ES2851474T3 - Polipéptidos de fusión B7-H1 para su uso en el tratamiento y prevención del fallo orgánico - Google Patents

Polipéptidos de fusión B7-H1 para su uso en el tratamiento y prevención del fallo orgánico Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención del fallo de órgano en un sujeto que padece sepsis, dicho polipéptido de fusión comprende al menos (i) una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y (ii) una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo, en el que dicha porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o variante del mismo se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 5; (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 6; (c) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 y que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de (a) o (b), y (d) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con (a) o (b) que comprende al menos uno de los siguientes intercambios de aminoácidos L27A, S34Y, D49S, Y56S, E58S, K62S, H69F, E72S, K75S, K89S, A98F, Q100S, R113Y, y S117Y.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de fusión B7-H1 para su uso en el tratamiento y prevención del fallo orgánico
La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención del fallo orgánico en un sujeto que padece sepsis, dicho polipéptido de fusión comprende al menos (i) una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y (ii) una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo. Además, también se incluye en la invención un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención del fallo orgánico en un sujeto que padece sepsis.
La sepsis es una enfermedad potencialmente mortal que puede ocurrir cuando todo el cuerpo reacciona a una infección. A pesar de una intensa investigación, la sepsis sigue siendo la tercera causa principal de mortalidad en las unidades de cuidados intensivos (Balk, 2004; Dellinger et al., 2008; Kaukonen et al., 2014; Vincent et al., 2014). Fisiopatológicamente, durante la progresión de la sepsis hay una fase hiperinflamatoria inicial que provoca el inicio de una etapa hipoinflamatoria, que ocurre en parte en paralelo (Angus and van der Poll, 2013; Munford y Pugin, 2001; Vincent et al., 2013).
Los enfoques terapéuticos recientes se centran principalmente en el tratamiento de la respuesta hiperinflamatoria para limitar la liberación de mediadores proinflamatorios, bloquear su función o eliminarlos de la circulación. Uno de los candidatos más prometedores, cuya inhibición demostró mejorar significativamente la supervivencia a la sepsis en un modelo de roedor, fue el TNFa (Márquez-Velasco et al., 2006). Usando anticuerpos neutralizantes, este enfoque se tradujo en la situación humana, pero no logró mejorar la supervivencia a la sepsis (Clark et al., 1998; Reinbart et al., 2001). Sin embargo, con este enfoque, la hiperinflamación es limitada y la mayoría de los pacientes sobreviven a esta fase. Debido a que el bloqueo de la respuesta inmune proinflamatoria reduce la capacidad del huésped para combatir y controlar las infecciones primarias y secundarias, este enfoque de terapia finalmente no logró mejorar significativamente la supervivencia de la sepsis, pero causó o potenció la fase hipoinflamatoria. Esta inmunosupresión a menudo provoca el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS) y la muerte del paciente (Otto et al., 2011; Torgersen et al., 2009).
También se han aplicado enfoques de tratamiento para rescatar al paciente durante la parálisis inmunitaria. Teniendo en cuenta que los monocitos están desactivados (Docke et al., 1997; Pangault et al., 2006), el tratamiento con GM-CSF restauró la función de los monocitos durante la sepsis (Meisel et al., 2009). En el modelo de ratón, se ha demostrado que la antagonización del receptor nuclear activado por el proliferador de peroxisomas y (PPARy) evita el agotamiento de las células T (Schmidt et al., 2011), una característica de la parálisis inmunitaria asociada con la fase hiperinflamatoria, que se correlaciona con mortalidad por sepsis (Hotchkiss et al., 2006; Wesche-Soldato et al., 2007b). Debido al origen multicausal de la sepsis, las diversas comorbilidades preexistentes o las precondiciones genéticas de los pacientes, todavía es difícil lograr un tratamiento adecuado específico para el paciente (Hotchkiss and Karl, 2003; Hotchkiss y Opal, 2010).
En general, la gravedad de la enfermedad ya está muy avanzada cuando se diagnostica sepsis en el paciente y ya se ha producido daño hepático, un evento relativamente tardío durante la progresión de la sepsis. Durante la sepsis, el fallo orgánico, a menudo seguido de un síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), suele provocar la muerte del paciente. Por lo tanto, es obligatorio comprender los mecanismos que conducen al daño orgánico para mejorar las opciones de atención ya existentes o para establecer nuevos enfoques terapéuticos.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de tratamiento y/o prevención del fallo orgánico durante la sepsis.
El problema técnico que subyace a la presente invención puede verse como la provisión de medios y procedimientos para cumplir con las necesidades antes mencionadas. El problema técnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente memoria a continuación.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención de fallo orgánico en un sujeto que padece sepsis, dicho polipéptido de fusión comprende al menos (i) una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y (ii) una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo.
El término "polipéptido" como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que consta de varios, típicamente, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o al menos 60 aminoácidos que están unidos covalentemente entre sí por enlaces peptídicos. Las moléculas que constan de menos de 20 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos se consideran generalmente péptidos.
Un "polipéptido de fusión" de acuerdo con la presente invención se refiere a un polipéptido que está compuesto por al menos dos polipéptidos o péptidos. Por tanto, se entenderá que un polipéptido de fusión como se menciona en la presente memoria puede comprender dos, tres, cuatro, cinco o incluso más porciones de polipéptido o péptido. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, el polipéptido de fusión comprenderá al menos una primera y una segunda porción como se especifica en la presente memoria. Las porciones de polipéptido o péptido comprendidas en el polipéptido de fusión pueden unirse entre sí de forma permanente, típicamente mediante enlaces peptídicos, o de manera reversible, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro o enlace por afinidad en base a enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y/o fuerzas de van der Waals. El enlace permanente entre las porciones del polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención se puede lograr típicamente mediante fabricación recombinante. Para ello, un polinucleótido que codifica las dichas porciones se sintetiza químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante y se expresa en un sistema de expresión adecuado. Posteriormente, el polipéptido de fusión expresado se puede purificar del sistema de expresión. Se conocen en la técnica diversos sistemas de enlace por afinidad que comprenden un ligando y una porción receptora, de modo que la persona experimentada en la técnica puede utilizarlos para interpretar polipéptidos de fusión que comprenden las diferentes porciones de péptido o polipéptido enlazadas reversiblemente entre sí sin más preámbulos. Los ejemplos típicos de tales sistemas de enlace por afinidad son aquellos en base a anticuerpos/antígenos, estreptavidina/biotina, avidina/biotina y otros bien conocidos en la técnica.
El polipéptido de fusión aplicado de acuerdo con la presente invención comprenderá una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo. Preferiblemente, la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo se localiza en el extremo N en el polipéptido de fusión, mientras que la porción Fc de la inmunoglobulina se localiza en el extremo C.
El término "porción cristalizable (Fc) de fragmentos de una inmunoglobulina" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios Ch2 y Ch3 de un anticuerpo y que pueden obtenerse mediante escisión proteolítica de un anticuerpo usando, por ejemplo, papaína. Se conocen en la técnica diversas inmunoglobulinas de una variedad de especies diferentes. Estas inmunoglobulinas comprenden IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgW o IgY. De acuerdo con la presente invención, se prefieren entre las inmunoglobulinas, sin embargo, las que aparecen en mamíferos y, en particular, en humanos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. La porción Fc de un anticuerpo determina el efecto de clase. Dado que solo los dominios constantes de las cadenas pesadas forman la porción Fc de un anticuerpo, las clases de cadenas pesadas determinan los efectos de clase. Las posibles clases de cadenas pesadas en anticuerpos abarcan alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Estas clases de cadenas pesadas definen el isotipo. Los diferentes isotipos de anticuerpos tienen diferentes efectos de clase debido a sus respectivas porciones de Fc. Dichos efectos de clase mediados por Fc incluyen los que afectan a las células efectoras o moléculas efectoras, por ejemplo, opsonización, aglutinación, hemólisis, activación del complemento y desgranulación de mastocitos. Las secuencias de aminoácidos para los dominios Ch2 y Ch3 que forman las porciones Fc son bien conocidas en la técnica para diferentes isotipos de anticuerpos y la persona experimentada en la técnica puede proporcionarlas sin más preámbulos. La porción Fc a la que se hace referencia de acuerdo con la presente invención puede ser, preferiblemente, modificada postraduccionalmente y, más preferiblemente, glicosilada. Preferiblemente, dicha inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención es IgG y, más preferiblemente, IgG humana. Las secuencias de aminoácidos que codifican la IgG humana son bien conocidas en la técnica, así como las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican. Además, también es bien conocido qué aminoácidos corresponden a las porciones Fc en dichas secuencias de aminoácidos.
El término "porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano" se refiere a la porción extracelular de la proteína homóloga 1 de B7 humana también conocida como ligando de muerte programada 1 (PD-L1) o grupo de diferenciación 274 (CD274). La proteína B7-H1 es una proteína transmembrana de 40 kDa que se sabe que se enlaza al receptor PD-1 que se encuentra en las células T activadas. Se ha sugerido que el complejo B7-H1/PD-1 está implicado en el control de la proliferación de células T CD8+. Las secuencias de aminoácidos para la proteína B7-H1 humana son bien conocidas en la técnica.
Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos para B7-H1 humano que se usará de acuerdo con la presente invención está disponible públicamente bajo UniprotKB No: Q9NZQ7, se muestra en la SEQ ID NO: 4 o está codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3 o con el número de acceso de GenBank AF177937. La porción extracelular de dicho B7-H1 humano abarca los aminoácidos 19 a 239 de la secuencia disponible públicamente bajo UniprotKB No: Q9NZQ7, se muestra en la SEQ ID NO: 2, está codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1 o está codificado por los nucleótidos 55 a 717 de la secuencia bajo el número de acceso de GenBank AF177937.
Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos para B7-H1 murino que se usará de acuerdo con la presente invención está disponible públicamente bajo UniprotKB No: Q9EP73, se muestra en la SEQ ID NO: 8 o está codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 7 o bajo el número de acceso de GenBank NM_021893. La porción extracelular de dicho B7-H1 murino abarca los aminoácidos 19 a 239 de la secuencia disponible públicamente bajo UniprotKB No: Q9EP73, se muestra en la SEQ ID NO: 6, está codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 5 o está codificado por los nucleótidos 55 a 717 de la secuencia bajo el número de acceso de GenBank NM_021893.
Incluidas como porciones extracelulares del polipéptido B7-H1 humano de acuerdo con la presente invención se encuentran, preferiblemente, variantes de cualquiera de los dominios extracelulares específicos mencionados anteriormente. Una variante de este tipo, típicamente, se diferencia de las secuencias de aminoácidos específicas mencionadas anteriormente por al menos una sustitución, eliminación y/o adición de aminoácidos. No obstante, la variante de la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano aún podrá ejercer los efectos biológicos mediados por la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano y, en particular, permanecer capaz de enlazarse a PD-1. Dicha variante, preferiblemente, tendrá una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 6 o a una secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de ácido nucleico mostradas en la SEQ ID NO: 1 o 5. Puede evaluarse la identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos como se usa en la presente memoria determinando el número de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos en las que las secuencias están alineadas de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden. Puede calcularse utilizando técnicas publicadas o procedimientos codificados en programas informáticos como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores porcentuales de identidad se calculan, preferiblemente, sobre una ventana de comparación. Una ventana de comparación, preferiblemente, es la longitud de la secuencia completa de la secuencia más corta a alinear o al menos la mitad de dicha secuencia. La persona experimentada dispone de una serie de programas en base a una variedad de algoritmos para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencia, el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48: 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2: 482), que forman parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711). Los valores de identidad de secuencia enumerados anteriormente en porcentaje (%) deben determinarse, en otro aspecto de la invención, utilizando el programa GAP en toda la región de secuencia con la siguiente configuración: Peso de intervalo: 50, Peso de longitud: 3, coincidente promedio: 10,000 y no coincidente promedio: 0,000, que, a menos que se especifique lo contrario, siempre se utilizará como configuración estándar para alineaciones de secuencia.
También abarcadas por la invención como variantes de las porciones extracelulares específicas mencionadas anteriormente del polipéptido B7-H1 humano están aquellas que están codificadas por polinucleótidos que tienen una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con las secuencias de ácido nucleico que codifican las porciones extracelulares específicas antes mencionadas del polipéptido B7-H1 humano o murino bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación rigurosas como se usan en la presente memoria son aquellas que permiten identificar polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen esencialmente la misma función biológica que B7-H1. Preferiblemente, las condiciones de hibridación rigurosas de acuerdo con la presente invención son: hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 45 ° C, seguido de una o más etapas de lavado en 0,2x SSC, SDS al 0,1 % a una temperatura entre 50 ° C hasta 65 ° C. La persona experimentada sabe que estas condiciones de hibridación difieren según el tipo de ácido nucleico y, por ejemplo, cuando están presentes disolventes orgánicos, con respecto a la temperatura y concentración del tampón. Los detalles sobre las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos son bien conocidos por las personas experimentadas en la técnica y se pueden encontrar en libros de texto estándar como Sambrook et al. Alternativamente, el polinucleótido que codifica las variantes antes mencionadas también se puede obtener mediante técnicas en base a PCR tales como amplificación de ADN a base de cebadores de oligonucleótidos mixtos, es decir, usando cebadores degenerados contra dominios conservados de las porciones extracelulares del polipéptido B7-H1 humano o murino. Los dominios conservados pueden identificarse mediante una comparación de secuencias de las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de la porción extracelular de B7-H1 humano o murino.
Preferiblemente, las variantes antes mencionadas de la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano comprenden al menos uno de los siguientes intercambios de aminoácidos L27A, S34Y, D49S, Y56S, E58S, K62S, H69F, E72S, K75S, K89S, A98F, Q100S, R113Y, y S117Y. Estos intercambios de aminoácidos antes mencionados en la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano corresponden a los siguientes intercambios de aminoácidos en la porción extracelular del polipéptido B7-H1 murino: L27A, S34Y, D49S, Y56S, E58S, E62S, A69F, E72S, K75S, K89S, A98F, Q100S, C113Y, y S117Y. Se ha reportado previamente que estos intercambios de aminoácidos potencian el enlace y/o actividad de la proteína B7-H1 a PD-1; véase Wang 2003, J. Exp. Med. 197 No. 9: 1083­ 1091.
También preferiblemente, el polipéptido de fusión que se aplicará de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9 o es una variante de la misma que tiene al menos una sustitución, eliminación y/o adición. Dicha proteína de fusión variante seguirá siendo capaz de ejercer los efectos biológicos mediados por la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano y, en particular, seguirá siendo capaz de enlazarse a PD-1. Dicha variante tendrá, preferiblemente, una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9.
El polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención también puede comprender porciones adicionales tales como secuencias enlazadoras o espaciadoras entre las porciones individuales. Además, también se incluyen porciones que contribuyen a funciones adicionales. Tales porciones incluyen, por ejemplo, porciones que permiten el direccionamiento de ciertas células en un organismo, porciones que aumentan la estabilidad del polipéptido de fusión así como porciones que facilitan la fabricación y/o purificación del polipéptido de fusión tales como etiquetas.
Preferiblemente, el dicho polipéptido de fusión comprende una tercera porción para direccionamiento y, en particular, una tercera porción es un polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas. Más preferiblemente, dicho polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una porción del complejo MHC-I que es capaz de enlazarse a CD8, una porción de CD80 que es capaz de enlazarse a CD28, un polipéptido que es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD8, un polipéptido que es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD28, y la porción de enlace a CD2 del antígeno 3 asociado a la función linfocítica (LFA-3). La persona experimentada en la técnica conoce bien cómo se pueden derivar tales porciones de las proteínas respectivas.
El término "tratar", como se usa en la presente memoria, se refiere a mejorar o curar una enfermedad o al menos un síntoma asociado con la misma. Por tanto, si hay una mejora o cura de la enfermedad o al menos un síntoma asociado con la misma, se considerará que el tratamiento es eficaz. Se entenderá que el tratamiento podría no ser eficaz en todos los sujetos. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención se prevé que el tratamiento será eficaz en al menos una porción estadísticamente significativa de los sujetos a tratar. La persona experimentada en la técnica sabe bien cómo determinar una porción estadísticamente significativa de sujetos que pueden tratarse eficazmente. La persona experimentada en la técnica puede determinar sin más preámbulos si una porción es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %. Los valores p son, preferiblemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Preferiblemente, la probabilidad contemplada por la presente invención permite que el hallazgo de un tratamiento eficaz sea correcto para al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de los sujetos de una cohorte o población determinada.
El término "prevenir", como se usa en la presente memoria, se refiere a evitar la aparición de la enfermedad o al menos un síntoma asociado con la misma o prevenir el empeoramiento de la enfermedad o el dicho al menos un síntoma. La prevención a la que se hace referencia en la presente memoria se puede lograr típicamente durante el período durante el cual se administra un fármaco. Sin embargo, si se detiene la administración del fármaco, es posible que la prevención no persista durante un tiempo ilimitado, pero puede permanecer presente durante un cierto período de tiempo preventivo después de la aplicación del fármaco. Normalmente, una ventana de tiempo preventiva de acuerdo con la presente invención puede ser de al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días o al menos 7 días. Sin embargo, la ventana de tiempo preventiva también puede depender de la dosificación de un fármaco, así como del modo de administración o del tipo de formulación. Por ejemplo, si se aplica una dosificación alta, normalmente se pueden lograr ventanas de tiempo preventivo más largas. Lo mismo es cierto si se administran formulaciones de liberación lenta de un fármaco o el fármaco se administra por vías que no conducen a la metabolización inmediata de un fármaco en el sujeto. En tales casos, la ventana de tiempo predictivo puede aumentarse hasta varias semanas, meses o incluso años. Se entenderá que la prevención puede no ser eficaz en todos los sujetos. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención se prevé que la prevención será eficaz en al menos una porción estadísticamente significativa de sujetos. La persona experimentada en la técnica sabe bien cómo determinar una porción estadísticamente significativa de sujetos que se pueden prevenir eficazmente. La persona experimentada en la técnica puede determinar sin más preámbulos si una porción es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, como se ha comentado anteriormente.
