KR20140032697A

KR20140032697A - Ｖｓｉｇ４를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140032697A
Application number: KR1020120099318A
Authority: KR
Inventors: 최인학; 정근옥; 정영희
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2014-03-17

Abstract

본 발명은 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로,
본 발명에 따른 VSIG4 단백질은 천식의 주된 요인인 호산구와 호중구의 모집, IL-5와 IL-17의 농도를 감소시키고, 기도과민반응성을 감소시키는 바, VSIG4를 천식 치료의 표적으로 사용하여 천식의 치료 및 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＶＳＩＧ４를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 조성물{Composition Comprising VSIG4 for Preventing or Treating Asthema}

본 발명은 VSIG4를 표적으로 하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

천식은 가역적인 기도 폐쇄 및 기도 과반응성(AHR)의 재발성 에피소드를 특징으로 하는 기도의 만성 염증성 질환으로, 전형적인 임상적 증상으로는 생명에 위협적이거나 치명적이 될 수 있는 호흡의 짧음, 천명, 기침 및 흉부 압박감이 포함된다.

천식의 병인은 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-13, IL-17을 포함하는 특정 사이토카인 반응 프로파일을 나타내는 T-헬퍼세포 타입 2(Th2) 질환으로 관찰되는데, 천식의 병태생리학을 밝히는데 있어서 상당한 진전이 이루어져 왔음에도 불구하고, 질환의 유병력, 이환율 및 사망율은 지난 20년 동안에 증가되어 왔다. 또한 현재 개발되어 사용중인 기관지 확장제와 스테로이드 등의 항염증제는 완치에 도달할 수 없고 증상을 조절할 수 있을 정도의 효과만을 지니고 있다. 뿐만 아니라 가장 효과적인 약제인 스테로이드를 장기간 사용시 여러 부작용이 수반될 수 있다.

한편, VSIG4(V-set and Ig domain-containing 4)는 B7 패밀리-관련 단백질로서, 구조적으로는 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하며, 기능적으로는 보체 (complement) iC3b, C3b 분절과 결합하여 보체의 활성을 억제하며, T 세포의 기능을 억제하는 기능이 있는 코시그날 분자이다(J. Clin . Invest . 116:2817-2826 (2006). doi:10.1172/JCI25673). 특히 간조직의 쿠퍼(Kupffer) 세포에서 VSIG4가 많이 발현되어 있다.

이에, 본 발명자들은 천식 치료에 대한 표적 단백질을 연구하던 중, VSIG4 단백질 (VSIG4.Ig)을 주사하면 천식의 치료 및 예방 효과가 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 VSIG4를 천식 치료 표적으로 한 천식 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 VSIG4를 이용한 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 VSIG4를 이용한 천식 진단방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 마우스 천식 모델에서 VSIG4 단백질을 주입한 경우, 천식의 주된 요인인 호산구와 호중구의 모집, IL-5와 IL-17의 농도를 감소시키고, 기도과민반응성을 감소시키는 것을 확인하였고 이에 따라 VSIG4를 천식 치료의 표적으로 사용하여 천식의 치료 및 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물, 천식 치료제의 제조를 위한 상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제의 용도, 상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 천식의 치료 방법을 제공한다.

상기 VSIG4 단백질을 이용하여 천식의 치료에 활용하는 경우로는, 면역세포 예를들어, 대식세포, 수지상세포 등에 전장 VSIG4 유전자를 벡터/바이러스를 이용하여 형질감염 시켜 이들 세포에 VSIG4 단백질을 발현시켜서 사용하는 방법과, VSIG4의 분절을 인간 의 Fc 부위와 융합시킨 재조합단백질 형태로 사용하는 방법이 있을 수 있다. 이때, VSIG4를 발현하는 면역세포를 사용하는 경우는 세포치료제의 형태가 될 것이고, 융합재조합 단백질은 단백질 치료제의 형태가 될 것이다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 인간 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등 모든 종류의 면역글로불린이 이에 해당할 수 있으며, 바람직하게는 IgG의 Fc 부위를 재조합단백질 제조에 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명의 일실시예에서는 IgG 중 IgG1의 Fc 영역과 VSIG4의 세포외 도메인(아미노산 1-186 영역)을 융합한 재조합 단백질(VSIG4.Ig)을 제조 후 사용하였다.

