KR20110011595A - 면역 반응 증진을 위한 타파신 증대 - Google Patents
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Abstract
타파신 (Tpn)은 MHC 클래스 I 적하 복합체의 일원으로서, TAP 펩티드 수송체를 MHC 클래스 I 분자들에 연결시키는 기능을 한다. 전이성 인간 암종은 항원 처리 성분 (APC)인 타파신 및 TAP를 낮은 수준으로 발현하며, 기능성 표면 MHC 클래스 I 분자를 거의 나타내지 않는다. 그 결과, 암종은 종종 효과기 세포용해 T 세포 (CTL)에 의해 인지불가능하다. Tpn은 단독으로 종양에 대항하여 포유동물의 생존 및 면역력을 증진시킬 수 있으나, 부가적으로, 종양을 근절하기 위해 Tpn과 TAP를 면역치료 백신 프로토콜의 성분으로서 함께 사용할 수 있다.
Description
MHC 클래스 I 항원 제시 경로는 종양 항원을 CD8+ T 세포에 교차 제시함으로써 항-종양 면역 반응을 개시함에 있어서, 및 종양-특이적 세포독성 림프구 (CTL)에 의한 종양 세포 인지 및 사멸에 있어서 모두 중요하다. 상기 두 과정 모두에서 중요한 성분은, 소포체 (ER) 내의 클래스 I 분자 상으로의 항원성 펩티드의 적하를 돕는 기능을 가진 48 kDa I형 막 당단백질인 샤페론 단백질 타파신 (Tpn)이다. Tpn이 이러한 기능을 매개하는 기작에는, 펩티드의 적하시까지 ER 내의 MHC 클래스 I 분자를 빈 상태로 보유하는 것, 항원 처리 단백질 (TAP)에 결합되어 수송된 것을 안정화하는 것, MHC 클래스 I 항원을 TAP에 연결시키는 것, 및 고친화성 펩티드의 MHC 클래스 I 항원에의 결합을 지탱하는 것이 포함된다. Tpn의 존재 하에서, 표면 MHC 클래스 I 분자는 더욱 안정하며, 그에 따라 항원을 CTL 또는 그의 전구체에 제시함에 있어 더욱 효율적이다. Tpn 발현의 결함은 TAP1 및 TAP2를 비롯한 MHC 클래스 I 적하 복합체의 불안정화, 및 세포 표면에서 MHC 분자의 발현 감소를 초래한다.
Tpn은 유방암, 흑색종, 결장직장 암종, 및 소세포 및 비(非)-소세포 폐 암종 모두 등의 다수의 인간 암종뿐 아니라, 마우스 섬유육종 및 마우스 흑색종 등의 마우스 암에서 하향 조절되어 있는 것으로 알려져 있다. 주목할 만한 것으로서, 인간 결장직장암에서, Tpn은 TAP1, 잠재 막단백질 2 (LMP2) 및 잠재 막단백질 7 (LMP7)보다 더 빈번히 소실되어 있는데, 이는 Tpn의 소실이 상기 종양에서 면역 감시를 극복함에 있어서 핵심 사건일 수 있음을 시사한다. 나아가, MHC 클래스 I 항원 제시 경로에서 Tpn을 비롯한 성분들의 하향 조절 또는 결핍은 종양의 면역원성 감소의 결과를 초래하며, 각종 인간 암종에서 질환 진행 및 질환 예후와 관련되어 있다. C57BL/6 마우스에서의 자발성 폐 암종에서 유래한 마우스 폐 암종 세포주 CMT.64는 MHC 클래스 I 중쇄, β2-마이크로글로불린, LMP2 및 LMP7, TAP1 및 TAP2, 및 Tpn을 비롯한 항원 제시 경로의 다수의 성분들이 하향 조절되어 있는 것이 특징이다. 복제성 우두 바이러스 또는 복제 불능 아데노바이러스를 이용하여 CMT.64 및 여타 종양 세포에서 TAP-1 발현을 회복시키면 종양 항원-특이적 면역 반응이 증가하여 동물 생존이 연장된다는 것이 수많은 연구들에 의해 증명되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 인간 Tpn (hTpn)이, 단독으로 또는 인간 TAP1 (hTAP1) (복제 불능 아데노바이러스로부터 발현된 것)과 조합적으로, 항원 제시를 회복시켜, 종양 항원-특이적 면역 반응을 증가시키고, 종양을 가진 포유동물의 생존을 연장시킬 수 있는지 측정하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 Tpn-결핍 암 세포에서 Tpn을 발현시켜, 기능성 표면 MHC 클래스 I 항원 복합체의 발현을 회복시키고, 종양 세포 면역원성을 증대시키고, 이러한 전이성 종양을 가진 동물의 장기 생존을 증진시키는 것에 관한 것이다. Tpn-결핍 마우스 간세포암 세포주 H6 암종 세포주 및 인간 HepG2 세포주에서 Tpn의 발현은 표면 MHC 클래스 I 발현을 증가시키는 것으로 나타났는데, 이는 이러한 접근법이 다수의 암종을 치료하는데 효과적일 수 있음을 시사한다. 여기서 제시된 결과들은 생체내 AdhTpn 감염으로 인한 MHC 클래스 I 표면 발현 및 면역원성의 증진이 CMT.64 종양 성장을 유의미하게 지연시키고 동물의 생존을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 종양 부위로 AdhTpn을 국소 주사하면, CMT.64 세포가 감염되어 내인성 항원 제시 경로의 활성이 증가되고, 이로 인해 MHC 클래스 I-구속성 종양 항원의 표면 발현이 초래되는 것으로 여겨지는데, 이것은 그 후 CD4+ T 세포 및 CD11c+ 수지상 세포 (DC)의 원조 하에서의 종양-침윤성 CD8+ T 세포수의 증가로 인지될 수 있다.
표면 MHC 클래스 I 발현의 회복 및 종양 세포의 면역원성 증가는 CMT.64 세포 내의 다수의 APC 결함 (이에는, MHC 클래스 I 중쇄, β2-마이크로글로불린, TAP1, TAP2, LMP2, 및 LMP7의 하향 조절이 포함됨)에도 불구하고 일어난다. 상기 펩티드들의 ER로의 잔류 수송은 낮은 수준의 TAP 발현 (웨스턴 블랏으로 검출불가)으로 인한 것일 수 있는데, 이는 Tpn-매개 샤페론 활성 존재 하에서, 특이적 T 세포 효과기에 의한 사멸에 대한 취약성이 유의미하게 증가하도록 하기에 충분한 MHC 클래스 I 펩티드 복합체를 생성한다. TAP를 비롯한 항원 제시 경로의 여타 성분들의 정상 상태 수준은 Tpn에 의해 안정화되는 것으로 나타났다. 따라서, CMT.64 세포에서의 Tpn 발현은 이들 세포에 존재하는 낮은 수준의 TAP를 안정화할 수 있으며, 그에 따라 H-2Kb 및 H-2Db 표면 발현 및 CMT.64 세포의 면역원성을 이러한 방식으로 유의미하게 증가시킨다. AdhTAP1 및 AdhTpn을 암종 (이들 두 성분이 모두 결여된 것) 치료에서 병용하면 종양을 가진 동물의 보호 및 생존을 증진시키는 결과를 낳는다.