Dado que el polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención se usará para tratar y/o prevenir fallas orgánicas, preferiblemente se formulará como un medicamento. Un medicamento en el sentido de la presente invención se refiere, preferiblemente, a una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión biológicamente activo de acuerdo con la invención como compuesto farmacéuticamente activo y uno o más de otros componentes tales como uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
El polipéptido de fusión puede estar presente en forma líquida o liofilizada. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede estar presente junto con estabilizadores de glicerol y/o proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano). El medicamento se administra, típicamente, por vía sistémica y, preferiblemente, por vía intravenosa o intramuscular. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza de la formulación y la aplicación terapéutica deseada, el medicamento también puede administrarse por otras vías.
El polipéptido de fusión es el ingrediente activo o fármaco del medicamento, y preferiblemente se administra en formas de dosificación convencionales preparadas combinando el fármaco con portadores farmacéuticos estándar de acuerdo con procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable viene dictado por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.
El portador o portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Ejemplares de portadores sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Son ejemplares de portadores líquidos la solución salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. De manera similar, el portador o diluyente puede incluir material de retraso de tiempo bien conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
El diluyente o diluyentes se seleccionan de manera que no afecten la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención para su uso en un medicamento que previene, mejora o cura los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección a la que se hace referencia en esta memoria descriptiva. La eficacia terapéutica y toxicidad de un fármaco se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y por factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, edad, la formulación particular del medicamento que se va a administrar, género, hora y vía de administración, salud general y otros fármacos que se están administrando al mismo tiempo. El progreso se puede monitorizar mediante evaluaciones periódicas. Las recomendaciones posológicas se indicarán en las instrucciones de los prescriptores o usuarios para anticipar ajustes de dosis dependiendo del receptor considerado.
El medicamento al que se hace referencia en la presente memoria se administra preferiblemente al menos una vez, por ejemplo, como un bolo. Sin embargo, dicho medicamento se puede administrar más de una vez y, preferiblemente, al menos dos veces, por ejemplo, de manera permanente o periódica después de ventanas de tiempo definidas.
El medicamento de acuerdo con la presente invención puede, en un aspecto adicional de la invención, comprender fármacos además del polipéptido de fusión que se añaden durante su formulación. Preferiblemente, el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención se aplicará junto con al menos un fármaco adicional y, por tanto, se puede formular junto con estos otros fármacos como un medicamento. Más preferiblemente, dicho al menos un fármaco adicional se selecciona del grupo que consiste en: antibióticos, vasopresores, esteroides, anticoagulantes, antitrombóticos, citoquinas proinflamatorias e inhibidores de DAMP.
Finalmente, debe entenderse que la formulación de una composición farmacéutica tiene lugar bajo condiciones estandarizadas de GMP o similares con el fin de garantizar la calidad, seguridad farmacéutica y eficacia del medicamento.
El término "fallo orgánico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier disfunción del órgano que afecte la función fisiológicamente esperada de un órgano hasta tal punto que la homeostasis normal no se puede mantener ni compensar endógenamente. El fallo orgánico puede ser agudo o crónico. Los síntomas asociados con el fallo orgánico dependen del órgano afectado, generalmente se hacen evidentes por una fisiología patológica que puede determinarse en el sujeto, por ejemplo, mediante parámetros clínicos o bioquímicos. Los síntomas de insuficiencia orgánica también son bien conocidos en la técnica y se describen en libros de texto de medicina. Preferiblemente, el fallo orgánico como se menciona en la presente memoria es un fallo multiorgánico. El fallo multiorgánico se caracteriza por el fallo de dos o más órganos al mismo tiempo o secuencialmente dentro de un período corto de tiempo. A menudo se puede observar como consecuencia de infecciones graves o reacciones inflamatorias como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) o sepsis. Los órganos típicos que fallan durante SIRS o sepsis son pulmón, riñón, corazón y/o todo el sistema circulatorio, el sistema gastrointestinal así como el sistema nervioso. Preferiblemente, el fallo multiorgánico al que se hace referencia en la presente memoria es causada por células citotóxicas autorreactivas y, más preferiblemente, es un fallo multiorgánico dependiente de células T citotóxicas CD8.
El término "sujeto", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier tipo de animal que incluya, por ejemplo, mamíferos, aves, peces o reptiles. Normalmente, dicho animal, sin embargo, es un mamífero como los mamíferos utilizados como mascotas, incluidos perros, gatos, caballos o roedores, animales de laboratorio, por ejemplo, ratas, ratones o simios, o animales de cría como cerdos, vacas, cabras, u ovejas. Más preferiblemente, el mamífero es un primate y, lo más preferiblemente, un humano. El sujeto de acuerdo con la presente invención sufrirá sepsis, es decir, presentará al menos uno o más cambios patológicos tales como síntomas clínicamente aparentes o cambios de parámetros fisiológicos o moleculares que se asocian típicamente con la sepsis.
El término "sepsis", como se usa en la presente memoria, se refiere a una respuesta inflamatoria que afecta a todo el organismo. Los síntomas típicos asociados con la sepsis son bien conocidos en la técnica y se describen en los libros de texto estándar de medicina. Incluyen una temperatura corporal significativamente alterada (temperatura baja o fiebre), respiración rápida, taquicardia, presión arterial baja debido a una disminución de la resistencia vascular periférica, confusión mental y formación de edemas. Los parámetros bioquímicos como la disfunción de la coagulación o acidosis metabólica también son signos típicos de sepsis. La sepsis es causada por una infección grave por bacterias, virus, parásitos u hongos. Además, existen factores cofundadores que influyen de manera inferior en la aparición o el resultado de la sepsis, como diabetes o cáncer. Preferiblemente, la sepsis se refiere de acuerdo con la presente invención se caracteriza por la presencia de dos o más de los siguientes síntomas en respuesta a una infección: temperatura anormal (preferiblemente, por debajo de 36 ° C o por encima de 38 ° C), frecuencia cardíaca anormal (preferiblemente, por encima de 90 latidos/minuto), frecuencia respiratoria anormal (preferiblemente, por encima de 20 respiraciones/minuto) o composición de gases en sangre (preferiblemente, CO2 menos de 4,3 kPa) y número anormal de glóbulos blancos en sangre (preferiblemente, menos de 4x109/l o más de 12x109/l o presencia histológica de neutrófilos en banda).
Ventajosamente, se ha encontrado en los estudios que subyacen a la presente invención que un polipéptido de fusión que comprende una porción Fc de una inmunoglobulina y la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano se puede usar para tratar de manera eficiente y/o prevenir el fallo orgánico en un sujeto que sufre de sepsis. Específicamente, se encontró que el polipéptido de fusión mencionado anteriormente o variantes del mismo son capaces de enlazarse a células T citotóxicas, inhibiendo así la citotoxicidad de células T inducida por sepsis y previniendo el fallo orgánico. Además, se encontró que la subregulación de la proteína B7-H1 permite la activación de CTL autoinmunes durante la sepsis. Mantener la expresión de B7-H1 o aplicar el polipéptido de fusión de la invención mejora significativamente el daño hepático. Mecánicamente, B7-H1 fue subregulado por la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Por tanto, el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención, preferiblemente, después de la administración inhibirá las células T citotóxicas inducidas por sepsis en el sujeto. Además, preferiblemente, tras la administración inducirá una tolerancia duradera en las células T citotóxicas del sujeto contra la activación causada por la sepsis. En consecuencia, sorprendentemente se puede aplicar tanto de manera terapéutica como preventiva.
Las explicaciones y definiciones anteriores de los términos se aplican en toda la especificación. Además, en lo que sigue, las realizaciones típicas del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la presente invención se definen mediante las reivindicaciones y se enumeran.
En una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicho fallo orgánico es uno fallo multiorgánico dependiente de células T citotóxicas CD8.
En una realización preferida adicional del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicha inmunoglobulina es IgG humana.
En aún una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la presente invención, dicha porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o variante del mismo se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 5;
(b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 6;
(c) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 y que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de (a) o (b), y (d) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con (a) o (b) que comprende al menos uno de los siguientes intercambios de aminoácidos L27A, S34Y, D49S, Y56S, E58S, K62S, H69F, E72S, K75S, K89S, A98F, Q100S, R113Y, y S117Y. En una realización preferida adicional del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la presente invención, dicho polipéptido de fusión comprende (iii) una tercera porción que es un polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas.
Más preferiblemente, dicho polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una porción del complejo MHC-I que es capaz de enlazarse a CD8, una porción del CD80 que es capaz de enlazarse a CD28, un polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD8, un polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD28, y la porción de enlace a CD2 del antígeno 3 asociado a la función de linfocitos (LFA-3).
En una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicha al menos la primera porción y al menos la segunda porción están unidas de forma permanente o reversible entre sí.
En todavía una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicho sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
En una realización preferida adicional del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicho polipéptido de fusión se aplicará una vez como un bolo o se aplicará al menos dos veces.
En una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicho polipéptido de fusión se aplicará junto con al menos un fármaco adicional.
Más preferiblemente, dicho al menos un fármaco adicional se selecciona del grupo que consiste en: antibióticos, vasopresores, esteroides, anticoagulantes, antitrombóticos, citoquinas proinflamatorias e inhibidores de DAMP. En una realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la presente invención, dicho polipéptido de fusión inhibe las células T citotóxicas tras la administración, inducidas por sepsis en el sujeto.
En otra realización preferida del polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la invención, dicho polipéptido de fusión tras la administración induce una tolerancia duradera en las células T citotóxicas en el sujeto contra la activación causada por sepsis.
