KR20140032696A - Ｖｓｉｇ４를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로,
본 발명에 따른 VSIG4 단백질 (VSIG4.Ig)을 주사하면 간염의 발생을 예방할 뿐 아니라, 이미 형성된 간염의 경우에도 치료 효과가 있기 때문에 VSIG4를 간염 치료의 표적으로 사용하여 간염 특히, 자가면역 간염의 치료 및 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＶＳＩＧ４를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 조성물{Composition Comprising VSIG4 for Preventing or Treating Hepatitis}

본 발명은 VSIG4를 표적으로 하는 간염 특히, 자가면역 간염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간염은 간세포 및 간 조직의 염증을 의미한다. 간염의 주요 원인으로는 바이러스, 알코올, 여러 가지 약물들 및 자가면역 등이 있다. 간염은 지속 기간에 따라 급성과 만성으로 구분하며, 간염이 6개월 이상 낫지 않고 진행하는 경우를 만성 간염이라고 한다.

급성 간염이란 간염바이러스(A형·B형·비A비B형)에 의해서 간에 생기는 급성염증을 병명으로 이르는 말로, 이는 그 감염양식(感染樣式)에서 수혈(輸血) 후에 발생하는 수혈 후 간염과, 감염경로를 알 수 없는 산발성 간염 및 집단으로 발생하는 유행성 간염의 세 가지 유형으로 나눌 수 있다. 급성 간염의 증세는 먼저 몸이 나른해지고 온몸에 권태감이 찾아오며 조그마한 일에도 곧 피로를 느끼게 된다. 그리고 식욕부진·발열·구토증·복통·설사 등, 감기나 급성위장염에 걸렸을 때와 같은 증세 등이 나타난다.

만성 간염은 간, 특히 현저한 무력감(astenia), 아황달(sub-jaundice) 및 체중 감소를 갖는 진행성 포우시(evolutive poussee)에 의하여 임상적으로 특징지워지는, 실질세포 손상(parenchymal impairment) 및 문맥 영역의 괴사를 갖는 문맥 공간(portal space)의 염증 과정이며, 지연되어 진행되며 문맥 섬유증 또는 경변을 일으킨다.

또한 자가면역 간염은 체내 면역반응체계가 비정상적으로 반응하여 간세포에 필요 이상의 염증반응을 일으켜 발생하는 간염으로, 자가면역 간염환자의 간은 간 세포의 파괴가 지속적으로 이루어져, 간수치가 항상 높은 상태로 유지되고, 염증이 오랜 기간 유지되면서 간경변증(간경화)나 간부전의 만성 간질환으로 진행되거나 심하게는 간암으로까지 진행되는 사례가 많다.

자가면역 간염과 유사한 임상적 면역학적 및 조직학적 특징을 갖는 질병을 20 mg/kg의 용량으로 콘카나발린 A (ConA)를 생쥐에 꼬리 정맥내 주사하여 실험적으로 유도할 수 있다. ConA 주사 8 내지 24 시간 후에, 간의 대량 림프 단핵세포 침윤(lymphomonocytary infiltration)이 관찰되며, 이는 트랜스아미네이즈 (transaminase)의 혈중 수준이 현저하게 증가하는 것에 의하여 임상적으로 확인할 수 있다. ConA 유도된 간염증 (hepatitic reaction)은, 흉선 제거 생쥐 (athymic mice)(T 림프구가 없음)에서는 이 질병을 유도할 수 없고 마크로파아지 활성을 차단하는 사이클로스포린 A 또는 실리카에 의하여 예방될 수 있다는 점에서 세포-매개성 질환이다.

만성 간염과 관련하여, 코티코스테로이드 또는 사이클로스포린 A에 의한 지연성 치료(protracted treatment)를 제외하고, 이를 예방하고 치료할 수 있는 약제의 개발이 전무한 실정이며, 현재 사용되는 약제들은 많은 부작용 및 면역 억제를 유발하는 문제가 있다.

