CN107921093B - 用于治疗和预防器官衰竭的b7-h1融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭的融合多肽。所述融合多肽包括：至少(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分；以及(ii)第二部分，包括人B7‑H1多肽的胞外部分或其变体。此外，本发明还包括一种编码用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭的所述融合多肽的多核苷酸。

Description

用于治疗和预防器官衰竭的B7-H1融合多肽
技术领域
本发明涉及一种用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭的融合多肽。所述融合多肽包括：至少(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分；以及(ii)第二部分，包括人B7-H1多肽的胞外部分或其变体。此外，本发明还包括一种编码用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭的所述融合多肽的多核苷酸。
背景技术
脓毒症是一种当机体对感染作出反应时，产生的危及生命的疾病。尽管对脓毒症进行了深入的研究，但是它仍然是重症监护病房的第三大致死原因(Balk,2004；Dellingeret al,2008；Kaukonen et al,2014；Vincent et al,2014)。病理生理学上，在脓毒症进程中，初始的高炎症阶段会促使低炎症阶段的发作，部分情况下，它们同时发生(Angus andvan der Poll,2013；Munford and Pugin,2001；Vincent et al,2013)。
近来，脓毒症治疗方法主要是治疗高炎症反应，以抑制促炎介质的释放、阻断其功能，或将其从血液循环系统中移除。TNFα是一种最有应用前景的候选药物，它的抑制作用显著提高了啮齿动物模型中的脓毒症动物的存活率(Marquez-Velasco et al,2006)。虽然使用中和抗体的这种方法已应用于人，但仍未能提高脓毒症患者的存活率(Clark et al,1998；Reinbart et al,2001)。然而，这种方法控制了高炎症阶段，所以，大多数患者在这个阶段得以存活。因为阻断促炎免疫反应会降低宿主对抗原发性和继发性感染的能力，所以这种治疗方法终究还是不能显著提高脓毒症患者的存活率，反而会引起或强化高炎症阶段。这种免疫抑制通常会引发多器官功能障碍综合征(MODS)，导致患者死亡(Otto et al,2011；Torgersen et al,2009)。
在免疫麻痹期间救治患者的治疗方法也得到了应用。考虑到单核细胞失活(Dockeet al,1997；Pangault et al,2006)，GM-CSF治疗方法用于脓毒症期间恢复单核细胞的功能(Meisel et al,2009)。在小鼠模型中，通过拮抗核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，可以避免T细胞耗竭(Schmidt et al,2011)，这是与高炎症相关的免疫麻痹的一个标志，其与脓毒症死亡率相关(Hotchkiss et al,2006；Wesche-Soldato et al,2007b)。由于脓毒症的病源多，而且受患者已有的的各种合并症或基因先决条件的限制，因此很难实现适宜的针对具体患者的治疗方法(Hotchkiss and Karl,2003；Hotchkiss and Opal,2010)。
一般而言，当患者确诊为脓毒症时，发病度已经到了晚期；此时，患者的肝脏已经受损，其发生在脓毒症晚期。在脓毒症期间，器官衰竭经常伴随着多器官功能障碍综合征(MODS)，这常常会导致患者死亡。因此，只有理解了导致器官损伤的机制，才能改善现有的护理或建立新的治疗方法。
因此，亟需一种脓毒症期间治疗和/或预防器官衰竭的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题可以看作是提供满足上述需求的手段和方法。所述技术问题通过权利要求和下文中所示的实施例来解决。
因此，本发明涉及一种用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭用途的融合多肽。所述融合多肽至少包括：(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分；以及(ii)第二部分，其包括人B7-H1多肽的胞外部分或其变体。
在本文中，术语“多肽”是指由数个，通常是由至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或至少60个通过肽键彼此共价连接的氨基酸组成的分子。由肽键共价连接的小于20个氨基酸组成的分子通常被称为肽。
根据本发明，“融合多肽”是指由至少两个多肽或肽组成的多肽。因此，应该理解的是，本文所指的融合多肽可以包含2、3、4或5，或甚至更多的多肽或肽部分。然而，根据本发明，融合多肽应至少包含本文指定的第一部分和第二部分。包含在融合多肽中的多肽或肽部分可以永久地相互连接，典型地是通过肽键，或者可逆地相互连接，例如通过二硫键或基于离子键、氢键和/或范德华力的亲和结合。通常可以通过重组制造来实现本发明的融合多肽部分之间的永久结合。鉴于此，可以通过化学方法或重组DNA技术合成编码所述部分的多核苷酸，并在合适的表达系统中表达所述多核苷酸。随后，表达的融合多肽可以从表达系统中纯化出来。在本领域，包含配体和受体部分的各种亲和结合系统是已知的。因此，本领域技术人员可以毫不费力地构建包含不同肽或多肽部分，且彼此可逆结合的融合多肽。这种亲和结合系统的典型例子如基于抗体/抗原、链霉亲和素/生物素、亲和素/生物素以及本领域众所周知的其它抗体。
根据本发明的融合多肽包括第一部分，其为免疫球蛋白的Fc部分，以及第二部分，其包括人B7-H1多肽的胞外部分或其变体。优选地，所述人B7-H1多肽的胞外部分或其变体位于融合多肽的N末端；所述免疫球蛋白的Fc部分位于融合多肽的C末端。
术语“免疫球蛋白的可结晶片段(Fc)部分”是指包括抗体的CH2和CH3结构域的抗体片段，而且可以通过使用诸如木瓜蛋白酶对抗体进行蛋白水解切割而获得所述抗体片段。从各种不同的物种中可知本领域的各种免疫球蛋白。这些免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgW或IgY。然而，根据本发明，优选地，所述免疫球蛋白来自哺乳动物，特别是人类，即为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。抗体的Fc部分决定了类效应。因为只有重链的恒定结构域才能形成抗体的Fc部分，所以重链的类别决定了类效应。抗体中可能存在的重链类别包括α、γ、δ、ε和μ。这些重链类别定义了同种型。由于抗体的Fc部分不同，因而不同的抗体同种型具有不同的类效应。这种Fc介导的类效应包括影响效应细胞或效应分子的那些效应，诸如调理效应、凝集效应、溶血效应、补体激活效应和肥大细胞脱粒效应。对于不同的抗体同种型，在本领域中，形成Fc部分的CH2和CH3结构域的氨基酸序列是公知的，并且本领域技术人员可以毫不费力地提供所述氨基酸序列。优选地，本发明所涉及的Fc部分可以经翻译后修饰，更优选地，可以被糖基化。优选地，本发明所述的免疫球蛋白是IgG，更优选地，是人IgG。编码人IgG的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列在本领域中是公知的。而且，对应于所述氨基酸序列中的Fc部分的那些氨基酸是公知的。
术语“人B7-H1多肽的胞外部分”是指被称为程序性死亡配体1(PD-L1)或分化簇274(CD274)的人B7同源蛋白的细胞外部分。已知B7-H1蛋白是一种与激活的T细胞上发现的PD-1受体结合的40kDa跨膜蛋白。已经提出B7-H1/PD-1复合物参与控制CD8+T细胞的增殖。人B7-H1蛋白的氨基酸序列在本领域中是公知的。
优选地，本发明使用的人B7-H1的氨基酸序列可在序号为Q9NZQ7的UniprotKB文件中公开获得，其在序列标识符(SEQ ID)NO:4中显示，或者其由显示在SEQ ID NO:3中的核酸序列编码，或者其由在GenBank中登录号为AF177937的核酸序列编码。所述人B7-H1的胞外部分包含可在序号为Q9NZQ7的UniprotKB文件中公开获得的氨基酸序列的氨基酸19至239，其在SEQ ID NO:2中显示，或者其由显示在SEQ ID NO:1中的核酸序列编码，或者其由在GenBank中登录号为AF177937的核甘酸序列的核甘酸55至717编码。
优选地，本发明使用的鼠类B7-H1的氨基酸序列可在序号为Q9EP73的UniprotKB文件中公开获得，其在SEQ ID NO：8中显示，或者其由显示在SEQ ID NO:7中的核酸序列编码，或者其由在GenBank中登录号为NM 021893的核酸序列编码。所述鼠类B7-H1的胞外部分包含可在序号为Q9EP73的UniprotKB文件中公开获得的氨基酸序列的氨基酸19至239，其在SEQ ID NO:6中显示，或者其由显示在SEQ ID NO:5中的核酸序列编码，或者其由在GenBank中登录号为NM 021893的核甘酸序列的核甘酸55至717编码。
优选地，本发明的人B7-H1多肽的胞外部分包括上述任何特定胞外结构域的变体。通常，通过至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加，这种变体不同于前面提到的特定氨基酸序列。尽管如此，人B7-H1多肽的胞外部分的变体仍然能够发挥由人B7-H1多肽的胞外部分介导的生物效应，特别地，其仍然能够结合PD-1。优选地，所述变体的氨基酸序列与在SEQID NO：2或SEQ ID NO：6显示的氨基酸序列，或者与被SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列编码的氨基酸序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。可以通过确定两个核酸序列或氨基酸序列之间的相同核苷酸或氨基酸的数目来评估本文所用的氨基酸序列或核酸序列之间的序列一致性，其中，对所述序列进行比对以获得最高级匹配。可以使用计算机程序编码的公开技术或方法，例如BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul 1990,J Mol Biol 215,403)来计算上述一致性。优选地，在比较窗口上计算所述一致性百分比值。优选地，所述比较窗口是要被比对的较短序列的整个序列的长度，或者是所述序列长度的至少一半。技术人员可以使用基于各种算法的一系列程序来比较不同的序列。在这种情况下，通过Needleman和Wunsch或Smith和Waterman算法得到的结果特别可靠。为了进行序列比对，可以使用程序PileUp(Higgins 1989,CABIOS 5,151)或作为GCG软件包(Genetics Computer Group1991,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)一部分的程序Gap和BestFit(Needleman 1970,J Mol Biol 48：443；Smith 1981,Adv Appl Math 2：482)。在本发明的另一方面中，使用具有以下设置的整个序列区域上的程序GAP来确定上述一致性百分比值(％)：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000以及平均不匹配：0.000。除非另有说明，否则，上述设置应始终用作序列比对的标准设置。