La presente invención, además, se refiere a un polinucleótido para su uso en el tratamiento y/o prevención de fallo orgánico en un sujeto que padece sepsis, codificando dicho polinucleótido un polipéptido de fusión definido de acuerdo con la presente invención.
El término "polinucleótido", como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de ADN de cadena sencilla o doble, así como a moléculas de ARN. Abarcado por el dicho término está el ADN genómico, ADNc, ARNhn, ARNm así como todos los derivados de origen natural o modificados artificialmente de tales especies moleculares. El polinucleótido puede ser, preferiblemente, una molécula lineal o circular. Así mismo, además de las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de fusión mencionado anteriormente, un polinucleótido de acuerdo con la presente invención puede comprender secuencias adicionales requeridas para la transcripción y/o traducción adecuadas tales como secuencias UTR 5' o 3' o secuencias requeridas para empalme o estabilidad del ARN. Los polinucleótidos preferidos que codifican el polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención también se describen anteriormente con más detalle.
En una realización preferida del polinucleótido para su uso de acuerdo con la presente invención, dicho polinucleótido está comprendido en un estructura de expresión que permite la expresión de dicho polinucleótido en dicho sujeto.
El término "estructura de expresión" como se usa en la presente memoria se refiere a un polinucleótido heterólogo que comprende el polinucleótido mencionado anteriormente que codifica el polipéptido de fusión, así como los ácidos nucleicos que son heterólogos al mismo y que se requieren para la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión. Típicamente, tales ácidos nucleicos heterólogos pueden ser secuencias promotoras, secuencias potenciadoras y/o secuencias de terminación de la transcripción tales como terminadores. Además, la estructura de expresión también puede comprender ácidos nucleicos adicionales necesarios para introducir la estructura de expresión en un huésped. Por ejemplo, si se desea expresión en células huésped, la estructura de expresión puede comprender ácidos nucleicos adicionales necesarios para la transformación o transfección y para la propagación de la estructura de expresión introducida en las células huésped.
Preferiblemente, la estructura de expresión a la que se hace referencia en la presente memoria puede ser un vector. Un vector como se entiende en la presente memoria, preferiblemente, incluye vectores de fagos, plásmidos, virales o retrovirales, así como cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. El vector que abarca el polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión, preferiblemente, comprende además marcadores seleccionables para la propagación y/o selección en un huésped. El vector puede incorporarse a una célula huésped mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir un vector plasmídico en un precipitado, como un precipitado de fosfato cálcico o un precipitado de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lípido cargado o en grupos a base de carbono, como los fullerenos. Alternativamente, se puede introducir un vector plasmídico mediante técnicas de electroporación o choque térmico. Si el vector fuera un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando una línea celular de empaquetamiento adecuada antes de su aplicación a las células huésped. Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En el último caso, la propagación viral se producirá generalmente sólo en células/huésped complementarias. Además, el polinucleótido está normalmente unido operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células huésped procariotas o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas en dicho vector. La expresión del polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en las células huésped son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y/o señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac-, trp- o tac- en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1- o GAL1- en levadura o el promotor de CMV-, SV40-, RSV- (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Otros sistemas de expresión previstos por la invención permitirán la expresión en células de insectos, tales como sistemas en base a promotores de polihedrina. Además, se pueden usar secuencias de control de la expresión inducible en un vector abarcado por la presente invención. Dichos vectores inducibles pueden comprender secuencias de operadores tet o lac o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Las secuencias de control de la expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo del polinucleótido. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcADN1, pcADN3 (Invitrogen) o pSPORT1 (Invitrogen) o vectores derivados de baculovirus. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión y un vector de transferencia o direccionamiento génico. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, pueden usarse para la administración de las estructuras de expresión de acuerdo con la invención en la población de células diana, por ejemplo, también en enfoques terapéuticos genéticos. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por las personas experimentadas en la técnica para construir vectores virales recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994).
Además, podría contemplarse introducir la estructura de expresión en el genoma de un huésped. En tal caso, la estructura de expresión también puede comprender ácidos nucleicos que permitan la integración heteróloga u homóloga de dicha estructura de expresión. Por tanto, la estructura de expresión a la que se hace referencia en la presente memoria también puede ser una estructura de direccionamiento que permita la integración aleatoria o dirigida al sitio de la estructura de direccionamiento en el ADN genómico. Tales estructuras diana, preferiblemente, comprenden ADN de longitud suficiente para la recombinación homóloga o heteróloga que flanquea el casete de expresión con el polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión. Además, la estructura de expresión también puede introducirse utilizando sistemas de integración como Cre/LoxP o CRISPR/CAS. En tales casos, la estructura de expresión puede comprender ácidos nucleicos adicionales que permitan el uso de tales sistemas de integración. Las modificaciones/adiciones adecuadas dependen del sistema de integración previsto y son bien conocidas por las personas experimentadas en la técnica.
Se entenderá que la presente invención proporciona además el uso del polipéptido o polinucleótido de fusión definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir el fallo orgánico en un sujeto. Normalmente, el polipéptido o polinucleótido de fusión, así como los sujetos a tratar o las enfermedades mencionadas, tienen las características preferidas definidas anteriormente.
Se entenderá que la presente invención también proporciona un procedimiento para tratar y/o prevenir el fallo orgánico en un sujeto.
En particular, se proporciona un procedimiento para tratar el fallo orgánico en un sujeto que padece sepsis, comprendiendo dicho procedimiento (a) administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión que comprende al menos (i) una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y (ii) una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo o (b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de fusión.
Los aspectos típicos de la invención con respecto al tipo de fallo orgánico, los sujetos a tratar, sepsis y el polipéptido o el polinucleótido de fusión se describen anteriormente y se aplican mutatis mutandis para el presente procedimiento de tratamiento y/o prevención de fallo orgánico en un sujeto.
En otro aspecto típico más del procedimiento de la invención mencionado anteriormente, dicho procedimiento puede abarcar la identificación de un sujeto a tratar determinando la presencia de sepsis antes de administrar el polipéptido de fusión o polinucleótido que lo codifica.
En otro aspecto típico del procedimiento de la invención mencionado anteriormente, dicho procedimiento comprende monitorizar a los sujetos para detectar signos de fallo orgánico después de la administración del polipéptido de fusión y, si es necesario, administrar el polipéptido de fusión o polinucleótido que lo codifica de nuevo o con una diferencia de dosificación.
Todas las referencias citadas en esta memoria descriptiva se incorporan aquí como referencia con respecto a su contenido de divulgación completo y el contenido de divulgación mencionado específicamente en esta memoria descriptiva. Las citas completas de las referencias se encuentran en otra parte de la presente memoria.
Figuras
Figura 1: Número potenciado de células T CD8+ en hígados de ratones sépticos. 24 horas después de la operación simulada o CLP, se sacrificaron los ratones. Se extrajeron los hígados para preparar suspensiones de células individuales. Las subpoblaciones de células se determinaron mediante análisis FACS. Se proporciona una cuantificación de cinco ratones de cada tratamiento.
Figura 2: Expresión de B7-H1, B7-DC, Fas y PD-1 en el hígado después de CLP. 24 horas después de la operación simulada o CLP, se sacrificaron los ratones. Se extrajeron los hígados para preparar suspensiones de células individuales. Se prepararon lisados totales en (A) y (C) para analizar la expresión de B7-H1, PD-1 y Fas. La expresión específica de hepatocitos de la expresión superficial de (B) B7-H y (D) B7-DC se realizó mediante análisis FACS. Todos los experimentos se realizaron al menos cinco veces. Los datos representan la media ± SD (*p <0,5) o muestran inmunoprecipitaciones representativas.
Figura 3: Expresión de B7-H1 en células Hepa1-6 después de la estimulación con LPS o LTA. Las células Hepa1-6 se estimularon durante los tiempos indicados con 100 ng/ml de LPS o 100 ng/ml de LTA. Posteriormente, se cosecharon las células y se aisló el ARNm o se prepararon lisados de proteínas como se describe en materiales y procedimientos. La expresión de ARNm de B7-H1 (A) se analizó mediante PCR cuantitativo. 18s ARNr se utilizó como un gen de mantenimiento. (B) La expresión de la proteína B7-H1 después de la estimulación con LPS se determinó mediante análisis Western. Todos los experimentos se realizaron al menos cinco veces. Los datos representan la media ± SD (*p <0,5) o muestran una inmunoprecipitación representativa.
Figura 4: La subregulación de B7-H1 dependiente de LPS potencia la citotoxicidad mediada por CTL. Se aislaron células T citotóxicas y se enriquecieron a partir del bazo de ratones OT-I como se describe bajo materiales y procedimientos como células efectoras. Se utilizaron células Hepa1-6 como células diana. (A) Para establecer el ensayo de citotoxicidad, las células Hepa1-6 se pulsaron durante 2 horas con XY pg/ml del péptido de ovoalbúmina 257-264 (OVA) o el péptido de control del virus de la hepatitis B (HBV). Las células Hepa1-6 se trataron durante 24 horas con LPS [100 ng/ml] o permanecieron sin tratar como controles. Posteriormente, las células Hepa1-6 se tiñeron con CellTrackerOrange™ y se incubaron durante 24 horas con células T citotóxicas (proporción de células diana frente a células efectoras 1:5). El número de células diana supervivientes se determinó mediante análisis FACS. Se proporciona una cuantificación de cinco experimentos independientes. Los datos representan la media ± SD (*p <0,5). (B) Las células Hepa1-6 se transdujeron de manera estable con un vector que codifica EGFP B7-H1 o un vector de control (CV). Después del enriquecimiento con FACS, las células positivas se estimularon durante los tiempos indicados con LPS [100 ng/ml] o permanecieron sin tratar como control. Posteriormente, las células Hepa1-6 se tiñeron con CellTrackerOrange™ y se incubaron durante 24 horas con células T citotóxicas (proporción de células diana frente a células efectoras 1:5). El número de células diana supervivientes se determinó mediante análisis FACS. Se proporciona una cuantificación de cinco experimentos independientes. Los datos representan la media ± SD (*p <0,5).