이러한 발견의 신규성에 더하여, 이는 마우스에서 Tpn 발현 증가가 외부로부터 획득한 항원 (OVA)에 대한 항원-특이적 면역 반응을 증가시킨다는 사실에 대한 최초의 지적인 것으로 보인다. 순환하는 CD8+ T 세포에 대한 바이러스 감염 세포 또는 종양 세포의 직접적 항원 제시에 있어 필수적인 펩티드 적하 복합체의 성분들은 또한 종양 항원-특이적 면역 반응의 개시 동안의 전구체 CD8+ T 세포에 대한 전문적인 항원 제시 세포의 간접적 제시에도 필요하다. 시험관내에서 DC의 교차 제시 활성을 증가시키는 추가적인 Tpn 발현은 Tpn과 벡터 효과(vector effect)의 조합일 수 있는데, 이는 항원 제시 경로와 선천적 기작 사이에 상호작용이 있음을 시사한다. AdhTpn과 OVA로 함께 감염된 마우스로부터의 DC가 SIINFEKL-특이적 B3Z 세포를 활성화하는 능력이 있는 것은, 시험관내에서 보여지는 효과들의 생리학적으로 관련된 생체내 연관성을 증명한다. AdhTpn 감염으로 인한 생체내 교차 프라이밍(cross-priming) 활성의 증가는, 사합체 염색으로 측정한 바 말초 혈액과 비장 모두에서 SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포수의 증가로써 추가로 증명되었다.
교차 프라이밍 증가의 기작은 AdhTpn으로 처리된 마우스의 종양 덩어리 내 CD4+ TIL의 유의미한 증가와 연관성이 있을 수 있는데, 이는 아데노바이러스 벡터 자체의 면역원성에 관련되었을 수 있다. CD4+ T 세포수가 많을 경우 CD8+ T 세포 활성화의 CD4+ T 세포 의존 경로에 유리하게 작용하여, 이에 의해 CD4+ T 세포는 CD40 리간드를 통해 DC를 자극하고/하거나 DC에 의한 교차 프라이밍을 허가할 수 있는 다른 신호들을 제공하거나, 또는 인터루킨-2와 같은 사이토카인에 의해 CD8+ T 세포를 직접적으로 자극할 수도 있다.
Tpn 및 TAP1을 코딩하는 APC 유전자를 함유한 아데노바이러스 벡터는 장래의 암 면역치료에서 중요한 역할을 할 수 있다. TAP와 함께 Tpn의 회복은 기존의 여타 접근법들에 비해 여러 장점들을 갖고 있으며, 종양의 항원 조성 또는 숙주의 MHC 일배체형(haplotype)에 관계없이 종양에 대한 면역 반응을 증가시키는 일반적인 방법을 제공한다.
도 1은 AdhTpn으로의 감염 후 CMT.64 세포에서의 타파신 발현이 용량 의존적이며, 표면 MHC 클래스 I 수준 증가 및 바이러스 에피토프의 제시를 초래함을 보여주는 일련의 그래프 및 블랏이다. 도 1a는 1, 5, 25, 50, 및 100 PFU/AdhTpn 세포의 MOI의 AdhTpn으로 또는 100 PFU/세포의 Ψ5로 감염시키고 48 시간 후에 거두어들인 CMT.64 세포를 보여주는 블랏 및 그래프이다. 웨스턴 블랏팅은 항-hTpn, mTAP1, 및 mTAP1 다클론 항체 및 β-액틴 mAb를 이용하여 수행하였다. β-액틴은 단백질 로딩에 대한 대조군으로 사용되었다. 각 용량의 AdhTpn 감염에 의해 생성된 단백질을 정량하기 위해 hTpn 밴드들에 대해 밀도측정을 수행하였다. 도 1b는 CMT.64 세포에서 AdhTpn 감염이 H-2Kb 및 H-2Db 표면 발현을 모두 증가시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. Ψ5 - 아데노바이러스 벡터 대조군, IFN-γ - 양성 대조군. 도 1c는, CMT.64 세포를 AdhTpn으로 감염시킴에 의해 VSV-NP 에피토프의 MHC 클래스 I 항원 제시가 회복되고 VSV-NP-특이적 효과기 세포에 의한 용해에 대한 취약성이 증가된다는 것을 보여준다. 표적: CMT/VSV-NP - VSV-NP (52-59) 미니유전자(minigene)로 트랜스펙션된 CMT.64, Ψ5(아데노바이러스 벡터 대조군)로 감염된 CMT/VSV-NP, 또는 AdhTpn으로 감염된 CMT/VSV-NP. 효과기: VSV 감염 마우스로부터의 비장세포.
