  91. バリアントCD80ポリペプチドが、リンカーを介して間接的に連結されている、請求項86〜90のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  92. 二量体である、請求項86〜91のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  93. 第一または第二の改変された非免疫グロブリンIgSFドメインと同じまたは異なる1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインをさらに含む、請求項49〜92のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  94. 前記1つまたは複数の追加の非免疫グロブリンIgSFドメインが、親和性が改変されたIgSFドメインである、請求項93記載の免疫調節タンパク質。
  95. リポソーム膜に結合されている、請求項49〜94のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質。
  96. 請求項1〜95のいずれか一項記載の免疫調節ポリペプチドをコードする、核酸分子。
  97. 合成核酸である、請求項96記載の核酸分子。
  98. cDNAである、請求項96または請求項97記載の核酸分子。
  99. 請求項96〜98のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
  100. 発現ベクターである、請求項99記載のベクター。
  101. 請求項99または請求項100記載のベクターを含む、細胞。
  102. 真核細胞または原核細胞である、請求項101記載の細胞。
  103. 免疫調節タンパク質を生産する方法であって、請求項96〜98のいずれか一項記載の核酸分子または請求項99もしくは請求項100記載のベクターを、細胞において該タンパク質を発現する条件下で宿主細胞に導入する工程を含む、前記方法。
  104. 前記細胞から前記免疫調節タンパク質を単離または精製する工程をさらに含む、請求項103記載の方法。
  105. 請求項1〜95のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質を含む、薬学的組成物。
  106. 薬学的に許容し得る賦形剤を含む、請求項105記載の薬学的組成物。
  107. 滅菌されている、請求項105または請求項106記載の薬学的組成物。
  108. バイアル中に請求項105〜107のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む、製造品。
  109. 前記バイアルが密閉されている、請求項108記載の製造品。
  110. 請求項105〜107のいずれか一項記載の薬学的組成物、および使用説明書を含む、キット。
  111. 請求項108または請求項109記載の製造品、および使用説明書を含む、キット。
  112. 対象における免疫応答を調節する方法であって、該対象に治療有効量の請求項1〜95のいずれか一項記載の免疫調節タンパク質を投与する工程を含む、前記方法。
  113. 前記免疫応答の調節により前記対象における疾患または状態が治療される、請求項112記載の方法。
  114. 前記免疫応答を向上させる、請求項112または請求項113記載の方法。
  115. 前記疾患または状態が、腫瘍またはがんである、請求項114記載の方法。
  116. 前記疾患または状態が、黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍から選択される、請求項114または請求項115記載の方法。
  117. 前記免疫応答を低下させる、請求項112または請求項113記載の方法。
  118. 前記疾患または状態が、炎症性疾患または状態である、請求項117記載の方法。
  119. 前記疾患または状態が、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬から選択される、請求項117または請求項118記載の方法。
  120. 以下の工程を含む、親和性が改変された免疫調節タンパク質を同定する方法：
    a）少なくとも1つの改変された非免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインまたはその特異的結合断片を含む改変されたタンパク質と、少なくとも2つの同族結合パートナーとを、該タンパク質と該少なくとも2つの同族結合パートナーとの結合をもたらすことができる条件下で接触させる工程であって、該少なくとも1つの改変されたIgSFドメインが、野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、工程；
    b）該野生型IgSFドメインを含むタンパク質と比較して該2つの同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する向上した結合性を有する該改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定する工程；および
    c）該少なくとも2つの同族結合パートナーに非競合的に結合する該改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を選択する工程であって、それによって、該親和性が改変された免疫調節タンパク質が同定される、工程。
  121. 工程b）が、前記野生型ドメインを含むタンパク質と比較して前記少なくとも2つの同族結合パートナーの各々に対する向上した結合性を有する改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を同定することを含む、請求項120記載の方法。
  122. 工程a）の前に、前記野生型IgSFドメインに1つまたは複数のアミノ酸置換を導入し、それによって、前記改変されたIgSFドメインを含む改変されたタンパク質を生成する、請求項120または請求項121記載の方法。
  123. 前記改変されたタンパク質が、少なくとも2つの改変されたIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片を含み、ここで、第一のIgSFドメインが、第一の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、かつ、第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインが、第二の野生型IgSFドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項120〜122のいずれか一項記載の方法。
  124. 前記第一および第二の親和性が改変された非免疫グロブリンIgSFドメインの各々が、少なくとも1つの異なる同族結合パートナーに特異的に結合する、請求項123記載の方法。
  125. 前記改変されたタンパク質を選択する工程の前に、工程b）で同定された2つ以上の改変されたIgSFドメインまたはそれらの特異的結合断片を組み合わせて、2つ以上の異なる改変されたIgSFドメインを含有するタンパク質を生成する工程をさらに含む、請求項120〜124のいずれか一項記載の方法。
  126. 前記親和性が改変されたタンパク質が、前記2つの同族結合パートナーに共に同時に結合することができる、請求項120〜125のいずれか一項記載の方法。
  127. 前記少なくとも2つの同族結合パートナーが、哺乳動物細胞の表面に発現する細胞表面分子種である、請求項120〜126のいずれか一項記載の方法。
  128. 前記細胞表面分子種が、シス配置またはトランス配置で発現する、請求項127記載の方法。
  129. 前記哺乳動物細胞が、免疫シナプス（IS）を形成する2つの哺乳動物細胞のうちの1つであり、かつ、前記細胞表面分子種の各々が、該ISを形成する該2つの哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つの表面に発現する、請求項127または請求項128記載の方法。
  130. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つがリンパ球である、請求項127〜129のいずれか一項記載の方法。
  131. 前記リンパ球がNK細胞またはT細胞である、請求項127〜130のいずれか一項記載の方法。
  132. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つが腫瘍細胞である、請求項127〜131のいずれか一項記載の方法。
  133. 前記哺乳動物細胞のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞である、請求項127〜132のいずれか一項記載の方法。
  134. 前記2つ以上の同族結合パートナーが、独立して、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNkp30から選択されるIgSFメンバーのリガンドである、請求項127〜133のいずれか一項記載の方法。
  135. 前記2つ以上の同族結合パートナーが独立して、B7ファミリーメンバーのリガンドである、請求項127〜134のいずれか一項記載の方法。
  136. 前記2つ以上の同族結合パートナーが、CD28、CTLA-4、ICOS、またはPD-L1のうちの2つ以上から選択される、請求項127〜135のいずれか一項記載の方法。
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