本发明还包括特定的上述人B7-H1多肽的胞外部分的变体。所述变体由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码具有在严格杂交条件下能够与编码特定的上述人或鼠类B7-H1多肽的胞外部分的核酸序列杂交的核酸序列。本文中，严格杂交条件是指允许鉴定用于编码具有与B7-H1基本上相同的生物功能的多肽的多核苷酸的条件。优选地，本发明的严格杂交条件指：在45℃下，在6倍的氯化钠/柠檬酸钠缓冲溶液(SSC)中杂交，然后在50℃-65℃下，在0.2倍的SSC和浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中清洗一次或数次后所得的产物。本领域技术人员知道，这些杂交条件根据核酸类型以及，例如，当有机溶剂存在时，缓冲液的温度和浓度的不同而不同。对于本领域技术人员而言，核酸杂交技术的细节是公知的，其可以在诸如Sambrook等人所著的标准教科书中找到。可选地，也可以通过基于PCR的技术来获得编码上述变体的多核苷酸，例如，所述基于PCR的技术为：基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即，将简并引物用于人或鼠类B7-H1多肽的胞外部分的保守结构域。可以通过人或鼠类B7-H1多肽的胞外部分的氨基酸或核酸序列的序列比较来鉴定保守结构域。
优选地，上述人B7-H1多肽的胞外部分的变体包括以下氨基酸交换中的至少一种：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113Y和S117Y。人B7-H1多肽的胞外部分中的上述这些氨基酸的交换对应于以下鼠类B7-H1多肽的胞外部分中的氨基酸的交换：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、E62S、A69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、C113Y和S117Y。之前已经报导了通过这些氨基酸的交换，可以增强B7-H1蛋白与PD-1的结合和/或活性(见Wang 2003,J.Exp.Med.197No.9:1083-1091)。
优选地，本发明提出的所述融合多肽具有在SEQ ID NO：9中显示的氨基酸序列，或者所述序列的变体，其中，所述变体具有至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加。所述变体融合蛋白仍然能够发挥由人B7-H1多肽的胞外部分介导的生物效应，特别地，其仍然能够结合PD-1。优选地，所述变体的氨基酸序列与在SEQ ID NO：9中显示的氨基酸序列至少有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
本发明所述的融合多肽也可以在各个部分之间包括诸如连接肽或间隔序列等的其它部分。此外，所述融合多肽还包括有助于进一步实现功能的部分。例如，这些部分包括：允许靶向生物体中的某些细胞的部分、增加融合多肽稳定性的部分以及便于融合多肽的诸如标签的生产和/或纯化的部分。
优选地，所述融合多肽包括用于靶向的第三部分，具体地，所述第三部分是能够特异性结合细胞毒性T细胞的多肽。更优选地，能够与细胞毒性T细胞特异性结合的所述多肽选自：包括能够结合CD8的MHC-I复合物的部分的多肽、能够与CD28结合的CD80的部分、作为能够与CD8特异性结合的抗体或其片段的多肽、作为能够与CD28特异性结合的抗体或其片段的多肽、以及与淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)的CD2结合部分。对于本领域技术人员而言，如何从对应的蛋白质中获得上述部分是已知的。
本文中，术语“治疗”是指治愈一种疾病、或缓解与所述疾病相关的至少一种症状。因此，如果疾病被治愈或者与其相关的至少一种症状得到了缓解，那么就认为该“治疗”有效。应该理解，所述治疗可能对所有受试者都有效。然而，在本发明中，设想所述治疗对具有统计显著性的部分待治疗的受试者有效。本领域技术人员熟知如何确定可以被有效治疗的具有统计显著性的部分待治疗的受试者。本领域技术人员可以使用各种公知的统计学评估手段，例如，置信区间的确定、p值测定，学生t检验(Student's t-test)、曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验等毫不费力地确定所述部分是否有统计显著性。可以在文献(Dowdy andWearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983)中找到评估的具体细节。优选地，所述置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。优选地，所述p值为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，在本发明的设想中，可以从给定队列或人群中发现能被有效治疗的受试者的正确率至少为60％、至少为70％、至少为80％或至少为90％。
本文中，术语“预防”是指避免疾病或至少一种与其相关的症状的发作或预防疾病或所述至少一种症状的恶化。本文所指的预防通常也可以在药物给药期间实现。然而，如果停止给药，这种预防作用可能不会无限期地持续，它只是在使用该药物之后的某个预防时间窗内继续存在。通常，本发明所述的预防时间窗可以至少为1天、至少为2天、至少为3天，至少为4天、至少为5天、至少为6天或至少为7天。然而，预防时间窗也可能取决于药物的剂量以及给药方式或药物的剂型。例如，如果给药的剂量大，通常，预防时间窗口可以更长。如果施用药物缓释制剂或通过不会使受试者体内药物被立即代谢的途径给药，预防时间窗口也可以更长。在这种情况下，所述预防时间窗口可能会延长到几周、几个月甚至几年。应当理解，预防不会对所有受试者都有效。然而，根据本发明，设想所述预防对至少具有统计显著性的部分的受试者有效。本领域技术人员熟知如何确定症状可以被有效预防的受试者的具有统计显著性的部分。本领域技术人员可以使用如上所述的公知的统计学评估手段毫不费力地确定所述部分是否有统计显著性。
因为本发明所述的融合多肽将用于治疗和/或预防器官衰竭，所以，优选地，所述融合多肽被制成药剂(medicament)。优选地，本发明意义上的药剂指包含根据本发明的作为药物活性化合物的生物活性融合多肽以及一种或多种其它组分，其中，所述一种或多种其它组分为一种或多种可药用载体。
所述融合多肽可以为液体形式或冻干形式。例如，所述融合多肽可以与甘油和/或蛋白质稳定剂(例如人血清白蛋白)共存。
通常，药剂为全身施用，优选地，为静脉施用或肌内施用。然而，基于剂型的性质和所需的治疗方式，药剂也可以通过其它途径施用。
所述融合多肽是药剂的活性成分或药物(drug)，优选地，其以常规剂型施用，其中，通过常规方法将药物与标准药物载体组合以制备所述常规剂型。所述制备步骤可以包括混合、制粒和压制、或者适当地将成分溶解于所需的制剂。应该理解，可药用载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、给药途径和其它众所周知的变量。
从与制剂的其它成分相容的意义上讲，载体必须是可用的，并且对其受体无害。所使用的药用载体可以是固体、凝胶或液体。例如，固体载体可以是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁以及硬脂酸等。例如，液体载体可以是磷酸盐缓冲溶液、糖浆、油、水、乳剂以及各种类型的润湿剂等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域公知的延时材料，例如，单硬脂酸甘油酯、甘油二硬脂酸酯、或甘油二硬脂酸酯与蜡的组合物。合适的载体包括上述载体以及本领域公知的其它载体，例如，参见文献：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。
选择的稀释剂不应影响组合物的生物活性。例如，这种稀释剂为蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体、佐剂或无毒、无治疗性、无免疫原性的稳定剂等。
治疗有效剂量是指本发明所述的融合多肽在药剂中的用量，所述药剂用于预防、缓解或治愈本说明书中所提及的疾病或病情的症状。可以通过细胞培养或动物实验中的标准药物程序来确定药物的疗效和毒性，例如，ED50(表示所述剂量在群体中的治疗有效率为半数)和LD50(表示所述剂量在群体中的致死率为半数)。疗效和毒性效应之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50与ED50的比值。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。在医学领域中众所周知，每个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、年龄、待施用的药剂的具体剂型、性别、给药时间和途径、患者的综合健康状况以及同时施用的其它药物。可以通过定期评估来监测进展情况。应在处方中或使用说明中给出建议剂量，以根据具体受体情况预计剂量调整。
优选地，本文所指的药剂例如以大剂量至少施用一次。然而，所述药剂的可以施用多于一次，优选地，至少两次，例如，在定义了时间窗口后永久地或定期地施用。
根据本发明的另一方面，本发明所述的药剂不但包括融合多肽，还包括在配制期间添加的其它药物。优选地，本发明所述的融合多肽可以至少与一种其它的药物一起应用，因此，它们能够与这些其它的药物一起被配制成药剂。更优选地，所述至少一种其它的药物选自：抗生素、血管加压药、类固醇、抗凝剂、抗血栓形成剂、促炎细胞因子和DAMP抑制剂。
最后，应该理解，药物组合物的配制是在GMP标准化条件或其它条件下进行的，以确保药剂的质量、安全性和有效性。
本文中，术语“器官衰竭”是指影响器官的生理预期功能的器官的任何功能障碍，以至于正常的体内平衡既得不到维持也得不到内源性补偿。器官衰竭可能是急性的，也有可能是慢性的。与器官衰竭相关的症状取决于受影响的器官，通常通过受试者的病理生理学而变得明显，其中，可以通过诸如临床或生物化学参数来确定所述病理生理变化。在本领域，器官衰竭的症状也是众所周知的，而且在医学教科书中有描述。优选地，本文所提及的器官衰竭是指多器官衰竭。多器官功能衰竭的特征是两个或两个以上器官的功能同时或在短时间内相继衰竭。这种现象是严重感染、或诸如系统性炎症反应综合征(SIRS)的炎症反应或脓毒症所引起的。在SIRS或脓毒症期间，通常，衰竭的器官包括肺、肾、心脏和/或整个循环系统、胃肠系统以及神经系统。优选地，本文所提及的多器官衰竭是由自身反应性细胞毒性细胞引起的。更优选地，本文所提及的多器官衰竭是CD8细胞毒性T细胞依赖性多器官衰竭。
本文中，术语“受试者”是指包括诸如哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行动物的任何种类的动物。然而，所述动物通常是哺乳动物，例如，被当作宠物的包括狗、猫、马或啮齿动物的哺乳动物，诸如大鼠、小鼠或猿的实验室动物、或者诸如猪、牛、山羊、或羊的农场动物。更优选地，所述哺乳动物是灵长类动物，最优选的是人类。在本发明中，受试者患有脓毒症，即其显现出了至少一种或多种病理变化，例如，临床上明显的症状或通常与脓毒症有关的生理或分子参数的变化。
本文中，术语“脓毒症”是指影响整个生物体的炎症反应。与脓毒症相关的典型症状在本领域中是公知的，并在医学标准教科书中有所描述。这些症状包括：体温明显变化(低温或发热)、呼吸急促、心率过速、外周血管阻力降低引起的低血压、精神错乱和水肿。诸如凝血功能障碍或代谢性酸中毒的生化参数也是脓毒症的典型征兆。脓毒症是由细菌、病毒、寄生虫或真菌的严重感染引起的。此外，还有一些混合因素，诸如糖尿病或癌症，它们会引发脓毒症或脓毒症会导致它们。优选地，本发明所述的脓毒症的特征在于存在以下感染反应的两种或更多种症状：体温异常(优选地，低于36℃或高于38℃)、心率异常(优选地，大于90次/分钟)、呼吸频率异常(优选地，大于20次/分钟)或血气成分异常(优选地，CO2小于4.3kPa)以及白细胞数量异常(优选地，小于4×109/L或大于12×109/L或存在带状嗜中性粒细胞的组织)。
有利地，在本发明的研究中发现，包含免疫球蛋白的Fc部分和人B7-H1多肽的胞外部分的融合多肽可以用于有效治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭。具体地，研究发现上述融合多肽或其变体能够与细胞毒性T细胞结合，从而抑制脓毒症诱导的T细胞的细胞毒性并防止器官衰竭。此外，研究还发现B7-H1蛋白的下调使得在脓毒症期间自身免疫CTL(细胞毒性T细胞)被活化。保持B7-H1的表达或应用本发明的融合多肽可以显著改善肝脏损伤。从机理上看，活性氧(ROS)的形成使B7-H1下调。因此，优选地，通过施用本发明所述的融合多肽，可以抑制受试者的脓毒症诱导的细胞毒性T细胞。此外，优选地，施用后，它可诱导受试者的细胞毒性T细胞针对脓毒症引起的活化的持久耐受。因此，用于治疗和预防脓毒症的所述融合多肽的应用效果是惊人的。