도 2는 AdhTpn이 난백 알부민 항원의 수지상 세포 교차 프라이밍을 증가시킨다는 것을 보여주는 일련의 그래프 및 현미경 사진이다. 도 2a는 AdhTpn이 시험관내 OVA 항원의 DC 교차 제시를 증가시킨다는 것을 보여준다. 비장의 DC를 AdhTpn 또는 Ψ5로 2 시간 동안 감염시키고, 이어서 OVA와 함께 16 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25.D1.16으로 염색시키고, FACS 분석으로 측정하였다. 도 2b 및 2c는 AdhTpn 감염이 가용성 OVA로의 면역화 후 CD8+ T 세포의 교차 프라이밍을 촉진시킨다는 것을 보여준다. C57BL/6 마우스에 AdhTpn, Ψ5 또는 PBS를 복강내 주사하고; 16 시간 후에, 마우스들에 OVA를 피하 주사하고, 제7일에 동일 바이러스 및 OVA를 추가접종하였다. 8일 후, 비장의 DC를 B3Z T 세포와 함께 상이한 비율로 배양하였다. 공동배양 24 시간 후에, B3Z 활성화 - β-갈락토시다제 생성으로 평가 - 를 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다. 도 2d는, H-2Kb/SIINFEKL 사합체 염색으로 정량한 바, 비장 및 혈액 APC의 MHC 클래스 I 분자 상의 난백 알부민-유래 면역우성 펩티드 SIINFEKL를 인식하는 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 3은 AdhTpn 및 AdhTAP1이 종양을 가진 마우스의 생존을 연장시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 3a는 C57BL/6 마우스에 CMT.64 세포를 복강내 주사하고(4X105 세포/마우스), 제1, 3, 5, 및 8일에 1.25, 2.5, 5.0, 10X107 PFU의 AdhTAP1, 500 μl PBS 중의 1X108 PFU의 ψ5, 또는 PBS 중 하나로 처리하고, 90일 동안 생존을 지켜본 결과를 나타낸다. 보호 효과를 나타내는 가장 적은 용량 (2.5X107 PFU)을 선택하여 AdhTpn을 이용한 보완 연구에 사용하였다. 도 3b는 AdhTpn, AdhTAP1, AdhTAP1 및 AdhTpn, Ψ5, (5.0X107 PFU/500 μl PBS) 또는 PBS를 이용한 처리를 상기와 같이 행하고, 90일 동안 생존을 지켜본 것을 나타낸다(군당 n = 10 마리 마우스). 모든 군이 동일한 수의 Ad 입자를 투여받는 것을 확실히 하기 위해, AdhTAP1 단독 또는 AdhTpn 단독으로 처리한 마우스들에 동일 양의 ψ5 벡터를 보충하여, 총 Ad 용량을 5X107 PFU로 유지하였다. 동일 용량에서, AdhTAP1 및 AdhTpn은 함께 AdhTAP1 단독 및 Ψ5 및 PBS 대조군들보다 통계학적으로 더 큰 최대 보호를 야기하였으나, AdhTpn 단독보다는 크지 않았다(AdhTAP1 + AdhTpn 대 AdhTAP1 단독에 있어서 p = 0.0061). AdhTAP1 + AdhTpn (각각 2.5X107 PFU의 바이러스)으로 처리한 마우스들의 생존은 AdhTAP1 단독을 가장 높은 용량 (1X108 PFU)으로 처리한 마우스의 생존과 유사하였다.
도 4는, 생체내에서 AdhTpn으로 처리한 CMT.64 종양에서 종양 침윤성 림프구 및 DC가 증가된 것을 보여주는 현미경 사진이다. AdhTpn (A, D, G) 또는 Ψ5 (Ad 벡터 대조군), 또는 PBS로 처리된 CMT.64 종양에서 CD4+ (도 4A), CD8+ (도 4B) 또는 CD11c+ (도 4C) 세포에 대한 IHC 염색. CMT.64 세포를 마우스에 도입한 후 제19일에 종양을 분석하였다. C57BL/6 마우스에 CMT.64 세포 (4X105 세포/마우스)를 복강내 주사하고, 제1, 3, 5, 및 8일에 2.5X107 PFU/마우스의 AdhTpn 또는 Ψ5 또는 PBS 단독으로 처리하였다. 양성 염색은 세포 표면 막의 짙은 갈색 표지로 나타났다(200X 배율).
도 5는, FACS 분석에 의해 생체내에서 AdhTpn으로 처리된 CMT.64 종양에서 종양 침윤성 림프구가 증가한 것을 보여주는 그래프이다(처리군 대 PBS 대조군에서의 CD8에 대한 **p= 0.011. 변량의 동질성을 만족시키기 위해 제곱근 변환 후의 처리군 대 PBS 대조군에서 CD4에 대한 *p = 0.042). 종양 침윤성 CD4+ 및 CD8+ 림프구는 종양 내의 총 세포에 대한 백분율로 표시되어 있다.
도 2는 AdhTpn이 난백 알부민 항원의 수지상 세포 교차 프라이밍을 증가시킨다는 것을 보여주는 일련의 그래프 및 현미경 사진이다. 도 2a는 AdhTpn이 시험관내 OVA 항원의 DC 교차 제시를 증가시킨다는 것을 보여준다. 비장의 DC를 AdhTpn 또는 Ψ5로 2 시간 동안 감염시키고, 이어서 OVA와 함께 16 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25.D1.16으로 염색시키고, FACS 분석으로 측정하였다. 도 2b 및 2c는 AdhTpn 감염이 가용성 OVA로의 면역화 후 CD8+ T 세포의 교차 프라이밍을 촉진시킨다는 것을 보여준다. C57BL/6 마우스에 AdhTpn, Ψ5 또는 PBS를 복강내 주사하고; 16 시간 후에, 마우스들에 OVA를 피하 주사하고, 제7일에 동일 바이러스 및 OVA를 추가접종하였다. 8일 후, 비장의 DC를 B3Z T 세포와 함께 상이한 비율로 배양하였다. 공동배양 24 시간 후에, B3Z 활성화 - β-갈락토시다제 생성으로 평가 - 를 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다. 도 2d는, H-2Kb/SIINFEKL 사합체 염색으로 정량한 바, 비장 및 혈액 APC의 MHC 클래스 I 분자 상의 난백 알부민-유래 면역우성 펩티드 SIINFEKL를 인식하는 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 3은 AdhTpn 및 AdhTAP1이 종양을 가진 마우스의 생존을 연장시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 3a는 C57BL/6 마우스에 CMT.64 세포를 복강내 주사하고(4X105 세포/마우스), 제1, 3, 5, 및 8일에 1.25, 2.5, 5.0, 10X107 PFU의 AdhTAP1, 500 μl PBS 중의 1X108 PFU의 ψ5, 또는 PBS 중 하나로 처리하고, 90일 동안 생존을 지켜본 결과를 나타낸다. 보호 효과를 나타내는 가장 적은 용량 (2.5X107 PFU)을 선택하여 AdhTpn을 이용한 보완 연구에 사용하였다. 도 3b는 AdhTpn, AdhTAP1, AdhTAP1 및 AdhTpn, Ψ5, (5.0X107 PFU/500 μl PBS) 또는 PBS를 이용한 처리를 상기와 같이 행하고, 90일 동안 생존을 지켜본 것을 나타낸다(군당 n = 10 마리 마우스). 모든 군이 동일한 수의 Ad 입자를 투여받는 것을 확실히 하기 위해, AdhTAP1 단독 또는 AdhTpn 단독으로 처리한 마우스들에 동일 양의 ψ5 벡터를 보충하여, 총 Ad 용량을 5X107 PFU로 유지하였다. 동일 용량에서, AdhTAP1 및 AdhTpn은 함께 AdhTAP1 단독 및 Ψ5 및 PBS 대조군들보다 통계학적으로 더 큰 최대 보호를 야기하였으나, AdhTpn 단독보다는 크지 않았다(AdhTAP1 + AdhTpn 대 AdhTAP1 단독에 있어서 p = 0.0061). AdhTAP1 + AdhTpn (각각 2.5X107 PFU의 바이러스)으로 처리한 마우스들의 생존은 AdhTAP1 단독을 가장 높은 용량 (1X108 PFU)으로 처리한 마우스의 생존과 유사하였다.