VSIG4 단백질 분절을 사용할 경우에는 VSIG4 단백질의 세포외 도메인 중 최소 활성부위로 판단되는 41 내지 113번째 아미노산 서열 부위를 포함하는 것이 바람직하며, 1 내지 186번째의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분절을 사용할 수도 있다. 또한, 상기 활성부위를 모방(mimic)할 수 있는 펩타이드, 항체, 압타머, 소분자(small molecule) 등도 염증의 억제를 통해 본 발명의 VSIG4 단백질의 대체물로서 사용할 수 있다.

상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 VSIG4를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질 또는 이의 분절일 수 있으며, 예를들어 인간 VSIG4(NM_001100431.1, NP_001093901.1) 또는 마우스 VSIG4(NM_177789.4, NP_808457.1), 또는 이의 분절일 수 있다. 또한, 상기 VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 진핵 생물 유래의 천연형의 아미노산 서열 뿐만 아니라 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 이때, 상기 서열 변이체는 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미하고, 본 발명과 같이 천식의 예방 또는 치료에 유효한 활성을 유지하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 절단, 결실, 삽입, 치환 등의 조합도 가능하다.

또한, VSIG4 단백질 또는 이의 분절은 천연 기원의 공급원으로부터 분리하는 방법, 화학적으로 합성하는 방법 또는 VSIG4 단백질 또는 이의 분절을 코딩하는 재조합 발현벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법으로 얻을 수 있다.

상기 약학조성물은 정제, 캡슐제, 주사액, 주사용 현탁제, 비강내 스프레이 및 경피용 패치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 VSIG4-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 VSIG4-인코딩 유전자는 정맥내, 시상하부내, 뇌실내 및 경막내로 이루어진 군에서 선택된 어느 부위로 주입될 수 있다.

상기 유전자는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터, 또는 다른 전달 비히클을 이용하여 개체에 전달될 수 있다. 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한 상기 비-바이러스성 벡터는 DNA-지질 복합체 예를 들어, 아시아로글리코-단백질-매개 전달 시스템과 같은 리포좀-매개 또는 리간드/폴리-L-라이신 접합체를 포함할 수 있다.

전달 비히클로 바이러스성 벡터가 선정되면, 유전자가 영구적으로 발현될 수 있도록 숙주 게놈으로 삽입될 수 있는 벡터일 수 있지만, 이는 필수 요건은 아니다. 벡터가 숙주 게놈으로 삽입되지 않는 경우라면 유전자 발현은 영구적이기 보다는 일시적일 것이다.

벡터는 일반적으로 시상하부내, 뇌실내 또는 척수강내 주입에 의해 숙주에 투여될 수 있지만, 이외에도 정맥내, 근육내, 복강내, 경구, 피하 또는 다른 전달 경로로도 투여될 수 있다. 적절한 역가는 선정된 특정 벡터, 숙주, 사용된 프로모터의 강도 및 치료받는 질환의 중증도와 같은 수많은 요인들에 따라 달라질 것이다. 마우스의 경우, 아데노바이러스 벡터는 바람직하게 체중 g 당 대략 1.0 x 10⁶ 내지 1.0 x 10¹⁰용균 형성 단위(plaque forming unit, p.f.u.)의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 더 많은 양이 사용될 수 있고, 10¹² 입자까지 사용될 수 있다.

한편, 원하는 효과가 일시적인 것이 아닌 영속적인 것이라면, 헬퍼 의존성 바이러스 벡터가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 벡터를 이용하기에 적절한 프로모터로는 Moloney 레트로바이러스 LTR, CMV 프로모터 및 생쥐 알부민 프로모터를 포함한다. 복제 효능 없는 바이러스가 생산되고 ex vivo로 자가 유래 세포의 형질도입 후 in vivo 주입에 의해 동물 또는 인간에게 직접 투입될 수 있다 (Zatloukal 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5148-5152, 1994).

