ES2439641T3 - Composiciones y procedimientos de producción de una composición - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de obtención de una composición que comprende una población de moléculas de CTLA4-Igaislada de un medio de cultivo líquido, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTLA4-Ig, enel que (1) las moléculas de CTLA4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido siálico, (2) el númerode restos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varia en la población inicial, (3) la población inicial comprendedímeros y agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP-1,comprendiendo el procedimiento: (i) recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTLA4-Ig; (ii) separar las moléculas de CTLA4-Ig de los componentes celulares; (iii) utilizar la cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición; (iv) utilizar la cromatografía en columna para separar los dímeros de CTLA4-Ig de los agregados de alto pesomolecular de CTLA4-Ig; y (v) utilizar la cromatografía en columna para separar las moléculas de CTLA4-Ig en dos o más fracciones, en elque al menos una fracción tiene una proporción molar más grande de ácido siálico con respecto a las moléculasde CTLA4-Ig en comparación con al menos la otra fracción; (vi) en las que las etapas (ii), (iii), (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dichacomposición.

Description

Composiciones y procedimientos de producción de una composición
Antecedentes de la invención
El antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4), un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una molécula expresada por linfocitos T activados. CTLA4 es similar a la molécula co-estimuladora de linfocitos T CD28, y ambas moléculas se unen a B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) en células presentadoras de antígenos (APC). Sin embargo, el CTLA4 transmite una señal inhibidora a linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimuladora.
Las moléculas de CTLA4-Ig son proteínas de fusión del dominio de unión a ligando del antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4) y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig). Esta molécula soluble ejerce sus efectos fisiológicos uniéndose a antígenos B7 (CD80 y CD86) en la superficie de diversas células presentadoras de antígenos (APC), bloqueando de este modo la interacción funcional de B7-1 y B7-2 con CD28 en la superficie de linfocitos T. Este bloqueo da como resultado la supresión de activación de linfocitos T, y de este modo, la supresión de la respuesta inmunitaria. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden por lo tanto proporcionar un procedimiento de inhibición de rechazo de trasplantes de tejidos y/u órganos sólidos, así como un uso terapéutico para enfermedades o trastornos relacionados con respuestas inmunitarias desreguladas en general, incluyendo autoinmunidad. Por ejemplo, las moléculas de CTLA4-Ig pueden suprimir la producción de anticuerpos anti-ADNbc y reducir la nefritis en ratones propensos a lupus; pueden reducir la proteinuria y prolongar la supervivencia en ratones con nefritis avanzada; y pueden mejorar los resultados clínicos para psoriasis y artritis reumatoide.
Para mejorar la utilidad terapéutica de moléculas de CTLA4-Ig, es importante determinar alteraciones moleculares que pueden hacerse para potenciar la eficacia de la molécula como un inhibidor de la estimulación de linfocitos T, por ejemplo, aumentando la avidez y potencia de la molécula por antígenos B7. Un aumento en la avidez y potencia de moléculas de CTLA4-Ig puede posibilitar la administración de una cantidad reducida de moléculas de CTLA4-Ig a un paciente para conseguir un efecto terapéutico deseado (es decir, administración de una dosis menor). Un aumento en la avidez y potencia de moléculas de CTLA4-Ig también puede reducir el número de dosis o la frecuencia de dosis que se administran a un paciente para conseguir un efecto terapéutico deseado.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para producir composiciones de CTLA4-Ig. La invención se refiere a un procedimiento para obtener una composición que comprenda una población aislada de moléculas de CTLA4-Ig de un medio líquido de cultivo, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTL4-Ig, en el que (1) las moléculas de CTL4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido sialíco,
(2) el número de restos de ácido sialico por molécula de CTL4-Ig varía en la población inicial, (3) la población inicial comprende dímeros y agregados de CTL4-Ig de alto peso molecular, y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP1, comprendiendo el procedimiento:
(i)
recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTL4-Ig;
(ii)
separar las moléculas de CTL4-Ig de componentes celulares;
(iii) usar cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición ;
(iv)
usar cromatografía en columna para separar los dímeros de CTL4-Ig de los agregados de CTL4-Ig de alto peso molecular; y
(v)
usar cromatografía en columna para separar las moléculas de CTL4-Ig en dos o más fracciones, en el que al menos una fracción tiene una proporción molar de ácido siálico con respecto a moléculas de CTL4-Ig mayor en comparación con al menos la otra fracción;
en el que las etapas (ii), (iii), (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dicha composición.
Las siguientes células, composiciones, formulaciones, kits, procedimientos de tratamiento y procedimientos de producción de CTLA4-Ig, se describen para ilustrar el procedimiento de la invención y sus usos.
Células: Se describen en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino capaces de producir CTLA4-Ig; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, comprendiendo cada célula 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, comprendiendo cada célula 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que un casete de expresión de CTLA4-Ig es estable durante aproximadamente 105 pases. El CTLA4-Ig puede codificarse por un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita por Koduri R., y col.
(Gene, 2001, 280: 87-95) y en las Patentes de Estados Unidos Nº. 6.800.457 y 6.521.419. El CTLA4-Ig también puede codificarse por un casete de expresión integrado en un genoma celular de la población celular en un locus específico descrito por Koduri R., y col. (Gene, 2001, 280: 87-95) y en las Patentes de Estados Unidos Nº. 6.800.457 y 6.521.419. La población puede comprender una subpoblación de células que comprenden 33 o más copias del casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 33 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula de la subpoblación.
Se describe en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 75% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 75% de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 85% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 85% de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 95% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula en el 95% de la población. La población celular puede ser una población capaz de producir más de 0,5 o más gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, y en la que el CTLA4-Ig muestra características de carbohidratos aceptables, cuando la proporción molar de ácido siálico y CTLA4-Ig es de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 a una escala de cultivo de 1000 l o más. La población celular puede ser una población adaptada a medio químicamente definido, sin suero. El CTLA4-Ig producido a partir del cultivo de la población celular puede tener un coeficiente de extinción de 1,00 ± 0,05 UA ml cm-1 mg-1. La población celular puede ser una población que, cuando se deja crecer en cultivo, es capaz de producir polipéptidos de CTLA4-Ig, en la que: (a) aproximadamente el 90% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) aproximadamente el 4% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la lisina en el número de resto 383,
(d) aproximadamente el 96% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la glicina en el número de resto 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el número de resto 25.
Se describe en el presente documento una célula descendiente de la célula clonal, en la que la célula descendiente produce CTLA4-Ig. La célula descendiente puede obtenerse de cultivo de la célula parental clonal durante al menos 5 generaciones. La célula descendiente puede obtenerse de cultivo de una célula durante al menos 10 generaciones, durante al menos 20 generaciones, durante al menos 40 generaciones, durante al menos 50 generaciones, durante al menos 75 generaciones o durante al menos 100 generaciones. Puede producirse una línea celular a partir de la célula clonal. La línea celular puede ser clonal. Una línea celular capaz de producir: (a) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 10 (metionina en la posición aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382; Figuras 1A y 1B); (b) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383; Figuras 1A y 1B); (c) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 9 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382; Figuras 1A y 1B); (d) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383; Figuras 1A y 1B); (e) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8 (metionina en la posición de aminoácido 25 y glicina en la posición de aminoácido 382; Figuras 1A y 1B); o (f) una proteína de fusión de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5 (metionina en la posición de aminoácido 25 y lisina en la posición de aminoácido 383; Figuras 1A y 1B). La línea celular puede ser capaz de producir proteínas de fusión de CTLA4-Ig, en las que: (a) aproximadamente el 90% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) aproximadamente el 4% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la lisina en el número de resto 383, (d) aproximadamente el 96% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la glicina en el número de resto 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el número de resto 25.
Las proteínas de fusión de CTLA4-Ig, que se producen a partir del cultivo de la línea celular, pueden tener un coeficiente de extinción de 1,00 ± 0,05 UA ml cm-1 mg-1. Puede derivarse una población celular de la línea celular clonal. La población celular puede consistir en al menos un cambio genético adicional en comparación con la línea celular clonal original y en la que la población celular derivada es capaz de producir CTLA4-Ig. La población celular puede consistir en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 10, al menos 15 o al menos 20 cambios genéticos adicionales en comparación con la célula parental, y en la que la población celular derivada es capaz de producir CTLA4-Ig. El cambio genético puede comprender al menos una
mutación no conservativa en el genoma celular o en el casete de expresión recombinante que codifica CTLA4-Ig. El cambio genético puede comprender al menos un ácido nucleico recombinante adicional dentro de la célula. El cambio puede comprender una mutación del genoma celular. El cambio puede comprender la adición de un ácido nucleico al genoma celular o como un ácido trans nucleico, que codifica un polipéptido anti-apoptótico. El polipéptido anti-apoptótico puede estar relacionado con la glucosilación. El cambio genético puede comprender al menos una mutación del genoma celular o del casete de expresión recombinante que codifica CTLA4-Ig.
Composiciones: Se describen en el presente documento una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 12 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 13 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 14 a aproximadamente 18; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 17; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 16; una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que más del 95% de las moléculas son dímeros de CTLA4-Ig. Más del 98% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. Más del 99% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. Más del 99,5% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. De aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99,5% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig y de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5% de las moléculas, tetrámeros de CTLA4-Ig o especies de alto peso molecular. Aproximadamente el 98,6% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig y aproximadamente el 1,2% de las moléculas, tetrámeros de CTLA4-Ig o especies de alto peso molecular y aproximadamente menos del 0,7% de las moléculas, monómeros de CTLA4-Ig. Se describe en el presente documento una población consistente en dímeros de CTLA4-Ig; una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que la población está sustancialmente sin monómero de CTLA4-Ig; una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que la población está sustancialmente sin tetrámero de CTLA4-Ig; una población de moléculas monoméricas de CTLA4-Ig sustancialmente sin dímero y tetrámero de CTLA4-Ig. Se describen en el presente documento una población en la que cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene al menos 3 grupos de ácido siálico; y una población en la que cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene de al menos 3 grupos de ácido siálico a al menos 8 grupos de ácido siálico; una población purificada de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig, estando la población sustancialmente sin dímero de CTLA4-Ig, y opcionalmente en la que la población comprende una cantidad que es mayor de aproximadamente 100 gramos; una población purificada de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig, estando la población sustancialmente sin monómero de CTLA4-Ig, y opcionalmente en la que la población comprende una cantidad que es mayor de aproximadamente 100 gramos, una población en la que cada molécula tetramérica comprende dos pares de polipéptidos de CTLA4-Ig, en la que cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 5-10, y en el que cada miembro del par de polipéptidos está ligado covalentemente con el otro miembro, y en la que los dos pares de polipéptidos no están asociados covalentemente entre sí; una población en la que cada molécula tetramérica es capaz de unirse a un CD80 o CD86; una población en la que cada molécula tetramérica tiene al menos una avidez 2 veces mayor por CD80 o CD86 en comparación con una molécula dimérica de CTLA4-Ig; una población en la que cada molécula tetramérica tiene al menos una inhibición 2 veces mayor de la proliferación o activación de linfocitos T en comparación con una molécula dimérica de CTLA4-Ig. Se describe en el presente documento una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que la composición comprende isoformas dominantes que pueden visualizarse en un gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,1 como se determina por isoelectroenfoque; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que la composición comprende isoformas dominantes visualizables en un gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,8 como se determina por isoelectroenfoque. La pI puede aumentar después de tratamiento con neuraminidasa. La composición puede comprender isoformas dominantes visualizables en un gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 o 4,5 como se determina por isoelectroenfoque. Al menos el 40% de las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,1 como se determina por isoelectroenfoque. Al menos el 70% de las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,1 como se determina por isoelectroenfoque. Al menos el 90% de las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 2,5 como se determina por isoelectroenfoque. Se describe en el presente documento una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un pI de aproximadamente 2,0 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un pI de aproximadamente 4,0 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tiene un pI de aproximadamente 4,3 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2; una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un pI de aproximadamente 3,3 ± 0,2 a aproximadamente 4,7 ± 0,2; un procedimiento para preparar una composición, comprendiendo la composición una molécula de CTLA4-Ig con un pI de aproximadamente 2,0 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2, comprendiendo el procedimiento: (a) someter una
mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a electroforesis en gel de isoelectroenfoque, en el que una única banda en el gel representa una población de moléculas de CTLA4-Ig con un pI particular; y (b) aislar la población de moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 2,0 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2 para preparar la composición.
Se describe en el presente documento una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig
o de molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o con molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12.
Se describe en el presente documento una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por:
(a)
una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; y (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig caracterizadas por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6 y (c) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17 y (d) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig caracterizadas por: (a) una proporción molar media de GlNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, (b) una proporción molar media de GalAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3 y (e) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig caracterizadas por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3, (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22 y (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que la composición muestra un pico de cromatograma de NGNA de aproximadamente 9,589 +/-0,3 y un pico de cromatograma de NANA de aproximadamente 10,543 +/-0,3; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig muestran un perfil de carbohidratos como se muestra en la Figura 68; una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig muestran un perfil de carbohidratos de los dominios I-V (por ejemplo, I-IV), en la que el dominio I comprende picos que representan oligosacáridos a-sialilados, el dominio II comprende picos que representan oligosacáridos mono-sialilados, el dominio III comprende picos que representan oligosacáridos di-sialilados, y el dominio IV comprende picos que representan oligosacáridos tri-sialilados. El dominio V comprende picos que representan oligosacáridos tetrasialilados. La diferencia en los tiempos de retención de oligosacáridos ligados a N entre un primer pico en el dominio I y un pico principal en el dominio II puede ser de aproximadamente 22 a aproximadamente 28 minutos. Se describe en el presente documento una composición que comprende moléculas diméricas de CTLA4-Ig, en la que al menos el 0,5% de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig están cisteiniladas. Al menos el 1,0% de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig pueden estar cisteiniladas. Se describe en el presente documento una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que la población muestra un perfil de espectrometría de masas como se muestra en las Figuras 8 y 10; una población de moléculas de CTLA4-Ig,
en al que la población muestra un perfil de electroforesis capilar como se muestra en las Figuras 20 y 21; una composición de moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18. La invención proporciona una composición de CTLA4-Ig obtenida por cualquiera de los procedimientos de la invención. Se describe en el presente documento una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas están glucosiladas en un resto de aminoácido asparagina en la posición 102 de SEC ID Nº: 2, un resto de aminoácido asparagina en la posición 134 de SEC ID Nº: 2, un resto de aminoácido asparagina en la posición 233 de SEC ID Nº: 2, un resto de aminoácido serina en la posición 155 de SEC ID Nº: 2, o un resto de aminoácido serina en la posición 165 de SEC ID Nº: 2.
Se describe en el presente documento una población de moléculas de CTLA4-Ig, en la que la población de moléculas se caracteriza por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3, (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22, (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, (g) un pI como se determina a partir de la visualización en un gel de isoelectroenfoque en un intervalo de aproximadamente 2,4 ± 0,2 a aproximadamente 5,0 ± 0,2, (h) MCP-1 de menos de o igual a 5 ppm, (i) menos de 3,0 % de tetrámero (por ejemplo, 2,5 % de especie de alto peso molecular o tetrámero, 2,0% de especie de alto peso molecular o tetrámero, (j) menos de 0,5% de monómero, (k) polipéptidos de CTLA4-Ig de la población que tiene un aminoácido al menos 95 % idéntico a cualquiera de SEC ID Nº: 2-8, (l) en la que las moléculas de CTLA4-Ig dentro de la población son capaces de unirse a CD80 y CD86.
Composiciones: Se describe en el presente documento una composición que comprende una cantidad eficaz de las moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable; una composición que comprende excipientes como se describen en la Solicitud de Estados Unidos Nº 60/752.150, presentada el 20 de diciembre 2005. La composición incluye CTLA4-Ig. La composición puede comprenden además un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición comprende además, maltosa, fosfato sódico monobásico monohidrato, cloruro sódico, hidróxido sódico y agua estéril. La composición puede comprender sacarosa, poloxámero, fosfato sódico monobásico monohidrato, fosfato sódico dibásico anhídrido, cloruro sódico, hidróxido sódico y agua estéril.
Formulaciones y kits: Se describe en el presente documento una mezcla de CTLA4-Ig liofilizada que comprende al menos 95 % de dímero de CTLA4-Ig, y no más del 5% de tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede ser una mezcla que comprende al menos el 98 % de dímero de CTLA4-Ig y no más del 2 % de especie de alto peso molecular o tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede ser una mezcla que comprenda al menos 99 % de dímero de CTLA4-Ig y no más del 1 % de especie de alto peso molecular o tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender al menos 8,0 moles de ácido siálico por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 15,7 a aproximadamente 31 moles de GlcNAc por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 1,6 a aproximadamente 3,2 moles de GalNAc por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 9,3 a aproximadamente 15,5 moles de galactosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 3,6 a aproximadamente 7,9 moles de fucosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 9,7 moles de manosa por mol de dímero o molécula de CTLA4-Ig. Se describe en el presente documento un kit farmacéutico que comprende: (a) un recipiente que contiene una mezcla de CTLA4-Ig liofilizada descrita en el presente documento; y (b) instrucciones para reconstituir la mezcla de CTLA4-Ig liofilizada en solución para inyección.
Procedimientos de tratamiento ilustrativos: Para inhibir la proliferación (o activación) de linfocitos T puede usarse un procedimiento que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para inducir tolerancia inmunitaria a un antígeno en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para tratar la inflamación en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para tratar la artritis reumatoide puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para tratar la psoriasis en un sujeto puede usarse en procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar el lupus en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento. Para tratar
o prevenir una alergia en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar o prevenir la enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende
administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar o prevenir el rechazo de un órgano trasplantado en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la esclerosis múltiple en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la enfermedad de Crohn en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la diabetes de tipo I en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la ooforitis en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la glomerulonefritis en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la encefalomielitis alérgica en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la miastenia grave en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en la presente invención.
Puede usarse una población de moléculas de CTLA4-Ig que tengan una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno inmunitario. Puede usarse una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero o molécula de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18 en la fabricación de un agente anti-artritis reumatoide en un envase junto con instrucciones para su uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.
Terapias de combinación ilustrativas: Puede usarse un procedimiento que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inhibir la proliferación (o activación) de linfocitos T. Puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto. Puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de CTLA4-Ig descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inducir tolerancia inmunitaria a un antígeno en un sujeto.
Procedimientos de producción de CTLA4-Ig: Puede producirse proteína recombinante mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una proteína recombinante, en el que la expansión es de un cultivo de siembra a un cultivo líquido, en el que la concentración de proteína recombinante es de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido. El cultivo líquido puede ser de al menos 1.000 l, al 5.000 l, al menos 10.000 l, al menos 15.000 l, al menos 20.000 l, al menos 25.000 l, al menos
30.000 l, al menos 40.000 l. La expansión de la etapa (a) puede comprender: (i) cultivar las células en un medio químicamente definido sin suero con al menos cuatro pases para obtener una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 105 células viables por ml, en el que cada estadio de semilla comienza a aproximadamente 2 x105 por ml y llega hasta 1-2 millones de células por ml, (ii) mantener las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir del cultivo al menos aproximadamente 0,5 g/l. La proteína es una proteína de CTLA4-Ig. Las células de mamífero pueden ser descendientes de una línea celular clonal de CHO capaz de producir la proteína de fusión de CTLA4-Ig, en la que las células CHO han integrado de forma estable en su genoma al menos 30 copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig. El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del cual la viabilidad de las células no quede por debajo del 30 %. Como alternativa, el tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del cual la viabilidad de las células no quede por debajo del 40%. Como alternativa, el tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del cual la viabilidad de las células no quede por debajo del 50 %. Como alternativa, el tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del cual la viabilidad de las células no quede por debajo del 60%. Como alternativa, el tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del cual la viabilidad de las células no quede por debajo del 70 %, 80 %, 90 %o95%.
Los al menos cuatro pases pueden comprender: (i) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 50 ml hasta que se alcanza una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml, (ii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 10 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; (iii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 100 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; y (iv) cultivar las células en un volumen de cultivo de 200 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml. Se añade galactosa al medio químicamente definido sin suero. El mantenimiento puede comprender (i) reducir la temperatura del cultivo de 37 ± 2 °C a 34 ± 2 °C; y (ii) reducir la temperatura del cultivo de 34 ± 2 °C a 32 ± 2 °C. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 ºC durante al menos 5 días. Como alternativa, la
temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 6 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 7 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 8 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 9 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 10 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 11 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 12 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 13 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 14 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 15 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 16 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 17 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante al menos 18 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C durante hasta 18 días. Como alternativa, la temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ± 2 °C hasta que la densidad celular del cultivo sea de aproximadamente 30 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml de cultivo líquido.
Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de modo que la concentración de proteína recombinante sea al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido, en el que el aislamiento se produce solamente cuando el cultivo líquido contiene más de o igual a aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de proteína o dímero de CTLA4-Ig. Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir las células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de modo que la concentración de proteína recombinante sea al menos de 0,5 gramos/l de cultivo líquido, y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido, en el que el aislamiento se produce solamente cuando el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml. Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir las células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de modo que la concentración de proteína recombinante sea de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido, en el que el aislamiento se produce cuando la viabilidad celular en el cultivo líquido no ha bajado por debajo de aproximadamente 20%, aproximadamente 30% o aproximadamente 38%. Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de modo que la concentración de proteína recombinante sea de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido, en el que el aislamiento se produce solamente cuando la endotoxina es menor de o igual a aproximadamente 76,8 UE por ml de cultivo líquido. Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de modo que la concentración de proteína recombinante sea de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos
10.000 l, en el que el aislamiento se produce solamente cuando la carga biológica es menor de 1 unidad formadora de colonia por ml de cultivo líquido. El cultivo líquido descrito en el presente documento puede ser de un volumen de al menos 5.000 l, al menos 10.000 l, al menos 15.000 l, al menos 20.000 l, al menos 25.000 l, al menos 30.000 l, al menos 40.000 l, al menos 50.000 l, al menos 60.000 l.
Puede producirse una proteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de modo que la concentración de proteína recombinante sea de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido, en el que el aislamiento se produce solamente si se cumplen al menos dos de las siguientes condiciones: (i) el cultivo líquido contiene más de o igual a aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de proteína, (ii) el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml, (iii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no ha caído por debajo de aproximadamente 20 % o aproximadamente 38 %, o (iv) la cantidad de CTLA4-Ig en el cultivo es mayor de 0,5 g/l. El aislamiento puede comprender: (i) obtener un sobrenadante de cultivo celular; (ii) someter el sobrenadante a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto proteico eluido; (iii) someter el producto proteico eluido de la etapa (ii) a cromatografía de interacción hidrófoba de modo que se obtenga un producto proteico enriquecido; (iv) someter el producto proteico enriquecido a cromatografía de afinidad para obtener un producto proteico eluido y enriquecido; y
(v) someter el producto proteico eluido y enriquecido de (iv) a cromatografía de intercambio aniónico. El producto proteico enriquecido obtenido en la etapa (iii) puede caracterizarse porque un porcentaje de cualquier contaminante de alto peso molecular es menor del 25 % en peso. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) puede llevarse a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 75 mM y NaCl aproximadamente 360 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) puede llevarse a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES 25 mM, y NaCl aproximadamente 325 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) puede llevarse a cabo usando un único tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 25 mM, y NaCl aproximadamente 850 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. La cromatografía de afinidad
de la etapa (iv) puede llevarse a cabo usando un tampón de lavado que comprende Tris aproximadamente 25 mM y NaCl aproximadamente 250 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. La cromatografía de afinidad de la etapa (iv) puede llevarse a cabo usando un tampón de elución que comprende glicina aproximadamente 100 mM y que tiene un pH de aproximadamente 3,5. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (v) puede llevarse a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 25 mM y de NaCl aproximadamente 120 mM a NaCl aproximadamente 130 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (v) puede llevarse a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES aproximadamente 25 mM, y NaCl aproximadamente 200 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) puede llevarse a cabo usando una columna que tiene una resina de intercambio aniónico que tiene un grupo funcional de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. La resina puede tener un grupo funcional de amina cuaternaria. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) puede llevarse a cabo usando una resina de interacción hidrófoba que tiene un grupo funcional fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo. El grupo funcional puede ser un grupo funcional fenilo. La cromatografía de afinidad de la etapa (iv) puede llevarse a cabo usando una columna que contiene proteína A.
Puede prepararse CTLA4-Ig por un procedimiento que comprende purificar CTLA4-Ig de un cultivo celular líquido de modo que la CTLA4-Ig purificada (a) tiene aproximadamente 38 ng de MCP-1 por mg de dímero de CTLA4-Ig, y (b) comprende menos del 2,5 % de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig (por ejemplo, tetrámero) en peso. CTLA4-Ig puede producirse por un procedimiento que comprende: (a) expandir células descendientes o células CHO que son capaces de producir CTLA4-Ig, en el que la expansión es de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que la concentración de CTLA4-Ig es de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido; y (b) aislar CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que la cromatografía es en una columna con resina de interacción hidrófoba con al menos un grupo funcional fenilo, en el que el aislamiento comprende una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba llevada a cabo usando un único tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 25 mM, y NaCl aproximadamente 850 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7,0.
Las moléculas de CTLA4-Ig incluyen moléculas polipeptídicas beta. CTLA4A29YL104E-Ig es una molécula polipeptídica beta. La presente invención se refiere a procedimientos para producir (incluyendo producir en masa) composiciones polipeptídicas beta o composiciones moleculares polipeptídicas beta, y composiciones mejoradas. En el presente documento se describen moléculas polipeptídicas beta, composiciones mejoradas que comprenden moléculas polipeptídicas beta y procedimientos mejorados para producir (incluyendo producir en masa) moléculas polipeptídicas beta.
Procedimientos de producción de polipéptidos beta y otras glucoproteínas: Puede producirse una glucoproteína recombinante mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una glucoproteína recombinante, en el que la expansión es de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l, en el que la concentración de proteína recombinante es de al menos aproximadamente 0,5 g/l de cultivo líquido, en el que la expansión comprende: (i) cultivar las células en un medio químicamente definido sin suero, con al menos cuatro pases para obtener una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x105 células viables por ml, en el que cada estadio de semilla comienza a aproximadamente 2 x 105 por ml y llega hasta aproximadamente 1-2 millones de células por ml, en el que el cultivo comprende: (1) cultivar las células en un medio de inóculo químicamente definido sin suero durante desde aproximadamente 15 días a aproximadamente 25 días; después (2) cultivar las células en un medio basal químicamente definido sin suero hasta que se alcanza una densidad celular de aproximadamente al menos 4 millones de células por ml; y (ii) mantener las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir la proteína recombinante del cultivo al menos aproximadamente 0,5 g/l; y
(b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l.
Puede producirse una glucoproteína recombinante por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una glucoproteína recombinante, en el que la expansión es de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l, en el que la concentración de proteína recombinante es de al menos aproximadamente 0,5 g/l de cultivo líquido, en el que la expansión comprende: (i) cultivar las células en un medio químicamente definido sin suero con al menos cuatro pases para obtener una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 105 células viables por ml, en el que cada estadio de semilla comienza a aproximadamente 2 x105 por ml y llega hasta aproximadamente 1-2 millones de células por ml, y (ii) mantener las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir la proteína recombinante del cultivo al menos aproximadamente 0,5 g/l, en el que el mantenimiento comprende: (1) reducir la temperatura del cultivo de 37 ± 2 °C a 34 ± 2 °C: y (2) añadir un compuesto polianiónico al cultivo; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l.
Puede producirse una glucoproteína recombinante mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que secretan una glucoproteína recombinante, en el que la expansión es de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l, en el que la concentración de proteína recombinante es de al menos aproximadamente 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos aproximadamente 10.000 l, en el que el aislamiento comprende: (i) obtener una fracción soluble del cultivo de la etapa (a); (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener un producto proteico eluido; (iii) someter el producto proteico eluido de la etapa (ii) a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto proteico eluido y enriquecido; y (iv) someter el producto proteico enriquecido a cromatografía de interacción
hidrófoba para obtener un producto proteico enriquecido.
La proteína comprende una CTLA4-Ig. En otra realización, la proteína comprende un polipéptido beta o moléculas polipeptídicas beta. En otra realización, la proteína comprende polipéptidos beta que tienen SEC ID Nº: 11, 12, 13, 14, 15 o16.
Los al menos cuatro pases pueden comprender: (i) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 50 ml hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; (ii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 10 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; (iii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 100 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; y (iv) cultivar las células en un volumen de cultivo de 200 l hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml.
El aislamiento puede comprender: (i) obtener una fracción soluble del cultivo de la etapa (a); (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener un producto proteico eluido; (iii) someter el producto proteico eluido de la etapa (ii) a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto proteico eluido y enriquecido; y (iv) someter el producto proteico enriquecido a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener un producto proteico enriquecido.
El producto proteico enriquecido obtenido en la etapa (iv) pude caracterizarse porque un porcentaje de cualquier multímero de alto peso molecular es menor del 25 % en peso. En otra realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) se lleva usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 50 mM y NaCl aproximadamente 135 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) puede llevarse a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES aproximadamente 50 mM y NaCl aproximadamente 200 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iv) puede llevarse a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 50 mM y (NH4)2SO4 aproximadamente 1,2 M, y que tiene un pH de aproximadamente 7. La cromatografía de afinidad de la etapa (ii) puede llevarse a cabo usando un tampón de lavado que comprende NaH2PO4 aproximadamente 25 mM y NaCl aproximadamente 150 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7,5. La cromatografía de afinidad de la etapa (ii) puede llevarse a cabo usando un tampón de elución que comprende glicina aproximadamente 250 mM y que tiene un pH de aproximadamente 3. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) puede llevarse a cabo usando una columna que tenga una resina de intercambio aniónico que tenga un grupo funcional de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. La resina puede tener un grupo funcional de amina cuaternaria. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) puede llevarse a cabo usando una resina de interacción hidrófoba que tenga un grupo funcional de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo. El grupo funcional puede ser un grupo funcional fenilo. La cromatografía de afinidad de la etapa (ii) puede levarse a cabo usando una columna que contenga Proteína A.
La expansión puede comprender: (i) cultivar las células en medio químicamente definido, sin suero, con al menos cuatro pases para obtener una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 105 células viables por ml, en el que cada estadio de semilla comienza a aproximadamente 2 x 105 por ml y llega a aproximadamente 1-2 millones de células por ml; y (ii) mantener las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir la proteína recombinante a partir del cultivo al menos aproximadamente 0,5 g/l. En otra realización, el cultivo comprende: (i) cultivar las células en un medio químicamente definido, sin suero, durante de aproximadamente 15 días a aproximadamente 25 días; después (ii) cultivar las células en un medio basal químicamente definido, sin suero, hasta que se alcance una densidad celular de aproximadamente al menos 4 millones de células por ml.
El mantenimiento puede comprender (i) reducir la temperatura del cultivo de 37 ! 2ºC a34 ! 2 ºC y (ii) añadir un compuesto polianiónico al cultivo. El compuesto polianiónico puede ser dextran sulfato y el dextran sulfato puede añadirse al cultivo a una concentración final de aproximadamente 50 mg/ml. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 5 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 6 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 7 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2º C durante al menos 8 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 9 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 10 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 11 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 12 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 13 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 14 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 15 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 16 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 17 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 18 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 19 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 20 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 21 días. La temperatura puede
mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 22 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 23 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 24 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 25 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 26 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 27 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante al menos 28 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2 ºC durante hasta 28 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 34 ! 2ºC hasta que la densidad celular del cultivo sea de aproximadamente 30 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml de cultivo líquido.
El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del que la viabilidad de las células no caiga por debajo del 30 %. El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del que la viabilidad de las células no caiga por debajo del 40 %. El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del que la viabilidad de las células no caiga por debajo del 50 %. El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del que la viabilidad de las células no caiga por debajo del 60 %. El tiempo suficiente puede ser un tiempo al cabo del que la viabilidad de las células no caiga por debajo del 70, 80, 90 o95 %.
Puede añadirse galactosa al medio químicamente definido, sin suero. En otra realización, el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido contiene más de o igual a aproximadamente 6 moles de ácido siálico por mol de proteína. En otra realización el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido contiene de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6 moles de ácido siálico por mol de proteína. En otra realixación el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml. En otra realización el aislamiento se realiza cuando la viabilidad celular en el cultivo líquido no ha caído por debajo de aproximadamente el 37 %. En otra realización, el aislamiento se produce cuando la endotoxina es menor de o igual a aproximadamente 4,8 UE por ml de cultivo líquido. En otra realización, el aislamiento se realiza cuando la carga biológica es menor de aproximadamente una unidad formadora de colonias por ml (ufc/ml) de cultivo líquido. En otra realización, el aislamiento se realiza si se cumplen al menos dos de las siguientes condiciones: (i) el cultivo líquido contiene más de o igual a aproximadamente 6 moles de ácido siálico por mol de proteína, (ii) el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml, (iii) la viabilidad celular en cultivo líquido no ha caído por debajo de aproximadamente el 37 %, o (iv) la cantidad de glucoproteína en el cultivo es de aproximadamente 0,46 g/l a aproximadamente 0,71 g/l.
Las células de mamífero pueden ser descendientes de una línea celular clonal de ovario de hámster chino que produzca cualquier combinación de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, en la que las células de ovario de hámster chino tienen integradas de forma estable en su genoma al menos 30 copias de un casete de expresión que comprende SEC ID Nº 3. En una realización, el cultivo líquido comprende una célula de o una célula descendiente de una célula de una línea celular de producción descrita en el presente documento.
Puede obtenerse un polipéptido beta que comprende SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 por un procedimiento descrito en la invención. Puede obtenerse una composición que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 por un procedimiento descrito en la invención. La invención proporciona un polipéptido beta mediante un procedimiento proporcionado por la invención.
Células: Se describe en el presente documento una célula de ovario de hámster chino clonal que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido beta o una molécula polipeptídica beta; una población clonal de célula de ovario de hámster chino que produce polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta. En el polipéptido beta puede comprender SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Se describe en el presente documento una célula de ovario de hámster chino clonal que comprende un ácido nucleico que comprende un casete de expresión que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16. El casete de expresión puede comprender SEC ID Nº 3. Se describe en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta o molécula polipeptídica beta, en la que el polipéptido beta se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos derivada de un plásmido que tiene el Número de Referencia de ATCC PTA-2104 depositado según las cláusulas del Tratado de Budapest el 19 de junio de 2000 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110.
Se describe en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta o moléculas polipeptídicas beta, comprendiendo cada célula 30 o más copias de un casete de expresión de polipéptido beta; una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta o moléculas polipeptídicas beta, comprendiendo cada células 30 o más copias de un casete de expresión de polipéptido beta, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula; una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que un casete de expresión de polipéptido beta es estable durante aproximadamente 105 pases. El polipéptido beta puede codificarse por un casete de expresión integrado en un genoma celular.
Se describe en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta, en la que al menos el 75 % de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de polipéptido beta por célula, en el que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 75 % de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta, en la que al menos el 85 % de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de polipéptido beta por célula, en el que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 85 % de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino que produce un polipéptido beta, en la que al menos el 95 % de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de polipéptido beta por célula, en el que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 95 % de la población. El casete de expresión puede derivar de un plásmido depositado con el Número de Referencia de ATCC PTA-2104. El casete de expresión puede comprender un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEC ID Nº 3. La población celular puede ser una población que produzca al menos aproximadamente 0,5 gramos del polipéptido beta por litro de cultivo líquido, y el polipéptido beta puede tener una proporción molar de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 a una escala de cultivo de 1.000 l o más. La población celular puede ser una población que produzca al menos 5, al menos 10 o al menos 20 gramos del polipéptido beta por litro de cultivo líquido. El polipéptido beta puede tener una proporción molar de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 a una escala de cultivo de 1.000 l o más. La población celular puede ser una población que se haya adaptado a un medio químicamente definido, sin suero. Un polipétido beta producido a partir del cultivo de la población celular puede tener un coeficiente de extinción de 1,0 ! 0,05 UA ml cm-1 mg-1. La población celular, cuando se deja crecer en cultivo, puede ser una población que produzca polipéptidos beta, en la que: (a) aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 80 % de los polipéptidos beta comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la metionina del resto 27; (b) aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 20 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 8 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la lisina en el número de resto 383; (d) de aproximadamente el 92 % o aproximadamente el 96 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la glicina en el número de resto 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la metionina en el número de resto 25.
Puede usarse una célula descendiente de una población celular descrita en el presente documento, en la que la célula descendiente produce un polipéptido beta. La célula descendiente puede obtenerse de cultivar una célula durante al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 50, al menos 75 generaciones. La célula descendiente puede obtenerse de cultivar una célula durante 27 generaciones.
Puede usarse una línea celular producida a partir de cualquier célula descrita en el presente documento. La línea celular puede ser clonal. La línea celular puede ser una línea que produzca: (a) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); (b) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 13 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (c) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 15 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); (d) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (e) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11 (metionina en la posición de aminoácido 25 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (f) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 (metionina en la posición de aminoácido 25 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); o (g) cualquier combinación de los mismos. La línea celular puede ser una línea que produzca polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que: (a) aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 80 % de los polipéptidos beta comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 20 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 8 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la lisina en el número de resto 383; (d) de aproximadamente el 92 % o aproximadamente el 96 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la glicina en el número de resto 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1 % de los polipéptidos beta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 que comienza con la metionina en el número de resto 25. Los polipéptidos beta, que se producen a partir del cultivo de la línea celular, pueden tener un coeficiente de extinción de 1,0 ! 0,05 UA ml cm-1 mg-1.
Puede usarse una población celular derivada de una célula descrita en el presente documento. Las células de la población pueden contener al menos un cambio genético adicional en comparación con la célula descrita en el presente documento de la que derivó la población, y las células pueden ser células que produzcan un polipéptido beta. Las células de la población pueden ser células que contengan al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 20 cambios genéticos adicionales en comparación con la célula descrita en el presente documento de la que derivó la población, y las células pueden ser
células que produzcan un polipéptido beta. El cambio genético puede comprender al menos una mutación no conservativa en el genoma celular o en el casete de expresión que codifica el polipéptido beta. El cambio genético puede comprender al menos un ácido nucleico recombinante adicional dentro de la célula. El cambio genético puede comprender una mutación del genoma celular. El cambio genético puede comprender adición de un ácido nucleico al genoma celular o como un ácido transnucleico, y el ácido nucleico puede ser un ácido nucleico que codifique un polipéptido anti-apoptótico. Este polipéptido anti-apoptótico puede ser un polipéptido relacionado con la glucosilación. El cambio genético puede comprender al menos una mutación del genoma celular o del casete de expresión que codifica un polipéptido beta. La población celular, cuando se deja crecer en cultivo, puede ser un población que produzca: (a) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); (b) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (c) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 15 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); (d) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (e) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11 (metionina en la posición de aminoácido 25 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (f) un polipéptido beta que tenga una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 (metionina en la posición de aminoácido 25 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); o (g) cualquier combinación de los mismos.
Composiciones: En el presente documento se describe una población aislada de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, que tiene una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. La proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta puede ser de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6. En el presente documento se describe una población aislada de polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, que tiene una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptidica beta de aproximadamente 6; una población aislada de polipépidos beta, e la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 y en la que más del 95 % de los polipéptidos forman dímeros. Más del 98 %, más del 99 % o más del 99,5 % de los polipéptidos pueden formar dímeros. De aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99,5 % de los polipéptidos pueden forman dímeros y de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 5 % de los polipéptidos pueden formar tetrámeros o especies de alto peso molecular. Aproximadamente el 98,6 % de los polipéptidos Pueden formar dímeros y aproximadamente el 1,2 % de los polipéptidos pueden formar tetrámeros o especies de alto peso molecular y aproximadamente menos del 0,7 % de los polipéptidos pueden ser monómeros. Aproximadamente el 95 % de los polipéptidos pueden formar dímeros y aproximadamente el 4 % de los polipéptidos pueden formar tetrámeros o especies de alto peso molecular y aproximadamente el 1 % de los polipéptidos puede ser una población aislada de dímeros polipeptídicos beta, en la que cada monómero polipeptídico comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16. La población puede ser una población que carezca sustancialmente de monómero polipeptídico beta. La población puede ser una población que carezca sustancialmente de tetrámero polipeptídico beta. En el presente documento se describe una población aislada de monómeros polipeptídicos beta que carece sustancialmente de dímero y tetrámero polipeptídico beta. La población puede ser una población en la que cada monómero de cada dímero polipeptídico beta comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 y tiene al menos 2,5 grupos de ácido siálico.
En el presente documento se describe una población aislada de polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 que tiene una potencia de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 130 % en un ensayo de unión de B7, en comparación con un patrón de CTLA4-Ig, en el que el ensayo comprende medir la resonancia de plasmón superficial; una población aislada de polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, que tiene una potencia de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 150 % en un ensayo de inhibición de IL-2 de células humanas, en comparación con un patrón; una población purificada de tetrámeros polipeptídicos beta o especies de alto peso molecular, en la que cada monómero polipeptídico comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, estando la población sustancialmente sin dímeros polipeptídicos beta, y opcionalmente en la que la población comprende una cantidad que es mayor de aproximadamente 100 g; una población purificada de tetrámeros polipeptídicos beta o especies de alto peso molecular, en la que cada monómero polipeptídico comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, estando la población sustancialmente sin monómero polipeptídico beta, y opcionalmente en la que la población comprende una cantidad que es mayor de aproximadamente 100 g. La población puede ser una población en la que cada molécula tetramérica comprenda dos pares de polipéptidos beta, en los que cada monómero polipeptídico comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que cada miembro del par de polipéptidos está unido covalentemente con el otro miembro, y en la que los dos pares de polipéptidos están asociados de forma no covalente entre sí; o una población en la que cada molécula tetramérica es capaz de unirse CD80 o CD86. En una realización, cada molécula tetramérica tiene una avidez al menos 2 veces mayor por CD80 o CD86 en comparación con un dímero polipeptídico beta, en el que cada monómero polipeptídico del dímero comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16; o una población en la que cada molécula tetramérica tiene una avidez al menos 2 veces mayor por CD80 o CD86 en comparación con una molécula
tetramérica CTLA4-Ig que comprende la secuencia de SEC ID Nº 2; o una población en la que cada molécula tetramérica tiene una inhibición al menos 2 veces mayor de la proliferación o activación de linfocitos T en comparación con un dímero polipeptídico beta, en el que cada monómero polipeptídico del dímero comprende la SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16; o una población en la que cada molécula tetramérica tiene una inhibición al menos 2 veces mayor de la proliferación o activación de linfocitos T en comparación con una molécula tetramérica CTLA4-Ig que comprende la secuencia de SEC ID Nº 2.
En el presente documento se describe una composición aislada que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada péptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que la composición comprende isoformas dominantes visualizables en un gel de isoelectroenfoque que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,5 como se determina por isoelectroenfoque. El pI puede aumentar después del tratamiento con neuraminidasa. Al menos el 40 % de los polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta puede mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 como se determina por isoelectroenfoque. Al menos el 70 % de los polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta puede mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 como se determina por isoelectroenfoque. Al menos el 90 % de los polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta puede mostrar un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 como se determina por isoelectroenfoque. Se describe en el presente documento una población aislada de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta que tienen un pI de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2; una población aislada de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta que tienen un pI de aproximadamente 4,5 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2; una población aislada de polipéptidos beta
o moléculas polipeptídicas beta que tienen un pI de aproximadamente 4,7 ! 0,2 a aproximadamente 5,1 ! 0,2; un procedimiento para preparar una composición, comprendiendo la composición polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta con un pI de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2, en el que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, comprendiendo el procedimiento: (a) someter una mezcla de polipéptidos beta a electroforesis en gel de isoelectroenfoque, en el que una única banda en el gel representa una población de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta con un pI particular, y (b) aislar la población de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta que tienen un pI de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2 para preparar la composición.
Se describen en el presente documento una composición aislada que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos están caracterizados por una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos están caracterizados por una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por una proporción molar media de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por una proporción molar media de manosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 14 a aproximadamente 16; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que las moléculas se caracterizan por una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que las moléculas se caracterizan por una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5 a aproximadamente 10; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que las moléculas se caracterizan por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6 y
(c)
una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 y en la que las moléculas se caracterizan por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por
mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 y (d) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos están caracterizados por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0 y (e) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0, (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 14 a aproximadamente 16, y (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 y (c) un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 8; una composición aislada que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 y (c) un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 8; y (d) un contenido de tetrámero polipeptídico beta menor de aproximadamente 5 %; una composición aislada que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 y (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13, (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 y (c) un contenido de tetrámero polipeptídico beta menor de aproximadamente 5 %; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 y (b) un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 8; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 y (b) un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 8; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5 y (b) un contenido de tetrámero polipeptídico beta o especies de alto peso molecular menor de aproximadamente 5 %; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos se caracterizan por: (a) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 y (b) un contenido de tetrámero polipeptídico beta o especie de alto peso molecular menor de aproximadamente 5 %.
Se describe en el presente documento una composición aislada que comprende polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 y en la que los polipéptidos muestran un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 8; una composición
aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que los polipéptidos muestran un perfil de carbohidratos de los Dominios I -IV, en el que el Dominio I comprende picos que representan oligosacáridos a-sialilados, el Dominio II comprende picos que representan oligosacáridos mono-sialilados, el Dominio III comprende picos que representan oligosacáridos disialilados, y el Dominio IV comprende picos que representan oligosacáridos tri-sialilados. La diferencia en los tiempos de retención de oligosacáridos ligados a N entre un primer pico en el Dominio I y un pico principal en el Dominio II puede ser de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 minutos. La suma de los Dominios III y IV puede comprender de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 36 % del perfil de carbohidratos total.
Se describe en el presente documento una composición aislada que comprende dímeros polipeptídicos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada monómero polipeptídico comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que al menos aproximadamente el 0,5 % de las moléculas están cisteiniladas; una población aislada de polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que la población muestra un perfil de espectrometría de masas como se muestra en la Figura 11; una población aislada de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, que tiene una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, en la que el dímero polipeptídico beta o moléculas polipeptídicas beta se produce a partir de células de una línea celular de producción; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, en la que los polipéptidos se glucosilan en un resto de aminoácido de asparagina en la posición 102 de SEC ID Nº 4, un resto de aminoácido de asparagina en la posición 134 de SEC ID Nº 4, un resto de aminoácido de asparagina en la posición 233 de SEC ID Nº 4; una composición aislada que comprende polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que las moléculas se caracterizan por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13, (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0, (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 14 a aproximadamente 16, (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5,
(g)
un pI como se determina a partir de la visualización de un gel de isoelectroenfoque en un intervalo de aproximadamente 2,4 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2, (h) MCP-1 de menos de o igual a 5 ppm, (i) menos de 5 % de tetrámero o especie de alto peso molecular, (j) menos de 1 % de monómero polipeptídico beta y (k) polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta de la población que tienen un aminoácido al menos 95 % idéntico a cualquiera de SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, en la que los polipéptidos beta dentro de la población son capaces de unirse a CD80 y CD86; una población aislada de polipéptidos beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que la población de moléculas está caracterizada por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 24 a aproximadamente 28, (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6, (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 11 a aproximadamente 13,
(d)
una proporción molar media de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0, (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 14 a aproximadamente 16, (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, (g) un pI como se determina a partir de la visualización en un gel de isoelectroenfoque en un intervalo de aproximadamente 2,4 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2, (h) MCP-1 de menos de o igual a 5 ppm, (i) menos de 5 % de tetrámero polipeptídico beta o alto peso molecular, (j) menos de 1 % de monómero, y (k) polipéptidos beta de la población que tengan un aminoácido al menos 95 % idéntico a cualquiera de las SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, en la que las moléculas polipeptídicas beta dentro de la población son capaces de unirse a CD80 y CD86, o equivalentes farmacéuticos de los mismos.
En el presente documento se describe una composición que comprende una cantidad eficaz del polipéptido beta descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable; y una composición que comprende excipientes como se describe en la Solicitud de Estados Unidos Nº 60/752.150; presentada el 20 de diciembre 2005. La composición puede incluir moléculas polipeptídicas beta. La composición puede comprender además un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además, sacarosa, fosfato sódico monobásico monohidrato, cloruro sódico, hidróxido sódico, ácido clorhídrico y agua estéril. La composición puede comprender además sacarosa, poloxámero, fosfato sódico monobásico monohidrato, fosfato sódico dibásico anhídrido, cloruro sódico, hidróxido sódico, y agua estéril. La composición puede estar liofilizada. Se describe en el presente documento una composición liofilizada que comprende una cantidad eficaz de los polipéptidos beta descritos en el presente documento, sacarosa, fosfato sódico monobásico monohidrato, cloruro sódico, hidróxido sódico y ácido clorhídrico.
Formulaciones y kits: Se describe en el presente documento una mezcla de polipéptidos beta liofilizada, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, que comprende al menos 95 % de dímero polipeptídico beta y no más del 5 % de tetrámero polipeptídico beta (especie de alto peso molecular). La mezcla puede comprender al menos 98 % de dímero polipeptídico beta y no más del 2% de tetrámero polipeptídico beta (especie de alto peso molecular). La mezcla puede comprender al menos 99 % de dímero polipeptídico beta y no más de 1 % de tetrámero polipeptídico beta (especie de alto peso molecular). La mezcla puede comprender al menos 5 moles de ácido siálico por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta. La mezcla puede comprender de aproximadamente 24 a aproximadamente 28 moles de GlcNAc por mol de dímero polipeptídico beta (especie de alto peso molecular). La mezcla puede comprender de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6 moles de GalNAc por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta. La mezcla puede comprender de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 moles de galactosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta. La mezcla puede comprender de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0 moles de fucosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta. La mezcla puede comprender de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 moles de manosa por mol de dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta. También se describe en el presente documento un kit farmacéutico que comprende: (a) un recipiente que contiene una mezcla polipeptídica beta liofilizada descrita en el presente documento y (b) instrucciones para reconstituir la mezcla polipeptídica beta liofilizada en solución para inyección.
Procedimientos de tratamiento ilustrativos: Para inhibir la proliferación, activación, o mabas, de linfocitos T puede usarse un procedimiento que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para inducir tolerancia inmunitaria a un antígeno en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para tratar la inflamación en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para tratar la artritis reumatoide puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para tratar la psoriasis en un sujeto puede usarse en procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar el lupus en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento. Para tratar o prevenir una alergia en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar o prevenir la enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar o prevenir el rechazo de un órgano trasplantado en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la esclerosis múltiple en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la enfermedad de Crohn en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la diabetes de tipo I en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta CTLA4-Ig descrita en la presente invención. Para tratar la ooforitis en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la glomerulonefritis en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la encefalomielitis alérgica en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención. Para tratar la miastenia grave en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en la presente invención.
En la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno inmunitario puede usarse una población de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16 y en la que la población tiene una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. En la fabricación de un agente anti-artritis reumatoide puede usarse en un envase junto con instrucciones para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide una población de polipéptidos beta o moléculas polipeptídicas beta, en la que cada polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que la población tiene una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. La población puede tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico y dímero polipeptídico beta o molécula polipeptídica beta de aproximadamente 5,5
a aproximadamente 8,5.
Terapias de combinación ilustrativas: Puede usarse un procedimiento que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de una composición de polipéptido beta descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inhibir la proliferación, activación o ambas de linfocitos T. Puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición polipeptídica beta descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto. Puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición de polipéptido beta descrita en el presente documento en combinación con metotrexato para inducir tolerancia inmunitaria a un antígeno en un sujeto.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1B presentan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1) de una parte de un casete de expresión para una molécula de CTLA4-Ig. También se muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2) codificada por el ácido nucleico. Las moléculas de CTLA4-Ig que pueden producirse a partir de este casete de expresión incluyen moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos: (i) 26 a 383 de SEC ID Nº 2, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 2, (iii) 27 a 383 de SEC ID Nº 2, (iv) 26-382 de SEC ID Nº 2, (v) 25-382 de SEC ID Nº 2 y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 2. El casete de expresión comprende las siguientes regiones: (a) una secuencia señal de oncostatina M (nucleótidos 11-88 de SEC ID Nº 1; aminoácidos 1-26 de SEC ID Nº 2); (b) un dominio extracelular de CTLA4 humano (nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº: 1; aminoácidos 27-151 de SEC ID Nº 2); (c) una parte modificada de la región constante de IgGI humana (nucleótidos 464-1159 de SEC ID Nº: 1; aminoácidos 152-383 de SEC ID Nº 2), incluyendo una región bisagra modificada (nucleótidos 464-508 de SEC ID Nº: 1; aminoácidos 152-166 de SEC ID Nº 2), un dominio CH 2 de IgG1 humana (nucleótidos 509-838 de SEC ID Nº 1; aminoácidos 167-276 de SEC ID Nº 2), y un dominio CH 3 de IgG1 humana (nucleótidos 839-1159 de SEC ID Nº 1; aminoácidos 277-383 de SEC ID Nº 2).
La Figura 2 presenta la secuencia de ácido nucleico (fila superior) y aminoácidos (fila inferior) que corresponden a CTLA4A29YL104E-Ig. La secuencia de aminoácidos contiene un cambio de aminoácidos de la secuencia mostrada en la Figura 1, en la que los cambios son en la posición 29 (A a Y) y en la posición 104 (L a E) en comparación con la de SEC ID Nº 2, en la que la numeración de los restos de aminoácidos comienza en metionina (M) marcado por “+1”. La secuencia de nucleótidos de CTLA4A29YL104E-Ig se muestra en esta figura comenzando desde la A en la posición 79 (es decir, la posición marcada por el “+1” debajo de la M) hasta la A en la posición de nucleótido 1149 (SEC ID Nº 3). En particular, la secuencia de nucleótidos que codifica CTLA4A29YL104E-Ig es desde el nucleótido en la posición 79 hasta el nucleótido en la posición 1149, designada SEC ID Nº 3. La secuencia de nucleótidos completa mostrada en la Figura 2 se designa SEC ID Nº 23 e incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de oncostatina M.
La Figura 3 presenta la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 4) de la molécula de CTLA4A29YL104E-Ig que incluye una prosecuencia de oncostatina M (véase negrita en cursiva). Los polipéptidos que pueden producirse que son moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig incluyen moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos: (i) 26-383 de SEC ID Nº 4, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 4, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 4, (iv) 26-382 de SEC ID Nº 4, (v) 25-382 de SEC ID Nº 4, y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 4.
La Figura 4 es un modelo de CTLA4A29Y104E-Ig mostrado con los sitios de glucosilación ligados a N (N76, N108 y N207), el enlace disulfuro C120-C120, y las dos sustituciones de aminoácidos realizadas en el dominio CTLA-4 (L104E y A29Y).
La Figura 5 representa la secuencia de aminoácidos derivada de ADNc teórica de un CTLA4A29YL104E-Ig (SEC ID Nº 4). Se realizaron dos sustituciones de aminoácidos en el dominio extracelular de CTLA-4 (L104E y A29Y) para generar CTLA4A29YL104E-Ig. La secuencia identifica el péptido señal (pro-secuencia) de oncostatina M junto con los sitios de glucosilación ligados a N.
La Figura 6 es una gráfica que representa la unión de muestras de CTLA4A29YL104E-Ig con anticuerpo Fc IgG de cabra anti-humano. La unión de muestras de CTLA4A29YL104E-Ig se detectó midiendo la respuesta obtenida en esta superficie, en comparación con una superficie de microplaca sensora no modificada. Los diversos lotes representan tres muestras de CTLA4A29YL104E-Ig diferentes.
La Figura 7 es una gráfica que muestra los pesos moleculares aparentes que corresponden a fracciones multiméricas, tetraméricas y diméricas de un pico de limpieza de HIC CTLA4-Ig como se determina por una superposición de SEC de dos columnas con detección de dispersión de luz dinámica (DSL) y tiempo de retención en SEC.
La Figura 8A (parte superior) y 8B (parte inferior) muestran geles de IEF representativos de fracciones de moléculas de CTLA4-Ig glucosiladas (que comprenden monómeros de SEC ID Nº 2) aisladas y purificadas de pico de limpieza de HIC. El orden de carga para gel superior es: carril 1, marcadores de pI (Amersham); carril 2, patrón de dímero de CLTA4-Ig; carril 3, eluato de proteína A; carril 4, multímero; carril 5, tetrámero; carril 6, dímero. El orden de carga para el gel inferior es: carril 1, marcador de pI (Amersham); carril 2, patrón de dímero de CLTA4-Ig; carril 3,
tetrámero; carril 4, tetrámero disociado. Los paneles muestran que el tetrámero está menos sialilado que el dímero.
La Figura 9 muestra las estructuras de carbohidratos predominantes y cantidades relativas de carbohidratos observadas en un dímero de CTLA4-Ig que comprende monómeros de SEC ID Nº 2. La numeración de los restos de aminoácidos en la figura no es coherente con la SEC ID Nº 2. Para que la numeración de restos de aminoácidos en la figura sea coherente con SEC ID Nº 2, la numeración debe aumentarse en 26, es decir, N76 es N102.
Figura 10 DEJADA EN BLANCO INTENCIONADAMENTE
La Figura 11 muestra un gel de IEF representativo (pH 4,0 a 6,5) de un dímero de CTLA4-Ig que comprende monómeros de SEC ID Nº 2. Los carriles 1 y 5 muestran un patrón de calibración, los carriles 2, 3, 4 muestran cada uno 20 ∀g/∀l de dímero de CLTA4-Ig.
La Figura 12 muestra un gel de IEF representativo (pH 4,0 a 6,5) de un dímero de CTLA4A29YL104E-Ig que comprende monómeros de SEC ID Nº 4. Los carriles 1 y 8 muestran un patrón de calibración, los carriles 2-7 muestran cada uno 10 ∀g/∀l de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig.
La Figura 13 muestra el perfil de carbohidratos ligados a N de una población de moléculas de CTLA4-Ig que comprende monómeros de SEC ID Nº 2. Los carbohidratos se recogieron de glucopéptidos y se separaron usando la técnica de oligosacáridos ligados a N EM/CL PGC. Los cromatogramas proporcionan el perfil de población para cada sitio de unión a enlace N. A) Los carbohidratos Asn76 (Asn102 de SEC ID Nº 2) del péptido T5 y B) los carbohidratos Asn108 (Asn134 de SEC ID Nº 2) del péptido T7 muestran ambos distribuciones entre especies mono y multi-sialiladas. C) Los carbohidratos Asn207 (Asn233 de SEC ID Nº 2) del péptido T14 consisten en especies predominantemente asialiladas. D) Se muestra la distribución de carbohidratos ligados a N para moléculas de CTLA4-Ig. E) Un espectro sin tratar seleccionado del péptido T5 muestra un pico principal correspondiente a la estructura monosialilada bi-antenaria representada. F) Un espectro sin tratar seleccionado del T14 muestra un pico principal correspondiente a la estructura de asialo bi-antenaria. G) Un espectro sin tratar seleccionado consiste en una especie menor que eluye conjuntamente con el pico a los 64,23 minutos, que corresponde a la estructura disialilada tri-antenaria. H) Un espectro sin tratar seleccionado revela las especies principales en el pico a los 64,23 minutos, que corresponde a la estructura di-sialilada bi-antenaria.
La Figura 14A-B muestra un rastro de UV y TIC de un perfil de oligosacáridos ligados a N de un monómero de SEC ID Nº 2 de CTLA4-Ig de cromatografía de PGC en condiciones de elución ácida (TFA al 0,05 %). El resto de la Figura 14A muestra recuento total de iones (TIC) negativo para el cromatograma de PGC en condiciones de elución ácida (TFA al 0,05%). El rastro de la Figura 14B muestra rastro de UV a 206 nm para el cromatograma de PGC en eluciones ácidas (TFA al 0,05 %).
La Figura 15A-B muestra un rastro de UV y TIC de un perfil de oligosacáridos ligados a N de un monómero de SEC ID Nº 2 de CTLA4-Ig de la cromatografía de PGC en condiciones de elución básicas (NH4OH al 0,4 %). El rastro de la Figura 15A muestra recuento total de iones negativo (TIC) para el cromatograma de PGC en condiciones de elución básicas (NH4OH al 0,4 %). El rastro de la Figura 15B muestra rastro de UV a 206 nm para el cromatograma de PGC en eluciones básicas (NH4OH al 0,4 %).
La Figura 16 representa los perfiles de carbohidratos de oligosacáridos ligados a N comparativos para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que comprenden SEC ID Nº 4. Se observan cuatro dominios de oligosacáridos: el Dominio I contiene especies no sialiladas, mientras que los Dominios II, III y IV contienen especies mono-sialiladas, disialiladas y tri-sialiladas, respectivamente. El aislamiento de los oligosacáridos cromatográficamente y su análisis por espectroscopía de masas determinó los dominios.
La Figura 17 muestra un perfil de HPAEC-PAD de oligosacáridos ligados a N de moléculas de CTLA4-Ig que comprende monómeros de SEC ID Nº 2. Los dominios se muestran en orden de contenido de ácido siálico creciente para oligosacáridos. Los Dominios I, II, III y IV contienen estructuras de oligosacáridos que tienen 0, 1, 2 y 3 ácidos siálicos respectivamente. Los marcadores de pico representan estructuras de oligosacáridos asignadas por realización de perfiles de HPAEC-PAD de picos recogidos de perfiles de PGC. La identificación estructural de la estructura de carbohidratos es coherente con determinaciones previas.
La Figura 18A-B muestra un perfil de PGC de moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros de SEC ID Nº
2. El perfil se obtiene de inyección directa de mezcla de digestión de carbohidratos preparada como se describe en el Ejemplo 3. La inyección directa da como resultado detección de la estructura P4144 que eluye a los 130 minutos. La estructura tetra-sialilada P4144 no se observa en perfiles de oligosacáridos que se aíslan antes de la inyección.
La Figura 19 representa un espectro de electropulverización positiva desconvolucionado de EM/CL para el fragmento de T9 de un monómero de SEC ID Nº 2. El espectro ilustra tres estructuras ligadas a O principales. El espectro ilustra el péptido base con escalera de azúcar coherente con la estructura ligada a O (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. La parte en negrita del espectro se ha potenciado 10 veces con respecto a la parte no negrita del espectro e ilustra dos estructuras ligadas a O adicionales con (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 y (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2.
La Figura 20 muestra los puntos de unión y poblaciones relativas de estructuras de carbohidratos ligadas a O de una cadena sencilla de CTLA4-Ig que tiene una secuencia monomérica de SEC ID Nº 2. Las cantidades relativas en cada sitio muestran datos generados por dos o más técnicas ortogonales y están sujetos a variabilidad. La localización de la cisteinilación covalente también se representa.
La Figura 21 representa un mapa del plásmido intermedio piLN-huCTLA4-Ig. Este plásmido comprende una secuencia que puede codificar una molécula de CTLA4-Ig humana (huCTLA4-Ig) (es decir, SEC ID Nº: 1) flanqueada por los sitios de enzima de restricción HindIII y XbaI.
La Figura 22 muestra un mapa del plásmido pD16LEA29Y. Este plásmido comprende una secuencia que puede codificar una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig humana (es decir, SEC ID Nº 4).
La Figura 23 es una fotografía de una transferencia de Southern de ADN extraído de células CHO que expresan el casete de expresión de CTLA4-Ig derivado de 1D5-100A1 (por ejemplo, clon 17). Los carriles para el gel de izquierda a derecha son: carril M, marcador de peso molecular de ADN; carril N, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (5 mg); carril 1, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) +1ngde pcSDhuCTLA4-Ig; carril 2, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) +0,5 ngde pcSDhuCTLA4-Ig; carril 3, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) + 0,25 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; carril 4, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) + 0,125 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; carril 5, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) + 0,0625 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; carril 6, ADN de CHO no transfectada digerido con EcoRI/XbaI (2,5 ∀g) + 0,03125 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; carril 7, ADN digerido con EcoRI/XbaI: MCB (5,0 ∀g); carril 8, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030618A-01 (5,0 ∀g); carril 9, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030712A-01 (5,0 ∀g); carril 10, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030801A-01 (5,0 ∀g) carril 11, ADN digerido con EcoRI/XbaI: MCB (2,5 ∀g); carril 12, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030618A-01 (2,5 ∀g); carril 13, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030712A-01 (2,5 ∀g); carril 14, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030801A-01 (2,5 ∀g); carril 15, ADN digerido con EcoRI/XbaI: MCB (1,25 ∀g); carril 16, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030618A-01 (1,25 ∀g); carril 17, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030712A-01 (1,25 ∀g); carril 18, ADN digerido con EcoRI/XbaI: EPCB Nº de lote C20030801A-01 (1,25 ∀g).
La Figura 24 representa un diagrama de flujo de un procedimiento de cultivo a escala de producción. Este procedimiento permite la producción en masa de proteínas recombinantes en un biorreactor de producción 25000 l.
La Figura 25 muestra un cromatograma representativo del patrón de idoneidad del sistema NGNA y NANA. El pico a ~ 9,7 minutos es NGNA, y el pico a ~ 10,7 minutos es NANA.
La Figura 26 muestra un cromatograma representativo de moléculas de CTLA4-Ig hidrolizadas que comprenden monómeros de SEC ID Nº 2. El pico a ~ 8,4 minutos es el pico de disolvente. El pico a ~ 9,6 minutos es NGNA. El pico a ~ 10,5 minutos es NANA. El pico a ~ 11,3 minutos es NANA degradada, que resulta de las condiciones de hidrólisis. Los recuentos de área de NANA y NANA degradada se combinan para cálculos de la proporción molar de NANA.
Las Figuras 27A, 27B y 27C muestran los espectros de MALDI de péptido cisteinilado de CTLA4-Ig. Los espectros de MALDI se obtuvieron para el fragmento de tripsina/quimiotripsina de CTLA4-Ig que contenía Cys146 de SEC ID Nº
2. La Figura 27A muestra el espectro de péptidos de cadena sencilla que ilustra la modificación por cisteinilación. La Figura 27B muestra el espectro del péptido monocatenario después de la reducción y demuestra que la modificación se produce en Cys146. La Figura 27C muestra alquilación del péptido de cadena sencilla reducido, que demuestra que la cisteinilación se produce en Cys146.
La Figura 28 presenta un esquema de clonación útil para generar el vector PcSD. pcDNA3 se digirió con la enzima de restricción NaeI para aislar un fragmento de 3,821 Kb que contiene el promotor de CMV, un gen de resistencia a ampicilina y un origen de replicación para E. coli. pSV2-dhfr se digirió con las enzimas de restricción PvuII y BamHI para aislar un fragmento de 1,93 Kb, que contiene el promotor de SV40 y el gen dhfr, y posteriormente sus extremos se hicieron romos. Para generar pcSD, se ligaron ambos fragmentos. El mapa del plásmido pcSD se muestra en la parte de abajo de la figura.
La Figura 29 presenta un esquema de clonación útil para generar el vector de expresión pcSDhuCTLA4-Ig. pcSD se digirió con las enzimas de restricción EcoRV y XbaI. piLN-huCTLA4-Ig se digirió con la enzima de restricción HindIII, sus extremos se hicieron romos, y después se digirió con la enzima de restricción XbaI para aislar el fragmento de huCTLA4-Ig de 1,2 kb. Para generar pcSDhuCTLA4-Ig, el fragmento de CTLA4-Ig se ligó al vector pcSD digerido. El mapa del plásmido pcSDhuCTLA4-Ig se muestra en la parte de abajo de la figura. Este plásmido se linealizó y se transfectó en células CHO que no tienen un gen dhfr funcional. Puesto que el plásmido contiene un gen dhfr funcional, pueden seleccionarse transfectantes estables basándose en la supervivencia celular. El pcSDhuCTLA4-Ig tiene el casete de expresión que comprende el promotor de CMV, una secuencia que puede codificar una molécula de CTLA4-Ig humana (huCTLA4-Ig) (es decir, SEC ID Nº 1) y una secuencia de cola de poli (A) de BGH.
La Figura 30 muestra un electroferograma de aminosacáridos adecuados para el sistema representados como unidades de fluorescencia relativa (UFR) frente al tiempo (minutos).
La Figura 31 muestra un electroferograma de monosacáridos neutros adecuados para el sistema representados como unidades de fluorescencia relativa (UFR) frente al tiempo (minutos).
La Figura 32 representa un mapa peptídico tríptico de CTLA4A29YL104E-Ig con péptidos marcados. La Tabla 23 corresponde a los péptidos marcados.
La Figura 33 muestra un análisis de hibridación de Northern del CTLA4A29YL104E-Ig. El panel A representa un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio en el que el carril M es el marcador de ARN; el carril 1 es ARN de CHO total; el carril 2 es ARN de MCB total; y el carril 3 es ARM de EPCB total. El panel B es el autorradiograma correspondiente en el que el carril M es un marcador de ARN; el carril 1 es ARN de CHO total, el carril 2 es ARN de MCB total; y el carril 3 es ARN de EPCB total.
La Figura 34A-C representa cromatogramas de exclusión por tamaño, que distinguen los dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig de especies de alto y bajo peso molecular.
La Figura 35 muestra un análisis de SDS-PAGE (reducido y no reducido) de CTLA4A29YL104E-Ig teñido con azul de Coomassie. El carril 1 está cargado con marcadores de peso molecular; los carriles 2, 7 y 12 están en blanco; los carriles 3-6 son muestras de CTLA4A29YL104E-Ig (reducida); los carriles 8-11 son muestras de CTLA4A29YL104E-Ig (no reducida).
La Figura 36 muestra un análisis de SDS-PAGE (reducido y no reducido) de CTLA4A29YL104E-Ig sometido a tinción de plata. El carril 1 está cargado con marcadores de peso molecular; los carriles 2, 7 y 12 están en blanco; los carriles 3-6 son muestras de CTLA4A29YL104E-Ig (reducida); los carriles 8-11 son muestras de CTLA4A29YL104E-Ig (no reducida).
La Figura 37 representa un mapa peptídico de CTLA4 A29YL104E-Ig no reducido usando una combinación de digestión con tripsina y quimiotripsina.
La Figura 38 representa un mapa peptídico de CTLA4A29YL104E-Ig no reducido usando una combinación de digestión con tripsina y elastasa.
La Figura 39 es un diagrama que representa pacientes con respuestas anti-CTLA4-Ig o anti-CTLA-4. La respuesta de anticuerpos a la molécula de CTLA4-Ig completa (CTLA-4 y parte de Ig) y la parte de CTLA-4 solamente se determinó usando ensayos A y B, como se representa en el Ejemplo 32.
La Figura 40 es un esquema que demuestra la distribución de eliminación y el volumen de compartimiento central por estado de inmunogenicidad.
La Figura 41 es una gráfica que demuestra perfiles de concentraciones en suero de CTLA4-Ig medias (DT) a lo largo del tiempo en monos a los que se administraron 10 mg/kg de sustancia farmacológica producida por un procedimiento de la invención.
La Figura 42 es una gráfica de un cromatograma de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de proteína A (MabSelect) purificada a partir de material de control y de CTLA4-Ig disgregado.
La Figura 43 es una gráfica de un análisis de N-glicano que compara el material procesado de disgregación (ii) con el control (i).
La Figura 44 es una gráfica que representa las concentraciones en suero de CTLA4-Ig medias [∀g/ml] frente al tiempo (durante 71 días).
La Figura 45 muestra un electroferograma de monosacáridos neutros representados como unidades de fluorescencia relativas (UFR) frente al tiempo (minutos).
La Figura 46 muestra un electroferograma de aminomonosacáridos representados como unidades de fluorescencia relativa (UFR) frente al tiempo (minutos).
La Figura 47 representa los perfiles de carbohidratos de oligosacáridos ligados a N comparativos para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que comprenden SEC ID Nº 4. Se observan cuatro dominios de oligosacáridos, en los que el dominio I contiene especies no sialiladas, mientras que los dominios II, III y IV contienen especies mono-sialiladas, di-sialiladas y tri-sialiladas, respectivamente.
La Figura 48 es una gráfica de una separación electroforética capilar de CTLA4-Ig que se mezcla 1:1 con CTLA4A29YL104E-Ig. Los tiempos de migración máximos principales están separados por aproximadamente 0,8 minutos.
La Figura 49 es un cromatograma de material de CTLA4A29YL104E-Ig hidrolizado, en el que se observa un pico de NANA a los 3,4 minutos.
La Figura 50 representa varias de las diversas estructuras de carbohidratos ligados a N halladas en proteínas de mamífero. Todas las cadenas comparten una estructura central común que contiene dos GlcNAc y tres restos de manosa.
La Figura 51 es una gráfica que representa la exposición a CTLA4-Ig (ABC) como una función de la sialilación de la glucoproteína (proporción de NANA).
La Figura 52 es una gráfica que representa la exposición a CTLA4-Ig (ABC) como una función del perfil de carbohidratos de CTLA4-Ig. Se generó un gran número de picos mediante HPLC de intercambio aniónico que se resolvieron en cuatro o cinco dominios. Los dominios 1 y 2 son principalmente estructuras asialiladas y monosialiladas, mientras que los dominios 3 y 4 son principalmente estructuras di y tri-sialiladas.
La Figura 53 representa un mapa peptídico tríptico de CTLA4A29YL104E-Ig con péptidos marcados. La Tabla 56 corresponde a los péptidos marcados.
La Figura 54 representa los perfiles de carbohidratos de oligosacáridos ligados a N comparativos para moléculas de CTLA4-Ig que comprenden SEC ID Nº 2. Se observan cuatro dominios de oligosacáridos, en los que el dominio I contiene especies no sialiladas, mientras que los dominios II, III y IV contienen especies mono-sialiladas, disialiladas y tri-sialiladas, respectivamente.
La Figura 55A-D es una gráfica que representa los perfiles de oligosacáridos de CTLA4-Ig y péptidos T5, T7 y T14 por HPAEC-PAD.
La Figura 56 es una gráfica que representa el perfil de oligosacáridos marcados de CTLA4-Ig obtenido a partir de columna de PGC (Hypercarb).
La Figura 57 representa una gráfica de datos farmacocinéticos que muestran ABC de mono en el eje Y y porcentaje de glucosilación ligada a N como se muestra en los dominios I y II a partir de un perfil de carbohidratos en el eje X. Véase procedimientos para determinar el perfil de carbohidratos ligados a N en, por ejemplo, los Ejemplos 3, 44, 22 y 37. A medida que el porcentaje de los dominios I y II aumenta (y el porcentaje de los dominios III, IV y V se reduce), aumenta la eliminación. Obsérvese que el control negativo, el CTLA4-Ig con bajo ácido siálico se elimina muy rápidamente. Obsérvese que la variante de CTLA4-Ig, LEA (CTLA4-IgA29YL104E-Ig) está incluida en esta gráfica.