도 4는, 생체내에서 AdhTpn으로 처리한 CMT.64 종양에서 종양 침윤성 림프구 및 DC가 증가된 것을 보여주는 현미경 사진이다. AdhTpn (A, D, G) 또는 Ψ5 (Ad 벡터 대조군), 또는 PBS로 처리된 CMT.64 종양에서 CD4+ (도 4A), CD8+ (도 4B) 또는 CD11c+ (도 4C) 세포에 대한 IHC 염색. CMT.64 세포를 마우스에 도입한 후 제19일에 종양을 분석하였다. C57BL/6 마우스에 CMT.64 세포 (4X105 세포/마우스)를 복강내 주사하고, 제1, 3, 5, 및 8일에 2.5X107 PFU/마우스의 AdhTpn 또는 Ψ5 또는 PBS 단독으로 처리하였다. 양성 염색은 세포 표면 막의 짙은 갈색 표지로 나타났다(200X 배율).
도 5는, FACS 분석에 의해 생체내에서 AdhTpn으로 처리된 CMT.64 종양에서 종양 침윤성 림프구가 증가한 것을 보여주는 그래프이다(처리군 대 PBS 대조군에서의 CD8에 대한 **p= 0.011. 변량의 동질성을 만족시키기 위해 제곱근 변환 후의 처리군 대 PBS 대조군에서 CD4에 대한 *p = 0.042). 종양 침윤성 CD4+ 및 CD8+ 림프구는 종양 내의 총 세포에 대한 백분율로 표시되어 있다.
본 발명을 이제 하기 상세한 실시예들에서 더 설명할 것인데, 이들은 단지 예시로서 제시되는 것으로서, 본 발명의 범위 또는 취지 또는 이의 실시양태 중 임의의 것을 여타의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
물질 및 방법
세포, 바이러스, 및 마우스
HEK 293 세포 (ATCC, Rockville, MD, U.S.A.), CRE8 세포 (S. Hardy 등; J. Virol; 71: 1842-1849 (1997)), CMT.64 세포 (Y. Lou 등; Cancer Res .; 65: 7926-7933 (2005); CMT/VSV-NP (H-2Kb 상에 나타난 아미노산 52 내지 59로부터의 면역우성 에피토프를 함유한 VSV 뉴클레오캡시드 단백질 (NP) 미니유전자로 트랜스펙션된 CMT.64) 및 T1 (ATCC, CRL-1991, hTpn 양성 세포주)을 10% FBS가 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지 중에 배양하였다. CRE8 세포는, HEK 293 세포 내로 안정적으로 통합된 N-말단 핵 위치 신호를 이용하여 Cre 재조합효소 유전자를 구동시키는 β-액틴-기재 발현 카세트를 갖는다(상기 S. Hardy 등 참조). Ψ5 바이러스는 패키징(packaging) 부위의 측면에 loxP 부위를 함유한 Ad5의 E1 및 E3 결실 형태이다(상기 S. Hardy 등 참조). Ψ5 및 재조합 아데노바이러스를 HEK 293 세포에서 증식시키고, 역가측정하였다. 일차적 마우스 비장세포 및 .220 세포 (Tpn-결핍 인간 골수종 세포, 예일대학교 의과대학(New Haven, CT, U.S.A.)의 Peter Cresswell 박사 제공)를 RPMI 1640 + 10% FBS로 이루어진 완전 배양 배지 중에 배양하였다. 잭슨 연구소(The Jackson Laboratory; BarHarbor, ME, U.S.A.)로부터 6 내지 8주령 C57BL/6 (H-2b) 암컷 마우스들을 입수하여, 캐나다 동물 관리 협의회(Canadian Council on Animal Care) 지침 하에서 브리티시 콜롬비아 대학의 바이오테크놀로지 브리딩 퍼실러티(Biotechnology Breeding Facility)에서 사육하였다.
복제 불능 아데노바이러스/인간 타파신 (AdhTpn)의 구축
엠비온 인크.(Ambion Inc.; Austin, TX)로부터 인간 비장으로부터의 퍼스트초이스(FirstChoice™) 총 RNA를 입수하였다. 제조업자의 지시사항에 따라 올리고(dT) 프라이머를 이용한 RT-PCR(엠비온 인크.)을 위해, RETROscriptR First 스트랜드 합성 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Pfu DNA 중합효소(스트라타진(Stratagene; La Jolla, CA))를 이용하여 인간 Tpn 전사 변형체 1 (NM_003190)의 서열을 기초로 설계된 프라이머를 이용하여 Tpn cDNA를 증폭시켰다. 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다: 전방향 프라이머 5'-GCCATGAAGTCCCTGTCTCTG-3' (서열번호:1) 및 역방향 프라이머 5'-GGGATTAGGAGCAGATGATAGGGTA-3' (서열번호:2). 삽입체를 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (인비트로젠 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA)) 내에 클로닝하고, 양 가닥을 서열분석하여, 변이가 존재하지 않도록 하였다. PstI 및 BamHI을 이용하여 TOPO/hTpn으로부터 hTpn을 분해한 후, 이를 PstI- 및 BamHI-분해처리된 셔틀 벡터인 padlox 플라스미드 내로 클로닝하였다(상기 S. Hardy 등 참조). 생성된 벡터 Pad/hTpn을 단리하고, 서열분석하여 서열 충실도를 확보하였다. AdhTpn을 앞서 기술한 바와 같이 생성하였다(상기 S. Hardy 등 참조). 간략히, SfiI로 선형화한 pad/hTpn을 LipofectAMINE PLUS™ 시약 (인비트로젠 라이프 테크놀로지스)을 이용하여 Ψ5 DNA와 함께 CRE8 세포 내로 공동-트랜스펙션하여 AdhTpn을 생성하였다. AdhTpn 재조합 바이러스 클론들을 면역형광 분석법으로 동정하고, 플라크를 HEK 293 세포 중에 3회 정제하였다. 당해 재조합 바이러스를 HEK 293 세포 중에 대규모 스탁으로 증폭시키고, CsCl 밀도 구배 원심분리로 정제하고, HEK 293 세포 중에 역가측정하였다. Tpn 유전자의 어느 한 측면에 위치하는 아데노바이러스 DNA 및 Tpn에 특이적인 프라이머를 이용한, 정제된 바이러스 DNA에 대한 DNA 서열분석 및 PCR을 이용하여 AdhTpn의 정체를 확인하였다. 프라이머 서열은 하기와 같았다: Tpn 증폭을 위한 전방향 프라이머 5'-AAG AGC ATG CAT GAA GTC CCT GTC TCT G-3' (서열번호:3) 및 역방향 프라이머 5'-AAT AAG TCG ACC AGT GAG TGC CCT CAC TCT GCT GCT TTC-3' (서열번호:4); 아데노바이러스 측면 서열의 증폭을 위한 전방향 프라이머 5'-GTG TTA CTC ATA GCG CGT AA-3'(서열번호:5) 및 역방향 프라이머 5'-CCA TCA AAC GAG TTG GTG CTC-3' (서열번호: 6).