한편, VSIG4(V-set and Ig domain-containing 4)는 B7 패밀리-관련 단백질로서, 구조적으로는 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하며, 기능적으로는 보체 (complement) iC3b, C3b 분절과 결합하여 보체의 활성을 억제하며, T 세포의 기능을 억제하는 기능이 있는 코시그날 분자이다(J. Clin . Invest . 116:2817-2826 (2006). doi:10.1172/JCI25673). 특히 간조직의 쿠퍼(Kupffer) 세포에서 VSIG4가 많이 발현되어 있다.

이에, 본 발명자들은 간염 치료에 대한 표적 단백질을 연구하던 중, VSIG4 단백질 (VSIG4.Ig)을 주사하면 간염의 발생을 예방할 뿐 아니라, 이미 형성된 간염의 경우에도 치료 효과가 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 VSIG4를 간염 치료 표적으로 한 간염 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 VSIG4를 이용한 간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 VSIG4를 이용한 간염 진단방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 간염은 바람직하게는 자가면역 간염일 수 있다.

상기 VSIG4 단백질을 이용하여 간염의 치료에 활용하는 경우로는, 면역세포 예를들어, 대식세포, 수지상세포 등에 전장 VSIG4 유전자를 벡터/바이러스를 이용하여 형질감염 시켜 이들 세포에 VSIG4 단백질을 발현시켜서 사용하는 방법과, VSIG4의 분절을 인간 항체 의 Fc 부위와 융합시킨 재조합단백질 형태로 사용하는 방법이 있을 수 있다. 이때, VSIG4를 발현하는 면역세포를 사용하는 경우는 세포치료제의 형태가 될 것이고, 융합재조합 단백질은 단백질 치료제의 형태가 될 것이다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 인간 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등 모든 종류의 면역글로불린이 이에 해당할 수 있으며, 바람직하게는 IgG의 Fc 부위를 재조합단백질 제조에 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명의 일실시예에서는 IgG 중 IgG1의 Fc 영역과 VSIG4의 세포외 도메인(아미노산 1-186 영역)을 융합한 재조합 단백질(VSIG4.Ig)을 제조 후 사용하였다.

VSIG4 단백질 분절을 사용할 경우에는 VSIG4 단백질의 세포외 도메인 중 최소 활성부위로 판단되는 41 내지 113번째 아미노산 서열 부위를 포함하는 것이 바람직하며, 1 내지 186번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분절을 사용할 수도 있다. 또한, 상기 활성부위를 모방(mimic)할 수 있는 펩타이드, 항체, 압타머, 소분자(small molecule) 등도 염증의 억제를 통해 본 발명의 VSIG4 단백질의 대체물로서 사용할 수 있다.

상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 VSIG4를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질 또는 이의 분절일 수 있으며, 예를들어 인간 VSIG4(NM_001100431.1, NP_001093901.1) 또는 마우스 VSIG4(NM_177789.4, NP_808457.1), 또는 이의 분절일 수 있다. 또한, 상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 진핵 생물 유래의 천연형의 아미노산 서열 뿐만 아니라 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 이때, 상기 서열 변이체는 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미하고, 본 발명과 같이 염증을 억제하여 자가면역 간염의 예방 또는 치료에 유효한 활성을 유지하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 절단, 결실, 삽입, 치환 등의 조합도 가능하다.

또한, VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 천연 기원의 공급원으로부터 분리하는 방법, 화학적으로 합성하는 방법 또는 VSIG4 단백질 또는 이의 분절을 코딩하는 재조합 발현벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법으로 얻을 수 있다.

상기 약학조성물은 정제, 캡슐제, 주사액, 주사용 현탁제, 비강내 스프레이 및 경피용 패치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 VSIG4-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 VSIG4-인코딩 유전자는 정맥내, 시상하부내, 뇌실내 및 경막내로 이루어진 군에서 선택된 어느 부위로 주입될 수 있다.

