BR112021001117A2

BR112021001117A2 - células cancerígenas modificadas, composição farmacêutica, linha celular, métodos para fazer células cancerígenas modificadas e para estimular uma resposta imune, vetor de expressão isolado ou combinação de vetores de expressão isolados, e, uma ou mais células cancerígenas modificadas

Info

Publication number: BR112021001117A2
Application number: BR112021001117-0A
Authority: BR
Inventors: Kunle Odunsi; Takemasa TSUJI; Junko MATSUZAKI
Original assignee: Health Research, Inc.
Priority date: 2018-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-04-20
Also published as: CN112930394B; EP3824097A1; JP2021531772A; EP3824097A4; WO2020023350A1; US20210268087A1; CA3106980A1; CN112930394A; JP7384896B2

Abstract

CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, LINHA CELULAR, MÉTODOS PARA FAZER CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS E PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE, VETOR DE EXPRESSÃO ISOLADO OU COMBINAÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO ISOLADOS, E, UMA OU MAIS CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS. Células cancerígenas modificadas que são modificadas para coexpressar transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora são providas. A molécula imunoestimuladora é Ligante OX40 ou Ligante 4-1BB. Métodos para fazer as células são providos introduzindo polinucleotídeos que codificam o CIITA e a molécula imunoestimuladora nas células cancerígenas. Métodos para estimular respostas imunes humorais e mediadas por células administrando as células cancerígenas modificadas ou os polinucleotídeos que codificam o CIITA e as moléculas imunoestimuladoras também são providos. Essas abordagens podem ser usadas para estimular uma resposta imune contra qualquer de uma ampla variedade de antígenos de câncer.

Description

1 / 39 CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, LINHA CELULAR, MÉTODOS PARA FAZER

CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS E PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE, VETOR DE EXPRESSÃO ISOLADO OU COMBINAÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO ISOLADOS, E, UMA OU MAIS CÉLULAS CANCERÍGENAS MODIFICADAS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório norte- americano nº 62/701.791, depositado em 22 de julho de 2018, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

CAMPO

[002] A presente descrição se refere de modo geral à profilaxia e terapia de câncer e, mais especificamente, a composições e métodos para melhorar as respostas imunes ao câncer.

FUNDAMENTOS

[003] As células T CD4+ específicas do antígeno tumoral, as células T CD8+ e as células B desempenham papéis cooperativos na imunidade antitumoral. No local do tumor, as células T CD8+, também conhecidas como células T citotóxicas, são consideradas as principais células efetoras para destruir células cancerígenas. As células T CD4+, também conhecidas como células T auxiliares, auxiliam na ativação, função e manutenção das células T CD8+ por meio da ativação de células apresentadoras de antígenos e/ou secretando citocinas. As células T CD4+ também ajudam a ativação das células B para induzir a secreção de anticorpos, expressando o ligante CD40 (CD40L), que se aglutina à molécula de CD40 nas células B, e secretando citocinas que induzem a troca de classe de anticorpos. As células B produzem anticorpos específicos do antígeno tumoral que se aglutinam às proteínas do antígeno tumoral para formar complexo antígeno-anticorpo, algumas vezes referido como um “complexo imune”. Os complexos imunes são

2 / 39 eficientemente capturados por células apresentadoras de antígenos e ao mesmo tempo células apresentadoras de antígeno (APCs) ativas através da aglutinação aos receptores Fc. Subsequentemente, as células apresentadoras de antígeno ativadas apresentam de forma cruzada proteínas de antígeno tumoral às células T CD4+ e CD8+. Devido às funções antitumorais distintas e colaborativas por células T CD4+, células T CD8+ e células B, uma estratégia que estabeleceria células T CD4+, células T CD8+ e células B secretoras de anticorpos integradas seria uma imunoterapia promissora para pacientes com câncer.

[004] As células T destroem as células cancerígenas ao identificar os peptídeos derivados da proteína do antígeno tumoral apresentados nas moléculas de MHC nas células cancerígenas. No entanto, sabe-se que algumas células cancerígenas escapam da morte mediada por células T eliminando moléculas de MHC de sua superfície. Os anticorpos que se aglutinam à superfície celular das células cancerígenas destroem as células cancerígenas por meio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), independentemente da expressão de MHC (ou de uma maneira independente de MHC).

[005] Considera-se que as células T auxiliares CD4+ desempenhem um papel central na indução da resposta imune antitumoral integrada, porque ajudam as células T e B CD8+. Geralmente, a ativação de células T CD4+ requer células apresentadoras de antígenos que capturem e apresentem de forma cruzada proteínas extracelulares, como proteínas de antígenos tumorais. Recentemente, verificamos um subconjunto único de células T CD4+ que identifica diretamente as células cancerígenas expressando MHC de classe II (MHC-II). Este subconjunto de células T CD4+, que denominamos “células T CD4+ de identificação tumoral (células TR-CD4)”, intensificou a função das células T CD8+ específicas do antígeno tumoral ao identificar diretamente as

3 / 39 células cancerígenas sem a necessidade de células apresentadoras de antígeno. Portanto, espera-se que as células TR-CD4 provejam ajuda de forma eficiente a outras células imunológicas para intensificar a imunidade antitumoral no local do tumor. No entanto, não há nenhum método atualmente conhecido para induzir de forma eficiente as células TR-CD4 no corpo. Assim, há uma necessidade iminente e não atendida por composições e métodos para melhorar as respostas imunológicas ao câncer e outros agentes imunogênicos. A presente descrição está relacionada a essas necessidades.

BREVE SUMÁRIO

[006] A presente descrição provê composições e métodos que são úteis para estimular e/ou intensificar respostas imunes, incluindo, mas não necessariamente limitada às respostas imunes a antígenos de peptídeos. Em modalidades, a imunidade mediada por células, imunidade humoral ou ambas são estimuladas e/ou intensificadas usando as composições e métodos desta descrição.

[007] A descrição em certos aspectos compreende composições para uso na vacinação. Em modalidades, a descrição provê composições de vacina celular compreendendo células cancerígenas modificadas que são engenheiradas para superexpressar o gene transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora. As moléculas imunoestimuladoras descritas nesta descrição incluem GM-CSF, CD80, Ligante GITR, Ligante OX-40, e Ligante 4-1BB. Em uma modalidade, CD86 pode ser usado. Em modalidades, as células cancerígenas modificadas expressam ligante 4-BB e/ou ligante OX40, confirme descrito adicionalmente abaixo. Em modalidades alternativas, a descrição inclui o uso de polinucleotídeos que codificam a proteína CIITA e os agentes imunoestimuladores, como em vetores de expressão, como os agentes que são distribuídos a um indivíduo. Em modalidades, como uma alternativa para o gene CIITA, a descrição inclui engenheirar células cancerígenas para aumentar a expressão de cadeias alfa e

4 / 39 beta de MHC II.

[008] Usando modelos de camundongo relevantes, as vacinas aqui descritas são demonstradas para induzir células T CD8+ antitumorais potentes e de longa duração, em comparação com células cancerígenas que expressam CIITA ou o ligante coestimulador sozinho. Além disso, as vacinas celulares aqui descritas induzem a produção de anticorpos citotóxicos contra moléculas de superfície celular em células cancerígenas. Portanto, espera-se que as vacinas aqui descritas provejam imunidade protetora contra cânceres expressando MHC por citotoxicidade mediada por células T, mas também variantes de escape imunológico com perda de MHC, por citotoxicidade mediada por anticorpos.

[009] Será identificado por aqueles versados na técnica que o termo MHC conforme usado no presente documento é extensível a aplicações humanas através do equivalente humano de MHC, referido na técnica como complexo de gene de antígeno de leucócito (HLA).

[0010] Como será identificado pelos exemplos não limitativos apresentados com esta descrição, a fim de induzir células TR-CD4, expressamos MHC-II na superfície celular de linhas celulares de câncer murino superexpressando retroviralmente o gene transativador MHC classe II (CIITA), que é um regulador mestre da apresentação de antígenos mediada por MHC de classe II. Para intensificar a imunogenicidade de células cancerígenas expressando MHC-II, um gene imunoestimulador também foi coexpresso em excesso. Em contraste com as células cancerígenas parentais ou células que expressam CIITA sozinho, algumas linhas celulares de câncer engenheiradas coexpressando CIITA e um gene imunoestimulador, particularmente o ligante 4-1BB (BB-L), induziram uma resposta imune antitumor forte e de longa duração em camundongos singênicos. As células cancerígenas que coexpressam CIITA+BB-L, mas que não expressam BB-L sozinho, induzem anticorpos circulantes que se aglutinam especificamente na

5 / 39 superfície das células cancerígenas e matam as células cancerígenas. Anticorpos específicos do câncer induzidos por células cancerígenas expressando CIITA+BB-L protegeram camundongos contra o crescimento de células cancerígenas com perda de MHC. Estas verificações mostram que as células cancerígenas engenheiradas que coexpressam CIITA+BB-L são adequadas para uso como vacinas para induzir células T integradas e resposta de anticorpos para proteção contra cânceres que expressam MHC e perda de MHC.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] Figura 1. Geração de linhas celulares de câncer murino que coexpressam CIITA e genes imunoestimuladores. CIITA e/ou gene imunoestimulador (CD80, GM-CSF, Ligante GITR, Ligante 4-1BB e Ligante OX40) foram clonados em um plasmídeo de transferência retroviral bicistrônico (pQCXIX, adquirido na Clontech). As partículas retrovirais foram produzidas por cotransfecção da linha celular de empacotamento de GP2-293 (Clontech) do plasmídeo de transferência e do plasmídeo que expressa o envelope pVSV-G (Clontech). Linhas celulares de câncer murino foram engenheiradas para expressar CIITA e/ou um gene imunoestimulador por transdução retroviral.

[0012] Figura 2. Imunogenicidade de células cancerígenas engenheiradas. Efeito da expressão de CIITA e de genes imunoestimuladores no crescimento de uma linha celular de linfoma murino, EL4, em camundongos singênicos (C57BL/6). Os camundongos foram injetados subcutaneamente com células EL4 que foram engenheiradas para expressar o(s) gene(s) indicado(s). O volume do tumor foi calculado a partir de diâmetros como 0,5 × (diâmetro mais curto) 2 × (diâmetro mais longo). A expressão de CIITA sozinho não alterou o crescimento do tumor de EL4. A coexpressão de CIITA e um gene imunoestimulador retardou significativamente o crescimento do tumor. Em particular, 4-1BB-L e OX40-

6 / 39 L induziram regressão completa espontânea em todos os camundongos. Enquanto a expressão de 4-1BB-L sozinho induziu regressão completa, OX- 40L sozinho retardou apenas parcialmente o crescimento do tumor.