Las Figuras 58 A y 58 B representan un rastro de cromatograma de carbohidratos ligados a N de los carbohidratos ligados a N liberados de CTA4-Ig (como se obtiene de procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3, 44, 22 y 37). El rastro en la Figura 58A es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo sin galactosa adicional añadida al cultivo. El rastro en la Figura 58B sí tenía galactosa añadida al cultivo. Los porcentajes de carbohidratos ligados a N en cada dominio se muestran en la tabla insertada.
La Figura 59 representa un rastro de un cromatograma de carbohidratos ligados a N de los carbohidratos ligados a N liberados de CTA4-Ig (tal como se obtienen de procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3, 44, 22 y 37). Este es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo con galactosa añadida al cultivo el día 8. Este rastro es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo sin galactosa adicional añadida al cultivo. Los porcentajes de carbohidratos ligados a N en cada dominio se muestran en la tabla insertada.
La Figura 60 representa un rastro de un cromatograma de carbohidratos ligados a N de los carbohidratos ligados a N liberados de CTA4-Ig (como se obtienen de procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3, 44, 22 y 37). Este es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo con galactosa añadida al cultivo el día 14. Este rastro es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo sin galactosa adicional añadida al cultivo. Los porcentajes de carbohidratos ligados a N en cada dominio se muestran en la tabla insertada.
Las Figuras 61A y 61B representan un rastro de un cromatograma de carbohidratos ligados a N de los carbohidratos ligados a N liberados de CTA4-Ig (como se obtiene de procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3, 44, 22 y 37). La Figura 61 A es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo sin galactosa añadida, y la Figura 61 B es de un análisis en el que se añadió galactosa al cultivo el día 14. Este rastro es de un análisis de CTLA4-Ig producido en un procedimiento de cultivo sin galactosa adicional añadida al cultivo. Los porcentajes de carbohidratos ligados a N en cada dominio se muestran en la tabla insertada.
La Figura 62 representa un rastro de cromatograma de carbohidratos ligados a N de los carbohidratos ligados a N liberados de CTA4-Ig (como se obtienen de procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3, 44, 22 y 37). Este rastro se obtuvo de material de CTLA4-Ig que se recuperó de la etapa de lavado de la columna de QFF, produciendo un corte del material de CTLA4-Ig con ácido siálico bajo. La cantidad relativa de dominio I y dominio II aumenta y los dominios III y IV se reducen, en comparación con los rastros mostrados en las Figuras 61, 60 y 59. Los porcentajes de carbohidratos ligados a N en cada dominio se muestran en la tabla insertada.
La Figura 63 muestra el mapa peptídico tríptico de CTLA4-Ig que indica que T8 se eluye al final del frente de disolvente y T9 se eluye en el hombro de T27.
La Figura 64 es una gráfica que representa el espectro de masas completo correspondiente al glucopéptido T8 de CTLA4-Ig.
5 La Figura 65 es una gráfica que representa el espectro de masas completo correspondiente al glucopéptido T9 de CTLA4-Ig.
La Figura 66 es una gráfica que representa los datos de MALDI-TOF para el fragmento del péptido T9 de CTLA4-Ig.
La Figura 67A-B representa cromatogramas de iones y espectros de masas de péptidos trípticos oxidados y nativos de CTLA4-Ig.
10 La Figura 68 representa un perfil de oligosacáridos ligados a N típico (dominios I, II, III, IV y V, y picos 1A y 1B dentro del 5% de las medias de lote). Los picos 1A, 1B y 1C representan las estructuras de oligosacáridos ligados a N asialilados de G0, G1 y G2. Los datos para el perfil están en la tabla a continuación. Véase Ejemplo 44.
Nombre del pico
RT Área % de área
1
Dominio I 19,413 47807873 31,3
2
Dominio II 29,076 50746179 33,2
3
Dominio III 42,819 36640805 24,0
4
Dominio V 67,546 3421324 2,2
5
Dominio IV 55,899 14331509 9,4
6
Pico 1A 19,413 11115168 7,3
7
Pico 1B 20,290 16331761 10,7
8
Pico 1C 21,032 13507144 8,8
9
Pico 2 21,925 4285962 2,8
10
22,685 2567838 1,7
11
29,076 2808537 1,8
12
30,763 27989176 18,3
13
31,577 19948466 13,0
14
42,819 4555254 3,0
15
Pico 3 43,823 22213064 14,5
16
46,626 9872487 6,5
17
55,899 3898179 2,5
18
Pico 4 57,368 6789516 4,4
19
60,333 3643813 2,4
20
67,546 3421324 2,2
La Figura 69 representa un gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig. Las bandas se caracterizan por:
Carril
Descripción Carga proteica (microgramos) Nº de banda Porcentaje de intensidad de banda acumulado Porcentaje de banda relativo (%)
1
Marcadores de IEF ND ND ND ND
2
Material de CTLA4-Ig 20 16 100 ND
3
Sustancia farmacológica de CTLA4-Ig 20 16 100 100
4
Control de tinción 1 ND ND ND
La Figura 70 representa un informe de análisis cuantitativo de gel de isoelectroenfoque representativo de CTLA4-Ig. 15 Se realizó la cuantificación del gel y los datos son los siguientes:
La Figura 71 A representa una inyección de 20 ∀l Típica de Patrón de Idoneidad Sistémica en Columna TOSO HAAS 3000 SWXL Equipada con una Columna de Guardia. La Figura 71 B representa una inyección de 20 ∀lde Material de Referencia de CTLA4-Ig en una Columna TOSO HAAS 3000 SWXL Equipada con una columna de Guardia.

Figura 72. Ejemplo de imagen adquirida digitalmente de Análisis de SDS-PAGE de CTLA4-Ig por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (4-20) teñida con Azul de Coomassie.
Carril
Descripción Carga proteica (microgramos) Condición no reducida (NR)/ Reducida (R) Porcentaje de intensidad de banda (%)
1
Sustancia farmacológica de CTLA4-Ig 10 NR 100
2
Material de CTLA4-Ig 10 NR 99
3
Blanco ND NR ND
4
Sustancia farmacológica de CTLA4-Ig 10 R 100
5
Material de CTLA4-Ig 10 R 100
6
Marcador de peso molecular ND ND ND
7
Producto farmacológico de CTLA4-Ig 10 NR 99
8
Material de CTLA4-Ig 10 NR 100
9
Blanco ND NR ND
10
Producto farmacológico de CTLA4-Ig 10 R 99
11
Material de CTLA4-Ig 10 R 99
12
Control de tinción de inhibidor de tripsina ND ND ND
La Figura 73 representa un ejemplo de informe de análisis cuantitativo para SDS-PAGE teñido con Azul de Coomasie.
5 La Figura 74 muestra una tabla que expone el análisis cuantitativo del gel SDS-PAGE teñido en la Figura 73.
La Figura 75 representa un ejemplo de una imagen potenciada de análisis de SDS-PAGE de gel teñido con Azul de Coomasie de CTLA4-Ig para ilustrar las posiciones migratorias de las bandas mayores y menores esperadas en relación con los marcadores de peso molecular.
La Figura 76 es una representación de un Perfil de Carbohidratos Ligados a N representativo del material de 10 referencia/patrón de CTLA4-Ig. Este es un perfil de carbohidratos representativo de ciclo en el sistema de Waters. Los tiempos de retención dependen del sistema.
La Figura 77 es una representación de un Cromatograma de Idoneidad Sistémica de Estaquiosa representativo.
La Figura 78 es un rastro de un Cromatograma Representativo de Material de CTLA4-Ig Hidrolizado.
La Figura 79 representa una imagen de gel explorada de análisis de SDS-PAGE de tinción con Azul de Coomasie 15 de Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (4-20 %) teñido con Azul de Coomasie de CTLA4A29YL104E-Ig.
Nº de Descripción Carga proteica Condición % de purezacarril ( g) R/NR (%)
1 Sustancia farmacológica de 10 NR 99
CTLA4A29YL104E-Ig
2 Material de referencia de CTLA4A29YL104E-10 NR 99 Ig
3 Blanco ND NR NA
40 (continuación)
Nº de carril
Descripción Carga proteica ( g) Condición R/NR % de pureza(%)
4
Sustancia farmacológica de CTLA4A29YL104E-Ig 10 R 100
5
Material de referencia de CTLA4A29YL104E 10 R 100
6
Marcador de peso molecular ND R ND
7
Material de referencia de CTLA4A29YL104E 10 R 99
8
Producto farmacológico de CTLA4A29YL104E-Ig 10 R 99
9
Blanco 0 NR 0
10
Material de referencia de CTLA4A29YL104E 10 NR 100
11
Producto farmacológico de CTLA4A29YL104E 10 NR 100
12
Control de tinción 0,1 NR 100
La Figura 80 representa un diagrama de flujo de las etapas de recogida, véase Ejemplo 28.
La Figura 81 representa un electroferograma de idoneidad sistémica de amino monosacáridos. Véase Ejemplo 16.
La Figura 82 representa una gráfica de datos farmacocinéticos que muestran ABC de mono en el eje Y y porcentaje de glucosilación ligada a N como se muestra en los Dominios I y II de un perfil de carbohidratos en el eje X. Véase procedimientos para determinar el perfil de carbohidratos ligados a N en, por ejemplo, los Ejemplos 2, 44, 22 y 37. A medida que aumenta el porcentaje de Dominios I y II (y se reduce el porcentaje de Dominios III, IV y V), aumenta la ABC. Obsérvese que el control negativo, el CTLA4-Ig con ácido siálico bajo se elimina muy rápidamente. Obsérvese que las moléculas de CTLA4-Ig mutantes, CTLA4A29YL104E-Ig (designada LEA) se incluyen en esta gráfica.
La Figura 83 representa una gráfica de datos farmacocinéticos que muestran ABC en el eje Y y porcentaje de glucosilación ligada a N como se muestra en los Dominios III y IV (como se determina a partir de un perfil de carbohidratos ligados a N) en el eje X. A medida que aumenta el porcentaje de Dominios III y IV, aumenta la ABC. Obsérvese que el control negativo, el CTLA4-Ig con ácido siálico bajo, se elimina muy rápidamente. Véase procedimientos para determinar el perfil de carbohidratos ligados a N en, por ejemplo, los Ejemplos 3, 44, 22 y 37. Obsérvese que las moléculas mutantes de CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig (designada LEA) se incluyen en esta gráfica.
La Figura 84 representa otra gráfica de datos farmacocinéticos que muestran ABC en el eje Y y porcentaje de glucosilación ligada a N como se muestra en los Dominios III y IV de un perfil de carbohidratos en el eje X. A medida que aumenta el porcentaje de Dominios III y IV, aumenta la ABC. Obsérvese que el control negativo, el CTLA4-Ig con ácido siálico bajo, se elimina muy rápidamente. Véase procedimientos para determinar el perfil de carbohidratos ligados a N en, por ejemplo, los Ejemplos 3, 44, 22 y 37. Obsérvese que las moléculas de CTLA4-Ig mutantes, CTLA4A29YL104E-Ig (designada LEA), se incluyen en esta gráfica.
La Figura 85 representa un Mapa tríptico de patrón de CTLA4-Ig, véase Tabla al final del Ejemplo 65 para asignaciones de picos. El pico pequeño marcado T1+A es el péptido tríptico T1 extendido por un resto de alanina N terminal. El pico pequeño marcado T31+K es el péptido tríptico T31 extendido por un resto de lisina C-terminal.
La Figura 86 representa una superposición de Datos de 380 nm para Mapa Tríptico de patrón de CTLA4-Ig Más el Mismo con Adiciones de 5 % molar de Péptido Indicador T6ox, Met(O) 85 (84-93). Véase ejemplo 65.
La Figura 87 representa una Vista expandida de Datos de 215 nm para Mapa Tríptico de patrón de CTLA4-Ig Más el Mismo con Adiciones de 5 % molar de Péptido Indicador T26deaml, isoAsp294(281-302).Véase ejemplo 65.
Descripción detallada de la invención
Pueden usarse moléculas de CTLA4-Ig para tratar una diversidad de trastornos, incluyendo trastornos relacionados con fenómenos inmunoproliferativos e inmunorreactivos aberrantes tales como autoinmunidad y alergia. Se describen en el presente documento composiciones de CTLA4-Ig que comprenden, por ejemplo, poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig que tienen modificaciones de glucosilación particulares, que tienen perfiles o características de carbohidratos particulares, que tienen estructuras multiméricas particulares y/o que tienen fuerzas de avidez particulares. Los documentos que también describen moléculas de CTLA4-Ig, usos y procedimientos de las mismas, incluyen las Patentes de Estados Unidos Nº 5.434.131; 5.851.795; 5.885.796; 5.885.579 y 7.094.874.
También se describen en el presente documento líneas celulares que son capaces de producir grandes cantidades de moléculas de CTLA4-Ig mediante los procedimientos de producción en masa y cultivo proporcionados en el presente documento. Una línea celular particular descrita en el presente documento es una línea celular clonal que puede usarse para producir en masa moléculas de CTLA4-Ig de modo que tengan un perfil de glucosilación y
carbohidratos particular. En comparación con la población celular heterogénea y no clonal que tiene el Nº de Referencia ATCC 68629 (véase Patente de Estados Unidos Nº 5.434.131), las líneas celulares descritas en el presente documento pueden secretar una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un perfil de glucosilación
o carbohidratos más coherente o más uniforme. Además, en comparación con la población celular heterogénea y no clonal que tiene el Nº de Referencia de ATCC 68629, las líneas celulares clonales descritas en el presente documento pueden secretar una cantidad mayor de moléculas de CTLA4-Ig, en parte porque las presentes líneas celulares clonales se seleccionan para tener número de copias alto de casetes de expresión de CTLA4-Ig integrados en un único sitio en el genoma de la célula.
La avidez y potencia de CTLA4-Ig (SEC ID Nº 2) puede aumentarse realizando dos sustituciones de aminoácidos en la región de unión B7 del dominio de unión de CTLA4-Ig: (i) alanina en la posición 29 de SEC ID Nº 2 se sustituye por tirosina (A29Y), y (ii) lisina en la posición 104 de SEC ID Nº 2 se sustituye por glutamato (L104E). En el presente documento se describe un subgénero de moléculas de CTLA4-Ig, denominado “moléculas polipeptídicas beta”, que comprende polipéptidos beta que tienen actividad de unión de B7 y pueden comprender la secuencia de aminoácidos en SEC ID Nº 24 (dominio extracelular de CTLA4-Ig con mutaciones A29Y y L104E), ligada a una región constante de inmunoglobulina, o parte de la misma.
[SEC ID Nº 24]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMG
NELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQI
YVIDPEPCPDSD
[SEC ID Nº 18] -Un dominio extracelular de CTLA4
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMG
NELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQI
YVIDPEPCPDSD
Términos
Como se usa en el presente documento “clonal” se refiere a una población celular que se expande a partir de una única célula. Con respecto a una línea celular clonal o población celular clonal capaz de expresar una molécula de CTLA4-Ig, la línea o población celular clonal se expande a partir de una única célula que se aisló a partir de una población de células que se transfectaron con un vector de expresión que codificaba la molécula de CTLA4-Ig. La población transfectada de células puede ser una población heterogénea. Puede considerarse que una línea o población celular clonal es homogénea en el sentido de que todas las células en la población vienen de un único transfectante.
Como se usa en el presente documento, el término “B7-1” se refiere a CD80; el término “B7-2” se refiere a CD86; y el término “B7” se refiere a uno o ambos de B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86). El término “B7-1-Ig” o “B7-1Ig” se refiere a CD80-Ig; el término “B7-2-Ig” o “B7-2Ig” se refiere a CD86-Ig.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “CTLA4-Ig”, “molécula de CTLA4-Ig”, “molécula de CTLA4Ig”, “proteína de CTLA4-Ig” o “proteína de CTLA4Ig” se usan de forma intercambiable, y se refieren a una molécula proteica que comprende al menos un polipéptido de CTLA4 que tiene un dominio extracelular de CTLA4-Ig y una región constante de inmunoglobulina o parte de la misma. En algunas realizaciones, por ejemplo, un polipéptido de CTLA4-Ig que comprende al menos la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 18. En ciertas realizaciones, el domino extracelular de CTLA4 y la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma pueden ser naturales, o mutantes o modificados. Un polipéptido de CTLA4Ig mutante es un polipéptido de CTLA4-Ig que comprende un dominio extracelular de CTLA4 mutante. Una molécula de CTLA4Ig mutante comprende al menos un polipéptido de CTLA4-Ig mutante. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de CTLA4 y la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser de mamífero, incluyendo ser humano o ratón. En lagunas realizaciones, un domino extracelular de CTLA4 mutante puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al dominio extracelular de CTLA4 mostrado en la Figura 1 o SEC ID Nº 18. En lagunas realizaciones, una región constante de inmunoglobulina mutante o parte de la misma puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la región constante de inmunoglobulina (g) como se muestra en la Figura
1. El polipéptido puede comprender además dominios proteicos adicionales. Una molécula de CTLA4-Ig puede referirse a un monómero del polipéptido de CTLA4-Ig y también puede referirse a formas multiméricas del polipéptido, tales como dímeros, tetrámeros y hexámeros, etc. (u otras especies de alto peso molecular). Las moléculas de CTLA4-Ig también son capaces de unirse a CD80 y/o CD86. Las moléculas de CTLA4-Ig incluyen moléculas de CTLA4Ig mutantes, tales como “moléculas polipeptídicas beta”, por ejemplo, CTLA4 A29YL104E-Ig. Por ejemplo, CTLA4-Ig comprende moléculas de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig comprende moléculas polipeptídicas beta
(un ejemplo de moléculas de CTLA4-Ig mutantes).
Como se usa en el presente documento, la expresión “dominio extracelular de CTLA4” se refiere a un dominio proteico que comprende toda o una parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 18, que se une a B7-1 (CD80) y/o B7-2 (CD86). En algunas realizaciones, un dominio extracelular de CTLA4 puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 idéntica a los aminoácidos 27-150 de SEC ID Nº 2, que son iguales que los aminoácidos mostrados en SEC ID Nº 18. El aminoácido 151 de SEC ID Nº 2 es un aminoácido de unión.
Como se usa en el presente documento, la expresión “polipéptido beta” se refiere a un polipéptido de CTLA4-Ig mutante que (1) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 18 en la que el aminoácido de la posición 29 se muta a tirosina y el aminoácido en la posición 104 se muta a glutamato, opcionalmente con diversas mutaciones adicionales, y una región constante de inmunoglobulina, o una parte de la misma; y (2) es capaz de unirse a CD80 y/o CD86. En algunas realizaciones, por ejemplo, un polipéptido beta comprende al menos la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4A29YL104E-Ig (como se muestra en SEC ID Nº 24). Los ejemplos no limitantes de poilpéptidos beta incluyen belatacept y SEC ID Nº 4 y 11-16. En ciertas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser natural, mutante o modificada. En ciertas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser de mamífero, incluyendo ser humano o ratón. Los ejemplos no limitantes adicionales de polipéptidos beta incluyen un polipéptido beta que comprende una o más mutaciones de aminoácidos en la región constante de inmunoglobulina o parte de la misma (por ejemplo, sustitución de cisteína 120 de SEC ID Nº 4) y un polipéptido beta que comprende mutaciones adicionales en una o más de las posiciones de aminoácido 25, 30, 93, 96, 103 o 105 de SEC ID Nº 18. Una molécula polipeptídica beta comprende un polipéptido beta. Una molécula polipeptídica beta puede referirse a un monómero del polipéptido beta y formas multiméricas del polipéptido beta, tales como dímeros, tetrámeros y hexámeros, etc. Por ejemplo, belatacept comprende moléculas polipeptídicas beta. Se describen moléculas polipeptídicas beta adicionalmente en la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/849.543 presentada el 5 de octubre de 2006.
Como se usa en el presente documento, los términos “glutamato” y “ácido glutámico” se usan de forma intercambiable.
Como se usa en el presente documento, el término “dímero” se refiere a una proteína de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig compuesta de dos polipéptidos o monómeros de CTLA4-Ig unidos o ligados entre sí. El enlace entre monómeros de un dímero puede ser un enlace o interacción no covalente, un enlace o interacción covalente o ambos. Se muestra un ejemplo de un dímero de CTLA4-Ig en la Figura 4. Una proteína de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig compuesta de dos monómeros idénticos es un homodímero. Un homodímero de CTLA4-Ig también abarca una molécula que comprende dos monómeros que pueden diferir ligeramente en la secuencia. Un homodímero abarca un dímero en el que los monómeros unidos entre sí tienen sustancialmente la misma secuencia. Los monómeros que comprenden un homodímero comparten homología estructural considerable. Por ejemplo, las diferencias en secuencia pueden deberse a modificaciones de procesamiento N-terminal del monómero.
Como se usa en el presente documento, “mutación conservativa” se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico que sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo sustitución de un aminoácido no polar por otro, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina; o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina).
Como se usa en el presente documento, “mutación no conservativa” se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico que sustituye un aminoácido por otro de una clase diferente (por ejemplo sustitución de un aminoácido básico, tal como lisina, arginina o histidina, con un aminoácido ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico). Por ejemplo, un aminoácido puede ser bioquímicamente diferente de otro aminoácido basándose en el tamaño, carga, polaridad, reactividad u otras características tales de los aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, “aislado” se refiere a una molécula que se saca de su ambiente nativo y está en un ambiente diferente de aquel en el que la molécula aparece de forma natural, o una sustancia (por ejemplo una proteína) que se recupera o separa parcial o completamente de otros componentes de su ambiente de modo que la sustancia (por ejemplo, proteína) sea la especie predominante (por ejemplo, especie proteica) presente en la composición, mezcla o colección de componentes resultante (por ejemplo en concentración molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). Por ejemplo, una preparación puede consistir en más de aproximadamente 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95%, de CTLA4-Ig aislado. “Aislado” no excluye mezclas de moléculas de CTLA4-Ig con otras moléculas de CTLA4-Ig del ambiente en el que aparece de forma natural la molécula. “Aislado” no excluye excipientes farmacéuticamente aceptables combinados con CTLA4-Ig, en los que se ha recuperado CTLA4-Ig de su ambiente, tal como un cultivo celular, un cultivo discontinuo, o un biorreactor. Como se usa en el presente documento “aislar” se refiere a llevar a cabo un proceso o procedimiento para obtener una molécula aislada de CTLA4-Ig.
Como se usa en el presente documento, la expresión “CTLA4 soluble” significa una molécula que puede circular in vivo o CTLA4 que no está unido a una membrana celular, por ejemplo, el CTLA4 soluble puede incluir CTLA4-Ig que incluye la región extracelular CTLA4, ligada a una Ig.
Como se usa en el presente documento, la expresión “fracción soluble de un cultivo celular” se refiere a la parte líquida de un cultivo celular distinta de, o que está sustancialmente sin, componentes en partículas o sólidos insolubles del cultivo celular, tales como células, membranas celulares y núcleos. La fracción soluble puede ser, por ejemplo, el sobrenadante resultante después de centrifugación del cultivo celular, o el filtrado resultante después de filtración del cultivo celular.
Como se usa en el presente documento, la expresión “casete de expresión” se refiere a un ácido nucleico que tiene al menos una región reguladora 5’ (por ejemplo, promotor) ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, y opcionalmente una región de terminación 3’ no traducida (por ejemplo, codón de parada y secuencia de poliadenilación). En condiciones apropiadas, un polipéptido codificado por un casete de expresión se produce por el casete de expresión. Un casete de expresión también puede tener una o más secuencias de nucleótidos que se dirigen a la integración del casete de expresión en un sitio específico en el genoma de una célula huésped (por ejemplo, véase Koduri y col., (2001) Gene 280: 87-95). Por ejemplo, un casete de expresión de polipéptido CTLA4A29YL104E-Ig derivado de un plásmido depositado con el Nº de Referencia de ATCC PTA-2104, es un ejemplo de un casete de expresión que codifica un CTLA4A29YL104E-Ig.
Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente purificado” se refiere a una composición que comprende una molécula de CTLA4-Ig o una población seleccionada de moléculas de CTLA4-Ig que está separada de su ambiente natural (por ejemplo, está aislada) y está al menos 90 % sin, 91 % sin, 92 % sin, 93 % sin, 94 % sin, 95 % sin, 96 % sin, 97 % sin, 98 % sin, 99 % sin, 99,5 % sin o 99,9 % sin otros componentes, tales como material celular o medio de cultivo, con los que está asociado de forma natural. Por ejemplo, con respecto a una molécula proteica de CTLA4-Ig producida de forma recombinante, la expresión “sustancialmente purificada” también puede referirse a una composición que comprende una molécula proteica de CTLA4-Ig que está separada de su ambiente de producción de modo que la molécula proteica esté al menos 90 % sin, 91 % sin, 92 % sin, 93 % sin, 94 % sin, 95 % sin, 96 % sin, 97 % sin, 98 % sin, 99 % sin, 99,5 % sin o 99,9 % sin moléculas proteicas que no son polipéptidos de SEC ID Nº 2 o polipéptidos mutantes de SEC ID Nº 2 que son de interés. “Sustancialmente purificado” no excluye mezclas de moléculas de CTLA4-Ig (tales como dímeros) con otras moléculas de CTLA4-Ig (tales como tetrámeros). “Sustancialmente purificado” no excluye excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables combinados con moléculas de CTLA4-Ig en las que las moléculas de CTLA4-Ig se han sacado de su ambiente nativo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “procedimiento a gran escala” se usa de forma intercambiable con la expresión “procedimiento a escala industrial”. La expresión “recipiente de cultivo” se usa de forma intercambiable con “biorreactor”, “reactor” y “tanque”.
Un “cultivo líquido” se refiere a células (por ejemplo, células bacterianas, vegetales, de insectos, de levaduras o animales) cultivadas en soportes, o cultivadas suspendidas en un medio nutriente líquido.
Un “cultivo de siembra” se refiere a un cultivo celular que se ha dejado crecer para usarlo para inocular volúmenes mayores de medio de cultivo. El cultivo de siembra puede usarse para inocular volúmenes mayores de medios para expandir el número de células que crecen en el cultivo (por ejemplo, células cultivadas en suspensión).
Como se usa en el presente documento, “cultivar” se refiere a dejar crecer una o más células in vitro en condiciones definidas o controladas. Los ejemplos de condiciones de cultivo que pueden definirse incluyen temperatura, mezcla de gases, tiempo y formulación del medio.
Como se usa en el presente documento, “expandir” se refiere a cultivar una o más células in vitro para el fin de obtener un mayor número de células en el cultivo.
Como se usa en el presente documento, “población” se refiere a un grupo de dos o más moléculas (“población de moléculas”) o células (“población de células”) que se caracterizan por la presencia o ausencia de una o más propiedades medibles o detectables. En una población homogénea, las moléculas o células en la población se caracterizan por las mismas o sustancialmente las mismas propiedades (por ejemplo, las células de una línea celular clonal). En una población heterogénea, las moléculas o células en la población se caracterizan por al menos una propiedad que es la misma o sustancialmente la misma, en la que las células o moléculas también pueden mostrar propiedades que no son las mismas (por ejemplo, una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un contenido siálico medio sustancialmente similar, pero que tienen contenido de manosa no similar).
Como se usa en el presente documento, “agregado de alto peso molecular” se usa de forma intercambiable con “especie de alto peso molecular” para referirse a una molécula de CTLA4-Ig que comprende al menos tres monómeros de CTLA4-Ig. Por ejemplo, un agregado de alto peso molecular puede ser un tetrámero, un pentámero o un hexámero.
“Porcentaje de producción (%)” se refiere a la producción real dividida por la producción teórica, y ese valor multiplicado por 100. La producción real puede proporcionarse como el peso en gramos o en moles (por ejemplo, una producción molar). La producción teórica puede proporcionarse como la producción ideal o calculada matemáticamente.
Como se usa en el presente documento, una “cantidad de MCP-1” se refiere a (1) una cantidad de MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocito-1, especialmente, MCP-1 de hámster) solamente, o (2) una cantidad de proteína de “tipo MCP-1”, en la que la proteína de “tipo MCP-1” incluye MCP-1, junto con proteínas homólogas de MCP-1, fragmentos de MCP-1 y/o fragmentos de proteínas homólogas de MCP-1 (por ejemplo, en cada uno de los casos anteriormente mencionados, que pueden reaccionar de forma cruzada con un ensayo de anticuerpos (por ejemplo, ELISA policlonal) para la detección de MCP-1). La ausencia de MCP-1 (y/o proteínas homólogas de MCP-1, fragmentos de MCP-1 y/o fragmentos de proteínas homólogas de MCP-1) se contempla cuando no se proporcione límite inferior con respecto a una serie de cantidades de MCP-1.
Como se usa en el presente documento, “contenido de glucosilación” se refiere a una cantidad de restos de azúcares ligados a N o ligados a O unidos covalentemente con una molécula proteica, tal como una glucoproteína como una molécula de CTLA4-Ig.
Como se usa en el presente documento, la expresión “proporción molar de ácidos siálicos y proteína” se calcula y se proporciona como número de moles de moléculas de ácido siálico por moles de proteína (moléculas de CTLA4-Ig) o dímero.
Como se usa en el presente documento, el término “glucoproteína” se refiere a una proteína que se modifica mediante la adición de uno o más carbohidratos, incluyendo la adición de uno o más restos de azúcar.
Como se usa en el presente documento, el término “sialilación” se refiere a la adición de un resto de ácido siálico a una proteína, incluyendo una glucoproteína.
Como se usa en el presente documento, la expresión “isoforma de glucoproteína” se refiere a una molécula caracterizada por su contenido de carbohidratos y ácido siálico como se determina por electroforesis en gel de isoelectroenfoque (IEF) u otros procedimientos adecuados para distinguir diferentes proteínas en una mezcla por su peso molecular, carga y/u otras características. Por ejemplo, cada banda distinta observada en un gel de IEF representa moléculas que tienen un punto isoeléctrico particular (pI) y por lo tanto la misma carga global neta. Una isoforma de glucoproteína puede ser una banda definida observada en un gel de IEF en el que cada banda puede ser una población de moléculas que tenga un pI particular.
“Tolerancia inmunitaria” se refiere a un estado de insensibilidad a un antígeno o grupo de antígenos específico al que una persona normalmente es sensible (por ejemplo, un estado en el que un linfocito T no puede ya responder a antígeno).
“Potencia” se refiere a una medida de la respuesta en función de la concentración de ligando. Por ejemplo, la potencia agonista se cuantifica como la concentración de ligando que produce la mitad del efecto máximo (CE50). Una definición farmacológica no limitante de la potencia incluye componentes de afinidad y eficacia, en los que la eficacia es la capacidad de un fármaco para inducir una respuesta una vez unido. La potencia se relaciona con la afinidad, pero la potencia y la afinidad son medidas diferentes de la acción farmacológica.
Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo para un agente farmacológicamente activo. El vehículo facilita el suministro del agente activo al sitio diana sin terminar la función del agente. Los ejemplos no limitantes de formas adecuadas del vehículo incluyen soluciones, cremas, geles, emulsiones en gel, gelatinas, pastas, lociones, pomadas, pulverizaciones, ungüentos, polvos, mezclas sólidas, aerosoles, emulsiones (por ejemplo, agua en aceite o aceite en agua), soluciones acuosas en gel, soluciones acuosas, suspensiones, linimentos, tinturas y parches adecuados para administración tópica.
Como se usa en el presente documento, la frase “composición farmacéuticamente aceptable” (o “composición farmacéutica”) se refiere a una composición que es aceptable para administración farmacéutica, tal como a un ser humano. Dicha composición puede incluir sustancias que son impurezas a un nivel que no excede un nivel aceptable para la administración farmacéutica (incluyendo dicho nivel una ausencia de dichas impurezas), y puede incluir excipientes, vehículos, transportadores farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes inactivos, por ejemplo, para formular dicha composición para facilitar la administración, además de cualquier agente o agentes activos. Por ejemplo, una composición de CTLA4-Ig farmacéuticamente aceptable puede incluir MCP-1 o ADN, siempre que esas sustancias estén a un nivel aceptable para administración a seres humanos.
“Sustancia farmacológica” es el principio activo farmacéutico contenido en una composición farmacéutica. La expresión “sustancia farmacológica” incluye un principio activo farmacéutico en solución y/o en forma tamponada. ”Producto farmacológico” es una composición farmacéutica que contiene sustancia farmacológica formulada para administración farmacéutica. Para fines de los ensayos contenidos en los ejemplos y en otra parte en el presente documento, que pueden referirse a sustancia farmacológica y/o producto farmacológico, las sustancias farmacológicas y productos farmacológicos ejemplares que pueden ensayarse son los siguientes.
La sustancia farmacológica ejemplar para moléculas de CTLA4-Ig que comprenden SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 18 es proteína de CLTA4-Ig a una concentración de 50 mg/ml, en una solución acuosa tamponada (fosfato sódico 25 mM, cloruro sódico 50 mM, pH de 7,5).
El producto farmacológico ejemplar para moléculas de CTLA4-Ig que comprende SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 18 es 250 mg de proteína de CTLA4-Ig liofilizada, 500 mg de maltosa, 17,2 mg de fosfato sódico monobásico y 14,6 mg de cloruro sódico, pH 7,0-8,0; o
Composición de producto farmacológico de proteína de CTLA4-Ig liofilizado (250 mg/vial)
Componente
Cantidad (mg/vial)a
Proteína de CTLA4-Ig
262,5
Monohidrato de maltosa
525
Fosfato sódico monobásico, monohidratob
18,1
Cloruro sódicob
15,3
Ácido clorhídrico
Ajustar a pH 7,5
Hidróxido sódico
Ajustar a pH 7,5
La sustancia farmacológica ejemplar para moléculas de CTLA4-Ig que comprende SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 24 es proteína de CTLA4-Ig a una concentración de 25 mg/ml, en una solución acuosa tamponada (fosfato sódico 25 mM, cloruro sódico 10 mM, pH de 7,5). El producto farmacológico ejemplar para moléculas de CTLA4-Ig que comprende SEC ID Nº: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o24:
Composición de producto farmacológico liofilizado de CLTA4A29YL104E-Ig 100mg/vial
Componente
Cantidad/vial (mg)
CLTA4A29YL104E-Ig
110
Sacarosa
220
Fosfato sódico monobásico monohidrato
15,18
Cloruro sódico
2,55
Hidróxido sódico 1N
Ajustar a pH 7,5
Ácido clorhídrico 1N
Ajustar a pH 7,5
Como se usa en el presente documento, las expresiones “medio de cultivo”, “medio de cultivo celular”, “medio de alimentación” y “medio de fermentación” se refieren a soluciones de nutrientes usadas para cultivar y/o mantener células, especialmente células de mamífero. Sin limitación, estas soluciones proporcionan de forma ordinaria al menos un componente de una o más de las siguientes categorías: (1) una fuente de energía, habitualmente en forma de un carbohidrato tal como glucosa; (2) todos los aminoácidos esenciales, y habitualmente el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína; (3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a concentraciones bajas; (4) ácidos grasos libres o lípidos, por ejemplo, ácido linoleico; y (5) oligoelementos, en los que los oligoelementos se definen como compuestos inorgánicos o elementos de origen natural que típicamente se requieren a concentraciones muy bajas, habitualmente en el intervalo micromolar. La solución de nutrientes puede complementarse selectivamente con uno o más componentes de cualquiera de las siguientes categorías: (1) hormonas u otros factores de crecimiento tales como suero, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico;
(2) sales, por ejemplo, magnesio, calcio y fosfato; (3) tampones, tales como HEPES; (4) nucleósidos y bases tales como adenosina, timidina e hipoxantina; (5) hidrolizados proteicos y tisulares, por ejemplo, peptona o mezclas de peptona que pueden obtenerse de gelatina purificada, material vegetal o productos secundarios animales; (6) antibióticos, tales como gentamicina; (7) agentes protectores celulares, por ejemplo poliol de Pluronic; y (8) galactosa.
El término “inoculación” como se usa en el presente documento se refiere a la adición de células a medio de cultivo para comenzar el cultivo.
La expresión “fase de crecimiento” del cultivo celular como se usa en el presente documento se refiere al período de crecimiento celular exponencial (por ejemplo, la fase logarítmica) en el que las células se dividen principalmente de forma rápida. Durante esta fase, la tasa de aumento de la densidad de células viables es mayor que en cualquier otro punto temporal.
Como se usa en el presente documento, la expresión “fase de producción” del cultivo celular se refiere al período de tiempo durante el que el crecimiento celular es estacionario o se mantiene a un nivel casi constante. La densidad de células viables permanece aproximadamente constante durante un periodo de tiempo dado. El crecimiento celular logarítmico ha terminado y la producción proteica es la principal actividad durante la fase de producción. El medio en
este momento se complementa generalmente para apoyar la producción proteica continua y para conseguir el producto glucoproteico deseado.
Como se usa en el presente documento, los términos “expresión” o “expresa” se usan para referirse a transcripción y traducción que se producen dentro de una célula. El nivel de expresión de un gen de producto en una célula huésped puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula o en la cantidad de la proteína codificada por el gen de producto que se produce por la célula, o ambos.
Como se usa en el presente documento, “glucosilación” se refiere a la adición de estructuras oligosacáridas complejas a una proteína en sitios específicos dentro de la cadena polipeptídica. La glucosilación de proteínas y el procesamiento posterior de los carbohidratos añadidos pueden afectar al plegamiento y estructura proteica, estabilidad proteica, incluyendo semivida de la proteína, y propiedades funcionales de una proteína. La glucosilación proteica puede dividirse en dos clases según el contexto de secuencia en el que se produzca la modificación, glucosilación ligada a O y glucosilación ligada a N. Los polisacáridos ligados a O están ligados a un grupo hidroxilo, habitualmente al grupo hidroxilo de un resto de serina o uno de treonina. No se añaden glicanos O a cada resto de serina y treonina. Los oligosacáridos ligados a O son habitualmente mono o biantenarios, es decir, comprenden una
o como máximo dos ramas (antenas) y comprenden de uno a cuatro tipos diferentes de restos de azúcares, que se añaden uno por uno. Los polisacáridos ligados a N están unidos al nitrógeno de amida de una asparagina. Solamente las asparaginas que son parte de una de dos secuencias tripeptídicas, bien asparagina-X-serina o bien asparagina-X-treonina (en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina), son dianas de glucosilación. Los oligosacáridos ligados a N pueden tener de una a cuatro ramas denominadas mono-, bi-, tri-o tetraantenarias. Las estructuras de restos de azúcares hallados en oligosacáridos ligados a N y O son diferentes. A pesar de esa diferencia, el resto terminal en cada rama de polisacáridos ligados tanto a N como a O pueden modificarse por una molécula de ácido siálico, una modificación denominada recubrimiento de ácidos siálicos. El ácido siálico es un nombre común para una familia de monosacáridos de nueve carbonos únicos, que pueden ligarse a otros oligosacáridos. Dos miembros de la familia son ácido N-acetil neuramínico, abreviado como Neu5Ac o NANA, y ácido N-glucolil neuramínico, abreviado como Neu5Gc o NGNA. La forma más común de ácido siálico en seres humanos es NANA. El ácido N-acetil neuramínico (NANA) es la principal especie de ácido siálico presente en moléculas de CTLA4-Ig. Sin embargo, debería observarse que también están presentes niveles menores pero detectables de ácido N glucolil-neuramínico (NGNA) en moléculas de CTLA4-Ig. Además, el procedimiento descrito en el presente documento puede usarse para determinar el número de moles de ácido siálico tanto para NANA como para NGNA, y por lo tanto los niveles tanto de NANA como de NGNA se determinan y se indican para moléculas de CTLA4-Ig. Los oligosacáridos ligados a N y a O tienen diferente número de ramas, que proporcionan diferente número de posiciones a las que pueden unirse moléculas de ácido siálico. Los oligosacáridos ligados a N pueden proporcionar hasta cuatro posiciones de unión para ácidos siálicos, mientras que los oligosacáridos ligados a O pueden proporcionar dos sitios para unión a ácido siálico.
Como se usa en el presente documento, la expresión “procedimiento a gran escala” puede usarse de forma intercambiable con la expresión “procedimiento a escala industrial”. Además, la expresión “recipiente de cultivo” puede usarse de forma intercambiable con “biorreactor”, “reactor” y “tanque”.
Como se usa en el presente documento, la frase “solución o soluciones de trabajo” se refiere a soluciones que se usan en un procedimiento. Los ejemplos no limitantes de soluciones de trabajo incluyen tampones.
Como se usa en el presente documento, “material de referencia” se refiere a un material que se usa como un patrón en un procedimiento. Por ejemplo, un material de referencia puede usarse como un patrón con el que se compararán las muestras experimentales.
La ausencia de una sustancia se contempla cuando no se proporciona límite inferior con respecto a un intervalo de cantidades de dicha sustancia.
Como se usa en el presente documento, las temperaturas enumeradas en referencia al cultivo celular se refieren al ajuste de temperatura en el instrumento que regula la temperatura del biorreactor. Por supuesto, la temperatura del cultivo líquido en sí mismo adoptará la temperatura establecida en el instrumento que regula la temperatura para el biorreactor. Cuando la temperatura se refiere a un cultivo celular que se mantiene en un estante en un incubador, la temperatura entonces se refiere a la temperatura del estante del incubador.
Se describen en el presente documento composiciones de moléculas de CTLA4-Ig y composiciones de moléculas de CTLA4-Ig mutantes, tales como CTLA4A29YL104E-Ig; y composiciones con ciertas características, tales como ciertas cantidades de endotoxina bacteriana, carga biológica, un pI dentro de un cierto intervalo (o ciertas bandas de IEF dentro de un pI de un cierto intervalo), una cierta cantidad de monómero (cadena sencilla), dímero o especie de alto peso molecular (tal como tetrámero), un cierto perfil peptídico tríptico, un cierto conjunto de bandas principales en SDS-PAGE, un cierto contenido de ADN, una cantidad de MCP-1 que no excede de un cierto máximo, una cantidad de proteína celular que no excede un cierto máximo, una cantidad de Triton X-100 que no excede de un cierto máximo, una cantidad de proteína A que no excede de un cierto máximo, un cierto perfil de carbohidratos ligados a N, una cierta composición de amino monosacáridos (GlcNac, GalNAc), una cierta composición de monosacáridos neutros (galactosa, fucosa, manosa), una cierta cantidad de unión a B7, una cierta cantidad de actividad en un
ensayo celular de inhibición de IL-2 y/o una cierta composición de ácido siálico (NANA, NGNA), en cada caso cuando dichas ciertas cantidades puedan ser un intervalo o intervalos. Las composiciones pueden tener una cualquiera de las características anteriormente mencionadas o más de una de las características anteriormente mencionadas, hasta, e incluyendo, todas las características anteriormente mencionadas en todas y cada una de las posibles permutaciones o combinaciones. Las composiciones descritas en el presente documento pueden estar presentes en forma aislada o sustancialmente purificada, o no en forma aislada o sustancialmente purificada. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas.
La invención se refiere a un procedimiento para obtener una composición que comprende una población aislada de moléculas de CTLA4-Ig de un medio de cultivo líquido, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTLA4-Ig, en la que (1) las moléculas de CTLA4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido siálico, (2) el número de restos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varía dentro de la población inicial y (3) la población inicial comprende dímero de CTLA4-Ig y agregado de alto peso molecular, y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP-1, comprendiendo el procedimiento (a) recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresan moléculas de CTLA4-Ig; (b) separar las moléculas de CTLA4-Ig de componentes celulares;
(c) usar cromatogradía en columna para reducir en contenido de MCP-1 en la composición; (d) usar cromatografía en columna para separar dímeros de CTLA4-Ig de agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig; y (e) usar cromatogradía en columna para separar las moléculas de CTLA4-Ig en dos o más fracciones, en las que al menos una fracción tiene una proporción molar mayor de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig en comparación con al menos otra fracción, y en el que las etapas (b), (c), (d) y (e) se llevan a cabo simultáneamente o en cualquier orden, para obtener dicha composición.
En una realización del procedimiento de la invención, la recogida en la etapa (a) puede comprender obtener una fracción soluble del cultivo líquido.
En algunas realizaciones del procedimiento de la invención, las moléculas de CTLA4-Ig comprenden uno o más polipéptidos que tienen la SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otras realizaciones las moléculas de CTLA4-Ig comprenden uno más polipéptidos que tienen la SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.
En algunas realizaciones del procedimiento de la invención, la fracción en (e) que tiene la mayor proporción molar de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig muestra una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 14. En realizaciones específicas, la proporción molar media es de aproximadamente 8 a aproximadamente 11, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 9.
Las moléculas de CTLA4-Ig pueden aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que producen una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig, (iii) someter la composición de la etapa (ii) a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida que comprenda moléculas de CTLA4-Ig; (iv) someter la composición de (iii) a cromatografía de afinidad para obtener una composición más enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (v) someter la composición de (iv) a cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, la composición obtenida en la etapa (ii) puede caracterizarse por: (a) una media de 6,0-10,1 moles de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; y (b) menos de o igual a 25,7 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En otra realización, la composición obtenida en la etapa (iii) puede caracterizarse por: (a) una media de 6,8-11,4 moles de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; y (b) menos de o igual a 2,5 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización adicional, la composición obtenida en la etapa (iv) se caracteriza por: (a) una media de 8,0-11,0 moles de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; y (b) menos de o igual a 2,5 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig. En otra realización, la composición obtenida en la etapa (v) se caracteriza por: (a) una media de 8,0-11,9 moles de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; y (b) menos de o igual a 2,0 por ciento de área que es de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica (SPD). En una realización, un ejemplo de SPD puede ser a A 280 nm.
Una composición de moléculas de CTLA4-Ig puede aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que producen moléculas de CTLA4-Ig y, en cualquier orden, (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iii) someter la fracción soluble a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iv) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (v) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que produce moléculas de CTLA4-Ig, (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición
eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iii) someter el producto proteico de la etapa (ii) a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iv) someter el producto proteico de (iii) a cromatografía de afinidad para obtener una composición más enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (v) someter el producto proteico de (iv) a cromatografía de intercambio aniónico, para aislar una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig.
En una realización, la composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig obtenidas en la etapa (ii) del procedimiento se caracteriza por: (a) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de 6,0 a 10,1, y (b) menos de o igual a 2,5 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En otra realización, la composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig obtenida en la etapa (iii) del procedimiento se caracteriza porque (a) la especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig es menos de aproximadamente 2,5 % de área como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica, (b) la proteína celular es de menos de aproximadamente 95 ng/ml y (c) MCP-1 es menos de aproximadamente 5 ppm. En una realización adicional, la composición que comprende las moléculas de CTLA4-Ig obtenidas en la etapa (iii) del procedimiento se caracteriza por: (a) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de 6,8 a 11,4, y (b) menos de o igual a 2,5 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización adicional, la composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig obtenidas en la etapa (iv) del procedimiento se caracteriza por: (a) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de 8,0 a 11,0 y (b) menos de o igual a 2,5 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En otra realización adicional, la composición obtenida en la etapa (iii) del procedimiento se caracteriza porque la especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig es menos de 2,5 % por ciento de área como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En otra realización más, la composición proteica que comprende moléculas de CTLA4-Ig en la etapa (v) del procedimiento se caracteriza por:
(a) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de 8,0 a 11,9 y (b) menos de o igual a 2,0 por ciento de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
Una composición de moléculas de CTLA4-Ig puede aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que producen moléculas de CTLA4-Ig y, en cualquier orden, (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig, (iii) someter la fracción soluble a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iv) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (v) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en el que la composición obtenida en la etapa (iii) se caracteriza porque el porcentaje de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig es menos de aproximadamente 2,5 % de área, la proteína celular es menos de 95 ng/ml y MCP-1 es menos de aproximadamente 5 ppm.
Una composición de moléculas de CTLA4-Ig puede aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que producen moléculas de CTLA4-Ig y, en cualquier orden, (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iii) someter la fracción soluble a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iv) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (v) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición enriquecida y eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig, en el que la composición obtenida en la etapa (iii) se caracteriza porque el porcentaje de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig es menor de aproximadamente 2,5 % de área, la proteína celular es menor de 95 ng/ml, MCP-1 es menor de aproximadamente 5 ppm y la proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 12.
En una realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 75 mM y NaCl aproximadamente 360 mM y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En otra realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa
(ii) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES 25 mM y NaCl aproximadamente 850 mM y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. En una realización adicional, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) del procedimiento se lleva a cabo usando un solo tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 25 mM y NaCl aproximadamente 850 mM y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. En una realización adicional la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende Tris aproximadamente 25 mM y NaCl aproximadamente 250 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En otra realización adicional la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende glicina aproximadamente 100 mM y que tiene un pH de aproximadamente 3,5. En otra realización más, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (v) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES
aproximadamente 25 mM y de NaCl aproximadamente 120 mM a NaCl aproximadamente 130 mM y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En otra realización adicional, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (v) del procedimiento se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES aproximadamente 25 mM, y NaCl aproximadamente 200 mM y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En otra realización más, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) del procedimiento se lleva a cabo usando una columna que tiene una resina de intercambio aniónico que comprende un grupo funcional de amina primaria, secundaria, terciaria
o cuaternaria. En una realización específica la resina comprende un grupo funcional de amina cuaternaria. En otra realización adicional, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) del procedimiento se lleva a cabo usando una resina de interacción hidrófoba que comprende un grupo funcional de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo
o isoamilo. En una realización específica, el grupo funcional comprende un grupo funcional de fenilo. En otra realización adicional, la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) del procedimiento se lleva a cabo usando una resina de cromatografía de afinidad que comprende Proteína A.
Puede prepararse una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig por un procedimiento que comprende purificar moléculas de CTLA4-Ig de un cultivo celular líquido, en el que la composición de CTLA4-Ig purificada comprende (a) una cantidad farmacéuticamente aceptable de MCP-1 por mg de moléculas de CTLA4-Ig y (b) menos de 2,5 % de área de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización, la cantidad farmacéuticamente aceptable de MCP-1 comprende de aproximadamente 40 a aproximadamente 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. En una realización adcional, la cantidad farmacéuticamente aceptable de MCP-1 puede comprender de aproximadamente 35 a aproximadamente 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. En una realización adicional, la cantidad farmacéuticamente aceptable de MCP-1 puede comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. En una realización adicional la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) del procedimiento se lleva a cabo usando una columna que comprende una resina capaz de reducir MCP-1 en el producto proteico eluido. En una realización adicional, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) del procedimiento se lleva a cabo usando una resina de interacción hidrófoba, en la que la resina es capaz de (a) separar dímeros de CTLA4-Ig de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig; (b) aumentar el contenido de ácido siálico de las moléculas de CTLA4-Ig eluidas; o (c) tanto (a) como (b). En una realización adicional, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) o etapa (iv), o ambas, se lleva a cabo usando una resina de intercambio aniónico, en la que la resina es capaz de (a) disminuir el contenido de agregado de alto peso molecular de CTLA4-Ig de la composición eluida; (b) aumentar el contenido siálico de la composición eluida; o (c) tanto (a) como (b).
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede aislarse por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble de un cultivo líquido que comprende células de mamífero que producen moléculas de CTLA4-Ig, y en cualquier orden; (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener una composición eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; (iii) someter la fracción soluble a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición eluida y enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y
(iv) someter la fracción soluble a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición eluida y enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig. En una realización, la etapa de cromatografía de afinidad se realiza en primer lugar. En otra realización, la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) del procedimiento se lleva a cabo usando una resina que comprende proteína A. En una realización adicional, la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende guanidina. En una realización adicional la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende urea. En otra realización adicional, la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) da como resultado un aumento de los dímeros de CTLA4-Ig en la composición eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig.
Puede aislarse una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig de líquido recogido de un cultivo celular de mamífero, en el que las células producen moléculas de CTLA4-Ig, por un procedimiento que comprende: (i) obtener una fracción soluble del líquido recogido; (ii) someter la fracción soluble a cromatografía de afinidad para obtener una composición eluida que comprende moléculas de CTLA4-Ig, (iii) someter la composición de la etapa (ii) a cromatografía de intercambio aniónico para obtener una composición eluida y enriquecida que comprende moléculas de CTLA4-Ig; y (iv) someter la composición de la etapa (iii) a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener una composición enriquecida adicional que comprende moléculas de CTLA4-Ig. En una realización, la composición obtenida en la etapa (iv) del procedimiento se caracteriza porque el porcentaje de especies de alto peso molecular es menor de aproximadamente 2,5 % de área como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica, y el porcentaje de proteína celular es menor de aproximadamente 95 ng/ml, y el porcentaje de MCP-1 es menor de aproximadamente 5 ppm. En otra realización adicional, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 50 mM, y NaCl aproximadamente 135 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7. En una realización adicional, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende HEPES aproximadamente 50 mM, y NaCl aproximadamente 200 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7. En una realización específica, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) se lleva a cabo usando una resina de interacción hidrófoba que comprende un grupo funcional de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo. En una realización adicional, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iv) se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 50 mM, y (NH4)2SO4 aproximadamente 1,2 M, y que tiene un pH de aproximadamente 7. En otra realización adicional, la cromatografía de
afinidad de la etapa (ii) se lleva a cabo usando un tampón de lavado que comprende NaH2PO4 aproximadamente 25 mM y NaCl aproximadamente 150 mM y que tiene un pH de aproximadamente 7,5. En otra realización adicional, la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) se lleva a cabo usando un tampón de elución que comprende glicina aproximadamente 250 mM y que tiene un pH de aproximadamente 3. En otra realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) se lleva a cabo usando una columna que tiene una resina de intercambio aniónico que comprende un grupo funcional de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. La resina puede comprender un grupo funcional de amina cuaternaria.
En una realización, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) se lleva a cabo usando una resina de interacción hidrófoba que comprende un grupo funcional de fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo. En una realización, el grupo funcional comprende un grupo funcional de fenilo. En una realización, la cromatografía de afinidad de la etapa (ii) se lleva a cabo usando una resina que comprende proteína A. La invención proporciona una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, obtenidas mediante el procedimiento de la invención. En una realización, la composición comprende uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, la composición comprende uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Puede usarse un plásmido de expresión de CTLA4-Ig que tenga la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 17. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y proteína de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 18. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 18.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 12. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 11. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7 a aproximadamente 12.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7 a aproximadamente 11. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 18. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 12 a aproximadamente 18.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 13 a aproximadamente 18. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 14 a aproximadamente 18. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 17.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 16. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 10. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6. El ácido siálico puede ser ácido N-acetil neuramínico (NANA). En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 12. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido N-glucolil neuramínico (NGNA) y moléculas de CTLA4-Ig de menos de, o igual a, aproximadamente 1,5.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de NGNA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de NGNA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,5. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18.
En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12.
Una composición sustancialmente purificada que comprende una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición en la que cada polipéptido de la molécula comprende la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y en la que las moléculas de CTLA4-Ig se caracterizan por una proporción molar media de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5. La proporción molar de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig puede determinarse mediante hidrólisis ácida y HPLC. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden comprender uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
Las moléculas de CTLA4-Ig pueden comprender uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15
o 16. En una composición sustancialmente purificada que comprende moléculas de CTLA4-Ig, más de o igual al 95% de las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. En una realización, más de o igual a 98 % de las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros de CTLA4-Ig. En una realización, más de o igual al 99 % de las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros de CTLA4-Ig.
En una realización, más de o igual al 99,5 % de las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros de CTLA4-Ig. En una realización, de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99,5 % de las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros de CTLA4-Ig y de aproximadamente el 0,5 por ciento de área a aproximadamente el 5 por ciento de área de las moléculas son especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización, aproximadamente el 98,6 % de las moléculas son dímeros de CTLA4-Ig y aproximadamente el 1,2 por ciento de área de las moléculas son especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig y aproximadamente menos del 0,7 por ciento de área de las moléculas son monómeros de CTLA4-Ig como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización, aproximadamente menos de aproximadamente el 0,3 % de las moléculas son multímeros que comprenden cinco o más monómeros de CTLA4-Ig. Una composición puede consistir esencialmente en dímeros de CTLA4-Ig. Una composición puede consistir esencialmente en moléculas de CTLA4-Ig, en la que la población está sustancialmente sin monómeros de CTLA4-Ig. Una composición puede consistir esencialmente en moléculas de CTLA4-Ig, en las que la población carece sustancialmente de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig. Una composición puede consistir esencialmente en monómeros de CTLA4-Ig y carecer sustancialmente de dímeros de CTLA4-Ig y especies de alto peso molecular. En una realización, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene al menos 3 grupos de ácido siálico. En una realización, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene al menos 2,5 grupos de ácido siálico. En una realización, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene de al menos 3 grupos de ácido siálico a al menos 8 grupos de ácido siálico.
En una realización, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig tiene de al menos 2,5 grupos de ácido siálico a al menos 5 grupos de ácido siálico. En una realización, cada dímero comprende dos polipéptidos de CTLA4-Ig, en los que cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 5-16. En una realización, la composición comprende uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, la composición comprende uno o más polipéptidos que tienen SEC ID Nº 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Una composición aislada que comprende tetrámeros de CTLA4-Ig puede estar sustancialmente sin dímeros de CTLA4-Ig. Una composición aislada que comprende tetrámeros de CTLA4-Ig puede estar sustancialmente sin monómeros de CTLA4-Ig. En una realización, la composición existe como una cantidad que es mayor de aproximadamente 100 gramos. En una realización, cada tetrámero comprende dos pares de polipéptidos de CTLA4-Ig, en los que cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 5-10. En una realización, cada tetrámero comprende dos pares de polipéptidos de CTLA4-Ig, en los que cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 11-16. En una realización, cada tetrámero es capaz de unirse a un CD80 o CD86. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, puedeser una composición farmacéuticamente aceptable que carezca sustancialmente de MCP-1. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición farmacéuticamente aceptable que comprende no más de aproximadamente 25 ppm de MCP-1. En una realización la composición comprende no más de 10 ppm de MCP-1. En una realización, la composición comprende de aproximadamente 0,2 ng/ml de MCP-1 a aproximadamente 10 ng/ml de MCP-1. En una realización, la composición farmacéuticamente aceptable que comprende moléculas de CTLA4-Ig comprende (a) de aproximadamente 0,2 ng/ml de MCP-1 a aproximadamente 10 ng/ml de MCP-1 y (b) no más de 25 ng/ml de proteína de CHO o no más de 10 ng/ml de proteína de CHO. En una realización, la composición comprende no más de aproximadamente 20 pg/ml de ADN.
Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición, en la que, cuando se administra a un sujeto una dosis intravenosa de aproximadamente 10 mg/kg, las moléculas de CTLA4-Ig son capaces de mostrar: un área bajo la curva (ABC) de aproximadamente 44.400 ∀g.h/ml; un volumen de distribución de aproximadamente 0,09 l/kg; una concentración máxima (Cmáx) de aproximadamente 292 ∀g/ml; y una velocidad de eliminación de aproximadamente 0,23 ml/h/kg. Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender isoformas dominantes de moléculas de CTLA4-Ig visualizables en un gel de isoelectroenfoque que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,1 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, el pI medio de la composición aumenta después de tratamiento con neuraminidasa. En una realización, al menos el 40 % de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,1 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 70 % de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,1 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 90 % de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,1 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tienen un pI de aproximadamente 3,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2. Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 4,3 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2.
Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 3,3 ! 0,2 a aproximadamente 4,7 ! 0,2. En una realización, la composición está sustancialmente purificada. Una composición que comprende una molécula de CTLA4-Ig con un pI de aproximadamente 3,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2 puede prepararse por un procedimiento que comprende: (a) someter una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a electroforesis en gel de isoelectroenfoque, en la que una única banda en el gel representa una población de moléculas de CTLA4-Ig con un pI particular, y (b) aislar la población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen un pI de aproximadamente 3,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2 para preparar la composición. Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender isoformas dominantes visualizables en un gel de isoelectroenfoque que tienen un punto isoeléctrico, pI, menor de o igual a 5,5 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, el pI medio de la composición aumenta después de tratamiento con neuraminidasa. En una realización, al menos el 40 % de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 70 % de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 90% de las moléculas de CTLA4-Ig muestran un punto isoeléctrico menor de o igual a aproximadamente 5,3 ! 0,2 como se determina por isoelectroenfoque. Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 3,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2.
Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 4,5 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2. Una composición aislada puede comprender moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI de aproximadamente 4,7 ! 0,2 a aproximadamente 5,1 ! 0,2. La composición puede estar sustancialmente purificada.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig con un pI de 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2 puede prepararse por un procedimiento que comprende: (a) someter una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a electroforesis en gel de isoelectroenfoque, en el que una única banda en el gel representa una población de moléculas de CTLA4-Ig con un pI particular, y (b) aislar la población de moléculas de CTLA4-Ig que tengan un pI mayor de aproximadamente 3,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,2 ! 0,2 para preparar la composición. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 17 a aproximadamente 28. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 17 a aproximadamente 25. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, cada polipéptido de la molécula puede comprender la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, cada polipéptido de la molécula puede comprender la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, cada polipéptido de la molécula puede comprender la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una
proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, cada polipéptido de la molécula puede comprender la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de manosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 22. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, cada polipéptido de la molécula puede comprender la secuencia de SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15 o 16, y las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de manosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 14 a aproximadamente 16.
En una realización, la proporción molar de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig se determina por electroforesis capilar. En una realización, la proporción molar de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig se determina por electroforesis capilar. En una realización, la proporción molar de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig se determina por electroforesis capilar.
En una realización, la proporción molar de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig se determina por electroforesis capilar. En una realización, la proporción molar de manosa y moléculas de CTLA4-Ig se determina por electroforesis capilar. En una realización, las moléculas de CTLA4-Ig se obtienen mediante unión enzimática de uno o más carbohidratos con la molécula. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas pueden comprender restos de carbohidratos unidos a las moléculas de forma enzimática in vitro. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; y (b) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; y (c) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (d) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; y (e) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; (e) una proporción molar media de manosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22; y (f) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; y (b) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6; y (c) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; y (d) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0; y (e) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5. Una composición que comprende
moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 24 a aproximadamente 28; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,0; (e) una proporción molar media de manosa y proteína de CTLA4-Ig de aproximadamente 14 a aproximadamente 16; y (f) una proporción molar media de ácido siálico y proteína de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden glucosilarse en un resto de aminoácido de asparagina en la posición 102 de SEC ID Nº 2 o 4, un resto de aminoácido de asparagina en la posición 134 de SEC ID Nº 2 o 4, un resto de aminoácido de asparagina en la posición 233 de SEC ID Nº 2 o 4, un resto de aminoácido de serina en la posición 155 de SEC ID Nº 2 o 4, o un resto de aminoácido de serina en la posición 165 de SEC ID Nº 2 o 4. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden estar glucosiladas, y en la que al menos aproximadamente el 2 % de la masa total de glucosilación es glucosilación ligada a O.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede mostrar un pico de cromatograma de NGNA de aproximadamente 9,6 ! 0,3 y un pico de cromatograma de NANA de aproximadamente 10,5 ! 0,3. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que la Figura 68. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un perfil de carbohidratos como se muestra en la Figura 68. En una composición que consiste esencialmente en moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden mostrar un perfil de carbohidratos de los dominios I-IV, en el que el dominio I comprende picos que representan oligosacáridos a-sialilados, el dominio II comprende picos que representan oligosacáridos mono-sialilados, el dominio III comprende picos que representan oligosacáridos di-sialilados, el dominio IV comprende picos que representan oligosacáridos tri-sialilados, y el dominio V comprende picos que representan oligosacáridos tetra-sialilados, y en el que el perfil es un cromatograma de oligosacáridos liberados de CTLA4-Ig. En una realización, la diferencia en los tiempos de retención de oligosacáridos ligados a N entre un primer pico en el dominio I y un pico principal en el dominio II es de aproximadamente 10 a aproximadamente 12 minutos. En una realización, la diferencia en los tiempos de retención de oligosacáridos ligados a N entre un primer pico en el dominio I y un pico principal en el dominio II es de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 minutos. En una realización, la glucosilación de los dominios III y IV comprende de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 36 % de glucosilación ligada a N como se mide por HPAEC. En una realización, la glucosilación del dominio I comprende de aproximadamente el 24,5 % a aproximadamente el 35,2 % de glucosilación ligada a N como se mide por HPAEC. En una realización, la glucosilación del dominio II comprende de aproximadamente 26,3 % a aproximadamente 34,1 % de glucosilación ligada a N como se mide por HPAEC. En una realización, la glucosilación del dominio III comprende de aproximadamente 21,9 % a aproximadamente 31,5 % de glucosilación ligada a N como se mide por HPAEC. En una realización, la glucosilación del dominio IV y el dominio V comprende de aproximadamente el 7,9 % a aproximadamente el 18,6 % de glucosilación ligada a N como se mide por HPAEC.
En una realización: (a) el dominio I muestra un porcentaje de área de al menos aproximadamente 31; (b) el dominio II muestra un porcentaje de área de al menos aproximadamente 33; (c) el dominio III muestra un porcentaje de área de al menos aproximadamente 24; (iv) el dominio IV muestra un porcentaje de área de al menos aproximadamente 9,4; (v) el dominio V muestra un porcentaje de área de al menos aproximadamente 67; o en el que el área se mide a partir de un cromatograma de oligosacáridos liberados de CTLA4-Ig.
En una realización: (a) el dominio I muestra al menos aproximadamente 5 picos; (b) el dominio II muestra al menos aproximadamente 5 picos; (c) el dominio III muestra al menos aproximadamente 5 picos; (d) el dominio IV muestra al menos aproximadamente 6 picos; o (e) el dominio V muestra al menos aproximadamente 6 picos, y en el que los picos se muestran en un cromatograma. Una composición en la que el dominio I muestra al menos 2 picos, en la que un primer pico tiene un área mínima de aproximadamente 4,5 % y un área máxima de aproximadamente 11,2 % y en el que un segundo pico tiene un área mínima de aproximadamente 8,7 % y un máximo de aproximadamente 11,8 %.
En una realización, los dominios III y IV muestran un porcentaje de área de aproximadamente 25 % a aproximadamente 36 % como se mide por HPAEC. En una realización, el dominio I muestra un porcentaje de área de aproximadamente 24,5 % a aproximadamente 35,2 % como se mide por HPAEC. En una realización, el dominio II muestra un porcentaje de área de aproximadamente 26,3 % a aproximadamente 34,1 % como se mide por HPAEC. En una realización, el dominio III muestra un porcentaje de área de aproximadamente 21,9 % a aproximadamente 31,5 % como se mide por HPAEC. En una realización, el dominio IV muestra un porcentaje de área de aproximadamente 7,9 % a aproximadamente 18,6 % como se mide por HPAEC.
En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos pueden tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos pueden tener glucosilación ligada a N triantenaria; y (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos pueden tener glucosilación ligada a N tetraantenaria. En una realización, la glucosilación ligada a N se determina por cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección amperométrica por pulsos (HPEAC-PAD). Una composición que
comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por:
(a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; y (c) un porcentaje de área de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor de aproximadamente 3% determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y (c) una proporción molar de NANA y moléculas de CTLA4-Ig menor que o igual a aproximadamente 1.5.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y (c) un contenido de agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor que aproximadamente un porcentaje de área de 3 determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; y (d) un perfil de carbohidratos sustancialmente igual al de la Figura 68. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y (c) un contenido de agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor que aproximadamente un porcentaje de área de 3 determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; y (d) un contenido de glucosilación en los Dominios III, IV y V de al menos aproximadamente 29,8% a aproximadamente 50,1% de glucosilación unida a N determinado por HPAEC. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (b) una proporción molar media de NANA y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y (c) un porcentaje de área de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig de aproximadamente 3 determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización, las moléculas se caracterizan adicionalmente por una proporción molar media de NANAy moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.
En una realización las moléculas se carecterizan adicionalmente por: (a) aproximadamente el 80 % de glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de glucosilación ligada a N triantenaria; y (c) aproximadamente el 6 % de glucosilación ligada a N tetraantenaria. En una realización, las moléculas comprenden además cualquier combinación de uno o más de: (a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 2); (b) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 2); (c) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 9 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 2); y (d) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 2). En una realización, (a) aproximadamente el 90 % de las moléculas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 que comienza con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10 % de las moléculas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) aproximadamente el 4 % de las moléculas comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 que termina con la lisina en el número de resto 383; y (d) aproximadamente el 96 % de las moléculas comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 que termina con la glicina en el número de resto 382. En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N triantenaria; (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N tetraantenaria; y (d) la proporción molar media de NGNA y moléculas de CTLA4-Ig puede ser menor de o igual a 1,5. En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N triantenaria; (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N tetraantenaria; y (d) la proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 35. En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N triantenaria; (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N tetraantenaria; y (d) la proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig puede ser de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; y (b) una proporción molar media de siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media
de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; y (b) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5; y (c) una especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig de menos de aproximadamente 5 % de área como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13;
(b)
una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5; (c) un contenido de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor de aproximadamente 5 % de área como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; y
(d)
un perfil de carbohidratos sustancialmente igual que el de la Figura 68. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; (b) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de 5,5 a aproximadamente 9,5; (c) un contenido de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor de aproximadamente 5 % de área como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; y (d) un contenido de glucosilación en los dominios III, IV y V de al menos aproximadamente el 29,8 % a aproximadamente el 50,1 % de glucosilación ligada a N como se determina por HPAEC.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 13; (b) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5; y (c) un contenido de especie de alto peso molecular de CTLA4-Ig menor de aproximadamente 5 % de área como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En una realización, las moléculas se caracterizan adicionalmente por: (a) aproximadamente el 80 % de glucosilación ligada a N biantenaria;
(b)
aproximadamente el 14 % de glucosilación ligada a N triantenaria; y (c) aproximadamente el 6 % de glucosilación ligada a N tetraantenaria. En otra realización, las moléculas comprenden además cualquier combinación de uno o más de: (a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); (b) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 13 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4); (c) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 15 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de SEC ID Nº 4); y (d) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de SEC ID Nº 4). En otra realización, (a) aproximadamente el 90 % de las moléculas comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la metionina en el resto 27;
(b)
aproximadamente el 10 % de las moléculas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) aproximadamente el 4 % de las moléculas comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la lisina en el número de resto 383; y (d) aproximadamente el 96 % de las moléculas comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 que termina con la glicina en el número de resto 382. En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N triantenaria; y (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N tetraantenaria; y (d) la proporción molar media de GlcNAc por mol de proteína de CTLA4-Ig puede ser de aproximadamente 24 a aproximadamente 28. En una composición que comprende polipéptidos de CTLA4-Ig (a) aproximadamente el 80 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N biantenaria; (b) aproximadamente el 14 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N triantenaria; (c) aproximadamente el 6 % de los polipéptidos puede tener glucosilación ligada a N tetraantenaria; y
(d)
la proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig puede ser de aproximadamente 2,7 a aproximadamente 3,6. La composición puede ser una composición sustancialmente purificada. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, menos de o igual a aproximadamente el 2,5 % de las moléculas de CTLA4-Ig pueden estar oxidadas. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, menos de o igual a aproximadamente el 2,0 % de las moléculas de CTLA4-Ig pueden estar desamidadas. En una composición que comprende moléculas diméricas de CTLA4-Ig, al menos el 0,5 % de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig pueden estar cisteiniladas. En una realización, al menos el 1,0 % de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig están cisteiniladas. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede mostrar un perfil de espectrometría de masas sustancialmente igual que la Figura 64, 65 o 67. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede mostrar un perfil de electroforesis capilar sustancialmente igual que la Figura 48.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 y aproximadamente 8,3; (e) una proporción molar media de manosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22;
(f)
una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; (g) un pI como se determina a partir de la visualización en un gel de isoelectroenfoque en un intervalo de aproximadamente 2,4 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2; (h) MCP-1 de menos de o igual a 3 ppm; (i) menos del 2,5
% de área de especies de alto peso molecular como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; (j) menos del 0,5 % de área de monómero como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; (k) polipéptidos de CTLA4-Ig que tienen un aminoácido al menos el 95 % idéntico a cualquiera de SEC ID Nº 5-10; (l) moléculas de CTLA4-Ig capaces de unirse a CD80 y CD86. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, la población de moléculas puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; (e) una proporción molar media de manosa y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22; (f) una proporción molar media de ácido siálico y moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; (g) un pI como se determina a partir de la visualización en un gel de isoelectroenfoque en un intervalo de aproximadamente 3,4 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2; (h) MCP-1 de menos de o igual a 5 ppm; (i) menos del 2,5 % de área de especies de alto peso molecular como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; (j) menos del 0,5 % de área de monómero como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; (k) polipéptidos de CTLA4-Ig que tienen un aminoácido al menos el 95 % idéntico a cualquiera de SEC ID Nº 5-10; (l) moléculas de CTLA4-Ig capaces de unirse a CD80 y CD86; o equivalentes farmacéuticos de los mimos.
Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede tener una incidencia de inmunogenicidad de menos de o igual al 7,4 %. En una realización, la incidencia de la inmunogenicidad es de aproximadamente el 2,1 % a aproximadamente el 7,4 %. En una realización, la incidencia de inmunogenicidad es menor de o igual al 3,7 %. En una realización, la incidencia de inmunogenicidad es menor de o igual al 3,0 %. En una realización, la incidencia de inmunogenicidad es de aproximadamente el 2,8 % a aproximadamente el 3,0 %. Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición en la que, después de la administración de la composición a seres humanos, la producción de anticuerpos que se unen a las moléculas de CTLA4-Ig se produce a una incidencia en los seres humanos menor de o igual al 7,4 %. En una realización, la incidencia es de aproximadamente el 2,1 % a aproximadamente el 7,4 %. En una realización, la incidencia es menor de o igual al 3,7 %. En una realización, la incidencia es menor de o igual al 3,0%. En una realización, la incidencia es de aproximadamente el 2,8 % a aproximadamente el 3,0 %. Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición en la que, después de la administración de la composición a seres humanos, la producción de anticuerpos que se unen a las partes de CTLA4 de las moléculas de CTLA4-Ig se produce en los seres humanos a una incidencia menor de o igual al 4,9 %. En una realización, la incidencia es de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4,9 %. En una realización, la incidencia es menor de o igual al 1,2 %. En una realización, la incidencia es menor de o igual al 1,0 %. En una realización, la incidencia es de aproximadamente el 0,9 % a aproximadamente el 1,0 %.En una realización, la incidencia se mide en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En una realización, la incidencia se mide en un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL).