Figura 5: La expresión del adenoviral B7-H1 mejora el daño hepático después de CLP. A los ratones se les inyectaron por vía intravenosa 5x109 partículas adenovirales que codifican EGFP (adTrack) o B7-H1 EGFP (adTrack B7-H1). 4 días después de la administración de partículas adenovirales, los ratones fueron sometidos a sepsis polimicrobiana mediante operación CLP. Después de 24 horas, se sacrificaron los ratones, se extrajeron los hígados y se extrajo sangre. La eficiencia de transducción se determinó mediante análisis FACS en suspensiones de células individuales de hígado, regulado para células no inmunes, es decir, CD45- (A). Se muestra un resultado representativo. Se aisló suero de la sangre y se determinó la liberación de ALT/AST con un analizador de hematología Reflotron Plus (B). Se muestran los resultados de 4 ratones cada uno.
Figura 6. La quimera Fc B7-H1 recombinante previene el daño hepático durante la sepsis. (A) Se determinó la muerte de hepatocitos dependiente de células T citotóxicas usando células Hepa1-6 como células diana y células T CD8+ derivadas de ratones OT-I como células efectoras. Se pulsaron células Hepa1-6 teñidas con CellTrackerOrange ™ durante 2 horas con el péptido OVA257-264. Posteriormente, las células Hepa1-6 se cocultivaron con células T CD8+ enriquecidas derivadas del bazo de ratones OT-I en una proporción de 5:1 (células efectoras:diana). Paralelamente, se añadió Fc B7-H1 recombinante en las concentraciones indicadas. El número de células diana supervivientes se examinó mediante análisis FACS. Se proporciona una cuantificación de cinco experimentos independientes. Los datos representan la media ± SD (*p <0,5). (B) Se sometieron ratones de tipo salvaje a operación de CLP. Inmediatamente después, se aplicó Fc B7-H1 por vía intravenosa. Se administró PBS solo como control de disolvente. El daño hepático en la siguiente operación de CLP se evalúa determinando la liberación de ALT/AST en el suero, que se examina con un analizador hematológico Reflotron Plus (tratado con Fc B7-H1 frente al control; CLP; n = 5/5, *p <0,5).
Figura 7: Se restauró la expresión de B7-H1 añadiendo el precursor de GSH N-acetil-cisteína (NAC). Las células Hepa1-6 se estimularon durante los tiempos indicados con LPS 100 ng/ml con NAC 10 mM. Posteriormente se cosecharon las células y se prepararon lisados de proteínas como se describe en materiales y procedimientos. La expresión de la proteína B7-H1 se determinó mediante análisis Western. Todos los experimentos se realizaron al menos cinco veces. Se muestra una inmunoprecipitación representativa.
Figura 8: La inhibición de Nox4 potencia la expresión de B7-H1. Se trataron células Hepa1-6 con el inhibidor específico de Nox4 GKT137831 [10 pM] durante 24 horas. Posteriormente, se cosecharon las células y se determinó la expresión de B7-H1 mediante análisis FACS. En (A) se proporciona una cuantificación de cinco experimentos independientes. En homogeneizados de hígado de ratones anulados de NOX4 global, se examinó la expresión de la proteína B7-H1 mediante inmunoprecipitación Western (B). Se muestra una inmunoprecipitación representativa. En (C) se proporciona una cuantificación de la expresión de B7-H1 (WT frente a NOX4-KO; n = 5/5; *p <0,5). Se estudió la expresión de B7-H1 en los hepatocitos después del inicio de la sepsis polimicrobiana mediante ligadura y punción cecal (CLP) en suspensiones de células individuales de hígado mediante análisis FACS controlando para CD45, es decir, células no inmunes como se describe en materiales y procedimientos. Se muestra una cuantificación (D), (simulado frente a CLP, WT simulado se establece como 1; n = 5/5/5/5; *p <0,5). El daño hepático en ratones con anulación global de NOX4 después de la operación de CLP se evalúa observando la liberación de ALT/AST en el suero, que se determina con un analizador de hematología Reflotron Plus (E) (NOX4-KO; simulado frente a CLP; n = 5/5, *p <0,5).
Figura 9: La anulación global de NOX2 restaura la expresión de B7-H1 hepática durante la sepsis. Se utilizaron ratones con una anulación global de NOX2 (NOX2-KO) y con una anulación específica de linaje mieloide (LysM-Cre NOX2-KO) así como compañeros de camada de tipo salvaje (WT). 24 horas después de la operación CLP o simulada, se sacrificaron los ratones. Se recolectó sangre y se extrajo el hígado. (A) La expresión de la proteína B7-H1 en los hepatocitos se determinó en suspensiones de células individuales de hígado mediante análisis FACS regulando para CD45, es decir, células no inmunes como se describe en materiales y procedimientos. (WT frente a NOX2-KO frente a LysM-Cre NOX2-KO; simulado frente a CLP; WT con tratamiento simulado se establece como 1; n = 5/5/5; *p <0,5). (B) Se aisló suero de la sangre y se determinó la liberación de ALT/AST con un analizador de hematología Reflotron Plus. (LysM-Cre NOX2-KO frente a NOX2-KO; simulado frente a CLP; n = 5/5/5/5; *p > 0,5).
Figura 10: Mantenimiento de la expresión de B7-H1 durante la sepsis: un nuevo enfoque terapéutico. (A) Durante la sepsis polimicrobiana, las especies reactivas de oxígeno (ROS) se forman muy probablemente por el Nox2 hepático en respuesta a componentes bacterianos, como LPS o LTA. Estos ROS subregulan la expresión de la proteína coinhibidora B7-H1 en la superficie de los hepatocitos, lo que en consecuencia permite la activación de las células T citotóxicas (CTL) de forma autoinmune. El mantenimiento de la expresión de B7-H1 mediante la eliminación genética de la enzima generadora de ROS Nox2 (B) o la administración exógena de B7-H1 (C) recombinante mantiene la tolerancia a las CTL, mejorando así el resultado séptico.
Ejemplos
La invención se ilustrará simplemente mediante los siguientes ejemplos. Dichos ejemplos, en cualquier caso, no se interpretarán de una manera que limite el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Las células T citotóxicas (CTL) se acumulan en el hígado de ratones sépticos.
Durante la sepsis, la insuficiencia orgánica, a menudo seguida de un síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), suele provocar la muerte del paciente. Por lo tanto, es obligatorio comprender los mecanismos que conducen al daño orgánico para mejorar las opciones de cuidado ya existentes o para establecer nuevos enfoques terapéuticos. Von Knethen et al., 2015 demostraron que las CTL se activan de manera autoinmune en un modelo de sepsis murina, mientras que se ha demostrado que la activación de las células T CD8+ está involucrada en el daño hepático en este modelo de ratón con sepsis (Wesche Soldato et al., 2007a). Para caracterizar el principio subyacente, se analizó el número de CTL en hígados derivados de ratones sometidos a operación simulada frente a ligadura y punción cecal (CLP). Como se muestra en la Figura 1, se pudo encontrar un mayor recuento de CTL en hígados derivados de ratones sépticos 24 horas después de la operación de CLP en comparación con los ratones tratados de forma simulada o de control, respectivamente. Este resultado sugiere una migración inducida por activación de CTL hacia el tejido hepático.
Ejemplo 2: La expresión de B7-H1 es subregulada en un modelo de sepsis polimicrobiana
La activación autoinmune de CTL se previene típicamente mediante proteínas coinhibidoras como B7-H1, también llamadas CD274 o PD-L1, o B7-DC designada CD273 o también p D-L2 (Butte et al., 2007; Sharpe et al., 2007). Estas proteínas coinhibidoras se expresan típicamente en células presentadoras de antígeno (APC), que muy probablemente son hepatocitos en el caso del modelo de sepsis polimicrobiana (Ueki et al., 2011). Por tanto, la expresión de estos factores coinhibidores se analizó en el hígado después de CLP. La expresión de B7-H1 se subreguló en el nivel de proteína total (Figura 2A) y en la superficie celular (Figura 2B). Por el contrario, la expresión de ARNm y proteína de su receptor PD-1 no se alteró (Figura 2C). La expresión de Fas (también conocida como CD95, el receptor del ligando Fas) que se sabe que juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune en ratones y humanos (Galle et al., 1995; Hanabuchi et al., 1994) tampoco se modificó (Figura 2C). La expresión de proteína total de B7-DC fue muy baja (datos no mostrados) y su expresión en la superficie celular no se modificó 24 horas después de la operación CLP (Figura 2D).