[0013] Figura 3. Indução da resposta de célula T CD8+ de memória por células cancerígenas engenheiradas. (A) Abordagem experimental. Para investigar a resposta imunológica antitumoral de memória a longo prazo, os camundongos foram primeiro inoculados com EL4 engenheirado com 4-1BB- L sozinho, CIITA+4-1BB-L ou CIITA+OX40-L. Dois meses após a regressão completa, os camundongos foram reintroduzidos por via subcutânea com o EL4 parental e o crescimento do tumor foi monitorado. (B) Crescimento do EL4 parental após reintrodução. Apenas alguns camundongos que rejeitaram EL4 expressando 4-1BB-L sozinho ou CIITA+OX40-L mostraram proteção mediante reintrodução. Em contraste, todos os camundongos que inicialmente receberam CIITA+4-1BB-L expressando EL4 rejeitaram EL4 parental reintroduzido. (C) Para investigar as respostas da célula T CD8+ de memória, os camundongos foram primeiro inoculados com o EL4 engenheirado indicado. Imediatamente e um mês após a regressão completa, células T CD8+ específicas de EL4 no baço foram investigadas por cocultura com o EL4 parental e mediram a produção de citocina por ensaio de coloração de citocina intracelular. (D) Imediatamente após a regressão do tumor (Dia 20), os camundongos que receberam EL4 expressando 4-1BB-L sozinho e CIITA+4-1BB-L mostraram células T CD8+ específicas de EL4 semelhantes. Os camundongos que receberam CIITA+OX40-L apresentaram diminuição das células T CD8+ específicas para EL4. Um mês após (Dia 50), enquanto os camundongos que receberam EL4 expressando 4-1BB-L sozinho e CIITA+OX40-L mostraram diminuição nas células T CD8+ específicas para EL4 comparados a aqueles no Dia 20, a porcentagem de células T CD8+ específicas para EL4 em camundongos que receberam EL4 expressando CIITA+4-1BB-L foi mantida.

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[0014] Figura 4. Indução de resposta de anticorpos por células cancerígenas engenheiradas. (A) Esquema experimental. Para investigar a resposta do anticorpo protetor, os camundongos foram primeiro inoculados com EL4 engenheirado com 4-1BB-L sozinho, CIITA+4-1BB-L ou CIITA+OX40-L. Dois meses após a regressão completa, os camundongos foram introduzidos por via subcutânea com EL4 engenheirado para silenciar a expressão de MHC de classe I pela interrupção do gene b2m pela tecnologia CRISPR/Cas9 (b2m-/- EL4) e o crescimento do tumor foi monitorado. (B) Crescimento de EL4 com perda de MHC (b2m-/- EL4) após reintrodução. Os camundongos que rejeitaram inicialmente EL4 expressando 4-1BB-L sozinho ou CIITA+OX40-L mostraram nenhuma ou proteção parcial, respectivamente, contra EL4 com perda de MHC. Em contraste, todos os camundongos que inicialmente receberam CIITA+4-1BB-L expressando EL4 rejeitaram EL4 com perda de MHC reintroduzido. (C) Para investigar a indução de anticorpos contra moléculas de superfície celular em células cancerígenas, os soros foram coletados de camundongos após rejeitarem EL4 engenheirado expressando 4-1BB-L sozinho, CIITA+4-1BB-L ou CIITA+OX40-L. Os EL4 parentais foram primeiro incubados com soro diluído e foram corados com anticorpo IgG anticamundongo marcado com fluorescência. A intensidade fluorescente medida por citometria de fluxo é mostrada. (D) A intensidade fluorescente foi comparada entre os grupos de tratamento. Os camundongos que rejeitaram EL4 expressando CIITA+4-1BB- L ou, em menor extensão, EL4 expressando CIITA+OX40-L desenvolveram anticorpos séricos que se ligaram a EL4. (E) Os mesmos soros de camundongos rejeitados por EL4 expressando CIITA+ 4-1BB-L em (C) foram usados para corar células de controle irrelevantes, como células T de murino ativadas, linha celular de melanoma de murino B16F10 e linha celular de câncer de cólon de murino MC38, indicando nenhuma reatividade cruzada diferente de EL4. (F) Citotoxicidade por anticorpos induzida por células

8 / 39 cancerígenas engenheiradas. Os EL4 parentais foram primeiro carregados com reagente fluorescente Calcein AM, incubados com soro diluído e foram incubados com o complemento de coelho. A citotoxicidade foi calculada a partir do nível de fluorescência no sobrenadante.

[0015] Figura 5. Efeito da vacinação terapêutica no crescimento do tumor. (A) Esquema experimental. Os camundongos foram primeiro inoculados por via subcutânea com CIITA expressando EL4 ou EL4 com perda de MHC. Nos dias 3, 10 e 17, os camundongos foram vacinados com CIITA-EL4 ou CIITA+4-1BB-L-EL4 irradiados ou não tratados. (B) Crescimento de EL4 expressando CIITA. Não há efeito significativo pela vacinação com CIITA-EL4, o crescimento do tumor foi significativamente inibido por CIITA+4-1BB-L-EL4. Dois em cada 5 camundongos rejeitaram completamente os tumores. (C) Os camundongos foram primeiro inoculados por via subcutânea com EL4 com perda de MHC. Nos dias 3, 10 e 17, os camundongos foram vacinados com CIITA+4-1BB-L-EL4 irradiados ou não tratados. Os camundongos que foram vacinados com CIITA+4-1BB-L-EL4 mostraram crescimento do tumor retardado e 2 de 7 camundongos rejeitaram completamente os tumores. (D) Sobrevivência de camundongo em (C).

[0016] Figura 6. Confirmação em outros modelos de tumor murino. (A) Os camundongos foram inoculados por via subcutânea com câncer de cólon MC38 e linhas celulares de melanoma B16F10 que foram engenheiradas para expressar os genes indicados. Em ambos os modelos de tumor murino, a coexpressão de CIITA e 4-1BB-L induziu rejeição espontânea. (B) Os soros de camundongos em (A) foram usados para corar o MC38 e B16F10 parental. Apenas camundongos que rejeitaram células cancerígenas engenheiradas expressando CIITA+4-1BB-L induziram anticorpos significativos que se ligaram à superfície celular das células cancerígenas. (C) Indução da resposta de anticorpos reativos ao tumor ovariano por vacinação. Os camundongos naïve foram vacinados com a linha

9 / 39 celular de câncer de ovário murino engenheirada, ID8, expressando CIITA+4- 1BB-L ou CIITA+OX40-L nos dias 0 e 7. Dezenove dias após a segunda vacinação, os soros foram coletados e usados para corar a linha celular ID8 parental. Ambos os camundongos que foram vacinados com CIITA+4-1BB- L-ID8 induziram anticorpos reativos a ID8, enquanto metade dos camundongos que receberam CIITA+OX40-L-ID8 induziu anticorpos reativos a ID8 significativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0017] A menos que definido de outra forma neste documento, todos os termos técnicos e científicos usados nesta descrição têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto ao qual esta descrição se refere.

[0018] Cada intervalo numérico dado ao longo deste relatório descritivo inclui seus valores superiores e inferiores, bem como cada intervalo numérico mais estreito que se enquadra dentro dele, como se tais intervalos numéricos mais estreitos fossem todos expressamente escritos aqui.

[0019] A descrição inclui todas as etapas e composições do assunto aqui descrito no texto e nas figuras desta descrição, incluindo todas essas etapas individualmente e em todas as combinações das mesmas, e inclui todas as composições do assunto incluindo, mas não necessariamente limitado a vetores, intermediários de clonagem, células, culturas de células, progênie das células e similares.

[0020] A descrição inclui, mas não está limitada a células cancerígenas imunogênicas engenheiradas descritas no presente documento, vacinas contra o câncer feitas usando as células cancerígenas imunogênicas, métodos para fazer as células cancerígenas imunogênicas, composições imunogênicas, polinucleotídeos e métodos para o tratamento do câncer. A descrição inclui todos os polinucleotídeos descritos no presente documento, suas sequências complementares e sequências complementares reversas. Para

10 / 39 qualquer referência a um polinucleotídeo ou sequência de aminoácidos por meio de uma entrada de banco de dados, o polinucleotídeo e a sequência de aminoácidos apresentados na entrada de banco de dados são incorporados aqui conforme existem na data de depósito efetivo deste pedido ou patente.

[0021] Conforme discutido acima, as células cancerígenas expressam uma série de antígenos imunogênicos que são identificados por células T e células B. Portanto, a presente descrição utiliza células cancerígenas modificadas como vacinas potentes para induzir resposta imune polivalente.

[0022] Em modalidades, a descrição compreende a modificação de células cancerígenas, conforme descrito neste documento, e compreende as próprias células cancerígenas modificadas e composições, tais como composições farmacêuticas, compreendendo as células cancerígenas. Em modalidades, as células cancerígenas são de qualquer tipo de câncer, incluindo tumores sólidos e líquidos. Em modalidades, as células cancerígenas modificadas de acordo com a presente descrição incluem, mas não estão necessariamente limitadas a câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de testículo, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de pele, qualquer sarcoma, incluindo, mas não se limitando a, fibrossarcoma, angiossarcoma, adenocarcinoma e rabdomiossarcoma e qualquer câncer do sangue, incluindo todos os tipos de leucemia, linfoma ou mieloma.

[0023] Em modalidades, uma composição de vacina celular descrita no presente documento é administrada a um indivíduo que tem câncer, ou teve câncer anteriormente ou está em risco de desenvolver câncer. O câncer pode ser de qualquer um dos tipos supramencionados. Em modalidades, as células cancerígenas modificadas para uso como vacinas da presente descrição compreendem células cancerígenas a partir de uma linha celular de

11 / 39 câncer. Em modalidades, as células cancerígenas modificadas para uso como vacinas da presente descrição compreendem células cancerígenas a partir de um indivíduo, e são modificadas de modo que expressem ou superexpressam CIITA e uma ou mais moléculas coestimuladoras ou citocinas imunoestimuladoras, conforme descrito neste documento, e são providas ao mesmo indivíduo como uma terapia do câncer. Em modalidades, as células cancerígenas alogênicas são modificadas e usadas nos métodos aqui descritos. Em modalidades, as células cancerígenas modificadas são do mesmo tipo de câncer que um câncer contra o qual uma resposta imune terapêutica é gerada em um indivíduo.

[0024] Em modalidades, o indivíduo pode ser vacinado com um ou mais antígenos que são expressos pelas células cancerígenas modificadas (ou as células cancerígenas que são alvejadas usando polinucleotídeos, conforme descrito neste documento). Em modalidades, um tumor ou lisado de células cancerígenas pode ser usado como a vacinação. Em modalidades, a proteção imunológica obtida por métodos da presente descrição (com ou sem vacinação subsequente) pode ser durável e durar dias, semanas ou meses ou mais, incluindo, mas não se limitando a após a vacinação, e tais vacinações podem ser eficazes para obter proteção após uma dose única ou doses múltiplas. As vacinações de reforço podem ser usadas de acordo com cronogramas que são conhecidos na técnica e podem ser adaptadas para uso com os métodos desta descrição quando providos o benefício deste relatório descritivo, e incluem abordagens como uma estratégia Prime-Boost.