VSIG4 코딩 서열은 또한 in vivo 또는 ex vivo로 VSIG4 발현용 플라스미드에 삽입될 수 있다. in vivo 치료를 위해, 코딩 서열을 조직에 직접 주입하거나 정맥내 주입하여 전달할 수 있다. 이러한 방법에 사용할 수 있는 프로모터로는 CMV와 같은 내인성 및 이종 프로모터를 포함한다. 코딩 서열은 코딩 서열을 안정화하고 세포에 코딩 서열을 형질전환하는 것을 촉진하고/하거나 표적을 제공할 수 있는 완충액을 포함한 제형으로 주입될 수 있다(Zhu et al., Science, 261: 209-211, 1993).

유전자 치료 목적으로 바이러스 또는 비바이러스 벡터 중 어느 하나에 의한 전달을 위한 VSIG4 코딩 서열의 in vivo 발현은 이미 알려진 조절된 유전자 발현 프로모터를 이용함으로써 최대 효능 및 안정성을 조절할 수 있다(Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992). 예를 들어, VSIG4 코딩 서열은 테트라사이클린 반응성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이러한 프로모터는 조절분자와 처리함으로써 양 또는 음의 방향으로 조절될 수 있다.

VSIG4 코딩 서열의 비-바이러스성 전달을 위하여, 고발현용 일반적인 대조군 서열을 포함한 일반적인 벡터에 이러한 서열을 삽입한 후, 폴리라이신, 프로타민 및 알부민과 같은 폴리머 DNA-결합 양이온과 같은 합성 유전자 전달 분자와 반응시킬 수 있다. 이러한 합성 유전자 전달 분자는 아시알로오로소뮤코이드(Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987), 인슐린(Hucked 등, Biochem.Pharmacol., 40: 253-263, 1990), 갈락토오스(Plank 등., Bioconjugate Chem., 3: 533-539, 1992), 락토오스(Midoux 등., Nucleic Acids Res., 21: 871-878, 1993) 또는 트랜스페린(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414, 1990)과 같은 세포 표적 리간드와 연결될 수 있다.

다른 전달 시스템은 다양한 조직-특이적 또는 보편적인 활성 프로모터의 조절 하에서 VSIG4 유전자를 포함한 DNA를 캡슐화하는 리포좀의 사용을 포함한다 (Nabel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11307-11311, 1993; Philip 등, Mol. Cell Biol., 14:2411-2418, 1994). 또한, 사용가능한 비-바이러스성 전달로는 유전자주입 접근과 같은 기계적 전달시스템을 포함한다(Woffendin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11581-11585, 1994). 또한 VSIG4 코딩 서열은 광중합 하이드로겔 재료의 침착을 통해 전달될 수도 있다. VSIG4 유전자의 전달을 위해서 유전자 전달에 사용되는 일반적인 방법, 예를 들면 휴대용 유전자 전달 입자총의 사용(USP No. 5,149,655)과 전달된 유전자 활성화용 이온화 방사선의 사용(USP No.5,206,152, PCT 공개 WO 92/11033)을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “치료”이라는 용어는 질환, 상태 또는 이상에 대처할 목적으로 환자를 처치하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 활성약물을 투여하여 증상 또는 합병증 발생을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 약화시키거나, 질환, 상태 또는 이상을 없애는 것을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “예방”이라는 용어는 약제가 천식 상태 발생 이전에 투여되어 천식의 발생을 예방하는 것을 의미한다. 천식을 겪고 있거나 증상을 나타낸 환자에게 투여된다면, 그러한 약제는 천식의 진행을 예방하는 효과가 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 사용된 “약제학적으로 허용 가능한 담체”는 사용한 용량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에게 무독한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 흔히 수용성 pH 완충액일 수 있으며, 담체의 예로는 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르빈산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 단당류, 다당류 및 다른 탄화수소; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올류; 소듐과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 TWEEN20, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 소듐 타우로디하이드로퓨시데이트(STDHF) 및 PLURONICS과 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 허용되는 약전을 기초로 투여경로에 따라 제형화될 수 있다(Fingi 등, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1, 1975; Lemington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). 따라서, 제형은 정제, 환약, 분말, 향낭, 엘릭실제, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태가 가능하다. 본 발명에 따른 약학조성물은 환자에게 투여된 후에 활성 성분의 즉효성, 지속성 및 서방성을 달성할 수 있도록 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다. 즉, 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.