상기 유전자는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터, 또는 다른 전달 비히클을 이용하여 개체에 전달될 수 있다. 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한 상기 비-바이러스성 벡터는 DNA-지질 복합체 예를 들어, 아시아로글리코-단백질-매개 전달 시스템과 같은 리포좀-매개 또는 리간드/폴리-L-라이신 접합체를 포함할 수 있다.

전달 비히클로 바이러스성 벡터가 선정되면, 유전자가 영구적으로 발현될 수 있도록 숙주 게놈으로 삽입될 수 있는 벡터일 수 있지만, 이는 필수 요건은 아니다. 벡터가 숙주 게놈으로 삽입되지 않는 경우라면 유전자 발현은 영구적이기 보다는 일시적일 것이다.

벡터는 일반적으로 시상하부내, 뇌실내 또는 척수강내 주입에 의해 숙주에 투여될 수 있지만, 이외에도 정맥내, 근육내, 복강내, 경구, 피하 또는 다른 전달 경로로도 투여될 수 있다. 적절한 역가는 선정된 특정 벡터, 숙주, 사용된 프로모터의 강도 및 치료받는 질환의 중증도와 같은 수많은 요인들에 따라 달라질 것이다. 마우스의 경우, 아데노바이러스 벡터는 바람직하게 체중 g 당 대략 1.0 x 10⁶ 내지 1.0 x 10¹⁰ 용균 형성 단위(plaque forming unit, p.f.u.)의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 더 많은 양이 사용될 수 있고, 10¹² 입자까지 사용될 수 있다.

한편, 원하는 효과가 일시적인 것이 아닌 영속적인 것이라면, 헬퍼 의존성 바이러스 벡터가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 벡터를 이용하기에 적절한 프로모터로는 Moloney 레트로바이러스 LTR, CMV 프로모터 및 생쥐 알부민 프로모터를 포함한다. 복제 효능 없는 바이러스가 생산되고 ex vivo로 자가 유래 세포의 형질도입 후 in vivo 주입에 의해 동물 또는 인간에게 직접 투입될 수 있다 (Zatloukal 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5148-5152, 1994).

VSIG4 코딩 서열은 또한 in vivo 또는 ex vivo로 VSIG4 발현용 플라스미드에 삽입될 수 있다. in vivo 치료를 위해, 코딩 서열을 조직에 직접 주입하거나 정맥내 주입하여 전달할 수 있다. 이러한 방법에 사용할 수 있는 프로모터로는 CMV와 같은 내인성 및 이종 프로모터를 포함한다. 코딩 서열은 코딩 서열을 안정화하고 세포에 코딩 서열을 형질전환하는 것을 촉진하고/하거나 표적을 제공할 수 있는 완충액을 포함한 제형으로 주입될 수 있다(Zhu et al., Science, 261: 209-211, 1993).

유전자 치료 목적으로 바이러스 또는 비바이러스 벡터 중 어느 하나에 의한 전달을 위한 VSIG4 코딩 서열의 in vivo 발현은 이미 알려진 조절된 유전자 발현 프로모터를 이용함으로써 최대 효능 및 안정성을 조절할 수 있다(Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992). 예를 들어, VSIG4 코딩 서열은 테트라사이클린 반응성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이러한 프로모터는 조절분자와 처리함으로써 양 또는 음의 방향으로 조절될 수 있다.

VSIG4 코딩 서열의 비-바이러스성 전달을 위하여, 고발현용 일반적인 대조군 서열을 포함한 일반적인 벡터에 이러한 서열을 삽입한 후, 폴리라이신, 프로타민 및 알부민과 같은 폴리머 DNA-결합 양이온과 같은 합성 유전자 전달 분자와 반응시킬 수 있다. 이러한 합성 유전자 전달 분자는 아시알로오로소뮤코이드(Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987), 인슐린(Hucked 등, Biochem.Pharmacol., 40: 253-263, 1990), 갈락토오스(Plank 등., Bioconjugate Chem., 3: 533-539, 1992), 락토오스(Midoux 등., Nucleic Acids Res., 21: 871-878, 1993) 또는 트랜스페린(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414, 1990)과 같은 세포 표적 리간드와 연결될 수 있다.