CMT.64 세포의 AdhTpn 감염 후 TAP 및 Tpn 발현
AdhTpn의 용량 증가에 대한 반응으로 나타나는 Tpn 및 TAP 발현을 조사하기 위해, CMT.64 세포를 1, 5, 25, 50, 및 100 PFU/세포의 AdhTpn으로 또는 100 PFU/세포의 Ψ5 (음성 대조군)로 감염시켰다. T1 세포 및 .220 세포는, 각각, hTpn 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. IFN-γ로 처리된 CMT.64 세포는 마우스 TAP1 (mTAP1), 마우스 TAP2 (mTAP2) 및 마우스 Tpn (mTpn) 발현에 대한 양성 대조군이었다. 감염 2일 후, 세포를 용해시키고, SDS-PAGE에 적용하고, 하이본드(Hybond) PVDF 막 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), Buckinghamshire, England)으로 전기이동시켰다. 당해 블랏을 토끼 항-hTpn 항체 (스트레쓰젠 바이오테크널러지즈 코오퍼레이션(StressGen Biotechnologies Corp), Victoria, BC, Canada), 토끼 항- mTpn 항체 (토론토 대학의 David Williams 박사로부터 기증받음), KLH에 접합된 토끼 항-mTAP1 및 토끼 항-mTAP2 [본 발명자들의 실험실에서 mTAP-1 (RGGCYRAMVEALAAPAD-C) (서열번호:7) 또는 mTAP-2 (DGQDVYAHLVQQRLEA) (서열번호: 8) (마우스 TAP2의 C-말단 끝의 마지막 16개 아미노산에 해당하는 펩티드)로부터 생성한 합성 펩티드로 토끼를 면역화하여 제조함] 서열 (Q.J. Zhang, Int . J. Cancer (2007)), 및 인간 β-액틴에 대한 마우스 단일클론 항체 (mAb)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) Oakville, ON, Canada)로 처리하였다. 염소 항-토끼 IgG (H+L)-HRP 및 염소 항-마우스 IgG (H+L)-HRP (잭슨 이뮤노리서치 랩(Jackson ImmunoResearch Lab), West Grove, PA)를 2차 항체로 사용하였다. 증강된 화학발광 및 하이퍼필름(Hyperfilm) (아머샴 바이오사이언시즈)에의 노출을 이용하여 밴드들을 가시화하였다. AlphaEaseFC 소프트웨어 6.0.0 버전 (알파 이노텍(Alpha Innotech), San Leandro, CA)을 이용하여 선 밀도측정(line densitometry)을 수행하였다.
MHC 클래스 I의 표면 발현에 대한 AdhTpn의 영향
CMT.64 세포를 50 PFU/세포의 AdhTpn 또는 Ψ5로 감염시켰다. 감염 2일 후, 세포를 항-MHC 클래스 I mAb, y3 (H-2Kb-특이적) 및 28.14.8S (H-2Db-특이적)와 함께 4 ℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 염소 항-마우스 IgG-FITC (잭슨 이뮤노리서치 랩)로 검출하였다. FACSCaliburTM® (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), Franklin Lakes, NJ)에서 FACS 분석을 수행하였다.
CTL 분석법
세포독성은 표준 4 hr 51Cr-방출 분석법으로 측정하였다. 간략히, 아미노산 52-59로 이루어진 면역우성 바이러스 펩티드를 함유한 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (VSV-NP)을 발현하는 안정적으로 트랜스펙션된 CMT.64 세포 (CMT/VSV-NP)를 50 PFU/세포의 AdhTpn 또는 Ψ5로 1일간 감염시켰다. 이들 세포를 Na2 51CrO4 (아머샴 바이오사이언시즈)로 표지하고, VSV-특이적 효과기 세포에 대한 표적으로 사용하였다. 5X107 PFU의 VSV를 마우스 내로 복강내 주사하여 VSV-특이적 CTL 효과기를 생성하였다. 감염 5일 후에 비장세포를 수거하고, RPMI-1640 완전 배지 + 1 μM VSV-NP (52-59) 펩티드 중에 5일간 배양하였다.
DC에 의한 난백 알부민의 시험관내 교차 제시
기술된 바와 같이 C57BL/6 마우스로부터 비장을 수득하고, (5% FCS, 1 mg 콜라게나제 D (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), Laval, Qc, Canada)를 함유한 1 ml RPMI-1640 배지를 주사하여 파쇄하고) 37 ℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포 현탁액을 피콜-파크(Ficoll-Paque) (아머샴 바이오사이언시즈) 구배 상에서 원심분리하여 DC-풍부 세포 개체군을 수득하였다. 이어서, DC를 항-CD11c MACS 비드 (밀테니 비오텍(Miltenyi Biotech), Auburn, CA)를 이용한 양성 선택으로 정제하였는데, 생성된 개체군은 >98% CD11c+이었다. 이어서, 비장의 DC를 20 PFU/세포의 AdhTpn 또는 Ψ5로 2 시간 동안 감염시킨 후, 5 mg/ml의 난백 알부민(OVA) (워싱턴 바이오케미컬 코포레이션(Worthington Biochemical Corporation), Lakewood, NJ)과 함께 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션시켰다. DC를 세정하고, Fc 수용체를 2.4G2 FcγIII/II 차단제 (비디 파르민젠(BD PharMingen), Mississauga ON, Canada)로 차단한 후, H-2Kb/SIINFEKL에 특이적인 25.D1.16 mAb (A. Porgador, Immunity, 6:715-726 (1997)), 이어서 피코에리트린 (PE)-접합된 래트 항-마우스 IgG1 항체 (잭슨 이뮤노리서치 랩.)로 염색하였다. 유세포 분석기를 사용하여 DC 표면 상의 H-2Kb/SIINFEKL 복합체를 정량하였다.