[0025] No que diz respeito às respostas imunes que são estimuladas e/ou intensificadas conforme descrito neste documento, para a indução de células TR-CD4 por vacinas baseadas em células cancerígenas, as células cancerígenas precisam expressar MHC-II (ou HLA, no caso de humanos). No entanto, nem todas as células cancerígenas expressam constitutivamente o MHC-II da superfície celular. Por exemplo, nenhuma das linhas celulares de

12 / 39 câncer murino, incluindo, mas não necessariamente limitado a, linfoma EL4, melanoma B16F10, câncer de cólon MC38 e câncer de ovário ID8, expressa MHC-II constitutivo.

[0026] A fim de expressar MHC-II em superfícies celulares de linhas celulares de câncer murino, superexpressamos retroviralmente o gene transativador MHC classe II (CIITA), que é um regulador mestre da apresentação de antígenos mediada por MHC de classe II. Assim, nas modalidades, cada célula cancerígena modificada para uso como uma vacina, conforme descrito neste documento, será modificada de modo que expresse CIITA se não o expressou anteriormente ou será modificada de modo que expresse mais CIITA, em relação à quantidade expressa antes de ser modificado de acordo com esta descrição. Aqueles versados na técnica identificarão que CIITA também é referido como C2TA, NLRA, MHC2TA e CIITAIV.

[0027] Em vez de usar o gene CIITA, espera-se que a superexpressão de genes de cadeia alfa e beta do MHC de classe II induza a expressão de MHC de classe II na superfície celular. Assim, nas modalidades, a engenharia de células cancerígenas usando abordagens de biologia molecular recombinante, como por introdução de direção de polinucleotídeos de codificação de cadeia alfa e beta de MHC, é considerada uma abordagem alternativa para prover vacinas de células cancerígenas modificadas que funcionarão de uma maneira semelhante a células cancerígenas modificadas conforme descrito de outra maneira aqui. Em certas modalidades, a descrição provê o aumento da expressão de MHC ou HLA introduzindo polinucleotídeos diretamente, ou para produzir células cancerígenas modificadas, usando polinucleotídeos que codificam cadeias alfa e beta de HLA de classe II. As cadeias alfa e beta de HLA de classe II para qualquer indivíduo em particular podem ser determinadas usando técnicas que são bem estabelecidas na técnica. Em modalidades, células cancerígenas preexistentes

13 / 39 que são combinadas com o tipo de HLA de um indivíduo podem ser usadas. Alternativamente, qualquer amostra biológica de um indivíduo que compreende células nucleadas pode ser testada para determinar o tipo de HLA do indivíduo, e polinucleotídeos adequados que codificam as cadeias alfa e beta de HLA classe II pertinentes podem ser projetados e produzidos e usados em modalidades desta descrição. Em modalidades, as cadeias alfa de HLA de classe II são para HLA-DM, HLA-DMA, HLA-DO, HLA-DOA, HLA-DP, HLA-DPA1, HLA-DQ, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DR ou HLA-DRA, ou qualquer subtipo desses tipos de HLA. Em modalidades, as cadeias beta de HLA de classe II são para HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, ou HLA-DRB5, ou qualquer subtipo desses tipos de HLA.

[0028] Exemplos representativos e não limitativos de sequências de aminoácidos murinos e humanos de CIITA e proteínas coexpressas, bem como sequências de DNA que as codificam, são providos abaixo. A descrição inclui o uso de sequências de nucleotídeos e aminoácidos que são diferentes dos providos aqui, desde que as células cancerígenas modificadas funcionem para intensificar as respostas imunológicas em relação às células cancerígenas não modificadas. Em modalidades, as células cancerígenas expressam CIITA e moléculas coestimuladoras ou citocinas imunoestimuladoras aqui descritas que são idênticas às sequências de aminoácidos descritas abaixo, ou têm de 70 a 99% de identidade de aminoácidos com as sequências pertinentes. A descrição inclui o uso de proteínas com inserções, deleções e substituições de aminoácidos, desde que mantenham a função pretendida. Todas as sequências polinucleotídicas que codificam as proteínas aqui descritas são abrangidas por esta descrição e não devem ser limitadas por aquelas apresentadas abaixo.

[0029] Os exemplos desta descrição combinam a expressão ou superexpressão de CIITA engenheirada com um ou uma combinação de G- CSF, CD80, Ligante GITR, Ligante OX-40 e Ligante 4-1BB. No entanto, é

14 / 39 demonstrado que a coexpressão de CIITA com 4-1BB-L é superior às outras proteínas coexpressas. Assim, nas modalidades, a descrição provê composições e métodos para uso como vacinas contra o câncer que compreendem células cancerígenas modificadas que são engenheiradas por abordagens de biologia molecular recombinante para expressar CIITA e um imunoestimulador que é preferencialmente 4-1BB-L, embora os outros fatores imunoestimuladores estejam incluídos no escopo desta descrição.

[0030] Em modalidades, o uso de uma vacina contra câncer celular descrita no presente documento compreende uma terapia do câncer. Em modalidades, o uso de uma vacina contra o câncer celular aqui descrita produz uma resposta de memória durável, incluindo, mas não necessariamente limitada a, uma resposta de memória durável de células T CD8+. Em modalidades, uma única administração de uma composição de vacina celular aqui descrita produziu uma resposta imune que dura pelo menos de pelo menos um mês, a pelo menos um ano, ou por pelo menos um ano, ou irá prover proteção vitalícia e, assim, para uso em humanos ou animais não humanos pode durar décadas. Assim, usos humanos e veterinários estão incluídos.

[0031] Em modalidades, o uso de uma vacina contra o câncer celular ou polinucleotídeo relacionado, conforme descrito aqui, produz qualquer um ou qualquer combinação de resultados, que podem ser comparados a qualquer referência adequada: ativação melhorada de células T, aumento de células T TR-CD4+, produção e/ou persistência celular de memória CD8+ melhorada, produção melhorada de anticorpos anticâncer, inibição melhorada do crescimento do tumor e tempo de sobrevivência melhorado. Em modalidades, uma vacinação desta descrição evita a formação de tumores, ou limita o crescimento de um tumor existente, ou erradica tumores existentes. Em modalidades, a referência é obtida por células cancerígenas que expressam uma molécula imunoestimuladora diferente da molécula imunoestimuladora

15 / 39 que era um componente de uma resposta imune melhorada. Em modalidades, a capacidade de uma vacina aqui descrita para melhorar a resposta à reintrodução com células cancerígenas é melhorada.

[0032] Os vetores que codificam o CIITA e ou as moléculas coestimuladoras podem ser qualquer vetor adequado ou outro polinucleotídeo. Um ou mais vetores ou polinucleotídeos podem ser usados. Em modalidades não limitativas, vetores retrovirais podem ser usados. A Figura 1 provê uma modalidade não limitativa de um vetor adequado. Em modalidades, uma codificação de sequência, ou projetada para codificar CIITA, uma vez integrada, é usada sozinha em um vetor. Em modalidades, uma codificação de sequência, ou projetada para codificar uma molécula coestimuladora uma vez integrada, é usada sozinha em um vetor. Em modalidades, um único vetor codifica ou é projetado para codificar o CIITA e a molécula coestimuladora. Assim, em modalidades, a descrição compreende vetores policistrônicos. Em modalidades, o CIITA e a sequência que codifica a molécula coestimuladora são separados por, por exemplo, uma sequência de entrada de ribossomo interna (IRES).

[0033] Em modalidades, as vacinas de células cancerígenas, ou polinucleotídeos que codificam as proteínas aqui descritas, são usadas simultaneamente ou sequencialmente com quimioterapia convencional ou radioterapia ou outra imunoterapia, ou antes ou após uma intervenção cirúrgica, como uma ressecção de tumor. Em modalidades, as vacinas de células cancerígenas, ou polinucleotídeos que codificam as proteínas que são expressas de forma recombinante pelas vacinas de células cancerígenas, são usadas em doses únicas ou múltiplas. Em modalidades, as vacinas contra o câncer são providas apenas uma vez ou semanalmente, mensalmente, a cada 3 meses, a cada 6 meses, anualmente ou em um intervalo de anos predeterminado.

[0034] As vacinas de células cancerígenas aqui descritas podem ser

16 / 39 administradas a um indivíduo em necessidade das mesmas usando qualquer via adequada, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal.

As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea.

Em modalidades, uma quantidade de células cancerígenas administradas compreende uma dose eficaz.

Em modalidades, uma dose eficaz compreende células suficientes para produzir um ou mais efeitos aqui descritos, incluindo qualquer resposta mediada por células, ou resposta humoral, ou uma combinação das mesmas, que é eficaz para inibir o crescimento do câncer, e/ou gerar uma resposta de memória anticâncer.

Em modalidades, 104 a 109 células cancerígenas modificadas são introduzidas.

Em modalidades, uma composição de célula cancerígena desta descrição para uso como uma vacina compreende células isoladas modificadas conforme descrito no presente documento, em que todas ou algumas das células cancerígenas são modificadas.

Em modalidades, a descrição inclui composições compreendendo células, em que de 1 a 100% das células são células cancerígenas modificadas.

Em modalidades, a descrição provê composições compreendendo células cancerígenas, em que de 1 a 100% das células cancerígenas são células cancerígenas modificadas.

Aqueles versados na técnica identificarão que a retenção da morfologia das células cancerígenas é uma solução pertinente ao fenótipo modificado das células cancerígenas.

Em modalidades, células cancerígenas modificadas podem ser incluídas em uma composição farmacêutica.

Células cancerígenas modificadas e/ou polinucleotídeos da presente descrição podem ser providos em composições farmacêuticas combinando-as com quaisquer carreadores, excipientes e/ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis adequados.

Exemplos de carreadores, excipientes e estabilizador farmaceuticamente aceitáveis podem ser verificados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA.

Lippincott Williams & Wilkins, a descrição da qual é incorporada neste documento por referência.

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[0035] Em modalidades, um ou mais polinucleotídeos recombinantes aqui descritos para uso na preparação de formulações de vacinas celulares, ou outro polinucleotídeo terapêutico, podem ser usados como o agente que é distribuído ao indivíduo e, assim, os próprios polinucleotídeos podem compreender um agente terapêutico. Em modalidades, uma composição distribuída a um indivíduo de acordo com esta descrição pode ser uma composição livre de célula. Em modalidades, uma combinação de células cancerígenas modificadas, e polinucleotídeos que não são células, pode ser usada.