다른 전달 시스템은 다양한 조직-특이적 또는 보편적인 활성 프로모터의 조절 하에서 VSIG4 유전자를 포함한 DNA를 캡슐화하는 리포좀의 사용을 포함한다 (Nabel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11307-11311, 1993; Philip 등, Mol. Cell Biol., 14:2411-2418, 1994). 또한, 사용가능한 비-바이러스성 전달로는 유전자주입 접근과 같은 기계적 전달시스템을 포함한다(Woffendin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11581-11585, 1994). 또한 VSIG4 코딩 서열은 광중합 하이드로겔 재료의 침착을 통해 전달될 수도 있다. VSIG4 유전자의 전달을 위해서 유전자 전달에 사용되는 일반적인 방법, 예를 들면 휴대용 유전자 전달 입자총의 사용(USP No. 5,149,655)과 전달된 유전자 활성화용 이온화 방사선의 사용(USP No.5,206,152, PCT 공개 WO 92/11033)을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “치료”이라는 용어는 질환, 상태 또는 이상에 대처할 목적으로 환자를 처치하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 활성약물을 투여하여 증상 또는 합병증 발생을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 약화시키거나, 질환, 상태 또는 이상을 없애는 것을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “예방”이라는 용어는 약제가 간염 상태 발생 이전에 투여되어 간염의 발생을 예방하는 것을 의미한다. 간염을 겪고 있거나 증상을 나타낸 환자에게 투여된다면, 그러한 약제는 간염의 진행을 예방하는 효과가 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 사용된 “약제학적으로 허용 가능한 담체”는 사용한 용량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에게 무독한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 흔히 수용성 pH 완충액일 수 있으며, 담체의 예로는 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르빈산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 단당류, 다당류 및 다른 탄화수소; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올류; 소듐과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 TWEEN20, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 소듐 타우로디하이드로퓨시데이트(STDHF) 및 PLURONICS과 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 허용되는 약전을 기초로 투여경로에 따라 제형화될 수 있다(Fingi 등, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1, 1975; Lemington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). 따라서, 제형은 정제, 환약, 분말, 향낭, 엘릭실제, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태가 가능하다. 본 발명에 따른 약학조성물은 환자에게 투여된 후에 활성 성분의 즉효성, 지속성 및 서방성을 달성할 수 있도록 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다. 즉, 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.

일 실시예로, 일반적인 지침에 따라 지시된 효과를 얻기 위해 사용될 활성성분의 일일 경구투여량은 체중 1 kg 당 대략 0.001∼1,000 mg, 바람직하게는 대략 0.01∼100 mg일 수 있다. 정맥내 투여시 일일 투여량은 일정한 속도로 주입시 체중 1kg 당 0.001 내지 100.0 ng일 수 있다. 이렇게 일정한 정맥내 주입은 바람직하게는 체중 1kg 당 0.01∼50 ng, 보다 바람직하게는 0.1∼10.0 ng으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 단회 일일 투여량으로 투여되거나, 또는 총 일일 투여량을 하루 2회, 3회 또는 4회의 분량으로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 원하는 몇일, 몇주, 몇 개월의 시간 동안 약물을 서서히 방출할 수 있는 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사 등에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 간염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 VSIG4 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 간염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 VSIG4의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 VSIG4의 발현 프로파일과 비교하여 간염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 간염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 VSIG4 단백질 (VSIG4.Ig)을 주사하면 간염의 발생을 예방할 뿐 아니라, 이미 형성된 간염의 경우에도 치료 효과가 있기 때문에 VSIG4를 간염 치료의 표적으로 사용하여 간염 특히, 자가면역 간염의 치료 및 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 VSIG4의 T-세포 증식 억제능 분석 결과로, 유세포 분석 결과이다.
도 2는 Balb/c WT T-cells (10⁵) 에 대한 세포 주기 분석 결과이다(R2, Sub-G0 phase; R3, G0/G1 phase; R4, S-phase; R5, G2/M phase).
도 3은 ConA 처리 2시간 전 B6 WT 마우스에 대한 가용 VSIG4.Ig 의 in vivo 처리 결과이다. 간 MNC는 세포내 IFN-γ, TNF-α 및 IL-17A 측면에서 조사되었다.
도 4는 는 VSIG4.Ig (400 μg/mouse)의 in vivo 주입으로 치사량(30 mg/kg)의 ConA의 처리로 인해 유발된 급성 간염에 대한 마우스의 생존률 분석 결과이다.
도 5는 30 mg/kg의 ConA 처리 시 VSIG4.Ig 전처리에 따른 헤마톡실린-에오신 염색된 마우스 간조직의 현미경 관찰 결과이다.
도 6은 치사량의 ConA 처리 3시간 후 VSIG4.Ig (400 μg/mouse)를 주입하여 검토한 ConA-유발 간 손상(면역 매개 간 손상)에서 VSIG4.Ig의 치료효과 검토 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 실험 동물 준비