上述术语的解释和定义适用于整个说明书。此外，下文列出了根据本发明使用的融合多肽的典型实施例。
在根据本发明的用途的融合多肽的优选实施例中，所述器官衰竭是CD8细胞毒性T细胞依赖性多器官衰竭。
在根据本发明的用途的融合多肽的另一个优选实施例中，所述免疫球蛋白是人IgG。
在根据本发明的用途的融合多肽的又一个优选实施例中，所述人B7-H1多肽胞外部分或其变体选自：
(a)具有被SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽；
(b)具有在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列的多肽；
(c)能够与PD1多肽结合且具有与(a)或(b)的多肽的氨基酸序列至少有70％相同的氨基酸序列的多肽；以及
(d)能够与PD1多肽结合的多肽，其具有基于(a)或(b)的氨基酸序列，包括以下氨基酸交换中的至少一种：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113Y和S117Y。
在根据本发明的用途的融合多肽的另一个优选实施例中，所述融合多肽包括：(iii)第三部分，其是能够与细胞毒性T细胞特异性结合的多肽。
更优选地，能够与细胞毒性T细胞特异性结合的所述多肽选自：包括能够结合CD8的MHC-I复合物的部分的多肽、能够与CD28结合的CD80的部分、作为能够与CD8特异性结合的抗体或其片段的多肽、作为能够与CD28特异性结合的抗体或其片段的多肽、以及与淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)的CD2结合部分。
在根据本发明的用途的融合多肽的优选实施例中，所述至少第一部分和所述至少第二部分永久或可逆地彼此连接。
在根据本发明的用途的融合多肽的又一个优选实施例中，所述受试者是哺乳动物，优选地，是人。
在根据本发明的用途的融合多肽的进一步优选的实施例中，所述融合多肽被大剂量应用一次，或者将被应用至少两次。
在根据本发明的用途的融合多肽的优选实施例中，所述融合多肽与至少一种其它的药物一起应用。
更优选地，所述至少一种其它的药物选自：抗生素、血管加压药、类固醇、抗凝剂、抗血栓形成剂、促炎细胞因子和DAMP抑制剂。
在根据本发明的用途的融合多肽的优选实施例中，所述融合多肽在施用时抑制受试者中的脓毒症诱导的细胞毒性T细胞。
在根据本发明的用途的融合多肽的另一个优选的实施例中，所述融合多肽在施用时诱导受试者中的细胞毒性T细胞针对脓毒症引起的活化的持久耐受。
此外，本发明涉及一种用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭用途的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明定义的融合多肽。
本文中，术语“多核苷酸”是指单链或双链DNA分子以及RNA分子。所述术语包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及这些分子种类的所有天然存在或人工修饰的衍生物。优选地，所述多核苷酸可以为线性或环状分子。而且，除了编码上述融合多肽的核酸序列之外，根据本发明的多核苷酸还可以包括正确转录和/或翻译所需的附加序列，例如5’-UTR序列或3’-UTR序列或剪接或维持RNA稳定性所需的序列。编码本发明所述的融合多肽的优选多核苷酸也在上文中进行了详细地描述。
在根据本发明的多核苷酸的优选实施例中，所述多核苷酸包含在允许在所述受试者中表达所述多核苷酸的表达构建体中。
本文中，术语“表达构建体”是指包括上述编码融合多肽的多核苷酸的异源多核苷酸以及与编码融合多肽的多核苷酸表达所需的异源核酸。通常，这样的异源核酸可以是启动子序列、增强子序列和/或诸如终止子的转录终止序列。此外，所述表达构建体还可以包括将表达构建体引入宿主所需的其它核酸。例如，如果需要在宿主细胞中表达，则所述表达构建体可以包括转化或转染所需的其它核酸以及为了在宿主细胞中增殖所导入的表达构建体的核酸。
优选地，本文涉及的表达构建体可以是载体。优选地，本文所述的载体包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及诸如细菌人造染色体或酵母人造染色体的人造染色体。优选地，包含编码融合多肽的多核苷酸的载体还包括用于在宿主中增殖和/或选择的选择性标记物。可以通过本领域公知的各种技术将载体整合到宿主细胞中。例如，可以将质粒载体导入诸如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物的沉淀物中、或导入带电脂质的复合物中、或导入诸如富勒烯的碳基簇中。可选地，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则可以将载体应用于宿主细胞之前使用合适的包装细胞系在体外包装所述载体。逆转录病毒载体可能具有复制能力或复制缺陷。在后一种情况下，病毒增殖通常只发生在补充宿主/细胞中。此外，多核苷酸通常与表达控制序列可操作地连接，从而实现在所述载体的原核或真核宿主细胞或其分离的片段中的表达。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在宿主细胞中表达的调节因子在本领域是公知的。优选地，所述调节因子包括确保转录开始的调控序列和/或确保转录终止和转录本稳定化的poly-A信号。其它调控因子可以包括转录和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可用的调控因子包括：例如，大肠杆菌中的lac-启动子、trp-启动子或tac-启动子。例如，允许在真核宿主细胞中表达的调控因子包括：酵母中的AOX1-启动子或GAL1-启动子或在哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。本发明设想的其它表达系统应允许在诸如基于多角体蛋白启动子系统的昆虫细胞中表达。而且，诱导型表达调控序列可用于本发明所包含的载体中。所述诱导型载体可以包括tet操纵子序列或lac操纵子序列或由热休克或其它环境因素诱导的序列。合适的表达调控序列是本领域公知的。除了负责转录开始的因子外，所述调控因子还可以包括多核苷酸下游的诸如SV40-聚腺苷酸(SV40-poly-A)位点或tk-poly-A位点转录终止信号。在本文中，合适的表达载体在本领域是已知的，例如，所述载体可以是Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)或pSPORT1(Invitrogen)，或杆状病毒派生的载体。优选地，所述载体是表达载体、基因转移或靶向载体。例如，源自逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒等病毒的表达载体可以用于将本发明所述表达构建体递送到靶细胞群，例如，所述靶细胞群也可用于基因治疗方法中。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体(参见诸如Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.以及Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中描述的技术)。
进一步地，可以设想将表达构建体引入宿主的基因组。在这种情况下，表达构建体还可以包括允许所述表达构建体异源整合或同源整合的核酸。因此，本文所述的表达构建体也可以是靶向构建体，从而，靶向构建体可以随机或定点整合到基因组DNA中。优选地，所述靶构建体包括足够长度的DNA，用于在侧翼同源重组或异源重组具有编码融合多肽的多核苷酸的表达盒。此外，也可以通过诸如Cre/LoxP或CRISPR/CAS的整合系统引入所述表达构建体。在这种情况下，所述表达构建体可以包括允许使用上述整合系统的其它核酸。基于所设想的整合系统，可以进行适当的修改/添加，这对本领域技术人员来说是公知的。
应该理解，本发明还提供了上文定义的融合多肽或多核苷酸在制备用于治疗和/或预防受试者器官衰竭的药物中的用途。典型地，所述融合多肽或多核苷酸以及待治疗的受试者或所提及的疾病具有上文定义的优选特征。
应该理解，本发明还提供了一种用于治疗和/或预防受试者器官衰竭的方法。
具体地，本发明提供了一种用于治疗患有脓毒症的受试者的器官衰竭的方法。所述方法包括：(a)向所述受试者施用治疗有效量的融合多肽，所述融合多肽包括：至少(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分，以及(ii)第二部分，其包括人B7-H1多肽的胞外部分或其变体；或(b)施用治疗有效量的编码所述融合多肽的多核苷酸。
本发明涉及的衰竭的器官的种类、待治疗的受试者、脓毒症和融合多肽或多核苷酸的典型方面如上所述，并且可以比照适用于本发明所述用于治疗和/或预防受试者器官衰竭的方法。
根据本发明所述方法的又一个典型方面，所述方法可以包括：在施用所述融合多肽或编码其的多核苷酸之前，通过确定是否有脓毒症来鉴定待治疗的受试者。
根据本发明所述方法的另一个典型方面，所述方法包括：在施用所述融合多肽之后，监测受试者的器官衰竭的体征，而且如果必要，再次或以不同的剂量施用所述编码融合多肽或多核苷酸的多核苷酸。
本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容以及本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。引用的全部参考文献可以在本文其它地方找到。
附图说明
图1示出了脓毒症小鼠肝脏中CD8+T细胞数量的增加。假手术(sham-operation)或盲肠结扎穿孔手术(CLP-operation)后24小时，处死小鼠。取出其肝脏以制备单细胞悬液。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)分析确定细胞亚群。每种治疗中定量提供五只小鼠。
图2示出了CLP术后肝脏中B7-H1、B7-DC、Fas和PD-1的表达。假手术或CLP术后24小时，处死小鼠。取出其肝脏以制备单细胞悬液。在图A和图C中制备全部裂解物以分析B7-H1、PD-1和Fas的表达。通过FACS分析进行B7-H(图B中)和B7-DC(图D中)表面表达的肝细胞特异性表达。所有实验至少进行五次。数据表示平均值±SD(*p<0.5)或显示代表性印迹。
图3示出了脂多糖(LPS)刺激或脂磷壁酸(LTA)刺激后Hep-6细胞中B7-H1的表达。在指定时间内，用100ng/ml LPS或100ng/ml LTA刺激Hepal-6细胞。之后获取细胞并分离mRNA或如材料和方法所述制备蛋白质裂解物。通过定量聚合酶链式反应(PCR)分析B7-H1(图A中)的mRNA表达。18s rRNA被用作管家基因。通过免疫印迹(Western)分析确定LPS刺激后的B7-H1(图B中)的蛋白表达。所有实验至少进行五次。数据表示平均值±SD(*p<0.5)或显示代表性印迹。
图4示出了LPS依赖性B7-H1的下调增强了CTL介导的细胞毒性。如材料和方法所述，从OT-I小鼠的脾中分离并富集的细胞毒性T细胞作为效应细胞。Hepal-6细胞用作靶细胞。在图A中，为了建立细胞毒性测定，用XY(μg/ml)的卵清蛋白肽257-264(OVA)或乙型肝炎病毒(HBV)对照肽脉冲处理Hepal-6细胞2小时。用LPS(100ng/ml)处理Hepal-6细胞24小时，对照不处理。之后，将Hepal-6细胞用CellTrackerOrangeTM染色，然后用细胞毒性T细胞(靶细胞与效应细胞比率为1：5)温育24小时。通过FACS分析确定存活的靶细胞的数目。定量进行5次独立实验。数据代表平均值±SD(*p<0.5)。在图B中，用编码B7-H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或对照载体(CV)的载体稳定转导Hepal-6细胞。FACS富集之后，在指定时间内，用LPS(100ng/ml)刺激阳性细胞，对照不处理。之后，将Hepal-6细胞用CellTrackerOrangeTM染色，然后用细胞毒性T细胞(靶细胞与效应细胞比率为1：5)温育24小时。通过FACS分析确定存活的靶细胞的数目。定量进行5次独立实验。数据代表平均值±SD(*p<0.5)。