난백 알부민의 생체내 교차 제시 및 특이적 면역 반응의 생성
제0일에, 마우스를 1x108 PFU AdhTpn, Ψ5, 또는 PBS로 복강내 감염시켰다. 16 시간 후에 가용성 OVA (100 μl 중 30 mg)를 피하 주사하고, 제7일에 동물들에 동일 용량의 바이러스 및 OVA를 추가접종하였다. DC의 교차 프라이밍 활성을 연구하기 위해, 24시간 후에 마우스 비장으로부터 비장 DC를 단리하고, 0.005% 글루타르알데히드 중에 고정시키고, 상이한 비율의 B3Z (H-2Kb/SIINFEKL 복합체 인식시에 활성화될 수 있는 IL-2 분비형 LacZ-유도성 T 세포 하이브리도마(N. Shastri, J. Immunol, 150: 2724-2736 (1993), - 캘리포니아 대학 (Berkeley, CA)의 Nilabh Shastri 박사로부터 기증받음)의 존재 하에서 96-웰 플레이트에서 37 ℃에서 배양하였다. 공동배양 24 시간 후, 클로로페놀 레드-B-D-갈락토피라노시드 (CPRG, 로슈 어플라이드 사이언스)의 첨가 후 β-갈락토시다제 생성을 평가하여 활성화를 측정하였다. 24시간 후에 상기 플레이트를 595 nm에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였는데, 630 nm 배경 흡광도는 제하였다. 마지막 면역화 후 제5일에, 정맥 혈액을 채취하고, 피콜-파크 구배 상에서 혈액을 원심분리하여 풍푸해진 림프구 개체군들을 수득하였다. 비장을 또한 수거하여, 상기 기술한 바와 같이 분해하고, 동일한 방식으로 비장세포-풍부 개체군을 생성시켰다. 림프구 및 비장세포를 iTAg™ H-2Kb/SIINFEKL-PE (베크만 컬터 캐나다 인크(Beckman Coulter Canada Inc), Mississauga, ON, Canada) 및 항-CD8-FITC (Ly-2) (비디 파르민젠) 항체로 이중 염색하여, H-2Kb/SIINFEKL에 특이적인 총 및 CD8+ 비장세포를 측정하였다. FACSCalibur™을 이용하여 데이터를 수집하고, 이를 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
CMT.64 종양을 가진 마우스에 대한 AdhTpn 및 AdhTAP1 처리
바이러스 용량의 역가측정을 위해, 군당 마우스 3 또는 4 마리의 6개 군에 대해 500 μl PBS 중의 4X105 CMT.64 세포를 복강내 주사하여 종양을 확립하였다. CMT.64 세포 도입 후 제1, 3, 5, 8일에, 마우스들에 1.25, 2.5, 5.0, 10X107 PFU의 AdhTAP1, 500 μl PBS 중의 1X108 PFU의 ψ5, 또는 PBS 중 하나를 추가로 복강내 주사하고, 90일 동안 생존을 지켜보았다. CMT.64 종양을 가진 마우스에서의 AdhTpn 또는 AdhTpn + AdhTAP1 처리를 위해서, 군당 마우스 14 내지 18 마리의 5개 군에 대해 CMT.64 세포 (500μl PBS 중 4X105 세포)를 복강내 주사하여 종양을 확립하였다. CMT.64 세포 도입 후 제1, 3, 5, 및 8일에, 마우스들에 AdhTpn, AdhTAP1, AdhTAP1 및 AdhTpn, Ψ5, (5.0X107 PFU/500 μl PBS) 또는 PBS를 추가로 복강내 주사하고, 90일 동안 생존을 지켜보았다. 모든 주사 군들이 동일한 수의 Ad 입자를 투여받는 것을 확실히 하기 위해, 한 가지 유형의 재조합체만으로 처리한 마우스들에 5X107 PFU의 총 Ad 용량을 유지하기에 충분한 ψ5 벡터를 보충하였다. 당해 실험 동안, 선택된 시간에 AdhTpn, ψ5 또는 PBS 군의 4 내지 8 마리 마우스를 각 군으로부터 희생시켜, 종양 성장 양상을 관찰하고 종양-침윤성 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 및 CD11c+ DC의 수를 측정하였다.
종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 DC
TIL 및 종양-침윤성 DC를 FACS와 면역조직화학 염색 (IHC) 양자를 이용하여 분석하였다. 종양을 단일 세포들로 해체하고, 래트 항-마우스 CD8 (Ly-2) mAb 및 R-PE-접합된 래트 항-마우스 CD4 (L3T4) mAb와 함께 인큐베이션하고, CD8+ 및 CD4+ TIL의 수를 FACS로 정량하였다. 동결시킨 종양의 아세톤 고정된 동결절편들 (8 μm)을 래트 항-마우스 CD4 mAb (RM4-5), 래트 항-마우스 CD8 mAb (53-6.7), 또는 햄스터 항-마우스 CD11c (HL3)를 이용하여 종양 침윤성 세포 (CD8+, CD4+ T 세포, 및 CD11c+ DC)에 대해 염색하였다. 항-CD8 및 항 CD4 항체들에 대한 동위원소 대조군으로는 래트 IgG2a를 사용하였고, CD11c+ 세포를 검출하는 항체를 위한 대조군으로는 햄스터 IgG를 사용하였다. 항체 결합을 비오틴화 다클론 항-래트 IgG 및 비오틴화 항-햄스터 IgG 2차 항체 및 스트렙타비딘-HRP 및 DAB 검출 시스템을 이용하여 검출하였다(상기 모든 시약은 비디 바이오사이언시즈 파르민젠(BD Biosciences PharMingen)으로부터 구매하였다).
통계학적 분석
교차 제시 분석법을 위해, 카이 제곱(Chi Squared) 검정 (다변량 비교, FlowJo 3.7.1.)을 이용하여, OVA와 함께 인큐베이션 후 AdhTpn 또는 Ψ5 (대조군 벡터)로 감염된 DC 상에 발현된 총 H-2Kb 또는 H-2Kb/OVA257 -267 복합체의 차이에 대한 FACS 히스토그램을 분석하였다. p < 0.01 (99% 신뢰)인 경우 결과는 유의미한 것으로 간주되었고, T(X) > 10은 실증적으로 절사값(cut off value)으로 결정되었다. 4회 반복된 실험 중 하나를 대표하는 히스토그램을 나타내었다. 생존 데이터는 "생존 분포 비교(Comparison of survival distributions)" 방법론을 이용하여 분석하였다. 상기 데이터는 p<0.05인 경우 통계학적으로 상이한 것으로 간주되었다.