일 실시예로, 일반적인 지침에 따라 지시된 효과를 얻기 위해 사용될 활성성분의 일일 경구투여량은 체중 1 kg 당 대략 0.001∼1,000 mg, 바람직하게는 대략 0.01∼100 mg일 수 있다. 정맥내 투여시 일일 투여량은 일정한 속도로 주입시 체중 1kg 당 0.001 내지 100.0 ng일 수 있다. 이렇게 일정한 정맥내 주입은 바람직하게는 체중 1kg 당 0.01∼50 ng, 보다 바람직하게는 0.1∼10.0 ng으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 단회 일일 투여량으로 투여되거나, 또는 총 일일 투여량을 하루 2회, 3회 또는 4회의 분량으로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 원하는 몇일, 몇주, 몇 개월의 시간 동안 약물을 서서히 방출할 수 있는 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사 등에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 천식을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 VSIG4 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 천식을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 VSIG4의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 VSIG4의 발현 프로파일과 비교하여 천식 여부를 판정하는 단계를 포함하는 천식의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 VSIG4 단백질은 천식의 주된 요인인 호산구와 호중구의 모집, IL-5와 IL-17의 농도를 감소시키고, 기도과민반응성을 감소시키는 바, VSIG4를 천식 치료의 표적으로 사용하여 천식의 치료 및 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 천식 유도된 마우스의 기관지폐포세척액에서 호중구, 호산구 및 대식세포에 대한 유세포분석결과이다.
도 2는 혈중 VSIG4.Ig 농도와 기관지폐포에 모집된 호산구의 상관관계의 분석 실험 결과이다.
도 3은 천식 유도된 마우스의 혈청 사이토카인 농도 분석 결과이다.
도 4는 천식 유도된 마우스의 기관지폐포세척액 사이토카인 농도 분석 결과이다.
도 5는 천식 유도된 마우스에 대한 VSIG4.Ig의 기도과민성 감소 효과에 관한 실험 결과 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 실험 동물

동물은 자성인 6~8주령의 Balb/c 마우스를 오리엔트에서 공급받아 물과 사료를 충분히 공급하고, 실온 22±2℃를 유지하여 1주일간 실험환경에 적응시킨 후 사용하였다. 본 발명의 실시예에 사용한 실험 동물은 인제대학교 의과대학의 실험동물윤리위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 사용하였다.

2. VSIG4 .인간 Fc 융합 단백질( VSIG4 . Ig )의 제조

VSIG4 융합 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 세포외 도메인(아미노산 1-186) 영역을 인간 IgG1의 Fc 영역을 코드하는 pFLAG-CMV (Sigma-Aldrich) 에서 클로닝 하여 VSIG4-인간 Fc 융합 단백질(VSIG4.Ig)을 제조하였다. 이때 발현되는 단백질의 N-말단에는 FLAG 태그가 삽입되어 있어 항-FLAG mAb로 검출이 가능하다.

이러한 재조합 플라스미드를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HEK293 세포 (Invitrogen)에 형질감염 시킨 후, 4, 6, 8일 후 배양액을 회수한 다음 제조자 (GE Healthcare, Piscataway, USA의 지침에 따라 HiTrap™ Protein G HP 컬럼을 이용하여 세포 상등액으로부터 VISG4.Ig를 정제하였다. VSIG4.hFc의 발현은 샌드위치 ELISA로 확인하였다. 즉, 항-FLAG 항체 (2 ug/ml)를 ELISA 플레이트에 코팅하고, 농도별로 희석한 융합단백질을 반응시킨 다음, HRP-컨쥬게이트 항-인간 IgG를 반응시키고, TMB로 발생반응을 유도하여 결과를 판정하였다.