Una composición aislada que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede ser una composición en la que, después de la administración de la composición a seres humanos, la producción de anticuerpos que neutralizan las moléculas de CTLA4-Ig se produce a una incidencia de menos de o igual al 75 % de los seres humanos que tienen anticuerpos que se unen a la parte de CTLA4 de la molécula de CTLA4-Ig. En una realización, la incidencia es del 40-75 %. En una realización, la incidencia es menor de o igual al 40%. En una realización, la incidencia se mide en un ensayo indicador de luciferasa basado en células.
Puede producirse proteína de CTLA4-Ig por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido muestra más de o igual a aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir las células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido muestra de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6 moles de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido, y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 células viables por ml de cultivo líquido a aproximadamente 79 x 105 células por ml de cultivo líquido. También
puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente el 38 %. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra de un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente el 37 %. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando la endotoxina es menor de o igual a aproximadamente 76,8 UE por ml de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando la endotoxina es menor de o igual a aproximadamente 4,8 UE por ml de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza solamente cuando la carga biológica es menor de 1 unidad formadora de colonias por ml de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro del cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento se realiza cuando se cumplen al menos dos de las siguientes condiciones: (i) el cultivo líquido contiene más de o igual a aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig, (ii) el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 células viables por ml de cultivo líquido a aproximadamente 79 x 105 células viables por ml de cultivo líquido, (iii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente 38 %; o (iv) el rendimiento de proteína de CTLA4-Ig es mayor de aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, en el que la concentración de NANA en (i) y el rendimiento en (iv) se determinan evaluando una alícuota del cultivo líquido. También puede producirse proteína de CTLA4-Ig por un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que producen proteína de CTLA4-Ig, en el que la expansión es desde un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l hasta que se produce la proteína de CTLA4-Ig a un rendimiento de al menos aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, como se determina evaluando una alícuota del cultivo líquido; y (b) aislar la proteína de CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 ml, en el que el aislamiento se realiza cuando se cumplen al menos dos de las siguientes condiciones: (i) el cultivo líquido contiene de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6 moles de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig; (ii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente el 37 %; o (iii) el rendimiento de la proteína de CTLA4-Ig es mayor de aproximadamente 0,5 gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, en el que el contenido de ácido siálico en (i) y el rendimiento en (iii) se determinan evaluando una alícuota del cultivo líquido.
Secuencias:
SEC ID Nº 1 [secuencia de nucleótidos de CTLA4-Ig, véase Figura 1]
SEC ID Nº 2 [secuencia de aminoácidos de CTLA4-Ig, véase Figura 1]
SEC ID Nº 3 [la secuencia de nucleótidos de CTLA4A29YL104E-Ig comprende los nucleótidos 79 a 1149 de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 2]
SEC ID Nº 23 es la secuencia de nucleótidos completa mostrada en la Figura 2. Esta secuencia de nucleótidos incluye la secuencia codificante para la prosecuencia.
SEC ID Nº 4 [secuencia de aminoácidos de CTLA4A29YL104E-Ig, Figura 3, sin la prosecuencia] SEC ID Nº 5 [aminoácidos 25-383 de SEC ID Nº 2]
SEC ID Nº 6 [aminoácidos 26-383 de SEC ID Nº 2]
SEC ID Nº 7 [aminoácidos 27-383 de SEC ID Nº 2]
SEC ID Nº 8 [aminoácidos 25-382 de SEC ID Nº 2] SEC ID Nº 9 [aminoácidos 26-382 de SEC ID Nº 2]
SEC ID Nº 10 [aminoácidos 27-382 de SEC ID Nº 2]
SEC ID Nº 11 [aminoácidos 25-383 de SEC ID Nº 4]
SEC ID Nº 12 [aminoácidos 26-383 de SEC ID Nº 4] SEC ID Nº 13 [aminoácidos 27-383 de SEC ID Nº 4]
SEC ID Nº 14 [aminoácidos 25-382 de SEC ID Nº 4]
SEC ID Nº 15 [aminoácidos 26-382 de SEC ID Nº 4]
SEC ID Nº 16 [aminoácidos 27-382 de SEC ID Nº 4] 5
SEC IDNº 17 SEC ID Nº 18 [secuencia de dominio extracelular de CTLA4]
SEC IDNº 19 5'-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3' SEC ID Nº 20-22 SEC ID Nº 20 --5'-GTACTCAGG SEC ID Nº 21 --AGTCAGAGAC SEC IDNº 22 --
Monómeros y multímeros de CTLA4-Ig
Para la producción de proteínas pueden usarse líneas celulares que tengan un casete de expresión que comprenda SEC ID Nº 1 (Figura 1A). Dicho casete de expresión cuando se expresa en células de mamífero, incluyendo células CHO, puede dar como resultado la producción de variantes N y C terminales, de modo que las proteínas producidas a partir del casete de expresión pueden tener la secuencia de aminoácidos de los restos: (i) 26-383 de SEC ID Nº 2,
(ii)
26-382 de SEC ID Nº 2, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 2, o (iv) 27-382 de SEC ID Nº 2, u opcionalmente (v) 25-382 de SEC ID Nº 2, o (vi) 25-383 de SEC ID Nº 2 (Figura 1A). Estas proteínas pueden denominarse en el presente documento monómeros de “SEC ID Nº 2”, o monómeros “que tienen una secuencia de SEC ID Nº 2”. Estos monómeros de SEC ID Nº 2 pueden dimerizarse, de modo que las combinaciones diméricas pueden incluir, por ejemplo: (i) y (i); (i) y (ii); (i) y (iii); (i) y (iv); (i) y (v); (i) y (vi); (ii) y (ii); (ii) y (iii); (ii) y (iv); (ii) y (v); (ii) y (vi); (iii) y (iii); (iii) y (iv); (iii) y (v); (iii) y (vi); (iv) y (iv); (iv ) y (v); (iv) y (vi); (v) y (v); (v) y (vi); y (vi) y (vi). Estas diferentes combinaciones diméricas también pueden asociarse entre sí para formar moléculas de CTLA4-Ig tetraméricas. Estos monómeros, dímeros, tetrámeros y otros multímeros pueden denominarse en el presente documento “proteínas de SEC ID Nº 2”
o proteínas “que tienen una secuencia de SEC ID Nº 2”. Aunque las líneas celulares pueden producir estas variantes inmediatamente tras la traducción, las variantes pueden ser más típicamente un producto de acciones posttraduccionales en las células. La línea celular también secreta moléculas de CTLA4-Ig. Abatacept se refiere a proteínas de SEC ID Nº 2.
Las moléculas de CTLA4-Ig pueden incluir, por ejemplo, proteínas de CTLA4-Ig en formas monoméricas, diméricas, triméricas, tetraméricas, pentaméricas, hexaméricas u otras multiméricas. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden comprender una fusión proteica con al menos un dominio extracelular de CTLA4 y una región constante de inmunoglobulina. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener secuencias naturales o mutantes, por ejemplo, con respecto al dominio extracelular de CTLA4 y secuencias de región constante de inmunoglobulina. Los monómeros de CTLA4-Ig, solos, o en forma dimérica, tetramérica u otra multimérica, pueden estar glucosilados.
Las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig pueden tener al menos un cierto porcentaje de moléculas diméricas u otras multiméricas. Por ejemplo, las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig pueden ser mayores de 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de dímeros de CTLA4-Ig. La población de moléculas de CTLA4-Ig puede comprender de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99,5% de dímeros de CTLA4-Ig y de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 5% de tetrámeros de CTLA4-Ig. La población de moléculas de CTLA4-Ig puede comprender aproximadamente el 98 % de dímeros de CTLA4-Ig, aproximadamente el 1,5 % de tetrámeros de CTLA4-Ig y aproximadamente el 0,5% de monómeros de CTLA4-Ig.
La población de moléculas de CTLA4-Ig puede estar sustancialmente sin moléculas monoméricas de CTLA4-Ig. Sustancialmente sin moléculas monoméricas de CTLA4-Ig puede referirse a una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga menos de 1 %, 0,5% o 0,1 % de monómeros.
La población de moléculas de CTLA4-Ig puede estar sustancialmente sin multímeros de CTLA4-Ig que son mayores que los dímeros, tales como tetrámeros, hexámeros, etc. (por ejemplo, especies de alto peso molecular). Sustancialmente sin moléculas multiméricas de CTLA4-Ig mayores que los dímeros puede referirse a una población de moléculas de CTLA4-Ig que tienen menos del 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de multímeros de CTLA4-Ig (por ejemplo, especies de alto peso molecular) mayores que la forma dimérica.
La molécula monomérica de CTLA4-Ig puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de: (i) 26-383 de SEC ID Nº 2, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 2, (iii) 27-383 SEC ID Nº 2, o (iv) 27-382 de SEC ID Nº 2, u opcionalmente (v) 25382 de SEC ID Nº 2 o (vi) 25-383 de SEC ID Nº 2. Cuando se expresa un casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 en células CHO, la forma monomérica predominante expresada tiene el resto de aminoácido N terminal de metionina (resto 27 de SEC ID Nº 2), que corresponde al resto de aminoácido N terminal de CTLA4 humano natural. Sin embargo, debido a que SEC ID Nº 1 también incluye la secuencia codificante para una secuencia señal de oncostatina M (nucleótidos 11-88 de SEC ID Nº 1), la proteína expresada a partir de SEC ID Nº contiene una secuencia señal de oncostatina M. La secuencia señal se escinde de la proteína expresada durante el proceso de exportación proteica del citoplasma, o secreción fuera de la célula. No obstante la escisión puede dar como resultado variantes N terminales, tales como escisión entre los restos de aminoácido 25 y 26 de SEC ID Nº 2 (que da como resultado un extremo N terminal del resto 26, es decir, la “variante de Ala”), o entre los restos de aminoácidos 24 y 25 de SEC ID Nº 2 (dando como resultado un extremo N terminal del resto 25, es decir, la “variante de Met-Ala”), a diferencia de escisión entre los restos de aminoácidos 26 y 27 de SEC ID Nº 2 (que dan como resultado un extremo N terminal del resto 27). Por ejemplo, la variante de Met-Ala puede estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a aproximadamente 1%, y la variante de Ala puede estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a aproximadamente 8-10%. Además, la proteína expresada de SEC ID Nº puede tener variantes de extremo C terminal debido a procesamiento incompleto. El extremo C terminal predominante es la glicina en el resto 382 de SEC ID Nº 2. En una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig, pueden estar presentes monómeros que tengan lisina en el extremo C terminal (resto 383 de SEC ID Nº 2), por ejemplo, a aproximadamente 4-5%.
En una realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SECIDNº 5 (que es la misma que los aminoácidos 25-383 de SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 5]
En otra realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SECIDNº 6 (que es la misma que los aminoácidos 26-383 de la SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 6]
En otra realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SECIDNº 7 (que es la misma que los aminoácidos 27-383 de SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 7]
En otra realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SECIDNº 8 (que es la misma que los aminoácidos 25-382 de SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 8]
10 En una realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente de aminoácidos de SECID Nº 9 (que es la misma que los aminoácidos 26-382 de SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 9]
En una realización, una molécula de CTLA4-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 10 (que es la misma que los aminoácidos 27-382 de SEC ID Nº 2):
[SEC ID Nº 10]
Una molécula monomérica de CTLA4-Ig puede comprender un dominio extracelular de CTLA4 humano. En una realización, el dominio extracelular puede comprender la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº que codifican los aminoácidos 27-151 de SEC ID Nº 2. En otra realización, el dominio extracelular puede comprender secuencias mutantes de CTLA4 humano. En otra realización, el dominio extracelular puede comprender cambios de nucleótidos a los nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº 1 de modo que se realicen cambios de aminoácidos conservativos. En otra realización, el dominio extracelular puede comprender una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a los nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº
1.
Una molécula monomérica de CTLA4-Ig puede comprender una región constante de una inmunoglobulina humana. Esta región constante puede ser una parte de una región constante; esta región constante puede tener una secuencia natural o mutante. La región constante puede ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE humana. La región constante puede ser de una cadena ligera o una cadena pesada de una inmunoglobulina. Cuando la región constante es de una molécula de IgG, IgD o IgA, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL, CH1, bisagra, CH2 o CH3. Cuando la región constante es de IgM
o IgE, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL,CH1, CH2, CH3oCH4. En una realización, la región constante puede comprender uno o más dominios de región constante de IgG, IgD, IgA, IgM o IgE.
En una realización, los dímeros de CTLA4-Ig están comprendidos por dos monómeros, en los que cada monómero puede tener la misma o diferente secuencia de aminoácidos, y en los que la secuencia puede ser la secuencia de aminoácidos de: (i) 26-383 de SEC ID Nº 2, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 2, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 2, (iv) 27-382 de SEC ID Nº 2, (v) 25-382 de SEC ID Nº 2, y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 2. Dichos monómeros de CTLA4-Ig pueden dimerizar a través del dominio extracelular de la secuencia de CTLA4 humana mediante un resto de aminoácido de cisteína en la posición 146 de SEC ID Nº 2.
Una molécula de CTLA4-Ig puede multimerizar mediante la interacción de dominios de región constante de IgM o IgA con una proteína de la cadena J. IgM e IgA se producen habitualmente como multímeros en asociación con una cadena polipeptídica adicional, la cadena J. En IgM pentamérico, los monómeros están entrecruzados por enlaces disulfuro entre sí en el dominio CH3 y con la cadena J a través del dominio CH4. IgM también puede formar hexámeros que carezcan de una cadena J en los que la multimerización se consigue mediante enlaces disulfuro entre sí. En IgA dimérica, los monómeros tienen enlaces disulfuro con la cadena J a través de su dominio CH3 y no
entre sí. Por lo tanto, en una realización, en multímeros de CTLA4-Ig, incluyendo dímeros, pentámeros y hexámeros, la parte de Ig comprende una región constante de IgM o parte de la misma o una región constante de IgA o parte de la misma. Dichos multímeros de CTLA4-Ig basados en IgM o IgA pueden incluir la cadena J.
En una realización, una molécula monomérica de CTLA4-Ig (Nº de referencia de GenBank de CTLA4 113253) comprende una región bisagra de IgG 1 humana modificada (nucleótidos 464-508 de SEC ID Nº 1; aminoácidos 152166 de SEC ID Nº 2) en la que las serinas en los restos de aminoácidos 156, 162 y 165 de SEC ID Nº 2 se han modificado por ingeniería genética a partir de cisteínas presentes en la secuencia natural.
En una realización, una molécula monomérica de CTLA4-Ig comprende una región CH2 de IgG1 humana modificada y una región CH3 natural (el dominio CH2 de IgG1 humano modificado que tiene los nucleótidos 509-838 de SEC ID Nº 1 y los aminoácidos 167-276 de SEC ID Nº 2; el dominio CH3 de IgG1 humano que tiene los nucleótidos 839-1159 de SEC ID Nº 1 y los aminoácidos 277-383 de SEC ID Nº 2).
En una realización, una población de moléculas de CTLA4-Ig comprende monómeros que tienen una secuencia mostrada en una cualquiera o más de las Figuras 7, 8 o 9 de la solicitud de patente de Estados Unidos publicada como publicación Nº US 2002/0182211 A1, y en las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas como Publicaciones Nº US20030083246 y US20040022787.
En una realización, una molécula tetramérica de CTLA4-Ig comprende dos pares o dos dímeros de polipéptidos de CTLA4-Ig, en los que cada polipéptido tiene una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) 26-383 de SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 2, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 2, (iv) 27-382 de SEC ID Nº 2, (v) 25-382 de SEC ID Nº 2, y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 2. Cada miembro del par de polipéptidos o dímero está unido covalentemente con el otro miembro, y los dos pares de polipéptidos están asociados de forma no covalente entre sí formando de este modo un tetrámero. Dichas moléculas tetraméricas son capaces de unirse a CD80 o CD86. En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden unirse a CD80 o CD86 con una avidez que es al menos 2 veces mayor que la avidez de unión de un dímero de CTLA4-Ig (cuyos monómeros tienen una de las secuencias de aminoácidos anteriores) por CD80 o CD86. En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden unirse a CD80 o CD86 con una avidez que es al menos 2 veces mayor que la afinidad de unión o avidez de CTLA4 natural por CD80 o CD86. Dicha mayor avidez puede contribuir a mayor eficacia en el tratamiento de trastornos inmunitarios y otras enfermedades como se describe posteriormente, así como en la inhibición de rechazos de trasplante de órganos sólidos y/o de tejidos. Además, una avidez mayor o mejorada puede producir el resultado de mayor potencia de un fármaco. Por ejemplo, una composición terapéutica que comprenda tetrámero de CTLA4-Ig tendría una mayor avidez y por lo tanto mayor potencia que la misma cantidad de una composición terapéutica que tenga monómero de CTLA4-Ig. En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden tener al menos una inhibición 2 veces mayor en la proliferación de linfocitos T en comparación con un dímero de CTLA4-Ig (cuyos monómeros tienen una o más las secuencias de aminoácidos anteriores). En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden tener una inhibición al menos 2 veces mayor en la proliferación de linfocitos T en comparación con una molécula de CTLA4 natural.
Monómeros, dímeros y multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig
CTLA4A29YL104E-Ig son formas modificadas de CTLA4-Ig (Figura 1A; SEC ID Nº 1-2). La modificación consiste en mutaciones puntuales que dan como resultado dos sustituciones de aminoácidos (L104E y A29Y) como se muestra en la Figura 2 (correspondiente a las posiciones de aminoácidos 55 y 130 en la Figura 3; SEC ID Nº 4). En relación con CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig (por ejemplo, SEC ID Nº 5-10) se une a CD80 (B7-1) con una avidez aumentada aproximadamente 2 veces, y se une a CD86 (B7-2) con una avidez aumentada aproximadamente 4 veces. CTLA4A29YL104E-Ig es aproximadamente 10 veces más eficaz que CTLA4-Ig en la inhibición de proliferación de linfocitos T, producción de citocinas y destrucción dependiente de CD28 de células diana por células citolíticas naturales. CTLA4A29YL104E-Ig provoca inhibición moderada de la proliferación de linfocitos T mediada por B7-1 pero es notablemente más potente que CTLA4-Ig en el bloqueo de la proliferación de linfocitos T mediada por B7-2. La potencia aumentada es comparable, bien si bloquea B7-2 solamente o si bloquea tanto B7-1 como B7-2, lo que sugiere que la actividad inmunomoduladora potenciada de CTLA4A29YL104E-Ig puede atribuirse más probablemente a la potencia aumentada para bloquear B7-2.
CTLA4A29YL104E-Ig es una proteína de fusión modificada por ingeniería genética, que consiste en el dominio de unión funcional de CTLA-4 humano modificado y el dominio Fc de inmunoglobulina humana de la clase IgG1 (Figura 3A-B). Se realizaron dos sustituciones de aminoácidos en la región de unión de B7 del dominio de CTLA-4 (L104E y A29Y) para generar una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig. Un dímero de CTLA4A29YL104E-Ig está comprendido por dos cadenas de CTLA4A29YL104E-Ig glucosiladas. Existe como un dímero covalente ligado a través de un enlace disulfuro intercatenario. Un modelo molecular de una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig se muestra en la Figura. 4. Una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tiene una masa media de aproximadamente 91.800 Da como se determina por espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
Las líneas celulares pueden tener un casete de expresión que comprenda SEC ID Nº 3. Dicho casete de expresión cuando se expresa en células de mamífero, por ejemplo células CHO, puede dar como resultado la producción de variantes N y C terminales, de modo que los polipéptidos producidos a partir del casete de expresión puedan tener la
secuencia de aminoácidos de los restos: (i) 26 -383 de SEC ID Nº 4, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 4; (iii) 27-383 de SEC ID Nº 4, o (iv) 27-382 de SEC ID Nº 4, opcionalmente (v) 25-382 de SEC ID Nº 4, o (vi) 25-383 de SEC ID Nº 4. Estos polipéptidos pueden denominarse en el presente documento “monómeros de SEC ID Nº 4” o monómeros “que tienen una secuencia SEC ID Nº 4”.
Estos monómeros de SEC ID Nº 4 pueden dimerizar, de modo que las combinaciones diméricas pueden incluir, por ejemplo: (i) y (i); (i) y (ii); (i) y (iii); (i) y (iv); (i) y (v); (i) y (vi); (ii) y (ii); (ii) y (iii); (ii) y (iv); (ii) y (v); (ii) y (vi); (iii) y (iii); (iii) y (iv); (iii) y (v); (iii) y (vi); (iv) y (iv); (iv) y (v); (iv) y (vi); (v) y (v); (v) y (vi); y (vi) y (vi). Estas diferentes combinaciones diméricas también pueden asociarse entre sí para formar moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tetraméricas. Estos monómeros, dímeros, tetrámeros y otros multímeros pueden denominarse en el presente documento “polipéptidos de SEC ID Nº 4” o polipéptidos “que tienen una secuencia de SEC ID Nº 4”. Aunque las líneas celulares pueden producir estas variantes inmediatamente después de la traducción, las variantes pueden ser más típicamente un producto de acciones post-traduccionales en las células. Los dímeros pueden unirse entre sí covalentemente, unirse entre sí de forma no covalente, o ambos. Las composiciones pueden consistir esencialmente en dímeros que están unidos covalentemente entre sí. Por ejemplo, en composiciones al menos el 50% de los dímeros de CTLA4-Ig pueden estar compuestos de monómeros unidos covalentemente. Como alternativa, en composiciones, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de los dímeros de CTLA4-Ig pueden estar compuestos de monómeros unidos covalentemente. En composiciones de moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas pueden estar predominantemente en forma dimérica, y los dímeros pueden estar predominantemente formados por enlaces covalentes. Por ejemplo, en una composición la mayoría de los dímeros de CTAL4-Ig pueden unirse covalentemente. Es posible que alguna fracción de los dímeros de CTLA4-Ig en la composición estén unidos de forma no covalente.
Las moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden incluir, por ejemplo, CTLA4A29YL104E-Ig en formas monomérica, dimérica, trimérica, tetramérica, pentamérica, hexamérica u otras multiméricas. Las moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden comprender una fusión proteica con al menos un dominio extracelular de CTLA4 modificado (SEC ID Nº 18) y una región constante de inmunoglobulina. Las moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden tener secuencias mutantes, por ejemplo, con respecto al dominio extracelular de CTLA4 modificado y secuencias de región constante de inmunoglobulina. Los monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig, solos, o en forma dimérica, tetramérica u otra multimérica, pueden estar glucosilados.
En algunas realizaciones, las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tienen al menos un cierto porcentaje de moléculas diméricas u otras multiméricas. Por ejemplo, las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden ser de más del 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99,5 % de dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig. En una realización, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig comprende de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99,5 % de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig y de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 5 % de tetrámero de CTLA4A29YL104E-Ig. En una realización adicional, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig comprende de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99,5 % de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 2,5% de monómero de CTLA4A29YL104E-Ig, y de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 5 % de tetrámero de CTLA4A29YL104E-Ig. En otra realización, la población de
CTLA4A29YL104E-Ig comprende CTLA4A29YL104E-Ig,
moléculas de aproximadamente el 96 % de dímero de aproximadamente el 2,5 % de tetrámero de CTLA4A29YL104E-Ig, y aproximadamente el 0,5 % de monómero de
CTLA4A29YL104E-Ig.
En una realización, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig está sustancialmente sin monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig. Sustancialmente sin monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig puede referirse a una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tienen menos del 1 %, 0,5 % o 0,1 % de monómeros.
En otra realización, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig está sustancialmente sin multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig que son mayores que los dímeros, tales como tetrámeros, hexámeros, etc. Sustancialmente sin multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig mayores que los dímeros puede referirse a una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tienen menos del 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig mayores que los dímeros.
Un monómero de CTLA4A29YL104E-Ig puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de: (i) 26-383 de SEC ID Nº 4, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 4 (iii) de 27-383 SEC ID Nº 4, o (iv) 27-382 de SEC ID Nº 4, u opcionalmente (v) 25382 de SEC ID Nº 4, o (vi) 25-383 de SEC ID Nº 4. Cuando un casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 3 o 23 se expresa en células CHO, la forma monomérica predominante expresada tiene el resto de aminoácido N terminal de metionina (resto 27 de SEC ID Nº 4), que corresponde al resto de aminoácido N terminal de CTLA4 humano. Sin embargo, debido a que SEC ID Nº 23 también incluye la secuencia codificante de una secuencia señal de oncostatina M (nucleótidos 11-88 de SEC ID Nº 23), la proteína expresada de SEC ID Nº 23 contiene una secuencia señal de oncostatina M.
La secuencia señal se escinde de la proteína expresada durante el proceso de la exportación de proteína desde el citoplasma, o secreción fuera de la célula. No obstante la escisión puede dar como resultado variantes N terminales, tales como escisión entre los restos de aminoácidos 25 y 26 de SEC ID Nº 4 (que dan como resultado un extremo N terminal del resto 26, es decir, la “variante de Ala”), o entre los restos de aminoácidos 24 y 25 de SEC ID Nº 4 (que dan como resultado un extremo N terminal de resto 25, es decir, la “variante de Met-Ala”), a diferencia de escisión entre los restos de aminoácidos 26 y 27 de SEC ID Nº 4 (que da como resultado un extremo N terminal que comienza con el resto Met en la posición de aminoácido 27). Por ejemplo, la variante de Met-Ala puede estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig a aproximadamente 1 %, y la variante de Ala puede
5 estar presente en una mezcla de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig a aproximadamente 10-20%.
Además, la proteína expresada a partir de un ácido nucleico que comprende SEC ID Nº 3 puede tener variantes de C terminal debido a procesamiento incompleto. El extremo C terminal predominante es la glicina en el resto 382 de SEC ID Nº 4. En una mezcla de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, pueden estar presentes monómeros que tengan lisina en el extremo C terminal (resto 383 de SEC ID Nº 4), por ejemplo, a aproximadamente 4-8%
10 En una realización, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 11 (que es la misma que los aminoácidos 25-383 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 11]
En otra realización, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC 15 ID Nº12 (que es la misma que los aminoácidos 26-383 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 12]
En una realización adicional, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 13 (que es la misma que los aminoácidos 27-383 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 13]
En otra realización, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº14 (que es la misma que los aminoácidos 25-382 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 14]
En una realización, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 15 (que es la misma que los aminoácidos 26-382 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 15]
En una realización adicional, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de SEC IDNº 16 (que es la misma que los aminoácidos 27-382 de SEC ID Nº 4):
[SEC ID Nº 16]
Un monómero de CTLA4A29YL104E-Ig comprende un dominio extracelular de CTLA4 humano, en el que se realizaron dos sustituciones de aminoácidos en el dominio de CTLA-4 (L104E y A29Y) (Figura 5). En una realización, el dominio extracelular puede comprender la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº 23 que codifican los aminoácidos 27-151 de SEC ID Nº 4. En otra realización, el dominio extracelular puede comprender las secuencias mutantes de CTLA4 humano (tales como mutantes de sitio único, doble y triple en los aminoácidos 27151 de SEC ID Nº 4). En otra realización, el dominio extracelular puede comprender cambios de nucleótidos a nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº 23 de modo que se realicen cambios de aminoácidos conservativos. En una realización adicional, el dominio extracelular puede comprender cambios de nucleótidos a nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº 23 de modo que se realicen cambios de aminoácidos no conservativos. En otra realización, el dominio extracelular puede comprender una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a los nucleótidos 89-463 de SEC ID Nº 23.
Un monómero de CTLA4A29YL104E-Ig puede comprender una región constante de una inmunoglobulina humana. Esta región constante puede ser una parte de una región constante. Esta región constante también puede tener una secuencia natural o mutante. La región constante puede ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE. La región constante puede ser de una cadena ligera o una cadena pesada de una inmunoglobulina. Cuando la región constante es de una molécula de IgG, IgD o IgA, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL,CH1, bisagra, CH2oCH3. Cuando la región constante es de IgM o IgE, la región constante puede comprender uno o más de los siguientes dominios de región constante: CL,CH1, CH2, CH3o CH4. En una realización, la región constante puede comprender uno o más dominios de región constante de IgG, IgD, IgA, IgM o IgE.
En una realización, los dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig están comprendidos por dos monómeros, en los que cada monómero puede tener la misma o diferente secuencia de aminoácidos, y en los que la secuencia puede ser la secuencia de aminoácidos de: (i) 26-383 de SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 4, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 4,
(iv) 27-382 de SEC ID Nº 4, (v) 25-382 de SEC ID Nº 4, y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 4. Dichos monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig pueden dimerizar a través del dominio extracelular de la secuencia de CTLA4 humana mediante un resto de aminoácido de cisteína en la posición 146 de SEC ID Nº 4 (o resto de aminoácido cisteína en la posición 120 de la Figura 5).
Una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig puede multimerizar mediante la interacción de dominios de región constante de IgM o IgA con una proteína de cadena J. IgM e IgA habitualmente se producen como multímeros en asociación con una cadena polipeptídica adicional, la cadena J. En IgM pentamérico, los monómeros se entrecruzan por enlaces disulfuro entre sí en el dominio CH3 y con la cadena J mediante el dominio CH4. IgM también puede formar hexámeros que carecen de una cadena J en los que se consigue multimerización mediante enlaces disulfuro entre sí. En IgA dimérico, los monómeros tienen enlaces disulfuro con la cadena J mediante su dominio CH3 y no entre sí. Por lo tanto, en una realización, en multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig, incluyendo dímeros, pentámeros y hexámeros, la parte de Ig comprende una región constante de IgM o parte de la misma o una región constante de IgA o parte de la misma. Dichos multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig basados en IgM o IgA pueden incluir la cadena J.
En una forma de realización, un monómero de CTLA4A29YL104E-Ig comprende una región bisagra de IgG1 humana modificada (nucleótidos 464-508 de SEC ID Nº 23; aminoácidos 152-166 de SEC ID Nº 4) en la que los restos de serina en las posiciones 156, 162 y 165 de SEC ID Nº 4 se han modificado por ingeniería genética de restos de cisteína presentes en la secuencia natural.
En una realización, un monómero de CTLA4A29YL104E-Ig comprende una región CH2 de IgG1 humana modificada y una región CH3 natural (el dominio CH2 de IgG1 humano modificado que tiene los nucleótidos 509-838 de SEC ID Nº 1 y los aminoácidos 167-276 de SEC ID Nº 2; el dominio CH3 de IgG1 humano que tiene los nucleótidos 839-1159 de SEC ID Nº 1 y los aminoácidos 277-383 de SEC ID Nº 2).
En una realización, una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig comprende monómeros que tienen una
secuencia mostrada en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº U.S. 2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859 y U.S. 2005/0084933 y Patente de Estados Unidos Nº
7.094.874.
En una realización, un tetrámero de CTLA4A29YL104E-Ig comprende dos pares o dos dímeros de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, en los que cada polipéptido tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) 26-383 de SEC ID Nº 4, (ii) 26-382 de SEC ID Nº 4, (iii) 27-383 de SEC ID Nº 4, (iv) 27-382 de SEC ID Nº 4, (v) 25-382 de SEC ID Nº 4, y (vi) 25-383 de SEC ID Nº 4. Cada miembro del par de polipéptidos o dímero está unido covalentemente con el otro miembro, y los dos pares de polipéptidos están asociados de forma no covalente entre sí formando de este modo un tetrámero. Dichas moléculas tetraméricas son capaces de unirse a CD80 o CD86. En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden unirse a CD80 o CD86 con una avidez que es al menos 2 veces mayor que la avidez de unión de un dímero de CTLA4A29YL104E-Ig (cuyos monómeros tienen una de las secuencias de aminoácidos anteriores) por CD80 o CD86.
Dicha avidez mayor puede contribuir a mayor eficacia en el tratamiento de trastornos inmunitarios y otras enfermedades como se describe posteriormente, así como en la inhibición de rechazos de trasplante de órganos sólidos y/o tisulares. Además, una avidez mayor o mejorada puede producir el resultado de mayor potencia de un fármaco. Por ejemplo, una composición terapéutica que comprende tetrámero de CTLA4A29YL104E-Ig tendría una mayor avidez y por lo tanto mayor potencia que la misma cantidad de una composición terapéutica que tuviera monómero de CTLA4A29YL104E-Ig. En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden tener una inhibición al menos 2 veces mayor en la proliferación de linfocitos T en comparación con dímero de CTLA4A29YL104E-Ig (cuyos monómeros tienen una de las secuencias de aminoácidos anteriores). En otra realización, dichas moléculas tetraméricas pueden tener al menos una inhibición 2 veces mayor en la proliferación de linfocitos T en comparación con una molécula tetramérica de CTLA4-Ig.
Caracterización de moléculas de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig
La proliferación de linfocitos T puede medirse usando ensayos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, una de las formas más habituales para evaluar la proliferación de linfocitos T es estimular los linfocitos T mediante anticuerpos antigénicos o agonistas para TCR y medir, por ejemplo, la incorporación de timidina tritiada (3H-TdR) en la proliferación de linfocitos T o la cantidad de citocinas liberadas por linfocitos T proliferantes al cultivo. El efecto inhibidor de moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig sobre la activación o proliferación de linfocitos T puede por lo tanto medirse.
La afinidad de una molécula de CTLA4-Ig es la fuerza de unión de la molécula con un único ligando, incluyendo CD80, CD86 o proteínas de fusión CD80Ig o CD86Ig. La afinidad de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig por los ligandos puede medirse, por ejemplo, usando análisis de interacción de unión (BIA) basado en la técnica de plasmón superficial. Aparte de medir la fuerza de unión, permite determinar en tiempo real la cinética de unión, tal como constantes de velocidad de asociación y disociación. Una microplaca sensora, que consiste en un portaobjetos de vidrio revestido con una película metálica fina, a la que se une covalentemente una matriz de superficie, se reviste con uno de los agentes que interaccionan, es decir, CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig o uno de los ligandos. Se permite que una solución que contiene el otro agente de interacción fluya sobre su superficie. Se dirige un haz de luz continuo contra el otro lado de la superficie, y se mide su ángulo de reflexión. Al unirse CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig con el ligando, el ángulo de resonancia del haz de luz cambia (ya que depende del índice refractario del medio cerca del lado reactivo del sensor, que a su vez se correlaciona directamente con la concentración de material disuelto en el medio). Se analiza posteriormente con la ayuda de un ordenador.
En una realización, los experimentos de unión a CTLA4-Ig pueden realizarse por resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento BIAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suecia). La CTLA4-Ig puede acoplarse covalentemente mediante grupos amina primarios a una matriz de dextrano carboximetilada en una microplaca detectora BIAcore, inmovilizando así la CTLA4-Ig en la microplaca detectora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-región constante para inmovilizar a la CTLA4-Ig indirectamente en la superficie detectora mediante el fragmento Ig. Después de esto, se añaden ligandos a la microplaca para medir la unión de CTLA4-Ig a los ligandos. Pueden realizarse mediciones de afinidad, por ejemplo, como se describe en van der Merwe, P. y col., J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404. En otra realización, pueden realizarse experimentos de unión a CTLA4A29YL104E-Ig usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (RPS) como se ha descrito anteriormente (FIG. 6; véase el EJEMPLO 21).
También puede medirse la avidez de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig. La avidez puede definirse como la suma total de la fuerza de unión de dos moléculas o células entre sí en sitios múltiples. La avidez es distinta de la afinidad, que es la fuerza de unión de una molécula con su ligando en un sitio. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, una mayor avidez de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig puede conducir a aumentar la potencia de inhibición por las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig sobre la proliferación y activación de linfocitos T. La avidez puede medirse, por ejemplo, mediante dos categorías de ensayos en fase sólida: a) ensayos de inhibición competitiva, y b) ensayos de elución. En ambos ensayos, el ligando está unido a un soporte sólido. En el ensayo de inhibición competitiva, las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig se añaden después en solución a una concentración fija, junto con el ligando libre a diferentes concentraciones, y se determina la cantidad de
ligando que inhibe la unión en fase sólida al 50%. Cuanto menos ligando se necesite, más fuerte es la avidez. En los ensayos de elución, el ligando se añade en solución. Después de obtener un estado de equilibrio, se añade un agente caotrópico o desnaturalizante (por ejemplo isotiocianato, urea o dietilamina) a diferentes concentraciones para alterar las interacciones CTLA4-Ig/ligando o las interacciones CTLA4A29YL104E-Ig/ligando. La cantidad de elución resistente a CTLA4-Ig o a CTLA4A29YL104E-Ig se determina después de esto con un ensayo ELISA. Cuanto mayor es la avidez, mayor es la cantidad de agente caotrópico necesaria para eluir una determinada cantidad de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig. La avidez relativa de una mezcla heterogénea de moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig puede expresarse como el índice de avidez (IA), igual a la concentración de agente de elución necesaria para eluir el 50% de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig unidas. Pueden realizarse análisis de datos refinados determinando porcentajes de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig eluidas a diferentes concentraciones del agente de elución.
Para reducir la cantidad de especies de alto peso molecular (APM) de CTLA4-Ig eluida en una etapa de purificación por CIH (véase el Ejemplo 15) puede usarse un proceso de cromatografía en columna Sepharose 4Fast Flow, Cromatografía de Interacción Hidrófoba (CIH). Por lo tanto, el pico de eliminación de la columna de CIH es rico en especies de APM de CTLA4-Ig. Por ejemplo, puede emplearse SEC HPLC en columna preparatoria sencilla o en tándem para purificar subpoblaciones de dímeros, tetrámeros y multímeros de material pico de eliminación CIH. En una realización, los componentes purificados son dímeros, tetrámeros y hexámeros de CTLA4-Ig. La caracterización de componentes de alto peso molecular de CTLA4-Ig presentes en el pico de eliminación CIH puede realizarse mediante técnicas de dispersión de luz estática y dinámica. Las muestras tomadas en la etapa del proceso de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) buscan revelar la presencia de dímeros, tetrámeros y multímeros a diversos momentos del muestreo. Las especies hexaméricas pueden detectarse solo en muestras correspondientes al “inicio del pico de eliminación” y a la “DO máxima del pico de eliminación”. Las especies decaméricas solo se detectaron en la “DO máxima del pico de eliminación”. La masa molar y la formación del radio hidrodinámico pueden determinarse por fraccionamiento mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) empleando dispersión de luz multiángulo (MALS) acoplada con detección de dispersión de luz casi elástica (QELS).
Con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig producidas a partir de la línea celular, la SEC demuestra que el eluado de Proteína A es una mezcla de componentes multiméricos, tetraméricos y diméricos. El fraccionamiento de esta mezcla en columna SEC preparatoria o en tándem permite aislar cantidades de especies multiméricas, tetraméricas y diméricas. La recuperación porcentaje del área de cada componente en análisis SEC de las fracciones aisladas da como resultado una homogeneidad del 93-98% para cada fracción. En un aspecto, la purificación de los componentes individuales permite comparar las propiedades fisicoquímicas de los componentes de material de APM de CTLA4-Ig con las del dímero de CTLA4-Ig. La FIG. 7 muestra los pesos moleculares aparentes, que corresponden a fracciones multiméricas, tetraméricas y diméricas del pico de eliminación CIH de CTLA4-Ig, determinado por SEC con detección de dispersión de luz dinámica (DSL) y tiempo de retención en SEC. En una realización, la actividad de unión bioespecífica de componentes purificados del pico de eliminación CIH es comparable a la actividad de unión determinada por BIAcore basándose en el ensayo de unión B7-1Ig inmovilizado. En otro aspecto, la proporción molar de ácido siálico para componentes aislados de pico de eliminación CIH está en el intervalo de 4,9 a 7,6 mientras que la proporción molar de ácido siálico de moléculas o dímeros CTLA4-Ig (no en el pico de eliminación CIH) está en el intervalo de 8-10. El análisis por gel de IEF reduce la movilidad de isoformas CTLA4-Ig purificadas del pico de eliminación CIH en comparación con la migración del dímero CTLA4-Ig. Esto es coherente con las proporciones molares de ácido siálico más bajas observadas para las fracciones del pico de eliminación CIH de CTLA4-Ig (FIG. 8).
La elección de las condiciones del cultivo celular pueden influenciar en la formación de especies monocatenarias (es decir, monoméricas) y de alto peso molecular (es decir dímeros, tetrámeros, etc.) de un producto de proteína recombinante. Las condiciones de cultivo, incluyendo también, sin limitación, composición de medios, son factores que pueden influir en la formación de especies monocatenarias y en el nivel de cisteinilación. Esto es probablemente el resultado de la presencia de agentes que conducen a la reducción de enlaces disulfuro. La complementación de medios que contienen cisteína o directamente de cisteína a células que segregan CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig puede dar como resultado una rápida formación de especies monocatenarias y de alto peso molecular. La tasa es proporcional a la cantidad de cisteína añadida. En otra realización, la complementación de yodoacetamida, un compuesto que reacciona con sulfidrilos libres, bloquea la formación de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig que son dependientes de enlaces disulfuro.
Por ejemplo, la ruta de especies de alto peso molecular sensible y no sensible a yodoacetamida destaca dos mecanismos principales y claramente diferentes mediante los cuales pueden formarse especies de alto peso molecular en CTLA4-Ig. La complementación de altas concentraciones salinas (0,5 M) a soluciones de CTLA4-Ig da como resultado una tasa rápida, prolongada, de formación de especies de alto peso molecular. El EDTA, ConAcidSol II y los yeastolatos aumentan moderadamente la formación de especies monocatenarias (véase el Ejemplo 5).
Pueden generarse poblaciones de CTLA4-Ig de alto peso molecular por procedimientos, en los que las mezclas que contienen predominantemente monómeros o dímeros de CTLA4-Ig se complementan con altas concentraciones salinas de tal manera que la mezcla tiene una concentración salina mayor de aproximadamente 0,3, 0,4, 0,45, 0,5, o 0,6 M. Dichos procedimientos pueden generar una mezcla que comprenda una población de CTLA4-Ig que tenga al
menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig.
Puede producirse una población de especies monocatenarias de CTLA4-Ig que contenga una modificación en Cys146 de tal manera que esté cisteinilada (véase el Ejemplo 4) puede producirse. La cisteinilación es una modificación postraduccional en la que una cisteína, dentro de una cadena polipeptídica, se modifica por la unión de otra cisteína a través de un enlace disulfuro. La cisteinilación de las proteínas se ha implicado en la modificación de la bioactividad de las proteínas incluyendo la inmunogenicidad y antigenicidad de determinantes virales limitados al MHC de Clase I. La composición puede comprender al menos el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 90 o 95% de moléculas de CTLA4-Ig monocatenarias cisteiniladas. La población de CTLA4-Ig puede tener no más de aproximadamente el 1% de moléculas monoméricas CTLA4-Ig o, en otra realización, menos del 0,6% de moléculas monoméricas CTLA4-Ig.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5 a aproximadamente 18. En algunas realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 e Y es aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18. En otras realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0 e Y es aproximadamente 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10,0. En otras realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 o 9,0 e Y es aproximadamente 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 o 13,0. En otras realizaciones, la proporción molar media del ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 7 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 11. En otras realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 9,5, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En otras realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es mayor que o igual a 5, o mayor que o igual a 8. En determinadas realizaciones, el ácido siálico es ácido N-acetil neuramínico (NANA).
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de ácido N-glucolil neuramínico (NGNA) con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig menor que o igual a 2,5, menor que o igual a 2,0, menor que o igual a 1,5, menor que o igual a 1,0 o menor que o igual a 0,5.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser dímeros de CTLA4-Ig mayores que o iguales a un porcentaje de área de 93,0, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 93,5, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 94,0, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 94,5, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 95,0, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 95,5, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 96,0, mayores que o iguales a un porcentaje de área de 96,5, o mayores que o iguales a un porcentaje de área de 97,0, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En algunas realizaciones, la composición comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros de CTLA4-Ig mayores que o igual a un porcentaje de área de 95,0 y especies de alto peso molecular menores que o iguales a un porcentaje de área de 4,0, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En algunas realizaciones, la composición comprende moléculas de CTLA4-Ig, en la que las moléculas de CTLA4-Ig son dímeros mayores que o iguales a un porcentaje de área de 95,0, y especies de alto peso molecular menores que o iguales a un porcentaje de área de 5,0, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser monómeros (es decir, moléculas monocatenarias) menores que o iguales a un porcentaje de área de 2,0, menores que o iguales a un porcentaje de área de 1,5, menores que o iguales a un porcentaje de área de 1,0, o menores que o iguales a un porcentaje de área de 0,5, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser especies de alto peso molecular (por ejemplo, tetrámeros) menores que o iguales a un porcentaje de área de 2,0, menores que o iguales a un porcentaje de área de 1,5, menores que o iguales que un porcentaje de área de 1,0, o menores que o iguales a un porcentaje de área de 0,5, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica. En algunas realizaciones, especialmente aquellas que implican composiciones concentradas que comprenden moléculas de CTLA4-Ig (tales como, por ejemplo, aquellas para administración subcutánea), las moléculas de CTLA4-Ig son especies de alto peso molecular menores que o iguales a un porcentaje de área de 10, menores que o iguales a un porcentaje de área de 9, menores que o iguales a un porcentaje de área 8, menores que
o iguales a un porcentaje de área de 7, menores que o iguales a porcentaje de área de 6, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de material MCP-1 o
similar a MCP-1 menor que o igual a 50 ppm, menor que o igual a 40 ppm, menor que o igual a 38 ppm, menor que
o igual a 30 ppm, menor que o igual a 20 ppm, menor que o igual a 10 ppm, 5 ppm, menor que o igual a 4 ppm, menor que o igual a menos de o igual a 3 ppm, menor que o igual a 2 ppm o menor que o igual a 1 ppm. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender material MCP-1 o similar a MCP-1 menor que o igual a 50 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 40 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 38 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 30 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 20 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 10 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 5 ng/mg, menor que o igual a 4 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig o menor que o igual a 1 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig. Una composición puede comprender moléculas de CTLA4-Ig y una cantidad de MCP-1 (incluyendo la ausencia de MCP-1) en la que dicha composición es una composición farmacéuticamente aceptable.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 19. En algunas realizaciones, la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente X a aproximadamente Y, donde X es aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, e Y es aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otras realizaciones la proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre de aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10,0 e Y es aproximadamente 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5 o 16,0. En otras realizaciones, la proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es entre de aproximadamente X a aproximadamente X, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 u 8,0 e Y es aproximadamente 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5 o 19,0. En otras realizaciones la proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 7 a aproximadamente 15, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, de aproximadamente 9 a aproximadamente 13, de aproximadamente 10 a aproximadamente 12. En otras realizaciones la proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 7 a aproximadamente 18, de aproximadamente 8 a aproximadamente 17, de aproximadamente 9 a aproximadamente 17, de aproximadamente 9 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 15. En otras realizaciones la proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es mayor que o igual a 8.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 12. En algunas realizaciones la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 o 4,5 e Y es aproximadamente 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 o 10,5. En otras realizaciones la proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 2,9, 3,1, 3,3, 3,5, 3,7, 3,9 o 4,1 e Y es aproximadamente 7,9, 8,1, 8,3, 8,5, 8,7, 8,9 o 9,1. En otras realizaciones la proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 1,0, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1, 2,3 o 2,5 e Y es aproximadamente 8,7, 8,9, 9,1, 9,3, 9,6, 9,9, 10,1, 10,3 o 10,5. En otras realizaciones la proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3, de aproximadamente 3,7 a aproximadamente 8,1, de aproximadamente 3,9 a aproximadamente 7,9. En otras realizaciones, la proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 9,5, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 9,3, de aproximadamente 1,9 a aproximadamente 9,1 o de aproximadamente 2,1 a aproximadamente 8,9. En otras realizaciones la proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es mayor que o igual a 1,7.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. En algunas realizaciones la proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21, e Y es aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24. En otras realizaciones la proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 6,5, 7,0, 7,5, 7,7, 7,9, 8,1, 8,3, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5 o 12,0 e Y es aproximadamente 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23, 23,5 o 24,0. En otras realizaciones la proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de entre aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 8, 8,5, 9,0, 9,5 10,0 o 11,0 e Y es aproximadamente 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 o 20,0. En otras realizaciones la proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 6 a aproximadamente 23, de aproximadamente 7 a aproximadamente 22, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 22, de aproximadamente 8 a aproximadamente 21, de aproximadamente 9 a aproximadamente 20, de aproximadamente 10 a aproximadamente 19, de aproximadamente 11 a aproximadamente 19 y de aproximadamente 11 a
aproximadamente 17. En otras realizaciones la proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 8 a aproximadamente 19, de aproximadamente 9 a aproximadamente 18, de aproximadamente 10 a aproximadamente 17 o de aproximadamente 11 a aproximadamente 16. En otras realizaciones la proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4 -Ig es mayor que o igual a 7.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser especies oxidadas con un porcentaje de área menor que o igual a 5,0, menor que o igual 4,5, menor que o igual a 4,0, menor que o igual a 3,5, menor que o igual a 3,0, menor que o igual a 2,5, menor que o igual a 2,0, menor que o igual a 1,5, menor que o igual a 1,0 o menor que o igual a 0,5. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden ser especies desaminadas con un porcentaje de área menor que o igual a 5,0, menor que o igual a 4,5, menor que o igual a 4,0, menor que o igual a 3,5, menor que o igual a 3,0, menor que o igual a 2,5, menor que o igual a 2,0, menor que o igual a de 1,5, menor que o igual a 1,0 o menor que o igual a 0,5. En algunas realizaciones, la composición comprende moléculas de CTLA4-Ig, en las que las moléculas de CTLA4-Ig son especies oxidadas con un porcentaje de área menor que, o igual a, 3,5, y especies desaminadas con un porcentaje de área menos que, o igual a, 2,5
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden comprender endotoxinas bacterianas, según ensayo LAL, en una cantidad menor que o igual a 0,7 UE/mg, menor que o igual a 0,6 UE/mg, menor que o igual a 0,5 UE/mg, menor que o igual a 0,42 UE/mg, menor que o igual a 0,4 UE/mg, menor que o igual a 0,35 UE/mg, menor que o igual a 0,3 UE/mg, menor que o igual 0,25 UE/mg, menor que o igual a 0,20 UE/mg, menor que o igual a 0,15 UE/mg o menor que o igual a 0,05 UE/mg.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una biocarga menor que o igual a 2 UFC/10 ml, menor que o igual a 1,5 UFC/10 ml, menor que o igual a 1 UFC/10 ml o menor que o igual a 0,5 UFC/10 ml.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de ADN menor que o igual a 25 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 20 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 15 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 10 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 5,0 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 4,0 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,5 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,0 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2,5 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,5 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,0 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 0,5 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o menor que o igual a 0,20 pg/ml en las moléculas de CTLA4-Ig.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de proteína celular (por ejemplo, proteína CHO o CHOP) menor que o igual a 200 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 150 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 125 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que
o igual a 100 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 90 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 80 ng/mg moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 70 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 60 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 50 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 40 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 30 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 25 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 20 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 15 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 10 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o menor que o igual a 5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de proteína celular menor que o igual a 200 ppm, menor que o igual a 150 ppm, menor que o igual a 125 ppm, menor que o igual a 100 ppm, menor que o igual a 90 ppm, menor que o igual a 80 ppm, 70 ppm, menor que o igual a 60 ppm, menor que o igual a 50 ppm, menor que o igual a 40 ppm, menor que o igual a 30 ppm, menor que o igual a 25 ppm, menor que o igual a 20 ppm, menor que o igual a 15 ppm, menor que o igual a 10 ppm o menor que o igual a 5 ppm.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de Triton-X (por ejemplo, Triton X-100) menor que o igual a 4,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o menor que o igual a 0,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de Triton-X menor que o igual a 4,0 ppm, menor que o igual a 3,5 ppm, menor que o igual a 3,0 ppm, menor que o igual a 2,5 ppm, menor que o igual a 2,0 ppm, menor que o igual a 1,5 ppm, menor que o igual a 1,0 ppm, o menor que o igual a 0,5 ppm.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de Proteína A menor que
o igual a 8,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 7,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 7,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 6,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 6,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 5,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 5,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 4,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 4,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 3,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 2,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig, menor que o igual a 1,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o menor que o igual a 0,5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig. Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender una cantidad de Proteína A menor que o igual a 8,0 ppm, menor que o igual a 7,5 ppm, menor que o igual a 7,0 ppm, menor que o igual a 6,5 ppm, menor que o igual a 6,0 ppm, menor que o igual a 5,5 ppm, menor que o igual a 5,0 ppm, menor que o igual a 4,5 ppm, menor que o igual a 4,0 ppm, menor que o igual a 3,5 ppm, menor que o igual a 3,0 ppm, menor que o igual a 2,5 ppm, menor que o igual a 2,0 ppm, menor que o igual a 1,5 ppm, menor que o igual a 1,0 ppm o menor que o igual a 0,5 ppm.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 10 a aproximadamente 40. En algunas realizaciones la proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es cualquier número entero entre 10 y 39 e Y es cualquier número entero entre 11 y 40. En otras realizaciones, la proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es entre aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 12, 14, 14, 15, 16 o 17, e Y es aproximadamente 32, 33, 34, 35, 36 o 37. En otras realizaciones la proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 12 a aproximadamente 35, de aproximadamente 13 a aproximadamente 35, de aproximadamente 14 a aproximadamente 35, de aproximadamente 15 a aproximadamente 35.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden tener una proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones la proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es entre aproximadamente X a aproximadamente Y, incluyendo X e Y, donde X es 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2,0 e Y es 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, ,46, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 6,0, 7,0 o 8,0. En otras realizaciones la proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es entre de aproximadamente X a Y, incluyendo X e Y, donde X es aproximadamente 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0, e Y es aproximadamente 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1 o 4,2. En otras realizaciones la proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 4,1, de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,9, o de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,8, o de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 3,7. En otras realizaciones, la proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig es de aproximadamente 1,6 a aproximadamente 3,7, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6, de aproximadamente 1,8 a aproximadamente 3,5, o de aproximadamente 1,9 a aproximadamente 3,4.
En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig la composición de CTLA4-Ig puede presentar las siguientes bandas, en intervalos de pl determinados en un gel de isoelectroenfoque (gel de IEF): de aproximadamente 10 a aproximadamente 22 bandas en el intervalo de pl de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,6; intensidad acumulativa de bandas de aproximadamente 90% a aproximadamente 110% en un intervalo de pl de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,3 y aproximadamente 3 bandas principales en un intervalo de pl de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2. En una realización, las bandas en el intervalo de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,6 son de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 6 a aproximadamente 29, de aproximadamente 7 a aproximadamente 28, de aproximadamente 8 a aproximadamente 27, de aproximadamente 9 a aproximadamente 26, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25, de aproximadamente 11 a aproximadamente 24, de aproximadamente 12 a aproximadamente 23, de aproximadamente 13 a aproximadamente 22, de aproximadamente 14 a aproximadamente 21, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 16 a aproximadamente 19, de aproximadamente 17 a aproximadamente 20, de aproximadamente 18 a aproximadamente 19.
Moléculas de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig glucosiladas y sus poblaciones
Sin limitación, la glucosilación puede referirse a la adición de estructuras de oligosacáridos complejos a una proteína en sitios específicos dentro de la cadena polipeptídica. La glucosilación de proteínas y el posterior procesamiento de los carbohidratos añadidos pueden influir en el plegamiento, estructura y estabilidad de las proteínas, incluyendo la semivida de las proteínas y propiedades funcionales de una proteína. La glucosilación de proteínas puede dividirse en dos clases, en virtud del contexto de secuencia en el que se produce la modificación, O-glucosidación y Nglucosilación. Los polisacáridos ligados a O están unidos a un grupo hidroxilo, normalmente al grupo hidroxilo de cualquier resto de serina o treonina. Los O-glucanos no están añadidos a cada resto de serina y treonina. Los oligosacáridos ligados a O son normalmente mono o biantenarios, es decir, comprenden una o a lo sumo dos ramas (antenas), y comprenden de uno a cuatro tipos de restos de azúcar diferentes, que se añaden de uno en uno.
Los polisacáridos ligados a N están unidos al nitrógeno amida de una asparagina. Únicamente las asparaginas que forman parte de una de dos secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina (donde X es cualquier aminoácido excepto prolina), son dianas de glucosilación. Los oligosacáridos ligados a N, denominados mono-, bi-tri-antenarios, pueden tener de una a cuatro ramas. Las estructuras de y los restos de azúcar encontrados en un oligosacárido unido a N y unido a O son diferentes. A pesar de esta diferencia, el resto terminal de cada rama, tanto del polisacárido unido a N como del que está unido a O, puede modificarse por una molécula de ácido siálico, una modificación denominada protección de ácidos siálicos. El ácido siálico es un nombre común de una familia de monosacáridos de nueve carbonos única, que puede unirse a otros oligosacáridos. Son dos miembros de familia el ácido N-acetil neuramínico, abreviado como Neu5Ac o NANA, y el ácido N-glucolil neuramínico, abreviado como Neu5Gc o NGNA.
La forma más común del ácido siálico en seres humanos es NANA. El ácido N-acetil neuramínico (NANA) es la especie de ácido siálico principal presente en las moléculas de CTLA4-Ig. Sin embargo, debe observarse que en las moléculas de CTLA4-Ig también están presentes menores niveles, aunque detectables, de ácido N-glucolil neuramínico (NGNA). Adicionalmente, el procedimiento descrito en el presente documento puede usarse para determinar el número de moles de ácidos siálicos, tanto de NANA como de NGNA, y por lo tanto se determinan los niveles tanto de NANA como de NGNA y se describen para moléculas de CTLA4-Ig. Los oligosacáridos ligados a N y ligados a O tienen diferentes números de ramificaciones, que proporcionan diferentes números de posiciones a los que pueden unirse las moléculas de ácido siálico. Los oligosacáridos ligados a N pueden proporcionar hasta cuatro posiciones de unión para los ácidos siálicos, mientras que los oligosacáridos ligados a O pueden proporcionar dos sitios para unión del ácido siálico.
Las proteínas glucosiladas (glucoproteínas), muchas de las cuales se han producido por procedimientos de tecnología de ADN recombinante, son de gran interés como agentes de diagnóstico y terapéutico. Muchas proteínas transmembrana eucariotas destinadas a la superficie celular y proteínas segregadas se modifican postraduccionalmente para incorporar grupos carbohidrato ligados a N o ligados a O. Los oligosacáridos ligados a N están unidos a restos de asparagina cuando forman parte del motivo peptídico Asn-X-Ser/Thr, en el que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. Los oligosacáridos ligados a O están unidos a restos de serina o treonina. Las estructuras de oligosacáridos ligados a N y ligados a O, así como los restos de azúcar encontrados en cada uno pueden ser diferente. Un tipo de azúcar que normalmente se encuentra en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (NANA; en lo sucesivo en el presente documento denominado ácido siálico). Normalmente, el ácido siálico es el resto terminal de ambos oligosacáridos ligados a N y ligados a O. La glucoproteína, debido a su carga negativa, puede presentar propiedades ácidas.
Las proteínas glucosiladas pretenden desempeñar funciones aumentando el plegamiento de la proteína, regulando la ordenación y el tránsito celular, previniendo la agregación de proteínas, mediando la adhesión célula-célula, e incrementando la resistencia a la proteólisis. En organismos eucariotas, la naturaleza y grado de glucosilación puede tener un profundo impacto sobre la semivida circulante y la bioactividad de agentes terapéuticos glucoproteínicos mediante procesos que implican endocitosis y eliminación mediadas por receptores. Se piensa que los sistemas mediados por receptores desempeñan una función principal en la eliminación de glucoproteínas séricas reconociendo los diversos componentes de azúcar del oligosacárido. Un grupo de ácido siálico terminal de una glucoproteína puede influir en la absorción, semivida y eliminación sérica. Por tanto, las estrategias de producción de glucoproteínas, que conservan el componente de ácido siálico terminal de la proteína glucosilada, pueden mejorar el aumento de la biodisponibilidad de la proteína y la semivida en suero. Se han investigado diversos parámetros de procesos de producción que están relacionados con la síntesis de glucoproteínas recombinantes, especialmente el efecto de la composición de medios y cambios de temperatura en diversas estrategias de producción.
Los dímeros de CTLA4-Ig compuestos de monómeros que tienen la secuencia de aminoácidos de los restos (i) 26383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2,
(v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2, o (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2, pueden tener un PM teórico previsto de aproximadamente 78.000 a 79.000 Daltons. Sin embargo, el PM de dichos dímeros, obtenido por MALDI-TOF, es de aproximadamente 91.000 Daltons. Esta diferencia en el PM de aproximadamente 13.000-14.000 Daltons se debe, al menos en parte, a la glucosilación, que en una realización, representa aproximadamente el 15% de la masa de esta molécula monomérica de CTLA4-Ig particular. Los monómeros especificados anteriormente tienen tres sitios de glucosilación ligados a N que, por mapeo peptídico, se ha confirmado que se produce en las asparaginas en los restos 102, 134 y 233 de la SEC ID Nº: 2. Las moléculas de carbohidrato que están unidas a través de asparagina pueden escindirse selectivamente usando la enzima Péptido-N glucosidasa F (PNGasa F). En un caso, el tratamiento del monómero que tiene la secuencia 27-383 de la SEC ID Nº: 2 con PNGasa F da como resultado especies con un PM de aproximadamente 80.200 Daltons, y dado que el PM teórico de este monómero es de aproximadamente 80.200, el tratamiento sugiere que los 1.400 Daltons no encontrados (80.200 -78.800 = 1.400) puede deberse a la O-glucosilación. Aunque existen numerosos restos de serina y de treonina que tienen el potencial de ser sitios de glucosilación, solo se han identificado dos sitios ligados a O: Ser155 y Ser165 de la SEC ID Nº: 2. En una realización, el glucano predominante unido a estos dos sitios es HexNAc-Hex-NeuAc.
Por ejemplo, la FIG 9 representa una visión general de las estructuras carbohidrato unidas a N o unidas a O en moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros que tienen una secuencia de la SEC ID Nº: 2 moléculas (es decir, un monómero que tiene una de las siguientes secuencias: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2), (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2, o (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2 en el que en una realización se producen dichas moléculas, con las características carbohidrato mostradas, mediante la línea celular descrita en el presente documento o su progenie de acuerdo con el procedimiento de producción descrito en los Ejemplos 14-15 y también mostrados en la Figura 10. Las estructuras principales indicadas para cada sitio están basadas en las técnicas ortogonales (véase en el presente documento). Para cada estructura hay un porcentaje estimado de esa estructura observado durante estos experimentos. Estos porcentajes representan las mejores estimaciones de las técnicas ortogonales.
Los dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig compuestos de monómeros que tienen la secuencia de restos de aminoácidos (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4 o (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4, pueden tener un PM teórico previsto de aproximadamente 78.000 a aproximadamente 79.000 Daltons. Sin embargo, el PM de dichos dímeros, obtenido por MALDI-TOF, es de aproximadamente 91.500 Daltons. Esta diferencia de PM de aproximadamente 12.000-13.000 Daltons se debe, al menos en parte, a la glucosilación. Los monómeros especificados anteriormente tienen tres sitios de N-glucosilación que, por mapeo peptídico, se ha confirmado que se produce en las asparaginas en los restos 102, 134 y 233 de la SEC ID Nº: 4 (N76, N108 y N207 de la FIG. 4). Las moléculas de carbohidrato que están unidas a través de asparagina pueden escindirse selectivamente usando la enzima Péptido-N Glucosidasa F (PNGasa F). Aunque existen numerosos restos de serina y de treonina que tienen el potencial de ser sitios de glucosilación, solo se han identificado tres sitios ligados a O: Ser149, Ser155 y Ser165 de la SEC ID Nº: 3 (véase la Tabla 25 en el EJEMPLO 22). En una realización, el glucano predominante unido a estos sitios es HexNAc-Hex-NeuAc.
En determinadas realizaciones, las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig son glucoproteínas que pueden producirse mediante los procedimientos de cultivo descritos en el presente documento. En una realización, las glucoproteínas CTLA4-Ig se modifican con oligosacáridos que representan aproximadamente el 15% (p/p) de la molécula. Estos oligosacáridos pueden desempeñar una función importante en los parámetros farmacocinéticos (PK) de una glucoproteína de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig. Además, diferentes perfiles de oligosacáridos pueden ejercer influencia sobre la estabilidad y degradación de las proteínas. Por ejemplo, los oligosacáridos ligados a O pueden potenciar la estabilidad de las moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig impidiendo la autolisis en la región bisagra de la región constante de inmunoglobulina.
La distribución de oligosacáridos en una población de moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig puede ser heterogénea por naturaleza debido a la complejidad del cultivo y de los procesos celulares. La heterogeneidad puede estar presente debido a sitios de glucosilación que están completamente ocupados o desocupados, y por el hecho de que cualquier sitio específico puede estar poblado con muchas estructuras de oligosacáridos diferentes, que adicionalmente puede presentar variación en el patrón de modificación del ácido siálico.
En una realización, el resto de ácido siálico primario sobre las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig es ácido N-acetil neuramínico (NeuAc, NANA), y el resto de ácido siálico secundario es ácido N-glucolil neuramínico (NGNA). La naturaleza cargada del ácido siálico y las estructuras complejas que contienen ácido siálico pueden dar como resultado isoformas múltiples de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig, respectivamente, en el que dichas isoformas pueden ser evidentes en un perfil de isoelectroenfoque (IEF). Por ejemplo, véase la FIG. 11 y el Ejemplo 3 para el perfil de IEF de CTLA4-Ig. Adicionalmente, véase la FIG. 12 y el EJEMPLO 22 para el perfil de IEF de CTLA4A29YL104E-Ig.
En una realización, la población de moléculas de CTLA4-Ig tiene una isoforma de CTLA4-Ig dominante que tenga un punto isoeléctrico (pI) que sea menor que o igual a 5,1 o a 5,0, que pueda determinarse, por ejemplo, por IEF. En otra ealización, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tiene isoformas de CTLA4A29YL104E-Ig dominantes que tengan un punto isoeléctrico (pI) que sea menor que o igual a 5,5, que pueda determinarse, por ejemplo, por IEF (FIG. 12).
En una realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig el pI es de aproximadamente 4,2 a aproximadamente 5,7, de aproximadamente 4,25 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,3 o de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig el pI es de aproximadamente 4,45 a aproximadamente 5,30. En una realización adicional, en la población de moléculas de CTLA4-Ig el pI es de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,1. En una realización particular, en la población de moléculas de CTLA4-Ig el pI es de aproximadamente 4,45 a aproximadamente 5,0. En una realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población puede presentar un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 o 2,1, determinado mediante IEF (estos valores pueden tener una Desviación Típica de ! 0,2). En una realización, una población de moléculas de CTLA4-Ig que tiene un pI de aproximadamente 4,45 a aproximadamente 5,30, o de aproximadamente 4,45 a aproximadamente 5,1, o de aproximadamente 4,45 a aproximadamente 5,0 se prepara mediante un procedimiento que implica someter una población de moléculas de CTLA4-Ig a electroforesis en gel de IEF, en la que una sola banda sobre el gel representa una subpoblación de moléculas de CTLA4-Ig que tiene un pI particular, y aislar la subpoblación de moléculas de CTLA4-Ig que tiene el pI particular separando la banda del gel y purificar posteriormente las proteínas de la banda separada del gel.
En realizaciones adicionales, en la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig el pI es de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2. En otras realizaciones, en la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig el pI es de
aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,1. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig el pI es de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,2. En una realización, en la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población presentan un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,1 o 3,0, determinado mediante IEF (estos valores pueden tener una Desviación Típica de ! 0,2). En una realización, una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tiene un pI de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2; de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,1; de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,2 se prepara mediante un procedimiento que implica someter una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig a electroforesis en gel de IEF, en el que una sola banda sobre el gel representa una subpoblación de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tiene un pI particular y aislar la subpoblación de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tiene el pI particular separando la banda del gel y purificar posteriormente las proteínas de la banda separada del gel.
En determinadas realizaciones, en las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig la proporción molar media de moles de grupos de ácido siálico con respecto a moles de las moléculas de CTLA4-Ig es de: de aproximadamente 6 a aproximadamente 32, de aproximadamente 8 a aproximadamente 32, de aproximadamente 11 a aproximadamente 30, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, de aproximadamente 13 a aproximadamente 19, de aproximadamente 14 a aproximadamente 18, de aproximadamente 15 a aproximadamente 17, de aproximadamente 6 a aproximadamente 16, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.
En algunas realizaciones, la composición de las moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por un máximo permisible de proteína de célula huésped CHO de #25 ppm a #10 ng/mg. En otra realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por un nivel de ADN de célula huésped de #2,5 pg/mg a #1,0 pg/mg. En otra realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por un nivel de Triton X-100 de lt;1,0 ng/mg o #1,0 ppm. La concentración de Triton X-100 puede determinarse por extracción del Triton X-100 usando extracción en fase sólida con OASIS-HLB de Waters seguido de lavado con agua para eliminar proteínas residuales. El Triton X-100 unido se elimina por elución con acetonitrilo. El eluado de acetonitrilo se analiza por cromatografía de fase inversa utilizando una columna SAS Hypersil de 5 ∀m y una fase móvil constituida por acetonitrilo:agua (80:20). La detección es por absorbancia UV a 225 nm. En una realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por un % de área de oxidación #2,5 y un % de área de desamidación # 2,0. En otra realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por un % de área de oxidación # 3,0 y un % de área de desamidación # 2,5. Se usó el procedimiento de mapeo peptídico tríptico para cuantificar la oxidación y la desamidación. Los datos del porcentaje de oxidación se determinaron usando un ensayo de mapeo tríptico con RP-HPLC que cuantifica el porcentaje de área de oxidación de Met85 en la proteína CTLA4-Ig a sulfóxido de metionina. El porcentaje de oxidación en el procedimientose obtiene midiendo las áreas pico UV en el mapa tríptico con RP-HPLC para el péptido tríptico T6, que comprende los restos 84-93 que contienen Met85, y el péptido tríptico oxidado correspondiente, T6ox, que comprende Met(O)85. El porcentaje de área de oxidación de Met85 a Met(O)85 es proporcional al porcentaje de área del pico T6ox: Porcentaje de Oxidación = 100 * AT6ox/ (AT6ox + AT6), donde, AT6 = área pico del péptido tríptico T6, (84-93). AT6ox = área pico del péptido tríptico T6ox, Met(O)85(84-93). Los datos del porcentaje de desamidación, adquiridos usando un ensayo de mapeo tríptico con RP-HPLC que cuantifica el porcentaje de área de oxidación y desamidación, se obtiene midiendo las áreas pico UV en el mapa tríptico con RP-HPLC para el péptido tríptico T26, que comprende los restos 281-302 que contienen Asn294, y el péptido tríptico desamidado correspondiente, T26desam1, que contiene isoAsp294. Por tanto, el porcentaje de área de desamidación de Asn294 a isoAsp294, es proporcional al porcentaje de área del pico T26desam 1: donde, AT26 = área pico de T26, (281-302), AT26desam1 = área pico de T26desam1, isoAsp294(281-302), AT26desam2 = área pico de T26desam2, Asp299(281-302), AT26desam3 = área pico de T26desam3, Asp294(281-302), AT26desam4 = área pico de T26desam4, Asu294(281-302).
En otra realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por N-acetilglucosamina (GlcNAc) de 15 a 35 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig, o N-acetilgalactosamina (GalNAc) de 1,7 a 3,6 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig. Los amino monosacáridos se cuantifican por electroforesis capilar (EC) tras liberarse de la proteína por hidrólisis ácida. Los amino monosacáridos liberados se re-acetilan y se marcan con fluorescencia con ácido aminopireno trisulfónico (APTS) para facilitar su detección y cuantificación. Se añade N-acetilmanosamina a una muestra y amino monosacáridos convencionales para servir como un patrón interno. Las áreas pico de los amino monosacáridos en las muestras se normalizan usando el patrón interno y se cuantifican comparando con sus áreas pico de amino monosacáridos normalizadas respectivas en el patrón. Después, se calcula la proporción molar de cada monosacárido con respecto a la molécula de CTLA4-Ig.
En una realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por las siguientes especificaciones de perfiles de oligosacáridos ligados a N:
Especificaciones de perfiles de oligosacáridos ligados a N
% de Diferencia del
% de Diferencia del
% de Diferencia del
Dominio I
Dominio II Dominio III
65
% de Diferencia
19-31 7 – 19 -6 --18
Desviación típica (% de diferencia de la especificación anterior)
! 29 ! 27 ! 25
En una realización, la composición de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una composición de monosacáridos neutros en la que la composición tiene proporciones de aproximadamente: Galactosa: de 8,0 a 17 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig Fucosa: de 3,5 a 8,3 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig Manosa: de 7,7 a 22 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig, o Galactosa: de 9,0 a 17 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig Manosa: de 11 a 19 Moles:Mol de Proteína CTLA4-Ig.
Composición ilustrativa de monosacáridos neutros: Moles:Mol de proteína de Galactosa, Fucosa y Manosa
Monosacárido neutro
Proceso W (n=34) Media (DT) Mín, Máx Proceso CD-CHOI (n=109) Media (DT) Mín, Máx
Galactosa Fucosa Manosa
13,9 (1,1) 5,8 (1,0) 15,3(1,0) 12,0, 16,0 4,2, 7,7 13,0, 17,0 12,6 (1,0) 5,6 (0,7) 15,4 (1,0) 10,0, 16,0 4,5, 7,6 13,0, 18,0
Ácido Siálico Ilustrativo (NANA:Mol de Proteína)
Ácido siálico
Proceso W (n=34) Media (DT) Mín, Máx Proceso CD-CHO1 (n=109) Media (DT) Mín, Máx
NANA
10,2 (0,6) 9,3, 11,6 9,7 (0,6) 8,2, 11,5
En otra realización, el intervalo de proporción molar de monosacárido para una composición de CTLA4A29YL104E-Ig es el siguiente: manosa de aproximadamente 10 -20 moles/mol de proteína; fucosa de aproximadamente 4,2 -7,0 moles/mol de proteína; y galactosa de aproximadamente 9,2 -17 moles/mol de proteína. En otra realización, la composición de CTLA4A29YL104E-Ig se caracteriza por una proporción molar de NGNA de aproximadamente 5,0-10,0 moles de NANA/mol de proteína. En otra realización, la composición de CTLA4A29YL104E-Ig se caracteriza por una proporción molar de NGNA de ∃ 1,5 moles. En algunas realizaciones, el % de desviación de proporción molar para los ácidos siálicos es # 15% o # 20% o # 30%.