图5示出了腺病毒B7-H1表达改善了CLP后的肝脏损伤。给小鼠静脉注射编码EGFP(adTrack)或B7-H1EGFP(adTrack B7-H1)的5×109个腺病毒颗粒。注射腺病毒颗粒4天后，通过CLP手术使小鼠患多微生物脓毒症。24小时后处死小鼠，取其肝脏并收集血液。在肝单细胞悬浮液中通过FACS分析测定转导效率，其中，门控非免疫细胞，即CD45-细胞，如图A所示。显示了一个代表性的结果。从血液中分离血清，并用Reflotron Plus血液学分析仪测定释放的丙氨酸氨基转移酶(ALT)/天门冬氨酸转氨酶(AST)，如B所示。显示4只小鼠中每只小鼠的结果。
图6示出了重组B7-H1Fc嵌合体能够预防脓毒症期间的肝脏损伤。在图A中，使用作为靶细胞的Hepal-6细胞和源自OT-I小鼠的作为效应细胞的CD8+T细胞测定细胞毒性T细胞依赖性肝细胞的杀伤性。用OVA257-264肽脉冲处理CellTrackerOrangeTM染色的Hepal-6细胞2小时。之后，将Hepal-6细胞与源自OT-I小鼠脾脏的富集的CD8+T细胞以5：1的比率(即，效应细胞：靶细胞＝5：1)一起培养。同时，以指定浓度添加重组B7-H1Fc。通过FACS分析检查存活的靶细胞的数目。定量进行5次独立实验。数据代表平均值±SD(*p<0.5)。在图B中，对野生型小鼠进行CLP手术。之后马上静脉注射B7-H1Fc。单独使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照溶剂。通过测定血清中释放的ALT/AST来评估CLP术后的肝脏损伤，其中，通过ReflotronPlus血液学分析仪测定血清中释放的ALT/AST(处理的B7-H1Fc vs.对照组；CLP；n＝5/5，*p<0.5)。
图7示出了通过添加GSH前体N-乙酰半胱氨酸(NAC)恢复B7-H1表达。用100ng/ml含有10mM NAC的LPS刺激Hepal-6细胞指定时间。之后，获取细胞并如材料和方法所述制备蛋白质裂解物。通过免疫印迹分析确定B7-H1蛋白的表达。所有实验至少进行五次。显示代表性的印迹。
图8示出了Nox4的抑制能够增强B7-H1的表达。将Hepal-6细胞用Nox4特异性抑制剂GKT137831(10μM)处理24小时。之后，获取细胞并通过FACS分析确定B7-H1的表达。在图A中，定量进行5次独立实验。在图B中，在Nox4整体敲除的小鼠的肝匀浆中，通过免疫印迹(Western blotting)法检查B7-H1蛋白表达。显示代表性的印迹。在图C中，显示了量化的B7-H1表达(野生型(WT)vs.Nox4-KO；n＝5/5；*p<0.5)。在肝单个细胞悬液中，通过FACS分析门控CD45-，即如材料和方法中所述的非免疫细胞，研究CLP术后引发的多微生物脓毒症中肝细胞上的B7-H1表达。在图D中，显示了量化值(假手术vs.CLP，WT假手术设为1；n＝5/5/5/5；*p<0.5)。在图E中，通过测定血清中释放的ALT/AST来评估CLP术后的Nox4整体敲除的小鼠的肝脏损伤，其中，通过Reflotron Plus血液学分析仪测定血清中释放的ALT/AST(NOX4-KO；假手术vs.CLP；n＝5/5，*p<0.5)。
图9示出了脓毒症期间，Nox2整体敲除能够恢复肝脏中B7-H1的表达。使用Nox2整体敲除(Nox2-KO)和骨髓谱系特异性Nox2敲除(LysM-Cre Nox2-KO)以及野生型同窝仔(WT)的小鼠。在CLP或假手术术后24小时，处死小鼠。收集血液并移除其肝脏。在图A中，在肝单个细胞悬液中，通过FACS分析门控CD45-，即如材料和方法中所述的非免疫细胞，确定肝细胞上的B7-H1蛋白表达(WT vs.NOX2-KO vs.LysM-Cre NOX2-KO；假手术vs.CLP；经过假手术处理的WT设置为1；n＝5/5/5；*p<0.5)。在图B中，从血液中分离血清，通过Reflotron Plus血液分析仪测定释放的ALT/AST(LysM-Cre NOX2-KOvs.NOX2-KO；假手术vs.CLP；n＝5/5/5/5；*p>0.5)。
图10示出了在脓毒症期间维持B7-H1表达的一种新的治疗方法。在图A中，在多微生物脓毒症期间，肝Nox2最有可能响应诸如LPS或LTA的细菌组分形成活性氧(ROS)。这些ROS下调了肝细胞表面上的共抑制性蛋白B7-H1的表达，从而能够以自身免疫方式允许细胞毒性T细胞(CTL)活化。通过ROS产生酶Nox2(如图B所示)的的基因缺失或外源给予重组B7-H1(如图C所示)，可以维持B7-H1的表达，这可以保持CTL耐受性，从而改善脓毒症的疗效。
具体实施方式
仅由下列示例来说明本发明。然而，所述示例不应理解为限制本发明的范围。
示例1：细胞毒性T细胞(CTL)在脓毒症小鼠的肝脏中积累
在脓毒症期间，器官衰竭经常伴随着多器官功能障碍综合征(MODS)，这常常会导致患者死亡。因此，只有理解了导致器官损伤的机制，才能改善现有的护理或建立新的治疗方法。Von Knethen等2015证明了在小鼠脓毒症模型中，能够以自身免疫方式活化CTL，同时，在所述小鼠脓毒症模型，显示D8+T细胞的活化与肝脏损伤有关(Wesche Soldato etal,2007a)。为了表现其基本的原理，分别分析了假手术术后和CLP术后的小鼠肝脏中的CTL的数量。如图1所示，可以发现相比于假手术术后小鼠或对照小鼠，CLP术后24小时，脓毒症小鼠的肝脏中CTL的数量增加。这个结果表明活化诱导CTL迁移到肝组织中。
示例2：B7-H1的表达在多微生物脓毒症模型中下调
通常，诸如B7-H1(也称为CD274或PD-L1)或B7-DC(也称为CD273或PD-L2)的共抑制性蛋白会阻碍自身免疫性CTL的活化(Butte et al,2007；Sharpe et al,2007)。这些共抑制性蛋白通常在抗原呈递细胞(APC)上表达，而且，在多微生物脓毒症模型中，所述细胞最有可能是肝细胞(Ueki et al,2011)。因此，从CLP术后的肝脏中分析这些共抑制因子的表达。B7-H1的表达在总蛋白水平(图2A所示)和细胞表面上(图2B所示)下调。相反，其受体PD-1的mRNA和蛋白表达没有改变(如图2C所示)。已知在调节小鼠和人体的免疫反应中发挥重要作用的Fas(也称为CD95，为Fas配体的受体)的表达也未改变(如图2C所示)(Galle etal,1995；Hanabuchi et al,1994)。B7-DC的总蛋白表达非常低(数据未显示)，在CLP术后24小时内，B7-DC的细胞表面表达不改变(如图2D所示)。
示例3：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁组分下调了Hep-6细胞中的B7-H1的表达
肝细胞的原代培养物表达了所有TLR的mRNA并响应TLR2和TLR4配体(Seki andBrenner,2008)。因此，在脓毒症期间，从肝脏中得到的细菌的组分可以使肝细胞中B7-H1的表达降低。为了阐明引起这种下调的机制，建立了基于鼠肝细胞瘤细胞系Hepal-6的细胞培养模型(Darlington,1987)。已经证实，该细胞系表达TLR2和TLR4(Matsumura et al,2000；Romics et al,2004)。为了模拟细菌感染，用革兰氏阴性细菌的细胞壁成分LPS和革兰氏阳性细菌的细胞壁成分LTA处理Hepal-6细胞。如图3所示，经过两种细菌组分刺激的B7-H1的表达在mRNA(如图3A所示)和蛋白质水平(如图3B所示)上随着时间的增长而降低。然而，LPS或LTA的刺激是否会使肝细胞更容易受CTL依赖性细胞毒性的影响以及维持B7-H1的表达是否能防止自身免疫CTL的活化仍然难以确定。
示例4：LPS处理的Hepal-6细胞更易受CTL依赖性细胞毒性的影响
为了阐明LPS或LTA的刺激是否会使肝细胞更易受CTL依赖性细胞毒性的影响或维持B7-H1的表达是否能防止自身免疫CTL的活化，使用源自OT-1小鼠(haplo type H2Kb)的作为效应细胞的CTL(Clarke et al,2000)和最初源自C57L小鼠(单倍型H2Kb)作为靶细胞的Hepal-6细胞建立同基因细胞毒性测定。将Hepal-6细胞用LPS处理24小时，对照保持原状。之后，用源自HBV表面抗原(HBsAg)的卵清蛋白肽257-264(OVA257-264)或乙型肝炎病毒(HBV)衍生的肽ILSPFLPLL脉冲处理细胞2小时，作为对照。将细胞在PBS中洗涤两次，用CellTrackerOrangeTM染色，并用CTL按照1：5(靶细胞：效应细胞)的比率温育细胞24小时。通过FACS分析确定存活的细胞。在对照组中，即，用CTL温育的未处理的Hepal-6细胞，大约有50％的靶细胞被杀死(如图4A所示)。在用LPS刺激Hepa1-6细胞后，当用OVA257-264肽脉冲处理Hepal-6细胞时，细胞毒性增强，约有70％的靶细胞被杀死。相比之下，经过HBV肽脉冲处理的Hepa1-6细胞被杀死的明显少于经过CTL肽脉冲处理被杀死的。
示例5：B7-H1的过表达能够保护Hepal-6细胞免受CTL依赖性细胞毒性的影响
为了验证在体外维持B7-H1的表达能够阻断CTL依赖性细胞毒性，通过使用编码和EGFP连接的B7-H1的慢病毒载体稳定转导Hepal-6细胞。通过FACS分选后，测定这些过表达的B7-H1细胞以及对照病毒转导的细胞的细胞毒性(如图4B所示)。不出所料，过表达的B7-H1细胞能够免受CTL依赖性细胞毒性的杀伤(如图4B中的白色柱形图所示)。然而，在对照组中，在没有LPS刺激的情况下，约有50％的病毒转导的细胞被细胞毒性杀死。并且，经过LPS(100ng/ml)处理后，随着时间的增长，被杀死的细胞越来越多。(如图4B中的黑色柱形图所示)。
示例6：维持B7-H1的表达能够抑制CLP术后的肝脏损伤
为了研究体内多微生物脓毒症小鼠模型中的病理生理学作用，建立了一种在肝脏中过表达B7-H1的腺病毒方法。图5A示出了可以实现约70％的肝细胞转导效率。4天之内不处理小鼠，使其从腺病毒转导中恢复，这会诱导小鼠的抗病毒免疫反应。24小时后，对小鼠进行CLP手术。然后处死小鼠，并且从小鼠血液中分离血清以通过分析肝脏损伤标记物ALT和AST来确定疾病的严重程度。如图5B所示，B7-H1的过表达改善了肝脏损伤，即显著降低了ALT/AST的浓度。维持B7-H1的表达是一种治疗方法，其可以通过外源添加B7-H1来实现。在使用OVA257-264脉冲的作为靶细胞的Hepal-6和源自OT-I小鼠的作为效应细胞CTL进行体外细胞毒性测定时，可以同时加入重组B7-H1Fc嵌合体抑制CTL介导的细胞毒性(如图6A所示)。虽然1μg/ml的重组B7-H1Fc嵌合体不能改变细胞毒性对靶细胞的杀伤力，但是5μg/ml的重组B7-H1Fc嵌合体可以将靶细胞的存活率提高约50％。然而，当浓度增加到20μg/ml时，重组B7-H1Fc嵌合体不会增加靶细胞的存活率。为了将体外结果转化为体内情况，CLP术后，直接将重组B7-H1Fc嵌合体静脉(i.v.)注射到尾静脉。24小时后，收集小鼠的血液并制备血清。测定释放的肝脏损伤标记物ALT/AST。如图6B所示，重组B7-H1Fc嵌合体的应用显著降低了释放的ALT/AST的量，这表明体内脓毒症的疗效得到了改善。
示例7：B7-H1的ROS依赖性下降
LPS和LTA通过靶细胞上的不同Toll样受体(TLRs)起作用，例如，所述受体包括用于LTA的TLR2和用于LPS的TLR4。已经证实，与这些受体的结合能够触发各种信号级联反应，即NADPH氧化酶介导的氧化还原信号。已经证实，NADPH氧化酶NOx4会组成性地生成活性氧(ROS)，包括：O2-或H2O2(Dikalov et al,2008)。近期的数据支持下列假设：生成的O2-不仅可以杀死病原体，还能作为第二信使(Brune et al,2013)。为了研究ROS依赖性机制是否能够引起B7-H1的降低，在仅用LPS或LPS与N-乙酰半胱氨酸(NAC)的组合物处理的Hepa1-6细胞中测定ROS的形成。通过ROS抑制剂NAC的处理，能够恢复B7-H1的表达(参见图7与图3B的对比)。
示例8：Nox4的抑制能够增强B7-H1的表达