8주령 내지 10주령의 Balb/c 및 C57BL/6 마우스를 각각 Jackson Laboratory (CA, USA)로부터 구입하였다.

마우스는 인제대학 동물사육시설에서 특이적 병원균이 없는 무균 상태에서 사육시켰다. 모든 실험동물은 인제대학교 의과대학의 실험동물운영위원회에 의해 승인된 절차에 따라 사육시켰다.

2. 시약

ConA, BrdU, OVA 단백질, 완전 프로인트 항원보강제, DNase, 및 콜라게나아제는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. α-GalCer (KRN 7000)는 Alexis Biochemicals 사로부터 구입하였고, OVA_{323 -339} 펩타이드는 Peptron에서 합성되었다. FITC-, PE-, PE Cy5- 또는 APC-컨쥬게이트 항-CD45.1 (A20), 항-TCR-β (H57-597), 항-NK1.1 (NKR-PIC), 항-CD11b (M1/70), 항-CD11c (N418), 항-F4/80 (BM8), 항-CD146 (ME-9F1), 항-I-A^d (39-10-8), 항-CD80 (16-10A1), 항-CD86 (GL1), 항-B7-H1 (M1H5), 항-CD44 (IM7), 항-CD62L (MEL-14), 항-CD4 (L3T4), 항-IFN-γ (XMG1.2), 항-TNF-α (MP6-XT22), 항-IL-4 (11B11), 항-IL-17A (TC11-18H10.1), 항-FoxP3 (FJK-16S), 항-BrdU, 및 7-AAD는 eBioscience 또는 BD Pharmingen로부터 구입하였다. 항-FITC, 항-CD11c 및 항-CD90.2 마이크로비드는 Miltenyi Biotech로부터 구입하였다. Rb, p130, E2F-1, E2F-4, cyclin D1, cyclin E, Cdk2, Cdk4, Cdk6, p53, p16^INI4a, p21^{Waf1 / Cip1}, 및 p27^Kip1 에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology 로부터 구입하였다. VSIG4 (14G8.2)에 대한 항체는 C3b가 VSIG4에 결합하는 것을 저해하며, Dr. Campagne (Genentech)으로부터 얻었다.

3. VSIG4 -인간 Fc 융합 단백질( VSIG4 . Ig ) 준비

VSIG4 융합 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 세포외 도메인(아미노산 1-186) 영역을 인간 IgG1의 Fc 영역을 코드하는 pFLAG-CMV (Sigma-Aldrich) 에서 클로닝 하여 VSIG4-인간 Fc 융합 단백질(VSIG4.Ig)을 제조하였다. 이러한 재조합 플라스미드를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HEK293 세포 (Invitrogen)에 형질감염 시킨 후, 제조자 (GE Healthcare, Piscataway, USA의 지침에 따라 HiTrap™ Protein G HP 컬럼을 이용하여 세포 상등액으로부터 VISG4.Ig를 정제하였다.