En una realización, una población de moléculas de CTLA4-Ig puede comprender monómeros de CTLA4-Ig, cada uno con al menos 3 grupos de ácido siálico. En otra realización una población de moléculas de CTLA4-Ig comprende monómeros de CTLA4-Ig cada uno con 3 a 8 grupos de ácido siálico.
En una realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población puede presentar un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 o 3,0.
En algunas realizaciones, en las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig la proporción molar media de moles de NANA y moléculas de CTLA4-Ig o dímero es: de aproximadamente 6 a aproximadamente 16, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16.
En otras realizaciones, en las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig la proporción molar media de moles de NGNA con respecto a moles de moléculas o dímero de CTLA4-Ig es menor que o igual a aproximadamente 2, 1,8, 1,6, 1,5, 1,4, 1,0, 0,8 o 0,5.
En realizaciones particulares, en las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig la proporción molar media de moles de grupos de ácido siálico con respecto a moles de moléculas o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig es de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5. En otra realización, en las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig la proporción molar media de moles de grupos de ácido siálico con respecto a moles de moléculas
o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig es de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.
En una realización, una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig puede comprender monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig cada uno con al menos 2,5 grupos de ácido siálico. En otra realización una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig comprende monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig cada uno con grupos de ácido siálico de 2,5 a 5.
En otras realizaciones, las poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig se diferencian por la proporción molar media de la población de moles de amino monosacáridos y/o monosacáridos neutros y/o ácidos siálicos con respecto a las moléculas o dímero de CTLA4-Ig. En realizaciones particulares, las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig se diferencian por la proporción molar media de la población de moles de amino monosacáridos y/o monosacáridos neutros y/o ácidos siálicos con respecto a moles de moléculas o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig. Los amino monosacáridos incluyen N-acetil galactosamina (GalNAc) y N-acetil glucosamina (GlcNAc). Los monosacáridos neutros incluyen manosa, fucosa y galactosa. Los ácidos siálicos incluyen ácido N-acetil neuramínico (NANA) y ácido N-glucolil neuramínico (NGNA).
En una realización, la población de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una proporción molar media de moles de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 15 a aproximadamente 35, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población se caracteriza por una proporción molar media de moles de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es menor que o igual a aproximadamente 40, 38, 35, 30, 25, 20, 18 o 15.
En otra realización, la población de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una proporción molar media de moles de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,0, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 8,0, o de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 8,3. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población se caracteriza por una proporción molar media de moles de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es menor que o igual a aproximadamente 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4,0, 3,8, 3,6, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,7 o 1,5.
En una realización adicional, la población de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una proporción molar media de moles de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 20,0, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 19,0, de aproximadamente 8 a aproximadamente 18,0, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 17,0, de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 17,0, o de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 17,0. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población se caracteriza por una proporción molar media de moles de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es menor que o igual a aproximadamente 20,0, 19,0, 18,0, 17,0, 16,0, 15,0, 13,0, 12,0, 11,0, 10,0, 9,0, 8,5, 8,0 o 7,5.
En una realización adicional, la población de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una proporción molar media de moles de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o molécula de CTLA4-Ig que es de aproximadamente 3 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,0. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población se caracteriza por una proporción molar media de moles de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es menor que o igual a aproximadamente 8,5, 8,3, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 3,5, 3,2 o 3,0.
En una realización adicional, la población de moléculas de CTLA4-Ig se caracteriza por una proporción molar media de moles de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es de aproximadamente 7 a aproximadamente 23, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 23, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 23, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 22,5, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 22, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 20, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 18, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 16, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 16,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 17, de aproximadamente 10 a aproximadamente 19,0 o de aproximadamente 11 a aproximadamente 19,0. En otra realización, en la población de moléculas de CTLA4-Ig al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las moléculas en la población se caracteriza por una proporción molar media de moles de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o de molécula de CTLA4-Ig que es menor que o igual que aproximadamente 23, 22,5, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,7, 7,5, 7,3 o 7.
En una realización, la población de CTLA4-Ig glucosilada presenta valores PK aumentados, tales como exposición aumentada, medida por el área bajo la curva (ABC), tal como resultante de o como demuestra la eliminación disminuida del suero conservando al mismo tiempo la bioactividad. En otra realización, la población de CTLA4A29YL104E-Ig glucosilada presenta valores PK aumentados, como demuestra la eliminación disminuida del suero conservando al mismo tiempo la bioactividad.
Adicionalmente, se describen análogos de moléculas de CTLA4-Ig solubles, que tienen sitios de glucosilación adicionales; y análogos de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig solubles, que tienen sitios de glucosilación. Los sitios de glucosilación adicionales proporcionan puntos de unión para estructuras carbohidrato adicionales que pueden estar sialiladas. El contenido de ácido siálico aumentado puede conducir a valores FD aumentados, y/o a una estabilidad de la glucoproteína aumentada. Un mayor contenido en ácido siálico es beneficioso. Pueden realizarse procedimientos de purificación posteriores in vitro que utilizan enzimas para añadir más ácidos siálicos para producir moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig adicionales descritas en el presente documento.
Procedimientos para analizar y aislar las glucoproteínas de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig
Los siguientes procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para diferenciar, identificar o aislar poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig particulares en base a diversos perfiles de azúcares, incluyendo, pero sin limitación, una proporción molar media de la población de moles de amino monosacáridos y/o monosacáridos neutros y/o ácidos siálicos por mol de moléculas o dímero de CTLA4-Ig o
CTLA4A29YL104E-Ig.
Una glucoproteína segregada por células cultivadas puede aislarse del medio o sobrenadante de cultivo. La glucoproteína producida por las células se recoge, se recupera, se aísla y/o se purifica, o se purifica sustancialmente, según se desee, al final del periodo de cultivo celular total usando procedimientos de aislamiento y purificación conocidos y realizados en la técnica o como se describe en el presente documento. Una glucoproteína descrita en el presente documento, que expresa la célula, pero que no segrega la célula, puede incluso recuperarse de las células, por ejemplo, a través de lisados celulares y aislando la glucoproteína, y/o utilizando procedimientos conocidos y realizados en la técnica, y como se describe adicionalmente más adelante.
La glucoproteína producida mediante los procedimientos de cultivo celular descritos en el presente documento comprende carbohidratos complejos que pueden analizarse mediante diversas técnicas de análisis de carbohidratos. Por ejemplo, técnicas tales como transferencia con lectina, muy conocida en la técnica, que revela proporciones de manosa terminal, o de otros azúcares tales como galactosa. La terminación oligosacáridos mono-, bi-, tri-, o tetraantenarios por ácidos siálicos puede confirmarse liberando azúcares de la proteína usando hidrazina anhidra o procedimientos enzimáticos y fraccionando los oligosacáridos por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, u otros procedimientos conocidos en la técnica.
Existen dos tipos principales de enlaces glucosídicos encontrados en las glucoproteínas, los que se unen a N y los que se unen a O. Las N-glucosilaciones se crean a través de un enlace covalente del glucano al nitrógeno amida de un resto de asparagina. Los enlaces O-glucosídicos se crean a través de un enlace covalente del glucano al grupo hidroxilo de serina, treonina, hidroxilisina o hidroxiprolina. Los restos carbohidrato de las glucoproteínas están implicados en numerosos fenómenos de reconocimiento molecular, incluyendo interacciones huésped-patógeno, eliminación de suero y direccionamiento de diferentes tejidos. Con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig, los restos carbohidrato pueden influir, al menos, en la unión entre moléculas de CTLA4-Ig y CD80
o CD86, o entre moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig y CD80 o CD86.
Típicamente las estructuras carbohidrato se producen en la proteína expresada como carbohidratos ligados a N o ligados a O. Los carbohidratos ligados a N o ligados a O se diferencian principalmente en sus estructuras núcleo. La N-glucosilación se refiere a la unión del resto carbohidrato mediante GlcNAc a un resto de asparagina en la cadena peptídica. En una realización, todos los carbohidratos ligados a N contienen una estructura núcleo común Man 1-6(Man1-3)Man%1-4Glc-NAc%1-4GlcNAc%-R, en la que, en esta estructura núcleo, R representa un resto de asparagina. La secuencia peptídica de la proteína producida contendrá una asparagina-X-serina, asparagina-Xtreonina y asparagina-X-cisteína, en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina.
Por otro lado, los carbohidratos ligados a O se caracterizan por una estructura núcleo común, que contiene GalNAc unido al grupo hidroxilo de una treonina o serina. De los carbohidratos ligados a N y ligados a O, los más importantes son los carbohidratos complejos ligados a N y ligados a O. Dichos carbohidratos complejos contienen diversas estructuras antenarias. Las estructuras mono-, bi-, tri-y tetra-antenarias son importantes para la adición de ácidos siálicos terminales. Dichas estructuras de cadena externa proporcionan sitios adicionales para los azúcares y enlaces específicos que comprenden los carbohidratos de los productos proteicos.
Las glucoproteínas terapéuticas a menudo se producen usando técnicas de cultivo celular de ADN recombinante. Las distribuciones de glucosilación de proteínas en cultivo celular pueden verse afectadas por variaciones en el pH, densidad celular, concentraciones de nutrientes y concentraciones de metabolitos. La sensibilidad de las distribuciones de glucano con respecto a efectos ambientales hace que sea necesario controlar cuidadosamente la distribución de glucano durante el desarrollo y la producción del producto para garantizar que se fabrica un producto reproducible.
El desarrollo de glucoproteínas derivadas de técnicas recombinantes para su uso terapéutico ha conducido a aumentar la demanda de procedimientos para caracterizar y perfilar sus estructuras carbohidrato. El mapeo de oligosacáridos se ha usado durante la caracterización inicial de proteínas recombinantes por comparación con la proteína nativa, para identificar estructuras de oligosacáridos presentes, para controlar la coherencia de la composición de oligosacáridos, para evaluar cambios que pueden producirse por alteración en cultivo celular o procesos de producción, y para identificar cambios en la glucosilación que se producen como resultado de la expresión en diferentes líneas celulares.
Se dispone de diversas técnicas para evaluar las distribuciones estructurales de carbohidratos. Estas técnicas incluyen filtración en gel, técnicas de separación cromatográficas y electroforéticas acopladas con una amplia serie de técnicas de detección. Si las cantidades de la muestra son limitadas, las glucoproteínas se derivatizan a menudo con reactivos fluorescentes, tales como ácido 2-aminobenzoico y 2-aminopiridina, para mejorar la detección. Sin embargo, la derivatización y purificación de los derivados puede ser lenta. Cuando el tamaño de la muestra no es un problema, es posible realizar la evaluación directa de las distribuciones estructurales de carbohidratos.
Análisis del contenido de oligosacáridos de una glucoproteína
Una glucoproteína particular puede presentar heterogeneidad de carbohidratos. La heterogeneidad puede observarse a diferentes niveles: los sitios de glucosilación pueden variar de completamente ocupados a desocupados, y cualquier sitio específico puede poblarse con cualquier estructura de oligosacárido diferente, en el que cada estructura puede modificarse por moléculas de ácido siálico, tales como NANA o NGNA.
El contenido de carbohidratos de la proteína descrita en el presente documento puede analizarse por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los procedimientos descritos en los Ejemplos del presente documento. En la técnica se conocen diversos procedimientos para analizar la glucosilación y son útiles en el contexto de la presente invención. Estos procedimientos proporcionan información con respecto a la identidad y a la composición de los oligosacáridos unidos al péptido producido. Los procedimientos para analizar carbohidratos, útiles en relación con la presente invención incluyen, pero sin limitación, cromatografía con lectina; cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento combinada con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD), que utiliza cromatografía de intercambio aniónico a pH alto para separar oligosacáridos en base a su carga; RMN; espectrometría de masas; HPLC; cromatografía con carbón poroso grafitizado (GPC).
Se conocen procedimientos para liberar oligosacáridos. Estos procedimientos incluyen 1) procedimientos enzimáticos, que normalmente se realizan usando péptido-N-glucosidasa F/endo-&-galactosidasa; 2) procedimientos de eliminación %, usando un entorno alcalino riguroso para liberar principalmente estructuras unidas a O; y 3) procedimientos químicos que utilizan hidrazina anhidra para liberar oligosacáridos unidos tanto a N como a O. Los procedimientos para realizar el análisis pueden comprender las siguientes etapas: 1. Diálisis de la muestra frente a agua desionizada para eliminar todas las sales tampón, seguido de liofilización. 2. Liberar las cadenas de oligosacáridos intactas con hidrazina anhidra. 3. Tratamiento de las cadenas de oligosacáridos intactas con HCl metanólico anhidro para liberar monosacáridos individuales como derivados de O-metilo. 4. N-acetilación de cualquiera de los grupos amino primarios. 5. Derivatización para producir per-O-trimetilsilil metil glucósidos. 6. Separación de estos derivados por cromatografía gas-líquido (CGL) capilar en una columna CP-SIL8. 7. Identificación de derivados de glucósido individuales por tiempo de retención a partir de la CGL y espectroscopía de masas, en comparación con patrones conocidos. 8. Cuantificación de derivados individuales por FID con un patrón interno (13-O-metil-D-glucosa).
La presencia de amino azúcares y de azúcares neutros puede determinarse usando cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento combinada con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD Carbohydrate System; Dionex Corp.). Por ejemplo, los azúcares pueden liberarse por hidrólisis en ácido trifluoroacético al 20% (v/v) a 100 ºC durante 6 horas. Después los hidrolizados se secan por liofilización o con Vacío Rápido (Savant Instruments). Después, los restos se disuelven en solución de trihidrato acetato sódico al 1% y se analiza en una columna de HPLC-AS6 (como describen Anumula y col., 1991, Anal. Biochem., 195: 269-280).
Como alternativa, puede realizarse análisis de carbohidratos por inmunotransferencia. En este procedimiento los carbohidratos unidos a proteína se detectan usando un sistema de detección de glucano comercial (Boehringer), que se basa en el procedimiento de inmunotransferencia oxidativa descrito por Haselbeck y col. (1993, Glycoconjugate J., 7: 63). El protocolo de tinción recomendado por el fabricante se sigue excepto que la proteína se transfiere a una membrana de polivilidendifloruro en lugar de a una membrana de nitrocelulosa y los tampones de bloqueo contienen albúmina de suero bovino al 5% en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, con cloruro de sodio al 0,9%. La detección se realiza con anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (Boehringer), dilución 1:1000 en solución salina tamponada con Tris usando los sustratos fosfatasa, cloruro de 4-nitroazul de tetrazolio, al 0,03% (p/v) y 5bromo-4 cloro-3-indoil-fosfato al 0,03% (p/v) en tampón Tris 100 mM, pH 9,5, que contiene cloruro de sodio 100 mM y cloruro de magnesio 50 mM. Normalmente, las bandas de proteína que contienen carbohidratos se visualizan aproximadamente a los 10 a 15 minutos.
Los carbohidratos asociados a proteínas también pueden escindirse por digestión con la enzima péptido-Nglucosidasa F. De acuerdo con este procedimiento el resto se suspende en 14 ∀l de un tampón que contiene SDS al 0,18%, beta-mercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3,6 mM a pH 8,6, y se calienta a 100 ºC durante 3 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se divide en dos partes aproximadamente iguales. Una parte, que no se trata adicionalmente, sirve como control. La otra parte se ajusta a aproximadamente el 1% con detergente NP-40 seguido por la adición de 0,2 unidades de péptido-N-glucosidasa F (Boehringer). Ambas partes se calientan a 37 ºC durante 2 horas y después se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.
El mapeo de las glucoproteínas con glucano es cada vez más aceptado. La metodología descrita en el presente documento permite la rápida caracterización de los oligosacáridos en cuanto al tipo de glucano, grado de sialilación y número de ramificaciones en el extremo no reductor de los carbohidratos. Por tanto, en determinadas realizaciones, las poblaciones de CTLA4-Ig se caracterizan por perfiles de oligosacáridos particulares. La determinación del perfil de los oligosacáridos se realiza típicamente por separación cromatográfica de oligosacáridos seguido por detección y cuantificación relativa. Una alternativa a la determinación del perfil cromatográfico es el análisis directo de oligosacáridos por infusión ESI y desalinización en línea.
La determinación del perfil de los oligosacáridos por CPG puede utilizarse para caracterizar los oligosacáridos ligados a N, de las moléculas de CTLA4-Ig. Existen 31 clases estructurales de oligosacáridos identificados a partir de moléculas de CTLA4-Ig (SEC ID Nº: 2), incluyendo una clase estructural que contiene grupos de ácido siálico Oacetilados. La verificación de clases estructurales se consigue mediante el uso de EM/ES y EM de iones positivos. La cuantificación relativa de clases estructurales es posible a través de la integración de la señal UV a 206 nm. Se conoce la comparación de los perfiles de subpoblaciones de sitios individuales ligados a N, lo que revela diferencias de población significativas entre sitios ligados a N. La determinación del perfil de los oligosacáridos usando CPG proporciona una alternativa rica en cuanto a información conveniente con respecto a los procedimientos de determinación de perfiles, tales como HPAEC, más tradicionales
Estructuras unidas a N en las moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros de la SEC ID Nº: 2
Existen tres sitios de N-glucosilación por cadena (es decir, por monómero) en un multímero o dímero de CTLA4-Ig, en el que el monómero tiene una secuencia de la SEC ID Nº: 2, por ejemplo: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2
o (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2). Las variaciones en cuanto a glucosilación por sitio se analizan aislando fragmentos peptídicos que contienen glucanos ligados a N a partir de una digestión tríptica de la proteína. Los sitios de Nglucosilación en la proteína se localizan en Asn102, Asn134 y Asn233, contenidos en los fragmentos trípticos 5, 7 y 14, respectivamente. La liberación enzimática de los oligosacáridos ligados a N de los fragmentos peptídicos aislados, seguido de la determinación del perfil por CPG de los oligosacáridos liberados da como resultado los perfiles mostrados en la FIG. 13. Es obvio, a partir del perfil de los glucanos liberados de Asn233 (fragmento tríptico 14, T14) que la población de oligosacáridos es rica en estructuras asialo (estructuras sin ácidos siálicos). Los perfiles de oligosacáridos de los glucanos unidos a Asn102 y Asn134 (T5 y T7) contienen la mayoría de las estructuras sialiladas.
Los oligosacáridos aislados liberados de glucoproteínas se inyectan directamente en el sistema de carbón poroso grafitizado CL/UV/EM. Las Figuras 14 y 15 muestran los cromatogramas TIC y UV de perfiles PGC típicos generados por gradientes con acetonitrilo que contienen aditivos ácidos y básicos. En la mayoría de los casos, los espectros de masa de un solo pico cromatográfico contienen picos de masa para un solo oligosacárido. Se identifican treinta clases estructurales de oligosacáridos a partir perfil de elución que contiene TFA. Solo dieciséis clases estructurales de polisacáridos se identifican a partir del perfil de elución que contiene NH4OH. En cada clase estructural hay estructuras variantes que contienen la sustitución de ácido N-glucolil-neuramínico (NGNA) en lugar de ácido N-acetilneuramínico (NANA) así como diferentes grados de acetilación de ácido siálico. Aunque solo puede obtenerse información cualitativa de la comparación de los recuentos iónicos para las clases de oligosacáridos, es obvio que las clases estructurales principales dentro de cada uno de los cuatro dominios son P2100, P2111, P2122 y P3133. Esto coincide con los valores de integración obtenidos de la señal UV a 206 nm. Puede obtenerse verificación estructural adicional a partir del espectrograma de masas de iones positivos. La ionización en modo iones positivos promueve la fuente de fragmentación de oligosacáridos, principalmente en los enlaces glucosídicos. Dado que hay una buena separación de oligosacáridos, determinada por los espectros de masas de iones negativos, los espectros fragmentados del modo iones positivos imitan los espectros de EM/EM de iones positivos. El Dominio III (estructuras di-sialiladas) contiene una cantidad significativa de la estructura O-acetilada P2122-Ac. Los datos m/s de iones positivos confirman la O-acetilación de uno de los ácidos siálicos en la estructura. El sitio de O-acetilación más común de los restos de ácido siálico está en las posiciones C-7 y C-9 (Shi WX, Chammas R., Varki A., J, Biol, Chem, 271 (1996) 15130-15188). A pH extracelular fisiológico, los O-acetil ésteres en C-7 migran espontáneamente a C-9. Por lo tanto, el sitio de O-acetilación es más probablemente C-9.
Análisis del contenido de Oligosacáridos ligados a N: las técnicas analíticas pueden comprender escisión y aislamiento de oligosacáridos ligados a N por cromatografía en columna, que en una realización no limitante utiliza una columna Hypercarb. Se aislaron glucanos sometidos a cromatografía Hypercarb y pudieron analizarse por HPAEC-PAD cuyo análisis determina los tipos de carbohidratos que modifican una glucoproteína particular. La caracterización analítica de los oligosacáridos ligados a N también puede conseguirse por Cromatografía Líquida/Espectrometría de Masas (CL/EM) usando un Carbón Poroso Grafitizado (CPG). El análisis de carbohidratos también puede incluir mapeo peptídico con tripsina, Asp-N y Tripsina/Quimotripsina para determinar los péptidos, que comprenden estructuras carbohidrato.
Las estructuras de oligosacáridos ligados a N pueden analizarse usando una serie de técnicas ortogonales de
espectrometría de masas y HPAEC-PAD (véanse los Ejemplos). Estas técnicas incluyen diversas escisiones con endopeptidasas seguido de análisis por CL/EM/EM. Con respecto a los monómeros de CTLA4-Ig que tienen una secuencia de la SEC ID Nº: 2, los tres sitios principales de N-glucosilación se caracterizan usando CL/EM e ionización por electropulverización con CL/EM/EM y se determinaron las estructuras principales en cada sitio de unión a N. Estos datos se resumen en la FIG. 9. Hay al menos tres puntos de unión principales para oligosacáridos ligados a N en Asn102, Asn134 y Asn233. Además, se observa que Asn233 contiene una población de estructuras unidas a N que no contienen grupos de ácido siálico lo cual se produce aproximadamente el 80% de las veces.
Estructuras de oligosacáridos ligados a N de CTLA4-Ig determinadas por CL/EM de los glucopéptidos, CL/EM de los oligosacáridos y HPAEC-PAD: Los carbohidratos ligados a N están asociados con un motivo de la secuencia consenso de Asn -X -Ser/Thr. Esta secuencia aparece tres veces en las cadenas monoméricas de CTLA4-Ig que tienen una de las siguientes secuencias: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2 y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2. El motivo de la secuencia consenso aparece en la SEC ID Nº: 2 en Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135 Thr136 y Asn233 Ser234 Thr235. Basándose en la secuencia consenso, hay seis sitios carbohidrato ligados a N por molécula dimérica que está formada por una cualquiera o dos de las siguientes secuencias monoméricas: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2 y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2.
Los carbohidratos ligados a N pueden ser de tres variedades generales: de alto contenido en manosa, híbridos y/o complejos. Se desarrolló una técnica de CL/EM para el análisis glucopeptídico. La escisión endoproteolítica con tripsina de los monómeros (que tenían una de las secuencias (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2 y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 2) dio como resultado tres péptidos que contenían N-glucosilación. Los tres sitios ligados a N contenían estructuras carbohidrato. El fragmento tríptico T5 correspondiente a los aminoácidos 65-109 de la SEC ID Nº: 2 contiene una glucosilación en Asn102. El fragmento tríptico T7 correspondiente a los aminoácidos 120-154 de la SEC ID Nº: 2 contiene una glucosilación en Asn134. El fragmento tríptico T14 correspondiente a los aminoácidos 229-237 de la SEC ID Nº: 2 contiene una glucosilación en Asn233.
Para determinar los tipos de glucosilación específicos en cada sitio, se obtuvieron carbohidratos de cada sitio específico aumentando la escala de digestión y separación de proteínas seguido de recogida de los péptidos T5, T7 y T14. Los picos peptídicos trípticos de interés se trataron con PNGasa F y se procesaron para análisis por CL/EM en una columna a Hypercarb. Los resultados mostraron una población heterogénea de estructuras bi-, tri-y tetraantenarias complejas en cada sitio. Esto puede observarse en la Figura 16 en la que la cromatografía separa los azúcares en cinco dominios: estructuras asialo, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo y tetra-sialo (denominados Dominios I, II, III, IV y V, respectivamente). Un cromatograma (Figura 13 panel A) de los carbohidratos Asn102 (T5) ilustra una serie de estructuras mono-y di-sialo en el sitio. Un cromatograma (Figura 13 panel B) de Asn134 (T7) ilustra dos estructuras di-sialo principales con una población de estructuras mono-sialo. Un cromatograma (Figura 13 panel C) de Asn233 (T14) ilustra poca sialilación. Para cada uno de los sitios carbohidrato ligados a N, se muestra un espectro de EM y la correspondiente estructura del pico principal en cada cromatograma (véase la Figura 13, paneles E, F, H). En la Figura 13, panel D, en el cromatograma se muestra el perfil total de carbohidratos ligados a N de CTLA4-Ig. La masa y estructuras de los picos seleccionados se indican en la Tabla 1. Los datos de CL/EM de los oligosacáridos se confirmaron mediante análisis en profundidad del mapeo peptídico. Asn102 (péptido T5) tiene el mayor grado de heterogeneidad de carbohidratos que varía desde estructuras bi-antenarias, no sialiladas a estructuras tetra-antenarias, tetra-sialiladas. Asn134 (péptido T7) contiene estructuras principalmente bi-antenarias. Este sitio contiene mucha menos heterogeneidad que el sitio Asn102. El sitio Asn233 (péptido T14) contiene poca sialilación. También se empleó una tercera técnica analítica, HPAEC-PAD, para confirmar los dos hallazgos por CL/EM ortogonal.
Tabla 1: Principales estructuras unidas a N y estructuras complejas secundarias seleccionadas observadas usando procedimientos de CL/EM
Estructura
Masa teórica Masa real desconvolucionada
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3
1462 1575*
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)1
1624 1737*
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)2
1786 1899*
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)1 (NeuAc)1
1916 1916
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)2 (NeuAc)1
2077 2077
(GlcNAc)5 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)3 (NeuAc)1
2443 2442
25 (Continuación)
Estructura
Masa teórica Masa real desconvolucionada
(GlcNAc)4 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)2 (NeuAc)2
2369 2368
(GlcNAc)5 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)3 (NeuAc)2
2734 2734
(GlcNAc)5 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)3 (NeuAc)3
3025 3025
(GlcNAc)6 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)3 (NeuAc)3
3388 3388
(GlcNAc)6 (Fuc)1 (Man)3 (Gal)3 (NeuAc)4
3680 3680
*Las especies asialo se detectan como aductos TFA.
La población de carbohidratos ligados a N total se analizó usando HPAEC-PAD. Los datos obtenidos mediante este procedimiento se indican en las Tablas 2 y 3. En la Tabla 2, se indican los porcentajes de área relativos de los dominios asialo a tri-sialo en cada sitio (Asn102, Asn134 y Asn233 de la SEC ID Nº: 2). En la Tabla 3, se indican los porcentajes de área de los dominios de los oligosacáridos como una fracción de toda la población de oligosacáridos.
Tabla 2: Porcentajes de área de cada dominio observados por HPAEC-PAD
Ligados a N
Asialo Mono Di Tri
N102
27 37 25 11
N134
25 38 28 8
N233
82 12 5 1
Tabla 3: Porcentajes de área de cada dominio expresados como promedio ponderado en el conjunto de datos de la Tabla 2
Ligados a N Asialo Mono Di Tri N102
9 128 4 N134
8 139 3 N233
28 4 20
Total / Molécula 45 29 19 7
Suponiendo glucosilación completa
Estructuras de oligosacáridos ligados a N de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig determinadas por CL/EM de los glucopéptidos, CL/EM de los oligosacáridos y HPAEC-PAD: los carbohidratos ligados a N se asociaron con un motivo de la secuencia consenso de Asn -X -Ser/Thr. Esta secuencia aparece tres veces en las cadenas monoméricas de CTLA4A29YL104E-Ig que tienen una de las siguientes secuencias: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4 e (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4. El motivo de la secuencia consenso aparece en la SEC ID Nº: 4 en: Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135 Thr136; y Asn233 Ser234 Thr235. Basándose en la secuencia consenso, hay seis sitios carbohidrato ligados a N por molécula dimérica que está formada por una cualquiera o dos de las siguientes secuencias monoméricas: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4 y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4.
Los carbohidratos ligados a N pueden ser de tres variedades generales: de alto contenido en manosa, híbridos y/o complejos. Se desarrolló una técnica de CL/EM para el análisis glucopeptídico. La escisión endoproteolítica con tripsina de los monómeros (que tenían una de las secuencias (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4 y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4) dio como resultado tres péptidos que contenían N-glucosilación (Véase la Tabla 25 en el EJEMPLO 22). Los tres sitios ligados a N contenían estructuras carbohidrato. El fragmento tríptico T5 correspondiente a los aminoácidos 65-109 de la SEC ID Nº: 4 contiene una glucosilación en Asn102. El fragmento tríptico T7 correspondiente a los aminoácidos 120-154 de la SEC ID Nº: 4 contiene una glucosilación en Asn134. El fragmento tríptico T14 correspondiente a los aminoácidos 229-237 de la SEC ID Nº: 4 contiene una glucosilación en Asn233 (Véase la Tabla 25 en el EJEMPLO 22).
Para determinar los tipos de glucosilación específicos en cada sitio, se obtuvieron carbohidratos de cada sitio específico aumentando la escala de digestión y separación de proteínas seguido de recogida de los péptidos T5, T7 y T14. Los picos peptídicos trípticos de interés se trataron con PNGasa F y se procesaron para análisis por CL/EM en una columna a Hypercarb. Los resultados mostraron una población heterogénea de estructuras bi-, tri-y tetraantenarias complejas en cada sitio. Esto puede observarse en la Figura 16, en la que la cromatografía separa los azúcares en cuatro dominios: estructuras asialo, mono-sialo, di-sialo y tri-sialo (denominados Dominios I, II, III y IV respectivamente). Las características de un perfil carbohidrato que pueden analizarse y compararse entre moléculas glucosiladas, o poblaciones o composiciones que comprenden moléculas glucosiladas, incluyen porcentaje de área de pico, porcentaje de área de dominio, distancia de valle a valle, o distancia de pico a pico.
Caracterización por CL/EM de oligosacáridos CTLA4-Ig ligados a N
La cromatografía con carbón poroso grafitizado (CPG) CL/EM, que es un procedimiento para realizar perfiles de oligosacáridos ligados a N, puede proporcionar diversas ventajas sobre la Cromatografía de Intercambio Aniónico a pH alto (HPAEC). Algunas de esas ventajas incluyen: perfilado directo de mezclas de digestión que minimiza la pérdida y la degradación de muestras; la interfaz de EM directa proporciona un procedimiento para caracterizar y analizar oligosacáridos de un modo rápido; la mayor resolución a través de cromatografía CPG permite realizar comparaciones inter-dominio así como realizar análisis intra-dominio más delicado.
El procedimiento CPG CL/EM permite realizar la determinación del perfil y la caracterización de oligosacáridos de un modo rápido en cuanto al tipo de glucano, y determinar el grado de sialilación y ramificación de los extremos no reductores de los carbohidratos. Después, los espectros EM en modo ión negativo producen datos sencillos de interpretar, con mínima fragmentación de oligosacáridos, mientras que la ionización en modo positivo permite la verificación de clase estructural. El procedimiento descrito en el presente documento puede aplicarse a mezclas de digestión completas de glucoproteínas, así como a muestras de oligosacáridos previamente aisladas sin necesidad de realizar derivatización. Las fases cromatográficas móviles utilizadas permiten la recogida de picos a partir de los perfiles y concentración hasta la deshidratación sin manipulación adicional para una caracterización más detallada. En una realización el procedimiento se usa para caracterizar oligosacáridos CTLA4-Ig ligados a N. Usando el procedimiento CPG CL/EM, pudieron identificarse treinta y una clases distintas de oligosacáridos en moléculas de CTLA4-Ig que comprendían monómeros que tenían secuencias de la SEC ID Nº: 2, por ejemplo, la SEC ID Nº: 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
La cromatografía de intercambio aniónico a pH alto (HPAEC) se ha usado ampliamente para realizar perfiles de oligosacáridos liberados de glucoproteínas sin necesidad de realizar derivatización. La alta resolución de la HPAEC y el hecho de que la separación está influenciada por el tipo de resto de azúcar presente, tipo de enlace y tamaño del glucano, son razones para la amplia difusión del uso de esta técnica. El factor dominante en la separación es la carga, los oligosacáridos altamente cargados se eluyen más tarde que los glucanos menos cargados. Frecuentemente, los perfiles cromatográficos se dividen en dominios definidos por el número de especies cargadas, típicamente restos de ácido siálico, en los glucanos (FiG. 17).
Para obtener más información sobre la estructura de los oligosacáridos desconocidos los picos HPAEC pueden recogerse, desalinizarse y caracterizarse por EM y/o RMN. Una consideración con respecto a la determinación del perfil de distribuciones de oligosacáridos por HPAEC-PAD es la variabilidad intrínseca respecto al modo de detección. El envejecimiento celular electroquímico y la contaminación en la superficie del electrodo producen variabilidad en los perfiles. También se ha descrito que las estructuras de oligosacáridos y el grado de sialilación pueden producir variabilidad entre células de detección cuando se usa HPAEC con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD). Esta variabilidad puede influir en los resultados cuantitativos y relativamente cuantitativos utilizados para evaluar el efecto de cambios de proceso o determinar regularidad lote a lote. Debido a su velocidad y especificidad, la espectrometría de masas (EM) ha ganado popularidad como una técnica para evaluar la determinación del perfil de oligosacáridos de las glucoproteínas. Aunque la determinación de perfiles por EM no puede usarse para determinar directamente la configuración anomérica o los patrones de ramificación, los datos de EM pueden usarse para identificar clases estructurales y detectar cambios cualitativos en las distribuciones de las glucoformas.
El procedimiento de determinación del perfil cromatográfico con carbón poroso grafitizado (CPG) para oligosacáridos ligados a N, liberados enzimáticamente, utiliza detección tanto por ultravioleta (UV) como por espectroscopía de masas (EM) para determinar el perfil y caracterizar a los oligosacáridos ligados a N, bien directamente a partir de mezclas de digestión enzimática o a partir de oligosacáridos aislados. Este procedimiento puede usarse para perfilar y caracterizar oligosacáridos liberados de glucoproteínas CTLA4-Ig. El procedimiento CL/EM CPG puede evaluar la consistencia de las distribuciones de oligosacáridos resultante del proceso de producción, así como cualquiera de los cambios que se producen en las distribuciones de los oligosacáridos resultantes de modificaciones de procesos. En un microanálisis cromatográfico de oligosacáridos ligados a N de moléculas de CTLA4-Ig, los oligosacáridos ligados a N liberados enzimáticamente pueden separarse fácilmente mediante la columna CPG para aumentar la sialilación y aumentar el tamaño. El intervalo de estructuras presentes y las cantidades relativas de cada clase de estructura se determinan a través de una combinación de análisis de EM y UV (Ejemplo 3).
Para optimizar el procedimiento de CL/EM CPG, puede ser útil optimizar las condiciones del espectro de masas. La optimización puede incluir un conjunto de experimentos de mapeo de superficie para evaluar los efectos de los parámetros de la composición del disolvente y de ionización EM en la detección de oligosacáridos. Los parámetros de la composición del disolvente para la evaluación comprenden un porcentaje de acetonitrilo (en volumen) y aditivos eluentes (ácido trifluoroacético e hidróxido de amonio). Los parámetros de ionización EM evaluados para la evaluación incluyen la temperatura de desolvación, voltaje por capilaridad y configuraciones de voltaje escalonado para la fuente de electropulverización.
Los parámetros de ionización pueden desempeñar una función significativa en respuesta a señales. El modelo resultante de la determinación del mapeo de superficie se usó para establecer parámetros de ionización durante la determinación cromatográfica. Valores más altos tanto para la temperatura de desolvación como para el voltaje gradual producen mayor respuesta. El voltaje capilar óptimo varía dependiendo del aditivo eluente, teniendo el TFA, que contiene un sistema disolvente, un voltaje capilar óptimo ligeramente más alto. El factor que tiene el mayor efecto es el porcentaje en volumen de acetonitrilo, un mayor contenido en acetonitrilo da como resultado mayores respuestas.
Cromatografía con carbón poroso grafitizado
Se había utilizado carbón poroso grafitizado (CPG) para la desalinización de oligosacáridos por extracción en fase sólida. La CPG también se conoce como un medio cromatográfico eficaz para la separación de oligosacáridos en condiciones de elución tanto ácidas como básicas. Se desarrollaron condiciones de cromatografía para realizar el perfil, tanto ácido como básico, de oligosacáridos liberados enzimáticamente de moléculas de CTLA4-Ig que tenían las secuencias monoméricas de la SEC ID Nº: 2. Cada condición es compatible con detección tanto por UV como por EM. Como se observó en los experimentos de infusión, las condiciones de elución ácida dio como resultado una mayor sensibilidad EM en comparación con las condiciones básicas. La respuesta EM para oligosacáridos neutros eluidos en condiciones ácidas, detectados como aductos TFA, son de cinco a nueve veces la intensidad del pico correspondiente eluido en condiciones básicas. La diferencia en la respuesta de señal es menos drástica para los oligosacáridos ácidos, con un promedio de tres veces la respuesta de señal para glucanos monosialilados y la misma respuesta de señal para glucanos di-sialilados. El mayor número de picos en el cromatograma eluido con TFA (Figuras 14A-B) comparado con el cromatograma eluido con NH4OH (Figura 15A-B) es un resultado de separación de formas anoméricas de oligosacáridos. La recogida y concentración de picos individuales eluidos a partir del gradiente TFA dio como resultado la división del único pico en dos picos de idéntica masa después de reinyección. La elución básica de los oligosacáridos a partir de la columna CPG da como resultado un perfil más sencillo (Figura 15A-B). Las condiciones de elución básicas no dan como resultado una separación anomérica completa, sin embargo se observa un ensanchamiento de pico significativo. Los picos de resolución pueden aumentarse aumentando la temperatura de la columna, que acelerará el intercambio de formas anoméricas (Itoh S., y col., J. Chromatogr. A. 2002 968(1-2), 89-100). Sin embargo, la sensibilidad (recuento iónico) de los oligosacáridos detectados sigue siendo reducida en comparación con las condiciones de elución ácidas. Se ha descrito que la adición de sales, tales como acetato amónico, puede aumentar la sensibilidad. (Churms SC, J. Chromatogr. A. 500 (1990) 555-583.)
La adición de acetato amónico, trifluoroacetato amónico o formato amónico da como resultado una mayor respuesta pero también da como resultado un ensanchamiento asimétrico de pico. El ensanchamiento de pico resultante y la posible interferencia de la sal añadida con detección UV hacen que la adición de sales sea una opción poco atractiva. Un medio alternativo para eliminar la separación anomérica es reducir los oligosacáridos a los alditoles correspondientes.
La mayor sensibilidad y resolución cromatográfica hace que las condiciones de elución ácidas sean útiles para realizar la determinación del perfil de los oligosacáridos. Un sistema particular de determinación del perfil consiste en una columna Luna C 18 acoplada a través de dos válvulas de seis puertos de posición dual en la columna Hypercarb de 5 ∀M (100 x 4,6 mm). La columna Hypercarb está acoplada a un detector UV (Waters 2996 PDA) en serie con un Micro Q-ToF (Micromass) con una sonda ESI convencional. A través de controles de conmutación apropiados, las muestras de CTLA4-Ig previamente purificadas pueden perfilarse usando solo la columna Hypercarb, o las mezclas de digestión pueden perfilarse por inyección directa de la mezcla de digestión sobre la columna Luna C18 en serie con la columna Hypercarb. Típicamente, se obtienen perfiles a partir de los oligosacáridos ligados a N liberados de 10 a 20 nmoles de proteína.
En determinadas realizaciones, las moléculas de CTLA4-Ig de la población tienen un cromatograma de acuerdo con uno cualquiera o más de los cromatogramas que tienen picos representativos. Los cromatogramas de determinación del perfil de oligosacáridos representativos para moléculas de CTLA4-Ig que tienen monómeros con secuencias de la SEC ID Nº: 2 se muestran en la Figura 13, Figuras 14A-B, Figuras 15A-B (CPG), Figura 17 (HPAEC/PAD) y Figuras 18A-B. Dos de estos perfiles cromatográficos pueden dividirse en cuatro dominios distintos que contienen estructuras de oligosacáridos con grados de sialilación en aumento en los dominios de elución posteriores. El sistema cromatográfico CPG permite una interfaz directa con un detector de masa. La resolución de masas y las proporciones de señal con respecto a ruido son aceptables incluso para oligosacáridos que están presentes en bajos porcentajes. La resolución cromatográfica de estructuras de oligosacáridos individuales parece ser mayor en la separación cromatográfica CPG en comparación con la HPAEC.
La recogida de picos del procedimiento HPAEC requiere desalinización y el alto pH empleado introduce la posibilidad de descartar reacciones que pudiesen interferir con la identificación estructural precisa de picos. Dado que las condiciones cromatográficas utilizadas con la cromatografía CPG no tienen sales, los picos de los oligosacáridos eluidos pueden recogerse y concentrarse con mínima manipulación. Esto permite la recogida y concentración de picos eluidos, seguido de inyección de los oligosacáridos recogidos sobre el sistema HPAEC. La reinyección de los oligosacáridos recogidos sobre el sistema HPAEC-PAD permite la asignación estructural de algunos de los picos presentes en el perfil HPAEC (Figura 17). Debido a la resolución de pico incompleta en la columna de intercambio aniónico, no todos los picos aislados pueden mapearse para el perfil HPAEC.
Los perfiles resultantes de inyección directa de mezclas de digestión y los de oligosacáridos aislados a partir de la misma muestra de proteína no son idénticos. Los perfiles resultantes de inyección directa (Figuras 18A-B) tienen diferentes proporciones de anómeros lo que sugiere que la concentración de los oligosacáridos recogidos da lugar a una anomerización aumentada. Lo que es más importante, el perfil resultante de inyección directa contiene un pico, que corresponde a una estructura tetra-sialilada. Esta estructura no está identificada en el perfil de los oligosacáridos recogidos y aislados. Además, para acortar el tiempo de ensayo, la determinación del perfil realizada directamente a partir de mezclas de digestión puede dar como resultado una representación más precisa de la distribución de oligosacáridos impidiendo la degradación de glucanos durante la recogida y concentración.
Cuantificación relativa
El mapeo de superficie realizado en muestras de infusión indica que el porcentaje en volumen de acetonitrilo tiene un efecto significativo sobre la eficacia de ionización de oligosacáridos de elución. La dependencia de la intensidad de señal sobre el contenido de acetonitrilo en la fase móvil hace que la cuantificación relativa de oligosacáridos por EM dependa del tiempo de retención del pico de elución. Las variaciones de condiciones en la columna pueden influir en los tiempos de elución sobre las columnas de CPG. Por esta razón, sería difícil obtener una cuantificación relativa coherente a partir del perfil de elución del cromatograma iónico. La señal UV a 206 nm podría no verse afectada por la composición del disolvente al mismo grado que la señal de iones. La cuantificación relativa se realizó usando la señal UV, la señal de iones solo se usó para la caracterización y para realizar comparaciones cualitativas. Inyecciones repetidas para oligosacáridos aislados de un solo lote de glucoproteína produjeron un porcentaje de desviaciones típicas relativas (%DTR) menor del 4% para cada uno de los cuatro dominios de oligosacáridos cuantificados.
Estructuras unidas a O en moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros de la SEC ID Nº: 2
Además de los carbohidratos ligados a N, las moléculas de CTLA4-Ig pueden contener carbohidratos ligados a O. Las estructuras de oligosacáridos ligados a O pueden analizarse usando una serie de técnicas ortogonales de espectroscopía de masas. Estas técnicas incluyen diversas escisiones con endopeptidasas seguido de análisis por CL/EM/EM.
Con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig formadas de monómeros que tienen una secuencia de la SEC ID Nº: 5, 6, 7, 8, 9 o 10, se caracterizaron los dos sitios principales de O-glucosilación usando ionización por electropulverización de masa exacta y se determinaron las estructuras principales en cada sitio unido a O. Estos datos se resumen en la Figura 9. Los datos son coherentes con las tres estructuras principales unidas a O: (GalNAc)1 (Gal)1, (NeuAc)1; (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2; (GalNAc)1 (GlcNac)1 (Gal)2 (NeuAc)2. Cada estructura se observa en diferentes cantidades en cada sitio. Estas cantidades son relativamente cuantitativas y representan datos obtenidos a partir de análisis múltiples. Los oligosacáridos ligados a O aportan una cantidad sustancial de ácido siálico a CTLA4-Ig. Hay dos puntos de conexión de oligosacáridos ligados a O principales por cadena. El primer sitio de aparición para oligosacáridos ligados a O es Ser165, que está ocupado aproximadamente el 95% de las veces. El segundo sitio de aparición para oligosacáridos ligados a O es Ser155/156 que está ocupado el 25% de las veces. Los datos ortogonales presentados en el presente documento proporcionan una visión general de las estructuras carbohidrato predominantes presentes en dichas moléculas de CTLA4-Ig y se resumen en la Figura 9.
En general, los carbohidratos ligados a O tienen mucha más heterogeneidad de estructura que la presentes en los carbohidratos ligados a N. Además, no hay secuencias consenso para la conexión unida a O. Por tanto, se desarrolló una serie de técnicas ortogonales para su uso en la caracterización estructural de los oligosacáridos ligados a O: análisis intacto por CL/EM y análisis glucopeptídico por CL/EM.
Basándose en la degradación Edman y MALDI, se describió un sitio unido a O que era Ser165 (con respecto a la SEC ID Nº: 2). Para obtener datos directos para la presencia de glucosilación Ser165, se realizó secuenciación por EM/EM usando series de iones b’ e y’’ sobre el péptido T9 (véase la Tabla 4 y la Tabla 5). La Tabla 4 indica las series de iones para el péptido T9 en cuatro estados de glucosilación diferentes. En los cuatro estados, las series de iones b’, b1... b6 son coincidentes. Sin embargo, las series de iones b’, b7 … bmáx varían por los diferentes estados de glucosilación en b7 (Ser165). Como una confirmación, se indican las series de iones y’’ correspondientes. En las cuatro series de iones y’’, los iones y1 … y19 coinciden por completo. Sin embargo, las series de iones y’’, y20 … ymax varían por los diferentes estados de glucosilación en y20 (Ser139). Las series de iones b’ e y’’ consideradas en su conjunto confirman la implicación de la secuenciación Edman de que la Ser139 es el sitio principal de glucosilación unida a O en el péptido T9. T9 es un péptido que contiene diversos restos de serina y treonina.
La Tabla 4 representa iones b’ e y’’ CL/EM/EM para el péptido T9 con y sin la escalera de (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 unida a O. Las series de iones b’ son idénticas para todos los espectros hasta b7 en el que después el espectro se diferencia por la estructura carbohidrato unida a O indicada en cada una de las series anteriores. Las series de iones y’ son idénticas para todos los espectros hasta y19 en el que después el espectro se diferencia por la estructura carbohidrato unida a O indicada en cada una de las series anteriores.
Tabla 4: iones b’ e y’’ CL/EM/EM para el péptido T9 5
T9-GalNAc-Gal-NeuAc
T9-GalNac-Gal T9-GalNac T9
b’
y’’ b’ y’’ b’ y’’ b’ yquot;
1 Thr 26
102,1 1 Thr 26 102,1 1 Thr 26 102,1 1 Thr 26 102,1
2 His 25
239,1 3243,6 2 His 25 239,1 2952,5 2 His 25 239,1 2790,5 2 His 25 239,1 2587,4
3 Thr 24
340,2 3106,6 3 Thr 24 340,2 28152,5 3 Thr 24 340,2 2653,4 3 Thr 24 340,2 2450,3
4 Ser 23
427,2 3005,5 4 Ser 23 427,2 2714,4 4 Ser 23 427,2 2552,4 4 Ser 23 427,2 2349,3
5 Pro 22
524,2 2918,5 5 Pro 22 524,2 2627,4 5 Pro 22 524,2 2465,3 5 Pro 22 524,2 2262,3
6 Pro 21
621,3 2821,4 6 Pro 21 621,3 2530,3 6 Pro 21 621,3 2368,3 6 Pro 21 621,3 2165,2
7 Olk 20
1364,6 2724,4 7 Oln 20 1073,52 2433,3 7 Oli 20 911,4 2271,2 7 Ser 20 708,3 2068,1
8 Pro 19
1461,6 1981,1 8 Pro 19 1170,5 1981,1 8 Pro 19 1008,5 1981,1 8 Pro 19 605,4 1981,1
9 Ala 18
1532,6 1884,1 9 Ala 18 1241,6 1884,1 9 Ala 18 1079,5 1884,1 9 Ala 18 876,4 1884,1
10 Pro 17
1629,7 1813,0 10 Pro 17 1338,6 1813,0 10 Pro 17 1176,6 1813,0 10 Pro 17 973,5 1813,0
11 Glu 16
1758,7 1716,0 11 Glu 16 1467,6 1716,0 11 Glu 16 1305,6 1716,0 11 Glu 16 1102,5 1716,0
12 Leu 15
1871,8 1586,9 12 Leu 15 1580,7 1586,9 12 Leu 15 1418,7 1586,9 12 Leu 15 1215,6 1586,9
13 Leu 14
1984,9 1473,8 13 Leu 14 1693,8 1473,8 13 Leu 14 1531,8 1473,8 13 Leu 14 1328,7 1473,8
14 Gly 13
2041,9 1360,8 14 Gly 13 1750,8 1360,8 14 Gly 13 1588,8 1360,8 14 Gly 13 1385,7 1360,8
15 Gly 12
2099,0 1303,7 15 Gly 12 18070,9 1303,7 15 Gly 12 1645,8 1303,7 15 Gly 12 1442,7 1303,7
16 Ser 11
2186,0 1246,7 16 Ser 11 1894,9 1246,7 16 Ser 11 1732,8 1246,7 16 Ser 11 1529,8 1246,7
17 Ser 10
2273,0 1159,7 17 Ser 10 1981,9 1159,7 17 Ser 10 1819,9 1159,7 17 Ser 10 1616,8 1159,7
50 Tabla 5: fragmentos glucopeptídicos ligados a O con los correspondientes números de secuencia, secuencias de aminoácidos y masas teóricas
Enzima
Fragmento enzimático Fragmento de secuencia Secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) Masa no modificada
Tripsina
T9 159-184 THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK 2688,44
AspN
D8 150-156 DQEPKSS 790,36
Tryp/chrmo
N/A 159-171 THTSPPSPAPELL 1345,7
Las estructuras de carbohidratos ligados a O en Ser165 representan una población heterogénea de tres especies principales. En la Figura 19, se observa el glucopéptido T9 en el espectro desconvolucionado. Hay un pico base a 2689,2 uma que coincide con la masa teórica de 2689,11 uma de este péptido. El espectro ilustra tres estructuras unidas a O principales. El espectro ilustra el péptido base con una escalera de azúcar que coincide con la estructura (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 unida a O. La parte en negrita ampliada del espectro se ha aumentado 10 veces e identifica dos estructuras adicionales unidas a O que coinciden con (GalNAc)1 (Gal)1, (NeuAc)2 y (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2.
Se usó espectrometría de masas para evaluar la redundancia relativa de cada especie unida a O. En la Figura 19, el glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 se observa a una proporción de 10:1 con el glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 y a una proporción de 30:1 con el glucano (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2. Por lo tanto en una realización, la población comprende moléculas de CTLA4-Ig que tienen una proporción de 10:1 de glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 con respecto a glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2. En otra realización, la población comprende moléculas de CTLA4-Ig que tiene una proporción de 30:1 de glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 con respecto a glucano (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2. El glucano (GalNAc) 1 (Gal)1 (NeuAc)2 se observa a una proporción de 20:1 con el glucano (HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2. En otra realización, la población comprende moléculas de CTLA4-Ig que tiene una proporción de 20:1 del glucano (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 con respecto al glucano (HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2. En otra realización, las moléculas de CTLA4-Ig de la población comprenden todas las proporciones indicadas este párrafo. Además, un espectro de electropulverización de ión negativo confirma estas tres estructuras predominantes; la abundancia relativa de cada una se muestra en la Figura 9.
Con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros de la SEC ID Nº: 2, además del sitio Ser165, se observa un segundo sitio de unión a O en Ser155 o Ser156. Este sitio denomina Ser155/156. El péptido D8 que contiene Ser155/156 se generó a partir de una digestión con AspN y corresponde a los aminoácidos 150-156 de la SEC ID Nº: 2. El péptido se separa y se detecta mediante CL/EM. El espectro (no mostrado en el presente documento) para el glucopéptido D8 unido a O muestra un pico base de 790,2 uma que coincide con la masa teórica de 790,8 uma. El espectro ilustra el ión peptídico y unas series de iones que coinciden con la estructura (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. El péptido está predominantemente no glucosilado; las especies (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 glucosiladas constituyen aproximadamente un área pico del 22%.
Las estructuras de oligosacáridos unidas a O de la molécula monocatenaria CTLA4-Ig se caracterizaron usando una serie de técnicas ortogonales de espectrometría de masas. Estas técnicas incluyen escisiones con endopeptidasa con análisis de CL/EM de los dos sitios de glucosilación ligados a N predominantes con el uso de ionización por electropulverización para determinar las estructuras predominantes en cada de sitio de unión a O. Estos datos se resumen en la Figura 20. Puede haber cuatro estructuras predominantes unidas a O: (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1; (GalNAc)1(Gal)1 (NeuAc)2; (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2; (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)3. Estas estructuras se detectan en diferentes cantidades en cada sitio. Mas del 95% de la molécula monocatenaria CTLA4-Ig tiene al menos (HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2.
Se desarrolló otro ensayo para confirmar los carbohidratos ligados a O e investigar estructuras menos frecuentes. Esta técnica utilizó co-digestión con tripsina y quimiotripsina para producir un péptido que, mediante EM/EM, se confirmó que era THTSPPSPAPELL (aminoácidos 159-171 de la SEC ID Nº: 2). Este péptido permite la identificación de una especie unida a O monosialilada, dos di-sialiladas y una tri-sialilada. Aún no se ha aclarado una estructura definitiva de la especie tri-sialilada, sin embargo, se proponen dos posibilidades: un péptido que contenga una estructura de 2 núcleos con tres ácidos siálicos o 1 estructura de dos núcleos presente en dos restos de aminoácido diferentes.
Se usó una técnica complementaria, análisis intacto por EM, para confirmar la presencia de O-glucosilaciones heterogéneas unidas a O de las moléculas de CTLA4-Ig. Los dímeros de CTLA4-Ig y la molécula monocatenaria de CTLA4-Ig se trataron con PNGasa F para eliminar los oligosacáridos ligados a N. Después, el espectrómetro de masas detectó la molécula y los iones correspondientes se desconvolucionaron en el espectro. En el material monocatenario, la composición de glucano predominante es (HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2, mientras que la referencia es predominantemente (HexNAc)1(Hex)1(NeuAc)1. Las composiciones de glucosilación coinciden con las observadas durante el análisis peptídico por CL/EM. Además de un cambio en el patrón O-glucosilación, se observó una segunda modificación principal. Se observó un cambio de masa de 113 ! 4 u entre la especie monocatenaria no reducida y la CTLA4Ig reducida convencional. El cambio de masa de 113 ! 4 u desapareció después de la reducción con DTT. En el material dimérico, la envoltura iónica resultante se desconvolucionó en un espectro (no mostrado en el presente documento) con un pico principal a 79944 uma, que corresponde a la presencia de dos estructuras (GalNAc)1, (Gal)1, (NeuAc)1. El siguiente pico más grande, a 80600 uma, corresponde a tres estructuras unidas a O
o a una combinación de, a lo sumo, una estructura ramificada unida a O. El tercer pico más grande corresponde a cuatro estructuras unidas a O o a una combinación que contiene, a lo sumo, dos estructuras ramificadas unidas a O.
Determinación del contenido de ácido siálico
Otro aspecto de la caracterización de las glucoproteínas es la determinación del contenido de ácido siálico. El contenido de ácido siálico puede ser una firma característica de las glucoproteínas. El contenido de ácido siálico de una proteína descrita en el presente documento puede evaluarse mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ácido siálico puede determinarse individualmente mediante un procedimiento colorimétrico directo (Yao y col., 1989, Anal. Biochem., 179: 332-335) usando al menos muestras por triplicado. Otro procedimiento de determinación del contenido de ácido siálico implica el uso de ácido tiobarbitúrico (TBA), como describen Warren y col., 1959, J. Biol. Chem., 234: 1971-1975. Otro procedimiento implica cromatografía de alto rendimiento, tal como describen H. K. Ogawa y col., 1993, J. Chromatography, 612: 145-149.
En una realización, un procedimiento para determinar la cantidad de ácido N-acetil neuramínico (NANA) y ácido Nglucolil neuramínico (NGNA) es mediante tratamiento con hidrólisis ácida de la glucoproteína de interés (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3). En este procedimiento, NANA y NGNA se escinden de la proteína por hidrólisis ácida. La glucoproteína puede purificarse sustancialmente por procedimientos adecuados para su purificación. El NANA y el NGNA liberados se separan por HPLC en una columna RHM de Monosacáridos Rezex y se detecta por absorbancia UV (206 nm). NANA y NGNA se cuantifican basándose en los factores de respuesta de los patrones NANA y NGNA procesados simultáneamente. Los resultados pueden presentarse como proporciones molares (PM) de NANA y NGNA respectivamente, con respecto a la proteína.
La finalidad del procedimiento de hidrólisis ácida para medir el contenido de ácido siálico es medir la cantidad de ácido siálico total (NANA y NGNA) con respecto a la proteína en muestras de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig (proporciones molares). Sin embargo, es importante observar, que estas proporciones molares de ácido siálico incluyen NANA y NGNA tanto unidos como libres. Los resultado de las proporciones molares se obtienen basándose en la comparación del área pico de NANA y NGNA a partir de muestras de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig hidrolizadas frente a patrones de NANA y NGNA no hidrolizados. También pueden usarse patrones hidrolizados de NANA y NGNA.
Por ejemplo, se obtuvieron proporciones molares para moléculas de CTLA4-Ig que tenían las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. Sin hidrólisis, el pico de interés en los cromatogramas de los patrones de NANA y NGNA aparecen como un solo pico. Cuando el patrón de NANA y las muestras de CTLA4-Ig se hidrolizan, los cromatogramas resultantes muestran a NANA como un pico principal seguido de cerca por un pequeño pico en forma de hombro (∃10% del área pico principal; denominado “NANA degradado”); se obtuvo la misma concentración de patrones NANA con y sin hidrólisis en áreas picos cercanas, incluyendo el degradante. No se observa claramente ningún pico en los cromatogramas para una especie NGNA degrada, aunque se observó que los recuentos del área del pico de NGNA en un patrón NGNA hidrolizado disminuían aproximadamente 8-9%. Experimentos realizados de espectrometría de masas (EM) demostraron que el “degradante NANA”, tanto en el patrón NANA hidrolizado como en las muestras de CTLA4-Ig hidrolizadas se produce por la pérdida de 18 Daltons (agua) de NANA. Por lo tanto, el procedimiento incluye apropiadamente el pequeño pico en forma de hombro en la integración del pico de NANA en la CTLA4-Ig hidrolizada. También se demostró mediante experimentos de EMS que NGNA se degradaba después de hidrólisis con una pérdida de 18 DaltonS. El degradante NGNA se eluyó entre NANA y el degradante NANA de tal manera que el UV no lo detectó. En el material CTLA4-Ig, el contenido de NGNA es casi el 5% del contenido de NANA y, como resultado, la co-elución del degradante NGNA produce un cambio menor del 0,5% del área pico de NANA, lo que está dentro del intervalo de variabilidad del área pico de NANA. El procedimiento no puede incluir el área de NGNA degradado en el resultado de NGNA; por lo tanto, el resultado de NGNA puede ser inferior que ∃ 10%, lo que también está dentro de la variabilidad del procedimiento.
Dado que se piensa que el NGNA es más inmunogénico que el NANA, existe una preferencia clínica de un agente terapéutico recombinante que contenga una proporción molar de NGNA baja. En una realización de la invención, el predominio del ácido siálico en una población de moléculas de CTLA4-Ig es NANA y no NGNA, en el que en esta población la proporción molar de moles de ácido siálico por mol de moléculas o dímero de CTLA4-Ig es de aproximadamente 5 a aproximadamente 18. En otra realización, el predominio de ácido siálico en una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig es NANA y no NGNA, en el que en esta población la proporción molar de moles de ácido siálico por mol de moléculas o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig es de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5.
Casetes de expresión de CTLA4-Ig y CTLA4A29YL104E-Ig
Un ácido nucleico que codifica una molécula de CTLA4-Ig puede ser un casete de expresión. Además, en el presente documento se describe un ácido nucleico codifica una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig. El ácido nucleico que codifica la molécula de CTLA4-Ig puede incluirse dentro de un casete de expresión. El ácido nucleico que codifica la molécula de CTLA4-Ig puede incluirse dentro de un casete de expresión derivado de un plásmido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. El ácido nucleico que codifica la molécula de CTLA4A29YL104E-Ig puede incluirse dentro de un casete de expresión. El ácido nucleico que codifica la molécula de CTLA4A29YL104E-Ig puede incluirse dentro de un casete de expresión derivado de un plásmido depositado en la ATCC con el Nº de registro PTA-2104.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden ser una molécula de ácido nucleico de ADNc, similar a ADNc, ADN o ARN de interés en un formato que expresable, tal como un casete de expresión, que puede expresarse a partir del promotor natural o de un derivado del mismo o de un promotor completamente heterólogo. Como alternativa, el ácido nucleico de interés puede codificar un ARN antisentido. El ácido nucleico de interés puede codificar una proteína (por ejemplo, una glucoproteína, tal como la glucoproteína de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig), y puede o no incluir intrones.
El ácido nucleico que codifica un péptido que tiene actividad CTLA4 puede obtenerse a partir de ADN genómico de células T o de ARNm presente en linfocitos T activados. El ácido nucleico que codifica una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig también puede obtenerse a partir de ADN genómico de células T o de ARNm presente en linfocitos T activados. El gen que codifica una proteína de interés, por ejemplo CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig, puede clonarse a partir de una genoteca o de un ADNc de acuerdo con protocolos convencionales que realiza un experto en la técnica. Un ADNc que codifica, por ejemplo, CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig, puede obtenerse aislando ARNm total de una línea celular adecuada. Usando procedimientos conocidos en la técnica, pueden prepararse ADN bicatenarios a partir del ARNm total y posteriormente puede insertarse en un vector bacteriófago o plásmido adecuado. Los genes también pueden clonarse usando técnicas PCR bien establecidas en la materia. Un gen que codifica CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig puede clonarse mediante PCR de acuerdo con la información de secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento.
Un vector de ADN que contiene un ADNc de CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig puede actuar como un molde en reacciones PCR en las que, para obtener un fragmento de ADN aislado que incluye esa región, pueden usarse cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar una región de interés. La región de interés diana en el ADNc de CTLA4 puede ser el dominio extracelular de CTLA4, incluyendo el dominio extracelular de CTLA4 humano. La región de interés diana en el ADNc de CTLA4A29YL104E-Ig puede ser el dominio extracelular de CTLA4 con cambios de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 55 y 130 de la SEC ID Nº: 2 (véase, por ejemplo, la SEC ID Nº: 18) incluyendo el dominio extracelular de CTLA4 humano con los cambios de aminoácidos descritos anteriormente.
Para expresar una proteína de fusión en el contexto de la presente invención, la fusión del gen quimérico (por ejemplo un gen que codifica una proteína de fusión CTLA4-inmunoglobulina (CTLA4-Ig) o una proteína de fusión CTLA4A29YL104E-Ig) puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal mediante la cual, después de la transcripción y la traducción del gen quimérico, se dirige la proteína de fusión recientemente sintetizada para la secreción. Puede usarse una secuencia señal de CTLA4 nativa (por ejemplo, la secuencia señal de CTLA4 humana descrita en Harper, K., y col. (1991, J. Immunol. 147,1037-1044). Como alternativa, puede usarse una secuencia señal heteróloga para dirigir la secreción de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig (por ejemplo, la secuencia señal de oncostatina-M (Malik N., y col., 1989, Mol Cell Biol 9(7), 2847-2853) o una secuencia señal de inmunoglobulina). Un experto en la técnica entiende que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia señal puede insertarse en la fusión del gen quimérico mediante técnicas convencionales de ADN recombinante, tal como realizando un ligamiento en fase de lectura de la secuencia señal en el extremo 5’ de una secuencia de ácido nucleico que codifica CTLA4.
De acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína de fusión de CTLA4-Ig se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, el 31 de mayo, de 1991. Se le ha asignado el Nº de registro 68629 de la ATCC. Adicionalmente, un plásmido de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína CTLA4A29YL104E-Ig se depositó de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest el 19 de junio de 2000 en la ATCC. Al plásmido depositado se le ha asignado el Nº de Registro PTA-2104 de la ATCC. El plásmido depositado también se denomina pD16 LEA29Y y pD16 L104EA29Y. En la Patente de Estados Unidos Nº 7.094.874 y en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos relacionadas Nos 09/579.927, 60/287.576 y 60/214.065, y en la Publicación de Patente Internacional Nº WO 01/923337 A2 también se describe la proteína CTLA4A29YL104E-Ig.
Puede usarse un vector de expresión descrito en el presente documento para transfectar células, eucariotas (por ejemplo, células de levadura, de mamífero o de insecto) o procariotas, para producir proteínas (por ejemplo, proteínas de fusión, tales como las moléculas de CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig y similares) codificadas por las secuencias de nucleótidos del vector. Un experto en la técnica entiende que, en procariotas, la expresión de productos de proteínas deseados se realiza más frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Algunos vectores de expresión de E. coli (conocidos también en la técnica como vectores de fusión) se diseñan para añadir un número de restos de aminoácidos, normalmente en el extremo N de la proteína recombinante expresada. Dichos vectores de fusión pueden realizar tres funciones: 1) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante deseada; 2) aumentar la expresión de la proteína recombinante de interés y 3) ayudar a purificar la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Algunos ejemplos de vectores de expresión de fusión incluyen, pero sin limitación: a) pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), que fusiona la glutatión S-transferasa con la proteína deseada; b) pcDNA∋ 3.1/V5-His A B y C (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) que fusiona 6x-His con las proteínas recombinantes de interés; y c) pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) que fusiona la proteína de unión a maltosa E con la proteína recombinante diana.
Las células adecuadas para cultivar de acuerdo con los procesos y procedimientos descritos en el presente documento pueden contener vectores de expresión introducidos (construcciones), tales como plásmidos y similares. Las construcciones de vectores de expresión pueden introducirse mediante transfección, lipofección, transformación, inyección, electroporación o infección. Los vectores de expresión pueden contener secuencias codificantes, o partes de las mismas, que codifican las proteínas para la expresión y producción en los procesos de cultivo. Dichos vectores de expresión pueden incluir los componentes necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los vectores de expresión que contienen secuencias que codifican las proteínas y los polipéptidos producidos, así como los elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados, pueden generarse usando procedimientos bien conocidos y realizados por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo que se describen en J. Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y en F. M. Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.
En un vector de expresión recombinante (por ejemplo, un plásmido) puede usarse un marcador de selección, en el que el vector se integra de manera estable en el genoma de la célula, para otorgar resistencia a las células que contienen el vector. Esto permite su selección en un medio de selección apropiado. Pueden usarse diversos sistemas de selección incluyendo, pero sin limitación, los genes de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT), timidina quinasa del Virus del Herpes Simple (HSV TK), (Wigler y col., 1977, Cell, 11: 223), (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 48: 202), y de adenina fosforribosiltransferasa (APRT), (Lowy y col., 1980, Cell, 22: 817), que pueden emplearse en células hgprt-, tk-o aprt-, respectivamente.
Como base de selección para resistencia anti-metabolitos también pueden usarse los siguientes ejemplos, no limitantes, de genes marcadores, que pueden estar dentro de un vector de expresión: gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 78: 2072); dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77: 357; y O’Hare y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 78: 1527); higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., 1984, Gene, 30: 147); y neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418 (Clinical Pharmacy, 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy, 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science,
260: 926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-21; mayo, 1993, TIB Tech, 11 (5): 155-215). Pueden usarse técnicas de ADN recombinante normalmente conocidas en la técnica aplicadas rutinariamente para seleccionar los clones de células recombinantes deseados. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; en los capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., 1981. J. Mol. Biol., 150: 1.
Los niveles de expresión de una molécula de proteína expresada pueden aumentarse mediante la amplificación del vector de expresión (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, “The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA Cloning”, Vol. 3, Academic Press, Nueva York, 1987). Un aumento en el nivel de un inhibidor presente en el medio de cultivo de una célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador cuando un marcador es amplificable en el sistema del vector de expresión que expresa una proteína de interés. Dado que la región amplificada está asociada con el gen que codifica la proteína, la producción de proteína aumentará simultáneamente (Crouse y col., 1983, Mol. Cell. Biol., 3: 257). Los vectores que contienen las secuencias de ácido nucleico que codifican los marcadores de selección glutamina sintasa (GS) o dihidrofolato reductasa (DHFR) pueden amplificarse en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de dichos vectores es la disponibilidad de líneas celulares, por ejemplo, la línea celular de mieloma murino, NSO y la línea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO), DG44, que son negativas a glutamina sintasa y a dihidrofolato reductasa, respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína de fusión de CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig soluble puede insertarse en un vector de expresión diseñado para expresar secuencias exógenas en un huésped eucariota. Los componentes reguladores del vector pueden variar de acuerdo con el huésped eucariota seleccionado para su uso. Los vectores usados para expresar la CTLA4 o CTLA4A29YL104E-Ig soluble en células huésped eucariotas pueden incluir secuencias potenciadoras para optimizar la expresión de la proteína.
Las células de mamífero (tales como células BHK, células VERO, células CHO y similares) pueden contener un vector de expresión (por ejemplo, uno que contenga un gen que codifique la proteína de fusión CTLA4-Ig o la proteína de fusión CTLA4A29YL104E-Ig) mediante la introducción del vector de expresión en una célula huésped apropiada. Por consiguiente, l en el contexto de la presente invención se describen vectores de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig y las células huésped en las que dichos vectores de expresión pueden introducirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un vector de expresión descrito en el presente documento puede incluir secuencias de nucleótidos que codifiquen una proteína de fusión CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig unidas a al menos una secuencia reguladora, de manera que se permita la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula huésped. Para los expertos en la técnica, las secuencias reguladoras son bien conocidas y pueden seleccionarse para dirigir la expresión de una proteína de interés en una célula huésped apropiada, como se describe en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras pueden comprender los siguientes elementos: potenciadores, promotores, señales de poliadenilación y otros elementos de control de expresión. Los profesionales en la técnica entienden que el diseño de un vector de expresión puede depender de factores tales como, la elección de la célula huésped que vaya a transfectarse y/o del tipo y/o de la cantidad de proteína deseada que vaya a expresarse.
Los plásmidos de clonación y expresión (por ejemplo, pcSD y piLN) se construyen como se describe en el Ejemplo
11. Un fragmento de ADN aislado del plásmido pSV2dhfr-puede ligarse a la estructura del vector pcDNA3 generando el vector de expresión pcSD. El vector pcSD comprende las siguientes características: un promotor de citomegalovirus (CMV) seguido de un sitio de clonación múltiple (SCM); una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (HCB) y una secuencia de terminación transcripcional; una secuencia de ADNc del dhfr de ratón para la selección y amplificación; un gen de resistencia a ampicilina; y un origen de replicación pUC para la selección y conservación en Escherichia coli. El vector piLN se construye conteniendo los ADNc que codifican partes de la secuencia de aminoácidos correspondientes a un fragmento del dominio extracelular del receptor de CTLA4 humano del Ejemplo 11, en el que el ADNc que codifica una primera secuencia de aminoácidos está unido a un ADN que codifica una segunda secuencia de aminoácidos, que corresponde a una región de IgC que permite la expresión del gen del receptor de CTLA4 modificando la solubilidad de la proteína CTLA4 expresada (véase la FIG. 1 y la breve descripción de la FIG. 1 para restos correspondientes a la parte extracelular de CTLA4 y la región constante de IgG1). Una secuencia peptídica señal de oncostatina M puede fusionarse a la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 que posteriormente se fusiona con una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de Ig (por ejemplo, el dominio de IgC(1 humano), como se ha descrito anteriormente en la FIG. 1. La secuencia señal de oncostatina M permite generar formas solubles del producto de proteína (por ejemplo CTLA4-1g) del gen de CTLA4.
Para construir un vector de expresión pcSD que contenga un gen que codifique la proteína de fusión CTLA4inmunoglobulina, pueden usarse procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, subclonación en sitios de restricción). El material de partida puede ser un fragmento de ADN digerido o escindido del vector de clonación piLN descrito en el Ejemplo 11. El fragmento de ADN escindido de dicho vector puede contener la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal de oncostatina M y la proteína de fusión CTL4Ig, en el que dicho fragmento de ADN está ligado al vector pcSD digerido. El fragmento de ADN oncostatina M-CTLA4-Ig puede insertarse entre el promotor del CMV y un casete que contiene la señal de poliadenilación de la HCB y la secuencia de terminación transcripcional. Esto colocaría a un producto génico CTLA4-Ig bajo el control del promotor del CMV en el plásmido denominado pcSDhuCTLA4-Ig (Figura 21; SEC ID Nº: 17).