Ejemplo 3: Los componentes de la pared celular de bacterias grampositivas y gramnegativas subregulan la expresión de B7-H1 en células Hepal-6
Los cultivos primarios de hepatocitos expresan ARNm para todos los TLR y responden a los ligandos TLR2 y TLR4 (Seki y Brenner, 2008). Por tanto, los componentes bacterianos, que están disponibles en el hígado durante la sepsis, pueden explicar una disminución en la expresión de B7-H1 en los hepatocitos. Para dilucidar el mecanismo que provoca esta subregulación, se estableció un modelo de cultivo celular en base a la línea celular de hepatoma murino Hepa1-6 (Darlington, 1987). Se ha demostrado que esta línea celular expresa TLR2 y -4 (Matsumura et al., 2000; Romics et al., 2004). Para imitar la infección bacteriana, las células Hepa1-6 se trataron con LPS, un componente de la pared celular de las bacterias gramnegativas y LTA, un componente de la pared celular de las bacterias grampositivas. Como se muestra en la Figura 3, la expresión de B7-H1 disminuyó en respuesta a la estimulación con los dos componentes bacterianos en el nivel de ARNm (Figura 3A) y proteína (Figura 3B) de una manera dependiente del tiempo. Sin embargo, sigue siendo difícil saber si la estimulación con LPS o LTA hace que los hepatocitos sean más susceptibles a la citotoxicidad dependiente de CTL y si el mantenimiento de la expresión de B7-H1 protege contra la activación autoinmune de CTL.
Ejemplo 4: las células Hepa1-6 tratadas con LPS son más susceptibles a la citotoxicidad dependiente de CTL Para aclarar si la estimulación con LPS o LTA hace que los hepatocitos sean más susceptibles a la citotoxicidad dependiente de CTL o si mantener la expresión de B7-H1 protege hacia la activación autoinmune de CTL, se dispuso un ensayo de citotoxicidad singénica con CTL derivadas de ratones OT-1 (haplotipo H2Kb) como células efectoras (Clarke et al., 2000) y células Hepa1-6, derivadas originalmente de ratones C57L (haplotipo H2Kb) como células diana. Las células Hepa1-6 se trataron durante 24 horas con LPS o se mantuvieron como control. Posteriormente, las células se pulsaron durante 2 horas con el péptido de ovoalbúmina 257-264 (OVA257-264) o el péptido derivado del virus de la hepatitis B (HBV) ILSPFLPLL derivado del antígeno de superficie de1HBV (HBsAg) como control. Las células se lavaron dos veces en PBS, se tiñeron con CellTrackerOrange™ y se incubaron en una proporción de 1:5 (células diana frente a células efectoras) con CTL durante 24 horas. Las células supervivientes se determinaron mediante análisis FACS. En la situación de control, es decir, células Hepa1-6 sin tratar incubadas con CTL, aproximadamente el 50 % de las células diana murieron (Figura 4A). Después de la estimulación con LPS de las células Hepa1-6, la citotoxicidad se potenció hasta aproximadamente 70 % de células diana muertas cuando las células Hepa1-6 se pulsaron con el péptido OVA257-264. Por el contrario, las células Hepa1-6 pulsadas con péptido de HBV murieron significativamente menos a causa de CTL.
Ejemplo 5: La sobreexpresión de B7-H1 protege a las células Hepa1-6 de la citotoxicidad dependiente de CTL Para verificar que el mantenimiento de la expresión de B7-H1 bloquea la citotoxicidad dependiente de CTL in vitro, las células Hepa1-6 se transdujeron de manera estable con un vector lentivírico que codifica B7-H1 unido a EGFP. Después de la clasificación FACs , estas células que sobreexpresan B7-H1, así como células transducidas con virus de control, se usaron en el ensayo de citotoxicidad (Figura 4B). Como se esperaba, las células que sobreexpresaban B7-H1 estaban protegidas contra la muerte dependiente de CTL (Figura 4B, columnas blancas), mientras que la citotoxicidad hacia las células transducidas con virus de control fue aproximadamente del 50 % sin estimulación con LPS y se potenció después del tratamiento con LPS (100 ng/ml) de manera dependiente del tiempo (Figura 4B, columnas negras).
Ejemplo 6: Mantener la expresión de B7-H1 inhibe el daño hepático después de CLP
Para investigar un papel patofisiológico en el modelo de ratón de sepsis polimicrobiana in vivo, se estableció un enfoque adenoviral para sobreexpresar B7-H1 en el hígado. La Figura 5a muestra que podría lograrse una eficiencia de transducción de hepatocitos de aproximadamente 70 %. Los ratones se mantuvieron sin tratamiento durante cuatro días para recuperarse de la transducción adenoviral, que en consecuencia induce una respuesta inmune antiviral de los ratones. Pasado ese tiempo, se inició CLP durante 24 horas. Luego, se sacrificaron los ratones y se aisló el suero de la sangre de los ratones para determinar la gravedad de la enfermedad analizando los marcadores de daño hepático ALT y AST. Como se muestra en la Figura 5B, la sobreexpresión de B7-H1 mejoró el daño hepático, es decir, redujo significativamente los niveles de ALT/AST. El mantenimiento de la expresión de B7-H1 como enfoque terapéutico se puede lograr mediante la adición exógena de B7-H1. En un ensayo de citotoxicidad in vitro con Hepa1-6 pulsado con OVA257-264 como células diana y CTL derivadas de ratones OT-I como células efectoras, la adición simultánea de quimera Fc B7-H1 recombinante inhibió la citotoxicidad mediada por CTL (Figura 6A). Mientras que 1 pg/ml de quimera Fc B7-H1 recombinante no alteró la muerte de las células diana, 5 pg/ml potenciaron la supervivencia de las células diana hasta aproximadamente un 50 %. El aumento de la concentración de quimera Fc B7-H1 recombinante hasta 20 pg/ml no potencia la supervivencia de las células diana. Para traducir el resultado in vitro a la situación in vivo, se aplicó quimera Fc B7-H1 recombinante por vía intravenosa (i.v.) en la vena de la cola, directamente después de la operación CLP. Veinticuatro horas después, se recolectó sangre de ratones y se preparó suero. Se determinó la liberación de marcadores de daño hepático ALT/AST. Como se muestra en la Figura 6b , la aplicación de quimera Fc B7-H1 recombinante redujo significativamente la liberación de ALT/AST, lo que es indicativo de una mejora en el resultado séptico in vivo.
Ejemplo 7: subregulación de B7-H1 dependiente de ROS
Los LPS y LTA actúan a través de diferentes receptores tipo Toll (TLR) en las células diana, es decir, TLR2 para LTA y TLR4 para LPS. Se ha demostrado que el enlace a estos receptores desencadena diversas cascadas de señalización, es decir, señalización rédox mediada por NADPH oxidasa. Se ha demostrado que la NADPH oxidasa NOX4 genera de forma constitutiva especies reactivas de oxígeno (ROS) como 02- o H2O2 (Dikalov et al., 2008).
Los datos recientes apoyan la suposición de que el 02- no solo se genera para matar patógenos, sino que también actúa como segundo mensajero (Brune et al., 2013). Para investigar si un mecanismo dependiente de ROS era responsable de la reducción de B7-H1, se determinó la formación de ROS en células Hepa 1-6 tratadas con LPS solo o en combinación con N-acetilcisteína (NAC). El tratamiento con NAC, el inhibidor de ROS, restauró la expresión de B7-H1 (véase la Figura 7 frente a la Figura 3B).
Ejemplo 8: La inhibición de Nox4 potencia la expresión de B7-H1
Se ha demostrado que la NADPH oxidasa 4 (Nox4) se expresa en células Hepa1-6 (Boudreau et al., 2009) y provoca una producción constitutiva de H2O2 que, tras la estimulación, puede potenciarse. Para evaluar si Nox4 juega un papel en la regulación de la expresión de B7-H1, las células Hepa1-6 se incubaron con el inhibidor específico de Nox4 GKT137S31 [10 j M] durante 24 horas sin ningún tratamiento adicional (Jiang et al., 2012). Como se muestra en la Figura 8A, la inhibición de Nox4 aumentó la expresión de superficie de B7-H1 hasta aproximadamente un 50 % en las células Hepa1-6. Además, se aislaron hígados de ratones con anulación global de NOX4 y se realizó un análisis Western de lisado total. La Figura 8B muestra que B7-H1 está sobrerregulado en hígados derivados de ratones deficientes en Nox4 en comparación con los controles de tipo salvaje. Una cuantificación densitométrica proporcionada en la Figura 8C demostró una expresión aproximadamente dos veces mayor de B7-H1 en hígados derivados de ratones con anulación de NOX4. Un análisis de la expresión superficial de B7-H1 en hepatocitos mostró un aumento similar en la expresión de B7-H1 (Figura 8D, columnas de la izquierda). Usando estos ratones con el modelo CLP, se pudo observar una subregulación de la expresión de B7-H1 tanto en ratones de tipo salvaje como en los anulados (Figura 8D, columnas de la derecha). Sin embargo, la expresión de B7-H1 en células deficientes en Nox4 seguía siendo un poco más alta en comparación con los ratones de tipo salvaje 24 horas después del inicio de la sepsis por CLP. A pesar de esto, la gravedad de la enfermedad no mejoró en ratones con anulación de NOX4 (Figura 8E). Por lo tanto, el bloqueo de la actividad de Nox4 puede excluirse como un medio para mejorar la supervivencia de la sepsis.