4. 동물 처리

앞서 준비된 마우스에 PBS에 용해된 치사량 (25-30 mg/kg) 또는 준치사량 (15 mg/kg)의 콘카나발린 A(concanavalin A; ConA, Sigma-Aldrich)을 정맥으로 주사하였다. 제조자의 지침에 따라 트랜스아미네이즈 키트 (Asan Pharmaceutical Co. Ltd., Hwaseong, South Korea)를 이용하여 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT)를 측정하였다.

5. 헤마톡실린 및 에오신 염색

마우스 간을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 탈수하며, 파라핀 포매 처리하였다. 조직학적 관찰을 위하여, 상기 준비된 조직을 Leica 모델 2165 로터리 마이크로톰 (Leica, Nussloch, Germany)으로 잘라 5-㎛ 절편을 준비하고, 이를 글래스 슬라이드에 놓고, 탈파라핀 시키고, 헤마톡실린 2 및 에오신 Y로 연속적으로 염색하였다.

6. 단핵 비실질세포( mononuclear nonparenchymal cells , MNC), KCs , 간 T- 및 NKT -세포 분리

간 MNC 가 변형된 콜라게나아제 분해법으로 분리되었다. 보다 구체적으로, 마우스 간은 0.025% 콜라게나아제를 포함하는 HBSS를 사용하여 in situ로 관류되었고, 제거 후 70-micron stainless steel mesh로 걸렀다. 초기 세포 부유액은 40% Percoll 에 재부유되었고, 70% Percoll로 오버레이되었으며, 750 x g으로 20분간 원심분리되었다. MNC는 계면에서 획득되었다.

KC의 정제를 위해, 간 MNC 부유액이 Percoll 구배(25%/50%)에 오버레이되었으며, 1,800 x g으로 50분간 원심분리되었다. KC-풍부 MNC는 계면에 존재하였고, 수거 후 FITC-컨쥬게이트 항-F4/80 (clone BM8, eBioscience)으로 염색되었다. F4/80 양성 KC는 제조자의 지침에 따라 항-FITC 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여 분리되었다. 분리된 KC 는 95%의 순도를 보였으며, 이는 간 APC 중 VSIG4 만을 발현하였다.

비장 DC의 정제를 위해, 비장세포가 항-CD11c 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)와 함께 배양되었고, 제조자의 지침에 따라 MACS 시스템을 통해 축적되었다. 간 T- 및 NKT-세포의 정제를 위해, 간 MNC가 FITC-컨쥬게이트-NK1.1 mAb 및 PE Cy5-컨쥬게이트 항-TCR-β mAb 로 염색되었고, TCR-β⁺NK1.1⁺ NKT 및 TCR-β⁺NK1.1^- T-세포가 BD FACSAria^TM 을 사용하여 분류되었다.

7. T-세포 증식 분석

T세포 (10⁵)를 VSIG4.Ig 또는 대조군 Ig (10 μg/ml)와 함께 마우스 항-CD3 항체 (145-2C11)가 미리 코팅된 96-웰 평저(flat-bottom) 플레이트에 분주하였다. [³H]-thymidine (1 μCi/well)을 가하고 16시간 후 배양물을 회수하였다. [³H]-thymidine 융합은 Wallac MicroBeta TriLux Liquid Scintillation counter (PerkinElmer)로 측정되었다. 상기 실험에서, 정제된 DO11.10 T-세포(10⁵)는 KC (1-10 × 10³)와 함께 OVA_{323 -339} (10 μg/ml) 존재 하에서 [³H]-thymidine 융합 전 3일간 배양되었다.