Adicionalmente, los plásmidos de clonación y expresión (por ejemplo, pD16LEA29Y) pueden derivar del plásmido pcDNA3 de Invitrogen. El vector pD16LEA29Y (FIG. 22) comprende las siguientes características: el gen de resistencia a neomicina de pcDNA3 se sustituyó por el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) murino bajo el control del promotor del SV40 menos potenciado (debilitado); el gen que codifica una CTLA4A29YL104E-Ig se expresó a partir del promotor del CMV, y la señal de poliadenilación es del gen de la hormona del crecimiento bovino; el casete de expresión del gen de interés está flanqueado por secuencias de terminación de la transcripción, es decir, 5’ con respecto al promotor y 3’ con respecto al sitio poli A; los vectores contienen dos poliengarces en distintos sitios de restricción, uno en dirección 3’ con respecto al promotor para clonar el gen de interés, y otro en dirección 5’ con respecto al promotor para la linealización del vector antes de la transfección; el vector contiene un gen de resistencia ampicilina y el origen de replicación ColE1 para la propagación del plásmido en E. coli; la secuencia de CTLA4A29YL104E-Ig (SEC ID Nº: 3) está precedida por el péptido señal de Oncostatina M y ensamblada en el vector de expresión conocido como vector pD16LEA29Y.
El vector se construye conteniendo los ADNc que codifican partes de la secuencia de aminoácidos correspondientes a un fragmento del dominio extracelular del receptor de CTLA4 humano (SEC ID Nº: 2), en el que el aminoácido Ala en la posición 55 se reemplaza por el aminoácido Tyr y el aminoácido Leu en la posición 130 se reemplaza por el aminoácido Glu (Figura 3). Estos cambios de aminoácidos se representan en la secuencia de aminoácidos de la CTLA4A29YL104E-Ig que tiene la SEC ID Nº: 4. El ADNc que codifica una primera secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia que codifica una CTLA4A29YL104E-Ig) se une al ADN que codifica una segunda secuencia de aminoácidos, que corresponde a una región de IgC que permite la expresión del gen del receptor de CTLA4A29YL104E-Ig modificando la solubilidad de la proteína CTLA4A29YL104E-Ig expresada (véase la FIG. 3 y la breve descripción de la FIG. 3 para restos correspondientes a la parte extracelular de CTLA4 modificada y a la región constante de IgG1) que tiene la SEC ID Nº: 3.
Una secuencia peptídica señal de oncostatina M puede fusionarse a la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 que posteriormente se fusiona con una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de Ig (por ejemplo, el dominio de IgC(1 humano) como se ha descrito previamente en la FIG. 3. La secuencia señal de oncostatina M permite generar formas solubles del producto de proteína (por ejemplo, CTLA4A29YL104E-Ig) del gen de CTLA4
Transfección estable para generar líneas celulares
Los vectores que contienen ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar) pueden transformarse en células huésped adecuadas (por ejemplo, células bacterianas) para producir grandes cantidades de ADN clonado. Algunos ejemplos no limitantes de células bacterianas para la transformación incluyen las cepas de E. coli de la línea celular bacteriana DH5 o MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, California), que pueden transformarse usando procedimientos convencionales realizados en la técnica, y después las colonias pueden explorarse con respecto a la expresión del plásmido apropiado.
Los vectores de expresión para células eucariotas, tales como células de mamífero, pueden incluir secuencias promotoras y de control compatibles con células de mamífero. Estos elementos reguladores pueden ser, por ejemplo, un promotor de CMV encontrado en el vector pcSD o pD16LEA29Y, o el virus del sarcoma aviar (VSA) localizado en el vector piLN. Otros promotores tempranos y tardíos normalmente usados incluyen, pero sin limitación, los procedentes del Virus del Simio 40 (SV 40) (Fiers, y col., 1973, Nature 273: 113), u otros promotores virales, tales como los derivados del virus del papiloma bovino, polioma, y Adenovirus 2. También puede usarse el promotor regulable, hMTII (Karin, y col., 1982, Nature 299: 797-802), junto con otros conocidos en la técnica. Para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células SF 9), algunos vectores de baculovirus disponibles incluyen la serie pVL (Lucklow, V. A., y Summers, M. D., 1989, Virology 170: 31-39) y la serie pAc (Smith y col., 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165). Un profesional experto en la técnica también entiende que las regiones potenciadoras (aquellas secuencias encontradas aguas arriba o aguas abajo de la región promotora en regiones de ADN no codificantes) también son importantes en la optimización de la expresión. Si fuese necesario, pueden emplearse orígenes de replicación de fuentes virales, por ejemplo, si se utiliza un huésped procariota para la introducción de ADN plasmídico. Sin embargo, la integración en el cromosoma es un mecanismo habitual para la replicación de ADN en organismos eucariotas.
Como alternativa al empleo de células huésped de mamíferos (tales como células CHO) para la expresión de una proteína deseada (por ejemplo, proteínas de fusión, glucoproteínas y similar), también pueden usarse, como huésped, otros organismos eucariotas. Pueden usarse cepas de laboratorio de la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae (también conocida como levadura del panadero o levadura del cervecero) así como otras cepas de levadura, tal como la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Los vectores de levaduras que contienen ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig), pueden utilizar el origen de replicación de Broach de 2∀, Meth. Enz. 101: 307 (1983), u otros orígenes de replicación compatibles con levaduras (por ejemplo, Stinchcomb y col., 1979, Nature
282:
39; Tschempe y col., 1980, Gene 10: 157; y Clarke y col., 1983, Meth. Enz. 101: 300). Un elemento regulador incluido en vectores de levadura puede ser un promotor para la síntesis de enzimas glucolíticas (Hess y col., 1968,
J.
Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland y col., 1978, Biochemistry 17: 4900).
Un experto en la técnica también puede utilizar otros promotores en los que las condiciones de cultivo pueden regular la transcripción de dicho gen regulable y pueden incluir los siguientes ejemplos no limitantes: isocitocromo C, alcohol deshidrogenasa 2, enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa, fosfatasa ácida, y enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno. Similares a los sistemas de expresión de mamíferos, las secuencias terminadoras en los vectores de expresión de levaduras también son deseables en el extremo 3’ de las secuencias codificantes y se encuentran en la región 3’ no traducida después de la fase de lectura abierta en los genes derivados de levadura. Algunos ejemplos no limitantes de vectores de levadura adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en levaduras (por ejemplo, en S. cerevisiae) incluyen pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y col., 1987, Gene 54: 113-123), pYepSec1 (Baldari, y col., 1987, Embo J. 6: 229-234), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California), así como los pertenecientes a la familia pRS de vectores de levadura.
Los clones, por ejemplo, clones bacterianos, que contienen ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar), obtenidos como se ha descrito anteriormente, pueden después transfectarse en células huésped adecuadas, tales como células de mamífero, para la expresión del producto deseado. Las técnicas de transfección se realizan usando técnicas convencionales establecidas en el campo técnico y que son apropiadas para dichas células huésped, en las que la técnica de transfección depende de la célula huésped que vaya a usarse. Por ejemplo, la transfección de células de mamífero puede conseguirse usando lipofección, fusión de protoplastos, transfección mediada por dextrano-DEAE, co-precipitación con CaPO4, electroporación, microinyección directa, así como otros procedimientos conocidos en la técnica que pueden comprender: raspado, captación directa, choque osmótico o con sacarosa, fusión con lisozimas o fusión con eritrocitos, microinyección indirecta, tal como mediante técnicas mediadas por eritrocitos, y/o sometiendo a las células huésped a corrientes eléctricas. Como se desarrollarán otras técnicas para introducir información genética en células huésped, la lista de procedimientos de transfección anteriormente mencionada no se considera que sea exhaustiva.
La expresión de ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar) en células huésped eucariotas derivadas de organismos multicelulares (por ejemplo, de origen mamífero) es particularmente utilizada en el contexto de la presente invención (Tissue Cultures, Academic Press, Cruz y Patterson, Eds. (1973)). Las células huésped derivadas de organismos multicelulares tienen la capacidad de dividirse en intrones y por tanto pueden usarse directamente para expresar fragmentos de ADN genómico. Como se ha indicado anteriormente, las líneas de células huésped útiles incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células BHK, células renales de mono (COS), VERO y HeLa. En la presente invención, se utilizan líneas celulares expresan de modo estable la proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar). Una línea celular de mamífero, (tal como la línea celular CHO) puede transfectarse (por ejemplo por electroporación) con un vector de expresión (por ejemplo, pcSDhuCTLA4-Ig, pD16LEA29Y, y similar) que contenga una secuencia de ADN que codifique una glucoproteína de interés. La glucoproteína de interés puede ser una proteína CTLA4-Ig, incluyendo la proteína (o proteínas) CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en la SEC ID Nº: 2, codificada por una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1. La glucoproteína de interés puede ser una CTLA4A29YL104E-Ig, incluyendo la CTLA4A29YL104E-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en la SEC ID Nº: 4, codificada por una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 23.
Una proteína recombinante, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig, puede expresarse en células huésped eucariotas, tales como células de mamífero (por ejemplo, células CHO, BHK, VERO o NSO), células de insecto (por ejemplo, usando un vector baculovirus), o células de levadura. Los expertos en la técnica pueden usar otras células huésped adecuadas, tales como las descritas anteriormente, en el contexto de la presente invención. Puede emplearse la expresión de una proteína de fusión recombinante (tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) eucariota, en lugar de procariota. La expresión de proteínas recombinantes eucariotas, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig humana, en células eucariotas, tales como células CHO, pueden conducir a la glucosilación parcial y/o completa, así como la a formación de enlaces disulfuro intra-o inter-catenarios. Para realizar la amplificación transitoria y la expresión de una proteína deseada, un vector que contiene ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo construcciones de fusión, glucoproteínas y similar, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) se transmite al interior de las células eucariotas mediante un procedimiento de transfección conocido en la técnica pero no integrado en el genoma de la célula. La expresión de genes transfectados puede medirse a las 16-96 horas. Para expresar de manera transitoria una proteína deseada, pueden utilizarse células de mamífero (tales como células COS) junto con vectores, tales como pCDM8 (Gluzman, Y., 1981, Cell 23: 175-182; Seed, B., 1987, Nature 329: 840).
En la técnica se sabe que para realizar la transfección estable de células de mamífero, una pequeña fracción de células puede integrar ADN en sus genomas y el éxito de la integración puede depender del vector de expresión y del procedimiento de transfección utilizado. Para realizar la amplificación estable y la expresión de una proteína deseada, un vector que incluye ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo construcciones de fusión, glucoproteínas y similar, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) se integra de manera estable en el genoma de células eucariotas (tal como células de mamífero), produciendo la expresión estable de genes transfectados. Para identificar y seleccionar clones que expresen de manera estable un gen que codifique una proteína de interés, puede introducirse un gen que codifique un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores de selección que utiliza un experto en la técnica pueden ser los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418 e higromicina. El gen que codifica un marcador de selección puede introducirse en una célula huésped en un plásmido distinto o puede introducirse en el mismo plásmido que el gen de interés. Las células que contienen el gen de interés pueden identificarse por selección de fármacos en las que las células que tienen incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán en presencia de dicho fármaco, mientras que las células que no tienen incorporado el gen marcador de selección mueren. Las células supervivientes pueden después explorarse con respecto a la producción de la proteína deseada (por ejemplo, una proteína CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig).
Como se ha descrito anteriormente, las células CHO carentes de expresión del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) solo pueden sobrevivir con la adición de nucleósidos. Cuando dichas células se transfectan de manera estable con un vector de ADN que contiene el gen dhfr, las células pueden entonces producir los nucleósidos necesarios. Usando el gen dhfr como el marcador de selección, un experto en la técnica sabe que, en presencia del antimetabolito, metotrexato, se produce fácilmente la amplificación génica de dhfr así como el gen de interés transfectado (por ejemplo, CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig). Pueden transfectarse células de mamífero, tales como células CHO dhfr-, con un vector de expresión, tal como pcSDhuCTLA4-Ig (Ejemplos 11-13) o pD16LEA29Y, para generar una población de células que pueda amplificarse de manera estable y que pueda expresar de manera estable un producto de proteína (tal como CTLA4-Ig o el oligopéptido beta p CTLA4A29YL104E-Ig, respectivamente) deseado. La línea celular dhfr-negativa DG44 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) puede emplearse para la transfección estable. La transfección puede producirse mediante electroporación.
Como se realiza fácilmente en la técnica, las células de mamífero transfectadas (por ejemplo, células CHO dhfrnegativas) se conservan en medio no selectivo que contiene suero durante 1-2 días posteriores a la transfección. Después, las células se tratan con tripsina y vuelven a sembrarse en placas en medio con suero, en presencia de una presión selectiva (por ejemplo, un fármaco tal como metotrexato). Las células se cultivan en medio selectivo con suero durante 2-3 semanas, realizando cambios frecuentes del medio selectivo para eliminar restos y células muertas, hasta que pueden observarse colonias diferenciadas. Las colonias individuales pueden después someterse a digestión con tripsina y disponerse en placas multipocillo para propagación y amplificación posterior en presencia de medio selectivo para identificar los productores que expresan un alto nivel la proteína deseada (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas y similar) mediante procedimientos establecidos en la técnica, tales como ELISA o inmunoprecipitación. El procedimiento descrito anteriormente puede realizarse para transfectar células CHO dhfr-negativas (por ejemplo células DG44) para establecer una línea celular estable que exprese una proteína recombinante de interés (por ejemplo, una proteína CTLA4-Ig) (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 12-13). Puede establecerse una línea celular estable que exprese una CTLA4A29YL104E-Ig (véase el EJEMPLO 23).
Una línea CHO estable descrita en el presente documento expresa de manera estable moléculas de proteína CTLA4-Ig como monómeros de CTLA4-Ig que tienen la secuencia (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2 y (vi) 25383 de la SEC ID Nº: 2. Esta línea celular puede segregar una población de moléculas de CTLA4-Ig que puede existir como formas multiméricas (tales como dímeros, tetrámeros, y similar), en la que la forma multimérica puede tener diferentes secuencias monoméricas de la SEC ID Nº: 2. El casete de expresión integrado en esta línea celular comprende la SEC ID Nº: 1, y está contenido en el vector pcSDhuCTLA4-Ig.
Puede usarse una línea CHO estable, que expresa de manera estable una CTLA4A29YL104E-Ig. La línea celular puede ser una línea que exprese monómeros de CTLA4A29YL104E-Ig que tengan la secuencia (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4,
(ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4, y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4. La línea celular puede ser una línea que segrege una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que puede existir como formas multiméricas (tales como dímeros, tetrámeros y similar), en la que la forma multimérica puede tener diferentes secuencias monoméricas de la SEC ID Nº: 4. El casete de expresión integrado en esta línea celular comprende la SEC ID Nº: 3, y está contenido en el vector pD16LEA29Y.
Subclonación para generar una población clonal de células
Las células identificadas como productoras de una proteína deseada (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas, y similar) se aíslan del cultivo celular y posteriormente se amplifican en condiciones equivalentes a las de producción, en las que el medio de cultivo puede contener suero. Pueden emplearse procedimientos de subclonación conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitación, clonación con agar suave. Después, los clones obtenidos de células recombinantes estables pueden multiplicarse adicionalmente en condiciones aséricas y sin productos animales. Un clon celular estable que exprese el producto de proteína deseado (por ejemplo CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig, y similar) se consigue obteniendo un clon celular recombinante a partir de un cultivo celular que se obtiene después de cultivar un clon celular original recombinante en medio con suero y re-adaptando a las células al medio asérico y sin productos animales. Los clones celulares que expresan CTLA4-Ig pueden continuar cultivándose en medio asérico y sin productos animales durante al menos 50 generaciones. Los clones celulares pueden continuar cultivándose como se ha descrito anteriormente durante al menos 75 generaciones. Los clones celulares también pueden continuar cultivándose en medio asérico y sin productos animales durante al menos 100 generaciones.
Los clones celulares que expresan CTLA4A29YL104E-Ig pueden continuar cultivándose en medio asérico y sin productos animales durante al menos 27 generaciones. Los clones celulares pueden continuar cultivándose como se ha descrito anteriormente durante al menos 75 generaciones. Adicionalmente, los clones celulares pueden cultivarse en medio asérico y sin productos animales durante al menos 100 generaciones.
Puede usarse una línea celular que produzca moléculas de CTLA4-Ig que comprenda monómeros de la SEC ID Nº: 2, en la que la línea celular sea estable durante más de 100 generaciones y en la que la línea celular comprenda de manera estable: (1) duplicar el tiempo en la generación 100 que es menor que aproximadamente 24,5 ! 2,6 horas;
(2) viabilidad celular en la generación 100 que es mayor que 95%, (3) la valoración de la producción de CTLA4-Ig en biorreactores de 5 l es mayor de 1,69 mg/ml en la generación 100; (4) la proporción molar de ácido siálico con respecto a proteína es de aproximadamente 9,3 a aproximadamente 11,0 en la generación 105.
El clon celular recombinante estable descrito en el presente documento se presenta en forma aislada en la que el aislamiento puede producirse de acuerdo con procedimientos realizados en la técnica (por ejemplo, clonación con agar suave o clonación con dilución limitada o similar). El clon celular recombinante estable deriva de una célula de mamífero recombinante (por ejemplo, una célula CHO) que contiene secuencias de ADN que codifican una proteína recombinante de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas, y similar, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig), que puede cultivarse en suspensión o de forma adherente. Una proteína recombinante expresada por la línea celular descrita en el presente documento puede ser una glucoproteína terapéutica, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig. Los clones celulares recombinantes estables, derivados de células eucariotas (tales como de células CHO de mamíferos, células DG44, o células CHO dhfr-negativas), que contienen una secuencia de ADN que codifica una glucoproteína recombinante, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig, y que son capaces de expresar de manera estable la glucoproteína recombinante durante varias generaciones, son útiles.
Una población de células huésped de mamífero que expresan de manera estable una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas, y similar, tal como CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) puede obtenerse en condiciones aséricas y sin productos animales amplificando las células transfectadas de manera estable. Después, un clon celular recombinante puede caracterizarse porque es estable en medio de cultivo asérico y sin productos animales durante, por ejemplo, al menos 105 generaciones.
La población clonal de células puede producir moléculas de CTLA4-Ig. Algunas de las características específicas de esta población de moléculas de CTLA4-Ig se indican más adelante en la Tabla 6. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede incluir, al menos, moléculas de CTLA4-Ig diméricas que comprenden dos moléculas monoméricas, pudiendo tener cada una de ellas, una de las siguientes secuencias: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 2, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 2, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 2, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 2 y (vi) 25383 de la SEC ID Nº: 2. Por tanto, la población de moléculas de CTLA4-Ig puede incluir, predominantemente, homodímeros o heterodímeros. La población puede incluir tanto homodímeros como heterodímeros. La población puede ser una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga las características mostradas en la Tabla 6 o un equivalente farmacéutico de la misma. Como se usa en el presente documento, un equivalente farmacéutico es cuando una población de moléculas tiene un perfil de seguridad y eficacia equivalente al de la población original (población patrón) para tratar a un paciente, como entiende una agencia gubernamental, tal como la FDA. Por ejemplo, la población de CTLA4-Ig descrita en el presente documento puede tener las características mostradas en la Tabla 6. La población de moléculas de CTLA4-Ig descrita en el presente documento puede tener las características mostradas en la Tabla 6 o equivalentes de las mismas individualmente o en cualquier combinación o permutación de las mismas.
El clon de interés también puede caracterizarse de acuerdo con el producto recombinante expresado y con sus características bioquímicas (por ejemplo, la CTLA4-Ig que tiene un valor de coeficiente de extinción particular). Un valor de coeficiente de extinción (denominado también valor de absortividad (as)) puede obtenerse teórica o
-
experimentalmente. A 280 nm, se determinó que el valor de absortividad (as) de la CTLA4-Ig era de 1,01 ml mg-1 cm 1 usando el procedimiento de Mach, y col. (Analytical Biochemistry, Vol. 200, págs. 74-80, 1992) como se detalla a continuación.
Para determinar la absortividad molar ()) se utilizó la ecuación 1.
Ecuación 1: = [(número de enlaces disulfuro x 134) + (número de restos de Triptófano x 5.540) + (número de restos de Tirosina x 1.480)]
La CTLA4-Ig tiene 9 enlaces disulfuro, 8 restos de triptófano y 32 restos de tirosina que proporciona una absortividad molar ()) de 92.886 M-1cm-1 como se muestra en la Ecuación 2.
Ecuación 2: ) = (9 x 134) + (8 x 5.540) + (32 x 1.480)] = 92.886 M-1 cm-1
La constante de absortividad (as) se calculó dividiendo la absortividad molar ()) entre el peso molecular, en el que el peso molecular se determinó por MALDI-TOF, como se muestra en la Ecuación 3:
Ecuación 3: as = )/Peso Molecular = 92.886 M-1cm-1 / 92.278 Da = 1,01 ml mg-1 cm-1
Se realizó una comparación del valor de absortividad obtenido teóricamente con respecto a los valores de absortividad determinados experimentalmente en dos lotes de material de CTLA4-Ig (que comprende la SEC ID Nº: 2) usando análisis de aminoácidos. La constante de absortividad promedio determinada experimentalmente es de 1,00 ! 0,05 ml mg-1 cm-1. El valor experimental confirma el valor teórico de 1,01 ml mg-1 cm-1 dentro del error de la determinación experimental. Por tanto, en el presente documento se describe una línea celular que produce moléculas de CTLA4-Ig que tienen un valor de absortividad, o coeficiente de extinción, de aproximadamente 1,00 ! 0,05 ml mg-1 cm-1.
El clon recombinante de interés también puede caracterizarse de acuerdo con el número de sitios de una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés (por ejemplo, construcciones de fusión, glucoproteínas, y similar, tal como CTLA4-Ig) integrados en el genoma de la célula huésped. Un experto en la técnica sabe que las técnicas de hibridación de Southern convencionales permitirán realizar dicho análisis. Puede detectarse un único fragmento de hibridación, de aproximadamente 1,2 kb, en cada una de las digestiones de restricción con EcoRI y Xbal del ADN genómico preparado a partir del clon celular recombinante descrito en el presente documento, de acuerdo con el tamaño esperado del gen de CTLA4-Ig (hibridación de Southern; Figura 23). La descripción de la figura se realiza de acuerdo con un único sitio de integración del plásmido, así como, sin realizar inserciones ni deleciones en el gen de CTLA4-Ig que es detectable por análisis de hibridación de Southern.
En el presente documento se describen poblaciones de células CHO que pueden producir moléculas de CTLA4-Ig, en las que cada célula de la población comprende al menos 30 copias de un ácido nucleico que codifica una proteína de CTLA4-Ig, en el que las 30 copias o más están integradas en tándem en un único sitio en el genoma de la célula, y en el que las poblaciones de células son clonales. Las poblaciones de células CHO capaces de producir moléculas de CTLA4-Ig pueden comprender una población en la que al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de las células en las poblaciones comprende al menos 30 copias de un ácido nucleico que codifica una proteína de CTLA4-Ig.
En el presente documento se describe una línea celular que cuando se cultiva en condiciones de acuerdo con la Figura 10 o con el Ejemplo 14, produce moléculas de CTLA4-Ig que comprenden la SEC ID Nº: 2 en una cantidad que es al menos de 1,0, 1,3, 1,6, 1,8, 2,0 o 2,5 gramos de moléculas de CTLA4-Ig por litro de cultivo celular en la fase de producción.
Puede generarse una línea celular de mamífero (por ejemplo, una línea celular CHO dhfr negativa) que exprese una proteína deseada (por ejemplo, una proteína CTLA4-Ig) que cuando se cultive en un cultivo suspendido pueda producir una población de moléculas que se segrege en el sobrenadante del cultivo. Esta población de moléculas puede tener, por ejemplo, una o más o todas las características indicadas en la siguiente TABLA 6.
Tabla 6. Características ilustrativas de CTLA4-Ig
Características
1
Secuencia N-terminal aa 26 (Ala) de la SEC ID Nº: 2 aa 27 (Met) de la SEC ID Nº: 2
2
Secuencia C-terminal aa 382 (Gly) de la SEC ID Nº: 2 aa 383 (Lys) de la SEC ID Nº: 2
3
Unión a B7 70-130%
4
pl 4,3-5,6
5
Proporción de Ácido Siálico NANA NGNA ∗8,0 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig 8,0 -12,0 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig #1,5 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
6
Dímero ∗95%
7
Especies de Alto Peso Molecular APM (por ejemplo, tetraméricas) #4,0%
8
Especies de Bajo Peso Molecular BPM (por ejemplo, monoméricas) ∗0,5%
9
Coeficiente de extinción 1,0!0,05 ml/mg+cm
10
Grupos Sulfidrilo Libres #0,24 tioles libres por molécula
11
Composición de Amino Monosacárido: GlcNAc 15-35 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
12
Composición de Amino Monosacárido: GalNAc 1,7-8,3 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
13
Composición de Monosacárido Neutro: Galactosa 8-17 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
14
Composición de Monosacárido Neutro: Fucosa 3,5-8,3 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
15
Composición de Monosacárido Neutro: Manosa 7,7-22 moles por mol de moléculas de CTLA4-Ig
De acuerdo con el Tabla 6, los porcentajes de dímero de CTLA4-Ig, de especies de APM (por ejemplo multímeros de CTLA4-Ig, tal como un tetrámero) y de especies de BPM (por ejemplo, monómero de CTLA4-Ig) son con respecto a una población de moléculas de CTLA4-Ig. Los moles de azúcares y los moles de ácido siálico descritos en la Tabla 6
10 son con respecto a mol de moléculas o dímero de CTLA4-Ig. El porcentaje de unión a B7 indicado en la Tabla 6 es en referencia a experimentos de unión a CTLA4-Ig realizados por resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento BIAcore descrito anteriormente en el que el porcentaje es una comparación de la unión de B7 con un control de CTLA4-Ig.
Una línea celular de mamífero (tal como, una línea celular CHO dhfr negativa) puede generar una población de
15 moléculas de CTLA4-Ig que presenten los atributos característicos indicados en los números 1-5 de la Tabla 6. Una línea celular de mamífero puede generar una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga los atributos característicos indicados en los números 1-10 de la Tabla 6. Una línea celular de mamífero puede generar una población de moléculas de CTLA4-Ig que presente los atributos característicos indicados en los números 1-15 de la Tabla 6. La cantidad de grupos sulfidrilo libres en CTLA4-Ig puede ser aproximadamente #0,20 tioles libres por
20 molécula.
Después de la purificación del sobrenadante del cultivo celular que contiene la proteína deseada (por ejemplo una proteína CTLA4-Ig) segregada por una población de células de mamífero transfectadas (por ejemplo una célula CHO dhfr negativa), la población de moléculas puede tener otras características. Además de las características indicadas en la Tabla 6, esta población de moléculas puede tener, por ejemplo, una o más o todas las características indicadas 25 a continuación: un intervalo de pH de aproximadamente 7,0 -8,0; capacidad de inhibir la actividad de la IL-2 en células humanas al 50-150%; moléculas de CTLA4-Ig o dímero de CTLA4-Ig con una cantidad de Proteína Quimiotáctica de Monocitos (MCP-1) presente en el producto final purificado de # 5 ng/mg; dímero de CTLA4-Ig con una concentración de ADN presente en el producto final purificado # 2,5 pg/mg; dímero de CTLA4-Ig con una cantidad de proteína de célula huésped CHO presente en el producto final purificado # 50 ng/mg; dímeros de 30 CTLA4-Ig con una concentración de Triton X-100 en el producto final purificado # 1,0 ppm; dímero de CTLA4-Ig con
una cantidad de Proteína A # 5 ng/mg; dímero de CTLA4-Ig con una cantidad de endotoxinas bacterianas en el producto final purificado # 0,3 UE/mg; una cantidad de biocarga en el producto final purificado # 3,0 UFC/10 ml.
En una realización, la cantidad de Proteína Quimiotáctica de Monocitos (PCM-1) presente en el producto final purificado es # 3 ng/mg en el dímero de CTLA4-Ig o moléculas de CTLA4-Ig; la concentración de ADN presente en el producto final purificado es # 1,0 pg/mg de en el dímero de CTLA4-Ig; la cantidad de proteína de célula huésped CHO presente en el producto final purificado es # 10 ng/mg en el dímero de CTLA4-Ig; la cantidad de Proteína A presente es # 1 ng/mg en el dímero de CTLA4-Ig; la cantidad de endotoxinas bacterianas en el producto final purificado es # 0,15 UE/mg en el dímero de CTLA4-Ig; y la cantidad de biocarga en el producto final purificado es # 1,0 UFC/10 ml; un intervalo de pH de aproximadamente 7,2 -7,8. En una realización particular, la cantidad de Proteína Quimiotáctica de Monocitos (PCM-1) presente en el producto final purificado es # 1 ng/mg en el dímero de CTLA4-Ig o moléculas de CTLA4-Ig. En una realización adicional, las moléculas de CTLA4-Ig inhiben la actividad de la IL-2 en células humanas al 60 -140%.
La población clonal de células puede producir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig. Algunas de las características específicas de esta población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig se indican en la Tabla 7. Una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig puede incluir al menos moléculas diméricas de CTLA4A29YL104E-Ig que comprenden dos moléculas monoméricas, teniendo cada una de ellas las siguientes secuencias: (i) 26-383 de la SEC ID Nº: 4, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº: 4, (iii) 27-383 de la SEC ID Nº: 4, (iv) 27-382 de la SEC ID Nº: 4, (v) 25-382 de la SEC ID Nº: 4, y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº: 4. Por tanto, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig puede incluir predominantemente homodímeros o heterodímeros, o cualquier mezcla de los mismos. Una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig puede tener las características mostradas en la Tabla 7 o un equivalente farmacéutico de las mismas. Como se usa en el presente documento, un equivalente farmacéutico es cuando una población de moléculas tiene un perfil de seguridad y eficacia equivalente al de la población original (población patrón) para tratar a un paciente, como entiende una agencia gubernamental, tal como la FDA. Por ejemplo, la población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig descrita en el presente documento puede tener las características mostradas en la Tabla 7. La población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig descrita en el presente documento puede tener las características mostradas en la Tabla 7 o equivalentes de las mismas individualmente o en cualquier combinación o permutación de las mismas.
En el presente documento se describen poblaciones de células CHO que son capaces de producir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, en las que cada célula de la población comprende al menos 30 copias de un ácido nucleico que codifica una proteína de CTLA4A29YL104E-Ig, en el que las 30 copias o más están integradas en tándem en un único sitio en el genoma de la célula, y en el que las poblaciones de células son clonales. Las poblaciones de células CHO capaces de producir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden comprender una población en la que al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de las células en las poblaciones comprenden al menos 30 copias de un ácido nucleico que codifica una CTLA4A29YL104E-Ig.
En el presente documento se describe una línea celular que cuando se cultiva en condiciones de acuerdo con la FIG. 24 o con los Ejemplos 19-20, produce moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que comprenden la SEC ID Nº: 4 en una cantidad que es al menos 22, 22,5, 23, 27,5 o 28 gramos de moléculas de of CTLA29YL104E-Ig por litro de cultivo celular en la fase de producción.
Puede generarse una línea celular de mamífero (por ejemplo una línea celular CHO dhfr negativa) que exprese una proteína deseada (por ejemplo una CTLA4A29YL104E-Ig) que cuando se cultiva en un cultivo suspendido puede producir una población de moléculas que se segrega en el sobrenadante de cultivo. Esta población de moléculas puede tener, por ejemplo, una o más o todas las características indicadas en la siguiente TABLA 7.
Tabla 7. Características ilustrativas de una CTLA4A29YL104E-Ig 5
Características
1
Secuencia N-terminal aa 26 (Ala) de la SEC ID Nº: 2 aa 27 (Met) de la SEC ID Nº: 2
2
Secuencia C-terminal aa 382 (Gly) de la SEC ID Nº: 2 aa 383 (Lys) de la SEC ID Nº: 2
3
Unión a B7 70-130%
4
pl 4,5-5,5
5
Proporción de Ácido Siálico ∗5,0 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
6
Dímero ∗95%
7
Especies de APM (por ejemplo, tetraméricas) #4,0%
45 (continuación)
Características
8
Especies de BPM (por ejemplo, monoméricas) ∗1%
9
Composición de Amino Monosacárido: GlcNAc 24-28 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
10
Composición de Amino Monosacárido: GalNAc 2,7-3,6 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
11
Composición de Monosacárido Neutro: Galactosa 11-13 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
12
Composición de Monosacárido Neutro: Fucosa 6,4-7,0 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
13
Composición de Monosacárido Neutro: Manosa 14-16 moles por mol de proteína CTLA4-Ig Total
De acuerdo con la Tabla 7, el porcentaje de dímero CTLA4A29YL104E-Ig, porcentaje de especies de APM (por ejemplo multímeros de CTLA4A19YL104E-Ig tal como un tetrámero) y porcentaje de especies de BPM (por ejemplo, monómero de CTLA4A19YL104E-Ig) son con respecto a una población de moléculas de CTLA4A19YL104E-Ig. Los moles de azúcares y los moles de ácido siálico descritos en la Tabla 7 son con respecto a moles de moléculas o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig. El porcentaje de unión a B7 indicado en la Tabla 7 es en referencia a experimentos de unión a CTLA4A29YL104E-Ig realizados por resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento BIAcore descrito anteriormente en el que el porcentaje es una comparación de la unión de B7 con un control de CTLA4A29YL104E-Ig.
Una línea celular de mamífero (tal como, una línea celular CHO dhfr negativa) puede generar una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que presente los atributos característicos indicados en los números 1-5 de la Tabla
7. Una línea celular de mamífero puede generar una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que tenga los atributos característicos indicados en los números 1-10 de la Tabla 7. Una línea celular de mamífero puede generar una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que presente los atributos característicos indicados en los números 1-13 de la Tabla 7.
Después de la purificación del sobrenadante del cultivo celular que contiene la proteína deseada (por ejemplo, una CTLA4A29YL104E-Ig) segregada por una población de células de mamífero transfectada (por ejemplo una célula CHO dhfr negativa), la población de moléculas puede tener otras características. Además de las características indicadas en la Tabla 7, esta población de moléculas puede tener, por ejemplo, una o más o todas las siguientes características: una cantidad de Proteína Quimiotáctica de Monocitos (PCM-1) presente en el producto final purificado # 5 ng/mg en el dímero de CTLA4A29YL104E-Ig; una concentración de ADN presente en el producto final purificado # 2,5 pg/mg en el dímero de CTLA4A29YL104E-Ig; y una cantidad de proteína de célula huésped de CHO presente en el producto purificado # 50 ng/mg en el dímero de CTLA4A29YL104E-Ig.
Cultivo general de líneas celulares
Las células de mamífero se cultivan para producir una proteína deseada, incluyendo una glucoproteína, como conoce convencionalmente un experto en la técnica. Las células de mamífero que expresan una glucoproteína de interés deben expresarse o manipularse para que expresen las enzimas apropiadas, de tal manera que, en condiciones satisfactorias, se produzcan modificaciones postraduccionales más pertinentes para la glucosilación in vivo. Las enzimas incluyen las que son necesarias para la adición y obtención de carbohidratos ligados a N-y a O-, tales como las descritas en Hubbard y Ivatt, Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583(1981) para oligosacáridos ligados a N. Opcionalmente, las enzimas incluyen oligosacariltransferasa, alfa-glucosidasa I, alfa-glucosidasa II, ER alfa(1,2)manosidasa, Golgi alfa-manodasa I, N-acetilglucosaminiltransferasa I, Golgi alfa-manodasa II, Nacetilglucosaminiltransferasa II, alfa(1,6)fucosiltransferasa, beta(1,4)galactosiltransferasa y una sialiltransferasa apropiada.
Un retraso en la apóptosis (muerte celular programada) puede tener un efecto de aumentar la viabilidad celular durante un proceso de cultivo celular. Una disminución de la apóptosis, y a su vez, un aumento del tiempo de vida de una célula particular puede aumentar la producción de proteínas de un cultivo celular. En una célula los sucesos apoptóticos pueden inhibirse introduciendo en una célula (tal como una célula de mamífero, una célula de insecto o una célula de levadura) una o más proteínas anti-apoptóticas, que inhiben la apóptosis en las células en momentos exactos a lo largo de la ruta apoptótica. Otro procedimiento para inhibir la apóptosis es inhibir la liberación de moléculas pro-apoptóticas de las mitocondrias en las células. En la técnica se conocen variantes de proteínas proapoptóticas, tales como formas negativas-dominantes de caspasa-9, que pueden usarse como un inhibidor de apóptosis en una célula. Dicha variante de proteína puede introducirse en una célula para retrasar la muerte celular programada. La inhibición de la apóptosis de una célula, a su vez, prolonga el tiempo durante el cual una célula particular produce proteína, dando como resultado un aumento global en la producción de una proteína deseada por una célula particular. Diversos genes que codifican inhibidores de caspasas (tal como el inhibidor de apóptosis ligado a X (XIAP) o variantes del mismo) o genes anti-apoptóticos (por ejemplo Bcl-2 y Bcl-xL o variantes de los mimos), pueden transfectarse en células de mamífero modificadas por ingeniería genética (tales como, células CHO, células VERO, células BHK y similares) (Sauerwald, T. y col., 2003, Biotechnol Bioeng. 81: 329-340; Sauerwald, T. y col., 2002, Biotechnol Bioeng. 77: 704-716; Mastrangelo, A., y col., 2000, Biotechnol Bioeng. 67: 544-564; Kim, N., y col., 2002, J Biotechnol. 95: 237-248; Figueroa, B., y col., 2001, Biotechnol Bioeng. 73: 211-222).
Las células de mamífero, que producen una proteína recombinante, pueden transfectarse con un vector que contenga un gen anti-apoptótico (tal como bcl-2). Las células de mamífero recombinantes pueden transfectarse con un plásmido que contenga un gen que codifique un inhibidor de caspasa, o un gen que codifique una variante de una molécula pro-apoptótica como se ha descrito anteriormente, un gen que codifique una proteína que un experto en la técnica sepa que posee actividad anti-apoptótica o cualquier combinación de los mismos.
La calidad del producto global (por ejemplo glucosilación potenciada) de una proteína recombinante deseada (tal como una proteína terapéutica) puede potenciarse. Para aumentar la glucosilación de una proteína recombinante, pueden transfectarse células de mamífero (por ejemplo, células CHO, células VERO, células BHK y similares) con ácidos nucleicos que codifiquen una o más enzimas que están implicadas en la glucosilación (tales como &2,3sialiltransferasa, %1,4-galactosiltransferasa, y similares) de proteínas (Weikert y col., 1999, Nature Biotechnol 17: 1116-21). Un plásmido que codifique %1,4-galactosiltransferasa puede introducirse en células de mamífero que expresen una proteína de interés. Un plásmido que codifique &2,3-sialiltransferasa puede introducirse en células de mamífero que expresen una proteína de interés.
Con respecto a la célula huésped que vaya a cultivarse, pueden usarse diversos parámetros de cultivo. Las condiciones de cultivo apropiadas para células de mamífero son bien conocidas en la técnica (Cleveland y col., J. Immunol. Methods, 56: 221-234 (1983)) o puede determinarlas un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2ª Ed., Rickwood, D. y Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: Nueva York, 1992)), y variar de acuerdo con la célula huésped particular seleccionada.
Sin limitación, medio de cultivo celular (tal como medio de inóculo, medio de alimentación, medio basal y similar) puede referirse a una solución de nutrientes usada para cultivar y/o conservar células, especialmente células de mamífero. Estas soluciones proporcionan normalmente al menos un componente procedente de una o más de las siguientes categorías: (1) una fuente de energía, normalmente en forma de un carbohidrato tal como glucosa; (2) todos los aminoácidos esenciales y normalmente el grupo básico de veinte aminoácidos más cisteína; (3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos necesarios a bajas concentraciones; (4) ácidos grasos libres o lípidos, por ejemplo, ácido linoleico; (5) oligoelementos, en los que los oligoelementos se definen como compuestos inorgánicos o elementos de origen natural que son típicamente necesarios a concentraciones muy bajas, normalmente en el intervalo micromolar. La solución con nutrientes puede complementarse electivamente con uno o más componentes de cualquiera de las siguientes categorías. (1) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, suero, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico; (2) sales, por ejemplo, magnesio, calcio y fosfato; (3) tampones, tal como HEPES; (4) nucleósidos y bases tales como, adenosina, timidina e hipoxantina; (5) hidrolizados de proteínas y tisulares, por ejemplo peptona o mezclas de peptona que pueden obtenerse a partir de gelatina purificada, material vegetal o productos secundarios de animales; (6) antibióticos, tal como gentamicina; (7) agentes protectores celulares, por ejemplo poliol plurónico; y (8) galactosa. Un ejemplo de medio basal puede ser el Medio Basal de Cultivo Celular. Un ejemplo de medio de inóculo puede ser el Medio Basal de Cultivo de Inóculo. Un ejemplo de medio de alimentación puede ser el Medio de Alimentación de Producción en Biorreactor
Pueden utilizarse medios disponibles en el comercio e incluir, por ejemplo, Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma); Medio F10 de Ham (Sigma); medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, Utah); Medio RPMI-1640 (Sigma); y medios químicamente definidos (CD), que se formulan para tipos de células particulares, por ejemplo, Medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Cualquiera de estos medios puede complementarse, si fuera necesario, con los componentes o ingredientes complementarios previamente definidos, incluyendo componentes opcionales, en concentraciones o cantidades apropiadas, según se desee o sea necesario. El cultivo de células de mamífero que puede usarse en la presente invención se prepara en un medio adecuado para la célula particular que vaya a cultivarse. El medio de cultivo celular puede ser uno de los medios anteriormente mencionados que sea generalmente asérico procedente de cualquier fuente de mamífero (por ejemplo, suero bovino fetal (SBF)). Como alternativa, el cultivo de células de mamífero puede cultivarse en el Medio CHO químicamente definido (CD) disponible en el comercio, complementado con componentes adicionales especificados en la Tabla 15. Además, el cultivo de células de mamífero puede cultivarse en Medio CD-CHO, complementado con componentes adicionales especificados en la Tabla 20 o 21.
Pueden cultivarse numerosos tipos de células. Las células pueden ser de animales o de mamíferos. Las células pueden expresar y segregar grandes cantidades de una proteína deseada. Las células pueden expresar y segregar grandes cantidades de una glucoproteína de interés en el medio de cultivo. Las células de animales o de mamífero también pueden modificarse molecularmente para expresar y segregar una proteína de interés. La proteína producida por la célula huésped puede ser endógena u homóloga para la célula huésped. La proteína también puede ser heteróloga (por ejemplo, exógena), para la célula huésped por lo cual la información genética que codifica la proteína de interés se introduce en la célula huésped mediante procedimientos convencionales de la técnica (por ejemplo, por electroporación, transfección y similar). En el medio de cultivo, una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) puede producir y segregar una glucoproteína de mamífero.
Pueden producirse poblaciones de moléculas de CTLA4-Ig mediante los procedimientos de producción descritos en el presente documento, incluyendo el procedimiento de producción masiva que se describe en el Ejemplo 14 y que se muestra en la FIG. 10. El proceso puede dar como resultado la producción de moléculas de CTLA4-Ig de alto peso molecular (APM) (véanse, por ejemplo, los EJEMPLOS 14 y 15). Las poblaciones de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pueden producirse mediante los procedimientos de producción descritos en el presente documento, tal como el procedimiento de producción masiva descrito en los EJEMPLOS 19 y 20, y mostrado en la FIG. 24. El proceso puede dar como resultado la producción de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de alto peso molecular (APM) (véanse, por ejemplo, los EJEMPLOS 19 y 20). Las especies de APM pueden ser aproximadamente el 15-25% de las moléculas o dímero producidos mediante un procedimiento de producción, incluyendo un proceso de fermentación químicamente definido (CD)-CHO1. Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen procedimientos de aislamiento, purificación y caracterización de componentes de APM de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig producidos por un proceso de fermentación CD-CHO1. Los componentes de APM de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig son multímeros (es decir, tetrámeros, hexámeros, etc.), que tienen un peso molecular más alto en comparación con los dímeros de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig.
Como células huésped de animales o mamíferos capaces de incluir, expresar y segregar grandes cantidades de una glucoproteína de interés en el medio de cultivo para posterior aislamiento y/o purificación se incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), tales como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin y col., 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12: 555-556; Kolkekar y col., 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909; y documento WO 01/92337 A2), células CHO dihidrofolato reductasa negativas (CHO/dhfr-, Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77: 4216) y células CHO dp12 (Patente de Estados Unidos Nº 5.721.121); células CV1 renales de mono transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651); células renales embrionarias humanas (por ejemplo, células 293, o células 293 subclonadas para cultivo en cultivo de suspensión, Graham y col., 1977, J. Gen. Virol., 36: 59); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL-10); células renales de mono (CV1, ATCC CCL-70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL-2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL-34); células pulmonares humanas (W 138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células tumorales mamarias de ratón (MMT 060562, ATCC CCL-51); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383: 44-68); células MCR 5; células FS4. En un aspecto de la presente invención, se utilizan células CHO, particularmente, células CHO/dhfr-y CHO DG44.
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para producir moléculas de CTLA4-Ig que son variantes de las SEC ID Nos: 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, una molécula de CTLA4-Ig puede comprender un monómero que tiene uno o más cambios en los restos 55 (A55Y) y 130 (L130E) (los restos a los cuales se hace referencia son de la SEC ID Nº: 2). Véase las descripciones de variantes y mutantes de CTLA4-Ig descritas en la Publicación de Estados Unidos US 2002/0182211 A1. En otra realización, una variante de CTLA4-Ig puede comprender una molécula de CTLA4-Ig que tiene una mutación en la región CTLA-4 o una mutación en la región Ig, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, una molécula variante de CTLA4-Ig comprende una molécula de CTLA4-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 99% con las SEC ID Nos: 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, la molécula variante de CTLA4-Ig puede unirse a CD80 o a CD86. En otra realización, la variante puede formar un dímero. En una realización adicional, la variante presenta un perfil carbohidrato similar al mostrado por una población de moléculas de CTLA4-Ig no mutada. En una realización, las moléculas variantes de CTLA4-Ig tienen los mismos sitios de glucosilación posibles ligados a N o ligados a O presentes en la SEC ID Nº: 2. En otra realización, una molécula variante de CTLA4-Ig tiene los mismos sitios de glucosilación ligados a N y ligados a O presentes en la SEC ID Nº: 2 y tiene sitios de glucosilación adicionales. Las mutaciones pueden incluir, pero sin limitación, deleciones, inserciones y adiciones de nucleótidos; deleciones, sustracciones y adiciones de aminoácidos; desplazamientos en fases de lectura de ácidos nucleicos; las sustituciones pueden ser no conservativas (por ejemplo, una glicina sustituida por un triptófano) o conservativas (por ejemplo, una leucina sustituida por una isoleucina).
Las moléculas variantes de CTLA4-Ig incluyen, pero sin limitación, CTLA4-L104EA29YIg (utilizando el sistema de numeración de restos de acuerdo con la SEC ID Nº: 2, en el presente documento CTLA4-L104EA29YIg se conoce como CTLA4-L130EA55YIg), así como aquellas moléculas variantes de CTLA4-Ig descritas en la solicitud de Patente de Estados Unidos Nos de Serie 09/865.321 (Publicación de Estados Unidos Nº US2002/0182211), 60/214.065 y 60/287.576; en el documento WO 01/92337 A2; en las Patentes de Estados Unidos Nos 6.090.914,
5.844.095 y 5.773.253; y como se describe en R. J. Peach y col., 1994, J Exp Med, 180: 2049-2058. Las moléculas variantes de CTLA4-Ig producidas en los presentes procedimientos pueden segregarse de una célula que comprenda un vector de expresión que codifique una proteína variante de CTLA4-Ig.
Una variante de CTLA4-Ig, L130EA55Yig, es una proteína de fusión modificada por ingeniería genética similar en estructura a la molécula de CTAL4-Ig. La L130EA55Y-Ig tiene el dominio de unión extracelular funcional de la CTLA4 humana modificada y el dominio Fc de la inmunoglobulina humana de la clase IgG1. Se realizaron dos modificaciones de aminoácidos, leucina por ácido glutámico en la posición 104 (L104E) de una variante L104EA29Y, que corresponde a la posición 130 de la SEC ID Nº: 2, y una alanina por tirosina en la posición 29 (A29Y) de una variante L104EA29Y, que corresponde a la posición 55 de la SEC ID Nº: 2, en la región de unión a B7 del dominio de CTLA-4 para generar L130EA55Y. L130EA55Y-Ig puede comprender dos cadenas polipeptídicas glucosiladas homólogas de aproximadamente 45.700 Daltons cada una, que están unidas entre sí mediante un enlace disulfuro intercatenatio e interacciones no covalentes. El ADN que codifica L130EA55Y-Ig se depositó como ADN que codifica L104EA29Y-Ig el 20 de junio del 2000, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest. Se ha acordado que tenga el número de registro PTA-2104 de la ATCC. L104EA29Y-Ig (que corresponde a L130EA55Y-Ig en la presente solicitud) se describe adicionalmente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada con los Nº de Serie 09/579.927, 60/287.576 y 60/214.065 y 09/865.321 y en el documento WO/01/923337 A2.
Dado que la proteína recombinante L130EA55Y-Ig solo difiere en 2 aminoácidos (Tyr en la posición de aminoácido 55 y Glu en la posición de amino 130) en comparación con los monómeros de CTLA4-Ig que tienen una Ala en la posición de aminoácido 55 y una Leu en la posición de aminoácido 130 de la SEC ID Nº: 2, y dado que estas 2 mutaciones no afectan a la N-glucosilación ni a la O-glucosilación, las poblaciones de moléculas variantes de CTLA4-Ig que comprenden L130EA55Y-Ig puede tener el mismo perfil de glucosilación, o muy similar, al de las poblaciones que comprenden CTLA4-Ig de tipo natural. Además, dado a que la proteína recombinante L130EA55Y-Ig solo difiere en 2 aminoácidos (Tyr en la posición de aminoácido 55 y Glu en la posición de aminoácido 130) en comparación con los monómeros de CTLA4-Ig que tienen una Ala en la posición de aminoácido 55 y Leu en la posición de aminoácido 130 de la SEC ID Nº: 2, los procedimientos descritos en el presente documento deben ser capaces de producir L130EA55Y-Ig con atributos característicos similares a los descritos en la Tabla 6.
Los procedimientos de la invención también pueden usarse para producir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, que son variantes de las SEC ID Nos: 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En una realización, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig puede comprender un monómero que tenga uno o más cambios en la SEC ID Nº: 3. Por ejemplo, se describen descripciones de otras moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos 2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859 y U.S. 2005/0084933 y en la Patente de Estados Unidos Nº 7.094.8874.
En una realización, la molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende una o más mutaciones en la región CTLA-4 (SEC ID Nº: 18), o una mutación en la región Ig, o cualquier combinación de las mismas. En otras realizaciones, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig comprende una CTLA4A29YL104E-Ig que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 99% con las SEC ID Nos: 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En una realización adicional, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig, como se ha descrito anteriormente, puede unirse a CD80 o CD86. En otra realización, la CTLA4A29YL104E-Ig puede formar un dímero. En una realización adicional, la CTLA4A29YL104E-Ig presenta un perfil carbohidrato similar al que presenta una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig no mutada. En otras realizaciones adicionales, las moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tienen los mismos sitios de glucosilación ligados a N o ligados a O posibles presentes en la SEC ID Nº: 4. En otra realización, una CTLA4A29YL104E-Ig tiene los mismos sitios de glucosilación ligados a N y ligados a O posibles presentes en la SEC ID Nº: 4, y tiene sitios de glucosilación adicionales. Las mutaciones pueden incluir, pero sin limitación, deleciones, inserciones y adiciones de nucleótidos; deleciones, sustituciones y adiciones de aminoácidos; desplazamientos de fases de lectura de ácidos nucleicos; las sustituciones pueden ser no conservativas (por ejemplo, una glicina sustituida por un triptófano) o conservativas (por ejemplo, una leucina sustituida por una isoleucina).
Una población de moléculas variantes de CTLA4-Ig puede producirse por células de mamífero (por ejemplo células CHO dhfr negativas), que expresen un gen que codifique la proteína deseada (por ejemplo una proteína L130EA55Y-Ig o similar), cultivada en suspensión de acuerdo con el procedimiento de producción masivo descrito en el presente documento. Una proteína variante de CTLA4-Ig recombinante producida por células de mamífero puede recuperarse de acuerdo con los parámetros de recogida descritos en el presente documento. Una proteína variante de CTLA4-Ig recombinante producida por células de mamífero puede purificarse de acuerdo con el esquema de purificación descrito en la presente invención (Ejemplo 15).
Una población de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig puede producirse por células de mamífero (por ejemplo células CHO dhfr negativas), que expresen un gen que codifique la proteína deseada (por ejemplo una CTLA4A29YL104E-Ig), cultivada en suspensión de acuerdo con el procedimiento de producción masivo descrito en el presente documento. Una CTLA4A29YL104E-Ig recombinante producida por células de mamífero puede recuperarse de acuerdo con los parámetros de recogida descritos en el presente documento. Una CTLA4A29YL104E-Ig recombinante producida por células de mamífero puede purificarse de acuerdo con el esquema de purificación descrito en la presente invención (Ejemplos 19-20).
Tipos de cultivos celulares y procedimientos de cultivo generales
Una proteína de interés, por ejemplo una glucoproteína, una proteína de fusión y similar, puede producirse cultivando células que expresen el producto de proteína deseado en diversas condiciones de cultivo celular. Un experto en la técnica sabe que para la producción de proteínas estos cultivos celulares y procesos de cultivo pueden incluir, pero sin limitación, tres tipos generales: cultivo continuo, cultivo discontinuo y cultivo semidiscontinuo. En un proceso de cultivo continuo, durante el periodo de cultivo a las células se las proporciona un medio de cultivo reciente complementado (por ejemplo, medio de alimentación) eliminando al mismo tiempo el medio de cultivo antiguo. Después, el producto producido durante un cultivo continuo puede recuperarse, por ejemplo, diariamente o de manera continuada. Siempre que las células permanezcan vivas y se conserven las condiciones ambientales y de cultivo, las células pueden permanecer en el cultivo durante el tiempo que se desee en un proceso de cultivo continuo.
En un proceso de cultivo discontinuo, las células se cultivan inicialmente en medio y este medio de cultivo nunca se sustituye, ni se elimina, ni se complementa. Las células no reciben “alimento” a través de nuevo medio durante o antes de finalizar el proceso de cultivo, por tanto el cultivo continúa hasta que los nutrientes se agotan. El producto de proteína se recoge al final del proceso de cultivo.
Para los procedimientos de cultivo semidiscontinuos, el tiempo de ejecución del cultivo puede aumentarse complementando el medio de cultivo una o más veces diariamente (o de manera continuada) con medio reciente durante la ejecución. En este procedimiento, a las células se las proporciona medio reciente, un “medio de alimentación”, durante el periodo de cultivo. Los cultivos semidiscontinuos pueden incluir los diversos esquemas de alimentación descritos anteriormente, por ejemplo, diariamente, cada dos días, cada día alterno, etc.; más de una vez al día, o menos de una vez al día, y así sucesivamente. Los cultivos semidiscontinuos también pueden alimentarse de manera continuada con medio de alimentación. Después, al finalizar la ejecución del cultivo/producción, se recoge el producto de proteína de interés.
Los sistemas de cultivo de células para la producción de proteínas, incluyendo glucoproteínas, a pequeña o gran escala, producidos por células huésped de mamíferos son útiles dentro del contexto de la presente invención. Los expertos en la técnica saben que en los procedimientos de cultivo a escala de laboratorio típicamente se usan placas de cultivo tisular, matraces rotativos y matraces en forma de T. Los procedimientos que pueden usarse para realizar cultivos a gran escala (por ejemplo, 500 l, 5000 l, 10.000 l, 20.000 l y similar) incluyen, pero sin limitación, un biorreactor de fibra hueca, un biorreactor de lecho fluido, un sistema de biorreactor de tanque agitado, o un cultivo en frasco rotativo. Los dos últimos procesos pueden utilizarse con o sin microtransportadores.
Los sistemas pueden funcionar en modo discontinuo, semidiscontinuo, o continuo. Para el cultivo de producción a escala, el biorreactor de tanque agitado es el sistema de elección debido a su flexibilidad. Estos reactores pueden conservar células en suspensión por agitación a través de agitación mecánica induciendo burbujas de gas o a través de un impulsor. Los biorreactores de tanque agitado pueden aplicarse a gran escala para volúmenes de producción a gran escala (por ejemplo, 20.000 litros) y pueden funcionar en diferentes modos de suministro. Estos sistemas proporcionan un gran área de superficie para el cultivo celular y la transferencia eficaz de residuos metabólicos, oxígeno y nutrientes y también mantienen un ambiente homogéneo en todo el reactor impidiendo la sedimentación de las células en el fondo mediante agitación o mezcla continuada de los componentes que están dentro del reactor. Para la producción de una glucoproteína deseada, los cultivos celulares semidiscontínuos, a gran escala, mantenidos en un biorreactor de tanque agitado, puede usarse un suministro diario con medio de alimentación que contenga D-galactosa. Los cultivos celulares semidiscontinuos también pueden mantenerse en un biorreactor de tanque agitado, suministrarse diariamente con medio de alimentación que contenga concentraciones adecuadas de nutrientes de cultivo celular limitantes, importantes para la glucosilación de proteínas, tales como glucosa y glutamina (Chee y col., 2005, Biotechnol. Bioeng. 89: 164-177).
Las células del cultivo productoras de una proteína de interés pueden propagarse de acuerdo con cualquier esquema o rutina más adecuado para la célula huésped de mamífero particular y el plan de producción particular contemplado. Pueden desarrollarse condiciones de cultivo celular para potenciar la expansión o el crecimiento de una población de células huésped de mamífero en la fase de crecimiento del cultivo celular durante un periodo de tiempo maximizado para dicha expansión y crecimiento. La fase de crecimiento del cultivo celular comprende el periodo de crecimiento celular exponencial (por ejemplo, la fase logarítmica) en el que en principio las células se dividen rápidamente. Durante esta fase, la tasa de aumento en cuanto a la densidad de células viables es mayor que en cualquier otro momento.
Además, para mejorar la producción de proteínas durante la fase de producción del cultivo celular durante un periodo de tiempo pueden desarrollarse condiciones de cultivo celular. La fase de producción del cultivo celular comprende el periodo de tiempo durante el cual el crecimiento celular es estacionario o se mantiene a un nivel casi constante. La densidad de células viables permanece aproximadamente constante durante un periodo de tiempo determinado. Durante la fase de producción el crecimiento celular logarítmico ha terminado y la producción de proteínas es la principal actividad. En este momento, el medio se complementa generalmente para dar soporte a la producción de proteínas de forma continua y para obtener el producto de glucoproteína deseado.
Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, oxígeno disuelto (DO2) y similar, son las utilizadas en el cultivo de células huésped de mamífero, conocidas por los expertos en la técnica. Un intervalo de temperatura apropiado para el cultivo de células huésped de mamífero, tales como células CHO, es entre 30 a 40 ºC, y en particular de aproximadamente 37 ºC. El pH generalmente se ajusta a un nivel entre aproximadamente 6,5 y 7,5 usando un ácido o una base. Un DO2 adecuado es entre 5-90% de saturación de aire. Estas condiciones de cultivo pueden usarse para facilitar el cultivo de células de mamífero que producen un producto de proteína o de glucoproteína deseado.
Una población de células huésped de mamífero puede expandirse y crecer en un cultivo en fase en crecimiento en el que las células, posiblemente eliminadas del almacenamiento, se inoculan en un medio de cultivo aceptable para promover el crecimiento y la alta viabilidad. Después, las células pueden conservarse en una fase de producción durante un periodo de tiempo adecuado por la adición de medio de cultivo reciente en el cultivo de células huésped. Durante la fase de producción, las células pueden someterse a diversos cambios de temperatura para mejorar la producción de proteínas. Los procesos de cultivo con cambios de temperatura múltiples se describen en las solicitudes de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 10/742.564, presentada el 18 de diciembre del 2003 y Nº de Serie 10/740.645, presentada el 18 de diciembre del 2003. Los dos o más cambios de temperatura que comprenden los procesos de cultivo celular pueden dar como resultado un mayor número de células viables que sobreviven en el cultivo hasta el final del proceso o desarrollo de producción. Durante la fase de producción del cultivo, cuanto mayor sea número de células supervivientes mayor puede ser la cantidad de producto de proteína o glucoproteína producida, aumentando la cantidad de producto de proteína al final del proceso.
En particular, en el presente documento se describe un cultivo de células de mamífero semidiscontinuo, a gran escala (por ejemplo 500 l, 5000 l, 10000 l y similar) suministrado diariamente con medio de alimentación como se describe en las Tablas 14, 15 que comprende D-galactosa para que las células produzcan una glucoproteína de interés. Para aumentar la calidad de la proteína producida en este cultivo celular, durante el periodo de cultivo pueden realizarse dos o más cambios de temperatura, para ampliar la fase de producción de proteína más allá de lo que ocurre cuando no se realiza ningún cambio de temperatura, o cuando solo se realiza un cambio de temperatura. Adicionalmente, en el presente documento se describe un cultivo de células de mamífero semidiscontinuo, a gran escala, (por ejemplo 500 l, 5000 l, 10000 l y similar), que consiste en suministrar diariamente 1 o más veces medio de alimentación como se describe en la Tabla 22, que comprende D-galactosa para que las células produzcan una glucoproteína de interés (por ejemplo, CTLA4A29YL104E-Ig). Para aumentar la calidad de la proteína, también pueden realizarse uno o más cambios de temperatura durante el periodo de cultivo para ampliar la fase de producción de proteínas más allá de lo que ocurre cuando no se realiza ningún cambio de temperatura. Como alternativa, al cultivo puede añadirse sulfato de dextrano con un cambio de temperatura simultáneo.
Producción en masa de proteína recombinante en biorreactores
Para el cultivo convencional de células eucariotas en biorreactores de tanque agitado (por ejemplo, un volumen de cultivo de 20000 L), particularmente para producir industriales o a gran escala de productos de proteína deseados expresados por dichas células, pueden utilizarse procedimientos. El proceso de cultivo es un proceso de cultivo semidiscontinuo de células eucariotas que crecen en suspensión, con recogida del sobrenadante de cultivo, en el que las células eucariotas, por ejemplo células de mamífero, que expresan una proteína de interés, segregan el producto de proteína deseado en el medio de cultivo.
Pueden usare procedimientos de cultivo de células de mamífero a gran escala, particularmente para producir grandes cantidades de productos de proteína deseados, expresados por dichas células. Los procedimientos pueden realizarse mediante las etapas que comprenden:
(i)
inocular células en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contenga medio de cultivo asérico y propagar el cultivo de siembra (por ejemplo, un cultivo iniciador que se use para inocular un volumen más grande) al menos hasta que las células alcancen una densidad mínima de siembra cruzada por lo cual la densidad es un valor predeterminado necesario para la propagación suficiente de células en el volumen de cultivo posterior;
(ii)
transferir el cultivo de siembra propagado a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotatorios o bolsas para células) que contenga medio de cultivo sin componentes derivados de animales para expandir el cultivo;
(iii) transferir el cultivo de siembra expandido a un recipiente de cultivo a gran escala que contenga medio de cultivo asérico para propagar adicionalmente el cultivo celular; y
(iv) conservar el cultivo a gran escala en medio sin componentes derivados de animales, al menos hasta que dichas células alcancen una densidad diana o presenten una característica bioquímica específica.
El procedimiento puede comprender la etapa de (iv) recoger el medio de cultivo y sustituir este medio por medio reciente.
Los procedimientos para el cultivo de células de mamífero a gran escala pueden realizarse mediante las etapas que comprenden:
(i)
inocular células en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contenga medio de cultivo asérico (por ejemplo, medio inoculante) y propagar el cultivo de siembra (por ejemplo, un cultivo iniciador que se use para inocular un volumen más grande) al menos hasta que las células alcancen una densidad mínima de siembra cruzada por lo cual la densidad es un valor predeterminado necesario para la propagación suficiente
de células en el volumen de cultivo posterior;
(ii)
transferir el cultivo de siembra propagado a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotatorios o bolsas para células) que contenga medio de cultivo sin componentes derivados de animales (por ejemplo, medio inoculante) para expandir el cultivo;
(iii) transferir el cultivo de siembra expandido a un recipiente de cultivo a gran escala (tal como un biorreactor de 1000 l) que contenga medio de cultivo asérico (por ejemplo, medio basal) para propagar adicionalmente el cultivo celular; y
(iv) conservar el cultivo a gran escala en medio sin componentes derivados de animales (por ejemplo, medio de alimentación) al menos hasta que dichas células alcancen una densidad diana o presenten una característica bioquímica específica.
El procedimiento puede comprender la etapa de:
(v) recoger el medio de cultivo y sustituir el medio agotado por medio reciente.
Para producir cantidades a gran escala de productos de proteína deseados puede utilizarse cualquier tipo de célula en cualquier formulación de medio que carezca de componentes derivados de animales, y puede utilizarse cualquiera de los dos procesos, o variaciones de los mismos, siguientes: a) procesos con microtransportadores o b) procesos de células en suspensión. El cultivo de células, por ejemplo, células de mamífero, puede utilizar cualquier proceso que funcione en dos fases distintas, una fase de crecimiento y una fase de producción. También puede emplearse cualquier formulación de medio que contenga componentes derivados de animales (siendo algunos ejemplos no limitantes la albúmina de suero bovino (ABS) o SBF) para la producción de cantidades de proteínas a gran escala, como se ha descrito anteriormente.
Un experto en la técnica sabe que para el cultivo de células puede utilizarse un proceso con microtransportadores, sin limitarse a un proceso convencional con microtransportadores o a un proceso de perfusión con microtransportadores, en el que las células están unidas a y/o inmovilizadas en un transportador macroporoso. En un proceso con microtransportador convencional, las células se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra que contenga medio de cultivo asérico y se propaga hasta que las células alcancen una densidad de siembra mínima. Posteriormente, el cultivo de siembra propagado se transfiere a un recipiente de cultivo a gran escala que contenga medio de cultivo asérico y microtransportadores. En esta fase de crecimiento, las células crecen en microtransportadores hasta que los transportadores estén completamente colonizados, por ejemplo, por células que migran al interior de los transportadores en el caso de un proceso que utilice transportadores macroporosos.
El cambio de medio puede realizarse cuando los microtransportadores se sedimentan en el fondo del recipiente de cultivo, después de lo cual se elimina un porcentaje predeterminado del volumen del tanque y al recipiente se le añade un porcentaje del volumen del tanque correspondiente de medio reciente. Después, los microtransportadores se resuspenden en el medio de cultivo. Un experto en la técnica sabe que el proceso de eliminación y sustitución del medio puede repetirse a un intervalo predeterminado, por ejemplo cada 24 horas, por lo cual la cantidad de medio sustituido depende de la densidad celular y puede ser típicamente del 25% al 80% del volumen del tanque. El 6095% del medio del tanque puede cambiarse cada 24 horas cuando la densidad celular alcanza un valor predeterminado adecuado para la expresión de la proteína. Los expertos en la técnica utilizan con frecuencia el % del valor de cambio de medio anteriormente mencionado también durante la fase de producción.
Durante la fase de producción, el medio de cultivo puede cambiarse dejando que los microtransportadores se sedimenten en el fondo del tanque, después de lo cual se elimina el % del volumen del tanque seleccionado y un % correspondiente del volumen del tanque, por ejemplo 60-95%, como se ha descrito anteriormente, de medio de cultivo reciente, se añade al recipiente. Después, los microtransportadores se resuspenden en el medio de cultivo y el proceso de eliminación y sustitución de medio puede repetirse diariamente.
El proceso de perfusión con microtransportadores se asemeja al proceso convencional con microtransportadores y también se utiliza en las fases de crecimiento/expansión y producción. La principal diferencia entre los dos procesos es el procedimiento empleado para cambiar el medio de cultivo. Una cantidad definida del volumen del tanque, por ejemplo el 60-95% del volumen total del tanque, se cambia a la vez en el proceso convencional con microtransportadores, mientras que en el proceso de perfusión el medio se añade de manera continuada. Básicamente, un % del medio del volumen del tanque se cambia gradualmente durante un tiempo predeterminado mientras que los microtransportadores se mantienen en el recipiente usando un dispositivo de separación (o un dispositivo de perfusión) que permite que el medio abandone el recipiente pero conserve los microtransportadores dentro del tanque. La fase de crecimiento en este proceso es como se describe en un proceso convencional con microtransportadores, excepto para el cambio de medio gradual.
Dos opciones no limitantes para un proceso de células en suspensión incluyen un proceso de perfusión de células en suspensión y un proceso discontinuo de células en suspensión. En el proceso de perfusión, las células en un medio de cultivo se suspenden libremente sin tener que movilizarse en transportadores y, al igual que en el proceso con microtransportadores, puede utilizarse en dos fases distintas (por ejemplo, una fase de crecimiento y una fase de producción). Durante la fase de crecimiento de un proceso de perfusión de células en suspensión, las células se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra que contenga medio de cultivo asérico y se propagan hasta que las células alcanzan una densidad de siembra cruzada diana. El cultivo de siembra propagado puede después transferirse a un recipiente de cultivo a gran escala, que contiene medio de cultivo sin componentes derivados de animales y propagarse hasta alcanzar un valor de densidad celular predeterminado adecuado para la expresión de las proteínas. Para ejecutar el proceso de cambio de medio se realiza una perfusión continua del recipiente de cultivo con medio de cultivo reciente.
En el proceso discontinuo de células en suspensión, el cultivo celular puede realizarse mediante los siguientes formatos no limitantes: a) proceso discontinuo sencillo o b) proceso semidiscontinuo. En un proceso discontinuo sencillo las células se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra que contiene medio de cultivo sin componentes derivados de animales y se propagan hasta que las células alcanzan una densidad de siembra cruzada predeterminada. Posteriormente, el cultivo de siembra propagado se transfiere a un recipiente de cultivo a gran escala que contiene medio de cultivo sérico y el recipiente de cultivo es operativo hasta que se agotan los nutrientes del medio de cultivo. En un proceso semidiscontinuo, el suministro al tanque de una solución de nutrientes concentrada (por ejemplo, un medio de alimentación) puede ampliar el aporte de nutrientes en el medio de este proceso de cultivo, ampliando así el tiempo de proceso y conduciendo finalmente a un aumento en la producción de la proteína deseada en el recipiente de cultivo. El procedimiento de adición del medio de alimentación puede variar. Este puede añadirse como un solo bolo por pulsos (una, dos, tres veces, etc. al día) o puede suministrarse gradualmente durante un periodo de 24 horas. Este suministro permite la propagación de las células en un recipiente de cultivo a gran escala y recoger el medio, que contiene el producto de proteína de interés segregado, al final de la ejecución antes de que lleguen a agotarse todos los nutrientes. En lugar de eliminar todo el contenido del recipiente, un experto en la técnica solo eliminaría una parte del volumen del tanque (que puede ser de aproximadamente 80%).
Un aspecto opcional del proceso semidiscontinuo es el uso de cambios de temperatura. En este proceso, las temperaturas empleadas como temperaturas operativas durante la fase de producción son más bajas que la temperatura utilizada durante la fase de crecimiento. Dichas fluctuaciones de temperatura, para un proceso semidiscontinuo, por ejemplo el proceso descrito en el presente documento, consistirían en una fase de crecimiento inicial a una temperatura adecuada para el crecimiento de la línea celular particular en uso seguido de una disminución en la temperatura operativa a una densidad celular predeterminada.
Un proceso de cultivo semidiscontinuo a gran escala puede comprender las siguientes etapas: (i) inocular células en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contenga medio de cultivo asérico y propagar el cultivo de siembra al menos hasta que las células alcancen una densidad de siembra cruzada predeterminada a una temperatura adecuada para el crecimiento; (ii) transferir el cultivo se siembra propagado a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotatorios o bolsas de células) que contenga medio de cultivo sin componentes derivados de animales para expandir el cultivo a una temperatura adecuada; (iii) transferir el cultivo de siembra expandido a un recipiente de cultivo a gran escala que contenga medio de cultivo asérico para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada; y (iv) conservar el cultivo a gran escala a una menor temperatura, adecuada para la expresión de la proteína, en medio sin componentes derivados de animales, sustituyendo diariamente por medio de alimentación reciente, al menos hasta que dichas células alcancen una densidad diana o una duración de tiempo crítica.
La etapa de sustitución con medio de alimentación reciente indicada en (iv) puede implicar la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo el 80% del volumen del tanque, y sustituirlo con el mismo volumen de medio de alimentación reciente.
Un proceso de cultivo semidiscontinuo a gran escala puede comprender las siguientes etapas: (i) inocular células en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contenga medio de cultivo asérico y propagar el cultivo de siembra al menos hasta que las células alcancen una densidad de siembra cruzada predeterminada a una temperatura adecuada para el crecimiento; (ii) transferir el cultivo de siembra propagado a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotativos o bolsas de células) que contenga medio de cultivo sin componentes derivados de animales para expandir el cultivo a una temperatura adecuada; (iii) transferir el cultivo de siembra expandido a un recipiente de cultivo a gran escala (por ejemplo, un biorreactor de 1000 l) que contenga medio de cultivo asérico para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada; y (iv) conservar el cultivo a gran escala a una menor temperatura adecuada para la expresión de la proteína, en medio sin componentes derivados de animales, sustituyendo diariamente por medio de alimentación reciente, al menos hasta que dichas células alcancen una densidad diana o una duración de tiempo crítica.
La etapa de sustitución con medio de alimentación reciente indicada en (iv) puede implicar la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo aproximadamente el 80% del volumen del tanque, y sustituirlo con el mismo volumen de medio de alimentación reciente.
Las células cultivadas en un proceso semidiscontinuo pueden ser células de mamífero, por ejemplo células CHO, que expresen un producto de proteína deseado. Las células de mamífero se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo un matraz T-175) que contenga medio de cultivo asérico, por ejemplo medio CD-CHO (Ejemplo 13) y se propagan a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo aproximadamente a 35-39 ºC, durante 3-4 días hasta que las células alcancen una densidad de siembra cruzada predeterminada (por ejemplo, que tenga ∗ 6,0x106 células viables, o en el que la viabilidad final del cultivo sea ∗ 80%). Después, el cultivo de siembra propagado se transfiere a un recipiente de cultivo grande (por ejemplo, frascos rotativos) que contenga medio de cultivo sin componentes derivados de animales para la expansión a una temperatura adecuada (por ejemplo a aproximadamente 35-39 ºC) durante aproximadamente 3-4 días. El cultivo celular se expande adicionalmente en un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, una bolsa de células de 20 l, una bolsa de células de 100 l y similar) que contenga medio asérico, por ejemplo medio CD-CHO, a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo a aproximadamente 35-39 ºC, durante 3-4 días hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga ∗ 1-2 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad final del cultivo sea ∗ 80%). La expansión del inóculo puede implicar un mínimo de 4 pases. La expansiónación del inóculo puede implicar no más de 20 pases.