[0036] Em modalidades, se um agente terapêutico usado em um método desta descrição for um polinucleotídeo, ele pode ser administrado ao indivíduo como um polinucleotídeo nu, em combinação com um reagente de distribuição, ou como um plasmídeo recombinante ou vetor viral que compreende e/ou expressa o agente polinucleotídico. Em uma modalidade, as proteínas são codificadas por um vírus oncolítico recombinante, que pode alvejar especificamente células cancerígenas e que podem ser não infecciosas para células não cancerígenas, e/ou são eliminadas de células não cancerígenas se o vírus oncolítico entrar nas células não cancerígenas. Exemplos de vírus oncolíticos recombinantes que podem ser usados com esta descrição incluem, mas não estão limitados a, vírus vaccinia recombinante (rOVV). Em modalidades, um ou mais polinucleotídeos aqui descritos podem ser distribuídos por meio de um vírus modificado compreendendo um capsídeo viral modificado ou outra proteína que é alvejada para, e assim, se aglutinará com especificidade, a um ou mais ligantes que são preferencialmente ou exclusivamente expressos por células cancerígenas. Em modalidades, polinucleotídeos separados que codificam proteínas distintas aqui descritas podem ser usados. Em modalidades, um ou mais polinucleotídeos aqui descritos podem ser injetados diretamente em um tumor.

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[0037] Os agentes terapêuticos polinucleotídicos desta descrição podem ser combinados, se desejado, com um agente de distribuição. Reagentes de distribuição adequados para administração incluem, mas não estão limitados ao reagente lipofílico Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; cellfectin; ou policatiões (por exemplo, polilisina), lipossomas ou combinações dos mesmos.

[0038] A terapia ou inibição do câncer, conforme descrito neste documento, pode ser combinada com qualquer outra abordagem anticâncer, como intervenções cirúrgicas e agentes quimioterápicos convencionais. Em modalidades, o tratamento do câncer de acordo com esta descrição pode ser combinado com a administração de um ou mais inibidores do ponto de verificação imunológico. Em modalidades, os inibidores do ponto de verificação compreendem um inibidor do ponto de verificação da proteína-1 anti-morte celular programada (anti-PD-1), ou um inibidor do ponto de verificação da proteína anti-T-linfócito-associada citotóxico 4 (anti-CTLA-4). Há inúmeros inibidores do ponto de verificação conhecidos na técnica. Por exemplo, agentes anti-PD-1 incluem Pembrolizumab e Nivolumab. Um exemplo anti-PD-L1 é Avelumab. Um exemplo anti-CTLA-4 é Ipilimumab.

[0039] Em certas demonstrações não limitativas nos exemplos abaixo, a imunogenicidade de células cancerígenas engenheiradas é analisada usando camundongos C57BL/6 singênicos com linfoma modificado, células de câncer de cólon, melanoma e linhas celulares de câncer de ovário, todos os quais demonstram coexpressão de CIITA e 4-1BB-L é uma abordagem eficaz para estimular respostas anticâncer potentes. Assim, e sem a intenção de se limitar a qualquer teoria em particular, espera-se que as abordagens aqui descritas, e particularmente a coexpressão de CIITA com 4-1BB-L, sejam amplamente aplicáveis a uma ampla variedade de tipos de câncer, e funcionarão com a mesma eficácia ou eficácia semelhante em humanos, dado que modelos de camundongo clinicamente relevantes são usados para

19 / 39 demonstrar aspectos da descrição.

[0040] Os aspectos da descrição são demonstrados pelos seguintes exemplos, que são destinados a ilustrar, mas não se limitam a descrição.

EXEMPLOS

[0041] A imunogenicidade das células cancerígenas engenheiradas foi investigada pela introdução delas em camundongos C57BL/6 singênicos.

[0042] Em um modelo de linfoma EL4, a superexpressão de CIITA sozinho não alterou o crescimento do tumor em comparação com o EL4 parental. Em contraste, a coexpressão de CIITA e moléculas imunoestimuladoras retardou significativamente o crescimento do tumor. Em particular, EL4 que coexpressa OX40-L+CIITA ou 4-1BB-L+CIITA foi completamente rejeitado. Neste modelo, 3 grupos que receberam EL4 superexpressando OX40-L+CIITA, 4-1BB-L+CIITA e 4-1BB-L sozinho mostraram eliminação completa do tumor em todos os camundongos (Figura 2).

[0043] A fim de avaliar a indução da resposta de célula T de memória a longo prazo pelas células cancerígenas engenheiradas, os camundongos que rejeitaram EL4 superexpressando OX40-L+CIITA, 4-1BB-L+CIITA ou 4- 1BB-L sozinho foram reintroduzidos com EL4 parental (Figura 3A). Apenas uma fração de camundongos que rejeitaram EL4 superexpressando 4-1BB-L sozinho ou OX40-L+CIITA foram resistentes à reintrodução (Figura 3B). Em contraste, todos os camundongos que rejeitaram 4-1BB-L+CIITA rejeitaram EL4 reintroduzido. 4-1BB-L-EL4 e 4-1BB-L+CIITA-EL4 induziram resposta de células T CD8+ específica de EL4 comparável na fase inicial de resposta imune (Figura 3D ESQUERDA). Em contraste, as células T CD8+ induzidas por 4-1BB-L+CIITA foram mantidas no ponto no tempo posterior, em comparação com a diminuição significativa no grupo 4-1BB-L sozinho (Figura 3D DIREITA). Os camundongos que rejeitaram OX40-L+CIITA desenvolveram menos células T CD8+ específicas de EL4 no ponto no tempo

20 / 39 anterior e diminuíram ainda mais no ponto no tempo posterior (Figura 3D ESQUERDA e DIREITA).

[0044] A fim de determinar se as células cancerígenas engenheiradas induzem anticorpos antitumorais, os camundongos que rejeitaram EL4 superexpressado OX40-L+CIITA, 4-1BB-L+CIITA e 4-1BB-L sozinho foram reintroduzidos com EL4 que foram engenheirados por edição de gene CRISPR/Cas9 para silenciar o gene 2m e, portanto, não expressam nenhuma molécula de MHC (EL4 com perda de MHC) (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, todos os camundongos que rejeitaram 4-1BB+CIITA expressando EL4 eram resistentes à reintrodução com EL4 com perda de MHC, enquanto aqueles EL4 expressando 4-1BB-L sozinho ou OX40-L+CIITA rejeitados mostraram nenhuma ou resistência parcial, respectivamente (Figura 4B). A presença de anticorpos circulantes reativos a EL4 foi testada incubando o EL4 parental em soro diluído e detectando imunoglobulina (IgG) ligada a EL4 por anticorpo IgG anticamundongo fluorescente. EL4 expressando 4-1BB- L+CIITA induziu resposta de IgG de ligação a EL4 significativamente maior do que EL4 expressando 4-1BB-L sozinho. Em contraste, EL4 expressando OX40-L+CIITA induziu uma resposta de anticorpo mais fraca (Figura 4C e 4D). Os anticorpos induzidos por 4-1BB-L+CIITA expressando EL4 foram específicos para EL4, como evidenciado por células T murinas ativadas de controle, melanoma B16F10 e câncer de cólon MC38 que não foram corados pelo soro (Figura 4E). Os anticorpos induzidos por EL4 expressando 4-1BB- L+CIITA induziram citotoxicidade dependente do complemento contra EL4 (Figura 4F).

[0045] O potencial terapêutico das células cancerígenas engenheiradas foi analisado usando um modelo de vacina terapêutica. Neste modelo, células EL4 superexpressando CIITA que expressam ambos MHC de classe I e MHC-II ou EL4 com perda de MHC foram inoculadas em camundongos C57BL/6, e os camundongos foram vacinados com EL4

21 / 39 engenheirado por irradiação (Figura 5A). A vacinação terapêutica com EL4 expressando 4-1BB-L+CIITA induziu efeito antitumoral significativo incluindo eliminação completa em 2/5 camundongos (Figura 5B). Além disso, a mesma vacinação eliminou EL4 com perda de MHC em 2/7 camundongos e prolongou a sobrevivência de camundongos restantes (Figura 5C e 5D).

[0046] O efeito das células cancerígenas engenheiradas foi testado em outros modelos de tumor. Em ambos os modelos de câncer de cólon MC38 e melanoma B16F10, células cancerígenas expressando 4-1BB-L+CIITA foram rejeitadas espontaneamente em todos os camundongos (Figura 6A), o que foi associado a anticorpos circulantes mais elevados específicos contra os respectivos cânceres (Figura 6B). Usando a linha celular de câncer de ovário murino, ID8, a vacinação de camundongos com ID8 expressando 4-1BB- L+CIITA irradiado e, em menor extensão, ID8 expressando OX40-L+CIITA, induziu anticorpos que se ligam ao ID8 parental (Figura 6C).

[0047] As seguintes sequências murinas representativas foram usadas para demonstrar modalidades desta descrição. Aqueles versados na técnica identificarão, dado o benefício desta descrição, que as sequências humanas proveem abaixo as sequências murinas que podem ser adaptadas para uso em vacinas contra o câncer humano e outras abordagens terapêuticas com base na presente descrição. Camundongo

[0048] Em sequências de DNA, os códons em negrito indicam o códon de Partida ou de Parada.

[0049] <CIITA>

[0050] >Transativador do complexo principal de histocompatibilidade de Mus musculus classe II (CIITA) (também conhecido como C2ta; Gm9475; Mhc2ta; EG669998) >Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_001302618.1)