결과
AdhTpn은 CMT.64 세포에서 MHC 클래스 I 표면 발현 및 면역원성을 증가시킴
AdhTpn으로 감염된 CMT.64 세포는 용량 의존 방식으로 hTpn을 발현하였다(도 1a). 그러나, AdhTpn-감염된 CMT.64 세포에서 내인성 mTpn, mTAP1 및 mTAP2 단백질 발현의 증가는 웨스턴 블랏으로 검출되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 유세포 분석기 분석 결과, AdhTpn으로 감염된 CMT.64 세포에서는 H-2Kb 및 H-2Db의 세포 표면 발현이 증가된 반면(도 1b), Ψ5로 감염된 세포는 그러한 증가를 나타내지 않는 것으로 나타났다. IFN-γ로 처리된 CMT.64 세포는 양성 대조군으로 사용되었는데, 이는 H-2Kb 및 H-2Db 표면 발현 증가가 훨씬 더 컸을 뿐 아니라(도 1b), 웨스턴 블랏 분석에서 내인성 mTpn, mTAP1 및 mTAP2 단백질 수준의 증가를 나타내었다(도 1a). AdhTpn은 또한 VSV 핵단백질 미니유전자 (CMT/VSV-NP)로 안정적으로 트랜스펙션된 CMT.64가 면역우성 VSV-NP52 -59 펩티드를 CTL에 제시할 수 있는 능력을 증진시켰다. AdhTpn으로 감염된 CMT/VSV-NP 세포는 VSV-특이적 효과기 T 림프구의 세포용해 활성에 민감했던 반면, CMT/VSV-NP 세포 자체 또는 Ψ5로 감염된 것은 사멸에 대한 저항성이 있었는데(도 1c), 이는 아마도 후자의 세포의 세포 표면 상에 H-2Kb/VSV 펩티드가 결여된 때문인 듯하다. 이러한 결과들은, AdhTpn 감염 후의 hTpn 발현 및 활성이, 이들 세포가 특이적 CTL 활성에 취약하게 되기에 충분한 특이적 에피토프 (VSV-NP52 -59)의 MHC 클래스 I-구속성 항원 제시를 회복시킬 수 있다는 것을 보여준다.
AdhTpn은 수지상 세포 교차 제시 및 교차 프라이밍을 증가시킴
모델 항원 OVA를 사용하여, AdhTpn으로 감염된 DC가 H-2Kb의 측면에서 면역우성 펩티드 SIINFEKL을 교차 제시할 수 있는 능력을 평가하였다. 유세포 분석기는 세포 표면 H-2Kb/SIINFEKL 복합체의 수에 대한 반(semi)-정량적 판독을 제공하여, 교차 제시 효율성에 대한 평가를 가능하게 해준다. Ψ5로 감염된 DC와 비교하여, AdhTpn으로 시험관내 감염된 비장의 CD11c+ DC에서는 H-2Kb 상에의 SIINFEKL의 교차 제시가 유의미하게 증가되었다(p<0.01)(도 2a). 총 표면 H-2Kb 수준 또한 Ψ5-감염된 DC와 비교하여 AdhTpn-감염된 DC에서 약간 증가되었다. 이러한 효과를 생체내에서 조사하기 위해, 본 발명자들은 Ψ5, PBS, 또는 AdhTpn을 복강내 투여하고, OVA를 피하로 주사하여, H-2Kb/SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포의 생성에서 AdhTpn의 효과를 시험하였다. AdhTpn으로 감염되고 OVA로 면역화된 마우스로부터 생체외 채취된 비장-유래의 DC는, 벡터만으로 감염된 마우스로부터의 DC보다 H-2Kb/SIINFEKL-특이적 T 세포 하이브리도마인 B3Z를 활성화하는 능력이 더 컸다(도 2b). OVA로 면역화된 AdhTpn-감염된 마우스는 벡터 대조군 (Ψ5) 또는 PBS 대조군과 비교하여, 총 CD8+ T 세포수의 증가로 검출된 바(데이터는 나타나 있지 않음) 더 큰 일반 면역 반응을 나타내었고, 비장에서 H-2Kb/SIINFEKL에 특이적인 CD8+ T 세포수가 더욱 큰 것으로 나타난 바(사합체 염색으로 측정) OVA-특이적 반응이 유의미하게 증가하였다. 이러한 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 증가는 Ψ5 및 PBS 대조군과 비교하여 AdhTpn-감염된 마우스들의 말초 혈액에서 훨씬 더 두드러졌다(도 2c & 도 2d). 이는 비장의 DC를 Ψ5 단독으로가 아니라 AdhTpn으로 감염시키는 것이 일반적 및 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응 모두의 증가에 대한 원인이 되었음을 시사하며, 이는 다음으로 생체내에서의 외인성 항원의 교차 제시 증가에 기인한 것일 가능성이 높다.
AdhTpn 처리는 AdhTAPA 처리보다 CMT.64 종양을 가진 마우스의 생존을 더욱 양호하게 증가시키며, 최대 보호는 AdhTpn 및 AdhTAP1 양자를 병용함에 의해 달성됨
이전에, 본 발명자들은, CMT.64 종양을 가진 마우스를 인간 TAP1을 발현하는 재조합 아데노바이러스(AdhTAP1)로 처리하면 Ψ5 또는 PBS 단독으로 처리한 마우스에 비해 생존이 증가되는 결과를 가져옴을 증명하였다(상기 Y. Lou 등 참조). AdhTpn은 AdhTAP1 처리와 유사한 방식으로 MHC-I 항원 표면 발현을 증가시키고 CTL 사멸에 대한 취약성을 회복시키므로, 본 발명자들은 AdhTpn과 AdhTAP1의 병용이 CMT.64 종양 형성의 저해를 강화할 수 있는지 조사하였다. 고 아데노바이러스 부하와 관련된 세포독성을 피하기 위해, 보호 효과를 갖는 것으로 증명된 역가측정으로 결정된 차선의 용량인 2.5X107 PFU의 AdhTAP1(도 3a)를, 동일 용량의 AdhTpn과 조합하여 사용하였다. 바이러스 부하의 균형을 맞추기 위해, AdhTAP1 및 AdhTpn 단독 치료제들을 동일한 수의 Ψ5 바이러스와 혼합하였다. AdhTpn 및 AdhTAP1을 이용한 이중적 처리는 Ψ5 단독인 바이러스에 비해 마우스 생존을 훨씬 더 증대시킨 결과를 가져왔는데, 이는 가시적인 종양을 나타내지 않으면서 장기 생존이 50%인 반면(100일 초과), 이에 비해 AdhTpn으로는 30% 및 저용량의 AdhTAP1로는 10%였다(도 3b). 상기 이중적 처리는 동일 바이러스 용량의 Ψ5 또는 AdhTAP1 처리 단독보다 통계학적으로 더욱 유효하였으나(p<0.01), 동일 용량의 AdhTpn 처리 단독과는 통계학적으로 상이하지 않았다. 각각 2.5X107 PFU 바이러스의 AdhTpn 및 AdhTAP1 (총 5X107 PFU 바이러스)은 훨씬 더 높은 용량(1X108 PFU)의 AdhTAP1 단독과 동등하였는데, 이는 상기 이중적 처리가 주어진 용량에서 더욱 효과적임을 증명한다(도 3b).