Después, el cultivo de siembra expandido puede usarse para inocular un tanque de cultivo a gran escala (por ejemplo, un biorreactor de 1000 l, 4000 l y similar), que contenga de medio de cultivo asérico (por ejemplo medio CD-CHO) para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada, por ejemplo a aproximadamente 35-39 ºC durante 3-6 días, hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga ∗ 1-2 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad final del cultivo celular sea ∗ 80%). Un cultivo a gran escala (por ejemplo un cultivo en un biorreactor de 10.000 l, 15.000 l, 20.000 l y similar) se conserva posteriormente en medio de cultivo asérico, en el que el medio es un medio de alimentación (por ejemplo medio eRDF, Ejemplo 14), a una temperatura más baja que la temperatura de crecimiento (por ejemplo a o aproximadamente 33-35 ºC durante 3-4 días, y a o aproximadamente 31-33 ºC durante 6-8 días), adecuada para la expresión de la proteína y la producción del producto de proteína segregado. El medio de alimentación se sustituye diariamente por medio de alimentación reciente, por lo cual la sustitución del tanque con medio de alimentación reciente implica la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo el 80% del volumen del tanque, y volver a poner en el tanque el mismo volumen de medio de alimentación reciente. El cultivo a escala comercial se conserva hasta que dichas células alcancen un valor de parámetros de producción diana que puede ser, pero sin limitación, una duración de tiempo, una densidad celular diana, o una característica bioquímica de la proteína (tal como una proporción molar NANA como se ha descrito anteriormente) en el que la densidad de células viables puede ser de 3,0-8,0 x 106 células/ml; una proporción molar NANA puede ser ∗ 6,0; una viabilidad final del cultivo celular puede ser ∗ 30% y una valoración final de producto de proteína puede ser ∗ 0,5 g/l).
Las células cultivadas en un proceso semidiscontinuo pueden ser células de mamífero, por ejemplo células CHO, que expresen un producto de proteína deseado (por ejemplo, una molécula de CTLA4-Ig). Las células CHO se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contiene medio de cultivo asérico, por ejemplo medio CD-CHO, y se propagan a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo aproximadamente 37 ºC, durante 3-4 días hasta que las células alcanzan una densidad de cruzamiento de siembra predeterminada (por ejemplo, que tenga ∗ 10,0x106 células viables, o en el que la viabilidad del cultivo final sea ∗ 84%). El cultivo sembrado propagado se transfiere después a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotatorios) que contiene medio de cultivo sin componentes derivados de animales para la expansiónación a una temperatura adecuada (aproximadamente 37 ºC) durante aproximadamente 4 días. El cultivo celular se expande adicionalmente en un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, una bolsa de células de 20 l, una bolsa de células de 100 l y similar), que contiene medio asérico, por ejemplo medio CD-CHO, durante 4 días a una temperatura adecuada para el crecimiento (por ejemplo a aproximadamente 37 ºC) hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tengan ∗ 1-2 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad del cultivo final sea ∗ 91%). La expansiónación del inóculo puede implicar un mínimo de 7 pases.
Después, el cultivo sembrado expandido se usa para inocular un tanque de cultivo a gran escala (por ejemplo, un biorreactor de 4000 l y similar), que contenga de medio de cultivo asérico (por ejemplo medio CD-CHO) para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada, por ejemplo, a aproximadamente 37 ºC, durante 5-6 días, hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tengan ∗ 1-2 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad del cultivo celular final sea ∗ 86%). Un cultivo a escala comercial (por ejemplo un cultivo de 20.000 l en un biorreactor) se conserva posteriormente en medio de cultivo asérico, en el que el medio es un medio de alimentación (por ejemplo medio eRDF), a una temperatura inferior a la temperatura de crecimiento, que es adecuada para la expresión de la proteína y producción del producto de proteína segregado (por ejemplo, CTLA4-Ig). La temperatura del cultivo a escala comercial se reduce de aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 34 ºC durante 4 días y después se somete a un segundo cambio de temperatura reduciendo la temperatura de aproximadamente 34 ºC a aproximadamente 32 ºC durante 8 días. El medio de alimentación se reemplaza diariamente por medio de alimentación reciente, en el que el reemplazo del medio de alimentación en el tanque de biorreacción implica la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo el 80% del volumen del tanque, y su reemplazo por el mismo volumen de medio de alimentación reciente. El cultivo a escala comercial se conserva hasta que dichas células CHO y/o producto de proteína segregado alcanza un valor diana de los siguientes parámetros de producción no limitantes: una densidad celular viable de 4,0-7,0 x 106 células/ml; una proporción molar de NANA ∗ 8,0; una viabilidad de cultivo celular final ∗ 38%; y una valoración del producto de proteína final de
∗ 0,6 g/l).
Las células cultivadas en un proceso semidiscontinuo pueden ser células de mamífero, por ejemplo células CHO, que expresen un producto de proteína deseado. Las células de mamífero se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contiene medio de cultivo asérico, por ejemplo medio CD-CHO (EJEMPLO 19), y se propagan a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 39 ºC, durante 3-4 días; o de aproximadamente 36 ºC a aproximadamente 38 ºC, durante aproximadamente hasta 4 días hasta que las células alcancen una densidad de siembra cruzada predeterminada (por ejemplo, que tenga una densidad celular que sea mayor que o igual a 1,5x106 o en el que la viabilidad del cultivo final sea mayor que o igual a aproximadamente 80%). El cultivo sembrado propagado se transfiere después a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, frascos rotativos) que contienen medio de cultivo sin componentes derivados de animales para la expansiónación a una temperatura adecuada (por ejemplo, de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 39 ºC, o de aproximadamente 36 ºC a aproximadamente 38 ºC) durante aproximadamente 34 días o hasta aproximadamente 4 días. El cultivo celular se expande adicionalmente en un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo, una bolsa de células de 20 l, una bolsa de células de 100 l y similar) que contiene medio asérico, por ejemplo medio CD-CHO, a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 39 ºC, o de aproximadamente 36 ºC a aproximadamente 38 ºC, durante aproximadamente 3-4 días o hasta aproximadamente 4 días hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga al menos aproximadamente 1,5 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad del cultivo final sea mayor que o igual al 80%). La expansión del inóculo puede implicar un mínimo de 4 pases. La expansión del inóculo puede implicar no más de 20 pases. El medio CD-CHO puede ser un medio de inóculo CD-CHO.
Después, el cultivo sembrado expandido puede usarse para inocular un tanque de cultivo a gran escala (por ejemplo, un biorreactor de 1000 l, 4000 l y similar), que contenga medio de cultivo asérico (por ejemplo medio CD-CHO, tal como medio de inóculo CD-CHO y/o medio basal CD-CHO) para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada, por ejemplo de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 39 ºC, o de aproximadamente 36 ºC a aproximadamente 38 ºC durante aproximadamente 3 a aproximadamente 6 días, o durante aproximadamente 4 a aproximadamente 5 días, o durante aproximadamente 4,7 días o durante menos de o igual a aproximadamente 113 horas, hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga aproximadamente 2,3 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad del cultivo celular final sea al menos aproximadamente del 88%).
Un cultivo a escala comercial (por ejemplo un cultivo de 10.000 l, 15.000 l, 20.000 l, 30.000 l en un biorreactor y similar) se conserva posteriormente en medio de cultivo asérico, en el que el medio es un medio de alimentación (por ejemplo medio eRDF, EJEMPLO 19), a una temperatura de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 39 ºC durante aproximadamente 3 a aproximadamente 6 días, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 días, adecuada para la expresión de la proteína y la producción del producto de proteína segregado. Como alternativa, puede añadirse un compuesto polianiónico (tal como, por ejemplo, sulfato de dextrano) a un cultivo conservado en medio de cultivo asérico, en el que el medio es un medio de alimentación (por ejemplo medio eRDF, EJEMPLO 19) como se describe más adelante y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2005/0019859. El cultivo puede someterse simultáneamente a una disminución de temperatura de una sola etapa (por ejemplo, a o a aproximadamente 32 ºC, a o a aproximadamente 36 ºC, durante aproximadamente de 3 a aproximadamente 14 días, o durante aproximadamente de 10 a aproximadamente 13 días, o durante aproximadamente de 234 a aproximadamente 304 horas.
El cultivo también puede someterse simultáneamente a una disminución de temperatura multietapa (por ejemplo, a o a aproximadamente 33 ºC, a o a aproximadamente 35 ºC, durante aproximadamente 3-6 días, y a o a aproximadamente 31 ºC, a aproximadamente a 33 ºC durante aproximadamente 6-8 días). El proceso descrito anteriormente es adecuado para la expresión de la proteína y la producción del producto de proteína segregado.
El medio de alimentación en los casos descritos anteriormente puede reemplazarse diariamente (1, 2, 3, etc. veces día) o cada algunos días con medio de alimentación reciente. El reemplazo del tanque con el medio de alimentación reciente implica la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo el 80% del volumen del tanque, y reemplazar el tanque con el mismo volumen de medio de alimentación reciente. El cultivo a escala comercial se conserva hasta que dichas células alcanzan un valor de parámetros de producción diana que puede ser, pero sin limitación, una duración de tiempo, una densidad celular diana, o una característica bioquímica de la proteína (tal como una proporción molar de NANA como se ha descrito anteriormente) en el que la densidad de celular viable puede ser de 3,0-8,0 x 106 células/ml; una proporción molar de NANA puede ser aproximadamente ∗ 5,0, o aproximadamente 6; o de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6; una viabilidad del cultivo celular final puede ser mayor que o igual a aproximadamente 30% o mayor que o igual a aproximadamente 37%; y una valoración del producto de proteína final puede ser de aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 g/l, mayor que o igual a 0,5 g/l, o mayor que o igual a 20 g/l.
Se describe un proceso de cultivo celular que implica la adición retardada de un compuesto polianiónico. El proceso comprende añadir un compuesto polianiónico a un cultivo celular en un momento después de la inoculación (por ejemplo, durante la fase de crecimiento o durante la fase de producción del proceso de cultivo). La adición retardada del compuesto polianiónico consigue aumentar la viabilidad celular. Un proceso de cultivo celular puede comprender cultivar células huésped, que expresen una proteína de interés, y añadir un compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento después de la inoculación.
Los compuestos polianiónicos incluyen, pero sin limitación, sulfato de dextrano (disponible en Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.), heparina (disponible en Sigma-Aldrich), heparán sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), mannan sulfato, crondroitín sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), dermatán sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), queratán sulfato (disponible de Sigma-Aldrich), hialuronato (disponible de Sigma-Aldrich), poli(vinil sulfato) (disponible de Sigma-Aldrich), kappa-carragenano (disponible de Sigma-Aldrich) y suramina (disponible de Sigma-Aldrich). Se dispone fácilmente de los compuestos a partir de las fuentes indicadas, o pueden obtenerse fácilmente mediante medios conocidos por un experto en la técnica. Estos compuestos se encuentran frecuentemente disponibles en forma de una sal, incluyendo pero sin limitación, sal de sodio, pero también pueden usarse en formas no salinas. Un compuesto polianiónico incluye todas sus formas, incluyendo pero sin limitación, formas salinas, tales como sales de sodio.
Como ejemplos no limitantes, particularmente útiles, de compuestos polianiónicos que pueden usarse se incluyen compuestos polisulfatados: sulfato de dextrano, heparina, heparan sulfato, mannan sulfato, condroitín sulfato, dermatán sulfato, queratán sulfato, poli(vinil sulfato), kappa-carragenano y suramina. El compuesto polianiónico puede ser sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano puede tener un peso molecular promedio de 5.000 a 500.000 Da. Puede utilizarse sulfato de dextrano que tenga un peso molecular de 5.000 Da.
El compuesto polianiónico puede añadirse al cultivo celular una vez, dos veces, tres veces o cualquier cantidad de veces durante el periodo de cultivo celular especificado (por ejemplo, en un momento después de la inoculación, tal como durante la fase de crecimiento o la fase de producción). Pueden utilizarse uno o más compuestos polianiónicos juntos. Por ejemplo, cualquier adición sencilla proporcionada de un compuesto polianiónico puede incluir la adición de uno o más compuestos polianiónicos diferentes. De manera similar, si hay más de una adición de un compuesto polimérico, pueden añadirse compuestos poliméricos diferentes a diferentes adiciones. Los compuestos y sustancias adicionales, incluyendo los compuestos polianiónicos, pueden añadirse al cultivo antes, con, o después de la adición del compuesto polianiónico, durante el periodo de tiempo especificado o no. Puede haber una sola adición, por ejemplo una vez, de compuesto polianiónico. Puede añadirse un compuesto polianiónico.
El compuesto polianiónico puede añadirse al cultivo celular mediante cualquier medio. Los medios de adición de compuestos polianiónicos incluyen, pero sin limitación, la disolución en agua, la disolución en medio de cultivo, la disolución en medio de alimentación, la disolución en un medio adecuado y en forma en la que este se obtiene. En particular, el compuesto polianiónico se añade disuelto en agua. El compuesto polianiónico se añade para llevar la concentración en el cultivo a un nivel apropiado. Como ejemplos no limitantes, el compuesto polianiónico se añade a una concentración de 1-1000 mg/l, 1-200 mg/l, 1-100 mg/l, o 25-75 mg/l. Las concentraciones particularmente útiles del compuesto polianiónico añadido al cultivo celular incluyen, pero sin limitación, aproximadamente 25-200 mg/l; aproximadamente 25-100 mg/l, y aproximadamente 50-100 mg/l. La concentración del compuesto polianiónico añadida al cultivo puede ser de aproximadamente 50 mg/l. Como alternativa, la concentración del compuesto polianiónico añadida al cultivo puede ser de aproximadamente 100 mg/l.
El cultivo puede desarrollarse durante cualquier duración de tiempo después de la adición del compuesto polianiónico. El tiempo de desarrollo del cultivo puede determinarse por un experto en la técnica, basándose en factores relevantes, tales como, la cantidad y la calidad de la proteína que pueda recuperarse, y del nivel de especies celulares contaminantes (por ejemplo proteínas y ADN) en el sobrenadante resultante de lisis celular, que complicará la recuperación de la proteína de interés. El compuesto polianiónico puede añadirse en un momento después de la inoculación (por ejemplo, durante la fase de crecimiento del proceso de cultivo celular o durante la fase de producción del proceso de cultivo celular). El compuesto polianiónico se añade en el momento después de la inoculación que es durante, o aproximadamente, al final de la fase de crecimiento. En particular, el compuesto polianiónico se añade en el momento después de la inoculación, que es durante la fase de producción, por ejemplo, al inicio de la aparición de la fase de producción.
Las células cultivadas en un proceso semidiscontinuo pueden ser células de mamífero, por ejemplo células CHO, que expresan un producto de proteína deseado (por ejemplo, una molécula de CTLA4A29YL104E-Ig). Las células CHO se inoculan en un recipiente de cultivo de siembra (por ejemplo, un matraz T-175) que contiene medio de cultivo asérico, por ejemplo medio CD-CHO (tal como medio de inoculación CD-CHO) y se propagan a una temperatura adecuada para el crecimiento, por ejemplo a aproximadamente 37 ºC, durante aproximadamente 3-4 días hasta que las células alcancen una densidad de siembra cruzada predeterminada (por ejemplo, que tenga ∗ 1,5x 106 células viables o en el que la viabilidad del cultivo celular sea ∗ 80%). El cultivo sembrado propagado se transfiere después a un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo frascos rotativos) que contienen medio de cultivo sin componentes derivados de animales para la expansión a una temperatura adecuada (aproximadamente a 37 ºC) durante aproximadamente 4 días. El cultivo celular se expande adicionalmente en un recipiente de cultivo más grande (por ejemplo una bolsa de células de 20 l, una bolsa de células de 100 l, y similar) que contiene medio asérico, por ejemplo medio CD-CHO (tal como medio de inóculo CD-CHO), durante aproximadamente 4 días a una temperatura adecuada para el crecimiento (por ejemplo, a aproximadamente 37 ºC) hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga ∗ 1,5x106 células viables, o en el que la viabilidad de cultivo final sea ∗ 80%). La expansión del inóculo puede implicar un mínimo de 7 pases.
El cultivo sembrado expandido se usa después para inocular un tanque de cultivo a gran escala (por ejemplo, un biorreactor de 1000 l, 4000 l y similar), que contiene medio de cultivo asérico (por ejemplo medio CD-CHO, tal como medio basal CD-CHO) para propagar adicionalmente el cultivo celular a una temperatura adecuada, por ejemplo a aproximadamente 37 ºC, durante aproximadamente 5-6 días, hasta que las células alcancen una densidad de siembra diana (por ejemplo, que tenga aproximadamente 2,3 x106 células viables/ml, o en el que la viabilidad del cultivo celular final sea ∗ 88%). Posteriormente, un cultivo a escala comercial (por ejemplo, un cultivo de 10.000 l,
15.000 l o 20.000 l y similar en un biorreactor) se conserva en medio de cultivo asérico, en el que el medio es un medio de alimentación (por ejemplo medio eRDF), a una temperatura inferior a la temperatura de crecimiento, que es adecuada para la expresión de la proteína y para la producción del producto de proteína segregado (por ejemplo
una CTLA4A29YL104E-Ig).
La temperatura del cultivo a escala comercial se reduce, por ejemplo, de aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 34 ºC, durante aproximadamente 4 días. Cuando se reduce la temperatura, al cultivo puede añadirse, de manera simultánea, un compuesto polianiónico. Como alternativa, la temperatura del cultivo a escala comercial se reduce de aproximadamente 35 ºC -37 ºC a aproximadamente 32 ºC -36 ºC durante aproximadamente 12 días y, a medida que se reduce la temperatura, al cultivo se le añade, de manera simultánea, un compuesto polianiónico.
El medio de alimentación en los casos descritos anteriormente puede reemplazarse diariamente (1, 2, 3, etc. veces día) o cada algunos días con medio de alimentación reciente. El reemplazo del tanque con medio de alimentación reciente implica la eliminación de un volumen predeterminado, por ejemplo el 80% del volumen del tanque, y el reemplazo del tanque con el mismo volumen de medio de alimentación reciente. El medio de alimentación puede añadirse diariamente durante aproximadamente 2 a 3 días, hasta que, por ejemplo, la concentración de glucosa sea de 1 g/l. Como alternativa, el medio de alimentación puede añadirse cada 8 horas, por ejemplo, una vez que la concentración de glucosa haya alcanzado 1 g/l. El cultivo a escala comercial se conserva hasta que dichas células CHO y/o producto de proteína segregado alcanza un valor diana de los siguientes parámetros de producción no limitantes: una proporción molar de NANA de aproximadamente 6,0, o de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,5; una viabilidad del cultivo celular final ∗ 37%; y una valoración del producto de proteína final de aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 g/l.
Las células a cultivar pueden ser células de mamífero, o una línea de células de mamífero establecida, incluyendo, sin limitación, líneas de células CHO (por ejemplo CCL 61 de la ATCC), HEK293 (por ejemplo, CRL 1573 de la ATCC; Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), COS-1 (por ejemplo, CRL 1650 de la ATCC), DG44 (línea de células CHO) (Cell, 33: 405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986) y la línea de células de riñón de cría de hámster (BHK). Otros ejemplos útiles, no limitantes, son los mielomas, las células 3T3, las células de Namalwa y fusiones de mielomas con otras células. Las células pueden ser células mutantes o recombinantes tales como, por ejemplo, células que expresen un espectro de enzimas diferente que catalizan la modificación de proteínas postraduccionales (por ejemplo, enzimas procesadoras, tales como propéptidos o enzimas de glucosilación, tales como glucosiltransferasas y/o glucosidasas) en comparación con el tipo de célula a partir del cual derivan. En particular, se utilizan células CHO/dhfr-.
Los recipientes de cultivo usados para expandir el cultivo celular pueden ser, pero sin limitación, matraces Erlenmyer, matraces T-175, frascos rotativos, y bolsas de células. Los recipientes de cultivo a gran escala pueden ser, por ejemplo, reactores aerotransportadores en los que la agitación se obtiene introduciendo aire desde el fondo del recipiente o reactores de tanque agitados convencionales (RTAC), en los que la agitación se obtiene mediante tipos de impulsores convencionales. Entre los parámetros controlados dentro de los límites especificados se encuentran la temperatura, el pH y la tensión de oxígeno disuelto (TOD). El medio de control de temperatura en este sistema es el agua, y puede calentarse o enfriarse según sea necesario. El agua puede pasar a través de un serpentín canalizador sumergido en el medio de cultivo celular o a través de una camisa que rodea el recipiente. El pH puede regularse, por ejemplo, mediante la adición de bases al medio de cultivo celular cuando se requiera o modificando la concentración de CO2 en el gas del espacio de cabeza. La TOD puede conservarse rociando con oxígeno puro o aire o mezclas de los mismos.
Por lo tanto puede producirse una proteína recombinante mediante un procedimiento que comprenda al menos dos etapas: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante (es decir, una proteína que las células de mamífero no expresen o sobreexpresen normalmente, donde la proteína recombinante se exprese en las células mediante un vector de expresión o construcción que se ha transfectado en las células o en las células parentales) desde un cultivo sembrado a un cultivo líquido de al menos 10.000 l y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos 10.000 l. Este procedimiento puede usarse de tal manera que la proteína recombinante se produzca a una concentración de al menos 0,5 gramos por litro de cultivo líquido antes de la purificación de la proteína del cultivo líquido. Como alternativa, el procedimiento puede usarse para producir una proteína recombinante a una concentración de al menos desde aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 gramos por litro de cultivo líquido antes de la purificación de la proteína del cultivo líquido.
La etapa de expansión puede implicar (i) cultivar las células en un medio asérico con al menos cuatro pases para obtener de esta manera una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 105 células viables por ml y (ii) conservar las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir al menos aproximadamente 0,5 de la proteína recombinante. En algunos casos, el número de pases no supera los 36 pases. En otros casos, el número de pases puede superar 36 pases en los que las células son estables durante generaciones con respecto al número de copias del ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, viabilidad celular y duplicación de tiempo.
El tiempo suficiente para producir al menos de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,3 g/l de la proteína recombinante puede ser cualquier cantidad de tiempo siempre que la viabilidad celular no se encuentre por debajo de 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% y/o siempre que el número de generaciones de células no supere 50, 75, 100, 105 o 125 generaciones. Esta etapa de conservación también puede comprender etapas de cambio de temperatura, tales como disminuir la temperatura del primer cultivo de 37 ! 2 ºC a 34 ! 2 ºC y a un tiempo posterior de 34 ! 2 ºC a 32 ! 2 ºC. La temperatura de 32 ! 2 ºC puede conservarse durante al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 o 100 días. La temperatura de 32 ! 2 ºC puede conservarse durante al menos 20, 50, 75 o 100 generaciones de células. La temperatura de 32 ! 2 ºC puede conservarse hasta que la densidad celular del cultivo sea de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 x 105 células por ml del cultivo líquido.
Puede producirse una proteína recombinante mediante un procedimiento que comprenda al menos las etapas de:
(a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo sembrado a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de tal manera que la concentración de la proteína recombinante sea al menos de 0,5 gramos/l de cultivo liquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo de al menos 10.000 l, cuando el cultivo líquido: (i) contiene una cantidad mayor que o igual a aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de proteína (en este caso glucoproteína); (ii) tiene una densidad celular de aproximadamente 33 a aproximadamente 79 x 105 células por ml; (iii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente 38% o es mayor que o igual a aproximadamente 38%; (iv) la endotoxina es menor que o igual a aproximadamente 76,8 UE por ml de cultivo líquido; y/o (v) la biocarga es menor que 1 unidad formadora de colonias por ml de cultivo líquido.
La etapa de expansión puede implicar (i) cultivar las células en un medio asérico con al menos cuatro pases para obtener así una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 106 células viables por ml, y (ii) conservar las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir al menos de aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 gramos de la proteína recombinante por litro de cultivo celular. En algunos casos, el número de pases no supera los 36 pases. En otros casos, el número de pases puede superar los 36 pases en los que las células son estables durante generaciones con respecto al número de copias del ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, viabilidad celular y duplicación de tiempo.
El tiempo suficiente para producir al menos de aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 g/l de la proteína recombinante puede ser cualquier cantidad de tiempo siempre que la viabilidad celular no se encuentra por debajo del 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% y/o siempre que el número de generaciones de células no supere las 27, 50, 75, 100, 105, o 125 generaciones. La etapa de conservación también puede comprender etapas de cambio de temperatura, tales como disminuir la temperatura del primer cultivo de 37 ! 2 ºC a 34 ! 2 ºC. La temperatura de 34 ! 2 ºC puede conservarse durante al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 o 100 días. Como alternativa, la etapa de conservación puede ser una etapa de cambio de temperatura, tal como disminuir de la temperatura del cultivo de 37 ! 2 ºC a 34 ! 2 ºC.
A medida que comienza a disminuir la temperatura la los cultivos puede añadirse un compuesto polianiónico. La concentración de compuesto polianiónico añadida al cultivo puede ser de aproximadamente 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 12,5 mg/l, 15 mg/l, 25 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l, 250 mg/l, 500 mg/l, 750 mg/l o 1000 mg/l. La temperatura de 32 ! 2 ºC puede conservarse durante al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 o 100 días. La temperatura de 34 ! 2 ºC puede conservarse durante al menos 20, 27, 50, 75 o 100 generaciones de células.
Puede producirse una proteína recombinante mediante un procedimiento que comprenda al menos las etapas de:
(a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de tal manera que la concentración de proteína recombinante sea al menos de aproximadamente 0,46 a aproximadamente 0,71 gramos por litro de cultivo liquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo de al menos 10.000 l de cultivo líquido cuando el cultivo líquido: (i) contiene aproximadamente 6 moles de NANA por mol de proteína (en este caso glucoproteína); (ii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no es menor de aproximadamente 37%; (iii) la endotoxina es menor que o igual a aproximadamente 4,8 UE por ml de cultivo líquido; y/o (iv) la biocarga es menor que 1 unidad formadora de colonias por ml de cultivo líquido.
La proteína recombinante producida por estos procedimientos descritos en el presente documento puede ser una proteína, una glucoproteína, una citocina, una hormona, una proteína CTLA4-Ig o una proteína CTLA4A29YL104E-Ig segregada. Las células de mamífero pueden ser progenitoras o subclones de células descritos en el presente documento. Como alternativa, las células de mamífero pueden ser progenitoras o subclones de células derivados de la línea celular descrita en el presente documento. Adicionalmente, las células de mamífero pueden ser una población clonal de células transfectadas con un casete de expresión que comprenda la SEC ID Nº: 1. En particular, las células de mamífero pueden ser una población clonal de células transfectadas con un casete de expresión que comprenda la SEC ID Nº: 3.
Técnicas generales para la purificación de proteína recombinante del cultivo
Después de la fase de producción de proteína del proceso de cultivo celular, la proteína de interés, por ejemplo, una glucoproteína, se recupera del medio de cultivo celular usando técnicas conocidas por un experto en la materia. En particular, la proteína de interés se recupera del medio de cultivo como un polipéptido segregado, aunque también puede recuperarse de lisados de células huésped. El medio de cultivo o lisado se centrifuga inicialmente para eliminar residuos y partículas celulares. Posteriormente, la proteína deseada puede purificarse de ADN contaminante, proteínas solubles y polipéptidos con los siguientes procedimientos de purificación no limitantes bien establecidos en la técnica: SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; precipitación con etanol; fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre resina de intercambio aniónico, tal como QAE o DEAE; cromatoenfoque; filtración en gel utilizando, por ejemplo, una columna Sephadex G-75™; y columnas de proteína A Sepharose™ para eliminar contaminantes tales como IgG. La adición de un inhibidor de proteasa, tal como fenil metil sulfonil fluoruro (FMSF) o un cóctel inhibidor de proteasa mixto también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Un experto habitual en la técnica reconocerá que los procedimientos de purificación adecuados para una proteína de interés, por ejemplo, una glucoproteína, pueden precisar alteraciones que representen cambios en el carácter de la proteína tras la expresión en cultivos de células recombinantes.
Las técnicas de purificación y los procedimientos que seleccionan los grupos carbohidrato de la glucoproteína son también útiles dentro del contexto de la presente invención. Por ejemplo, dichas técnicas incluyen, HPLC o cromatografía de intercambio iónico usando resinas de intercambio catiónico o aniónico, en las que se recogen las fracciones más básicas o más ácidas, dependiendo del carbohidrato que vaya a seleccionarse. El uso de dichas técnicas también puede dar como resultado la eliminación simultánea de contaminantes.
Las células CHO capaces de producir proteínas de fusión CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig se cultivan como una suspensión en un medio específico de CHO a una densidad celular predeterminada. Las células CHO cultivadas en suspensión en el medio de expresión asérico producen posteriormente moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig, segregadas por las células CHO en el medio de cultivo. La suspensión celular puede depurarse por centrifugación y las moléculas de CTLA4-Ig pueden después separarse del sobrenadante de cultivo depurado mediante técnicas de purificación convencionales. Son ejemplos no limitantes de procedimientos de purificación adecuados para obtener
CTLA4A29YL104E-Ig,
mayor pureza y homogeneidad de CTLA4-Ig oindividualmente o en combinación: la cromatografía de afinidad sobre sepharose; el fraccionamiento en columnas de intercambio aniónico (CIA); y cromatografía de interacción hidrófoba (CIH).
En algunas realizaciones el aislamiento de moléculas de CTLA4-Ig u otras proteínas (incluyendo glucoproteínas) a partir de los procedimientos de producción descritos en el presente documento pueden incluir al menos las siguientes etapas: (i) obtener un sobrenadante de cultivo celular; (ii) someter el sobrenadante a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto de proteína eluido; (iii) someter el producto de proteína eluido de la etapa (ii) a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener un producto de proteína enriquecido; (iv) someterla al producto de proteína enriquecido a cromatografía de afinidad para obtener un producto de proteína eluido y enriquecido; y (v) someter el producto de proteína eluido y enriquecido de la etapa (iv) a cromatografía de intercambio aniónico. El producto de proteína enriquecido obtenido en la etapa (iii) puede caracterizarse, por ejemplo, porque su porcentaje de cualquier proteína de APM o contaminante es menor que 5, 10, 15 o 25%. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de lavado que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 25-100 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 300-900 mM y que tenga un pH de aproximadamente 7,0-8,0. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) puede realizarse, por ejemplo, usando un solo tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 7,0 y que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 850 mM; o un tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 8,0 y que comprenda Tris a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 250 mM. La cromatografía de afinidad de la etapa (iv) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de elución que tenga un pH de aproximadamente 3,5 y que comprenda glicina a una concentración de aproximadamente 100 mM. La cromatografía de afinidad de la etapa (v) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 8,0 y que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 120 mM a aproximadamente 130 mM, o un tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 8,0 y que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 200 mM. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) puede realizarse usando una columna que tenga una resina de intercambio aniónico que tenga un grupo funcional amina primario, secundario, terciario o cuaternario. La columna de interacción hidrófoba de la etapa (iii) puede realizarse usando una resina de interacción hidrófoba que tenga un grupo funcional fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo.
En otras realizaciones, el aislamiento de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig u otras proteínas (incluyendo glucoproteínas) a partir de los procedimientos de producción descritos en el presente documento pueden incluir al menos las siguientes etapas: (i) obtener un sobrenadante de cultivo celular; (ii) someter el sobrenadante a cromatografía de afinidad para obtener un producto de proteína eluido; (iii) someter el producto de proteína eluido de la etapa (ii) a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto de proteína enriquecido; y (iv) someter el producto de proteína enriquecido a cromatografía de interacción hidrófoba para obtener un producto de proteína eluido y enriquecido con complejos reducidos de proteína de alto peso molecular (APM). El producto de proteína enriquecido obtenido en la etapa (iv) puede caracterizarse, por ejemplo, porque su porcentaje de cualquier proteína de APM o contaminante es menor que 5, 10, 15 o 25%. La cromatografía de afinidad de la etapa (ii) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de elución que tenga un pH de aproximadamente 3,0 y que comprenda glicina a una concentración de aproximadamente 250 mM. La cromatografía de afinidad de la etapa (ii) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 7,5 y que comprenda NaH2PO4 a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 150 mM. La cromatografía de intercambio iónico de la etapa (iii) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de lavado que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 50 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 130 mM y que tenga un pH de aproximadamente 7,0. La cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (iii) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de elución que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 50 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 200 mM y que tenga un pH de aproximadamente 7,0. La cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iv) puede realizarse, por ejemplo, usando un tampón de lavado que tenga un pH de aproximadamente 7,0 y que comprenda HEPES a una concentración de aproximadamente 50 mM y (NH4)2SO4 a una concentración de aproximadamente 1,2 M. La cromatografía de intercambio iónico de la etapa (iii) puede realizarse usando una columna que tenga una resina de intercambio aniónico que tenga un grupo funcional amina primario, secundario, terciario, cuaternario. La columna de interacción hidrófoba de la etapa (iv) puede realizarse usando una resina de interacción hidrófoba que tenga un grupo funcional fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo.
En una realización, la invención proporciona un procedimiento de purificación de moléculas de CTLA4-Ig de un cultivo celular líquido, de tal manera que la CTLA4-Ig purificada carezca sustancialmente de Proteína Quimiotáctica de Monocitos 1 (MCP-1). En una realización, la invención proporciona una composición farmacéuticamente aceptable de moléculas de CTLA4-Ig, en la que la composición comprende no más de 0,5 ppm de MCP-I, 1 ppm de MCP-1, 2 ppm de MCP-1, 3 ppm de MCP-1, 4 ppm de MCP-1, 5 ppm de MCP-1, 6 ppm de MCP-1, 7 ppm de MCP1, 8 ppm de MCP-1, 9 ppm de MCP-1 o 10 ppm de MCP-1. En otra realización, en la composición, la cantidad de MCP-1 no puede superar el 1%, 0,5% o 0,1% del peso de la CTLA4-Ig purificada. En otra realización, la composición de las moléculas de CTLA4-Ig carece sustancialmente de MCP-1, en la hay menos de 50, 45, 40, 38, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o un 1 ng/ml de MCP-1 en el líquido eluado QFF. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de purificación de moléculas de CTLA4-Ig de un cultivo celular líquido, de tal manera que la CTLA4-Ig purificada carece sustancialmente de MCP-1 y comprende menos del 2,5% del tetrámero de CTLA4-Ig.
La cantidad de proteína quimiotáctica de Monocitos 1 (MCP-1) en la composición puede cuantificarse usando un procedimiento ELISA. El anticuerpo de revestimiento es un anticuerpo anti MCP-1 IgG 1 de ratón de cabra. El anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-MCP-1 IgG de rata de conejo. La detección se realiza usando peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra y el sustrato TMB. El reactivo peroxidasa de rábano picante produce una reacción colorimétrica que se revela en proporción con la cantidad de proteína capturada. El ELISA cuantifica el nivel de MCP-1 relativo a una curva patrón material. En una realización, la MCP-1 se cuantifica en la composición y los niveles de MCP-1 estaban en intervalos de 0-0,097 ng/mg y 0,0140,154 ng/mg.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para purificar moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de un cultivo celular líquido de tal manera que la CTLA4A29YL104E-Ig carece sustancialmente de Proteína Quimiotáctica de Monocitos-1 (MCP-1). En una realización, la cantidad de MCP-1 no puede superar el 1%, 0,5% o 0,1% del peso de la CTLA4A29YL104E-Ig purificada. En otra realización, la CTLA4A29YL104E-Ig carece sustancialmente de MCP-1 en la que hay menos de 50, 45, 40, 38, 35 o 30 ng/ml de MCP-1 en el líquido eluado de CIH. En el presente documento se describe un procedimiento para purificar moléculas DE CTLA4A29YL104E-Ig de un cultivo celular líquido de tal manera que la CTLA4A29YL104E-Ig carece sustancialmente de MCP-1 y comprende menos del 2,5% del tetrámero de
CTLA4A29YL104E-Ig.
Recuperación de glucoproteínas del cultivo celular y purificación
La presente invención describe una serie de etapas para la separación de una glucoproteína (CTLA4-Ig o
CTLA4A29YL104E-Ig) de
un conjunto de proteínas del sobrenadante de cultivo celular impuro, que contiene la glucoproteína de interés (CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) y contaminantes no deseables. El sobrenadante de cultivo celular impuro puede usarse como material de partida para la purificación de la glucoproteína CTLA4-Ig o
CTLA4A29YL104E-Ig.
En una realización de la presente invención, el sobrenadante de cultivo celular impuro que contiene la glucoproteína CTLA4-Ig y los contaminantes no deseables pueden aplicarse a un medio de intercambio aniónico. La glucoproteína CTLA4-Ig presente en el sobrenadante de cultivo celular impuro se une al medio de intercambio aniónico. El medio de intercambio aniónico puede después lavarse para eliminar cualquier material no unido del medio de intercambio aniónico. La gluocoproteína CTLA4-Ig se eluye después de eliminar el material no unido, y el eluado se recoge.
En una realización de la presente invención, el sobrenadante de cultivo celular impuro que contiene la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig y contaminantes no deseados puede aplicarse a un medio de cromatografía de afinidad. La glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig presente en el sobrenadante de cultivo celular impuro puede unirse al medio de cromatografía de afinidad. El medio de cromatografía de afinidad puede después lavarse para eliminar cualquier material no unido del medio de intercambio aniónico. La glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig puede eluirse después de eliminar el material no unido y el eluado se recoge.
En una realización paticular de la presente invención, para separar la glucoproteína CTLA4-Ig del material recogido, así como para disminuir los contaminantes a granel, puede emplearse Cromatografía de Intercambio Aniónico (CIA) en Q-Sepharose, por ejemplo usando una columna Q-Sepharose XL (GE Healthcare). Esta columna puede usarse como una etapa temprana en la purificación de la glucoproteína CTLA4-Ig a partir de un cultivo de células de mamífero por fraccionamiento del medio de cultivo celular recogido. La Cromatografía de Intercambio Aniónico en Q-Sepharose, por ejemplo Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), puede usarse después de una etapa de purificación con cromatografía de afinidad. La propiedad de flujo muy alto de las columnas de intercambio aniónico permite que un gran volumen de glucoproteína de CTLA4-Ig o medio de cultivo celular recogido se concentre rápidamente antes de realizar las siguientes etapas de cromatografía, tal como SP-Sepharose o CIH, ajustando condiciones de tal manera que la proteína CTLA4-Ig se una a la columna. Para un tampón de lavado de pH de aproximadamente 5 a 9, en particular aproximadamente 8, son útiles concentraciones de HEPES de 75 mM y NaCl de 360 mM. Típicamente, para un tampón de elución de pH de aproximadamente 5 a 8, en particular aproximadamente 7, son útiles concentraciones de HEPES de 25 mM y NaCl de 325 mM.
Las resinas que son adecuadas para separar la glucoproteína CTLA4-Ig del medio de cultivo recogido son las que tienen grupos funcionales de amina inmovilizados. Más útiles son las resinas que tienen grupos funcionales de amina cuaternaria, por ejemplo las resinas de Q-Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en las que el ligando de amonio cuaternario se une a agarosa reticulada de alta porosidad. También son útiles las resinas de grupos funcionales de amina primaria, secundaria y terciaria, por ejemplo las resinas de DEAE Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en las que un ligando de dietil aminoetil terciario está unido a agarosa reticulada de alta porosidad.
En otra realización de la presente invención, el eluado que contiene la gluocoproteína CTLA4-Ig se recoge del medio de intercambio aniónico y después se pone en contacto con una resina de interacción hidrófoba. Como se describe más adelante, el volumen que contiene la glucoproteína CTLA4-Ig pasa a través de la columna de CIH y el grupo recogido, que adicionalmente puede purificarse, se une después a una resina de intercambio aniónico.
La CIH es útil para la separación de dímeros de glucoproteína CTLA4-Ig deseados de material de alto peso molecular y otras impurezas de proteína del cultivo de células de mamífero. Por ejemplo, el cultivo de células CHO que expresan CTLA4-Ig contiene agregados de alto peso molecular de la glucoproteína CTLA4-Ig. También se encuentran impurezas de proteínas de células CHO, en el medio de cultivo de células de mamífero. Estos productos no deseables podrían generar una respuesta antigénica no deseada en un paciente y contribuir a una mala calidad o actividad del producto. La CIH separa eficazmente variantes hidrófobas, dímeros de glucoproteína CTLA4-Ig de complejos de glucoproteína CTLA4-Ig de APM e impurezas de proteínas de células CHO mediante los últimos productos que se unen a la resina de CIH y los dímeros de glucoproteína CTL4-Ig pasan a través de la columna. Por tanto, podría obtenerse un grupo de glucoproteína CTLA4-Ig que careciese sustancialmente de estas especies, y que fuese particularmente idóneo para otra etapa cromatográfica, tal como cromatografía de intercambio aniónico. Una fuente de mezclas de glucoproteína CTLA4-Ig para su uso con CIH es un cultivo de células de mamífero, por ejemplo, un cultivo de células CHO. En particular, el cultivo puede someterse a al menos una etapa de purificación inicial como se ha indicado anteriormente.
En otra realización de la presente invención, el procedimiento de CIH puede modificarse para recoger un conjunto de glucoproteínas distintas (por ejemplo, complejos de CTLA4-Ig de APM). Los agregados de APM pueden unirse a la resina de CIH (por ejemplo, que comprende tetrámero de CTLA4-Ig y similares). Estos complejos de APM tienen mayor avidez y se unen más eficazmente in vitro que el dímero de CTLA4-Ig en solitario. Por tanto, un experto en la técnica puede obtener un conjunto de agregados de CTLA4-Ig de APM eluyendo el conjunto de CTLA4-Ig fuera de la CIH.
Las resinas de CIH más útiles para separar formas de glucoproteína CTLA4-Ig son aquellas que tienen grupos funcionales fenilo inmovilizados. De las resinas de CIH con grupos fenilo, las más útiles son las de Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub (sustitución alta) de GE Healthcare. Los medios Phenil Toyopearl de TosoHaas y TSK Phenil 5PW son ejemplos no limitantes de otras resinas de CIH con grupos fenilo que pueden usarse. Otros grupos funcionales de CIH incluyen, pero sin limitación, los restos propilo, octilo, alcoxilo, butilo e isoamilo.
Para reducir la cantidad de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig eluidas en una etapa de purificación por CIH (véase el Ejemplo 15 y el EJEMPLO 20) puede usarse un proceso de cromatografía en columna con Phenyl Sepharose 4 Fast Flow, Cromatografía de Interacción Hidrófoba (CIH). Por lo tanto, el pico de eliminación de la columna de CIH es rico en especies de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig de APM.
La fracción no unida que contiene la glucoproteína CTLA4-Ig de la etapa de purificación por CIH puede someterse a un procedimiento de purificación adicional, tal como cromatografía de afinidad, y el eluado resultante puede después aplicarse a un medio de intercambio aniónico. La glucoproteína CTLA4-Ig se une a la resina de intercambio aniónico, que posteriormente puede lavarse para eliminar las proteínas no unidas. Después de eliminar las proteínas no unidas, la glucoproteína CTLA4-Ig se eluye de la segunda resina de intercambio aniónico. El eluado se recoge y se concentra adicionalmente.
En otra realización de la presente invención, se emplea cromatografía de afinidad, por ejemplo rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) para enriquecer adicionalmente la glucoproteína CTLA4-Ig, a la que después le sigue una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). La etapa de cromatografía de afinidad también puede reducir los niveles de impurezas de proteínas de células CHO y Proteína Quimiotáctica de Monocitos (MCP-1, una quimiocina). La cromatografía de afinidad implica la separación adsortiva, en la que una molécula de interés a purificar, por ejemplo una glucoproteína CTLA4-Ig, se une específicamente y de manera reversible a un ligando inmovilizado en alguna matriz o resina. Algunos ejemplos no limitantes de columnas de purificación por afinidad incluyen lectina; una etiqueta de afinidad (por ejemplo, una columna GST o una columna de 6X-His); Estreptavidina; heparina; o anticuerpo (por ejemplo una columna de Proteína A o una columna de Proteína G). En particular, para unir la glucoproteína CTLA4-Ig la presente invención utiliza una resina de proteína A. Para un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 5 a 9, más eficaz un pH de aproximadamente 8, son útiles concentraciones de Tris de 25 mM y de NaCl de 250 mM. Para un tampón de elución con un pH de aproximadamente 2 a 5, más eficaz un pH de aproximadamente 3,5, es útil una concentración de glicina de 100 mM. El eluado de cromatografía de afinidad puede después neutralizarse y cargarse sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico, siendo más útil la columna Q-Sepharose Fast Flow.
En el procedimiento de purificación, para reducir adicionalmente los niveles de proteína A, ADN, y especies de glucoproteína CTLA4-Ig no deseadas en el producto, después de las etapas de recuperación/purificación inicial anteriores, puede incorporarse otra etapa de intercambio iónico. La presente invención puede emplear columnas de intercambio iónico a la venta en el mercado, tales como una columna de Q-Sepharose Fast Flow de GE Healthcare,
o una columna de DEAE Sepharose Fast Flow, también de GE Healthcare. Como se determina en el presente documento, las resinas más adecuadas para separar la glucoproteína CTLA4-Ig del medio de cultivo recogido son las que tienen grupos funcionales amina inmovilizados. Otros grupos útiles son las resinas con grupos funcionales de amina cuaternaria, por ejemplo, las de la columna de Q-Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en la que un ligando de amonio cuaternario está unido a agarosa reticulada de alta porosidad. También son útiles las resinas con grupos funcionales de amina primaria, secundaria y terciaria, por ejemplo, las de la columna de DEAE Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en la que un ligando de dietil aminoetil terciario está unido a agarosa reticulada de alta porosidad. En una realización particular de la invención, se utiliza una columna que utiliza un fuerte intercambiador aniónico, tal como una columna Q-Sepharose Fast Flow.
En una realización de la invención, un eluado de glucoproteína CTLA4-Ig se carga sobre una columna de intercambio aniónico, por ejemplo Q-Sepharose Fast Flow. La columna se lava y posteriormente la glucoproteína CTLA4-Ig se eluye de la columna de intercambio aniónico. Para un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 5 a 9, o un pH 8, en una realización, pueden ser útiles concentraciones de HEPES de 25 mM y de NaCl de 100-140 mM. Para un tampón de elución con un pH de aproximadamente 5 a 9, o en otra realización, un pH 8, pueden ser útiles concentraciones de HEPES de 25 mM y de NaCl de 200 mM. La glucoproteína CTLA4-Ig eluida del medio de intercambio aniónico se recupera, se concentra y se lava por diafiltración, u otro procedimiento adecuado conocido por un experto en la técnica, para proporcionar un producto de glucoproteína CTLA4-Ig purificado final. El producto de glucoproteína CTLA4-Ig, preparado de acuerdo con el proceso de la presente invención, es muy puro, conteniendo, por ejemplo, ∗ 95% de dímero de CTLA4-Ig, conteniendo # 5% de producto de APM de CTLA4-Ig, y conteniendo # 1% de monómero de CTLA4-Ig.
El procedimiento de purificación también puede comprender etapas adicionales que inactivan y/o eliminan virus y/o retrovirus que podrían estar posiblemente presentes en el medio de cultivo celular de líneas celulares de mamífero. Existen diversas etapas significativas de eliminación viral, que incluyen, pero sin limitación, tratamiento con caotropos, tales como urea o guanidina, detergentes, etapas adicionales de ultrafiltración/diafiltración, separación convencional, tal como cromatografía de intercambio aniónico o de exclusión por tamaño, pH extremos, calor, proteasas, disolventes orgánicos o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización de la presente invención, la cromatografía de afinidad, por ejemplo, con resina MabSelect Proteína A Sepharose (GE Healthcare), se emplea para capturar la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig, que posteriormente puede ir seguida de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico por ejemplo con Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). La etapa de cromatografía de afinidad también puede reducir niveles de impurezas de proteínas procedentes de células CHO y Proteína Quimiotáctica de Monocitos (MCP-1, una quimiocina). La cromatografía de afinidad implica separación adsortiva, en la que una molécula de interés a purificar, por ejemplo, la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig, se une específicamente y de manera reversible a un ligando inmovilizado en alguna matriz o resina. Como algunos ejemplos no limitantes de columnas de purificación por afinidad se incluyen lectina; etiqueta de afinidad (por ejemplo, una columna GST o una columna 6X-His); Estreptavidina; heparina; o anticuerpo (por ejemplo una columna de Proteína A o una columna de Proteína G). Particularmente, puede utilizarse una resina de proteína A para unirse a la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig. Para un tampón de lavado con pH de aproximadamente 5 a 9, más eficaz de aproximadamente 7,5, son útiles concentraciones de Tris de aproximadamente 25 mM, NaH2PO4 25 mM y NaCl 250 mM. Para un tampón de elución con un pH de aproximadamente 2 a 5, más eficaz a aproximadamente 3,5, es útil una concentración de glicina de 100-300 mM. El eluado de la cromatografía de afinidad puede después neutralizarse y cargarse sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico, siendo la más útil Q-Sepharose Fast Flow.
Para reducir adicionalmente los niveles de proteína A, ADN y especies de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig no deseadas en el producto después de las etapas de recuperación/purificación inicial anteriores, en el procedimiento de purificación puede incorporarse una etapa de intercambio iónico. La presente invención puede emplear columnas de intercambio iónico disponibles en el comercio, tales como la columna Q-Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, la columna de Q-Sepharose XL (GE Healthcare) o una columna de DEAE Sepharose Fast Flow, también de GE Healthcare. Las resinas más adecuadas para separar la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig son las que tienen grupos funcionales amina inmovilizados. Otros grupos útiles son las resinas con grupos funcionales de amina cuaternaria, por ejemplo las de la columna Q-Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en la que un ligando de amonio cuaternario está unido a agarosa reticulada de alta porosidad. También son útiles las resinas con grupos funcionales de amina primaria, secundaria y terciaria, por ejemplo las de la columna DEAE Sepharose Fast Flow de GE Healthcare, en la que un ligando de dietil aminoetil terciario está unido a agarosa reticulada de alta porosidad. En una realización particular de la invención, se utiliza una columna que utiliza un fuerte intercambiador aniónico, tal como una columna Q-Sepharose Fast Flow.
En una realización de la invención, un eluado de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig se carga en una columna de intercambio anionico, por ejempo, Q-Sepharose Fast Flow. La columna se lava y posteriormente la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig se eluye de la columna de intercambio anionico. Para un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 5 a 9, en una realización, con un pH 7, son útiles concentraciones de HEPES de 25-55 mM y de NaCl de 100-140 mM. Para un tampón de elución con un pH de aproximadamente 5 a 9, o en otra realización, con un pH 7, pueden ser útiles concentraciones de HEPES de 25-50 mM y de NaCl de 200 mM.
En otra realización de la presente invención el eluado que contiene la glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig se recoge del medio de intercambio aniónico y después se pone en contacto con una resina de interacción hidrófoba. La CIH puede ser útil para la separación de dímeros de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig deseados de material de alto peso molecular y de otras impurezas de proteína del cultivo de células de mamífero. Por ejemplo, el cultivo de células
CTLA4A29YL104E-Ig
CHO que expresan la contiene agregados de alto peso molecular de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig. En el medio de cultivo de células de mamífero también se encuentran impurezas de proteína de células CHO. Estos productos no deseables podrían generar una respuesta antigénica no deseada en un paciente y contribuir a una mala calidad o actividad del producto.
La CIH separa eficazmente variantes hidrófobas, dímeros de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig de complejos de APM de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig e impurezas de proteína de células CHO mediante la unión de los últimos productos a la resina de CIH y los dímeros de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig pasan a través de la columna. Por tanto, puede obtenerse un conjunto de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig que carezca sustancialmente de estas especies. Una fuente de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig para su uso con CIH es un cultivo de células de mamífero, por ejemplo, un cultivo de células CHO. En particular, el cultivo puede someterse a al menos una etapa de purificación anterior, como se ha indicado previamente.
En otra realización de la presente invención, el procedimiento de CIH puede modificarse para recoger un conjunto de glucoproteínas distinto (por ejemplo, complejos CTLA4A29YL104E-Ig de APM). Los agregados de APM pueden unirse a la resina de CIH (por ejemplo, que comprende tetrámero CTLA4A29YL104E-Ig y similar). Estos complejos de APM tienen una avidez más alta y se unen más eficazmente in vivo en comparación con el dímero CTLA4A29YL104E-Ig en solitario. Por tanto, un experto en la técnica puede obtener un conjunto de agregados de CTLA4A29YL104E-Ig de APM eluyendo el conjunto de CTLA4A29YL104E-Ig fuera la CIH.
La glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig eluida del medio de CIH se recupera, se concentra y se lava, por diafiltración, u otro procedimiento adecuado conocido por un experto en la técnica, para proporcionar un producto de glucoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig purificado final. El producto de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig preparado de acuerdo con el proceso descrito en el presente documento es muy puro, conteniendo, por ejemplo, ∗ 95% del dímero CTLA4A29YL104E-Ig, conteniendo # 5% del producto APM de CTLA4A29YL104E-Ig y conteniendo el 1% de monómero
CTLA4A29YL104E-Ig.
Las resinas de CIH más útiles para separar formas de glucoproteína CTLA4A29YL104E-Ig son las que tienen grupos funcionales fenilo inmovilizados. De las resinas de CIH con grupos fenilo, la más útil es la Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub (alta sustitución) de GE Healthcare. Los medios Phenyl Toyopearl de TosoHaas y TSK Phenyl 5PW son ejemplos no limitantes de otras resinas de CIH con grupos fenilo que pueden usarse. Otros grupos funcionales de CIH incluyen, pero sin limitación, los restos propilo, octilo, alcoxi, butilo e isoamilo.
El procedimiento de purificación también puede comprender etapas adicionales que inactivan y/o eliminan virus y/o retrovirus que podrían estar posiblemente presentes en el medio de cultivo celular de líneas de células de mamífero. Se dispone de diversas etapas significativas de eliminación viral, incluyendo pero sin limitación, tratamiento con caotropos tales como urea o guanidina, detergentes, etapas de ultrafiltración/diafiltración adicionales, separación convencional, tal como cromatografía de intercambio aniónico o exclusión por tamaño, pH extremo, calor, proteasas, disolventes orgánicos o cualquiera combinación de estos.
En un aspecto, las moléculas de CTLA4-Ig purificadas que se han concentrado y sometido a etapas de diafiltración pueden cargarse en frascos Biotainer® de 2 l, en bolsas de bioprocesamiento de 50 l o en cualquier otro recipiente adecuado. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden conservarse en dichos recipientes durante aproximadamente 60 días a una temperatura de 2 º a 8 ºC antes de congelarse. La expansión de la conservación de CTLA4-Ig purificada a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC puede conducir a aumentar la proporción de tetrámero de CLTA4-Ig. Por lo tanto, para la conservación a largo plazo, las moléculas de CTLA4-Ig pueden congelarse aproximadamente -70 ºC antes de almacenarse y conservarse a una temperatura de aproximadamente -40 ºC. La temperatura de congelación puede variar de aproximadamente -50 ºC a aproximadamente -90 ºC. El tiempo de congelación puede variar y depende en gran medida del volumen del recipiente que contiene las moléculas de CTLA4-Ig y de la cantidad de recipientes cargados en el congelador. Por ejemplo, en una realización, las moléculas de CTLA4-Ig están en frascos Biotainer® de 2 l. La carga de menos de cuatro frascos Biotainer® de 2 l en el congelador puede requerir de aproximadamente 14 a al menos 18 horas de tiempo de congelación. La carga de al menos cuatro frascos puede requerir de aproximadamente 18 a al menos 24 horas de tiempo de congelación. Los recipientes con las moléculas de CTLA4-Ig congeladas se conservan a una temperatura de aproximadamente -35 ºC a aproximadamente -55 ºC.
El tiempo de conservación a una temperatura de aproximadamente -35 ºC a aproximadamente -55 ºC puede variar y puede ser tan corto como 18 horas. Las moléculas de CTLA4-Ig congeladas pueden descongelarse de una manera controlada. La descongelación de las moléculas de CTLA4-Ig congeladas es controlada y puede realizarse en una incubadora a una temperatura de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 24 ºC. La duración de las etapas de descongelación depende de la carga de la incubadora en la que la carga de menos de cuatro frascos Biotainer® de 2 l puede requerir menos de aproximadamente 24 horas de tiempo de descongelación. La carga de cuatro frascos Biotainer® de 2 l puede requerir aproximadamente 18 horas. La solución descongelada que comprende las moléculas de CTLA4-Ig puede mezclarse para impedir posibles gradientes de concentración. Por lo tanto, la descongelación puede realizarse en una incubadora a temperatura controlada, que también permite agitar los recipientes que contienen la CTLA4-Ig. La velocidad de agitación puede ser de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 rpm. Las moléculas de CTLA4-Ig descongeladas pueden mezclarse adicionalmente durante 510 minutos más a una tasa rotacional de aproximadamente 3 rpm. Las moléculas de CTLA4-Ig descongeladas pueden conservarse de 2 ºC a 8 ºC, dividirse en alícuotas y liofilizarse durante la producción de las composiciones farmacéuticas que comprenden CTLA4-Ig.
Formulaciones y kits
Cualquiera de las moléculas de CTLA4-Ig descritas puede proporcionarse como una mezcla liofilizada. Las formulaciones para liofilizar que comprenden CTLA4-Ig pueden comprender adicionalmente tres componentes básicos: (1) un principio (o principios) activo adicional que incluye otras proteínas recombinantes o moléculas pequeñas (tales como inmunosupresores), (2) un excipiente (o excipientes) y (3) un disolvente (o disolventes). Los excipientes incluyen reactivos farmacéuticamente aceptables para proporcionar buenas propiedades de torta liofilizada (agentes formadores de volumen) así como para proporcionar lioprotección y/o crioprotección de proteínas (“estabilizante”), mantenimiento de pH (agentes tamponantes), y conformación adecuada de la proteína durante el almacenamiento para mantener esta retención sustancial de actividad biológica (incluyendo la estabilidad de los principios activos, tal como estabilidad de la proteína). Con respecto a los excipientes, un ejemplo de una formulación puede incluir uno o más agentes tamponantes, uno o más agentes formadores de volumen, uno o más estabilizantes de proteína y uno o más compuestos antimicrobianos. Los azúcares o polioles pueden usarse como estabilizantes de proteína no específicos en solución y durante la congelación-descongelación y liofilización. Los polímeros pueden usarse para estabilizar proteínas en solución y durante la congelación-descongelación y liofilización. Un polímero conocido es la albúmina de suero, que se ha usado como crioprotector y como lioprotector. Las formulaciones pueden no tener albúmina. Diversas sales pueden usarse como agentes formadores de volumen. Como agentes salinos formadores de volumen ilustrativos, se incluyen, por ejemplo, NaCl, MgCl2 y CaCl2. Algunos aminoácidos pueden usarse como crioprotectores y/o lioprotectores y/o agentes formadores de volumen. Aminoácidos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, glicina, prolina, 4-hidroxiprolina, L-serina, glutamato sódico, alanina, arginina y clorhidrato de lisina. Muchos agentes tampón que cubren un amplio intervalo de pH se encuentran disponibles para la selección en formulaciones. Los agentes tamponantes incluyen, por ejemplo, acetato, citrato, glicina, histidina, fosfato (sódico o potásico), dietanolamina y Tris. Los agentes tampón incluyen aquellos agentes que mantienen el pH de la solución en un intervalo aceptable antes de la liofilización. Las formulaciones se han descrito anteriormente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/752,150, presentada el 20 de diciembre del 2005.
La mezcla de CTLA4-Ig liofilizada puede comprender al menos el 90%, 95%, 99% o 99,5% de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla de CTLA4-Ig liofilizada puede comprender al menos 90%, 95%, 99% o 99,5% de dímero de CTLA4-Ig y no más del 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla de CTLA4-Ig liofilizada puede comprender al menos 90%, 95%, 99% o 99,5% de dímero de CTLA4-Ig, y no más de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de tetrámero de CTLA4-Ig, y no más del 2%, 1,5%, 1,0%, 0,8%, 0,5% o 0,3% de monómero de CTLA4-Ig. La mezcla de CTLA4-Ig liofilizada puede comprender al menos 8,0 moles de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig o con respecto a la molécula de CTLA4-Ig. La mezcla de CTLA4-Ig liofilizada puede comprender: de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 moles de GlcNac por mol de moléculas o dímero de CTLA4-Ig; de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 moles de GalNac por mol de dímero de CTLA4-Ig o con respecto a la molécula de CTLA4-Ig; de aproximadamente 5 moles a aproximadamente 20 moles de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o con respecto a la molécula de CTLA4-Ig; de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 moles de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o con respecto a la molécula de CTLA4-Ig; y/o de aproximadamente 5-15 moles de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig o con respecto a la molécula de CTLA4-Ig.
La sustancia farmacológica CTLA4A29YL104E-Ig se encuentra disponible como una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 25 mg/ml (22,5-27,5 mg/ml) en tampón fosfato sódico 25 mM y cloruro sódico 10 mM a pH , 7,5. La CTLA4A29YL104E-Ig tiene tendencia a formar especies de alto peso molecular en solución acuosa. Por lo tanto, se desarrolló un producto liofilizado para minimizar los niveles de especies de alto peso molecular que pudiesen formarse en el producto farmacológico. Se exploraron diversos excipientes, tales como, maltosa, sacarosa y aminoácidos, tales como, clorhidrato de L-arginina, como posibles lioprotectores durante la liofilización de la CTLA4A29YL104E-Ig. Se descubrió que la sacarosa era el lioprotector más eficaz. Se observó adicionalmente que aumentando la proporción de sacarosa con respecto a proteína se mejoraba la estabilidad de la proteína. Se seleccionó una proporción de sacarosa: proteína de 2:1 (peso:peso) para la solución de proteína a liofilizar. El producto farmacológico liofilizado tiene una estabilidad adecuada y un comportamiento de constitución satisfactorio.
Procedimientos de tratamiento
Puede tratarse una enfermedad mediada por interacciones de linfocitos T con linfocitos B7 positivos recibiendo una formulación farmacéuticamente aceptable de CTLA4-Ig o CTLA4A19YL104E-Ig. Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig segregadas por una línea celular de mamífero modificada por ingeniería genética (por ejemplo, una línea celular de Ovario de Hámster Chino dhfr-negativa que lleva ADN que codifica la CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig) puede ser una población de moléculas que tiene un perfil de glucosilación particular. Como se indica en el presente documento, un perfil de glucosilación particular puede afectar a la unión de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig con CD80 y/o CD86 de tal manera que las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig pueden proporcionar una mayor inhibición sobre la activación y/o proliferación de linfocitos T. Como se ha indicado en el presente documento, un perfil de glucosilación particular puede estar afectado por la línea celular y el procedimiento de producción. Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig producidas por una línea celular en un procedimiento de producción descrito en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con linfocitos T, que incluyen, pero sin limitación, generalmente cualquier trastorno o enfermedad linfoproliferativa dependiente de linfocitos T o cualquier trastorno o enfermedad autoinmunitaria dependiente de linfocitos T, y más específicamente: linfoma de linfocitos T, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, linfoma de linfocitos T angiocéntrico testicular, angeitis linfocitaria benigna, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), trastornos inmunitarios asociados con rechazo de transplante de injerto, psoriasis, inflamación, alergia, ooforitis, enfermedad intestinal inflamatoria, glomerulonefritis, encefalomielitis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso, mixedema primario, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, artritis reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente, síndrome de good pasture, miastenia grave, pénfigo, esclerosis múltiple, oftalmia simpática, uveitis auotinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, esclerodermia, polimiositis y enfermedad mixta del tejido conectivo.
Cualquiera de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig desveladas pueden usarse en los procedimientos para inhibir la proliferación o activación de linfocitos T, inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto o in vitro y para el tratamiento de un trastorno inmunitario en un sujeto o inducir tolerancia inmunitaria contra un antígeno en un sujeto. La tolerancia inmunitaria es un tipo de respuesta inmunológica en el que se desarrolla una reactividad no específica de los tejidos linfoides contra un antígeno específico, en el que en ausencia de tolerancia, el antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria. Las moléculas y composiciones de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig descritas en la presente memoria pueden usarse para tratar a un sujeto que ha recibido un trasplante para inducir tolerancia y reducir la posibilidad de rechazo. El trasplante puede ser un trasplante de órgano, un trasplante de tejido o un trasplante de célula. El trasplante de célula comprende células de médula ósea o células de los islotes.
Puede usarse cualquiera de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig desveladas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o trastornos indicados anteriormente. Puede usarse cualquiera de las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig desveladas en una coadministración con otro agente para el tratamiento de las enfermedades o trastornos anteriormente mencionados. Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea y/o por inhalación. Las formulaciones de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig aplicables por administración intravenosa o subcutánea se describen en el documento de Estados Unidos Nº de serie 60/752.150, presentado el 20 de diciembre del 2005. Las formulaciones de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig también pueden incluir formulaciones basadas en liposomas en las que los liposomas pueden administrar las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig a células o tejidos diana. Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig también pueden administrarse a células o a tejidos diana administrando un vector viral que comprenda un casete de expresión del gen de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig. La administración y dosificaciones de una población de moléculas de CTLA4
CTLA4A29YL104E-Ig se
Ig o describen en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos publicadas como US20030083246 y US20040022787, así como en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite con número de serie 60/668.774, presentada el 6 de abril del 2005.
Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig descritas en el presente documento pueden estar en una diversidad de formas de dosificación que incluyen, pero sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infusibles. La forma depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. Un modo de administración y un régimen de dosificación eficaz para las moléculas descritas en el presente documento dependen de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, de la salud del sujeto y de la respuesta al tratamiento y de la evaluación del médico tratante. Por consiguiente, las dosificaciones de las moléculas deben ajustarse al sujeto individual. La interrelación de dosificaciones para animales de diversos tamaños y especies y seres humanos basada en mg/m2 del área de superficie la describen Freireich, E. J., y col. (Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother, Rep., 50, Nº 4, 219-244, Mayo 1966). Pueden realizarse ajustes en el régimen de dosificación para optimizar la respuesta de inhibición del crecimiento.
Las dosis pueden dividirse y administrarse diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente dependiendo de la situación. Por ejemplo, pueden administrarse diversas dosis divididas diariamente o mensualmente o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indique la situación terapéutica específica. La administración puede realizarse mensualmente, cuatrimestralmente, diariamente, dos veces al día, aproximadamente cada 10 horas, aproximadamente cada 6 horas, aproximadamente cada 4 horas, aproximadamente cada 2 horas, aproximadamente una vez cada hora. Una cantidad eficaz para el tratamiento de un sujeto puede ser entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto. Además, la cantidad eficaz puede ser una cantidad entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto. Las moléculas de CTLA4-Ig o CTLA4A29YL104E-Ig descritas en el presente documento también pueden tener aplicación clínica in vivo. Pueden usarse para la enumeración de linfocitos B7 positivos en el diagnóstico o pronóstico de algunas afecciones de inmunodeficiencia, para la fenotipificación de leucemias y linfomas, y para controlar cambios inmunológicos después de un transplante de órgano.
La administración de las composiciones descritas en el presente documento puede realizarse por inyección, administración oral, inhalación de un pulverizador u otra dispersión particular, inyección subcutánea, administración intravenosa, administración tópica, supositorios, administración ocular, administración nasal u oral. La composición puede administrarse mediante encapsulación en un liposoma u otro vehículo de administración similar a una membrana. La composición puede administrarse a través de la sangre u otros fluidos corporales que previamente se tratan con la composición y posteriormente se transfunden al sujeto.
Lista de secuencias
La SEC ID Nº: 17 es la secuencia de nucleótidos que codifica la pcSDhuCTLA4Ig:
La SEC ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos el dominio extracelular de la CTLA4 humana.
En el presente documento se describe una población de células clonales de Ovario de Hámster Chino capaz de producir la CTLA4-Ig. La población de células puede ser una población capaz de producir más de 0,5 o más gramos de proteína CTLA4-Ig por litro del cultivo líquido, y la CTLA4-Ig puede presentar una proporción molar de ácido siálico con respecto a dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 a una escala de cultivo de
1.000 l o más. La población de células puede ser una población que se ha adaptado a medio asérico, químicamente definido. La CTLA4-Ig producida a partir del cultivo de la población de células puede tener un coeficiente de extinción de 1,00! 0,05 UA ml cm-1 mg-1. La población de células puede ser una población que, cuando crece en cultivo, es capaz de producir polipéptidos de CTLA4-Ig, en la que: (a) aproximadamente el 90% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 comenzando con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 comenzando con la alanina en el resto número 26; (c) aproximadamente el 4% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 finalizando con la lisina en el resto número 383; (d) aproximadamente el 96% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 finalizando con la glicina en el resto número 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 comenzando con la metionina en el resto número 25.
En el presente documento se describe una progenie celular de las células descritas anteriormente, en la que la progenie celular produce CTLA4-Ig. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 5 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 10 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 20 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 40 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 50 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 75 generaciones. La progenie celular puede obtenerse a partir del cultivo de una célula durante al menos 100 generaciones.
Una línea celular puede producirse a partir de cualquiera de las células descritas anteriormente. La línea celular puede ser clonal. La línea celular puede ser una línea capaz de producir: una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2); (b) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); (c) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2); (d) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); (e) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 (metionina en la posición de aminoácido 25 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); o (f) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 (metionina en la posición de aminoácido 25 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2).
La línea celular puede ser una línea capaz de producir proteínas de fusión de CTLA4-Ig, en la que: (a) aproximadamente el 90% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 comenzando con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 que comenzando con la alanina en el resto número 26;
(c) aproximadamente el 4% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 finalizando con la lisina en el resto número 383; (d) aproximadamente el 96% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 finalizando con la glicina en el resto número 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 comenzando con la metionina en el resto número 25.
Las proteínas de fusión CTLA4-Ig, producidas a partir del cultivo de la línea celular, pueden tener un coeficiente de extinción de 1,00 ! 0,05 UA ml cm-1 mg-1. Una población de células puede derivar de una célula descrita en el presente documento. La población de células puede constar de al menos un cambio genético adicional en comparación con la célula originalmente transfectada y la población de células derivada puede ser una población capaz de producir CTLA4-Ig. La población de células puede constar de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 cambios genéticos adicionales en comparación con la célula originalmente transfectada y la población de células derivada puede ser una población capaz de producir CTLA4-Ig. El cambio genético puede comprender al menos una mutación no conservativa en el genoma celular o en el casete de expresión recombinante que codifica la CTLA4-Ig.
El cambio genético puede comprender al menos un ácido nucleico recombinante adicional dentro de la célula. El cambio puede comprender una mutación del genoma celular. El cambio puede comprender la adición de un ácido nucleico en el genoma celular o como un ácido nucleico en trans, que codifique un polipéptido anti-apoptótico. El polipéptido anti-apoptótico puede estar relacionado con glucosilación.
El cambio genético puede comprende al menos una mutación del genoma celular o del casete de expresión recombinante que codifica la CTLA4-Ig. La población de células puede ser una población que, cuando crece en cultivo, es capaz de producir: (a) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (metionina en la posición de aminoácido 27 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2); (b) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 (metionina en la posición de aminoácido 27 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); (c) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 (alanina en la posición de aminoácido 26 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2); (d) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 (alanina en la posición de aminoácido 26 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); (e) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 (metionina en la posición de aminoácido 25 y lisina en la posición de aminoácido 383 de la SEC ID Nº: 2); o (f) una proteína de fusión CTLA4-Ig que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 (metionina en la posición de aminoácido 25 y glicina en la posición de aminoácido 382 de la SEC ID Nº: 2).
Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 11 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 12 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 13 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 14 a aproximadamente 18. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 17. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto al dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 16.
En una población de moléculas de CTLA4-Ig más del 95% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. En particular, más del 98% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. En particular, más del 99% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. En particular, más del 99,5% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig. En particular, de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99,5% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig y aproximadamente del 0,5% a aproximadamente el 5% de las moléculas pueden ser tetrámeros de CTLA4-Ig. En particular, aproximadamente el 98,6% de las moléculas pueden ser dímeros de CTLA4-Ig y aproximadamente el 1,2% de las moléculas pueden ser tetrámeros de CTLA4-Ig y aproximadamente menos del 0,7% de las moléculas pueden monómeros de CTLA4-Ig. En el presente documento se describe una población que consiste en dímeros de CTLA4-Ig. La población de moléculas de CTLA4-Ig puede carecer sustancialmente de monómeros de CTLA4-Ig. La población de moléculas de CTLA4-Ig puede carecer sustancialmente de tetrámeros de CTLA4-Ig. La población de moléculas de monómero de CTLA4-Ig puede carecer sustancialmente de dímeros y tetrámeros de CTLA4-Ig. En la población, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig puede tener al menos 3 grupos de ácido siálico.