8. 유세포 분석( Flow cytometric analysis )

세포 내 사이토카인 염색을 위해, Cytofix/Cytoperm Plus kit (BD PharMingen)를 사용하여 간 MNC가 고정되고, 투과성이 있도록 하였으며, FITC-컨쥬게이트 항-IFN-γ, 항-TNF-α 및 항-IL-17A로 염색하고, CellQuest software (Becton Dickinson) 또는 FlowJo software (Tree Star)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 세포 주기 분석을 위해, 세포는 BrdU Flow Kit (BD Bioscience)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 BrdU로 표시되었다. 세포는 FITC-컨쥬게이트 항-BrdU 항체로 20분간 상온에서 염색되었다. 7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD, 5 μg/ml)를 유세포 분석 전 세포 부유액에 가하였다.

< 실시예 1> VSIG4 의 T-세포 증식 억제능 검토

상기 유세포 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 항-CD3의 존재 하의 VSIG4.Ig costimulation (20 μg/ml)이 대조군에 비해 T-세포 분열을 억제함을 보여준다.

또한, 세포 주기 분석 결과인 도 2는 VSIG4.Ig의 도입으로 인해 S 기의 세포 빈도가 현저히 감소되었으며, 반면 G0/G1 기의 빈도는 증가하는 것을 보여준다. 또한, 자멸세포를 보여주는 subdiploid (sub-G0)의 수는 VSIG4.Ig의 도입과는 무관한 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해, 본 발명의 VSIG4.Ig는 세포 분열 억제 및 세포 주기를 G0/G1 기에 유지시키는 기작을 통해 T-세포 증식을 저해함을 알 수 있었다.

< 실시예 2> Con A 유발 간염에 대한 VISG4 의 효과 검토

도 3은 ConA 처리 2시간 전 B6 WT 마우스에 대한 가용 VSIG4.Ig 의 in vivo 처리 결과를 보여준다. 도 3을 참조하면, VSIG4.Ig 처리군에서 염증 유발 사이토카인을 생성하는 NKT-세포가 대조군과 비교하여 유의하게 감소됨을 확인할 수 있고, 유사한 결과를 간 T-세포에서도 확인할 수 있었다.

또한 도 4는 VSIG4.Ig (400 μg/mouse)의 in vivo 주입으로 치사량의 ConA의 처리로 인해 유발된 급성 간염에 대한 마우스의 생존률이 연장됨을 보여준다. 약 60%의 마우스가 VSIG4.Ig의 처리로 인해 생존하였으며, 반면 대조군은 ConA 주입 후 24시간 내에 모두 급성 간염으로 죽었다(P=0.0108).

도 5를 참조하면, 간 조직 연구를 통해, ConA 처리된 마우스에서 VSIG4.Ig의 전처리는 출혈성 괴사를 감소시키고, 염증 세포의 침윤을 감소시킴으로써, 정상 간 미세조직의 온전화를 유지시킴을 알 수 있었다.

ConA-유발 간 손상(면역 매개 간 손상)에서 VSIG4.Ig의 치료효과를 검토하였다. 도 6과 같이, 치사량의 ConA 처리 3시간 후 VSIG4.Ig (400 μg/mouse)를 주입하면, ConA 처리 28시간 후까지 마우스의 생존을 연장시킴을 알 수 있었다(P=0.0336). 반면 대조군 마우스는 ConA 처리 14시간 내에 모두 급성 간염으로 죽었다.

따라서, 본 발명의 VSIG4는 염증성 사이토카인 생산 및 간 염증을 억제하여 ConA-유발 간 손상으로부터 마우스를 보호함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 VSIG4 단백질 분절은 VSIG4 단백질의 세포외 도메인 중 41 내지 113번의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 VSIG4 단백질 분절은 인간 항체의 Fc 부위와 융합시킨 재조합단백질 형태로 사용하는 것을 특징으로 하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 간염은 자가면역 간염인 것을 특징으로 하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. VSIG4-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 VSIG4-인코딩 유전자는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 사용한 것을 특징으로 하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 간염 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 간염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 VSIG4 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 간염 치료제의 스크리닝 방법.
9. 간염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 VSIG4의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 VSIG4의 발현 프로파일과 비교하여 간염 여부를 판정하는 단계를 포함하는 간염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
   

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