Ejemplo 9: La eliminación global de NOX2 evita la subregulación de B7-H1 durante la sepsis polimicrobiana A continuación, se evaluó el modelo experimental de sepsis usando ratones deficientes en NOX2 global (NOX2-KO) así como ratones con una anulación de NOX2 específico para el linaje mieloide (LysM-Cre Nox2-KO). Como se muestra en la Figura 9A, la expresión de B7-H1 en los hepatocitos fue similar 24 horas después de la operación simulada en los tres genotipos. Curiosamente, 24 horas después de CLP, la expresión de B7-H1 se subreguló en ratones de tipo salvaje (columna negra) y en ratones con una eliminación de Nox-2 en el linaje mieloide (columna gris), mientras que en ratones con una anulación global de NOX2 (columna blanca), la expresión de B7-H1 se mantuvo alta. La liberación de marcadores de daño hepático en el suero reveló un aumento significativo de ALT y AST en ratones con una eliminación de NOX2 de linaje mieloide (Figura 9B, columnas grises), pero permaneció débil en ratones con anulación de NOX2 global (Figura 9B, columnas blancas).
Ejemplo 10: material y procedimientos generales
Se generaron ratones con una anulación específica de NOX2 para el linaje mieloide cruzando ratones C57Bl/6 que llevaban alelos condicionales de NOX2 (NOX2fl/fl) flanqueados por loxP, amablemente proporcionado por el Prof. Shah (King's College London BHF Centre of Excellence, Londres, Reino Unido) con ratones transgénicos C57Bl/6N-(Tg) LysM-Cre, donde la recombinasa Cre ha sido incorporada tras el promotor LysM (Akiyama et al., 2002; Cui et al., 2002; Hennet et al., 1995; Hume, 2011; Schmidt et al., 2011). También se utilizaron ratones con anulación de NOX2 y NOX4 global, así como ratones de tipo salvaje, sobre un fondo C57Bl/6. Los ratones se mantuvieron en una habitación con temperatura controlada con un ciclo diurno de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Se alojaron en jaulas con tapa de filtro y se les suministró comida de laboratorio estándar y agua ad libitum. Los genotipos se determinaron mediante PCR del ADN de la cola y la eliminación de NOX2 y NOX4 se confirmó mediante análisis de ARNm (datos no mostrados). Todos los experimentos con animales siguieron las directrices del comité de uso y cuidado de animales de Hessian (autorización no. F144/15).
El modelo de punción y ligadura cecal (CLP) se realizó como se describió anteriormente (Rittirsch et al., 2009) o sin ligadura y punción para ratones simulados (simulación). Brevemente, los ratones se anestesiaron con ketamina (Ketavet®)/xilazina (Rompun®) 100 mg/200 mg por kg de peso corporal. Se realizó una incisión de laparotomía en la línea media de manera aséptica y se ligó un tercio del ciego distal a la válvula ileocecal, teniendo cuidado de no interrumpir la continuidad intestinal. La parte ligada se perforó de arriba abajo con una aguja de calibre 20. Los animales recibieron i.p. 1 ml de NaCl al 0,9 % inmediatamente después de la cirugía y buprenorfina (Temgesic®) 0,5 mg/kg después de la cirugía s.c. y en el siguiente tiempo cada 6 horas. 24 horas después de la cirugía de CLP, se sacrificaron los ratones, se disecaron los bazos y se preparó una suspensión de células individuales. Las células T CD8+ se enriquecieron hasta > 95 % mediante selección positiva de bazos usando el kit Dynabeads FlowComp Mouse CD8 (Life Sciences, Heidelberg, Alemania) siguiendo las instrucciones de los distribuidores. La purificación se verificó mediante análisis FACS usando un anticuerpo marcado con anti-CD8a-FITC (EuroBioScience, Friesoythe, Alemania). En algunos experimentos, se extrajo sangre previamente, de una punción cardíaca para aislar el suero para la determinación de los dos marcadores de daño hepático alanina- y aspartato aminotransferasa. Las cantidades de las dos enzimas se analizaron utilizando un analizador de hematología Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) con las tiras reactivas correspondientes. Cuando también se extrajo el hígado, el órgano se lavó antes con PBS. Posteriormente, se disecó el hígado y se preparó una suspensión de células individuales. Después de la tinción CellTracker™ Orange (Life Technologies GmbH, Frankfurt, Alemania), estas células se usaron directamente para el ensayo de citotoxicidad de cocultivo con CTL enriquecidas.
Se cultivaron células Hepa1-6 (Darlington, 1987) en RPMI1640 (PAA Laboratories) suplementado con 100 U/ml de penicilina (PAA Laboratories), 100 pg/ml de estreptomicina (PAA Laboratories) y suero de ternero fetal inactivado por calor al 10 % (Laboratorios PAA).
Para sobreexpresar B7-H1 murino in vitro, amplificamos B7-H1 a partir de ARNm murino de células Hepa1-6 mediante Pc R utilizando el siguiente par de cebadores (NM_021893): 5'-CGC CCG GGG GGG ATC ATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC ACA-3' hacia adelante; 5' -TCA AGC TTG CAT GCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CA-3' hacia atrás. Los cebadores se usaron para clonar mB7-H1 en el vector lentiviral pSEW (Demaison et al., 2002) frente a la secuencia codificadora de EGFP, ya presente en el vector pSEW. Las secuencias de codificación de B7-H1 se muestran en cursiva. Después de la linealización de pSEW con BamHI, el fragmento mB7-H1 amplificado se insertó con el sistema InFusion (Takara Bio Europe, Saint-Germain-en-Laye, Francia). La secuencia correcta se verificó mediante secuenciación. Para la transducción in vivo de B7-H1 en el hígado de ratones, se subclonó B7-H1 EGFP en el vector pSEW en el vector pShuttle-CMV del sistema de vector adenoviral adEasy (Luo et al., 2007). Se utilizó el siguiente par de cebadores que contenía la clonación de InFusion apropiada de secuencia flanqueante en el sitio BgllI/EcoRV de pShuttle-CMV: 5'-GAT CCG CTA GAG ATC GCC ACC ATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC ACA GC-3' hacia adelante, 5'-TCC GGT GGA TCG GAT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3' hacia atrás. Las secuencias codificantes de B7-H1 (cebador hacia adelante) y EGFP (cebador hacia atrás) se muestran en cursiva. La secuencia correcta se verificó mediante secuenciación. Como control negativo se utilizó el vector pAdTrack, que solo codifica EGFP.
Para la preparación de adenovirus, se sembraron células Ad-293 en un matraz de 75 cm2 en DMEM (glucosa alta, Glutamax) FCS al 10 % pen/estrep 1:100 HEPES 1:100 aminoácidos no esenciales 1:100. Después de 4 días, las células se separaron con 1 ml de tripsina. Se añadieron 9 ml de medio de cultivo y las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos. Tras la resuspensión del sedimento en 10 ml de medio de cultivo, se sembraron 3,5 ml en matraces de 2 x 175 cm2. Después de tres días, las células se separaron de ambos matraces de 175 cm2 con 1 x 2 ml de tripsina. Se añadieron 9 ml de medio, se centrifugaron las células y se resuspendió el sedimento y se dispensó en matraces de 16 x 175 cm2. 4 días después, se retiró el medio de las células 100 % confluentes. En tubos de 8 x 50 ml se añadieron 29 ml y en tubos de 15 ml se añadieron 7,5 ml de medio de cultivo tibio. Se descongelaron a temperatura ambiente 0,5 ml de solución madre de virus [1x1011 partículas/ml]. La solución madre de virus se añadió al tubo de 15 ml y se mezcló pipeteando arriba/abajo. Se transfirió 1 ml de adenovirus diluido a cada tubo de 50 ml. Después de cerrar herméticamente y mezclar, se agregaron 15 ml de adenovirus diluido a cada matraz. Los matraces se incubaron durante 4 horas en una incubadora. Luego, se añadieron a cada matraz 15 ml de medio de cultivo precalentado. Después de 3 días, la mayoría de las células infectadas se separaron en grupos. Las células no infectadas todavía estaban esparcidas y unidas al plástico. El medio era amarillento. Las células se separaron golpeando los matraces contra la mano. El medio se transfirió a tubos de 10 x 50 ml y se centrifugó a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Se descartó el sobrenadante. Los tubos se agitaron ligeramente. Se transfirieron 3 x 1 ml de medio de cultivo a 3 tubos. Usando una punta de filtro de 1 ml, los primeros tres sedimentos se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo. Las células resuspendidas se transfirieron a un criovial, que se congeló instantáneamente en N2 líquido y se transfirió a un congelador a -80 ° C. Para purificar la partícula adenoviral, se prepararon lisados celulares sometiendo células de 10 viales a 4 ciclos rápidos de descongelación/congelación. Los lisados se transfirieron a un tubo de 15 ml y se centrifugaron a 1.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. Mientras tanto, se prepararon 6 gradientes de CsCl: a cada tubo de ultracentrífuga se le añadieron 4 ml de CsCl al 40 % en PBS. Luego, esto se cubrió cuidadosamente con 4,5 ml de CsCl al 15 % en PBS. El lisado celular aclarado se transfirió a un tubo de 50 ml, se llenó hasta 18 ml con medio de cultivo y se mezcló pipeteando. Se transfirieron tres ml de lisado aclarado a cada gradiente de CsCl. Los tubos de ultracentrífuga se transfirieron a cubetas del rotor. Se ajustó el peso de los pares de cubetas correspondientes. Los gradientes de CsCl se centrifugaron a 25.400 rpm durante aproximadamente 17 horas a 4 ° C. Tanto la aceleración como la desaceleración se establecieron en 1. Después de la centrifugación, los tubos se retiraron cuidadosamente. El virus se recolectó insertando una aguja de 23 G conectada a una jeringa de 2 ml por debajo de la banda inferior del virus. Los virus de 3 tubos de ultracentrífuga se recolectaron y se cargaron en un casete slide-a-lyzer de 3 ml (10 kDa) (Thermo Scientifc, Darmstadt, Alemania). Las partículas virales se dializaron frente a 21 l de PBS frío durante 4 horas. Luego se cambió el PBS y se prolongó la diálisis durante 12 horas. Posteriormente, se recolectó el virus y se transfirió a un tubo de 15 ml en hielo. Las alícuotas se transfirieron a crioviales, se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 ° C. Para determinar la capacidad de la unidad formadora de colonias, se aplicó un ensayo de placa. La evaluación se realizó mediante microscopía de fluorescencia debido a la etiqueta EGFP de genes transducidos. Para la transducción de ratón, se administraron 5 x 1010 partículas infecciosas en 100 |il de PBS.