En la población, cada monómero de cada dímero de CTLA4-Ig puede tener de al menos 3 grupos de ácido siálico a al menos 8 grupos de ácido siálico. En el presente documento se describe una población purificada de moléculas de tetrámero de CTLA4-Ig, careciendo la población sustancialmente de dímero de CTLA4-Ig, en la que opcionalmente la población comprende una cantidad mayor de aproximadamente 100 gramos. En el presente documento se describe una población purificada de moléculas de tetrámero de CTLA4-Ig, careciendo la población sustancialmente de monómero de CTLA4-Ig, en la que opcionalmente la población comprende una cantidad mayor de aproximadamente 100 gramos. En la población, cada molécula tetramérica puede comprender dos pares de polipéptidos CTLA4-Ig, en la que cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 3-8, y en la que cada miembro del par de polipéptidos está unido covalentemente al otro miembro y en la que los dos pares de polipéptidos están asociados entre sí de manera no covalente. En la población, cada molécula tetramérica puede ser capaz de unirse a CD80 o a CD86. En la población, cada molécula tetramérica puede tener al menos una avidez 2 veces mayor por CD80 o CD86 en comparación con una molécula dimérica de CTLA4-Ig. En la población, cada molécula tetramérica puede tener al menos una inhibición 2 veces mayor de proliferación o activación de linfocitos T en comparación con la molécula dimérica de CTLA4-Ig.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede comprender isoformas dominantes que pueden visualizarse en un gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig que tiene un punto isoeléctrico, pl, menor que o igual a 5,1 determinado por isoelectroenfoque. En una realización, el pl aumenta después del tratamiento con neuraminidasa. En una realización, al menos el 40% de las moléculas de CTLA4-Ig presentan un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 5,1 determinado por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 70% de las moléculas de CTLA4-Ig presentan un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 5,1 determinado por isoelectroenfoque. En una realización, al menos el 90% de las moléculas de CTLA4-Ig presentan un punto isoeléctrico menor que o igual a aproximadamente 2,5 determinado por isoelectroenfoque. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener un pl de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener un pl de aproximadamente 4,3 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2. Las moléculas de CTLA4-Ig de la población pueden tener un pl de aproximadamente 3,3 ! 0,2 a aproximadamente 4,7 ! 0,2. Puede prepararse una composición que comprenda una molécula de CTLA4-Ig con un pl de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2 mediante un procedimiento que comprenda: (a) someter una mezcla de moléculas de CTLA4-Ig a electroforesis en gel de isoelectroenfoque, en la que una sola banda en el gel representa una población de moléculas de CTLA4-Ig con un pl particular, y (b) aislar la población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga un pl de aproximadamente 2,0 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2 para preparar la composición. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 17 a aproximadamente 25. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden caracterizarse por una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Las moléculas de CTLA4-Ig comprendidas por una composición pueden caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; y (b) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente
12. Las moléculas de CTLA4-Ig comprendidas por una composición pueden caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; y (c) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Las moléculas de CTLA4-Ig comprendidas por una composición puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; y (d) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Las moléculas de CTLA4-Ig comprendidas por una composición pueden caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; y (e) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12. Las moléculas de CTLA4-Ig comprendidas por una composición pueden caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22; y (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12.
Una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig puede presentar un pico de cromatograma NGNA de aproximadamente 9,589+/-0,3 y un pico de cromatograma NANA de aproximadamente 10,543+/-0,3. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden presentar un perfil carbohidrato como se muestra en la Figura 7. En una composición que comprende moléculas de CTLA4-Ig las moléculas de CTLA4-Ig pueden presentar un perfil carbohidrato de los Dominios I-IV, en el que el Dominio I comprende picos que representan oligosacáridos a-sialilados, el Dominio II comprende picos que representan oligosacáridos mono-sialilados, el Domino III comprende picos que representan oligosacáridos di-sialilados y el Dominio IV comprenda picos que representen oligosacáridos tri-sialilados. La diferencia en cuanto a los tiempos de retención de los oligosacáridos ligados a N entre un primer pico en el Dominio I y un pico principal en el Dominio II puede ser de aproximadamente 22 a aproximadamente 28 minutos. En una composición que comprende moléculas diméricas de CTLA4-Ig al menos el 0,5% de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig puede estar cisteinilado. Como alternativa, al menos el 1,0% de las moléculas diméricas de CTLA4-Ig puede estar cisteinilado. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede presentar un perfil de espectrometría de masas como se muestra en las Figuras 8 y
10. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede presentar un perfil de electroforesis capilar como se muestra en las Figuras 20 y 21. Las moléculas de CTLA4-Ig de una composición pueden tener una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto a dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18, en el que el dímero de CTLA4-Ig se produce a partir de células de una línea celular comercial. La invención proporciona una composición de CTLA4-Ig obtenida mediante cualquier procedimiento de la invención. En una población de moléculas de CTLA4-Ig, las moléculas pueden estar glucosiladas en un resto de aminoácido asparagina en la posición 102 de la SEC ID Nº: 2, en un resto de aminoácido asparagina en la posición 134 de la SEC ID Nº: 2, en un resto de aminoácido asparagina en la posición 233 de la SEC ID Nº: 2, en un resto de aminoácido serina en la posición 155 de la SEC ID Nº: 2 o en un resto de aminoácido serina en la posición 165 de la SEC ID Nº: 2. Una población de moléculas de CTLA4-Ig puede caracterizarse por: (a) una proporción molar media de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; (b) una proporción molar media de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; (c) una proporción molar media de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 8 a aproximadamente 17; (d) una proporción molar media de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; (e) una proporción molar media de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 22; (f) una proporción molar media de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 12; (g) un pl, determinado a partir de visualización de un gel de isoelectroenfoque, en un intervalo de aproximadamente 2,4 ! 0,2 a aproximadamente 5,0 ! 0,2; (h) una cantidad de MCP-1 menor que o igual a 5 ppm;
(i) menor que 2,5% de tetrámero; (j) menor que 0,5% de monómero; (k) los polipéptidos de CTLA4-Ig de la población tienen una identidad de aminoácidos de al menos 95% con cualquiera de las SEC ID Nos: 2-8; (1) en el que las moléculas de CTLA4-Ig dentro de la población pueden unirse a CD80 y a CD86; o a equivalentes farmacéuticos de los mismos. En el presente documento se describe una composición que comprende una cantidad eficaz de las moléculas de CTLA4-Ig y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el presente documento se describe una composición que comprende una cantidad eficaz de las moléculas de CTLA4-Ig, en el que la composición comprende adicionalmente una cantidad de monohidrato de maltosa. La composición puede comprender adicionalmente, un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender adicionalmente maltosa, fosfato de sodio monobásico monohidratado, cloruro de sodio, hidróxido de sodio y agua estéril. La composición puede comprender adicionalmente sacarosa, poloxámero, fosfato de sodio monobásico monohidratado, fosfato de sodio dibásico anhidro, cloruro de sodio, hidróxido de sodio y agua estéril.
En el presente documento se describe una mezcla de CTLA4-Ig liofilizada que comprende al menos el 95% del dímero de CTLA4-Ig y no más del 5% del tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender al menos el 98% del dímero de CTLA4-Ig y no más del 2% del tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender al menos el 99% del dímero de CTLA4-Ig y no más del 1% del tetrámero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender al menos 8,0 moles de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 15,7 a aproximadamente 31 moles de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 1,6 a aproximadamente 3,2 de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 9,3 a aproximadamente 15,5 moles de galactosa por mol de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 3,6 a aproximadamente 7,9 moles de fucosa por mol de dímero de CTLA4-Ig. La mezcla puede comprender de aproximadamente 9,7 moles de manosa por mol de dímero de CTLA4-Ig. En el presente documento se describe un kit farmacéutico que comprende: (a) un envase que contiene la mezcla de CTLA4-Ig liofilizada; y (b) instrucciones para reconstituir la mezcla de CTLA4-Ig liofilizada en solución para inyección.
Para inhibir la proliferación (o activación) de linfocitos T, puede usarse un procedimiento que comprenda poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de la composición de CTLA4-Ig. Para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto, puede usarse un procedimiento que comprenda administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición. En el presente documento se proporcionan procedimientos para inducir en un sujeto tolerancia inmunológica contra un antígeno, tratando en un sujeto la inflamación, la artritis reumatoide, la psoriasis, el lupus, tratando o previniendo en un sujeto una alergia, la enfermedad de injerto contra huésped, el rechazo de un órgano trasplantado; tratando en un sujeto la esclerosis múltiple, la diabetes de tipo I, la enfermedad intestinal inflamatoria, la ooforitis, la glomerulonefritis, la encefalomielitis alérgica o la miastenia grave, administrando a un sujeto una composición de la invención en una cantidad para tratar la enfermedad o trastorno. La composición puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno inmunitario puede usarse una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto a dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18. En la fabricación de un agente antireumatoide para la artritis puede usarse una población de moléculas de CTLA4-Ig que tenga una proporción molar media de grupos de ácido siálico con respecto a dímero de CTLA4-Ig de aproximadamente 6 a aproximadamente 18, en un envase junto con instrucciones para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide. Para inhibir la proliferación (o activación) de linfocitos T puede usarse un procedimiento que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de la composición descrita en el presente documento en combinación con metotrexato. Para inhibir una respuesta inmunitaria en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición descrita en el presente documento en combinación con metotrexato. Para inducir tolerancia inmunitaria contra un antígeno en un sujeto puede usarse un procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición descrita en el presente documento en combinación con metotrexato. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante, en el que la expansión se realiza a partir de un cultivo sembrado a un cultivo líquido de al menos 10.000 en el que la concentración de la proteína recombinante es de al menos de 0,5 gramos/l de cultivo líquido: y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos 10.000 l. La etapa de expansión (a) puede comprender: (i) cultivar las células en un medio asérico químicamente definido con al menos cuatro pases para obtener una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 105 células viables por ml, en el que cada fase de siembra comienza a aproximadamente 2 x 105 células por ml y va hasta 1-2 mil células por ml; (ii) conservar las células en cultivo durante un tiempo suficiente para producir, a partir del cultivo, al menos aproximadamente 0,5 g/l. La proteína es una glucoproteína. La proteína es una proteína CTLA4-Ig. Las células de mamífero pueden ser células progenitoras. Las células de mamífero pueden ser progenitoras de una línea celular clonal CHO capaz de producir la proteína de fusión CTLA4-Ig en la que las células CHO tienen integrado establemente en su genoma al menos 30 copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig. El tiempo suficiente puede ser un tiempo mediante el cual la viabilidad de las células no está por debajo del 30%. El tiempo suficiente puede ser un tiempo en el que la viabilidad de las células no está por debajo del 40%. El tiempo suficiente puede ser un tiempo mediante el cual la viabilidad de las células no se encuentra por debajo del 50%. El tiempo suficiente puede ser un tiempo mediante el cual la viabilidad de las células no se encuentra por debajo del 60%. El tiempo suficiente puede ser un tiempo mediante el cual la viabilidad de las células no se encuentra por debajo del 70%, u 80%, o 90% o 95%. Los al menos cuatro pases pueden comprender: (i) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 50 ml hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml, (ii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 10 l hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; (iii) cultivar las células en un volumen de cultivo de al menos 100 l hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml; y (iv) cultivar las células en un volumen de cultivo de 200 l hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 2,5 millones de células por ml. Al medio asérico, químicamente definido, puede añadirse galactosa. El mantenimiento puede comprender (i) reducir la temperatura del cultivo de 37!2 ºC a34!2 ºC; y (ii) disminuir la temperatura del cultivo de 34!2 ºC a 32!2 ºC. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 5 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 6 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 7 días.
La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 8 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 9 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 10 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 11 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 12 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 13 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 14 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 15 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 16 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 17 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo de 32!2 ºC durante al menos 18 días. La temperatura puede mantenerse en el intervalo
de 32!2 ºC durante hasta 18 días. La temperatura puede mantenerse dentro del intervalo de 32 ! 2 ºC hasta que la densidad celular del cultivo sea de aproximadamente 30 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml de cultivo líquido. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l, de tal manera que la concentración de la proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos 10.000 l , en el que el aislamiento solo se produce cuando el cultivo líquido contiene una cantidad mayor que, o igual a, aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de proteína. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l, de tal manera que la concentración de proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento solo se produce cuando el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 células por ml.
Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos
10.000 l de tal manera que la concentración de la proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y
(b)
aislar la proteína recombinante de al menos el cultivo líquido de 10.000 l, en el que el aislamiento se produce cuando la viabilidad celular del cultivo líquido no ha caído por debajo de aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, o aproximadamente 38%. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un método que comprende:
(a)
expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de tal manera que la concentración de la proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante de al menos el cultivo líquido de 10.000 l, en el que el aislamiento solo se produce cuando la endotoxina es menor que o igual a aproximadamente 76,8 EU por ml de cultivo líquido. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen una proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de tal manera que la concentración de proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante de al menos el cultivo líquido de 10.000 l, en el que el aislamiento solo se produce cuando la carga biológica es menor que 1 unidad formadora de colonias por ml de cultivo líquido. Para producir una proteína recombinante, puede usarse un procedimiento que comprende: (a) expandir células de mamífero que segreguen la proteína recombinante de un cultivo de siembra a un cultivo líquido de al menos 10.000 l de tal manera que la concentración de la proteína recombinante sea al menos de 0,5 g/l de cultivo líquido; y (b) aislar la proteína recombinante del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que el aislamiento solo se produce si se cumplen al menos dos de las siguientes condiciones: (i) el cultivo líquido contiene una cantidad mayor que, o igual a, aproximadamente 6,0 moles de NANA por mol de proteína, (ii) el cultivo líquido tiene una densidad celular de aproximadamente 33 x 105 a aproximadamente 79 x 105 célula por ml, (iii) la viabilidad celular en el cultivo líquido no ha caído por debajo de aproximadamente 20%, o aproximadamente 38%, o (iv) la cantidad de CTLA4-Ig en el cultivo es mayor que 0,5 g/l. El aislamiento puede comprender: (i) obtener un sobrenadante del cultivo celular; (ii) someter el sobrenadante a cromatografía de intercambio aniónico para obtener un producto de proteína eluido; (iii) someter el producto de proteína eluido de la etapa (ii) a cromatografía de interacción hidrófoba de tal manera que se obtiene un producto de proteína enriquecido; (iv) someter el producto de proteína enriquecido a cromatografía por afinidad para obtener un producto de proteína eluido y enriquecido; y (v) someter el producto de proteína eluido y enriquecido de (iv) a cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, el producto de proteína enriquecido obtenido en la etapa (iii) se caracteriza porque un porcentaje de cualquier multímero de alto peso molecular es menor del 25% en peso. En una realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa
(ii)
se realiza usando un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente a 75 mM, y NaCl aproximadamente a 360 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En una realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) se realiza usando un tampón de elución que comprende HEPES aproximadamente a 25 mM y NaCl aproximadamente a 325 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. En una realización, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) se realiza usando un solo tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente a 25 mM y NaCl aproximadamente a 850, y que tiene un pH de aproximadamente 7,0. En una realización, la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) se realiza usando un tampón de lavado que comprende Tris, a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a aproximadamente 250 mM y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En una realización, la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) se realiza usando un tampón de elución que comprende Glicina a una concentración de aproximadamente 100 mM y que tiene un pH de aproximadamente 3,5. En una realización, la cromatografía de intercambio iónico de la etapa (v) se realiza usando un tampón de lavado que comprende HEPES a una concentración de aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 120 mM a 130 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 8,0. En una realización, la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (ii) se realiza usando una columna que tiene una resina de intercambio aniónico que tiene un grupo funcional amina primario, secundario, terciario o cuaternario. En una realización, la resina tiene un grupo funcional amina cuaternario. En una realización, la cromatografía de interacción hidrófoba de la etapa (iii) se realiza usando una resina de interacción hidrófoba que tiene un grupo funcional fenilo, octilo, propilo, alcoxi, butilo o isoamilo. En una realización, el grupo funcional es un grupo funcional fenilo. En una realización, la cromatografía de afinidad de la etapa (iv) se realiza usando una columna que contiene Proteína A. En una realización, el procedimiento para preparar CTLA4-Ig comprende purificar la CTLA4-Ig de un cultivo celular líquido de tal manera que la CTLA4-Ig (a) tenga aproximadamente 38 ng de MCP-1 por mg de dímero
de CTLA4-Ig y (b) comprenda menos del 2,5% de tetrámero de CTLA4-Ig en peso.
En una realización, el cultivo celular líquido puede comprender una célula o una célula progenitora descrita en el presente documento. La CTLA4-Ig puede producirse mediante un procedimiento que comprende: (a) expandir células progenitoras de cualquier la línea celular comercial o células CHO que puedan ser capaces de producir 5 CTLA4-Ig, en el que la expansión es de un cultivo sembrado a un cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que la concentración de CTLA4-Ig es de al menos 0,5 gramos/l de cultivo líquido y (b) aislar la CTLA4-Ig del cultivo líquido de al menos 10.000 l, en el que la cromatografía es sobre una columna con una resina de interacción hidrófoba con al menos un grupo funcional fenilo, en el que el aislamiento comprende una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba realizada usando un solo tampón de lavado que comprende HEPES a una concentración de
10 aproximadamente 25 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 850 mM y que tiene un pH de aproximadamente 7,0.
Ejemplos de la invención
A continuación se proporcionan diversos ejemplos para facilitar un entendimiento más completo de la presente invención. Los siguientes ejemplos ilustran modos ejemplares para fabricar y llevar a la práctica la presente
15 invención. Sin embargo, el ámbito de la invención no está limitado a realizaciones específicas desveladas en estos ejemplos, que se proporcionan con fines únicamente ilustrativos, ya que pueden utilizarse procedimientos alternativos para obtener resultados similares.
Los siguientes ejemplos se refieren a moléculas de CTLA4-Ig que comprenden secuencias de una o más de las SEC ID Nos: 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Estos ejemplos no pretenden ser limitantes, y un experto en la 20 técnica entiende que los ejemplos pueden ampliarse y adaptarse a otras moléculas de CTLA4-Ig.
La siguiente tabla expone ejemplos que están relacionados con la CTLA4-Ig y la CTLA4A29YL104E-Ig.
Características de la proteína CTLA4-Ig
Proteína ejemplar CTLA4-Ig Nº 1 --CTLA4-Ig que tiene la SEC ID Nº: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 Proteína ejemplar CTLA4-Ig Nº 2 --CTLA4A29YL104E-Ig que tiene la SEC ID Nº: 3 o 4 u 11-16
Unión a B7-1; tasas de asociación/disociación; fuerza, valencia
Ejemplo 6
Biocarga
Ejemplo 49
Electroforesis capilar
Ejemplo 38
Contenido en carbohidratos, Perfil HPEAC unido a N, Dominios
Ejemplo 3 Ejemplo 44 Ejemplo 22 Ejemplo 37
Transfección de línea celular
Ejemplo 12 Ejemplo 23
ADN de CHO
Ejemplo 58 Ejemplo 55
Proteína de célula hospedadora CHO
Ejemplo 60 Ejemplo 52
Caracterización Genética
Ejemplo 24
Disgregación
Ejemplo 5 Ejemplo 33
Endotoxina
Ejemplo 48 Ejemplo 48
Carga final
Ejemplo 30
Formulaciones
Ejemplo 2 Ejemplo 27
Proporciones molares de GalNAc, GlcNAc
Ejemplo 17, Ejemplo 63 Ejemplo 36
IEF
Ejemplo 50 Ejemplo 22
Bioensayo IL-2
Ejemplo 45 Ejemplo 40
Inmunogenicidad
Ejemplo 31
PK en individuos sanos a una sola dosis
Ejemplo 66
MALDI-TOF
Ejemplo 8
Proporciones molares de manosa, fucosa, galactosa
Ejemplo 18 Ejemplo 64 Ejemplo 35
Espectroscopía de Masas
Ejemplo 7
MCP-1
Ejemplo 59 Ejemplo 54
(continuación)
Características de la proteína CTLA4-Ig
Proteína ejemplar CTLA4-Ig Nº 1 --CTLA4-Ig que tiene la SEC ID Nº: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 Proteína ejemplar CTLA4-Ig Nº 2 --CTLA4A29YL104E-Ig que tiene la SEC ID Nº: 3 o 4 u 11-16
Medios / cultivo
Ejemplo 9
PK en monos
Ejemplo 32
Monómero
Ejemplo 4
Proporciones molares de NANA, NGNA
Ejemplo 3, Ejemplo 16 Ejemplo 39
Oligosacáridos ligados a O
Ejemplo 46
Oxidación y Desamidación
Ejemplo 47
Correlaciones de PK
Ejemplo 42
Plásmido
Ejemplo 1,Ejemplo 11, Ejemplo 67
Producción
Ejemplo 14 Ejemplo 28 Ejemplo 19
Proteína A
Ejemplo 62 Ejemplo 53
Purificación
Ejemplo 15 Ejemplo 29 Ejemplo 20
PK de AR a Dosis múltiple
Ejemplo 34
SDS-PAGE
Ejemplo 51 Ejemplo 26
Ejemplo 56
SEC -APM, dímero, monómero, homogeneidad por tamaño
Ejemplo 10 Ejemplo 25
RPS -unión a B7.1 (BIAcore)
Ejemplo 21 Ejemplo 41
Subclonación de líneas celulares
Ejemplo 13 Ejemplo 24
Tritón-X 100
Ejemplo 61 Ejemplo 57
Mapeos trípticos
Ejemplo 3, Ejemplo 47, Ejemplo 65 Ejemplo 22
Abreviaturas:
15N 15 Nanómetros A280 Absorbancia a 280 nm
5 CTLA4-Ig Antígeno-4 de Linfocito T Citotóxico-Inmunoglobulina; CTLA-4 Ig PFA Principio Farmacéutico Activo UA Unidades de Absorbancia B7 Ligando del receptor de CTLA-4 ufc Unidad Formadora de Colonias
10 CHO Ovario de Hámster Chino (Chinese Hamster Ovary) CHOP Proteínas de Células Huésped de Ovario de Hámster Chino (Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins) VC Volumen de columna Carga de Sustancia Farmacológica Etapa de Concentración/Diafiltración de Sustancia Farmacológica y de Carga
15 ELISA Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas UE Unidades de Endotoxina Fc Región constante de anticuerpos GalNAc N-Acetil-galactosamina GlcNAc N-Acetil-glucosamina
20 HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etanosulfónico CIH Cromatografía de Interacción Hidrófoba; Phenyl Sepharose∋ Fast Flow APM Alto Peso Molecular HPLC Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (High Performance Liquid Chromatography) IgG1 Inmunoglobulina de Clase G1
25 IPC Control en Proceso LAL Lisado de Amebocitos de Limulus MBR(s) Registro(s) de Lote Maestro MCP-1 Proteína Quimiotáctica de Monocitos 1 MTX Metotrexato
30 PM Peso Molecular N/A No Aplicable NANA Ácido N-acetilneuramínico; Ácido Siálico; AS
LNPM Límite Nominal de Peso Molecular DO Densidad Óptica PAR Intervalo Aceptable Aprobado Planova filtros de eliminación viral, tamaño de poro de15 nm
5 PP(s) Parámetro(s) del Proceso CR Calificación del Rendimiento psi Libras por Pulgada Cuadrada (Pounds per Square Inch)(kPa, kilopascales) psid Libras por Pulgada Cuadrada, Diferencial psig Libras por Pulgada Cuadrada; Calibre;
10 QFF Q Sepharose™ Fast Flow QXL Q Sepharose Extreme Load rPA Proteína A Recombinante Sepharose Fast Flow AS Ácido Siálico; Ácido N-acetilneuramínico; NANA SDS-PAGE electroforesis en gel de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato Sódico
15 POS Procedimiento Operativo Estándar Tris Tris (hidroximetil) Aminometano Triton X-100 t-Octilfenoxipolietoxietanol; éter de polietilenglicol terc-octilfenilo UF Ultrafiltración UV Ultravioleta
20 v/v Volumen por Volumen FV Filtración Viral; Filtración en Nanómetros IV Inactivación Viral
Ejemplo 1: Confirmación de la secuencia codificante de CTLA4-Ig en el plásmido pcSDhuCTLA4-Ig
En la FIG. 1 se muestra la secuencia comentada de ácido nucleico del gen CTLA4-Ig presente en el plásmido
25 pcSDhuCTLA4-Ig y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente de la CTLA4-Ig. El ácido nucleico de pcSDhuCTLA4-Ig se transfectó a células CHO para generar transfectantes estables que pudiesen expresar moléculas de CTLA4-Ig (véase el Ejemplo 12). Los transfectantes se exploraron y algunos transfectantes se subclonaron o expandieron para generar líneas celulares clonadas.
El análisis de los datos de secuencias de ADN confirmó que las uniones creadas durante la construcción del
30 plásmido eran como las diseñadas y que los cebadores oligonucleotídicos sintéticos usados en la reacción en cadena de la polimerasa generaban la correcta secuencia señal de oncostatina M aguas arriba de la secuencia de CTLA4-Ig. Se confirmaron los cambios de cisteína por serina deseados (en las posiciones 156, 162 y 165 de la SEC ID Nº: 2) en la región bisagra de la proteína de fusión. Estos restos de aminoácidos se indican en negrita con un asterisco en la FIG. 1. También se detectó un cambio de aminoácido adicional de prolina por serina en la posición
35 174 de la SEC ID Nº: 2. Este cambio se introdujo durante la síntesis de ADNc de la IgG1 por la reacción en cadena de la polimerasa. Este resto de aminoácido también se indica en negrita con un asterisco en la FIG 1.
El análisis de los datos de secuencia de ADN identificaron una diferencia adicional cuando se compararon con las secuencias de nucleótidos publicadas de la región constante de la IgG1 humana y la CTLA4 humana. El codón en el aminoácido 110 de la región codificante de CTLA4 se identificó como ACC (treonina) en lugar de como GCC
40 (alanina).
Ejemplo 2: Formulación de CTLA4-Ig
La composición de CTLA4-Ig para inyección, 250 mg/vial, es una composición liofilizada, no pirogénica, estéril, para administración intravenosa (IV). La población de moléculas de CTLA4-Ig se envasó en viales de tubo de vidrio de sílex de Tipo I de 15 cc. Cada vial se tapó con un tapón gris de 20 mm, revestido con fluoro-resina butil D-21-7-S/B2
45 TR, de Daikyo y se cerró herméticamente con un cierre a presión, blanco, de aluminio de 20 mm.
Cada vial de un solo uso contenía 250 mg de composición de CTLA4-Ig constituida con agua estéril para inyección, USP y diluida posteriormente, en el momento del uso, con Cloruro Sódico para inyección al 0,9%, USP. En la siguiente Tabla se indica la composición de CTLA4-Ig para inyección, 250 mg/vial, y la función de cada componente.
Tabla 8: composición de CTL4-Ig
Componente Función mg por vial
CTLA4-Ig Principio activo 262,5 Monohidrato de maltosa Agente formador de volumen/estabilizante 525 Fosfato sódico, monobásico, monohidratob Agente tamponante 18,1 Cloruro sódicob Ajuste de la fuerza iónica 15,3 Ácido clorhídrico Ajuste de pH Ajuste de pH a
50 (continuación)
Componente Función mg por vial
Hidróxido sódico Ajuste de pH b Estos componentes se presentan en la solución de la composición de CTLA4-Ig
La composición de CTLA4-Ig comprende aproximadamente 50 mg/ml de CTLA4-Ig en tampón fosfato sódico 25 mM y cloruro sódico 50 mM a pH 7,5. Durante el desarrollo inicial, este sistema tampón se seleccionó basándose en la evaluación de la estabilidad física y química de la CTLA4-Ig en función del pH, tipo de tampón, concentración del tampón y concentración de cloruro sódico. La estabilidad de las soluciones de CTLA4-Ig se investigó en el intervalo de pH de 5 a 9. Los resultados indicaron que la formación de especies de alto peso molecular era dependiente del pH y que el intervalo de pH de estabilidad máxima se encontraba entre 7 y 8. En una determinación distinta, se evaluó el efecto del tipo y concentración del tampón, en el que se encontró que la composición de CTLA4-Ig era también estable en tampón fosfato sódico o tris a pH 8. Adicionalmente, las concentraciones del tampón entre una concentración de 10 a 100 mM no tenían ningún impacto sobre la estabilidad de la composición de CTLA4-Ig a 2 ºC -8 ºC. De manera similar, la presencia de cloruro sódico a una concentración entre 30 y 500 mM no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad en el estado en solución de la composición de CTLA4-Ig conservada a 2 ºC -8 ºC.
Basándose en estos resultados, se seleccionó la composición de CTLA4-Ig a 10 mg/ml en tampón fosfato sódico 25 mM y cloruro sódico 50 mM de a pH 7,5 para formulación a una fuerza de 50 mg/vial. La concentración de CTLA4-Ig se modificó después a 50 mg/ml en la misma composición de tampón para permitir el desarrollo de las composiciones de CTLA4-Ig con fuerzas de 200 y 250 mg/vial.
La CTLA4-Ig para inyección se formuló con maltosa además del tampón con fosfato sódico y cloruro sódico. La función de los excipientes utilizados en este producto se indica en la Tabla anterior.
La presencia de sales inorgánicas, como componentes tampón de cloruro sódico y fosfato sódico reduce la temperatura de transición vítrea (Tg’) del sistema congelado. Además, el fosfato sódico dibásico, que se forma in situ a pH 7,5, experimenta cristalización preferencial durante la congelación, lo cual reduce el pH microambiental de la solución congelada. Basándose en estos razonamientos, se seleccionaron cantidades mínimas de tampón de cloruro sódico y fosfato sódico para minimizar su impacto en el proceso de liofilización. La maltosa se añade como un estabilizante que actúa como crio-y lio-protector durante la liofilización y después durante la conservación del producto farmacológico, respectivamente. La composición de CTLA4-Ig para inyección, 250 mg/vial, es una composición estéril, en viales de un solo uso sin conservantes antimicrobianos.
Ejemplo 3: análisis del contenido de carbohidratos de una composición de CTLA4-Ig
El propósito del procedimiento es proporcionar perfiles cromatográficos de oligosacáridos de CTLA4-Ig ligados a N. Este procedimiento puede usarse para obtener la proporción molar de ácido N-acetil neuramínico (NANA) y ácido Nglucolil neuramínico (NGNA) con respecto a la proteína en muestras de CTLA4-Ig (unida y libre total). NANA y NGNA son dos formas de ácido siálico. La glucosilación en la proteína CTLA4-Ig contiene oligosacáridos ligados a
N. Por ejemplo, estos oligosacáridos pueden liberarse por hidrólisis enzimática con PNGasa F durante 22 horas. La determinación del perfil de los oligosacáridos libres se realiza usando cromatografía de intercambio aniónico a pH alto, empleando detección electroquímica. Los perfiles carbohidrato de los oligosacáridos ligados a N se evaluaron usando cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD). Estos perfiles se confirmaron y usando cromatografía con carbón poroso grafitizado (PGC) acoplada a EM se obtuvo información estructural. Ambas técnicas y resultados se describen en esta sección. Este procedimiento es ilustrativo para la CTLA4-Ig de la SEC ID Nº:
Aislamiento de oligosacáridos ligados a N: la escisión de oligosacáridos (ligados a N) unidos a asparagina (ligados a N) de la CTLA4-Ig se realizó por hidrólisis enzimática usando PNGasa F. Para realizar la desglucosilación, primero se redujo la CTLA4-Ig y se desnaturalizó: 1-2 mg de CTLA4-Ig en 176 ∀l de tampón fosfato sódico 5 mM que contenía SDS al 0,5% y se calentó betamercaptoetanol al 1% a 100 ºC durante 2 minutos, después se dejó enfriar a temperatura ambiente. A la mezcla enfriada, se añadieron 16 ∀l de NP-40 al 10%. La muestra se mezcló bien y se añadieron 40 ∀l de PNGasa F (50.000 U/ml, en tampón fosfato sódico 50 mM). La muestra se mezcló bien y se incubó a 38 ºC durante 24 horas. Los oligosacáridos (glucanos) liberados enzimáticamente se purificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa usando una columna Phenomenex Luna C 18 (4,6 x 150 mm; 5 ∀l) acoplada a una columna Thermo HyperCarb (4,6 x 100 mm; 5 ∀l) a un caudal de 1,0 ml/minuto; el cromatógrafo utilizado para el aislamiento era un Waters Alliance 2695 equipado con un detector Waters 2996. En primer lugar, las columnas se equilibraron con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,05%. Después de la inyección de una muestra, se inició un gradiente de acetonitrilo, finalizando a los 15 minutos con una composición de disolvente de TFA al 0,05% en acetonitrilo al 12%. Después, los glucanos se eluyeron de la columna HyperCarb con un gradiente en etapas a TFA al 0,5% en acetonitrilo al 60%. Los glucanos se recogieron controlando al mismo tiempo la absorbancia UV a 206 nm y se concentraron hasta sequedad al vacío. Antes de realizar inyecciones posteriores la columna Luna C18 se limpió con TFA al 0,05% en acetonitrilo al 40%, isopropanol al 40% y agua al 20%.
Preparación de solución madre de NANA (ácido N-acetil neuramínico) (1 mg/ml). Importante: antes de pesar, dejar que el prototipo de NANA se caliente a temperatura ambiente. Si esto no se hace se producirá la condensación de agua en el prototipo. Abrir solo durante el tiempo suficiente para obtener la cantidad deseada, después volver a
5 cerrar herméticamente el frasco y llevar de nuevo al congelador, conservando con desecante. Pesar exactamente entre 3 y 10 mg de ácido N-acetil neuramínico. Registrar casi a 0,1 mg. Transferir a un recipiente de tamaño apropiado si el pesaje se realiza utilizando papel/cartón de pesaje. Añadir suficiente cantidad de agua de calidad HPLC para obtener una concentración de solución 1 mg/ml. Mezclar con una barra agitadora o con agitación vorticial hasta su disolución. Conservar entre 2 y 8 ºC durante hasta 3 meses en un tubo de polipropileno.
10 Preparación de solución madre de NGNA (ácido N-glucolil neuramínico) (1 mg/ml). Importante: antes de pesar, dejar que el prototipo de NGNA se caliente a temperatura ambiente. Si esto no se hace se producirá la condensación en la solución madre. Abrir solo durante el tiempo suficiente para obtener la cantidad deseada, después volver a cerrar herméticamente el frasco y llevar de nuevo al congelador, conservando con desecante. Pesar exactamente entre 3 y 10 mg (registrar casi a 0,1 mg de ácido N glucolil neuramínico). Transferir a un recipiente de tamaño apropiado si el
15 pesaje se realiza utilizando papel/cartón de pesaje. Añadir un volumen apropiado de agua de calidad HPLC para obtener una concentración diana de solución de 1 mg/ml. Mezclar con una barra agitadora o con agitación vorticial hasta su disolución. Conservar entre 2 y 8 ºC durante un periodo de hasta 3 meses en un tubo de polipropileno.
Solución de viabilidad del sistema. Añadir 0,050 ml de cada una de las soluciones madre de NANA y NGNA de 1 mg/ml a 0,900 ml de agua de calidad HPLC en un recipiente apropiado. Mezclar con agitación vorticial. Conservar 20 entre 2 y 8 ºC durante un periodo de hasta 3 meses. Solución de trabajo de ácido N-acetil neuramínico (0,050 mg/ml). Medir exactamente 0,050 ml de solución de reserva NANA de 1 mg/ml y añadir a 0,950 ml de agua de calidad HPLC. Mezclar con agitación vorticial. Preparar, por duplicado, en el momento de su uso. Solución de trabajo de ácido N-glucolil neuramínico (0,050 mg/ml). Medir exactamente 0,050 ml de solución madre de NGNA de 1 mg/ml y añadir a 0,950 ml de agua de calidad HPLC. Mezclar con agitación vorticial. Preparar por duplicado en el momento
25 de su uso.
Preparación de muestras y blanco de hidrólisis. Obtener la concentración de proteína para el material de CTLA4-Ig a partir del Certificado de Análisis (COA). Preparar una sola muestra de Blanco de Hidrólisis añadiendo 0,190 ml de agua de calidad HPLC a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Preparar dos soluciones de muestras de 1 mg/ml y material de referencia de CTLA4-Ig usando agua de calidad HPLC. Mezclar con agitación vorticial.
30 Hidrólisis de las muestras, material de referencia de CTLA4-Ig y blanco de hidrólisis. Realizar la hidrólisis en preparaciones por duplicado de material de referencia y muestras en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Observación: es importante usar tubos de microcentrífuga que se ajustarán completamente en el bloque de calentamiento. Añadir 0,010 ml de H2SO4 1 M a 0,190 ml de diluciones 1 mg/ml de muestras y material de referencia de CTLA4-Ig, y blanco de hidrólisis. Mezclar con agitación vorticial y tapar con tapa o cinta de bloqueo. Colocar los
35 tubos de microcentrífuga en el bloque de calentamiento a 80 ºC ! 2 ºC durante 1 hora ! 2 minutos. Después de la incubación, retirar los tubos del bloque de calentamiento, colocar los tubos en la microcentrífuga y centrifugar para hacer que la muestra vaya al fondo del tubo. Dividir en alícuotas las soluciones hidrolizadas en viales de automuestreo y colocarlas en el inyector automático para su inyección.
Condiciones del instrumento. Preparar el sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Establecer
40 las siguientes condiciones. Equilibrar la columna durante al menos una hora a un caudal de 0,6 ml/min y a una temperatura de 40 ºC.
Fase (fases) móvil(es)
A: H2SO4 5 mM B: Agua de calidad de HPLC (lavado de columna)
Caudal
0,6 ml/min
Tiempo de desarrollo
25 minutos
Longitud de onda del detector
206 nm
Temperatura de la columna
40 ºC
Automuestreador Temperatura Volumen de inyección
4 ºC 5 ∀l
Tiempos de retención NGNA NANA
9,8 ! 1 minutos (dependiendo del sistema) 10,8 ! 1 minutos (dependiendo del sistema)
Condiciones de gradiente
Isocráticas
Viabilidad del sistema. Iniciar el análisis con una inyección de fase móvil como el blanco instrumento para evaluar la línea basal del sistema, que debe ser plana y estable. Si la línea basal no es plana y estable, deben realizarse inyecciones blanco adicionales. Observación: no debe superarse un cambio de la línea basal de 0,25 UA. Realizar seis inyecciones repetidas de la solución de viabilidad del sistema.
Calcular la resolución R (R) y las placas teóricas (N).
Usando la primera inyección de viabilidad del sistema, calcular el número (N) de placas teóricas usando la siguiente ecuación:
En la que:
10 N = Recuento en placas teóricas
t = tiempo de retención del pico de NANA, en minutos
W = anchura del pico de NANA en la línea basal, en minutos
Calcular los moles de NANA y de NGNA en el material de referencia y muestras de CTLA4-Ig. Los prototipos de
NANA y NGNA se inyectan al principio y al final de cada desarrollo. Promediar los recuentos de área de las 15 inyecciones repetidas de NANA y NGNA. Utilizar esta área en la siguiente ecuación:
X = moles de NANA o NGNA en las soluciones de trabajo calculados en la Sección 7.3.1 Y = recuentos de área de NANA o NGNA en el material de referencia o muestra de abatacept de cada preparación (Observación: véase la Sección 7.2 y la Figura 3 para picos para integrar NANA) 20 Z = Área promediada de NANA o NGNA repetido en soluciones de trabajo
En una realización, la resolución entre los picos de NGNA y de NANA debe ser − 1,3. El recuento de placas teóricas debe ser − o = 4000. La reproducibilidad de inyección de viabilidad del sistema evaluada como % DTR de los recuentos de área del pico de NANA debe ser # 3%. El recuento de placas teóricas debe ser ∗ 4000. La reproducibilidad de inyección de viabilidad del sistema evaluada como % de DTR de los recuentos del área del pico
25 de NANA debe ser # 3%.
Determinación del perfil de oligosacáridos ligados a N por cromatografía de intercambio aniónico a alto pH con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD): se realizó HPAEC de oligosacáridos aislados en un sistema de cromatografía que consistía en un cromatógrafo Waters Alliance equipado con un detector electroquímico Waters 464 utilizando una columna de intercambio aniónico Dionex CarboPack PA1 (4 x 250 mm) y una columna protectora 30 Dionex CarboPack. Las muestras de oligosacáridos se eluyeron usando un gradiente de acetato sódico en hidróxido de sodio 200 mM (aumentando la concentración de acetato sódico de 0 mM en el momento de la inyección a 225 mM a los 60 minutos). El detector electroquímico se desarrolló en modo de pulsos con potenciales de pulso E 1 = 0,05 V (t 1 = 0,4 s), S = 0,75 V (t2 = 0,2 s), E3 = -0,15 V (t3 = 0,4 s). La célula de detección estaba compuesta por un electrodo de trabajo de oro, un electrodo de recuento de acero inoxidable y un electrodo de referencia de
35 plata/cloruro de plata.
Este procedimiento describe el proceso para determinar el perfil de oligosacáridos con HPAEC (cromatografía de intercambio aniónico a pH alto) de los oligosacáridos ligados a N liberados de la proteína en muestras de CTLA4-Ig. La finalidad del procedimiento es proporcionar perfiles cromatográficos de CTLA4-Ig, tales como oligosacáridos ligados a N de la sustancia farmacológica CTLA4-Ig que pueden usarse para análisis comparativo entre diferentes
40 composiciones de moléculas de CTLA4-Ig. La glucosilación sobre la proteína CTLA4-Ig contiene los oligosacáridos ligados a N. Estos oligosacáridos se liberan por hidrólisis enzimática con PNGasa F (Péptido: N-glucosidasa F) durante 22 horas. La determinación del perfil de los oligosacáridos libres se realiza usando cromatografía de intercambio aniónico a pH alto empleando detección electroquímica.
Sustancia farmacológica a granel de CTLA4-Ig CTLA4-Ig en fosfato sódico 25 mM, NaCl 10 mM, pH = 7,5
Viales de recuperación total Waters con tabique Waters Corporation, Nº de Catálogo 186000234
PTFE/silicona unido
RapiGest SF Waters Corporation, Nº de Catálogo 186001861 Sistema HPLC de Alliance equipado con: Waters Corporation automuestreador (enfriado), Módulo EluentDegas
Detector electroquímico modelo 2465
Columna: CarboPac PA-1 4 x 250 mm Dionex Corporation, Nº de Catálogo 35391
Columna protectora: CarboPac PA-1 4 x 50 mm Dionex Corporation, Nº de Catálogo 43096 Sistema de recogida de datos Empower
Los perfiles de los oligosacáridos de la sustancia farmacológica se evalúan frente a muestras procesadas simultáneamente de material de referencia. Los resultados se presentan como un porcentaje de desviación de los dominios y picos seleccionados a partir de los mismos picos en los patrones de referencia.
Condiciones de cromatografía para el perfil de oligosacáridos por cromatografía de intercambio aniónico
5
Temperatura de columna 29 ºC
Caudal
1 ml/min
Fases móviles y condiciones de gradiente
Programa de gradiente
1: NaOAc 500 mM
Tiempo
10 15
2: NaOH 400 mM 3: Agua calidad HPLC (min) Inicial 0,0 11,0 12,0 20,0 80,0 81,0 100 %1 0 0 0 4 10 45 0 0 %2 30 30 30 30 30 30 30 30 %3 70 70 70 66 60 25 70 70
Ajustes del Waters 2465
Modo
Pulso
20
Ajustes del Empower Intervalo = 5 ∀A
E1 = +0,05V E2 = +0,75V E3 = -0,15V t1 = 400 msegundos t2 = 200 msegundos t3 = 400 msegundos Tiempo de muestreo (ts) = 100 msegundos Constante de tiempo (filtro) t = 0,1 segundos
25 Intervalo de compensación = 5% Polaridad + Temperatura = 29 ºC
NOTA: Se equilibran la columna y el detector con la fase móvil inicial al caudal de análisis durante aproximadamente 2 horas, o hasta que la línea basal sea estable antes de hacer las inyecciones.
30 Temperatura del inyector automático establecida a:
4 ºC
Volumen de inyección 60 ∀l
Tiempo de procesamiento 100 minutos
Los valores de los tiempos de retención aproximados (TR; minutos) de los picos dominantes en cada dominio (véase 35 la Figura 1) pueden variar dependiendo del TR del patrón de idoneidad del sistema (SS)
TR aproximados (min)
SS: 18,5 Pico 1A: 20,0 Pico 1B: 20,8 40 Pico 1C: 21,4 Pico 1D: 22,4 Pico 1E: 23,1
(continuación)
Pico 2: 31,5 Pico 3: 44,8 Pico 4: 58,5
Preparación de fases móviles para el perfilado de carbohidratos oligosacáridos por HPAEC
Eluyente de HPAEC 1: Acetato sódico (NaOAc) 500 mM. Se pesan 20,51 ± 0,05 g de acetato sódico (anhidro) en un cilindro graduado de 500 ml que contiene 400 ml de agua calidad HPLC. Se lleva a un volumen de 500 ml con agua calidad HPLC y se agita durante 5 minutos usando una pipeta serológica de plástico hasta que se mezcla completamente. Se filtra la solución a través de un filtro de nylon de 0,2 ∀m. Se transfiere a un frasco de eluyente de 1 l. Se tapa el frasco sin apretar y se rocía con helio durante 20 minutos. Se aprieta el tapón y se presuriza el frasco con helio. Se almacena la solución a temperatura ambiente en atmósfera de helio durante hasta tres semanas.
Eluyente de HPAEC 2: Hidróxido sódico (NaOH) 400 mM. Usando un cilindro graduado de 1 l, se miden 960 ml de agua calidad HPLC y se transfieren a un frasco de eluyente de 1 l limpio. Usando una pipeta serológica de plástico, se añaden 40,0 ml de NaOH 10 N directamente en el frasco de eluyente y se mezcla el eluyente por agitación con vórtice. Se tapa el frasco su apretar y se rocía con helio durante 20 minutos. Se aprieta el tapón y se presuriza el frasco con helio. Se almacena la solución a temperatura ambiente en atmósfera de helio durante hasta tres semanas.
Eluyente de HPAEC 3: Agua calidad HPLC. Se llena un frasco de eluyente de 1 l con aproximadamente 1 l de agua calidad HPLC. Se coloca el frasco de eluyente en el sistema, se tapa sin apretar, y se rocía durante aproximadamente 20 minutos. Se aprieta el tapón y se presuriza el frasco con helio. Se almacena la solución a temperatura ambiente en atmósfera de helio durante hasta tres semanas.
Tampón fosfato sódico 50 mM, azida sódica al 0,02%, pH = 7,5.
NaH2PO4 • H2O 6,9 g
NaN3 0,2 g
H2O 1,0 litro de volumen final
Se pesan 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 • H2O y 0,2 g de NaN3 y se disuelven en 800 ml de H2O calidad HPLC en un frasco de reactivo de 1 l usando mezcla continua con una barra magnética de agitación. Usando un medido de pH, se ajusta el pH de la solución a 7,5 usando NaOH 10 M. Se lleva el volumen final a 1,0 litro usando un cilindro graduado de 1 l. Se almacena la solución a temperatura ambiente durante hasta seis meses.
Solución madre de trabajo de enzima PNGasa F en tampón fosfato sódico 50 mM, azida sódica al 0,02%, pH = 7,5.
Tampón fosfato sódico 50 mM Azida sódica al 0,02%, pH = 7,5. 1,8 ml PNGasa F del Kit, Nº Catálogo P0704L 0,2 ml
Se pipetean 1,8 ml de tampón fosfato sódico 50 mM, azida sódica al 0,02%, pH 7,5 en un vial criogénico de 1,8 ml. Se añaden 0,2 ml de PNGasa F del kit y se mezclan minuciosamente. Se almacena la solución a -20 ºC o menos durante hasta seis meses. La solución puede dividirse en alícuotas antes de congelarse.
Patrón externo de idoneidad del sistema. Solución madre de estaquiosa (1,25 mg/ml). Se pesan 0,125 g de estaquiosa en un papel de pesaje. Usando una balanza analítica y se transfieren a un matraz volumétrico de 100 ml. Se llena hasta la marca con agua calidad HPLC y se mezcla minuciosamente. Se divide en alícuotas en partes de 2 ml en crioviales Nalgene. Se almacena la solución a -20 ºC o menos durante hasta seis meses.
Patrón de estaquiosa de idoneidad del sistema (12,5 ∀g/ml). Se pipetea 1 ml de la solución madre de 1,25 mg/ml en un matraz volumétrico de 100 ml. Se llena hasta la marca con agua calidad HPLC y se mezcla minuciosamente. Se divide en alícuotas en partes de 200 ∀l en tubos de Microfusa de 0,65 ml. Se colocan los tubos en una caja de almacenamiento apropiadamente etiquetada. Se almacena la solución de idoneidad del sistema a -20 ºC o menos durante hasta seis meses.
PREPARACIÓN DEL PATRÓN Y LA MUESTRA
Preparación del material de referencia. A un vial que contiene 1 mg de RapiGest SF liofilizado, se añaden 625 ∀l de tampón fosfato Na 50 mM que contiene azida Na al 0,02%, pH 7,5. A un tubo Eppendorf de 0,65 ml se añaden 120 ∀l de RapiGest SF que contiene tampón. Se añaden 40 ∀l del material de referencia (~ 50 mg/ml). La concentración final de RapiGest SF debe ser del 0,12% p/v. Se añaden 40 ∀l de la solución madre de trabajo de PNGasa F, se mezclan minuciosamente, se centrifuga la muestra, y se coloca a 38 ± 2 ºC durante 22 ± 2 horas (baño de agua o el compartimiento del inyector automático Alliance). Se pipetea la muestra en un filtro de centrifugación microcon YM10 y se centrifuga a 13.000 g durante 30 minutos. Se colocan 200 ∀l de agua HPLC en el filtro y se aclara en el filtrado centrifugando durante 30 minutos adicionales a 13.000 g. Se agita con vórtice el filtrado combinado durante 15 segundos y se centrifuga la muestra durante 10 segundos. Usando una pipeta se transfiere la solución resultante (~ 380 ∀l) a un vial de inyector automático de recuperación total de HPLC (punto 1.15).
Preparación de la muestra. A un tubo Eppendorf de 0,65 ml se añaden 120 ∀l de RapiGest SF que contiene tampón. Se añaden 40 ∀l demuestra de proteína (este volumen debe ser igual a entre 1 y 2 mg de CTLA4-Ig). La concentración final de RapiGest SF debe ser del 0,12% p/v. Se añaden 40 ∀l de la solución madre de trabajo de PNGasa F, se mezcla minuciosamente por agitación con vórtice durante 10 segundos. Se centrifuga la muestra, y se coloca a 38 ± 2 ºC durante 22 ± 2 horas (baño de agua o el compartimiento del inyector automático Alliance). Se pipetea la muestra en un filtro de centrifugación microcon YM-10 y se centrifuga a 13.000 g durante 30 minutos. Se colocan 200 ∀l de agua HPLC en el filtro y se aclara en el filtrado centrifugando durante 30 minutos adicionales a 13.000 g. Se agita con vórtice el filtrado combinado durante 15 segundos y se centrifuga la muestra durante 10 segundos. Se transfiere la solución resultante (-380 ul) a un vial de inyector automático de HPLC de recuperación total (punto 1.15).
IDONEIDAD DEL SISTEMA
Estabilización de las celdas del detector electroquímico. Se inyectan 30 ∀l del patrón externo de estaquiosa de idoneidad del sistema (12,5 ∀g/ml). Se asegura que la altura del pico para estaquiosa es ∗ 800 nA. Se asegura que no hay excesivo ruido eléctrico desde la celda y que la línea basal es plana. Se muestra un cromatograma representativo de idoneidad del sistema en la Figura 2. Si la sensibilidad de estaquiosa o la línea basal es inaceptable, se comprueba la composición del tampón, se limpia el electrodo o se remplaza el electrodo. Si hay excesivo ruido presente, se comprueba la celda para asegurar la eliminación de todas las burbujas de aire. Se reestabiliza la celda y se re-inyecta el patrón de estaquiosa.
Placas teóricas (N). Se determina la cantidad de placas teóricas (N) en base al pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace a través del sistema de análisis de datos Empower o también puede hacerse de forma manual. N = 16 (t / W)2 DONDE
t: tiempo de retención medido desde el tiempo de inyección hasta el tiempo de elución del pico a la altura máxima
W: anchura de pico por extrapolación de los laterales hasta la línea basal.
N debe ser ∗ 6000. Si el recuento de placas es menor de 6000, se ajusta el gradiente de procesamiento o se remplaza la columna.
Factor de cola (T). Se determina el factor de cola de la columna (T) en base al pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace a través del sistema de análisis de datos Empower o también puede hacerse de forma manual. T = (W0,05 / 2f), DONDE:
W0,05: anchura del pico al 5% de la altura (0,05h).
f: la medición (anchura) desde el borde frontal del pico a W0,05 hasta el ápice del pico.
T debe ser # 1,2. Si el factor de cola es mayor de 1,2, se comprueba la composición del tampón, se remplaza la columna o se limpia la columna como se indica y se re-inyecta patrón de idoneidad del sistema.
Verificación del tiempo de retención del patrón de estaquiosa de idoneidad del sistema. El tiempo de retención es dependiente del sistema. El patrón de estaquiosa de idoneidad del sistema debe mostrar un tiempo de retención de 18,5 ± 2,0 minutos. Material patrón de CTLA4-Ig. Se observa el perfil de carbohidratos desde la primera intercalación de material de referencia inyectado antes de la inyección de muestras. El perfil de carbohidratos debe ser similar al mostrado en la Figura 1. Los tiempos de retención absolutos son dependientes del sistema. Se asegura que la diferencia en los tiempos de retención entre el primer pico en el Dominio I (Pico 1A) y el pico principal en el Dominio III (Pico 3) es entre 22 minutos y 28 minutos. Si la delineación de los picos no se parece a la obtenida en la Figura 1 se adoptan acciones apropiadas (por ejemplo, se comprueba la función del instrumento, se limpia la columna, se comprueban/remplazan los tampones, se remplaza la columna) y se re-evalúa. Puede usarse el siguiente procedimiento para limpiar la columna: se apaga la celda y se limpia la columna con Eluyente 1 al 80%, Eluyente 2 al 20% durante 5 minutos seguido de Eluyente 1 al 50%, Eluyente 2 al 50% durante 10 minutos. Se re-equilibra la columna y la celda (con la celda encendida) a condiciones iniciales y se re-evalúa.
SECUENCIA DE INYECCIÓN
Se establece la secuencia de inyección de los oligosacáridos aislados del siguiente modo:
Patrón de estaquiosa (30 ∀l)
Material de referencia (60 ∀l)
Muestra(s) (60 ∀l)
Material de referencia (60 ∀l)
Se recomienda procesar # cinco muestras entre las inyecciones de material de referencia intercalado.
ANÁLISIS DE DATOS
Procesamiento de los cromatogramas. Se procesan los cromatogramas para el material de referencia y las muestras en Empower. Se establecen los parámetros de integración de modo que la delineación del pico y la línea basal sea
5 similar a la mostrada en la Figura 76, puede que las líneas de integración tengan que colocarse de forma manual. Se realizan cálculos para las áreas de dominio relativas y las áreas de pico relativas mostradas. Se determinan los valores promedio para estos parámetros para el material CTLA4-Ig y para cada muestra si se hicieron inyecciones replicadas. Para el material de referencia, se determina la desviación relativa para los dominios I, II, III, los picos 1A y 1B para cada réplica con respecto al promedio de todas las réplicas.
10 Comparación de los perfiles de muestra con perfiles de material de referencia. Comparación visual. Se determina si tanto las muestras como el material de referencia tienen la misma cantidad de dominios y picos primarios. Los picos primarios son aquellos picos marcados en la Figura 76 (picos 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 y 4). Comparación de cuantificación relativa. Se comparan las áreas relativas de las muestras (dominios I, II, y III y picos 1A, y 1B; si se hicieron inyecciones replicadas de muestras se usan sus valores promedio) con las áreas relativas promedio de las
15 inyecciones de CTLA4-Ig intercaladas. Se determina la diferencia relativa de estas áreas a partir de los valores promedio del material CTLA4-Ig. Cálculos -% de área de dominio (área de dominio relativa). Se calcula el % de área de dominio para los dominios de los perfiles para el material de referencia y las muestras. Remítase a la Figura 76 para el patrón de áreas de dominio. Siguiendo el ejemplo de la Figura 76, se calculan las proporciones porcentuales de dominio usando la siguiente información y fórmula (los tiempos de retención son dependientes del sistema y
20 reflejan el resultado de la Figura 76):
Dominio I: Suma de las áreas de pico a tiempos de retención aproximados de 18-24 minutos (picos 1A-1E) Dominio II: Suma de los picos de 26-38 minutos Dominio III: Suma de los picos de 39-50 minutos Dominio IV: Suma de los picos de 51-64 minutos
25 Dominio V Suma de los picos de 65-75 minutos
NOTA: Las ventanas de tiempos de retención para los dominios se desplazará de acuerdo con variaciones en el rendimiento cromatográfico diario. Se ajusta los tiempos en consecuencia.
área de dominio individual % de área de dominio = x 100% suma de todas las áreas de dominio
Para los dominios I-III también se calculan los valores promedio en las inyecciones de material de referencia intercalado, así como en muestras si se hacen inyecciones replicadas.
30 % de área de pico (área de pico relativa). Se calcula el % de área de pico para los picos 1A, 1B, 1C, y 3 de los perfiles para el material de referencia y las muestras. Remítase a la Figura 1 para el patrón de áreas de pico; los tiempos de retención son dependientes del sistema. Se calculan las proporciones porcentuales de pico usando la siguiente información y fórmula:
área de pico individual% de área de pico individual = x 100% suma de todas las áreas de dominio
Para cada uno de los picos 1A y 1B, también se calculan los valores promedio en las inyecciones de material de
35 referencia intercaladas, así como en las muestras si se hacen inyecciones replicadas. Cálculo de la diferencia porcentual a partir de valores promedio de material de referencia. Se usa la siguiente fórmula para calcular las diferencias porcentuales en áreas relativas promedio de los dominios I-III, los picos 1A y 1B de las muestras en comparación con el material de referencia:
% Dif = |RM -S| / RM x 100
40 DONDE:
RM = valor promedio de área relativa de interés para el material de referencia S = valor promedio de área relativa de interés para una muestra | | = valor absoluto
Valores ejemplares. Para que un procesamiento sea aceptable, deben reunirse los valores ejemplares y todas las
45 inyecciones relevantes para la muestra deben haber sucedido de forma satisfactoria. Además, para cada una de las inyecciones de material de referencia intercaladas, el % de áreas de dominio para el dominio I, II y III y el % de áreas de pico para el pico 1A y 1B deben estar dentro del 15% de sus valores promedio.
Análisis por HPAEC-PAD: Los oligosacáridos ligados a N se escindieron de las moléculas de CTLA4-Ig y se analizaron por HPAEC-PAD. Los oligosacáridos eluyen en cuatro dominios en base a la cantidad de ácido siálico presente. Los dominios se establecieron en base a la migración de los patrones de oligosacárido y se confirmaron por EM. El dominio I representa especies asialiladas. Los dominios II, III, y IV representan especies mono-, di-, y trisialiladas, respectivamente. Para caracterizar la estructura de los oligosacáridos en los tres sitios ligados a N, se aislaron individualmente los péptidos T5, T7 y T14 (remítase a la Tabla 59 para la identidad de estos péptidos). Esto se realizó usando digestión tríptica de CTLA4-Ig y recogiendo manualmente los picos correspondientes a estos tres péptidos.
Los péptidos aislados se trataron con PNGasa F para liberar los oligosacáridos, que posteriormente se purificaron y analizaron por HPAEC-PAD. El péptido T5 no produjo un buen perfil ya que es difícil de purificar debido a su extrema hidrofobicidad. Las cantidades de oligosacáridos escindidos son bajas debido a la baja recuperación de este péptido a partir de la etapa de cromatografía en fase inversa tras la digestión tríptica.
Tabla 59. Masas teóricamente esperadas y observadas de CTLA4-Ig
Nº
Nº
Masa Masa
fragmento T1+A
resto -1-14 esperada(Dalton) 1536,8 observada (Dalton) 1536,8 Secuencia peptídica AMHVAQPAVVLASSR
T1
1-14 1465,8 1465,7 MHVAQPAVVLASSR
T2
15-28 1485,7 1485,6 GIASFVCEYASPGK
T3
29-33 574,6 574,2 ATEVR
T4
34-38 586,7 586,3 VTVLR
T5a
39-83 4900,4 c QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLD
DSICTGTSSGNQVNLTIQGLR
T6
84-93 1171,4 1171,4 AMDTGLYICK
T7a
94-128 3997,5 c VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEP
T8b T9b
129-132 133-158 435,2 3345,7 ND c CPDSDQEPK SSDK THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK
T10
159-165 834,9 834,4 DTLMISR
T11
166-184 2139,3 2138,6 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK
T12
185-198 1677,8 1677,2 FNWYVDGVEVHNAK
T13
199-202 500,6 500,3 TKPR
T14a
203-211 1189,2 c EEQYNSTYR
T15
212-227 1808,1 1807,4 VVSVLTVLHQDWLNGK
T16
228-230 438,5 438,1 EYK
T17
231-232 307,4 ND CK
T18
233-236 446,5 ND VSNK
T19
237-244 838,0 837,4 ALPAPIEK
T20
245-248 447,5 447,2 TISK
T21
249-250 217,2 ND AK
T22
251-254 456,2 456,2 GQPR
T23
255-265 1286,4 1286,6 EPQVYTLPPSR
T24
266-270 604,7 604,3 DELTK
T25
271-280 1161,4 1160,5 NQVSLTCLVK
T26
281-302 2544,7 2545,6 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
T27
303-319 1874,1 1873,2 TTPPVLDSDGSFFLYSK
T28
320-324 574,7 574,2 LTVDK
T29
325-326 261,3 ND SR
T30
327-349 2803,1 2800,8 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
T31
350-356 659,7 659,1 SLSLSPG
T31+K
350-357 787,9 787,0 SLSLSPGK
T2 clip
15-23 NE 1045,3 GIASFVCEY
T12 clip
185-195 NE 1364,7 FNWYVDGVEVH
T27 clip
303-317 NE 1658,5 TTPPVLDSDGSFFLY
T30 clip
327-335 NE 1125,3 WQQGNVFSC
T30 clip
327-333 NE 878,3 WQQGNVF
ND no detectado NE no esperado a partir de la digestión con tripsina (estas masas no se esperaban de la digestión, escisión no específica) a Los péptidos trípticos T5, T7, y T14 tienen N-glucosilación. La masa enumerada es la del péptido sin glucosilación. b Los péptidos trípticos T8 y T9 tienen O-glucosilación. La masa enumerada es la del péptido sin glucosilación. c Se observaron varias masas diferentes correspondientes a diferentes glucoformas de péptidos glucosilados.
Los perfiles HPAEC-PAD para todos los carbohidratos ligados a N de CTLA4-Ig y los tres péptidos se muestran en las FIG. 55A-D. El panel A muestra el perfil de oligosacárido ligado a N de la molécula de CTLA4-Ig, mientras que los paneles B, C y D muestran los perfiles para T5, T7 y T14, respectivamente. La cantidad de oligosacáridos inyectada para cada uno de los péptidos es diferente debido a los procesos de preparación. La mayoría de los oligosacáridos detectados en el péptido T5 consiste en oligosacáridos mono-y di-sialilados. El perfil de T7 contiene principalmente especies de glucano mono-, di-, y alguno a-y tri-sialilado. Solamente una pequeña cantidad de las estructuras tri-sialiladas puede detectarse en T5. El péptido T14 consiste predominantemente en oligosacáridos asialilados y una pequeña cantidad de oligosacáridos mono-y di-sialilados.
Los resultados obtenidos por HPAEC-PAD proporcionan información sobre la N-glucosilación específica de sitio. Los oligosacáridos ligados a N de la región CTLA4 de CTLA4-Ig contienen una mayor proporción de especies sialiladas que aquellos de la región Fc de CTLA4-Ig.
Mapeo peptídico con tripsina, Asp-N, y tripsina/quimotripsina de CTLA4-Ig: Se desnaturalizó CTLA4-Ig y se redujo en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía guanidina 6 M y ditiotreitol 5 mM (DTT). Después de una incubación de 20 minutos a 50 ºC, se añadió yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 10 mM para alquilar los tioles libres, y se continuó la incubación durante 20 minutos adicionales a 50 ºC en la oscuridad. La mezcla reducida y alquilada se cargó en una columna de desalación (Amersham NAP-5), después se eluyó en el volumen vacío con Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0 o tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,5. Después de la desalación, se digirió CTLA4-Ig reducido/alquilado usando dos proteasas diferentes: tripsina o Asp-N. Para la digestión con tripsina más quimotripsina, CTLA4-Ig no está ni reducido ni alquilado.
Para la digestión con tripsina, se añadió tripsina calidad secuencia (Roche, 2%, p/p, enzima/proteína) y se incubó durante 4 horas a 37 ºC. Para la digestión con Asp-N, se añadió Asp-N calidad secuencia (Roche, 4%, p/p, enzima/proteína) y se incubó durante 16 horas a 37 ºC. Para la digestión con tripsina/quimotripsina, se añadió tripsina calidad secuencia (Promega, 4%, p/p, enzima/proteína) y se incubó durante 4 horas a 37 ºC, después se añadió a-quimotripsina (Sigma, 4%, p/p, enzima/proteína) y se incubó durante 16 horas a 37 ºC. Todas las muestras se colocaron en un congelador después de la digestión.
Las mezclas resultantes de péptidos se separaron por elución en gradiente desde una columna Waters AtlantisTM dC 18 (2,1 x 250 mm) en una estación de trabajo de HPLC Waters Alliance a 0,120 ml/minuto. La columna se conectó directamente al espectrómetro de masas Waters Micromass Q-Tof microTM equipado con una fuente de nebulización iónica para recoger los espectros de masas. Las mezclas de péptidos también se separaron en una columna Varian Polaris C18 (4,6 x 250 mm) a 0,7 ml/minuto usando la misma estación de trabajo de HPLC: La columna se equilibró con disolvente A (TFA al 0,02% en agua) y los péptidos se eluyeron aumentando la concentración de disolvente B (acetonitrilo al 95%/TFA al 0,02% en agua). Se usó una válvula difusora post-columna para dirigir el 15% del flujo a la estación de trabajo Q-Tof, que se procesó en modo TOF positivo (m/z 100-2000). El voltaje de nebulización iónica típica usado fue 3000 V.
Análisis de CTLA4-Ig por EM: Se diluyó CTLA4-Ig con Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8 hasta una concentración final de 0,7 mg/ml. Se diluyó PNGasa F (New England Biolabs) 30 veces con Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8 hasta una concentración final de 17 U/∀l. Se mezclaron volúmenes iguales (60 ∀l cada uno) de muestra diluida de fermentación purificada y solución diluida de glucosidasa y se incubaron a 37 ºC durante 4 horas.
El CTLA4-Ig desglucosilado resultante (2 ∀g) se cargó en una columna de cartucho (2,1 x 20 mm) de extracción en fase inversa Waters Oasis® de base polimérica (copolímero de poliestireno y poli N-vinil-2-pirrolidinona). La columna cargada se lavó con disolvente B al 5% (disolvente A: ácido fórmico al 1% en agua, disolvente B: ácido fórmico al 1% en acetonitrilo) a un caudal de 0,2 ml/minuto durante cinco minutos para la desalación, con el eluyente desviado a residuos. Al cabo de los 5 minutos, un rápido gradiente (disolvente B al 5% hasta disolvente B al 95% en 10 minutos) comenzó la elución de CTLA4-Ig de la columna; aquí el eluyente se dirigió al espectrómetro de masas (Waters Micromass Q-Tof microTM) a 45 ∀l/min después de dividir el flujo (el sistema de cromatografía usado fue un Waters Alliance 2695 equipado con un detector Waters 2996).
El voltaje capilar para el Q-Tof microTM se estableció a 3 kV y el voltaje de cono de muestra a 40 V. Se promediaron los escaneos cada 0,9 segundos en un escaneo; el tiempo entre escaneos fue 0,1 segundo. El analizador Q-Tof escanea de m/z 800 a 2500. Los espectros correspondientes a la parte más alta que la mitad de la altura máxima del pico (en el cromatograma TIC) se combinan usando el software Waters MassLynxTM. El espectro combinado se sometió a desconvolución Waters MaxEnt 1. La resolución se estableció a 1 Da/canal, y se seleccionó el modelo gaussiano uniforme de deterioro con anchura a la mitad de la altura establecida entre 0,5-1 Da. Las proporciones de intensidad mínima para el pico izquierdo y el pico derecho se establecieron ambas al 50%.
Análisis de oligosacáridos ligados a N por cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM) usando carbono grafitado poroso (PGC): Los oligosacáridos aislados se separaron en una columna grafitada porosa (Thermo Hypercarb; 4,6 x 100 mm) usando un sistema de HPLC Waters Alliance 2695 equipado con un detector con serie de fotodiodo Waters 2996. La separación de los oligosacáridos se consiguió usando un gradiente de dos fases de proporciones crecientes de acetonitrilo en TFA al 0,05%. En la primera fase del gradiente, el porcentaje de acetonitrilo varió del 9,6% en el momento de la inyección hasta el 24% a los 80 minutos. En la segunda fase del gradiente, el porcentaje de acetonitrilo varió del 24% a los 80 minutos hasta el 60% a los 110 minutos. Se usó un caudal de 0,2 ml/minuto todo el tiempo. La corriente de elución se controló por detección UV a 206 nm y se analizó por espectrometría de masas usando un Waters MicroMass Q-Tof microTM para la identificación de masas.
Análisis de carbohidratos por el procedimiento de CL/EM con PGC: El aislamiento de oligosacáridos por desglucosilación de la proteína se realizó por hidrólisis enzimática usando PNGasa F (New England Biolabs, Beverly, MA). Para la desglucosilación, se desnaturalizaron entre 1 y 2 mg de glucoproteína en 160 ∀l de tampón fosfato sódico 50 mM que contenía Rapigest SF (Waters Corporation) al 0,15% (p/v) calentando a 100 ºC durante 2 minutos. La solución enfriada se mezcló y se añadieron 40 ∀l de PNGasa F (50.000 U/ml, en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,5). La muestra se agitó en vórtice seguido de incubación a 38 ºC durante 24 horas. Los oligosacáridos liberados enzimáticamente se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución. Se realizó cromatografía líquida en fase inversa en una columna Phenomenex Luna 5 ∀l C18 (4,6 x 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA) acoplada con un Thermo HyperCarb 5 ∀l (4,6 x 100 mm, Phenomenex, Torrance, CA) a un caudal de 1,0 ml/min. Las columnas se equilibraron con ácido triflouroacético (TFA) al 0,05% antes de la inyección. Después de la inyección de muestra (150 ∀l de la mezcla de digestión), se inició un gradiente de acetonitrilo terminando a los 15 minutos y una composición disolvente de TFA al 0,05% en acetonitrilo al 12%. Los glucanos después se eluyeron de la columna HyperCarb lavando con TFA al 0,05% en acetonitrilo al 60%. Los glucanos se detectaron por absorbancia UV a 206 nm. Los picos eluido del lavado de Hypercarb se recogieron y se concentraron a sequedad al vacío. Antes de las posteriores inyecciones, se limpió la columna Luna C18 con TFA al 0,05% en acetonitrilo al 40%, isopropanol al 40%, agua al 20%.
Perfilado de oligosacáridos aislados con PGC
El sistema usado para la cromatografía con PGC de los oligosacáridos aislados consistía en un Waters Alliance equipado con un detector de serie de fotodiodo Waters 2996 utilizando una columna Hypercarb (2,1 x 100 mm). Las muestras de oligosacárido se eluyeron usando un gradiente de acetonitrilo.
Elución en fase móvil ácida: Gradiente de acetonitrilo en ácido triflouroacético (TFA) al 0,05%. Se usó un gradiente de dos fases de acetonitrilo creciente para la separación cromatográfica de los oligosacáridos. El gradiente lineal inicial de porcentaje volumétrico creciente de acetonitrilo del 9,6% en el momento de la inyección hasta el 24% a los 80 minutos va seguido de un segundo gradiente de porcentaje volumétrico creciente de acetonitrilo del 24% a los 80 minutos hasta el 60% de acetonitrilo a los 110 minutos. Se usó un caudal de 0,15 ml/min para todo el gradiente. La corriente de elución se controló a 206 nm con un detector UV Waters, seguido de un Micromass Q-Tof Micro para la identificación de masas. Los parámetros de ionización para la sonda IEN se establecieron del siguiente modo: Voltaje capilar = 3 kV, voltaje de cono = 45 V, temperatura de la fuente 80 ºC, y temperatura de desolvatación de 175 ºC.
Elución en fase móvil básica: Se usó un gradiente de acetonitrilo en hidróxido de amonio (NH4OH) al 0,4% para la separación cromatográfica de los oligosacáridos. Se usó un gradiente lineal de porcentaje volumétrico creciente de acetonitrilo del 10,4% en el momento de la inyección hasta el 28% a los 150 minutos a un caudal de 0,15 ml/min para producir el perfil. La corriente de elución se controló a 206 nm con un detector UV Waters, seguido de un Micromass Q-Tof Micro para la identificación de masas. Los parámetros de ionización para la sonda IEN se establecieron del siguiente modo: Voltaje capilar = 3 kV, voltaje de cono = 45 V, temperatura de la fuente 80 ºC, y temperatura de desolvatación de 175 ºC.
Perfilado directo de las mezclas de digestión de oligosacárido con PGC: El sistema usado para la cromatografía con PGC de mezclas de digestión de oligosacárido consistía en un Waters Alliance equipado tanto con una columna Luna C18 como con una de grafito poroso Hypercarb (4,6 x 100 mm, Thermo). El sistema acopló con un detector de serie de fotodiodo Waters 2996 y un Q-ToF Micro (Micromass). La desglucosilación de la proteína se realizó por hidrólisis enzimática usando PNGasa F. Para la desglucosilación, se desnaturalizaron entre 1 y 2 mg de glucoproteína en 160 ∀l de tampón fosfato sódico 50 mM que contenía un 0,15% en peso de Rapigest SF (Waters Corporation), calentando a 100 ºC durante 2 minutos. La solución enfriada se mezcló bien y se añadieron 40 ∀l de PNGasa F (50.000 U/ml, en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,5). La muestra se mezcló y después se incubó a 38 ºC durante 24 h. Los oligosacáridos liberados enzimáticamente se perfilaron por cromatografía líquida de alta resolución. Se realizó cromatografía líquida en fase inversa en una columna Phenomenex Luna 5|u C18 (4,6 x 150 mm) acoplada con una columna Thermo HyperCarb 5 ∀l (4,6 x 100 mm) a un caudal de 1,0 ml/min. Las columnas se equilibraron con ácido triflouroacético (TFA) al 0,05%. Después de la inyección de muestra (150 |il de mezcla de digestión) se inició un gradiente de acetonitrilo, terminando a los 11 minutos y una composición de disolvente de TFA al 0,05% en acetonitrilo al 9%. Se usó un conmutador de columna para aislar la columna hypercarb y después se eluyen los glucanos de la columna HyperCarb con un gradiente lineal de porcentaje creciente de acetonitrilo. Se usó un gradiente inicial de porcentaje creciente de acetonitrilo del 9% en el momento de la inyección hasta el 36% a los 160 minutos. El segundo gradiente implicó un porcentaje volumétrico creciente de acetonitrilo del 36% a los 160 minutos hasta un 60% de acetonitrilo a los 170 minutos. Se usó un caudal de 0,15 ml/min en todos los gradientes de elución. Los glucanos se detectaron por absorbancia UV a 206 nm, y por EM escaneando el intervalo de masas de 400 -3000 m/z. Los parámetros de EM se establecieron a los siguiente valores: Capilar 3 kV, cono 45 V. Antes de las posteriores inyecciones, se limpió la columna Luna C18 con TFA al 0,05% en acetonitrilo al 40%, isopropanol al 40%, agua al 20%.