已经证实，NADPH氧化酶4(Nox4)能在Hepal-6细胞中表达(Boudreau et al,2009)并能促使组成性地生成H2O2，而且，通过刺激，可以提高H2O2的生成。为了评估Nox4是否在调节B7-H1的表达中起作用，在无需任何其它处理的条件下，将Hepal-6细胞与特异性Nox4抑制剂GKT137S31[10μM]一起温育24小时(Jiang et al,2012)。如图8A所示，在Hepal-6细胞中，Nox4的抑制使B7-H1的表面表达提高了约50％。此外，取出Nox4整体敲除小鼠的肝脏，并且通过Western分析法分析总裂解物。图8B示出了与野生型对照组相比，在Nox4缺失的小鼠肝脏中，B7-H1的表达上调了。图8C中示出的密度定量表明：在Nox4敲除的小鼠肝脏中，B7-H1的表达约比对照组高出两倍。通过分析肝细胞中B7-H1的表面表达，发现其增加与B7-H1的表达的增加类似(如图8D中左侧柱状图所示)。在CLP模型中使用这些小鼠，可以在野生型小鼠和敲除型小鼠中观察到B7-H1表达的下调(如图8D中右侧柱状图所示)。然而，相比于24小时后，通过CLP手术诱导脓毒症型野生型小鼠，Nox4缺失细胞中B7-H1的表达仍然稍高。即便如此，Nox4敲除小鼠的疾病严重程度还是没有改善(如图8E所示)。因此，可以排除通过阻断Nox4的活性来改善脓毒症存活率的手段。
示例9：在多微生物脓毒症期间，Nox2整体缺失能够防止B7-H1下调
接下来，使用Nox2整体敲除(Nox2-KO)和骨髓谱系特异性NOx2敲除(LysM-CreNox2-KO)的小鼠来评估实验性脓毒症模型。如图9A所示，假手术术后24小时，在三种基因型中，肝细胞中B7-H1的表达相似。有趣的是，在CLP术后24小时，野生型(黑色柱)Nox2缺失的小鼠和骨髓谱系(灰色柱)中Nox2缺失的小鼠的B7-H1的表达都下调，而在Nox2整体敲除(白色柱)的小鼠中，B7-H1的表达依然保持较高水平。在骨髓谱系的Nox2缺失(图9B，灰色柱)的小鼠中，释放在血清中的肝脏损伤标记物会使ALT和AST显著增加，但是，在Nox2整体敲除(图9B，白色柱)的小鼠中，变化不明显。
示例10：通用方法和材料
通过将携带条件性loxP侧翼Nox2等位基因(NOX2fl/fl)的C57Bl/6小鼠(由英国伦敦国王学院伦敦BHF优化中心的Shah教授提供)与C57Bl/6N-(Tg)LysM-Cre转基因小鼠交配，得到骨髓谱系特异性NOx2敲除小鼠，其中，Cre重组酶已经敲入LysM启动子的后面(Akiyama et al,2002；Cui et al,2002；Hennet et al,1995；Hume,2011；Schmidt et al,2011)。所用的Nox2整体敲除的小鼠、Nox4整体敲除的小鼠以及野生型小鼠也是基于C57B1/6的背景。将小鼠在温控室内按照12h光照/12h黑暗的循环条件饲养。小鼠被饲养在顶部设有过滤器的笼子里，自由供应实验室标准食物和水。通过尾部DNA的PCR确定基因型，并且通过mRNA分析来证实Nox2缺失和Nox4的缺失(数据未显示)。所有动物实验按照Hessian动物护理和使用委员会(授权号F144/15)批准的指导方针进行。
执行先前所述的CLP模型(Rittirsch et al,2009)，或者对假手术术后的小鼠(假手术)不进行结扎和穿孔。简而言之，小鼠麻醉时，每公斤小鼠使用100mg/200mg的氯胺酮
Figure BDA0001563449880000171
/赛拉嗪
Figure BDA0001563449880000172
以无菌的方式进行中线剖腹切口，将盲肠的三分之一结扎在回盲瓣的远端，注意不要破坏盲肠的连续性。用20号针刺穿结扎的部分。立即给术后的小鼠腹腔注射1ml 0.9％的NaCl和按照0.5mg/kg的量皮下注射丁丙诺啡，在接下来的时间里，每隔6小时注射丁丙诺啡
Figure BDA0001563449880000173
CLP术后24小时，处死小鼠，解剖脾脏并制备单细胞悬液。根据DynabeadsFlowComp小鼠CD8试剂盒(由德国海德堡的Life Sciences委员会提供)的使用说明书，将所述试剂盒用于通过从脾脏中进行阳性选择，而使CD8+T细胞富集到大于95％。使用抗CD8a-FITC标记物的抗体(由德国下萨克森州的弗里索伊特的EuroBioScience委员会提供)，通过FACS分析验证纯度。在一些实验中，心脏穿孔之前，采集血液并且分离血清，以测定两个肝脏损伤标记物丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶。使用Reflotron Plus血液学分析仪(由德国曼海姆的Roche Diagnostics公司提供)和相应的测试条分析两种酶的量。当肝脏被移除时，用PBS冲洗器官。之后，解剖肝脏并制备单细胞悬液。用CellTrackerTMOrange(由德国法兰克福的Life Technologies股份有限公司提供)染色后，将这些细胞和富集的CTL一起直接用于共培养细胞毒性的测定。
将Hepal-6细胞(Darlington,1987)在添加有100U/ml青霉素(PAA实验室)、100μg/ml链霉素(PAA实验室)和10％热灭活的胎牛血清(PAA实验室)的RPMI1640(PAA实验室)培养。
为了在体外过表达小鼠B7-H1，我们使用以下引物对(NM_021893)通过PCR扩增源自小鼠Hepal-6细胞的mRNA的B7-H1，其中，所述引物对包括：正向5’-CGC CCG GGG GGG ATCATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC AC A-3’；以及反向5’TCA AGC TTG CAT GCC TTACTT GTA CAG CTC GTC CA-3’。所述引物用于将mB7-H1克隆到慢病毒载体pSEW(Demaisonet al,2002)中，其中，所述载体位于pSEW载体中的EGFP编码序列之前。B7-H1的编码序列显示为斜体。用BamHI线性化pSEW后，用InFusion系统(由法国曼昂莱的Takara Bio Europe，公司提供)插入扩增的mB7-H1片段。通过测序验证正确的序列。为了在体内将B7-H1转导入小鼠肝脏，将pSEW载体中的B7-H1EGFP亚克隆到adEasy腺病毒载体系统的pShuttle-CMV载体中(Luo et al,2007)。使用下列引物对：正向5’-GAT CCG CTA GAG ATC GCC ACC ATGAGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC ACA GC-3’，反向5’-TCC GGT GGA TCG GAT TTA CTTGTA CAG CTC GTC CAT GCC-3’，其中，包含将侧翼序列适当的InFusion克隆到pShuttle-CMV的BglII/EcoRV位点。B7-H1(正向引物)和EGFP(反向引物)的编码序列显示为斜体。通过测序验证正确的序列。作为阴性对照，使用仅编码EGFP的pAdTrack载体。
为了制备腺病毒，将Ad-293细胞接种到75cm2的烧瓶中，其中，所述烧瓶中包含DMEM(高葡萄糖，Glutamax)、10％的胎牛血清(FCS)、按照1:100比例添加的聚萘二甲酸乙二醇酯/链霉素、按照1:100比例添加的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、以及按照1:100比例添加的非必需氨基酸。4天后，用1ml胰蛋白酶分离细胞。加入9ml培养基并将细胞在500g下离心5分钟。在10ml培养基中重新悬浮颗粒后，将3.5ml培养基接种到2个175cm2的烧瓶中。三天后，用2ml胰蛋白酶将细胞分别从2个175cm2烧瓶中分离。加入9ml培养基，离心细胞，重新悬浮颗粒，然后将其分配到16个175cm2烧瓶。4天后，从完全融合的细胞中移出培养基。在8个50ml试管中各加入29ml温热的培养基，在15ml试管中加入7.5ml温热的培养基。将0.5ml病毒原液[1×1011个粒子/ml]在室温(RT)下解冻。将病毒原液加入到15ml的试管中，通过吸管上下吸移将其混合。将1ml稀释的腺病毒转移到每个50ml的试管中。密封混合后，将15ml稀释的腺病毒加入到每个烧瓶中。将烧瓶在培养箱中温育4小时。然后，将15ml预热的培养基加入到每个烧瓶中。3天后，将大多数感染细胞作为簇分离。未感染的细胞仍然散开附着在塑料上。介质是淡黄色的。通过用手轻拍烧瓶来分离细胞。将培养基转移至10个50ml的试管中，并在4℃以500g离心5min。除去上清液。轻轻摇动试管。将3份1ml的培养基转移到3个试管中。首先，使用1ml过滤嘴，在1ml培养基中重新悬浮三种颗粒。将重新悬浮的细胞转移到冷冻小瓶中，其中，所述小瓶在液氮中快速冷冻并转移到-80℃冷冻机中。为了纯化腺病毒颗粒，将10个小瓶的细胞经过4次快速解冻/冷冻循环以制备细胞裂解物。将裂解物转移到15ml的试管中，并在4℃以1500g离心10分钟。同时，制备6个CsCl梯度，包括：向每个超速离心管中加入4ml含有40％CsCl的PBS溶液；然后，用4.5ml含有15％CsCl的PBS仔细叠加在上述溶液上；将澄清的细胞裂解物转移到50ml的试管中，用培养基填充至18ml并通过吸管混合；将3ml澄清的裂解物转移到每个CsCl梯度上；超速离心管被转移到转子的转头上；调整相应的转头对的重量；温度为4℃，将CsCl梯度在25,400rpm下离心约17小时，其中，加速和减速值均设为1；以及离心后，小心地取出试管。通过把与2ml注射器连接的23G针头插入下部病毒带的下方来收集病毒。收集3个超速离心管的病毒并将其加载到3ml载玻片盒(10kDa)(由德国达姆施塔特的Thermo Scientifc公司提供)中。将病毒颗粒在2L冰冷的PBS溶液中透析4小时。然后，改变PBS溶液并将透析延长至12小时。之后，收集病毒并将其转移至放在冰上的15ml的试管中。将等分试样转移到冷冻的试管中，速冻并在-80℃下储存。应用噬斑试验确定菌落形成单位的能力。根据转导基因的EGFP标签，可以通过荧光显微镜进行评估。为了实现小鼠转导，在100μl的PBS溶液中使用5×1010个感染性颗粒。
为了实现细胞毒性测定，将源自C57B1/6N OT-I小鼠(单倍型H-2b)的脾脏中的作为效应细胞的CD8+T细胞与来自C57L菌株(单倍型H-2b)的作为靶细胞的Hepal-6细胞共温育24小时。在此之前，用卵清蛋白(OVA)肽257-264(美国弗里蒙特的AnaSpec公司提供)或源自HBsAg的乙型肝炎病毒(HBV)肽ILSPFLPLL(由德国哥廷根的IBA公司提供)脉冲Hepal-6细胞2小时作为对照或不处理Hepal-6细胞作为对照。载入抗原后，在添加CD8+T细胞之前，用CellTrackerTMOrange(由德国法兰克福的Life Technologies股份有限公司提供)对Hepal-6细胞进行染色。24小时后，通过FACS分析(由德国海德堡的BD FACS Fortessa公司提供)确定存活的靶细胞。
根据制造商说明书的规定，使用peqGOLD RNAPure试剂盒(由德国埃朗根的Peqlab公司提供)从5×105个CD8+T细胞、Hepal-6细胞或原发性肝细胞中分离出总RNA。用iScriptTMcDNA合成试剂盒(由德国慕尼黑的Bio-Rad公司提供)将2μg RNA逆转录为互补的DNA(cDNA)。根据分销商说明书的规定，使用iQTM
Figure BDA0001563449880000191
Green Supermix(由Bio-Rad提供)进行定量PCR(qPCR)。使用Bio-Rad提供的CFX实时PCR系统进行qPCR测量和数据分析。选择以下用于鼠类靶细胞的引物对(由德国乌尔姆的Biomers提供)：B7-H1(NM_21893)正向：5’-TGC AGC AGT AAA CGC CTG CG-3’，反向：5’CGC TGC CAA AGG ACC AGC TT-3’；IL-2(NM_008366)正向：5’TGA GCA TCC TGG GGA GTT TC-3’，反向：5’-GTG ACC TCA AGT CCT GCAGG-3’；Fas-L(NM_010177)正向：5’-ACC AAC CAA AGC CTT AAA-3’，反向：5’-ATA CTT CACTCC AGA GAT-3’；颗粒酶B(NM_013542)正向：5’-CTC CAC GTG CTT TCA CCA AA-3’，反向：5’-GGA AAA TAG TAC AGA GAG GCA-3’；穿孔素(NM_O11073)正向：5’-TGC TAC ACT GCCACT CGG TCA-3’，反向：5’-TTG GCT ACC TTG GAG TGG GAG-3’。IFNγ(NM_008337)正向：5’-TTT GCA GCT CTT CCT CAT GG-3’，反向：5’-TCG CCT TGC TGT TGC TGA AG-3’。数值被归一化为18s rRNA。