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ATGAACCACTTCCAGGCCATCCTGGCCCAAGTACAG ACACTGCTCTCCAGCCAGAAGCCCAGGCAGGTGCGGGCCCTCCTG GATGGCCTGCTGGAAGAAGAGCTGCTCTCACGGGAATACCACTGT GCCTTGCTGCATGAGCCTGATGGTGATGCCCTGGCCCGGAAGATTT CCCTGACCCTGCTGGAGAAAGGGGACTTAGACTTGACTTTCTTGAG CTGGGTCTGCAACAGTCTGCAGGCTCCCACGGTAGAGAGGGGCAC CAGCTACAGGGACCATGGAGACCATAGTCTGTGTGCCACCATGGA TCTGGGATCTCCAGAGGGCAGCTACCTGGAACTCCTTAACAGTGAT GCCGACCCCCTACATCTCTACCACCTCTATGACCAGATGGACCTGG CTGGGGAGGAGGAGATCGAACTCAGCTCAGAGCCAGACACAGAT ACCATCAACTGCGACCAGTTCAGCAAGCTGTTGCAGGACATGGAA CTGGATGAAGAGACCCGGGAGGCCTATGCCAACATTGCGGAACTG GATCAGTACGTGTTCCAGGATACCCAGCTCGAGGGCCTGAGCAAG GACCTCTTCATAGAGCACATTGGAGCAGAGGAAGGCTTTGGTGAG AACATAGAGATCCCTGTAGAAGCAGGACAGAAGCCTCAGAAGAG ACGCTTCCCGGAAGAGCATGCTATGGACTCAAAGCACAGGAAGCT AGTGCCCACCTCTAGGACCTCACTGAACTATTTGGATCTCCCCACT GGGCACATCCAGATCTTCACCACTCTGCCCCAGGGACTCTGGCAA ATCTCAGGGGCTGGCACAGGTCTCTCCAGTGTCCTAATCTACCACG GTGAGATGCCCCAGGTCAACCAAGTGCTCCCTTCAAGCAGCCTCA GTATCCCCAGTCTCCCCGAGTCCCCAGACCGGCCTGGCTCCACCAG CCCCTTCACACCATCTGCAGCTGACCTGCCCAGCATGCCCGAACCT GCGCTGACCTCCCGTGTAAATGAGACAGAGGACACATCTCCCTCC CCATGCCAAGAGGGTCCCGAGTCTTCCATCAAGCTTCCAAAATGG CCAGAGGCTGTGGAGCGATTCCAGCACTCCCTACAGGACAAATAC AAGGCATTGCCCCAGAGCCCAAGGGGTCCTCTGGTGGCCGTGGAG CTGGTACGGGCCAGGCTGGAAAGAGGCAGCAACAAGAGCCAGGA AAGGGAGCTGGCCACTCCCGACTGGACAGAGCGCCAGCTAGCCCA CGGTGGTCTGGCAGAGGTACTTCAGGTTGTCAGTGACTGCAGGCG

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ACCAGGAGAGACACAGGTGGTCGCTGTGCTGGGCAAGGCTGGCCA GGGAAAGAGCCACTGGGCCAGGACAGTGAGTCACACCTGGGCATG TGGCCAGTTGCTACAATATGACTTTGTCTTCTATGTCCCCTGTCATT GCTTGGATCGTCCCGGGGACACCTACCACCTGCGGGATCTGCTCTG TCCCCCGAGCCTGCAGCCACTGGCCATGGATGACGAGGTCCTTGAT TATATCGTGAGGCAGCCAGACCGTGTTCTGCTCATCCTAGATGCTT TCGAGGAGCTAGAGGCCCAAGATGGCCTCCTGCACGGACCCTGTG GATCTCTGTCCCCAGAGCCCTGCTCCCTCCGAGGACTGCTGGCTGG GATCTTCCAGCGGAAGCTACTGCGAGGCTGCACACTGCTCCTCACA GCCCGGCCCCGGGGCCGCCTGGCTCAGAGCCTGAGCAAGGCAGAT GCCATCTTTGAGGTGCCCAGCTTCTCTACCAAGCAGGCCAAGACTT ACATGAGGCACTACTTTGAGAACTCAGGGACAGCGGGGAACCAAG ACAAGGCCCTGGGCCTCCTGGAGGGCCAGCCTCTTCTCTGCAGCTA TAGTCACAGCCCTGTTGTGTGCAGGGCTGTGTGCCAGCTCTCCAAG GCCCTGCTAGAACAGGGCACAGAGGCCCAGCTACCTTGTACACTT ACAGGACTCTATGTCAGCCTGCTAGGTCCTGCAGCTCAGAACAGTC CTCCCGGAGCCTTAGTCGAGCTGGCCAAGCTGGCCTGGGAGCTGG GACGAAGACACCAAAGCACCTTGCAAGAAACCCGGTTTTCATCCG TGGAGGTGAAAACCTGGGCAGTGACCCAAGGCTTGATGCAGCAGA CCCTGGAGACCACGGAGGCTCAACTGGCCTTCTCCAGTTTTCTGCT ACAGTGTTTCCTGGGTGCTGTGTGGCTGGCACAGTGCAATGAAATC AAAGACAAGGAGCTGCCACAGTACCTGGCCTTGACTCCGAGGAAG AAGAGACCCTATGACAACTGGCTGGAGGGTGTACCACGCTTTCTG GCTGGATTAGTTTTCCAGCCTCGAGCCCACTGCCTGGGAGCTCTGG TGGAGCCTGCAGTGGCTGCAGTGGCGGATAGGAAACAGAAGGTTC TTACCAGGTACCTGAAGCGCCTGAAGCTGGGGACACTCCGGGCAG GGAGGCTGCTGGAGCTGCTCCACTGTGCCCACGAGACACAGCAAC CTGGGATATGGGAGCATGTTGCACACCAGCTCCCTGGCCACCTCTC CTTCCTGGGCACCCGGCTCACACCCCCAGATGTGTATGTGCTGGGC

24 / 39

AGGGCCTTGGAGACAGCCAGCCAGGACTTCTCCTTGGACCTTCGTC AGACTGGCGTTGAGCCTTCTGGACTGGGAAACCTCGTGGGACTCA GCTGTGTCACCAGTTTCAGGGCCTCCTTGAGTGATACAATGGCATT ATGGGAGTCCCTTCAGCAGCAGGGAGAAGCCCAGCTACTCCAGGC GGCAGAGGAGAAGTTCACCATTGAGCCATTTAAAGCCAAATCCCC AAAGGATGTGGAAGACCTGGATCGTCTCGTGCAGACCCAGAGGCT GAGAAACCCCTCAGAAGATGCAGCCAAGGATCTTCCTGCCATCCG GGACCTTAAGAAGCTAGAGTTTGCGTTGGGCCCCATCTTGGGCCCC CAGGCTTTCCCCACACTGGCAAAGATCCTTCCAGCCTTCTCTTCTCT GCAACACCTGGACCTGGACTCACTTAGTGAGAACAAGATCGGAGA CAAGGGTGTGTCGAAGCTCTCAGCCACCTTCCCTCAGCTGAAGGCC CTGGAGACGCTCAACTTGTCCCAAAACAACATCACTGATGTGGGT GCCTGCAAGCTTGCAGAAGCTCTGCCAGCCCTAGCCAAGTCCCTCC TAAGGCTGAGCTTGTACAATAACTGCATCTGTGACAAAGGAGCCA AGAGCCTGGCACAAGTACTTCCGGACATGGTGTCCCTGCGTGTGAT GGATGTCCAGTTCAACAAGTTCACGGCTGCCGGTGCCCAGCAACT GGCCTCCAGCCTTCAGAAGTGCCCTCAGGTGGAAACACTGGCAAT

GTGGACACCCACTATCCCCTTTGGGGTTCAGGAACACCTGCAGCA GCTGGATGCCAGGATCAGTCTGAGATGA (SEQ ID NO:1) Sequência de Proteína CIITA (Sequência de Referência NCBI: NP_001289547.1)

MNHFQAILAQVQTLLSSQKPRQVRALLDGLLEEELLSR EYHCALLHEPDGDALARKISLTLLEKGDLDLTFLSWVCNSLQAPTVE RGTSYRDHGDHSLCATMDLGSPEGSYLELLNSDADPLHLYHLYDQM DLAGEEEIELSSEPDTDTINCDQFSKLLQDMELDEETREAYANIAELDQ YVFQDTQLEGLSKDLFIEHIGAEEGFGENIEIPVEAGQKPQKRRFPEEH AMDSKHRKLVPTSRTSLNYLDLPTGHIQIFTTLPQGLWQISGAGTGLS SVLIYHGEMPQVNQVLPSSSLSIPSLPESPDRPGSTSPFTPSAADLPSMP EPALTSRVNETEDTSPSPCQEGPESSIKLPKWPEAVERFQHSLQDKYK

25 / 39

ALPQSPRGPLVAVELVRARLERGSNKSQERELATPDWTERQLAHGGL AEVLQVVSDCRRPGETQVVAVLGKAGQGKSHWARTVSHTWACGQL LQYDFVFYVPCHCLDRPGDTYHLRDLLCPPSLQPLAMDDEVLDYIVR QPDRVLLILDAFEELEAQDGLLHGPCGSLSPEPCSLRGLLAGIFQRKLL RGCTLLLTARPRGRLAQSLSKADAIFEVPSFSTKQAKTYMRHYFENSG TAGNQDKALGLLEGQPLLCSYSHSPVVCRAVCQLSKALLEQGTEAQL PCTLTGLYVSLLGPAAQNSPPGALVELAKLAWELGRRHQSTLQETRF SSVEVKTWAVTQGLMQQTLETTEAQLAFSSFLLQCFLGAVWLAQCN EIKDKELPQYLALTPRKKRPYDNWLEGVPRFLAGLVFQPRAHCLGAL VEPAVAAVADRKQKVLTRYLKRLKLGTLRAGRLLELLHCAHETQQP GIWEHVAHQLPGHLSFLGTRLTPPDVYVLGRALETASQDFSLDLRQT GVEPSGLGNLVGLSCVTSFRASLSDTMALWESLQQQGEAQLLQAAEE KFTIEPFKAKSPKDVEDLDRLVQTQRLRNPSEDAAKDLPAIRDLKKLE FALGPILGPQAFPTLAKILPAFSSLQHLDLDSLSENKIGDKGVSKLSATF PQLKALETLNLSQNNITDVGACKLAEALPALAKSLLRLSLYNNCICDK

GAKSLAQVLPDMVSLRVMDVQFNKFTAAGAQQLASSLQKCPQVETL AMWTPTIPFGVQEHLQQLDARISLR (SEQ ID NO:2) <4-1BB-L> >TNFSF9: Membro 9 da superfamília TNF (também conhecido como Ly63l; 4-1BBL; Cd137l; 4-1BB-L; AI848817) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_009404.3)

ATGGACCAGCACACACTTGATGTGGAGGATACCGCG GATGCCAGACATCCAGCAGGTACTTCGTGCCCCTCGGATGCGGCG CTCCTCAGAGATACCGGGCTCCTCGCGGACGCTGCGCTCCTCTCAG ATACTGTGCGCCCCACAAATGCCGCGCTCCCCACGGATGCTGCCTA CCCTGCGGTTAATGTTCGGGATCGCGAGGCCGCGTGGCCGCCTGC ACTGAACTTCTGTTCCCGCCACCCAAAGCTCTATGGCCTAGTCGCT TTGGTTTTGCTGCTTCTGATCGCCGCCTGTGTTCCTATCTTCACCCG

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CACCGAGCCTCGGCCAGCGCTCACAATCACCACCTCGCCCAACCT GGGTACCCGAGAGAATAATGCAGACCAGGTCACCCCTGTTTCCCA CATTGGCTGCCCCAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTGTTCGCC AAGCTACTGGCTAAAAACCAAGCATCGTTGTGCAATACAACTCTG AACTGGCACAGCCAAGATGGAGCTGGGAGCTCATACCTATCTCAA GGTCTGAGGTACGAAGAAGACAAAAAGGAGTTGGTGGTAGACAG TCCCGGGCTCTACTACGTATTTTTGGAACTGAAGCTCAGTCCAACA TTCACAAACACAGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTCTCTCTTGTTT TGCAAGCAAAGCCTCAGGTAGATGACTTTGACAACTTGGCCCTGA CAGTGGAACTGTTCCCTTGCTCCATGGAGAACAAGTTAGTGGACC GTTCCTGGAGTCAACTGTTGCTCCTGAAGGCTGGCCACCGCCTCAG TGTGGGTCTGAGGGCTTATCTGCATGGAGCCCAGGATGCATACAG