3. pLive VSIG4 . hFc DNA

pLive mVSIG4.hFc와 pLive hFc DNA 플라스미드는 각각 pFLAG_VSIG4.hFc와 pFLAG_hFc DNA 플라스미드를 SacI 제한효소로 잘라서 pLive 벡터에 클로닝하였다. 이때 발현되는 단백질의 N-말단에는 FLAG 태그가 삽입되어 있어 항-FLAG mAb로 검출이 가능하다.

pLive mVSIG4.hFc와 pLive hFc DNA 플라스미드는 하이드로다이나믹법으로 쥐 꼬리에 주사하였으며 혈액을 채취하여 VSIG4.Ig와 hFc의 농도를 상기 실험예 2의 샌드위치 ELISA법으로 확인하였다.

4. In vivo 실험

(1) 천식 마우스 모델

실험 1일째와 15일째에 20 μg의 OVA와 1.0 mg의 알루미늄 하이드록사이드 아쥬번트를 혼합하여 마우스의 복강에 주사하였다. 22일과 24일째에 OVA (50 mg/ml)를 기도투여하였으며 대조군은 생리식염수를 기도로 투여하였다. OVA의 기도투여는 마우스를 ultrasonic nebulizer (NE-U12, Omron, Tokyo, Japan)이 연결된 챔버에 넣어 20분 동안 실시하였다.

(2) 기도과민성 측정

실험 마우스에서 천식 발생에 의한 기도과민성 여부는 기도 저항을 측정하여 판단하였다.

기도 저항은 단일 챔버 플레티스모그래피 (All Medicus, Seoul)를 이용하여 측정하였다. 기도 저항의 정도는 enhanced pause(Penh)를 측정하여 평가하였다. Penh의 측정은 마우스를 챔버에 넣고 정상 호흡 상태에서 기저 값을 측정한 후 PBS를 네뷸라이저를 이용하여 5분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린(methacholine,Sigma, St. Louis, MO)을 12.5, 25, 50 mg/ml의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Pehn을 측정하였다. 기도저항의 지표로 이용된 Pehn은 한 주기의 호흡에 대하여 최대호기유량(peak expiratory flow, PEF)/최대흡기유량(peak inspiratory flow, PIF)의 비와 전반기 호기량(former expiratory volume)에 비례하는 무차원의 수로 표시되며 기도저항과 상관관계가 좋아 기도 수축의 지표로 알려져 있다.

Penh=(Te/RT-1)(PEF/PIF)

Te=expiratory time,

RT=relaxation time,

PEF=peak expiratory flow,

PIF=peak inspiratory flow

(3) Bronchoalveoler-lavage fluid (BALF) 분리 및 유세포 분석

마우스를 마취한 후 표피를 열고 기도에 PBS를 넣은 주사기를 삽입한 다음 PBS를 3회 순환시켜 분리하였다. BALF를 PBS로 세척하여 1500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 표식항체를 반응시켜 FACS Canto II (BD)로 분석하였다.

(4) 혈액채취 및 혈청 분리

마우스 복부의 중앙선을 따라 절개하여 하대정맥에서 혈액을 수거하였다. 수거된 혈액을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 얻은 후 분석을 위하여 -20℃에 보관하였다.

(5) ELISA 분석

마우스에서 분리한 BALF와 혈청 내의 사이토카인 양을 측정하기 위해 항사이토카인 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 BALF 또는 혈청을 가하여 반응시킨 후 4번 세척한 다음 바이오틴이 표식된 항 사이토카인 항체를 가하여 반응시킨 후 4번 세척하고 여기에 스트렙타비딘-HRP를 가하여 ELISA 리더를 이용하여 측정하였다.

< 실시예 1> VISG4 의 천식 지표 물질 억제효과 검토

VSIG4가 마우스의 천식모델에서 천식의 지표가 되는 호중구와 호산구의 수, 혈액 및 기관지폐포내 IL-5, IL-17A의 농도를 감소시키는지를 알아보기 위하여 pLive mVSIG4.hFc를 하이드로다이나믹법으로 주사한 다음 실험 1일째와 15일 째에 OVA를 복강으로 면역하고, 22-24일째에 OVA를 기도흡입하여 마우스의 천식을 유도하였다.