将所有抗体和第二试剂滴定到最适浓度。使用抗小鼠Vα2TCR FITC抗体(由美国加州圣地亚哥的eBioscience公司提供)以及抗小鼠Vβ5.1、5.2TCR-PE抗体(由德国海德堡BDBioscience公司提供)，通过FACS分析鉴定OT1CD8+T细胞。使用CD16/CD32抗小鼠抗体将结合在OT1CD8+T细胞上的Fc受体在冰上封闭15分钟，随后在冰上温育T细胞的抗-CD8a-APC20分钟。使用抗B7-H-PE或抗B7-DC-PE，通过FACS分析确定原发性肝细胞表面上B7-H1和B7-DC的表面表达。通过CD45-FITC染色可以排除免疫细胞，这样就可以仅分析CD45-细胞。
通过Western分析能够分析B7-H1、B7-DC、PD-1、Fas和EGFP的表达。简而言之，使用PBS溶液洗涤等量的原发性肝细胞或Hepal-6细胞两次，在含有1x完全蛋白酶抑制剂混合物片(由瑞士巴塞尔的Roche公司提供)的RIPA缓冲液中进行裂解，并且通过10次脉冲进行超声处理。随后，当温度为4℃，在16,000g下离心10分钟。用SDS-PAGE样品缓冲液(包括：250mMTris pH 6.8、40％甘油、10％2-ME、8％SDS和0.02％溴酚蓝)将上清液在95℃下变性10分钟。通过Lowry(Bio-Rad)蛋白测定法保持可比较的蛋白浓度。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，并通过半干印迹将其转移到硝酸纤维素膜上。用5％BSA/TTBS封闭膜，随后将封闭膜与抗B7-H1-(R&D系统)、抗B7-DC-(Santa Cruz)、抗PD-1-(Santa Cruz)以及a-Fas抗体(Santa Cruz)在5％BSA/TBS的溶液中一起反应过夜，其中，温度保持为4℃。β-肌动蛋白(抗肌动蛋白，Sigma-Aldrich)的加样是标准化的。为了检测蛋白，将膜与5％BSA/TTBS中的IRDye第二抗体(由德国巴特洪堡的LI-COR公司提供)一起温育。用Odyssey红外成像系统对蛋白质进行可视化的密度分析。
每个实验至少进行三次。使用配对t检验进行统计分析。当P值小于或者等于0.05时，我们认为效果是显著的。否则，将显示代表性的数据。
整个说明书中引用的全部参考文献内容
Akiyama,T.E.,S.Sakai,G.Lambert,C.J.Nicol,K.Matsusue,S.Pimprale,Y.H.Lee,M.Ricote,C.K.Glass,H.B.Brewer,Jr.,and F.J.Gonzalez.2002.Conditionaldisruption of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma gene inmice results in lowered expression of ABCA1,ABCG1,and apoE in macrophages andreduced cholesterol efflux.Mol Cell Biol22:2607-2619.
Angus,D.C.,and T.van der Poll.2013.Severe sepsis and septic shock.NEngl J Med369:840-851.
Balk,R.A.2004.Optimum treatment of severe sepsis and septic shock:evidence in support of the recommendations.Dis Mon 50:168-213.
Bettaieb,A.,J.X.Jiang,Y.Sasaki,T.I.Chao,Z.Kiss,X.Chen,J.Tian,M.Katsuyama,C.Yabe-Nishimura,Y.Xi,C.Szyndralewiez,K.Schroder,A.Shah,R.P.Brandes,F.G.Haj,and N.J.Torok.2015.Hepatocyte Nicotinamide AdenineDinucleotide Phosphate Reduced Oxidase 4Regulates Stress Signaling,Fibrosis,and Insulin Sensitivity During Development of Steatohepatitis inMice.Gastroenterology doi:10.1053/j.gastro.2015.1004.1009.
Boudreau,H.E.,S.U.Emerson,A.Korzeniowska,M.A.Jendrysik,andT.L.Leto.2009.Hepatitis C virus(HCV)proteins induce NADPH oxidase 4expressionin a transforming growth factor beta-dependent manner:a new contributor toHCV-induced oxidative stress.J Virol 83:12934-12946.
Brune,B.,N.Dehne,N.Grossmann,M.Jung,D.Namgaladze,T.Schmid,A.vonKnethen,and A.Weigert.2013.Redox control of inflammation inmacrophages.Antioxid Redox Signal 19:595-637.
Butte,M.J.,M.E.Keir,T.B.Phamduy,A.H.Sharpe,andG.J.Freeman.2007.Programmed death-1ligand 1interacts specifically with theB7-1costimulatory molecule to inhibit T cell responses.Immunity 27:111-122.
Chen,L.2004.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28family in thecontrol of T-cell immunity.Nat Rev Immunol 4:336-347.
Clark,M.A.,L.D.Plank,A.B.Connolly,S.J.Streat,A.A.Hill,R.Gupta,D.N.Monk,A.Shenkin,and G.L.Hill.1998.Effect of a chimeric antibody to tumornecrosis factor-alpha on cytokine and physiologic responses in patients withsevere sepsis—a randomized,clinical trial.Crit Care Med 26:1650-1659.
Clarke,S.R.,M.Barnden,C.Kurts,F.R.Carbone,J.F.Miller,andW.R.Heath.2000.Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic lineOT-I:MHC elements for positive and negative selection.Immunol Cell Biol 78:110-117.
Cui,Y.,K.Miyoshi,E.Claudio,U.K.Siebenlist,F.J.Gonzalez,J.Flaws,K.U.Wagner,and L.Hennighausen.2002.Loss of the peroxisome proliferation-activated receptor gamma(PPARgamma)does not affect mammary development andpropensity for tumor formation but leads to reduced fertility.J Biol Chem277:17830-17835.
Darlington,G.J.1987.Liver cell lines.Methods Enzymol 151:19-38.
del Rio,M.L.,L.Buhler,C.Gibbons,J.Tian,and J.I.Rodriguez-Barbosa.2008.PD-l/PD-LI,PD-1/PD-L2,and other co-inhibitory signaling pathwaysin transplantation.Transpl Int 21:1015-1028.
Dellinger,R.P.,M.M.Levy,J.M.Carlet,J.Bion,M.M.Parker,R.Jaeschke,K.Reinhart,D.C.Angus,C.Brun-Buisson,R.Beale,T.Calandra,J.F.Dhainaut,H.Gerlach,M.Harvey,J.J.Marini,J.Marshall,M.Ranieri,G.Ramsay,J.Sevransky,B.T.Thompson,S.Townsend,J.S.Vender,J.L.Zimmerman,J.L.Vincent,C.InternationalSurviving Sepsis Campaign Guidelines,N.American Association of Critical-Care,P.American College of Chest,P.American College of Emergency,S.CanadianCritical Care,M.European Society of Clinical,D.Infectious,M.European Societyof Intensive Care,S.European Respiratory,F.International Sepsis,M.JapaneseAssociation for Acute,M.Japanese Society of Intensive Care,M.Society ofCritical Care,M.Society of Hospital,S.Surgical Infection,I.World Federationof Societies of,and M.Critical Care.2008.Surviving Sepsis Campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2008.Crit Care Med 36:296-327.
Demaison,C,K.Parsley,G.Brouns,M.Scherr,K.Battmer,C.Kinnon,M.Grez,andA.J.Thrasher.2002.High-level transduction and gene expression inhematopoietic repopulating cells using a human immunodeficiency[correction ofimunodeficiency]virus type 1-based lentiviral vector containing an internalspleen focus forming virus promoter.Hum Gene Ther 13:803-813.
Diaz-Cruz,A.,M.M.Vilchis-Landeros,R.Guinzberg,R.Villalobos-Molina,andE.Pina.2011.NOX2 activated by alpha 1-adrenoceptors modulates hepaticmetabolic routes stimulated by beta-adrenoceptors.Free Radic Res 45:1366-1378.