AGACTGGGAGCTGTCTTATCCCAACACCACCAGCTTTGGACTCTTT CTTGTGAAACCCGACAACCCATGGGAATGA (SEQ ID NO:3) Sequência de Proteína 4-1BB-L (Sequência de Referência NCBI: NP_033430.1)

MDQHTLDVEDTADARHPAGTSCPSDAALLRDTGLLAD AALLSDTVRPTNAALPTDAAYPAVNVRDREAAWPPALNFCSRHPKL YGLVALVLLLLIAACVPIFTRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPV SHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGAGSSYLSQ GLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQ

AKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVG LRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWE (SEQ ID NO:4) <OX40-L> >TNFSF4: Membro 4 da superfamília TNF (também conhecido como Ath1; gp34; Ath-1; Ox40l; TXGP1; CD134L; OX-40L; Tnlg2b; Txgp1l) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI:

27 / 39 NM_009452.2)

ATGGAAGGGGAAGGGGTTCAACCCCTGGATGAGAAT CTGGAAAACGGATCAAGGCCAAGATTCAAGTGGAAGAAGACGCT AAGGCTGGTGGTCTCTGGGATCAAGGGAGCAGGGATGCTTCTGTG CTTCATCTATGTCTGCCTGCAACTCTCTTCCTCTCCGGCAAAGGAC CCTCCAATCCAAAGACTCAGAGGAGCAGTTACCAGATGTGAGGAT GGGCAACTATTCATCAGCTCATACAAGAATGAGTATCAAACTATG GAGGTGCAGAACAATTCGGTTGTCATCAAGTGCGATGGGCTTTAT ATCATCTACCTGAAGGGCTCCTTTTTCCAGGAGGTCAAGATTGACC TTCATTTCCGGGAGGATCATAATCCCATCTCTATTCCAATGCTGAA CGATGGTCGAAGGATTGTCTTCACTGTGGTGGCCTCTTTGGCTTTC AAAGATAAAGTTTACCTGACTGTAAATGCTCCTGATACTCTCTGCG AACACCTCCAGATAAATGATGGGGAGCTGATTGTTGTCCAGCTAA

CGCCTGGATACTGTGCTCCTGAAGGATCTTACCACAGCACTGTGAA CCAAGTACCACTGTGA (SEQ ID NO:5) > Sequência de Proteína OX40-L (Sequência de Referência NCBI: NP_033478.1)

MEGEGVQPLDENLENGSRPRFKWKKTLRLVVSGIKGA GMLLCFIYVCLQLSSSPAKDPPIQRLRGAVTRCEDGQLFISSYKNEYQT MEVQNNSVVIKCDGLYIIYLKGSFFQEVKIDLHFREDHNPISIPMLNDG

RRIVFTVVASLAFKDKVYLTVNAPDTLCEHLQINDGELIVVQLTPGYC APEGSYHSTVNQVPL (SEQ ID NO:6) <GITR-L> >Membro 18 da superfamília TNFSF18 TNF (também conhecido como Gitrl; Tnlg2a) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_183391.3)

ATGGAGGAAATGCCTTTGAGAGAATCAAGTCCTCAA AGGGCAGAGAGGTGCAAGAAGTCATGGCTCTTGTGCATAGTGGCT

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CTGTTACTGATGTTGCTCTGTTCTTTGGGTACACTGATCTATACTTC ACTCAAGCCAACTGCCATCGAGTCCTGCATGGTTAAGTTTGAACTA TCATCCTCAAAATGGCACATGACATCTCCCAAACCTCACTGTGTGA ATACGACATCTGATGGGAAGCTGAAGATACTGCAGAGTGGCACAT ATTTAATCTACGGCCAAGTGATTCCTGTGGATAAGAAATACATAA AAGACAATGCCCCCTTCGTAGTACAGATATATAAAAAGAATGATG TCCTACAAACTCTAATGAATGATTTTCAAATCTTGCCTATAGGAGG GGTTTATGAACTGCATGCTGGAGATAACATATATCTGAAGTTCAAC

TCTAAAGACCATATTCAGAAAACTAACACATACTGGGGGATCATC TTAATGCCTGATCTACCATTCATCTCTTAG (SEQ ID NO:7) > Sequência de Proteína TNFSF18 (Sequência de Referência NCBI: NP_899247.3)

MEEMPLRESSPQRAERCKKSWLLCIVALLLMLLCSLGT LIYTSLKPTAIESCMVKFELSSSKWHMTSPKPHCVNTTSDGKLKILQSG

TYLIYGQVIPVDKKYIKDNAPFVVQIYKKNDVLQTLMNDFQILPIGGV YELHAGDNIYLKFNSKDHIQKTNTYWGIILMPDLPFIS (SEQ ID NO:8) <CD80> >CD80 (também conhecido como B71; Ly53; TSA1; Cd28l; Ly-53; MIC17) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_001359898.1)

ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCAC TCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTG ATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCA AGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCC TCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGA CAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCC CGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTT ATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTG

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TCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGG CTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACAT AACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTG CTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAA AATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGAT CCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATA CGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGC TCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGACCC TCCTGATAGCAAGAACACACTTGTGCTCTTTGGGGCAGGATTCGGC GCAGTAATAACAGTCGTCGTCATCGTTGTCATCATCAAATGCTTCT GTAAGCACAGAAGCTGTTTCAGAAGAAATGAGGCAAGCAGAGAA

ACAAACAACAGCCTTACCTTCGGGCCTGAAGAAGCATTAGCTGAA CAGACCGTCTTCCTTTAG (SEQ ID NO:9) > Sequência de Proteína CD80 (Sequência de Referência NCBI: NP_001346827.1)

MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVD EQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLK VWPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKH LALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENG RELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDF

TWEKPPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRN EASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL (SEQ ID NO:10) <GM-CSF> > CSF2: fator estimulante de colônias 2 (também conhecido como CSF; Csfgm; GMCSF; Gm-CSf; MGI-IGM) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_009969.4)

ATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGG TCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCG

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GCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCT GGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTC TAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTG AAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAG GGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCC CCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCG

GATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTG AATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGA (SEQ ID NO:11) > Sequência de Proteína GM-CSF (Sequência de Referência NCBI: NP_034099.2)

MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEA LNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKL

KGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFEC KKPGQK (SEQ ID NO:12). Humano

[0051] Nas sequências de DNA seguintes, os códons em negrito indicam o códon de Partida ou de Parada. <CIITA>

[0052] >Transativador do complexo principal de histocompatibilidade de Homo sapiens classe II (CIITA) (também conhecido na técnica como C2TA; NLRA; MHC2TA; CIITAIV) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_001286402.1)

ATGCGTTGCCTGGCTCCACGCCCTGCTGGGTCCTACC TGTCAGAGCCCCAAGGCAGCTCACAGTGTGCCACCATGGAGTTGG GGCCCCTAGAAGGTGGCTACCTGGAGCTTCTTAACAGCGATGCTG ACCCCCTGTGCCTCTACCACTTCTATGACCAGATGGACCTGGCTGG AGAAGAAGAGATTGAGCTCTACTCAGAACCCGACACAGACACCAT CAACTGCGACCAGTTCAGCAGGCTGTTGTGTGACATGGAAGGTGA

31 / 39

TGAAGAGACCAGGGAGGCTTATGCCAATATCGCGGAACTGGACCA GTATGTCTTCCAGGACTCCCAGCTGGAGGGCCTGAGCAAGGACAT TTTCATAGAGCACATAGGACCAGATGAAGTGATCGGTGAGAGTAT GGAGATGCCAGCAGAAGTTGGGCAGAAAAGTCAGAAAAGACCCT TCCCAGAGGAGCTTCCGGCAGACCTGAAGCACTGGAAGCCAGCTG AGCCCCCCACTGTGGTGACTGGCAGTCTCCTAGTGGGACCAGTGA GCGACTGCTCCACCCTGCCCTGCCTGCCACTGCCTGCGCTGTTCAA CCAGGAGCCAGCCTCCGGCCAGATGCGCCTGGAGAAAACCGACCA GATTCCCATGCCTTTCTCCAGTTCCTCGTTGAGCTGCCTGAATCTCC CTGAGGGACCCATCCAGTTTGTCCCCACCATCTCCACTCTGCCCCA TGGGCTCTGGCAAATCTCTGAGGCTGGAACAGGGGTCTCCAGTAT ATTCATCTACCATGGTGAGGTGCCCCAGGCCAGCCAAGTACCCCCT CCCAGTGGATTCACTGTCCACGGCCTCCCAACATCTCCAGACCGGC CAGGCTCCACCAGCCCCTTCGCTCCATCAGCCACTGACCTGCCCAG CATGCCTGAACCTGCCCTGACCTCCCGAGCAAACATGACAGAGCA CAAGACGTCCCCCACCCAATGCCCGGCAGCTGGAGAGGTCTCCAA CAAGCTTCCAAAATGGCCTGAGCCGGTGGAGCAGTTCTACCGCTC ACTGCAGGACACGTATGGTGCCGAGCCCGCAGGCCCGGATGGCAT CCTAGTGGAGGTGGATCTGGTGCAGGCCAGGCTGGAGAGGAGCAG CAGCAAGAGCCTGGAGCGGGAACTGGCCACCCCGGACTGGGCAG AACGGCAGCTGGCCCAAGGAGGCCTGGCTGAGGTGCTGTTGGCTG CCAAGGAGCACCGGCGGCCGCGTGAGACACGAGTGATTGCTGTGC TGGGCAAAGCTGGTCAGGGCAAGAGCTATTGGGCTGGGGCAGTGA GCCGGGCCTGGGCTTGTGGCCGGCTTCCCCAGTACGACTTTGTCTT CTCTGTCCCCTGCCATTGCTTGAACCGTCCGGGGGATGCCTATGGC CTGCAGGATCTGCTCTTCTCCCTGGGCCCACAGCCACTCGTGGCGG CCGATGAGGTTTTCAGCCACATCTTGAAGAGACCTGACCGCGTTCT GCTCATCCTAGACGGCTTCGAGGAGCTGGAAGCGCAAGATGGCTT CCTGCACAGCACGTGCGGACCGGCACCGGCGGAGCCCTGCTCCCT