Para el ensayo de citotoxicidad, se coincubaron células T CD8+ derivadas del bazo de ratones C57Bl/6N OT-I (haplotipo H-2b) como células efectoras con células Hepa1-6, procedentes de la cepa C57L (haplotipo H-2b) como células diana durante 24 horas. Antes de esto, las células Hepa1-6 se pulsaron durante 2 horas con el péptido de ovoalbúmina (OVA) 257-264 (AnaSpec, Fremont, EE. UU.), o el péptido del virus de la hepatitis B (HBV) iLs PFLPLL derivado del HBsAg como control (IBA, Goettingen, Alemania) o no se trató como control. Después de la carga con antígeno, las células Hepa1-6 se tiñeron con CelITracker™ Orange (Life Technologies GmbH, Frankfurt, Alemania) antes de la adición de células T CD8+. Después de 24 horas, se determinaron las células diana supervivientes mediante análisis FACS (FACS Fortessa, BD, Heidelberg, Alemania).
Se aisló el ARN total de 5*105 células T CD8+, células Hepa1-6 o células hepáticas primarias usando el kit peqGOLD RNAPure (Peqlab, Erlangen, Alemania) según las instrucciones del protocolo del fabricante. Se sometieron a transcripción inversa dos |jg de ARN en ADN complementario (ADNc) con el kit de síntesis de ADNc iScript™ (Bio-Rad, Munich, Alemania). La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó con el iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del distribuidor. La medición de qPCR y el análisis de datos se realizaron con el sistema de PCR en tiempo real CFX de Bio-Rad. Se seleccionaron los siguientes pares de cebadores (Biomers, Ulm, Alemania) contra dianas murinas: B7-H1 (NM_21893) hacia adelante: 5'-TGC AGC AGT AAA CGC CTG CG-3', hacia atrás: 5'CGC TGC CAA AGG ACC AGC TT-3'; IL-2 (NM_008366) hacia adelante: 5'TGA GCA TCC TGG GGA GTT TC-3', hacia atrás: 5'-GTG ACC TCA AGT CCT GCA GG-3'; Fas-L (NM_010177) hacia adelante: 5'-ACC AAC CAA AGC CTT AAA-3', hacia atrás: 5'-ATA CTT CAC TCC AGA GAT-3'; granzima B (NM_013542) hacia adelante: 5'-CTC CAC GTG CTT TCA CCA AA-3', hacia atrás: 5'-GGA AAA TAG TAC AGA GAG GCA-3'; perforina (NM_011073) hacia adelante: 5'-TGC TAC ACT GCC ACT CGG TCA-3', hacia atrás: 5'-TTG GCT ACC TTG GAG TGG GAG-3'. IFNy (NM_008337) hacia adelante: 5'-TTT GCA GCT CTT CCT CAT GG-3', hacia atrás: 5'-TCG CCT TGC TGT TGC TGA AG-3'. Los valores se normalizaron a ARNr 18s.
Todos los anticuerpos y reactivos secundarios se titraron a concentraciones óptimas. Las células T OT 1 CD8+ se identificaron mediante análisis de FACS utilizando anticuerpos anti ratón V alfa 2 TCR FITC (eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.), así como anticuerpos anti ratón Vp 5,1, 5,2 TCR-PE (BD Bioscience Heidelberg, Alemania). El enlace del receptor Fc en las células T OT 1 CD8+ fue bloqueado por el anticuerpo anti ratón CD16/CD32 durante 15 minutos en hielo seguido de incubaciones de 20 minutos de anti-CD8a-APC para las células T en hielo. La expresión superficial de B7-H1 y B7-DC en la superficie de hepatocitos primarios se determinó mediante análisis FACS, usando anti-B7-H-PE o anti-B7-DC-PE. Las células inmunes se excluyeron mediante tinción con CD45-FITC, por lo que se analizaron únicamente las células CD45-.
La expresión de B7-H1, B7-DC, PD-1, Fas y EGFP se analizó mediante análisis Western. En resumen, se lavaron dos veces con PBS números equivalentes de hepatocitos primarios o células Hepa1-6, se lisaron en tampón RIPA que contenía 1x comprimidos completos de cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, Basilea, Suiza) y se sometieron a sonicación durante 10 impulsos, seguido de centrifugación durante 10 minutos a 16.000 g (4 ° C). Los sobrenadantes se desnaturalizaron con tampón de muestra SDS-PAGE (Tris 250 mM pH 6,8, glicerol al 40 %, 2-ME al 10 %, SDS al 8 %, azul de bromofenol al 0,02 %) durante 10 minutos a 95 ° C. Lowry (Bio-Rad) mantuvo concentraciones de proteína comparables. Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante inmunoprecipitación semiseca. Las membranas se bloquearon con BSA/TTBS al 5 % seguido de incubación con anti-B7-H1-(R&D systems), anti-B7-DC-(Santa Cruz), anti-PD-1-(Santa Cruz), a-Fas-anticuerpo (Santa Cruz) en BSA/TBS al 5 % a 4 ° C durante la noche. La carga se normalizó a p-actina (anti-actina, Sigma-Aldrich). Para la detección de proteínas, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios IRDye (LI-COR, Bad Homburg, Alemania) en BSA/TTBS al 5 %. Las proteínas se visualizaron y analizaron densitométricamente con el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey.
Cada experimento se realizó al menos tres veces. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t pareada. Consideramos significativos los valores de p < 0,05. De lo contrario, se muestran datos representativos.
Citas completas de las referencias citadas a lo largo de la memoria descriptiva
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención del fallo de órgano en un sujeto que padece sepsis, dicho polipéptido de fusión comprende al menos (i) una primera porción que es una porción Fc de una inmunoglobulina y (ii) una segunda porción que comprende la porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o una variante del mismo,
en el que dicha porción extracelular del polipéptido B7-H1 humano o variante del mismo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 5;
(b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 6;
(c) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 y que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de (a) o (b), y (d) un polipéptido que permanece capaz de enlazarse al polipéptido PD1 que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con (a) o (b) que comprende al menos uno de los siguientes intercambios de aminoácidos L27A, S34Y, D49S, Y56S, E58S, K62S, H69F, E72S, K75S, K89S, A98F, Q100S, R113Y, y S117Y.
2. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fallo de organo es un fallo multide organo dependiente de células T citotóxicas CD8.
3. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha inmunoglobulina es IgG humana.
4. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido de fusión comprende (iii) una tercera porción que es un polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas,
en el que dicho polipéptido capaz de enlazarse específicamente a células T citotóxicas se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una porción del complejo MHC-I que es capaz de enlazarse a CD8, una porción del CD80 que es capaz de enlazarse a CD28, un polipéptido que es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD8, un polipéptido que es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de enlazarse específicamente a CD28, y la porción de enlace a CD2 del antígeno 3 asociado a la función de linfocitos (LFA-3).
5. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha al menos la primera porción y al menos la segunda porción están unidas entre sí de forma permanente o reversible.
6. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
7. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polipéptido de fusión es para aplicarse una vez como un bolo o es para aplicarse al menos dos veces.
8. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polipéptido de fusión es para aplicarse junto con al menos un fármaco adicional.
9. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho al menos un fármaco adicional se selecciona del grupo que consiste en: antibióticos, vasopresores, esteroides, anticoagulantes, antitrombóticos, citoquinas proinflamatorias e inhibidores de DAMP.
10. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polipéptido de fusión tras la administración inhibe las células T citotóxicas inducidas por sepsis en el sujeto.
11. Un polinucleótido para su uso en el tratamiento y/o prevención de fallo de organo en un sujeto que padece sepsis, codificando dicho polinucleótido un polipéptido de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. El polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho polinucleótido está comprendido en una estructura de expresión que permite la expresión de dicho polinucleótido en el dicho sujeto.
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