Dikalov,S.I.,A.E.Dikalova,A.T.Bikineyeva,H.H.Schmidt,D.G.Harrison,andK.K.Griendling.2008.Distinct roles of Noxl and Nox4 in basal and angiotensinII-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.Free Radic Biol Med45:1340-1351.
Docke,W.D.,F.Randow,U.Syrbe,D.Krausch,K.AsaduUah,P.Reinke,H.D.Volk,and W.Kox.1997.Monocyte deactivation in septic patients:restoration by IFN-gamma treatment.Nat Med 3:678-681.
Drummond,G.R.,and C.G.Sobey.2014.Endothelial NADPH oxidases:which NOXto target in vascular disease？Trends Endocrinol Metab 25:452-463.
Fife,B.T.,K.E.Pauken,T.N.Eagar,T.Obu,J.Wu,Q.Tang,M.Azuma,M.F.Krummel,and J.A.Bluestone.2009.Interactions between PD-1 and PD-L1 promote toleranceby blocking the TCR-induced stop signal.Nat Immunol 10:1185-1192.
Galle,P.R.,W.J.Hofmann,H.Walczak,H.Schaller,G.Otto,W.Stremmel,P.H.Krammer,and L.Runkel.1995.Involvement of the CD95(APO-l/Fas)receptor andligand in liver damage.J Exp Med 182:1223-1230.
Hanabuchi,S.,M.Koyanagi,A.Kawasaki,N.Shinohara,A.Matsuzawa,Y.Nishimura,Y.Kobayashi,S.Yonehara,H.Yagita,and K.Okumura.1994.Fas and itsligand in a general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity.Proc Natl AcadSci USA 91:4930-4934.
Hennet,T.,F.K.Hagen,L.A.Tabak,and J.D.Marth.1995.T-cell-specificdeletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by site-directed recombination.Proc Natl Acad Sci USA 92:12070-12074.
Hotchkiss,R.S.,and I.E.Karl.2003.The pathophysiology and treatment ofsepsis.N Engl J Med 348:138-150.
Hotchkiss,R.S.,K.W.McConnell,K.Bullok,C.G.Davis,K.C.Chang,S.J.Schwulst,J.C.Dunne,G.P.Dietz,M.Bahr,J.E.McDunn,I.E.Karl,T.H.Wagner,J.P.Cobb,CM.Coopersmith,and D.Piwnica-Worms.2006.TAT-BH4 and TAT-Bcl-xLpeptides protect against sepsis-induced lymphocyte apoptosis in vivo.JImmunol 176:5471-5477.
Hotchkiss,R.S.,and S.Opal.2010.Immunotherapy for sepsis—a newapproach against an ancient foe.N EnglJ Med 363:87-89.
Hume,D.A.2011.Applications of myeloid-specific promoters intransgenic mice support in vivo imaging and functional genomics but do notsupport the concept of distinct macrophage and dendritic cell lineages orroles in immunity.J Leukoc Biol 89:525-538.
Jiang,J.X.,X.Chen,N.Serizawa,C.Szyndralewiez,P.Page,K.Schroder,R.P.Brandes,S.Devaraj,and N.J.Torok.2012.Liver fibrosis and hepatocyteapoptosis are attenuated by GKT137831,a novel NOX4/NOX1 inhibitor invivo.Free Radic Biol Med 53:289-296.
Kaukonen,K.M.,M.Bailey,S.Suzuki,D.Pilcher,andR.Bellomo.2014.Mortality related to severe sepsis and septic shock amongcritically ill patients in Australia and New Zealand,2000-2012.JAMA 311:1308-1316.
Luo,J.,Z.L.Deng,X.Luo,N.Tang,W.X.Song,J.Chen,K.A.Sharff,H.H.Luu,R.C.Haydon,K.W.Kinzler,B.Vogelstein,and T.C.He.2007.A protocol for rapidgeneration of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.Nat Protoc 2:1236-1247.
Marquez-Velasco,R.,R.Bojalil,A.Buelna,F.Flores-Guzman,J.Estevez-Ramirez,J.Laguna,A.M.Hernandez,A.Diaz-Quinonez,and J.F.Paniagua-Solis.2006.Antitumor necrosis factor alpha F(ab')2 antibody fragments protectin murine polymicrobial sepsis:concentration and early intervention arefundamental to the outcome.Inflamm Res 55:378-384.
Matsumura,T.,A.Ito,T.Takii,H.Hayashi,and K.Onozaki.2000.Endotoxin andcytokine regulation of toll-like receptor(TLR)2 and TLR4 gene expression inmurine liver and hepatocytes.J Interferon Cytokine Res 20:915-921.
Meisel,C,J.C.Schefold,R.Pschowski,T.Baumann,K.Hetzger,J.Gregor,S.Weber-Carstens,D.Hasper,D.Keh,H.Zuckermann,P.Reinke,andH.D.Volk.2009.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to reversesepsis-associated immunosuppression:a double-blind,randomized,placebo-controlled multicenter trial.Am JRespir Crit Care Med 180:640-648.
Munford,R.S.,and J.Pugin.2001.Normal responses to injury preventsystemic inflammation and can be immunosuppressive.Am JRespir Crit Care Med163:316-321.
Ostrand-Rosenberg,S.,L.A.Horn,and S.T.Haile.2014.The programmeddeath-1 immune-suppressive pathway:barrier to antitumor immunity.J Immunol193:3835-3841.
Otto,G.P.,M.Sossdorf,R.A.Claus,J.Rodel,K.Menge,K.Reinhart,M.Bauer,andN.C.Riedemann.2011.The late phase of sepsis is characterized by an increasedmicrobiological burden and death rate.Crit Care 15:R183.
Pangault,C,Y.Le Tulzo,P.Tattevin,V.Guilloux,N.Bescher,andB.Drenou.2006.Down-modulation of granulocyte macrophage-colony stimulatingfactor receptor on monocytes during human septic shock.Crit Care Med 34:1193-1201.
Paterson,R.L.,H.F.Galley,and N.R.Webster.2003.The effect of N-acetylcysteine on nuclear factor-kappa B activation,interleukin-6,interleukin-8,and intercellular adhesion molecule-1 expression in patientswith sepsis.Crit Care Med 31:2574-2578.
Reinhart,K.,T.Menges,B.Gardlund,J.Harm Zwaveling,M.Smithes,J.L.Vincent,J.M.Tellado,A.Salgado-Remigio,R.Zimlichman,S.Withington,K.Tschaikowsky,R.Brase,P.Damas,H.Kupper,J.Kempeni,J.Eiselstein,andM.Kaul.2001.Randomized,placebo-controlled trial of the anti-tumor necrosisfactor antibody fragment afelimomab in hyperinflammatory response duringsevere sepsis:The RAMSES Study.Crit Care Med29:765-769.
Rittirsch,D.,M.S.Huber-Lang,M.A.Flierl,and P.A.Ward.2009.Immunodesignof experimental sepsis by cecal ligation and puncture.Nat Protoc 4:31-36.
Romics,L.,Jr.,A.Dolganiuc,K.Kodys,Y.Drechsler,S.Oak,A.Velayudham,P.Mandrekar,and G.Szabo.2004.Selective priming to Toll-like receptor 4(TLR4),not TLR2,ligands by P.acnes involves up-regulation of MD-2 in mice.Hepatology40:555-564.
Schmidt,M.V.,P.Paulus,A.M.Kuhn,A.Weigert,V.Morbitzer,K.Zacharowski,V.A.Kempf,B.Brune,and A.von Knethen.2011.Peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma-induced T cell apoptosis reduces survival during polymicrobialsepsis.Am J Respir Crit Care Med 184:64-74.
Seki,E.,and D.A.Brenner.2008.Toll-like receptors and adaptormolecules in liver disease:update.Hepatology 48:322-335.
Sharpe,A.H.,E.J.Wherry,R.Ahmed,and G.J.Freeman.2007.The function ofprogrammed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity andinfection.Nat Immunol 8:239-245.
Spencer,N.Y.,W.Zhou,Q.Li,Y.Zhang,M.Luo,Z.Yan,T.J.Lynch,D.Abbott,B.Banfi,and J.F.Engelhardt.2013.Hepatocytes produce TNF-alpha followinghypoxia-reoxygenation and liver ischemia-reperfusion in a NADPH oxidase-andc-Src-dependent manner.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 305:G84-94.
Sunshine,J.,and J.M.Taube.2015.PD-l/PD-Ll inhibitors.Curr OpinPharmacol 23:32-38.
Szakmany,T.,B.Hauser,and P.Radermacher.2012.N-acetylcysteine forsepsis and systemic inflammatory response in adults.Cochrane Database SystRev 9:CD006616.
Thomson,A.W.,and P.A.Knolle.2010.Antigen-presenting cell function inthe tolerogenic liver environment.Nat Rev Immunol 10:753-766.
Topalian,S.L.,C.G.Drake,and D.M.Pardoll.2012.Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1)pathway to activate anti-tumor immunity.Curr Opin Immunol 24:207-212.
Torgersen,C,P.Moser,G.Luckner,V.Mayr,S.Jochberger,W.R.Hasibeder,andM.W.Dunser.2009.Macroscopic postmortem findings in 235 surgical intensivecare patients with sepsis.Anesth Analg 108:1841-1847.
Ueki,S.,A.Castellaneta,O.Yoshida,K.Ozaki,M.Zhang,S.Kimura,K.Isse,M.Ross,L.Shao,D.B.Stolz,A.W.Thomson,A.J.Demetris,D.A.Geller,andN.Murase.2011.Hepatic B7homo log 1 expression is essential for controllingcold ischemia/reperfusion injury after mouse liver transplantation.Hepatology54:216-228.
van Dijk,K.W.,K.E.Kypreos,F.J.Fallaux,and J.Hageman.2011.Adenovirus-mediated gene transfer.Methods Mol Biol 693:321-343.
Venner,J.M.,K.S.Famulski,D.Badr,L.G.Hidalgo,J.Chang,andP.F.Halloran.2014.Molecular landscape of T cell-mediated rejection in humankidney transplants:prominence of CTLA4 and PD ligands.Am J Transplant 14:2565-2576.
Vincent,J.L.,J.C.Marshall,S.A.Namendys-Silva,B.Francois,I.Martin-Loeches,J.Lipman,K.Reinhart,M.Antonelli,P.Pickkers,H.Njimi,E.Jimenez,Y.Sakr,and I.investigators.2014.Assessment of the worldwide burden of criticalillness:the intensive care over nations(ICON)audit.Lancet Respir Med 2:380-386.
Vincent,J.L.,S.M.Opal,J.C.Marshall,and K.J.Tracey.2013.Sepsisdefinitions:time for change.Lancet 381:774-775.
von Knethen,A.,L.K.Sha,T.Knape,L.Kuchler,A.K.Giegerich,M.Schulz,LA.Hauser,and B.Brune.2015.Activation of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma counteracts sepsis-induced T cell cytotoxicitytoward alloantigenic target cells.J Mol Med(Berl)93:633-644.
Wesche-Soldato,D.E.,C.S.Chung,S.H.Gregory,T.P.Salazar-Mather,C.A.Ayala,and A.Ayala.2007a.CD8+T cells promote inflammation and apoptosis inthe liver after sepsis:role of Fas-FasL.Am J Pathol 171:87-96.