도 1은 OVA의 기도 흡입한 48시간 째에 폐와 기관지폐포세척액 (BALF)을 분리하여 PE-cy7 컨쥬게이트 항-Ly6G와 APC 컨쥬게이트 항-CD11c 항체로 염색한 후 유세포 분석기로 분석한 실험 결과이다. 호중구 (Ly-6G^hiCD11c^lo), 호산구 (Siglec-F^hiCD11c^lo) 및 대식세포 (Siglec-F^hiCD11c^hi) 를 전체 기관지폐포세척액에 대한 비율 (%)로 나타내었다. 도 1을 참조하면, pLive mVSIG4.hFc를 하이드로다이나믹법으로 주사하였을 때 마우스의 천식모델에서 기관지폐포에 모집된 호중구와 호산구의 수가 유의적으로 감소되었음을 알 수 있었다(p<0.05).

도 2는 OVA를 기도흡입하기 전에 혈청을 분리하여 VSIG4.Ig의 농도를 ELISA법으로 측정하여 VSIG4.Ig의 농도와 BALF에 모집된 호산구의 수와의 상관관계를 분석한 실험 결과이다. 도 2를 참조하면, 혈중 VSIG4.Ig 농도와 기관지폐포에 모집된 호산구의 수는 유의적인 음의 상관관계가 있음을 알 수 있었다(p<0.05).

도 3 및 도 4는 천식이 유도된 마우스가 OVA의 기도 흡입한 48시간 째에 폐와 기관지폐포세척액 (BALF)과 혈청을 분리하여 사이토카인의 농도를 ELISA법으로 측정한 실험 결과이다. 도 3은 혈청 사이토카인, 도 4는 기관지폐포세척액의 사이토카인에 대한 실험 결과이다.

도 3을 참조하면, pLive mVSIG4.hFc에 의해 생성된 VSIG4.Ig는 OVA의 기도흡입에 의해 유도된 혈청 내 Th2 사이토카인인 IL-5와 Th17 사이토카인인 IL-17A의 농도를 모두 유의적으로 감소시켰음을 알 수 있었다(IL-5; p<0.05, IL-17A; p<0.001).

또한 도 4를 참조하면, VSIG4.Ig는 기관지폐포세척액 내의 IL-5와 IL-17A의 농도도 유의적으로 감소시킴을 알 수 있었다(IL-5; p<0.05, IL-17A; p<0.001).

따라서 VSIG4는 천식에 의한 호중구와 호산구의 모집과 혈중 사이토카인의 농도를 감소시켜 OVA에 의해 유도되는 알레르기 천식의 발생을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> VISG4 의 기도과민성 감소효과 검토

VSIG4가 마우스의 천식모델에서 기도과민성을 감소시키는지는 알아보기 위하여 OVA의 기도흡입 2시간 전에 hFc (200 μg/마우스) and VSIG4.Ig (200 μg/마우스)를 마우스의 복강으로 주사하였다. 메타콜린을 12.5, 25, 50 mg/ml의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Pehn을 측정하여 기도과민성을 측정하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 메타콜린의 농도가 25 mg/ml일 때 VSIG4.Ig는 hFc보다 Penh 값을 유의적 (p<0.01)으로 감소시켜 VSIG4가 OVA 감작 및 흡입으로 생성된 기도과민성을 감소시킴을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

VSIG4 단백질 또는 이의 분절, 이의 활성화제 및 이의 발현조절제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서,
상기 VSIG4 단백질 분절은 VSIG4 단백질의 세포외 도메인 중 41 내지 113번의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
제2항에 있어서,
상기 VSIG4 단백질 분절은 인간 항체의 Fc 부위와 융합시킨 재조합단백질 형태로 사용하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
VSIG4-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
제4항에 있어서,
상기 VSIG4-인코딩 유전자는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 사용한 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
제5항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학조성물.
천식을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 VSIG4 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 천식 치료제의 스크리닝 방법.
천식을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 VSIG4의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 VSIG4의 발현 프로파일과 비교하여 천식 여부를 판정하는 단계를 포함하는 천식의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.