32 / 39

CCGGGGGCTGCTGGCCGGCCTTTTCCAGAAGAAGCTGCTCCGAGG TTGCACCCTCCTCCTCACAGCCCGGCCCCGGGGCCGCCTGGTCCAG AGCCTGAGCAAGGCCGACGCCCTATTTGAGCTGTCCGGCTTCTCCA TGGAGCAGGCCCAGGCATACGTGATGCGCTACTTTGAGAGCTCAG GGATGACAGAGCACCAAGACAGAGCCCTGACGCTCCTCCGGGACC GGCCACTTCTTCTCAGTCACAGCCACAGCCCTACTTTGTGCCGGGC AGTGTGCCAGCTCTCAGAGGCCCTGCTGGAGCTTGGGGAGGACGC CAAGCTGCCCTCCACGCTCACGGGACTCTATGTCGGCCTGCTGGGC CGTGCAGCCCTCGACAGCCCCCCCGGGGCCCTGGCAGAGCTGGCC AAGCTGGCCTGGGAGCTGGGCCGCAGACATCAAAGTACCCTACAG GAGGACCAGTTCCCATCCGCAGACGTGAGGACCTGGGCGATGGCC AAAGGCTTAGTCCAACACCCACCGCGGGCCGCAGAGTCCGAGCTG GCCTTCCCCAGCTTCCTCCTGCAATGCTTCCTGGGGGCCCTGTGGC TGGCTCTGAGTGGCGAAATCAAGGACAAGGAGCTCCCGCAGTACC TAGCATTGACCCCAAGGAAGAAGAGGCCCTATGACAACTGGCTGG AGGGCGTGCCACGCTTTCTGGCTGGGCTGATCTTCCAGCCTCCCGC CCGCTGCCTGGGAGCCCTACTCGGGCCATCGGCGGCTGCCTCGGTG GACAGGAAGCAGAAGGTGCTTGCGAGGTACCTGAAGCGGCTGCAG CCGGGGACACTGCGGGCGCGGCAGCTGCTGGAGCTGCTGCACTGC GCCCACGAGGCCGAGGAGGCTGGAATTTGGCAGCACGTGGTACAG GAGCTCCCCGGCCGCCTCTCTTTTCTGGGCACCCGCCTCACGCCTC CTGATGCACATGTACTGGGCAAGGCCTTGGAGGCGGCGGGCCAAG ACTTCTCCCTGGACCTCCGCAGCACTGGCATTTGCCCCTCTGGATT GGGGAGCCTCGTGGGACTCAGCTGTGTCACCCGTTTCAGGGCTGCC TTGAGCGACACGGTGGCGCTGTGGGAGTCCCTGCAGCAGCATGGG GAGACCAAGCTACTTCAGGCAGCAGAGGAGAAGTTCACCATCGAG CCTTTCAAAGCCAAGTCCCTGAAGGATGTGGAAGACCTGGGAAAG CTTGTGCAGACTCAGAGGACGAGAAGTTCCTCGGAAGACACAGCT GGGGAGCTCCCTGCTGTTCGGGACCTAAAGAAACTGGAGTTTGCG

33 / 39

CTGGGCCCTGTCTCAGGCCCCCAGGCTTTCCCCAAACTGGTGCGGA TCCTCACGGCCTTTTCCTCCCTGCAGCATCTGGACCTGGATGCGCT GAGTGAGAACAAGATCGGGGACGAGGGTGTCTCGCAGCTCTCAGC CACCTTCCCCCAGCTGAAGTCCTTGGAAACCCTCAATCTGTCCCAG AACAACATCACTGACCTGGGTGCCTACAAACTCGCCGAGGCCCTG CCTTCGCTCGCTGCATCCCTGCTCAGGCTAAGCTTGTACAATAACT GCATCTGCGACGTGGGAGCCGAGAGCTTGGCTCGTGTGCTTCCGG ACATGGTGTCCCTCCGGGTGATGGACGTCCAGTACAACAAGTTCA CGGCTGCCGGGGCCCAGCAGCTCGCTGCCAGCCTTCGGAGGTGTC CTCATGTGGAGACGCTGGCGATGTGGACGCCCACCATCCCATTCA

GTGTCCAGGAACACCTGCAACAACAGGATTCACGGATCAGCCTGA GATGA (SEQ ID NO:13) > Sequência de Proteína CIITA Humana (Sequência de Referência NCBI: NP_001273331.1)

MRCLAPRPAGSYLSEPQGSSQCATMELGPLEGGYLELL NSDADPLCLYHFYDQMDLAGEEEIELYSEPDTDTINCDQFSRLLCDME GDEETREAYANIAELDQYVFQDSQLEGLSKDIFIEHIGPDEVIGESMEM PAEVGQKSQKRPFPEELPADLKHWKPAEPPTVVTGSLLVGPVSDCSTL PCLPLPALFNQEPASGQMRLEKTDQIPMPFSSSSLSCLNLPEGPIQFVPT ISTLPHGLWQISEAGTGVSSIFIYHGEVPQASQVPPPSGFTVHGLPTSPD RPGSTSPFAPSATDLPSMPEPALTSRANMTEHKTSPTQCPAAGEVSNK LPKWPEPVEQFYRSLQDTYGAEPAGPDGILVEVDLVQARLERSSSKSL ERELATPDWAERQLAQGGLAEVLLAAKEHRRPRETRVIAVLGKAGQ GKSYWAGAVSRAWACGRLPQYDFVFSVPCHCLNRPGDAYGLQDLLF SLGPQPLVAADEVFSHILKRPDRVLLILDGFEELEAQDGFLHSTCGPAP AEPCSLRGLLAGLFQKKLLRGCTLLLTARPRGRLVQSLSKADALFELS GFSMEQAQAYVMRYFESSGMTEHQDRALTLLRDRPLLLSHSHSPTLC RAVCQLSEALLELGEDAKLPSTLTGLYVGLLGRAALDSPPGALAELA KLAWELGRRHQSTLQEDQFPSADVRTWAMAKGLVQHPPRAAESELA

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FPSFLLQCFLGALWLALSGEIKDKELPQYLALTPRKKRPYDNWLEGVP RFLAGLIFQPPARCLGALLGPSAAASVDRKQKVLARYLKRLQPGTLR ARQLLELLHCAHEAEEAGIWQHVVQELPGRLSFLGTRLTPPDAHVLG KALEAAGQDFSLDLRSTGICPSGLGSLVGLSCVTRFRAALSDTVALWE SLQQHGETKLLQAAEEKFTIEPFKAKSLKDVEDLGKLVQTQRTRSSSE DTAGELPAVRDLKKLEFALGPVSGPQAFPKLVRILTAFSSLQHLDLDA LSENKIGDEGVSQLSATFPQLKSLETLNLSQNNITDLGAYKLAEALPSL

AASLLRLSLYNNCICDVGAESLARVLPDMVSLRVMDVQYNKFTAAG AQQLAASLRRCPHVETLAMWTPTIPFSVQEHLQQQDSRISLR (SEQ ID NO:14) <4-1BB-L> >Humano TNFSF9: Membro 9 da superfamília TNF (também conhecido como CD137L; TNLG5A; 4-1BB-L) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_003811.3)

ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAG CCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCC TTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCC GCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTC GCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTC CCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCA GGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGAT GGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCC CTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGT GGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTG CGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCG CTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGG CTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTC GGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAG

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CGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCT GGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGA

CCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAA (SEQ ID NO:15) > Sequência de Proteína 4-1BB-L Humana (Sequência de Referência NCBI: NP_003802.1)

MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLL LLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGL LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDT KELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGA

AALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARAR HAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE (SEQ ID NO:16) <OX40-L> >TNFSF4: Membro 4 da superfamília TNF (também conhecido como GP34; CD252; OX4OL; TXGP1; CD134L; OX-40L; TNLG2B) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_003326.4)

ATGGAAAGGGTCCAACCCCTGGAAGAGAATGTGGGA AATGCAGCCAGGCCAAGATTCGAGAGGAACAAGCTATTGCTGGTG GCCTCTGTAATTCAGGGACTGGGGCTGCTCCTGTGCTTCACCTACA TCTGCCTGCACTTCTCTGCTCTTCAGGTATCACATCGGTATCCTCGA ATTCAAAGTATCAAAGTACAATTTACCGAATATAAGAAGGAGAAA GGTTTCATCCTCACTTCCCAAAAGGAGGATGAAATCATGAAGGTG CAGAACAACTCAGTCATCATCAACTGTGATGGGTTTTATCTCATCT CCCTGAAGGGCTACTTCTCCCAGGAAGTCAACATTAGCCTTCATTA CCAGAAGGATGAGGAGCCCCTCTTCCAACTGAAGAAGGTCAGGTC TGTCAACTCCTTGATGGTGGCCTCTCTGACTTACAAAGACAAAGTC TACTTGAATGTGACCACTGACAATACCTCCCTGGATGACTTCCATG

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TGAATGGCGGAGAACTGATTCTTATCCATCAAAATCCTGGTGAATT CTGTGTCCTTTGA (SEQ ID NO:17) > Sequência de Proteína OX40-L Humana (Sequência de Referência NCBI: NP_003317.1)

MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLL CFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMK VQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVN

SLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL (SEQ ID NO:18) <GITR-L> >Membro 18 da superfamília TNFSF18 TNF (também conhecido como TL6; AITRL; GITRL; TNLG2A; hGITRL) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_005092.3)

ATGACATTGCATCCTTCACCCATCACTTGTGAATTTTT GTTTTCCACAGCTCTCATTTCTCCAAAAATGTGTTTGAGCCACTTG GAAAATATGCCTTTAAGCCATTCAAGAACTCAAGGAGCTCAGAGA TCATCCTGGAAGCTGTGGCTCTTTTGCTCAATAGTTATGTTGCTATT TCTTTGCTCCTTCAGTTGGCTAATCTTTATTTTTCTCCAATTAGAGA CTGCTAAGGAGCCCTGTATGGCTAAGTTTGGACCATTACCCTCAAA ATGGCAAATGGCATCTTCTGAACCTCCTTGCGTGAATAAGGTGTCT GACTGGAAGCTGGAGATACTTCAGAATGGCTTATATTTAATTTATG GCCAAGTGGCTCCCAATGCAAACTACAATGATGTAGCTCCTTTTGA GGTGCGGCTGTATAAAAACAAAGACATGATACAAACTCTAACAAA CAAATCTAAAATCCAAAATGTAGGAGGGACTTATGAATTGCATGT TGGGGACACCATAGACTTGATATTCAACTCTGAGCATCAGGTTCTA

AAAAATAATACATACTGGGGTATCATTTTACTAGCAAATCCCCAAT TCATCTCCTAG (SEQ ID NO:19) > Sequência de Proteína GITR-L Humana (Sequência de

37 / 39 Referência NCBI: NP_005083.2)

MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQG AQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPS KWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPF

EVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKN NTYWGIILLANPQFIS (SEQ ID NO:20) <CD86> >CD86 (também conhecido como B70; B7-2; B7.2; LAB72; CD28LG2) > Sequências de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_175862.4)

ATGGATCCCCAGTGCACTATGGGACTGAGTAACATTC TCTTTGTGATGGCCTTCCTGCTCTCTGGTGCTGCTCCTCTGAAGATT CAAGCTTATTTCAATGAGACTGCAGACCTGCCATGCCAATTTGCAA ACTCTCAAAACCAAAGCCTGAGTGAGCTAGTAGTATTTTGGCAGG ACCAGGAAAACTTGGTTCTGAATGAGGTATACTTAGGCAAAGAGA AATTTGACAGTGTTCATTCCAAGTATATGGGCCGCACAAGTTTTGA TTCGGACAGTTGGACCCTGAGACTTCACAATCTTCAGATCAAGGAC AAGGGCTTGTATCAATGTATCATCCATCACAAAAAGCCCACAGGA ATGATTCGCATCCACCAGATGAATTCTGAACTGTCAGTGCTTGCTA ACTTCAGTCAACCTGAAATAGTACCAATTTCTAATATAACAGAAA ATGTGTACATAAATTTGACCTGCTCATCTATACACGGTTACCCAGA ACCTAAGAAGATGAGTGTTTTGCTAAGAACCAAGAATTCAACTAT CGAGTATGATGGTATTATGCAGAAATCTCAAGATAATGTCACAGA ACTGTACGACGTTTCCATCAGCTTGTCTGTTTCATTCCCTGATGTTA CGAGCAATATGACCATCTTCTGTATTCTGGAAACTGACAAGACGC GGCTTTTATCTTCACCTTTCTCTATAGAGCTTGAGGACCCTCAGCCT CCCCCAGACCACATTCCTTGGATTACAGCTGTACTTCCAACAGTTA TTATATGTGTGATGGTTTTCTGTCTAATTCTATGGAAATGGAAGAA

38 / 39

GAAGAAGCGGCCTCGCAACTCTTATAAATGTGGAACCAACACAAT GGAGAGGGAAGAGAGTGAACAGACCAAGAAAAGAGAAAAAATCC

ATATACCTGAAAGATCTGATGAAGCCCAGCGTGTTTTTAAAAGTTC GAAGACATCTTCATGCGACAAAAGTGATACATGTTTTTAA (SEQ ID NO:21) > Sequência de Proteína CD86 Humana (Sequência de Referência NCBI: NP_787058.4)

MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADL PCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMG RTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSV LANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEY DGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPF SIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYK

CGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF (SEQ ID NO:22) <GM-CSF> > CSF2: fator estimulante de colônias 2 (também conhecido como CSF; GMCSF) > Sequência de DNA (Sequência de Referência NCBI: NM_000758.3)

ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGG CCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCA GCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCT GAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGA AGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAG ACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACC AAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAG CACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCA CCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCAT

39 / 39 CCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA (SEQ ID NO:23) > Sequência de Proteína GM-CSF Humana (Sequência de Referência NCBI: NP_000749.2)

MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEA RRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSL

TKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPF DCWEPVQE (SEQ ID NO:24).

[0053] A descrição acima de modalidades específicas é para fins de ilustração e não deve ser interpretada como restritiva. A partir dos preceitos da presente invenção, aqueles versados na técnica identificarão que várias modificações e mudanças podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células cancerígenas modificadas, caracterizadas pelo fato de serem modificadas para coexpressar transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora.

2. Células cancerígenas modificadas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a molécula imunoestimuladora é selecionada dentre Ligante OX40 e Ligante 4-1BB.

3. Células cancerígenas modificadas de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a molécula imunoestimuladora é o Ligante 4-1BB.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende as células cancerígenas modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicação 1 a 3.

5. Linha celular, caracterizada pelo fato de que compreende as células cancerígenas modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicação 1 a 3.

6. Método para fazer células cancerígenas modificadas para uso em uma vacina contra o câncer, o método caracterizado pelo fato de que compreende introduzir nas células cancerígenas um ou mais polinucleotídeos que resultam na expressão de transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a molécula imunoestimuladora é selecionada dentre Ligante OX40 e Ligante 4-1BB.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula imunoestimuladora é o Ligante 4-1BB.

9. Método para estimular uma resposta imune em um indivíduo contra um ou mais antígenos de câncer, o método caracterizado pelo fato de que compreende: i) introduzir nas células cancerígenas modificadas do indivíduo como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, de modo que a resposta imune contra o um ou mais antígenos expressos pelas células cancerígenas é estimulada; ou ii) introduzir nas células cancerígenas no indivíduo um ou mais polinucleotídeos que codificam transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora para produzir células cancerígenas modificadas no indivíduo, em que as células cancerígenas modificadas expressam o CITTA e a molécula imunoestimuladora a partir de um ou mais polinucleotídeos, e em que a resposta imune é estimulada para um ou mais antígenos expressos pelas células cancerígenas modificadas.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas modificadas expressam uma molécula imunoestimuladora que é selecionada dentre Ligante OX40 e Ligante 4-1BB, e/ou em que um dos polinucleotídeos expressa Ligante OX40 ou Ligante 4-1BB.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas modificadas expressam o Ligante 4- 1BB.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a resposta imune estimulada compreende um ou uma combinação de: uma resposta de célula T CD8+ antitumor de memória durável que é específica para o mesmo tipo de câncer que as células cancerígenas modificadas, ou uma resposta de anticorpo antitumor contra o mesmo tipo de câncer que as células cancerígenas modificadas, ou uma inibição de crescimento de um tumor que compreende células cancerígenas que são do mesmo tipo de câncer que as células cancerígenas modificadas ou erradicação de um ou mais tumores existentes que compreendem células cancerígenas que são do mesmo tipo de câncer que as células cancerígenas modificadas.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas modificadas expressam o Ligante 4- 1BB.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas modificadas de i) são introduzidas no indivíduo.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que um ou mais polinucleotídeos de ii) são introduzidos no indivíduo.

16. Vetor de expressão isolado ou combinação de vetores de expressão isolados, caracterizado pelo fato de que codifica transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora.

17. Vetor de expressão ou combinação de vetores de expressão de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a molécula imunoestimuladora é Ligante OX40 ou Ligante 4-1BB.

18. Vetor de expressão ou combinação de vetores de expressão de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a imunoestimuladora é o Ligante 4-1BB.

19. Uma ou mais células cancerígenas modificadas, caracterizadas pelo fato de ser/serem célula(s) de câncer de mama selecionada(s) a partir do grupo que consiste em célula(s) de câncer de próstata, célula(s) de câncer pancreático, célula(s) de câncer de pulmão, célula(s) de câncer de fígado, célula(s) de câncer de ovário, célula(s) de câncer cervical, célula(s) de câncer de cólon, célula(s) de câncer de esôfago, célula(s) de câncer de estômago, célula(s) de câncer de bexiga, célula(s) de câncer do cérebro, célula(s) de câncer testicular, célula(s) de câncer de cabeça e pescoço, célula(s) de melanoma, célula(s) de câncer de pele, qualquer célula(s) de sarcoma, célula(s) de leucemia, célula(s) de linfoma, célula(s) de mieloma e combinações das mesmas, em que uma ou mais células cancerígenas modificadas expressam transativador de classe II (CIITA) e uma molécula imunoestimuladora de um ou mais polinucleotídeos recombinantes.

20. Uma ou mais células cancerígenas modificadas de acordo com a reivindicação 19, caracterizadas pelo fato de que a molécula imunoestimuladora compreende Ligante OX40 ou Ligante 4-1BB.

21. Uma ou mais células cancerígenas modificadas de acordo com a reivindicação 20, caracterizadas pelo fato de que a molécula imunoestimuladora compreende o Ligante 4-1BB.

Petição 870210023685, de 12/03/2021, pág. 51/60 1/8

Ligante Coestimulatório: CD80, GITR-L, 4-1BB-L, ou OX40-L ou citocina: GM-CSF ou Vazio

CIITA ou GFP

Figura 1

Nenhum CIITA sozinho 0/5 Livre de Tumor 0/5 Livre de Tumor

1/5 Livre de Tumor 2/8 Livre de Tumor

3/5 Livre de Tumor

OX40-L sozinho 8/8 Livre de Tumor 0/8 Livre de Tumor

4-1BB-L sozinho Volume do tumor

8/8 Livre de Tumor 8/8 Livre de Tumor

Dias após inoculação

Figura 2

Rejeição do Tumor

Introdução Monitorar crescimento do tumor 3 semanas 2 meses Reintrodução de EL4 Parental

Camundongos preparados com Camundongos preparados com EL4 4-1BBL EL4 4-1BBL+CIITA

4/8 Livre de Tumor 8/8 Livre de Tumor 5/8 Livre de Tumor Volume do tumor

Rejeição do Tumor

Introdução 3 semanas 1 mes

Colher baço, cocultura com EL4

Dia 20 Dia 50 %IFNᵧ+ entre células CD8+

Figura 3

Rejeição do Tumor Introdução Monitorar crescimento do tumor 3 semanas 2 meses Reintrodução de EL4 com perda de MHC Camundongos preparados com Camundongos preparados com Camundongos preparados com 4-1BB-L+CIITA EL4 OX40-L+CIITA EL4 4-1BBL EL4 0/4 4/4 1/4 Livre de Tumor Livre de Tumor Livre de Tumor Volume do tumor Dias após reintrodução de β2m-/- EL4 (dias) Coloração de superfície celular de EL4 parental Camundongo naïve % de máx.

Soro + IgG anticamundongo Figura 4

Células T ativadas Camundongo naïve % de máx.

% Citotoxicidade Figura 4 continuação

Vacinação com células cancerígenas engenheiradas irradiadas

Introdução 3 dias 7 dias 7 dias CIITA-EL4 ou EL4 com perda de MHC

Camundongos vacinados com Camundongos vacinados com Camundongos não vacinados CIITA EL4 4-1BB-L-L+ CIITA EL4

2/5 Livre de Tumor Volume do tumor

Dias após introdução de CIITA EL4 (dias)

Figura 5

Camundongos não vacinados Camundongos vacinados com 4-1BB-L+ CIITA EL4 Volume do tumor

Dias após introdução de β2m-/- EL4 (dias) % de Sobrevivência

Não vacinado

Dias após introdução de β2m-/- EL4 (dias)

Figura 5 continuação

Câncer de cólon MC38 Melanoma B16F10 Volume do tumor Volume do tumor Dias após inoculação (dias) Dias após inoculação (dias) Livre de Tumor Livre de Tumor Camundongo naïve % de máx.

Soro + IgG anticamundongo Soro + IgG anticamundongo Camundongo naïve

I % de máx.

Soro + IgG anticamundongo Figura 6