Wesche-Soldato,D.E.,R.Z.Swan,C.S.Chung,and A.Ayala.2007b.Theapoptotic pathway as a therapeutic target in sepsis.Curr Drug Targets 8:493-500。
序列表
<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会
<120> 用于治疗和预防器官衰竭的B7-H1融合多肽
<130> FH13448PC
<160> 25
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
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<220>
<221> source
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atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 180
agtagctaca gacagagggc ccggctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 240
cttcagatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggtgt accgctgcat gatcagctat 300
ggtggtgccg actacaagcg aattactgtg aaagtcaatg ccccatacaa caaaatcaac 360
caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag 420
ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag 480
accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga 540
atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600
aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660
act 663
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<211> 221
<212> PRT
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<220>
<221> SOURCE
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Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
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Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
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Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
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Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
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<220>
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attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
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290
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130 135 140
Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly Lys Arg
145 150 155 160
Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser
165 170 175
Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe
180 185 190
Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro
195 200 205
Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His
210 215 220
<210> 7
<211> 873
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> source
<222> 1..873
<223> /mol_type="DNA"
/organism="Mus musculus"
<400> 7
atgaggatat ttgctggcat tatattcaca gcctgctgtc acttgctacg ggcgtttact 60
atcacggctc caaaggactt gtacgtggtg gagtatggca gcaacgtcac gatggagtgc 120
agattccctg tagaacggga gctggacctg cttgcgttag tggtgtactg ggaaaaggaa 180
gatgagcaag tgattcagtt tgtggcagga gaggaggacc ttaagcctca gcacagcaac 240
ttcaggggga gagcctcgct gccaaaggac cagcttttga agggaaatgc tgcccttcag 300
atcacagacg tcaagctgca ggacgcaggc gtttactgct gcataatcag ctacggtggt 360
gcggactaca agcgaatcac gctgaaagtc aatgccccat accgcaaaat caaccagaga 420
atttccgtgg atccagccac ttctgagcat gaactaatat gtcaggccga gggttatcca 480
gaagctgagg taatctggac aaacagtgac caccaacccg tgagtgggaa gagaagtgtc 540
accacttccc ggacagaggg gatgcttctc aatgtgacca gcagtctgag ggtcaacgcc 600
acagcgaatg atgttttcta ctgtacgttt tggagatcac agccagggca aaaccacaca 660
gcggagctga tcatcccaga actgcctgca acacatcctc cacagaacag gactcactgg 720
gtgcttctgg gatccatcct gttgttcctc attgtagtgt ccacggtcct cctcttcttg 780
agaaaacaag tgagaatgct agatgtggag aaatgtggcg ttgaagatac aagctcaaaa 840
aaccgaaatg atacacaatt cgaggagacg taa 873
<210> 8
<211> 290
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..290
<223> /mol_type="protein"
/organism="Mus musculus"
<400> 8
Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu
35 40 45
Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val
50 55 60
Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn
65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp
130 135 140
Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro
145 150 155 160
Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly
165 170 175
Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val
180 185 190
Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys
195 200 205
Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile
210 215 220
Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp
225 230 235 240
Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val
245 250 255
Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys
260 265 270
Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 9
<211> 459
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..459
<223> /mol_type="protein"
/note="B7-H1 (Phe19-Thr239)-Linker(DIEGRMD)-IgG1(Pro100-Lys330)"
/organism="Homo sapiens"
<400> 9
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Asp Ile Glu
210 215 220
Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> source
<222> 1..45
<223> /mol_type="DNA"
/note="forward primer"
/organism="Mus musculus"
<400> 10
cgcccggggg ggatcatgag gatatttgct ggcattatat tcaca 45
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> source
<222> 1..35
<223> /mol_type="DNA"
/note="reverse primer"
/organism="Mus musculus"
<400> 11
tcaagcttgc atgccttact tgtacagctc gtcca 35
<210> 12
<211> 53
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> source
<222> 1..53
<223> /mol_type="DNA"
/note="forward primer for cloning"
/organism="Mus musculus"
<400> 12
gatccgctag agatcgccac catgaggata tttgctggca ttatattcac agc 53
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<211> 39
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> source
<222> 1..39
<223> /mol_type="DNA"
/note="reverse primer for cloning"
/organism="Mus musculus"
<400> 13
tccggtggat cggatttact tgtacagctc gtccatgcc 39
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer B7-H1 forward"
/organism="Homo sapiens"
<400> 14
tgcagcagta aacgcctgcg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer B7-H1 reverse"
/organism="Homo sapiens"
<400> 15
cgctgccaaa ggaccagctt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer IL-2 forward"
/organism="Homo sapiens"
<400> 16
tgagcatcct ggggagtttc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer IL-2 reverse "
/organism="Homo sapiens"
<400> 17
gtgacctcaa gtcctgcagg 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..18
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer Fas-L forward"
/organism="Homo sapiens"
<400> 18
accaaccaaa gccttaaa 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..18
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer Fas-L reverse"
/organism="Homo sapiens"
<400> 19
atacttcact ccagagat 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer granzyme B forward"
/organism="Homo sapiens"
<400> 20
ctccacgtgc tttcaccaaa 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..21
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR Primer granzyme B reverse"
/organism="Homo sapiens"
<400> 21
ggaaaatagt acagagaggc a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..21
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer perforin forward"
/organism="Homo sapiens"
<400> 22
tgctacactg ccactcggtc a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..21
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer perforin reverse"
/organism="Homo sapiens"
<400> 23
ttggctacct tggagtggga g 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer IFNγ forward "
/organism="Homo sapiens"
<400> 24
tttgcagctc ttcctcatgg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> source
<222> 1..20
<223> /mol_type="DNA"
/note="qPCR primer IFNγ reverse"
/organism="Homo sapiens"
<400> 25
tcgccttgct gttgctgaag 20

Claims (25)

1.一种融合多肽在制备用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的肝衰竭的药剂中的用途，该融合多肽至少包括：
(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分；以及
(ii)第二部分，其由人B7-H1多肽的胞外部分或其变体组成，
其中，所述人B7-H1多肽的胞外部分或其变体选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示的多肽；以及
(b)有且仅有至少一种以下氨基酸替换，且能够与PD1多肽结合的(a)中所述的多肽：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113Y和S117Y。
2.根据权利要求1的用途，其中，所述肝衰竭是CD8细胞毒性T细胞依赖性的肝衰竭。
3.根据权利要求1的用途，其中，所述免疫球蛋白是人IgG。
4.根据权利要求1的用途，其中，所述融合多肽包括：
(iii)第三部分，其是用于靶向的能够与细胞毒性T细胞特异性结合的多肽，
其中，所述能够与细胞毒性T细胞特异性结合的多肽选自：包括能够结合CD8的MHC-I复合物的部分的多肽、能够与CD28结合的CD80的部分、作为能够与CD8特异性结合的抗体或其片段的多肽、作为能够与CD28特异性结合的抗体或其片段的多肽、以及与淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)的CD2结合部分。
5.根据权利要求1的用途，其中，所述至少第一部分和所述至少第二部分永久或可逆地彼此连接。
6.根据权利要求1的用途，其中，所述受试者是哺乳动物。
7.根据权利要求1的用途，其中，所述受试者是人。
8.根据权利要求1的用途，其中，所述融合多肽将被大剂量应用一次，或者将被应用至少两次。
9.根据权利要求1的用途，其中，所述融合多肽将与至少一种其它的药物一起应用。
10.根据权利要求9的用途，其中，所述至少一种其它的药物选自：抗生素、血管加压药、类固醇、抗凝剂、抗血栓形成剂、促炎细胞因子和DAMP抑制剂。
11.根据权利要求1的用途，其中，所述融合多肽在施用时抑制受试者中的脓毒症诱导的细胞毒性T细胞。
12.根据权利要求1的用途，其中，所述融合多肽在施用时诱导受试者中的细胞毒性T细胞针对脓毒症引起的活化的持久耐受。
13.一种多核苷酸在制备用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的肝衰竭的药剂中的用途，所述多核苷酸编码融合多肽，该融合多肽至少包括：
(i)第一部分，其是免疫球蛋白的Fc部分；以及
(ii)第二部分，其由人B7-H1多肽的胞外部分或其变体组成，
其中，所述人B7-H1多肽的胞外部分或其变体选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示的多肽；以及
(b)有且仅有至少一种以下氨基酸替换，且能够与PD1多肽结合的(a)中所述的多肽：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113Y和S117Y。
14.根据权利要求13的用途，其中，所述多核苷酸包含在允许在所述受试者中表达所述多核苷酸的表达构建体中。
15.根据权利要求13的用途，其中，所述肝衰竭是CD8细胞毒性T细胞依赖性的肝衰竭。
16.根据权利要求13的用途，其中，所述免疫球蛋白是人IgG。
17.根据权利要求13的用途，其中，所述融合多肽包括：
(iii)第三部分，其是用于靶向的能够与细胞毒性T细胞特异性结合的多肽，
其中，所述能够与细胞毒性T细胞特异性结合的多肽选自：包括能够结合CD8的MHC-I复合物的部分的多肽、能够与CD28结合的CD80的部分、作为能够与CD8特异性结合的抗体或其片段的多肽、作为能够与CD28特异性结合的抗体或其片段的多肽、以及与淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)的CD2结合部分。
18.根据权利要求13的用途，其中，所述至少第一部分和所述至少第二部分永久或可逆地彼此连接。
19.根据权利要求13的用途，其中，所述受试者是哺乳动物。
20.根据权利要求13的用途，其中，所述受试者是人。
21.根据权利要求13的用途，其中，所述融合多肽将被大剂量应用一次，或者将被应用至少两次。
22.根据权利要求13的用途，其中，所述融合多肽将与至少一种其它的药物一起应用。
23.根据权利要求22的用途，其中，所述至少一种其它的药物选自：抗生素、血管加压药、类固醇、抗凝剂、抗血栓形成剂、促炎细胞因子和DAMP抑制剂。
24.根据权利要求13的用途，其中，所述融合多肽在施用时抑制受试者中的脓毒症诱导的细胞毒性T细胞。
25.根据权利要求13的用途，其中，所述融合多肽在施用时诱导受试者中的细胞毒性T细胞针对脓毒症引起的活化的持久耐受。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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EP3596114A2 (en) 2017-03-16 2020-01-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP4306537A3 (en) * 2017-03-16 2024-03-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10650210B1 (en) 2019-03-18 2020-05-12 Haier Us Appliance Solutions, Inc. Method for authenticating a filter cartridge for a refrigerator appliance
CA3174381A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Pd-l1 variants with improved affinity towards pd-1

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014121085A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Pd-l1 and pd-l2-based fusion proteins and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015050663A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating cancer in patients with elevated levels of bim

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014121085A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Pd-l1 and pd-l2-based fusion proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of B7-H1 as a novel mediator of the innate immune/proinflammatory response as well as a possible myeloid cell prognostic biomarker in sepsis;Xin Huang等;《The Journal of Immunology》;20131230;第192卷(第3期);1091-1099 *
Molecular Modeling and Functional Mapping of B7-H1 and B7-DC Uncouple Costimulatory Function from PD-1 Interaction;Shengdian Wang等;《J. Exp. Med.》;20030505;第197卷(第9期);1083-1091 *
PD-1/PD-L1与脓毒症诱导的急性肺损伤关系的研究进展;程婷婷等;《同济大学学报（医学版）》;20141031;第35卷(第5期);128-132 *

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