CMT.64 종양에서 AdhTpn 처리는 TIL 및 종양-침윤성 DC를 증가시킴
AdhTpn 처리군, 및 Ψ5 및 PBS 대조군으로부터의 4 내지 8 마리 마우스에 대해 마지막 처리 주사 후 제20일에 종양 성장의 패턴을 조사하였다. AdhTpn으로 처리된 마우스의 복강에는 종양이 부재하거나 또는 직경 1 또는 2 밀리미터 미만의 작은 종양이 단지 소수로 존재하였다. 간과 창자 모두 육안 검사시 정상으로 보였다. 이는 PBS 또는 Ψ5로 처리된 마우스와 뚜렷이 대조되었다. 이들 마우스들에는 다량의 혈성 복수액 (2-5 ml)이 존재하였고, 다수의 종양이 복강 전체에 걸쳐 분포되어 있었다. 종양은 간과 창자에서 성장하고 있는 상태로 관찰되었고, 다량의 섬유성 유착과 결합되어 있었다. 상기 마우스들에서 수거한 종양을 FACS 및 IHC 염색에 의해 TIL 및 DC 침윤물이 있는지 조사하였다. IHC 염색 결과, Ψ5 또는 PBS로 처리된 마우스로부터 채취한 종양에서에 비해 AdhTpn으로 처리된 마우스의 종양 덩어리에서 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및 CD11c+ DC의 수가 유의미하게 더 큰 것으로 나타났다(도 4). FACS 분석에 의해서도 또한, AdhTpn으로 처리된 마우스가 Ψ5 및 PBS로 처리된 마우스로부터 채취한 종양에서에 비해 CD8+ 및 CD4+ TIL이 유의미하게 더 큰 것(각각, p = 0.011 및 p = 0.042)으로 확인되었다(도 5). 이러한 결과들은 CMT.64 종양을 가진 마우스를 AdhTAP1로 처리한 본 발명자들의 이전의 발견과 일치하며(10), 이는 AdhTpn 처리가 종양 항원-특이적 면역 반응을 증가시킴으로써 유사한 방식으로 기능할 수 있음을 시사한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Tapimmune
Jefferies, Wilfred
<120> Tapasin Augmentation for Enhanced Immune Response
<130> T005/7015US0
<160> 8
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(21)
<400> 1
gccatgaagt ccctgtctct g 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(25)
<400> 2
gggattagga gcagatgata gggta 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(28)
<400> 3
aagagcatgc atgaagtccc tgtctctg 28
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(39)
<400> 4
aataagtcga ccagtgagtg ccctcactct gctgctttc 39
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(20)
<400> 5
gtgttactca tagcgcgtaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> primer
<222> (1)..(21)
<400> 6
ccatcaaacg agttggtgct c 21
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> mrna
<222> (1)..(18)
<400> 7
Arg Gly Gly Cys Tyr Arg Ala Met Val Glu Ala Leu Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Asp Cys
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> mrna
<222> (1)..(16)
<400> 8
Asp Gly Gln Asp Val Tyr Ala His Leu Val Gln Gln Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Claims (26)
- 항원을 지닌 표적 세포에서 타파신의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제의 유효량을 이를 필요로 하는 세포 또는 동물에 단독의 면역 반응 증진제로서 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 작용제가 타파신을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 작용제가 타파신을 코딩하는 핵산을 함유한 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
- 제1항에 있어서, 작용제가 타파신을 코딩하는 핵산을 함유한 플라스미드 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 세포가 바이러스에 감염된 세포 또는 세균 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 작용제가 타파신을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 동물이 인간 환자인 방법.
- 제9항에 있어서, 투여가 생체외에서 일어나는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 투여가 생체내에서 일어나는 것인 방법.
- 포유동물의 면역 반응을 증대시킬 수 있는 작용제의 유효량 및 적합한 면역보강제(adjuvant) 또는 담체를 포함하며, 이 때 상기 작용제는 포유동물의 표적 세포에서 타파신의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제를 단독의 면역 반응 증진제로서 포함하는 것인, 암, 바이러스 또는 세균 감염에 대해 부적당한 면역 반응을 수반하는 장애를 앓고 있는 포유동물에 투여하기 위한 약학 조성물.
- 제12항에 있어서, 장애가 자궁경부암, 결장직장암, 비(非)-호지킨 림프종, 림프종, 위 암종, 간 암종, 백혈병, 신장 암종, 췌장 암종, 육종, 중피종, 자궁 암종, 방광 암종, 두경부 암종, 식도암, 고환암, 난소 암종, 갑상선암, 구강암, 위암, 후두암, 호지킨 림프종, 유방 암종, 전립선 암종, 흑색종, 비(非)-흑색종 피부암, 기저 세포 피부암, 편평상피 세포 피부암, 폐 암종, 뇌암, 다발성 골수종, 독감, 천연두, 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 유효량의 (a) 항원을 지닌 표적 세포에서 타파신의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제, 및 (b) 상기 표적 세포에서 TAP-1의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제를 단독의 면역 반응 증진제들로서 조합하여 이를 필요로 하는 세포 또는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법.
- 제14항에 있어서, 작용제들이 각각 타파신 및 TAP-1을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 작용제들이 각각 타파신 및 TAP-1을 코딩하는 핵산을 함유한 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
- 제14항에 있어서, 작용제들이 각각 타파신 및 TAP-1을 코딩하는 핵산을 함유한 하나 이상의 플라스미드 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인 방법.
- 제14항에 있어서, 표적 세포가 바이러스에 감염된 세포 또는 세균 세포인 방법.
- 제14항에 있어서, 작용제들이 각각 타파신 및 TAP-1을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 동물이 인간 환자인 방법.
- 제22항에 있어서, 투여가 생체외에서 일어나는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 투여가 생체내에서 일어나는 것인 방법.
- 포유동물의 면역 반응을 증대시킬 수 있는 작용제들의 유효량 및 적합한 면역보강제 또는 담체를 포함하고, 이 때 상기 작용제들은 (a) 포유동물의 표적 세포에서 타파신의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제, 및 (b) 포유동물의 표적 세포에서 TAP-1의 수준을 증대시킬 수 있는 작용제를 단독의 면역 반응 증진제들로서 조합하여 포함하는 것인, 암, 바이러스 또는 세균 감염에 대해 부적당한 면역 반응을 수반하는 장애를 앓고 있는 포유동물에 투여하기 위한 약학 조성물.
- 제25항에 있어서, 장애가 자궁경부암, 결장직장암, 비(非)-호지킨 림프종, 림프종, 위 암종, 간 암종, 백혈병, 신장 암종, 췌장 암종, 육종, 중피종, 자궁 암종, 방광 암종, 두경부 암종, 식도암, 고환암, 난소 암종, 갑상선암, 구강암, 위암, 후두암, 호지킨 림프종, 유방 암종, 전립선 암종, 흑색종, 비(非)-흑색종 피부암, 기저 세포 피부암, 편평상피 세포 피부암, 폐 암종, 뇌암, 다발성 골수종, 독감, 천연두 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
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