Análisis por cromatografía con carbono grafitado poroso: Las estructuras de los oligosacáridos de los dominios I-IV se investigaron usando cromatografía con carbono grafitado poroso (PGC) acoplada a EM. Se aislaron los oligosacáridos ligados a N de CTLA4-Ig y se purificaron como se describe en la sección HPAEC-PAD previa. Los oligosacáridos se analizaron usando una columna Hypercarb (PGC) con un detector UV seguido de IEN/EM Q-TOF. El perfil PGC para los oligosacáridos ligados a N liberados de CTLA4-Ig por digestión con PNGasa F se muestra en la FIG. 56 con los dominios indicados. El orden de elución es el mismo que el observado en HPAEC-PAD. Las estructuras obtenidas se muestran en la Tabla 60.
La nomenclatura para nombrar los oligosacáridos presentados en la Tabla 60 se muestra a continuación:
El área sombreada de gris muestra la estructura central del oligosacárido ligado a N, donde P indica digestión con PNGasa F, y los posteriores dígitos describen la cantidad de restos de manosa (círculo), fucosa (triángulo apuntando hacia abajo), galactosa (triángulo apuntando hacia la derecha), y ácido siálico (estrella), respectivamente. La N-acetil glucosamina (GlcNAc) se representa mediante un cuadrado.
15 Tabla 60. Estructuras de oligosacáridos ligados a N y masas detectadas en CTLA4-Ig
Estructura
Masa esperada(Dalton) Masa observada (Dalton)
Asialilado
P2100
1463 1576 [M-H]. TFA
P2110
1625 1738 [M-H]. TFA
P2120
1787 1900 [M-H]. TFA
Monosialilado
P2111
1916 1915 [M-H]
(continuación)
Estructura
Masa esperada(Dalton) Masa observada (Dalton)
Monosialilado
P2121
2078 2077 [M-H]-
P3131
2443 1279 [M-2H]2-
Disialilado
P2122
2369 1184 [M-2H]-2
P3132
2734 1367 [M-2H]-2
P4142
3099 1549 [M-2H]-2
Trisialilado
P3133
3025 1512 [M-2H]-2
P4133
3389 1695 [M-2H]-2
En el dominio I, se identificaron seis picos, correspondientes a tres oligosacáridos asialilado (estructuras P2100, P2110, P2120). La diferencia de masa de 113 Dalton entre la estructura predicha y la masa observada se debe a la detección de un aducto de ácido trifluoroacético (TFA). Diferentes pucos con la misma masa de 1.463 correspondiente a P2100, indica que son anómeros probablemente diferentes.
En el dominio II, se identificaron seis picos, correspondientes a tres oligosacáridos de dos antenas y de tres antenas (estructuras P2111, P2121, y P3131, respectivamente), conteniendo cada uno un resto de ácido siálico (ácido Nacetilneuramínico, NANA).
En el dominio III, se identificaron seis picos, correspondientes a tres oligosacáridos de dos antenas, de tres antenas y de cuatro antenas (estructuras P2122, P3132, y P4142, respectivamente), conteniendo cada uno dos restos de ácido siálico (NANA).
En el dominio IV, se identificaron dos picos, correspondientes a dos oligosacáridos de tres antenas y de cuatro antenas (estructuras P3133 y P4133), conteniendo cada uno tres restos de ácido siálico (NANA).
Medición de la proporción molar de moles de ácido siálico a moles de moléculas o dímeros CTLA4-Ig por tratamiento por hidrólisis ácida de moléculas de CTLA4-Ig (véanse las FIG. 25 y 26): En este procedimiento, se escinden NANA y NGNA de la proteína por hidrólisis ácida. El NANA y NGNA liberados se separan por HPLC en una columna Rezex Monosaccharide RHM y se detectan por absorbancia UV (206 nm). Se cuantifican el NANA y NGNA en base a los factores de respuesta de patrones NANA y NGNA procesados simultáneamente. Los resultados de ensayo se presentan como proporciones molares (MR) de NANA y NGNA respectivamente, a proteína. Este ensayo determina la cantidad total de moles, unidos y no unidos, de ácido siálico.
Reactivo, instrumentación y condiciones cromatográficas usadas en el ensayo: ácido sulfúrico H2SO4 1 M (solución madre) y tampón de procesamiento de fase móvil H2SO4 5 mM; solución patrón NANA de 1 mg/ ml; solución patrón NGNA de 1 mg/ml. Sistema cromatográfico Alliance -Waters Corporation 2695 Separations Module con inyector automático integrado; columna Rezex monosaccharide RHM-8 micrómetros, 7,8 x 300 mm, Phenomenex, equipado con columna de seguridad de 7,8 x 50 mm, Phenomenex; detector --detector de serie de fotodiodo Waters Corporation 996 o detector de absorbancia de longitud de onda dual Waters Corporation 2487. Parámetros cromatográficos: Flujo --0,600 ml/min; fase móvil --H2SO4 5 mM; volumen de inyección --5 microl; concentración diana --1 mg/ ml; tiempo de procesamiento --25 min; temperatura de columna --40 ºC; temperatura del inyector automático --4 ºC; longitud de onda – 206 nm; tiempo de retención de NANA (dependiente del sistema) -10,8 min. (+ o -1 min.), tiempo de retención de NGNA (dependiente del sistema) -9,8 min. (+ o -1 min.).
Patrón de idoneidad del sistema: Se añaden 50 ∀l cada uno de 1 mg/ml de NANA y NGNA a 900 ∀l de H2O en un recipiente apropiado. Se almacena a 4 ºC durante hasta 3 meses; Patrón de trabajo de ácido N-acetil neuramínico (0,05 mg/ml); Patrón de trabajo de ácido N-glucolil neuramínico (0,05 mg/ml).
Hidrólisis de las muestras y material patrón de CTLA4-Ig: Se diluyen las muestras y el material patrón de CTLA4-Ig hasta 1 mg/ml en H2O para la hidrólisis. Se hidrolizan las muestras de CTLA4-Ig y el material patrón de CTLA4-Ig añadiendo 10 ∀l de H2SO4 1 M a 190 ∀l de muestras diluidas a 1 mg/ml y CTLA4-Ig. La hidrólisis se realiza por duplicado en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se fijan las tapas con cierres o cinta. Los tubos se mezclan por agitación con vórtice y se colocan en bloque de calentamiento a 80 ºC durante 1 h. Después de incubación, los tubos se retiran del bloque de calentamiento, se enfrían hasta temperatura ambiente durante 3 min., y se colocan en la centrífuga para una rápida centrifugación para recoger la muestra en el fondo del tubo. De los tubos, se hacen alícuotas de 50 ∀l de la solución hidrolizada en un vial de muestra, que se coloca en el inyector automático refrigerado para inyección. Se hace un blanco de hidrólisis como una preparación única añadiendo 10 ∀l de H2SO4 1 M a 190 ∀l de agua en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. El blanco se procesa como la muestras.
Idoneidad del sistema: Para comprobar la idoneidad del sistema, se inyectaron seis inyecciones replicadas del patrón de idoneidad del sistema (5 ∀l cada una) seguido de una inyección del blanco de hidrólisis (5 ∀l). Usando la última inyección de patrón de idoneidad del sistema, los valores aceptables de resolución (R) son mayores del 1,3, y el recuento teórico de placas aceptable de placas teóricas (N) debe ser de al menos 4000, que se calcularon respectivamente. Usando las últimas cinco réplicas de idoneidad del sistema, se calculó la reproducibilidad de los recuentos de NANA, y se evaluó el blanco de hidrólisis.
Resolución: Usando la última inyección de patrón de idoneidad del sistema, se calculó la resolución del pico usando la siguiente ecuación: R=2(T2-T1)/(W2+W1), donde R es la resolución, T2 es el tiempo de retención del pico de NANA (pico 2), T1 es el tiempo de retención del pico de NGNA (pico 1), W2 es la anchura en la línea basal de las líneas trazadas tangentes a los laterales del pico 2, W1 es la anchura en la línea basal de las líneas trazadas tangentes a los laterales del pico 1. La FIG. 25 representa una inyección típica de idoneidad del sistema.
Placas teóricas (N): Usando la última inyección de patrón de idoneidad del sistema, se calculó el recuento de placas teóricas (N) usando la siguiente ecuación: N=16(TR2/W), donde N es el recuento de placas teóricas, TR es el tiempo de retención del pico de NANA en minutos, W es la anchura en la línea basal de las líneas trazadas tangentes a los laterales del pico de NANA.
Las últimas cinco inyecciones del patrón de idoneidad del sistema se usaron para calcular los recuentos de área promedio y su desviación típica para NANA. La desviación típica relativa fue igual o menor del 3%. El blanco de hidrólisis estaba libre de cualquier pico significativo con el tiempo de retención de NANA y NGNA.
Secuencia de inyección: Se inyectó una inyección de cada uno de los patrones de trabajo de NANA y NGNA, seguido del material de muestra de CTLA4-Ig hidrolizado (muestras duplicadas), seguido del material de CTLA4-Ig hidrolizado. Después de completarse los procesamientos de CTLA4-Ig, se inyectó una inyección de cada uno de los patrones de trabajo de NANA y NGNA.
Para determinar los moles de NANA o NGNA inyectados en el patrón de trabajo, se usa la siguiente ecuación: moles de NANA o NGNA= (C)(P)(I)/PM, donde C es la concentración de NANA y NGNA en el patrón de trabajo, P es la pureza del patrón, I es el volumen de inyección, PM es el peso molecular (309,2 g/mol para NANA, y 325,3 g/mol para NGNA).
Para determinar los moles de NANA y NGNA en las muestras de CTLA4-Ig, se usa la siguiente ecuación: moles de NANA o NGNA en la muestra=(X)(Y)/Z, donde X es la cantidad de moles en el patrón de trabajo de NANA y NGNA, Y es el recuento promedio de NANA y NGNA en la muestra de CTLA4-Ig, Z es el área promediada de NANA y NGNA duplicados en los patrones de trabajo. A partir de las inyecciones duplicadas de los patrones, los recuentos de área del patrón de NANA y NGNA deben ser menores del 10% DTR.
Para determinar la cantidad inyectada en cada muestra, se usa la siguiente ecuación: moles de proteína=(C)(D)(I)/PM, donde C es la concentración de dímero CTLA4-Ig en g/ml (obtenida a partir de análisis UV), D es la dilución para la hidrólisis (0,95), I es el volumen de inyección (0,005 ml) y PM es el peso molecular de dímero CTLA4-Ig determinado a partir de espectrometría de masas (92.439 g/mol).
La proporción molar (MR) de NANA o NGNA a la proteína CTLA4-Ig se calcula mediante la siguiente ecuación: MR=A/B, donde A es la cantidad de moles de NANA o NGNA, y B es la cantidad de moles de moléculas o dímero CTLA4-Ig.
La proporción molar (MR) de ácido siálico, NANA y NGNA, a la proteína CTLA4-Ig se calcula mediante la siguiente ecuación: MR=(A+B)/C, donde A es la cantidad de moles de NANA, B es la cantidad de moles de NGNA, y C es la cantidad de moles de moléculas o dímero CTLA4-Ig. Los duplicados de las muestras de CTLA4-Ig y el material patrón de CTLA4-Ig deben tener menos del 10% DTR en las proporciones molares para NANA.
Linealidad de las respuestas determinada por el procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: Se demostró que las respuestas de NANA eran lineales con respecto a las concentraciones de patrón de NANA en el intervalo de 0,5 ∀g/ml (~0,1% nominal de patrón de NANA = NANA~QL) a 98,7 ∀g/ml (-200% nominal de patrón de NANA). Se demostró que las respuestas de NGNA eran lineales para las concentraciones de patrón de NGNA en el intervalo de 5,0 ∀g/ml (-10% nominal de patrón de NGNA) a 82,0 ∀g/ml (-160% nominal de patrón de NGNA).
Las respuestas de NANA a partir de material CTLA4-Ig hidrolizado son lineales con respecto a concentraciones de proteína en el intervalo de 0,25 mg/ml (25% nominal de carga de CTLA4-Ig) a 2,0 mg/ml de CTLA4-Ig (200% nominal de carga de CTLA4-Ig). Las respuestas de NGNA a partir de material CTLA4-Ig hidrolizado son lineales para las concentraciones de proteína en el intervalo de 0,25 mg/ml (25% nominal de carga de CTLA4-Ig) a 2,0 mg/ml de CTLA4-Ig (200% nominal de carga de CTLA4-Ig).
Precisión del procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: La precisión se demostró para material CTLA4-Ig (1 mg/ml) con adiciones de patrones de NANA o NGNA.
Precisión del procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: Los experimentos de validación demostraron la precisión del instrumento (%DTR lt; 3%), la repetibilidad para las preparaciones de muestra (%DTR lt; 4%) y la reproducibilidad entre las diferentes preparaciones de muestra, diferentes días, diferentes instrumentos y diferentes analistas (%DTR lt; 6% para NANA, %DTR lt; 12% para NGNA). Se consideró que las proporciones molares de NANA y NGNA eran precisas dentro de un intervalo del 10% y 20%, respectivamente, de los resultados presentados.
Intervalo del procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: Se demostró que el intervalo de trabajo para este ensayo era de 0,49 mg/ml a 3,87 mg/ml de material CTLA4-Ig.
Límite de detección (LD) del procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: Los valores individuales de DL para los patrones de NANA y NGNA usando un detector de serie de fotodiodo (PDA; sistema de HPLC 1) fueron 0,464 ∀g/ml y 0,402 ∀g/ml, respectivamente; los valores individuales de DL para NANA y NGNA usando detector de longitud de onda dual (sistema de HPLC 2) fueron 0,131 ∀g/ml y 0,111 ∀g/ml, respectivamente. El LD del procedimiento, para ambas especies siálicas y en base al uso del detector menos sensible, fue 0,5 ∀g/ml para NANA y NGNA.
Límite de cuantificación (LC) del procedimiento de hidrólisis para medir el contenido de ácido siálico: Los valores individuales de LC para los patrones de NANA y NGNA usando un detector de serie de fotodiodo (PDA; sistema de HPLC 1) fueron 1,68 ∀g/ml y 1,52 ∀g/ml, respectivamente; los valores de LC para NANA y NGNA usando un detector de longitud de onda dual (sistema de HPLC 2) fueron 0,48 ∀g/ml y 0,41 ∀g/ml, respectivamente. El LC del procedimiento, para ambas especies de ácido siálico y en base al uso del detector menos sensible, fue de 1,7 ∀g/ml para NANA y NGNA.
Robustez/solidez: Se demostró que el procedimiento es robusto con respecto a la estabilidad de la solución de muestra 48 horas refrigerada, el uso de diferentes columnas, el uso de diferentes lotes de NANA y NGNA y el uso de fases móviles con ± 5% de alteración de concentración.
Electroforesis en gel de EIE: El pI de la glucoproteína también puede medirse, antes y después del tratamiento con neuraminidasa, para retirar los ácidos siálicos. Un aumento en el pI después del tratamiento con neuraminidasa indica la presencia de ácidos siálicos en la glucoproteína. Puede usarse un gel de EIE para determinar el punto isoeléctrico, la cantidad de isoformas de CTLA4-Ig. Un sistema adecuado para procesar un gel de EIE es el sistema de electroforesis Multiphore II, y un gel de EIE de pH 4,0 a 6,5 (Amersham Biosciences). El tampón de ánodo tiene la siguiente composición: ácido glutámico 0,1 M en ácido fosfórico 0,5 M. El tampón de cátodo tiene la siguiente composición: beta-alanina 0,1 M. El gel de EIE se pre-enfoca a potencia (25 vatios) y corriente (25 mAmp) constantes hasta que el voltaje alcanza ∗ 300 V. Los patrones de calibrado de EIE y las muestras de la concentración apropiada se cargaron y se procesó el gel a potencia (25 vatios) y corriente (25 mAmp) contantes con un máximo de 2000 V durante 2,5 horas. Después de la fijación y la tinción con azul de Coomassie del gel de EIE, se visualizan las bandas de proteína por densitometría. Se muestra un gel de EIE típico de la preparación de dímero CTLA4-Ig en la FIG. 11.
Ejemplo 4: Aislamiento y caracterización de la cadena sencilla (monómero) de CTLA4-Ig
Preparación de CTLA4-Ig de cadena sencilla nativa: Las muestras de proteína recombinante CTLA4-Ig preparada por los procedimientos de la invención se separaron por CET no desnaturalizante usando Alliance 2695 HPLC (Waters, Milford, MA) en dos columnas preparativas TSK Gel® G3000SWXL de 21,5 x 300 mm (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA) en tándem. Se separaron treinta inyecciones (1,0 ml cada una) de la muestra a ~ 50 mg/ml en condiciones isocráticas usando una fase móvil que consistía en NaH2PO4 0,2 M, NaCl al 0,9%, pH 7,0, a un caudal de 1,0 ml/min. Las muestras se controlaron a una absorbancia de 280 nm usando un detector de Water's 2996 PDA. El análisis se realizó usando el software Waters Millennium 4.0TM y Empower Pro©. Se recogieron las fracciones (1,0 ml cada una) en un colector de fracciones automatizado Foxy 200 desde 90 hasta 150 minutos. Las fracciones 16 a 39 (comenzando en 105 ml y acabando en 129 ml) se combinaron y se concentraron usando concentradores Centricon con un punto de corte de 3.500 PM.
La muestra (2,0 ml a ~ 4 mg/ml) se sometió a cromatografía adicional en condiciones desnaturalizantes usando una columna de calidad preparativa HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a un causar isocrático de 2,0 ml/min usando NaH2PO4 200 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M a pH 6,0 como fase móvil en un ÄKTAexplorerTM (Amersham Biosciences). Se recogieron las fracciones 12-16, se combinaron, se intercambió el tampón en NaH2PO4 200 mM, pH 6,0 usando una columna de desalación HiPrep 26/10 (Amersham Biosciences), y finalmente se concentraron.
Preparación de CTLA4-Ig de cadena sencilla inducida: Se preparó CTLA4-Ig de cadena sencilla inducida a través de la desnaturalización, reducción y alquilación de la proteína recombinante CTLA4-Ig preparada por los procedimientos descritos en el presente documento. Se pesó clorhidrato de guanidina (0,684 g) en un tubo de centrífuga Eppendorf de 1,5 ml, y se añadieron 512 ∀l de NaH2PO4 200 mM pH 6,0, y se agitaron con vórtice hasta que el clorhidrato de guanidina se disolvió completamente. La proteína recombinante CTLA4-Ig se desnaturalizó mediante la adición de 238 ∀l de material de CTLA4-Ig (concentración: 50 mg/ml) en el tubo anterior y se agitó con vórtice, dando como resultado una concentración final de CTLA4-Ig de ~ 10,0 mg/ml en clorhidrato de guanidina 6,0
M. La proteína desnaturalizada se redujo mediante la adición de 2,6 ∀l de DTT 1,0 M e incubando a 37 ºC durante 90 minutos. A continuación, la proteína reducida se alquiló mediante la adición de 0,047 g de yodoacetamida sólida en la mezcla de la muestra, seguido por agitación con vórtice, y una incubación a 37 ºC durante 60 minutos en la oscuridad. La muestra (2,0 ml a ~ 4,0 mg/ml para cada inyección) se cromatografió en condiciones desnaturalizantes usando una columna de calidad preparativa HiLoad 26/60 Superdex 200 a un caudal isocrático de 2,0 ml/min usando NaH2PO4 200 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M a pH 6,0 en un ÄKTAexplorerTM. Se recogieron las fracciones de cadena sencilla resultantes (9-12), se combinaron, se intercambió el tampón en NaH2PO4 200 mM, pH 6,0 en una columna de desalación HiPrep 26/10, y se concentraron.
Análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF de CTLA4-Ig de cadena sencilla virgen e inducida: Las muestras de cadena sencilla (20 ∀l) se desalaron y se concentraron con C4 ZipTips (Millipore, Billerica, MA), después se eluyeron con 20 ∀l de acetonitrilo al 80% con TFA al 0,1% saturado con ácido sinapínico. La mezcla (1,0 ∀l) se aplicó puntualmente en un pocillo de la placa de muestra MALDI y se dejó secar al aire antes de colocarse en el espectrómetro de masas. Los espectros MALDI-EM se adquirieron en un espectrómetro de masas OmniFlex (Bruker Daltonics, MA) usando un láser de nitrógeno (337 nm). Las muestras se analizaron en modo de iones positivos reflectantes por extracción retardada usando un voltaje de aceleración de 20 kV y un tiempo de retardo de 200 ns. Se sumó un total de 250 espectros de una sola etapa para cada muestra. La calibración externa se consiguió usando una mezcla de tripsinógeno (23982 m/z), proteína A (44613 m/z), y albúmina bovina (66431 m/z).
Análisis de la cadena sencilla usando cromatografía por exclusión de tamaño desnaturalizante (HCl guanidina): Se prepara el sobrenadante CTLA4-Ig de cultivo celular cultivado y recogido en diferentes puntos durante el transcurso del tiempo para el análisis HPLC. Las muestras se preparan pesando 0,114 g de clorhidrato de guanidina (Mallinckrodt Baker, Inc.) en un tubo de microcentrífuga Eppendorf de 0,65 ml; añadiendo 125 ul de la muestra de CTLA4-Ig en el tiempo, y agitando con vórtice para disolver completamente el HCl de guanidina. Entonces se añade inmediatamente 1,8 ul de yodoacetamida 250 mM y se mezcla, y se incuba a 37 ºC durante 30 minutos.
Se usa una columna en tándem TSK-GEL® G3000SWXL de exclusión de tamaño (7,8 mm DI x 30 cm) con un protector de columna TSK (SWxL, 6,0 mm DI x 4,0 cm) para el análisis CET de la cadena sencilla realizado en el módulo de separación Waters 2695 separaciones con un detector de serie de fotodiodo 2996. Se inyectan 25 ∀l de cada muestra en la columna equilibrada con fosfato sódico 200 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M pH 6,0 como fase móvil. Las proteínas se separan en la columna con una caudal de 0,5 ml/min, y el cromatograma resultante se recoge sobre una ventana de 60 minutos. La integración y cuantificación de los picos individuales (monómero, cadena sencilla, etc.) se realizan usando el software Empower Pro. Para asegurar que el sistema de HPLC está funcionando correctamente, también se hacen inyecciones en la fase móvil, el tampón de muestra de proteína, el patrón de idoneidad del sistema, y el presente material de CTLA4-Ig antes y después de las inyecciones de muestra. Se calculan la resolución del pico y el recuento de placas en el cromatograma del patrón de idoneidad del sistema.
Análisis de la cisteinilación de CTLA4-Ig de cadena sencilla por CL/EM de péptidos: Se desnaturalizó CTLA4-Ig y se redujo en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía guanidina 6 M y ditiotreitol 5 mM (DTT). Después de una incubación de 20 minutos a 50 ºC, se añadió yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 10 mM para alquilar los tioles libres y se continuó la incubación durante 20 minutos adicionales a 50 ºC en la oscuridad. La mezcla reducida y alquilada se cargó en una columna de desalación (Amersham, NAP-5), después se eluyó en el volumen vacío con Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0 o tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,5. Después de la desalación, se digirió CTLA4-Ig reducido/alquilado con dos proteasas diferentes: tripsina o Asp-N. El material CTLA4-Ig también se sometió a digestión con tripsina/quimotripsina sin reducción y alquilación.
Para la digestión con tripsina, se añadió tripsina de calidad secuencia (Promega, 2%, p/p, enzima/proteína) y la mezcla se incubó durante 4 horas a 37 ºC. Para digestión con Asp-N, se añadió Asp-N de calidad secuencia (Roche, 2%, p/p, enzima/proteína) y la mezcla se incubó durante 16 horas a 37 ºC, Para la digestión con tripsina/quimotripsina, se añadió tripsina de calidad secuencia (Promega, 4%, p/p, enzima/proteína) y la mezcla se incubó durante 4 horas a 37 ºC, después se añadió a-quimotripsina (Sigma, 4%, p/p, enzima/proteína) y la mezcla se incubó durante 16 horas a 37 ºC. Todas las muestras se congelaron (-20 ºC) después de la digestión.
Las mezclas de péptidos resultantes se separaron mediante elución en gradiente de una columna Waters AtlantisT M dC18 (2,1 x 250 mm) en una estación de trabajo de HPLC Waters Alliance a 0,12 ml/minuto. La columna se conectó directamente al espectrómetro de masas Waters Micromass Q-Tof microTM equipado con una fuente de nebulización iónica para la recogida de los espectros de masa. Las mezclas de péptidos también se separaron en una columna Varian Polaris C18 (4,6 x 250 mm) a 0,70 ml/minuto usando la misma estación de trabajo de HPLC. Las columnas se equilibraron con disolvente A (TFA al 0,02% en agua) y los péptidos se eluyeron aumentando la concentración de disolvente B (acetonitrilo al 95%/TFA al 0,02% en agua). Se usó una válvula difusora post-columna para dirigir el 15% del flujo a la estación de trabajo Q-TOF, que se procesó en modo positivo TOF (tiempo de vuelo) (m/z 100-2000). El voltaje típico de nebulización iónica usado fue 3000 V.
La pérdida de 113 ! 4 u tras la reducción sugiere que hay una modificación de disulfuro covalente en la proteína. El desplazamiento predicho para cisteinilación es 119,14 u. Sin embargo, se espera una pérdida real de masa de 111,14 u tras la reducción de las especies de cadena sencilla. La pérdida de 119,14 u proviene de la eliminación de una cisteína y la ganancia de 8 u proviene de la adición de 8 protones tras la reducción de las ocho cisteínas intracatenarias (Cys 47,74,92,118,197,157,303,361 de la SEC ID Nº 2). Por tanto, las 113 ! 4 u adicionales en la masa intacta corresponde a cisteinilación con un aminoácido cisteína. La cisteína más probable para ser modificada es Cys146 ya que el enlace disulfuro intercatenario está ausente en la especie de cadena sencilla en base a los datos de MALDI intacto. Usando análisis de péptidos por CL/EM para examinar los péptidos, que contienen Cys146, se encontró que el material reducido y no reducido presentaba diferentes tiempos de retención y masas que el material de cadena sencilla. Para confirmar la cisteinilación, el péptido de cadena sencilla que contiene Cys146 se recogió y analizó usando MALDI.
El pico recogido que contenía Cys146 tiene una masa de 1787,48 u, de acuerdo con la masa predicha de 1787,51 u para el péptido con un cisteinilación de Cys146 (FIG. 27, panel A). Este péptido, después de someterse a reducción, pierde 119,11 u de acuerdo con una pérdida prevista de 119,14 u; la pérdida de cisteína (FIG. 27, panel B). El material entonces se manipula adicionalmente con yodoacetamida produciendo un desplazamiento de 56,99 u de acuerdo con una ganancia de masa prevista de 57,03 u (FIG. 27, panel C).
Ejemplo 5: Manipulación de la formación de CTLA4-Ig monomérico o multimérico
Efectos agonistas de los medios y los componentes de los medios sobre la formación de cadena sencilla: Los efectos agonistas de los diferentes medios y componentes de los medios se determinan para la formación de cadena sencilla. Pueden incubarse moléculas de CTLA4-Ig a 37 ºC con diversos medios y los constituyentes individuales de los medios durante un período de 60 horas y pueden analizarse para la formación de cadena sencilla por CET desnaturalizante en columna en tándem. Se halla una respuesta agonista abrumadora para la formación de cadena sencilla después de la adición de cisteína 10 mM al tampón de formulación. Hay un rápido aumento en la formación de cadena sencilla, que es máxima en torno a seis horas después de la adición de cisteína. Esta respuesta disminuye gradualmente durante las restantes 56 horas. Además, el suministro de +gal al 30% afectó a un aumento más gradual pero todavía relativamente rápido en la formación de cadena sencilla. El suministro de +gal al 30% es una composición de galactosa y 117E. Esta mezcla se añade cada día para alimentar a las células. Aunque en este experimento se introdujo cisteína en cantidades artificialmente grandes independientes de 117E, existe la necesidad de determinar cuál de los componentes 117E puede estar implicado en la formación de cadena sencilla.
Los componentes específicos de 117E y otros medios se incuban con CTLA4 Ig durante un período de 60 horas y se analizan para la formación de cadena sencilla por CET desnaturalizante en columna en tándem. La investigación en este medio se centra en los posibles componentes reductores de disulfuro y/o inhibidores, que producirían la formación de cadena sencilla en base a experimentos previos que muestran que el disulfuro intercatenario no está presente. Se ensayaron los constituyentes de 117E que se sabe que tienen algunos efectos reductores sobre los disulfuros; ácido lipoico, cistina, cisteína, metionina, y glutatión. De nuevo, se halla una respuesta agonista abrumadora para la formación de cadena sencilla tras la adición de cisteína al tampón de formulación. Hay una respuesta rápida en la formación de cadena sencilla, que es máxima en torno a seis horas después de la adición de cisteína. Esta respuesta disminuye gradualmente durante las restantes 56 horas. La mayor formación de cadena sencilla sucede con medios que contienen cisteína: cisteína, yeastolate y medios de fermentación. Los otros componentes que contienen azufre tales como metionina y glutatión tienen de ninguno a poco efecto sobre la formación de cadena sencilla. No se observan efectos del cloruro de amonio.
Puede proporcionarse una proporción de forma de cadena sencilla:dimérica de una proteína, siendo capaz dicha proteína de existir en forma dimérica así como en forma de cadena sencilla, mediante un procedimiento que comprende las etapas de (1) proporcionar y/o el mantener (tal como durante la etapa (2)) un medio de cultivo celular líquido para el cultivo de células que expresan dicha proteína, en que la concentración de un agente capaz de reducir o inhibir la formación de dímeros (tal como cisteína) se selecciona para proporcionar dicha proporción, y (2) cultivar dichas células para expresar dicha proteína. La adición y/o el aumento de la concentración de dicho agente (por ejemplo, cisteína) en un medio de cultivo celular líquido proporciona una mayor proporción de forma de cadena sencilla:dimérica de dicha proteína, mientras que la retirada, disminución o eliminación de la concentración de dicho agente (por ejemplo, cisteína) en un medio de cultivo celular líquido disminuye la proporción de forma de cadena sencilla:dimérica de dicha proteína.
Dicha proteína es una glucoproteína con capacidad de formación de dímeros a través de la formación de un enlace disulfuro intercatenario, concretamente una molécula CTLA4-Ig descrita en el presente documento.
Efectos agonistas de la elevada salinidad sobre la formación de alto peso molecular: Durante el procedimiento de purificación, CTLA4-Ig se expone a altas concentraciones salinas durante cantidades variables de tiempo. Los efectos de altas concentraciones salinas se determinan para la formación de alto peso molecular. CTLA4-Ig (a ~ 50 mg/ml) se incuba en presencia de fosfato sódico 500 mM, pH = 6,0, 37 ºC. Existe un efecto agonista a altas concentraciones de fosfato sódico; se observa un rápido aumento sostenido en las formas de alto peso molecular, principalmente tetrámeros, durante un periodo de 100 horas.
La proporción de forma agregada: dimérica de una proteína, tal como una proteína capaz de existir en agregados, así como en forma dimérica, puede reducirse durante el procesamiento (tal como durante la purificación) de dicha proteína, mediante un procedimiento que comprende el uso de uno o más líquidos que son soluciones salinas no agregadas. Una quot;solución salina no agregadaquot; se refiere a un líquido que contiene una concentración de sal disuelta en el mismo que es, en relación con el mismo líquido que contiene una mayor concentración de dicha sal, menos agonística en la formación de agregados.
Dicha proteína es una glucoproteína con capacidad de formación de dímeros a través de la formación de un enlace disulfuro intercatenario, concretamente las moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento.
Efectos antagonistas sobre la formación de cadena sencilla: Los experimentos previos de modelado demostraron un efecto grande y rápido sobre la formación de cadena sencilla mediante la adición de componentes que contienen cisteína. La cisteína es un aminoácido que contiene un sulfhidrilo libre. Si el sulfhidrilo está implicado en la formación de cadena sencilla, debe bloquearse a través del uso de compuestos antagonistas. Uno de dichos compuestos es yodoacetamida. La yodoacetamida es un compuesto soluble en agua que reacciona de una manera rápida con cualquier sulfhidrilo libre para formar un enlace tioéter irreversible. Se incuba CTLA4-Ig a 37 ºC con diversos medios, cisteína, y yodoacetamida durante un período de 60 horas y se analiza para la formación de cadena sencilla por CET desnaturalizante en columna en tándem y para el elevado PM por CET no desnaturalizante en columna en tándem. La yodoacetamida no solamente bloquea la formación de cadena sencilla, sino que también bloquea la formación de agregados tanto en una composición de CTLA4-Ig como en alta concentración salina. La yodoacetamida no bloquea la formación de agregados en baja concentración de monómeros de ácido siálico. Sin embargo, la cantidad de agregado formado en material de baja concentración de ácido siálico es comparable a la cantidad formada en la composición de CTLA4-Ig.
El modelo proporciona una idea de un mecanismo que previamente no se ha comprendido bien. Parece que hay al menos dos vías principales de formación de agregados en el proceso de CTLA4-Ig que se han identificado. En la primera vía, que produce gran cantidad de agregados, la cisteína del sulfhidrilo libres actúa como agonista para la formación de especies de cadena sencilla. El efecto agonístico de la cisteína puede bloquearse mediante la adición de yodoacetamida. Sorprendentemente, la yodoacetamida no solamente es un antagonista para la formación de cadena sencilla, sino también para la formación de alto peso molecular. Debe apreciarse que el procedimiento está diseñado para producir una composición que contenga una cantidad aumentada de ácido siálico en comparación con la fermentación durante la purificación corriente abajo. En una segundo vía, que produce mucho menos agregado, una subespecie que contiene bajas cantidades de ácido siálico no se ve afectada por yodoacetamida para la formación de cadena sencilla o agregado.
La proporción de forma de cadena sencilla:dimérica de una proteína, siendo dicha proteína capaz de existir en forma dimérica así como en forma de cadena sencilla, puede disminuirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de (1) y proporcionar/o el mantener (tal como durante la etapa (2)) un medio de cultivo celular líquido para el cultivo de células que expresan dicha proteína, conteniendo dicho medio un agente antagonista para la formación de cadena sencilla (tal como yodoacetamida), y (2) cultivar dichas células para expresa dicha proteína.
La proporción de forma agregada:dimérica de una proteína, siendo dicha proteína capaz de existir en forma agregada así como dimérica, también puede disminuirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de
(1) proporcionar y/o el mantener (tal como durante la etapa (2)) de un medio de cultivo celular líquido para el cultivo de células que expresan dicha proteína, conteniendo dicho medio un agente antagonista para la formación de cadena agregada y/o antagonista para la formación de cadena sencilla (tal como yodoacetamida), y (2) cultivar dichas células para expresar dicha proteína.
Dicha proteína es una glucoproteína con capacidad de formación de dímeros a través de la formación de un enlace disulfuro intercatenario, concretamente las moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento.
En base a estos datos, no es difícil de imaginar que se inducen al menos dos vías para la formación de agregados en CTLA4-Ig. En la vía principal, está implicada la cadena sencilla en la formación de agregados a través de un mecanismo aún no completamente claro. Una segunda vía minoritaria, que es independiente de la formación de cadena sencilla, está implicada en la formación de agregados. Estas vías pueden ayudar a explicar porqué hay al menos tres formas de especies de alto peso molecular que se pueden separar cromatográficamente. Estos son modelos y deben ensayarse durante el procedimiento de fermentación real para determinar los efectos reales si los hubiera y la magnitud de los mismos. En base a estos datos, debe considerarse ensayar no solamente el procedimiento de fermentación actual sino también la fermentación desprovista de cisteína.
Ejemplo 6: Dímero y tetrámero de CTLA4-Ig
Unión de dímero y tetrámero de CTLA4-Ig a Ig B7-1
En el presente documento se describen procedimientos para la evaluación de la unión de dímeros y tetrámeros de CTLA4-Ig a Ig B7-1. Las características físicas (por ejemplo, coeficiente de difusión, peso molecular, valencia de unión) y los parámetros operativos del instrumento (por ejemplo, caudal, densidad de chip) pueden influir en los resultados del ensayo Biacore. Bajo limitación de transferencia de masa, la tasa de unión del tetrámero es aproximadamente un 20% más lenta que el dímero para la misma concentración molar. A un caudal especificado, es posible que las moléculas de tetrámero penetren en la matriz de forma menos eficaz en comparación con el dímero. A una alta densidad de Ig B7-1 inmovilizado en chip la unión competitiva del tetrámero y el dímero presenta curvas de inhibición comparables. Esto indica que la valencia teórico del tetrámero (cuatro) frente al dímero (dos) no tiene ninguna influencia sobre la unión a Ig B7-1. Las concentraciones molares de tetrámero se pueden calcular en base a una curva patrón de dímero. Usando este enfoque, se encontró que la unión de tetrámero a Ig B7-1 tiene una respuesta dependiente de dosis equivalente en comparación con el dímero.
La comparación de la potencia de unión de un tetrámero y un dímero está influenciada por la unidad de medición usada para la preparación de patrones y muestras. Pueden compararse muestras de tetrámeros y dímeros a una concentración de 2000 ng/ml. En base a la masa (ng/ml), cada especie muestra una potencia de unión de aproximadamente el 100% usando una curva patrón de la misma especie. Sin embargo, la potencia de unión del tetrámero se redujo a la mitad cuando se determinaba sobre una curva patrón del dímero, y la potencia de unión del un dímero era más del doble cuando se determinaba en una curva patrón del tetrámero. Dado que el instrumento Biacore detecta interacciones moleculares en base a la masa, las unidades de resonancia de la señal (UR) de idénticas concentraciones (ng/ml) del dímero y el tetrámero deben ser iguales. Aunque el sistema de detección es una función de la masa, la interacción entre las moléculas se produce sobre una base molar. Por lo tanto, las concentraciones molares de dímero CTLA4-Ig y tetrámero CTLA4-Ig son 21,6 nM y 10,8 nM, respectivamente, a
2.000 ng/ml. Usando la concentración molar, tanto la muestra de dímero CTLA4-Ig como la de tetrámero CTLA4-Ig muestran potencia de unión comparable sobre una curva patrón de dímero. Usando el mismo enfoque de concentración molar en una curva patrón de tetrámero CTLA4-Ig, la muestra de dímero CTLA4-Ig muestra un aumento adicional del 30% en la potencia de unión en comparación con la muestra de tetrámero. Esta observación se debe a una disminución en la pendiente de la curva patrón de tetrámero a altas concentraciones, lo que provoca una mayor concentración calculada para una tasa de unión inicial dada. Una explicación para esta observación es el efecto de la transferencia de masa.
El experimento de limitación de transferencia de masa indica que la tasa de unión inicial del tetrámero CTLA4-Ig es aproximadamente un 20% más lenta que el dímero CTLA4-Ig para la misma cantidad de moléculas (es decir, la tasa de unión del tetrámero difiere del dímero en un factor de 0,8). Esta diferencia observada se debe al peso molecular de las dos especies y su efecto sobre la difusión de las moléculas en la superficie del chip. El coeficiente de difusión de una molécula es inversamente proporcional a la raíz cúbica del peso molecular. Un coeficiente de difusión inferior indicaría un movimiento más lento de las moléculas. En base a los respectivos pesos moleculares, el coeficiente de difusión calculado del tetrámero CTLA4-Ig es 0,8 veces el del dímero CTLA4-Ig, o por el contrario el dímero es 1,25 veces mayor que el del tetrámero. Los datos experimentales son coherentes con esta observación, donde el dímero CTLA4-Ig muestra una potencia del 133% calculada a partir de una curva patrón de tetrámero CTLA4-Ig usando concentraciones molares. Las limitaciones de transferencia de masa en los chips de alta densidad son más pronunciadas en caudales inferiores y a concentraciones más bajas de analito. A medida que aumenta el caudal, el dímero muestra tasas de unión iniciales más rápidas en comparación con el tetrámero. Por lo tanto, el aumento del peso molecular y el menor coeficiente de difusión del tetrámero contribuyen a las diferencias en la tasa unión inicial en comparación con el dímero.
La unión competitiva del tetrámero y el dímero CTLA4-Ig a Ig B7-1 indica que el tetrámero y el dímero muestran valencia de unión similar en condiciones limitadas de transferencia de masa. Los efectos de tetrámero adicional sobre un chip Ig B7-1 inicialmente unido con dímero o tetrámero indican un bajo potencial de unión. Esta observación no se debe a la disponibilidad limitada de sitios de unión porque podría unirse dímero adicional a los chips de Ig B7-1 inicialmente unidos con dímero CTLA4-Ig o tetrámero CTLA4-Ig. La penetración limitada en la matriz puede explicar la disminución observada en la unión del tetrámero.
La naturaleza en que las moléculas se unen en el Biacore afecta a la interpretación de los resultados. Las moléculas de dímero y tetrámero difunden a diferentes tasas debido a sus diferencias en el tamaño molecular en condiciones de limitación de transferencia de masa. Además, el impedimento estérico en la superficie de un chip de alta densidad afecta a la penetración de moléculas posteriores a la matriz.
Las características físicas tales como el peso molecular, el coeficiente de difusión, y la unión de cada especie deben tenerse en cuenta al realizar análisis de concentración en el Biacore. Los patrones usados para la comparación con el analito de interés deben ser del mismo material. Sin embargo, el tetrámero todavía se puede analizar frente a los patrones de dímero si tanto los patrones como las muestras se expresan sobre una base molar, donde se toma en cuenta el tamaño molecular. Los datos presentados indican que la unión del dímero CTLA4-Ig y el tetrámero CTLA4-Ig a Ig B7-1 es comparable.
Tanto el dímero como el tetrámero CTLA4-Ig muestran velocidades de asociación similares (kon). Sin embargo, el tetrámero muestra una velocidad de disociación más lenta (koff) que se atribuye a la avidez debida al aumento en la cantidad de sitios de unión.
Se puede realizar un análisis cinético de la unión entre dos proteínas tales como un ligando y un receptor en el Biacore usando un chip inmovilizado con una baja densidad de ligando de aproximadamente 600 a 800 UR de modo que la capacidad de unión máxima (Rmax) esté en el intervalo de 50-150 UR. El propósito de un chip de baja densidad es minimizar los efectos de la avidez y el transporte de masa. Se observa avidez cuando analitos multivalentes permanecen unidos a la superficie del chip debido a la proximidad de ligandos disponibles ya que sucede disociación de sitios de unión individuales. Se observa transporte de masa cuando hay una diferencia significativa en las concentraciones de analito entre la superficie del chip y la solución a granel.
En una realización, la molécula CTLA4-Ig es un dímero que consisten dos moléculas de cadena sencilla unidas por un único enlace disulfuro intercatenario, y contiene dos sitios de unión para moléculas B7. En otra realización, la formación de tetrámero CTLA4-Ig, según lo confirmado por dispersión de luz, CET y SDS-PAGE, produce una molécula con, potencialmente, cuatro sitios de unión. La cinética de unión de monómero y dímero purificado se comparan estadísticamente con el material de dímero CTLA4-Ig. No hay diferencias significativas en las velocidades kon (valores de pgt; 0,05). La velocidad koff de tetrámero es significativamente diferente de la velocidad koff del dímero.
La velocidad koff del dímero purificado a partir del pico de limpieza de CIH no es significativamente diferente de la velocidad koff del material de dímero CTLA4-Ig. Por lo tanto, el tetrámero se disocia más lento que el dímero, lo que indica un efecto de avidez debido al aumento del número de sitios de unión por molécula.
El tetrámero puede desplegarse y disociarse en dímero por tratamiento con guanidina. Este dímero CTLA4-Ig tratado con guanidina se analizó y los resultados indican que sus características cinéticas de unión eran similares a los del dímero CTLA4-Ig formado en condiciones fisiológicas. Esta observación apoya la hipótesis de que la diferencia observada en la velocidad koff entre el dímero y el tetrámero está relacionada con la valencia de unión de las moléculas y la naturaleza inherente del procedimiento Biacore específico donde la avidez desempeña un papel en la cinética de unión.
Purificación por afinidad del material CTLA4-Ig a partir del pico de limpieza de CIH:
Cromatografía de afinidad con Proteína A-Sepharose: Se filtraron 500 ml del pico de limpieza de CIH a través de un sistema de filtro de 1 l de 0,22 micrómetros (Corning, Corning, NY, pieza Nº 430517) y se cargaron en una columna de rProteína A-Sepharose (5 cm x 15 cm), que se pre-equilibró con solución salina tamponada con fosfato (Sigma, St. Louis, MO, P-4417) a pH 7,4. La columna se lavó con 700 ml de PBS, pH 7,4 y se eluyó con glicina 100 mM, pH 3,5. Las fracciones de 50 ml cada una se neutralizaron durante la recogida mediante la adición de 0,5 ml de Tris 2,0 M, pH 10 a los tubos de recogida. Las fracciones se ensayaron a 280 nm de absorbancia, se combinaron y se concentraron usando un cartucho centriprep YM-3 (Millipore Corporation, Bedford, MA, pieza Nº 4203). La solución de proteína purificada se almacenó a -70 ºC.
Cromatografía de afinidad con PROSEP-rA (Proteína A recombinante): Se filtraron 500 ml de pico de limpieza de CIH a través de un sistema de filtro de 1 l de 0,22 micrómetros (Corning, Corning, NY, pieza Nº 430517) y se cargaron a un caudal de 25 ml/minuto en una columna de alta capacidad PROSEP-rA (Millipore Corporation, Bedford, MA) (25 mm x 28 cm), que se pre-equilibró con Tris 25 mM, pH 8,0 que contenía cloruro sódico 250 mM. Se usó el sistema Waters PrepLC equipado con el gestor de muestras Waters 2767 y el detector de serie de fotodiodo Waters 2996 para esta cromatografía. La columna se lavó con tampón de equilibrado 25 durante 30 minutos a una caudal de 25 ml/minuto y se eluyó con acetato 100 mM, pH 3,0 a un caudal de 25 ml/minuto durante 30 minutos. Las fracciones de 10 ml cada una se neutralizaron durante la elución recogiéndolas sobre 50 ul de Tris 2,0 M, pH 10, que se había añadido previamente a los tubos. Las fracciones que tenían alta absorbancia a 280 nm se combinaron y se concentraron usando un cartucho Centriprep YM-3 (Millopore Corporation, Bedford, MA, pieza Nº 4203). La solución de proteína purificada se almacenó a -70 ºC
Cromatografía por exclusión de tamaño: La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en un módulo de separaciones Waters Alliance 2695 equipado con un detector de serie de fotodiodo Waters 2996 (Milford, MA), y un colector de fracciones Foxy 200 controlado por el software Millennium32 versión 3.20 o Empower. Se usaron columnas en tándem TOSOH BIOSCIENCE (Montgomery, PA) TSK G3000 SW (21,5 mm x 300 mm) y TSK G3000 SWXL (7,8 mm x 300 mm) para CET preparativa y analítica, respectivamente. Las proteínas eluidas se controlaron mediante absorbancia UV a 280 nm.
El aislamiento preparativo de dímeros, tetrámeros y multímeros se consiguió mediante CET del material del pico de limpieza de CIH purificado con Proteína A. Se inyectaron trece muestras (~ 10 mg cada una) de eluato de Proteína A en una columna CET preparativa en tándem usando una fase móvil de tampón fosfato sódico monobásico 100 mM pH 7,0 que contenía cloruro sódico al 0,9% a una caudal de 1 ml/min. Las fracciones se recogieron a cada minuto desde 90-160 minutos para cada una de las trece inyecciones. El tiempo de procesamiento de una única inyección fue de 180 minutos.
Cada fracción se examinó por HPLC de exclusión de tamaño analítica con columna en tándem. Se combinaron las fracciones 13-15 (que contenían multímero), las fracciones 22 y 23 (que contenían tetrámero), y las fracciones 43-49 (que contenían dímero). Las fracciones purificadas de multímero, tetrámero y dímero se examinaron en CET analítica de dos columnas con detección de dispersión de luz dinámica (DSL).
Análisis de unión bioespecífica del componente CTLA4-Ig del pico de limpieza de CIH y componentes purificados a Ig B7-1 inmovilizada: Se midió la unión bioespecífica de CTLA4-Ig a Ig B7-1 inmovilizada (en un chip CM5) usando un biosensor BIAcore C basado en SPR (BIAcore, AB, Piscataway NJ). Se usó el material de CTLA4-Ig para generar la curva patrón. Se inmovilizó Ig B7-1 a una densidad de 5000 a 10000 unidades de resonancia (UR) en un chip sensor CM5 activado. Los patrones de referencia de CTLA4-Ig, los controles de calidad, y las muestras se inyectaron a un caudal de 20 ∀l/min sobre la superficie del chip sensor de Ig B7-1 para generar sensogramas. La tasa de unión inicial (UR/s) de CTLA4-Ig a Ig B7-1 inmovilizada se midió en condiciones de difusión limitada sobre una superficie Ig B7-1 de alta densidad, y esto se correlaciona directamente con la concentración activa de CTLA4-Ig en las muestras. La concentración del patrón, la muestra de control de calidad, y las muestras desconocidas se interpolaron a partir de la curva patrón generada por el trazado de la UR frente a las concentraciones de CTLA4-Ig en el intervalo nominal de 125-8000 ng/ml. Los resultados finales se expresaron como porcentaje de unión (concentración media de desconocida/muestra/2000) x 100.
Determinación de la masa molar y el radio hidrodinámico: La separación CET se realizó con una columna TSK3000 SWXL y una columna de seguridad correspondiente. La fase móvil consistía en HEPES 25 mM, NaCl 850 mM, pH 7,0, usando condiciones isocráticas para la elución a 0,8 ml/min. Los análisis de HPLC se realizaron a temperatura ambiente y las muestras se mantuvieron a 4 ºC durante el análisis. La determinación de la masa molar incorporó el Wyatt Dawn EOS usando 15 diferentes ángulos de dispersión para medir la variación angular de dispersión de la luz para cada especie. Se usó un para gráficos de Zimm para la determinación de la masa molar, donde se promediaron trozos para cada especie para la masa molar. El valor del incremento del índice de refracción específico (dn/dc) usado para calcular la masa molar absoluta fue 0,189 obtenido usando a) y un interferómetro Optilab DSP (RI. La determinación del radio hidrodinámico (Rh) se realizó en línea con un detector Photon Correlator QELS colocado a un ángulo de aproximadamente 90º respecto a la celda de flujo. La constante de difusión traslacional se mide a partir de esta señal y Rh se calcula usando la relación de Einstein-Stokes. El análisis de datos se consiguió usando el software Astra versión 4.90 de Wyatt Technology.
Se encontró que el peso molecular y los valores de los radios hidrodinámicos para las especies de dímero y tetrámero eran de 86-91 kDa y 172-199 kDa, respectivamente. Se observó que las muestras del pico de limpieza contenían especies adicionales de alto PM correspondientes a hexámero y decámero por el peso molecular. El intervalo de los radios hidrodinámicos para la especie dimérica es de 3,8-4,7 nm. Los intervalos de los radios hidrodinámicos de las especies tetraméricas heterogéneas fueron de 5,7 nm a 6,2-6,3 nm.
Unión de dímero y tetrámero CTLA4-Ig a Ig B7-1 usando resonancia de plasmón superficial: Análisis de concentración: Se realizaron análisis de concentración de las diversas especies de CTLA4-Ig para Ig B7-1 en un instrumento Biacore 3000 (Biacore, Piscataway, NJ) de acuerdo con el Procedimiento 7441-42, con modificaciones minoritarias. Las modificaciones incluyen las siguientes: se usó Biacore 3000 en lugar de Biacore C. El caudal fue de 10 ∀l/min en lugar de 20 ∀l/min. La muestra se inyectó durante 60 segundos en lugar de 15 segundos. La superficie del chip sensor se regeneró a 30 ∀l/min mediante tres cortos pulsos de 30 segundos (15 ∀l) de citrato sódico 10 mM, pH 4,0, que contenía NaCl 100 mM (tampón de regeneración), seguido por un pulso de 30 segundos de agua.
Se inmovilizó un chip sensor CM5 con Ig B7-1 a una concentración de 20 ∀g/ml en tampón acetato, pH 5,0, con el objeto de obtener una densidad diana de 6000-12000 unidades de resonancia (UR). Los patrones se prepararon diluyendo en serie material de CTLA4-Ig a concentraciones de 62,5-8000 ng/ml (0,675-86,3 nM) y dímero a concentraciones de 125-16000 ng/ml (0,675-86,3 nM) en tampón HBS-EP. Las muestras de ensayo, que consistían en monómero o dímero, se diluyeron a una concentración diana de ~ 2000 ng/ml y se analizaron en el Biacore. Las concentraciones se determinaron mediante el software BIAevaluation (versión 4.0.1) usando las curvas patrón de material de CTLA4-Ig (gt; 98% de monómero) o dímero purificado. La potencia de unión se calcula como el porcentaje de la concentración determinado en el Biacore dividido por la concentración determinada por A280 nm.
La tasa de unión de una molécula a una superficie dada es una función de la concentración, lo que permite la determinación de concentraciones desconocidas. El dímero CTLA4-Ig muestra una mayor tasa de unión como una función de la concentración (ng/ml) en comparación con el tetrámero CTLA4-Ig.
Las potencias de unión del dímero y el tetrámero CTLA4-Ig se resumen en la Tabla 7. Basado en ng/ml, la potencia de unión de una muestra de dímero se calcula a partir de una curva patrón de dímero y se encuentra que es del 99,5%, mientras que una concentración equivalente de una muestra de tetrámero es del 47,2%. A la inversa, la potencia de unión de una muestra de dímero se calcula a partir de una curva patrón de tetrámero y se encuentra que es del 266%, mientras que una concentración equivalente de una muestra de tetrámero es del 103%. Sin embargo, cuando se expresan el dímero y el tetrámero como concentraciones molares (nM), las potencias de unión de las dos especies son comparables. La potencia de unión de las muestras de dímero y tetrámero, calculada a partir de una curva patrón de dímero es del 99,4% y 94,3%, respectivamente. En una curva patrón de tetrámero, es del 133% y el 103%, respectivamente. Las curvas patrón de dímero y tetrámero son comparables en base a las concentraciones molares.
Tabla 9: Potencias de unión de dímero y tetrámero CTLA4-Ig.
Curva patrón de dímero
Curva patrón de tetrámero
Muestra
ng/ml nM ng/ml nM
Dímero
99,5% 99,4% 266% 133%
Tetrámero
47,2% 94,3% 103% 103%
Valencia de unión: Se premezcló dímero (25-1600 nM) o tetrámero CTLA4-Ig (25-400 nM) en diversas proporciones molares con Ig B7-1 durante tres minutos antes de inyectar 30 ∀l de la mezcla a una caudal de 10 ∀l/min sobre un chip de Ig B7-1 inmovilizado con una densidad de 9,392 UR. El chip se regeneró después de cada inyección mediante tres pulsos de 30 segundos de tampón de regeneración seguido por un pulso de 30 segundos de agua. Se compararon las UR obtenidas al final de cada inyección.
Teóricamente, la valencia de unión de la molécula dimérica es dos; cada cadena sencilla consiste en un sitio de
unión. Una molécula tetramérica consiste en dos moléculas diméricas, y por tanto tiene una valencia de unión de
cuatro. Para determinar la valencia de unión aparente del dímero y el tetrámero, se diseñó un ensayo competitivo y
se realizó en el Biacore 3000. En el experimento, se premezclaron los analitos con Ig B7-1 a diversas proporciones
5 molares durante tres minutos antes de inyectar la mezcla en un chip de Ig B7-1 (9392 UR) a una caudal de 10 ∀l/min
durante un minuto. La Tabla 10 muestra el porcentaje de dímero o tetrámero que se inhibió competitivamente con
cantidades molares crecientes de Ig B7-1. A una proporción molar de 1,25 (Ig B7-1) a 1 (dímero o tetrámero), se
observó una diferencia significativa en la inhibición competitiva con monómero en un 96,1% y dímero en un 84,9%.
Sin embargo, el dímero y el tetrámero muestran curvas de inhibición similares, lo que sugiere que las valencias son 10 aproximadamente iguales. Además, tanto el dímero como el tetrámero también mostraron perfiles de inhibición
similares usando chips de densidad más baja.
Tabla 10: Inhibición de dímero y tetrámero con Ig B7-1.
Dímero (% de inhibición)
Tetrámero (% de inhibición)
Proporción molar de Ig B7-1
N Prom. D.T. N Prom. D.T.
0,02 a 1
1 1,5 n/a 1 3,4 n/a
0,04 a 1
2 1,2 0,2 2 5,1 0,3
0,08 a 1
3 2,9 1,1 3 7,4 0,8
0,16 a 1
4 5,5 0,7 4 12,6 0,9
0,32 a 1
5 14,7 3,3 5 20,9 2,2
0,64 a 1
5 38,1 6,1 4 40,8 3,5
1,25 a 1
5 96,1 2,6 3 84,9 4,6
2,5 a 1
4 99,7 0,1 2 97,5 0,5
5,0 a 1
3 99,9 0,1 1 99,4 n/a
10,0 a 1
2 100,0 0,0 n/a n/a n/a
20,0 a 1
1 100,0 n/a n/a n/a n/a
Saturación del chip Ig B7-1: Inicialmente se inyectó dímero o tetrámero CTLA4-Ig (200, 1000, o 8000 ng/ml) a 10 ∀l/min durante un minuto sobre un chip Ig B7-1 de alta densidad (6738 UR), seguido de una serie de siete
15 inyecciones de 1 minuto con monómero o dímero (200, 1000, o 8000 ng/ml). El chip se regeneró después de cada condición mediante cuatro inyecciones de 25 ∀l de tampón de regeneración seguido por inyección de 25 ∀l de agua. Se compararon las UR obtenidas al final de cada inyección.
Se inyectó repetidamente dímero o tetrámero sobre una superficie de Ig B7-1 pre-recubierta con dímero o tetrámero sin regeneración de la superficie. La unión inicial con tetrámero no impide la unión de las inyecciones posteriores de 20 dímero, sin embargo, inyecciones adicionales de tetrámero provocan una tasa de unión significativamente disminuida en comparación con la inyección de dímero. La unión inicial con dímero seguida por inyecciones posteriores de dímero provoca una unión aumentada hacia la hacia la saturación. La posterior inyección de tetrámero al chip pre-recubierto con dímero muestra una disminución gradual en la unión, lo que indica una disociación de las moléculas del chip y una ausencia de penetración del tetrámero en la matriz. Se observan
25 resultados similares con inyección inicial de 200 ng/ml u 8000 ng/ml de moléculas de CTLA4-Ig.
El tetrámero CTLA4-Ig tiene mayor avidez por el receptor de Ig B7-1: Se purificaron especies de CTLA4-Ig, incluyendo las partes desechadas de columnas de purificación, tales como los picos de limpieza de columnas CIH y QFF y se analizaron sus cinéticas de unión en el Biacore.
Especies de CTLA4-Ig del pico de limpieza de CIH: Se usa la columna de CIH en el proceso de CTLA4-Ig para
30 retirar las especies de alto peso molecular, tales como ADN. Las especies de CTLA4-Ig del pico de limpieza de la columna de CIH pueden usarse para su posterior purificación y análisis cinético. El pico de limpieza de CIH se pasó a través de una columna de Proteína A para capturar todas las especies de CTLA4-Ig y para retirar otras impurezas que pudieran estar presentes. El eluato de la columna de Proteína A, que consistía en una mezcla de todas las especies de CTLA4-Ig (es decir, dímero, tetrámero, hexámero multímero), mostró una tasas kon y koff aparentes que
35 eran comparables al patrón de dímero CTLA4-Ig. La separación de eluato de Proteína A mediante CET de 2 columnas dio lugar a tres especies de CTLA4-Ig: dímero, tetrámero, hexámero/multímero, con tasas kon y koff
resumidas en la Tabla 11. El contenido de ácido siálico del dímero purificado a partir del pico de limpieza de CIH fue bajo en comparación con dímero CTLA4-Ig.
En la Tabla 11, se ensayaron concentraciones de muestra de 75-200 nM sobre el chip Ig B7-1 (694 UR). Las especies CTLA4-Ig purificadas a partir del pico de limpieza de CIH mostraron unión más baja en comparación con la referencia de CTLA4-Ig. El tetrámero que se desagregó dio tasas kon y koff comparables a la referencia de CTLA4-Ig.
Tabla 11: Análisis cinético de especies de CTLA4-Ig del pico de limpieza de CIH
Especie
konx105 (1/Ms) koffx103 (1/s) KAx107 (1/M) KD (nM)
Patrón de dímero CTLA4-Ig
4,03 9,65 4,18 23,9
Eluato de Proteína A
3,77 9,73 3,87 25,8
Dímero
1,52 5,88 2,59 38,7
Tetrámero
1,65 8,07 2,04 48,9
Hexámero
1,54 12,3 1,25 79,9
Tetrámero dimerizado
3,12 9,88 3,16 31,7
El análisis estadístico de los datos se realizó mediante ensayo t de Student basado en 7 observaciones del patrón de dímero CTLA4-Ig y 14 observaciones de dímero y tetrámero purificados. No hubo diferencia en las tasas kon comparando el patrón de dímero CTLA4-Ig con dímero o tetrámero purificado. Sin embargo, la tasa koff y la KD fueron estadísticamente significativas cuando se comparó la referencia con tetrámero purificado (Tabla 12). Comparando el tetrámero purificado con dímero purificado, tanto las tasas kon y koff así como la KD fueron estadísticamente diferentes. Debe señalarse que, aunque los datos se agruparon en dímero y tetrámero, las clasificaciones individuales de las muestras (es decir, frontal, trasera, etc.) pueden tener características ligeramente diferentes que pueden afectar a sus cinéticas de unión. Para el dímero, las tasas kon y koff promediaron 3,3 ! 1,0 x 105 M-1s-1 y 8,8 ! 3,5 x 10-3s-1, respectivamente. Las tasas kon y koff del tetrámero fueron 2,6 ! 0,8 x 105 M-1s-1 y 3,1 ! 1,4 x 10-33s-1, respectivamente.
En la Tabla 12, se analizaron el dímero (n =14) y el tetrámero (n = 14) y el patrón de dímero CTLA4-Ig (n = 7).
Tabla 12: Análisis estadístico de especies de CLTA4-Ig.
Ensayo T de Student
Valores p
kon
koff KD
Patrón de dímero frente a dímero
0,9118 0,8678 0,7893
Patrón de dímero frente a tetrámero
0,1044 0,0000002 0,0002
Dímero frente a tetrámero
0,0372 0,000006 0,0004
Especies de CTLA4-Ig del pico de limpieza de QFF: La columna QFF es la última columna de purificación usada para limpiar las impurezas residuales del producto. Se aislaron las especies de CTLA4-Ig a partir del pico de limpieza de la columna de QFF usando el procedimiento de CET de 2 columnas y se analizaron en el Biacore 3000. Los datos mostraron que la cinética de unión de esta muestra del quot;pico de limpieza de QFFquot; era similar al patrón de dímero CTLA4-Ig. Además, tanto el dímero como el tetrámero purificados a partir del pico de limpieza de QFF dieron cinéticas de unión similares en comparación con los purificados a partir de la composición. Además, los contenidos de ácido siálico de las fracciones de monómero purificado fueron mayores que los del patrón de dímero CTLA4-Ig.
Tratamiento con guanidina (dimerización del tetrámero): El tetrámero puede convertirse en dímero por tratamiento con guanidina seguido por diálisis en tampón fosfato y se confirmó que existía en forma de dímero por CET analítica. El análisis cinético del tetrámero quot;dimerizadoquot; del pico de limpieza de CIH mostró que sus tasas kon y koff eran similares a las del dímero CTLA4-Ig.
Ejemplo 7: Análisis intacto por EM por electronebulización iónica (IEN)
Se diluyó CTLA4-Ig con Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8 a una concentración final de 0,7 mg/ml. Se diluyó PNGasa F (New England Biolabs) 30 veces con Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8 a una concentración final de 17 unidades/∀l. Se mezclaron volúmenes iguales (60 ∀l de cada uno) de la muestra diluida y la solución de glucosidasa diluida y se incubaron a 37 ºC durante 4 horas.
El CTLA4-Ig desglucosilado resultante (2 ∀l) se cargó en una columna de cartucho de extracción en fase inversa Waters Oasis® (2,1 x 20 mm). La columna cargada se lavó con disolvente B al 5% (disolvente A: ácido fórmico al 1% en agua, disolvente B: ácido fórmico al 1% en acetonitrilo) a una caudal de 0,2 ml/minuto durante cinco minutos para desalar, con el eluyente desviado a los residuos. Al final de los 5 minutos, un gradiente rápido (disolvente B al 5% a disolvente B al 95% en 10 minutos) inició la elución de CTLA4-Ig de la columna; aquí el eluyente se dirigió hacia el espectrómetro de masas (Waters Micromass Q-TOF microTM) a 45 ∀l/min después de dividir el flujo (el sistema de cromatografía usado fue un Waters Alliance 2695 equipado con un detector Waters 2996).
El voltaje capilar para el Q-Tof microTM se estableció a 3 kV y el voltaje de cono de la muestra a 40 V. Los escaneos (cada 0,9 segundos) se promediaron en un escaneo; el tiempo de entre escaneos fue de 0,1 segundos. El analizador Q-Tof escanea desde m/z 800 hasta 2500. Se combinaron los espectros correspondientes a la parte más alta que la mitad de la altura máxima del pico (en el cromatograma TIC) usando el software Waters MassLynxTM. Los espectros combinados se sometieron a desconvolución Waters MaxEntI. La resolución se estableció a 1 Da/canal, y se seleccionó el modelo gaussiano uniforme de deterioro con anchura a la mitad de la altura establecida entre 0,5-1 Da. Las proporciones de intensidad mínima para el pico izquierdo y el pico derecho se establecieron ambos al 50%.
Ejemplo 8: Ionización por desabsorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
Los espectros MALDI-EM se adquirieron en un OmniFlexTM (Bruker Daltonics, MA) usando un láser de nitrógeno (337 nm). Las muestras de proteína se usaron sin desalar o desaladas usando extracción en fase sólida en forma de puntas de pipeta C4 ZipTip® (Millipore, Bedford MA). Las puntas de pipeta se humedecieron con acetonitrilo-agua
(1:1 v/v) y se equilibraron con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% antes de su uso. Las puntas de pipeta entonces se cargaron recogiendo y expulsando 10 ∀l de la muestra de la pipeta tres veces. La muestra cargada se lavó tres veces con 10 ∀l de TFA al 0,1%. Las muestras de proteína desaladas se eluyeron de la pipeta con 10 ∀l de acetonitrilo a agua (1:1 v/v). Las muestras se aplicaron de forma puntual mezclando una muestra de 1 ∀l (desalada o conteniendo tampón) con 1 ∀l de solución de matriz y colocando 1 ∀l de la mezcla en la diana de acero inoxidable. La disolución de matriz era una solución saturada de ácido sinápico en agua a acetonitrilo 1:1 (v/v) que contenía TFA al 0,1%. La mezcla se aplicó de forma puntual en la placa de muestra de MALDI y se dejó secar al aire antes de colocarla en el espectrómetro de masas. Todas las muestras de proteína se analizaron en modo lineal, de iones positivos por extracción retardada usando un voltaje de aceleración de 20 kV y un tiempo de retardo de 200 nanosegundos. Se acumuló un total de 400 espectros de una sola etapa de cada muestra. La calibración externa se consiguió usando una mezcla de proteínas patrón que contenían tripsinógeno (23,982 m/z), proteína A (44,613 m/z), y albúmina bovina (66431 m/z).
Análisis MALDI-TOF EM de los péptidos
Se separó la mezcla de péptidos por cromatografía en fase inversa y las fracciones de los picos cromatográficos se recogieron y se evaporaron a sequedad. La muestra se reconstituyó en 50 ∀l de tampón fosfato 25 mM pH 7,5. Se añadió DTT a una concentración final de 5 mM y las fracciones se incubaron a 50 ºC durante 20 minutos. Después de la reducción, se añadió IAM a una concentración final de 10 mM y se incubó en la oscuridad a 50 ºC durante 20 minutos adicionales.
Los espectros MALDI-EM se adquirieron en un OmniFlex (Bruker Daltonics, MA) usando un láser de nitrógeno (337 nm). Las muestras se prepararon mezclando una muestra de 1 ∀l con 1 ∀l de solución de matriz. La disolución de matriz era una solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en agua:acetonitrilo 1 a 1 con TFA al 0,1%. La mezcla se aplicó de forma puntual en un pocillo de la placa de muestra de MALDI y se dejó secar al aire antes de colocarla en el espectrómetro de masas. Todos los péptidos se analizaron en modo reflexivo de iones positivos por extracción retardada usando un voltaje de aceleración de 20 kV y un tiempo de retardo de 200 nanosegundos. Se acumuló un total de 100 espectros de una sola etapa de cada muestra. La calibración externa se consiguió usando una mezcla de péptidos patrón que contenía angiotensina II (1046,54 m/z), angiotensina I (1296,68 m/z), sustancia P (1347,74 m/z), bombesina (1619,82 m/z), ACTH clip 1-17 (2093,09 m/z), ACTH clip 18-39 (2465,20 m/z) y somatostatina (3147,47 m/z).
Ejemplo 9: Análisis de los efectos de los medios y los constituyentes de los medios sobre las especies de cadena sencilla y multimérica de CTLA4-Ig
Se preparan y purifican dímero CTLA4-Ig, una sub-fracción de bajo contenido de ácido siálico, una sub-fracción de alto contenido de ácido siálico, monómero frontal, y especies monoméricas de CTLA4-Ig. Estas muestras se usan en una serie de experimentos de modelado diseñados para determinar los efectos de los medios y los constituyentes de los medios sobre la formación de cadena sencilla y alto peso molecular durante tiempos de cero a al menos 60 horas. Se ensayan los efectos del tampón de formulación, yodoacetamida, fosfato sódico, cloruro de amonio, medio basal, caldo de fermentación, medio 177e, solución de ácido concentrado medio I, solución de ácido concentrado medio II, insulina, EDTA, cisteína, ácido lipoico, glutatión, metionina, y yeastolate solos y en combinaciones.
Ejemplo 10: Análisis de moléculas de CTLA4-Ig por tamaño
Se puede emplear un procedimiento de cromatografía de exclusión por tamaño (CET), que usa condiciones desnaturalizantes para la cuantificación de especies proteicas de diferente tamaño. En una realización puede emplearse el procedimiento de CET en tándem usando condiciones desnaturalizantes para la cuantificación de especies de cadena sencilla de CTLA4-Ig. CTLA4-Ig de cadena sencilla puede ser una especie que carece del puente disulfuro intercatenario. Las especies de CTLA4-Ig de cadena sencilla aisladas durante el procedimiento de purificación se mencionan como CTLA4-Ig de cadena sencilla nativa. La cadena sencilla purificada producida por la reducción y alquilación del dímero CTLA4-Ig se menciona como cadena sencilla inducida. Los CTLA4-Ig de cadena sencilla nativa e inducida tienen las mismas características.
Materiales:
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) calidad ACS Hidróxido de potasio (KOH) al 45% p/p Solución calidad ACS Cloruro sódico (NaCl) calidad ACS Pipeta individual ajustable calibrada, 100 _l Rainina (Nº de catálogo P-100) Agua (H2O) calidad HPLC Viales criogénicos Nalgene de 2,0 ml (Nº de catálogo 5000-0020) Ácido clorhídrico concentrado (HCl) Fisher (Nº de catálogo A144-212) Hidróxido sódico (NaOH) Solución 10 N JT Baker (Nº de catálogo 5674-02) Unidad de filtro de 1000 ml de 0,22 mm Corning (Nº de catálogo 430517) Tubo de ensayo de polipropileno de 15 ml Falcon (Nº de catálogo 352097) Azida sódica (NaN3) calidad ACS Fosfato sódico monobásico, monohidrato (NaH2PO4·H2O) Hidróxido de potasio (KOH) Gránulos
Instrumentación y Condiciones
Módulos de separaciones del sistema de HPLC Waters 2695 Columna Toso Haas 5 ∀TSK 3000 SWXL, 300 mm x 7,8 mm D.I. (Pieza Nº 08541) Columna de seguridad Toso Haas 5 ∀TSK 3000 SWXL, 40 mm x 6,0 mm D.I. (Pieza Nº 08543) Detector de longitud de onda dual Waters 2487 de 280 nm Caudal 1 ml/min Sistema de la Integración Empower Volumen de inyección de 20 ∀l Conc. diana del ensayo 10 mg/ml Fase móvil KH2PO4 0,2 M, NaCl al 0,9%, pH 6,8 con KOH Tiempo de procesamiento del ensayo 20 min. Temperatura de la columna ambiente Temperatura de la muestra 4 ºC Tiempo de retención del monómero 8,7 min. ! 1,0 min., de las especies de alto PM 7,5 min. ! 1,0 min., si están presente las especies de PM eluirán después del pico de monómero.
Reactivos
Hidróxido de potasio 4 N (KOH 4 N) (100 ml) Se usa una de las siguientes preparaciones descritas:
Se añaden 40 ml de agua calidad HPLC y 11,6 ml de solución al 45% p/p de KOH a un matraz volumétrico de 100 ml. Se lleva el volumen hasta 100 ml con agua calidad HPLC.
En un matraz volumétrico de 100 ml, se añaden 80 ml de agua calidad HPLC, se pesan 22,4 gramos de gránulos de KOH y se agita magnéticamente hasta su completa disolución. Se lleva hasta un volumen de 100 ml con agua calidad HPLC.
Se transfiere la solución a un frasco reactivo de vidrio de 250 ml. Se mezcla bien por inversión. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 1 año.
Fase móvil (KH2PO4 0,2 M, NaCl al 0,9%, pH 6,8) Se pesan 27,2 gramos de KH2PO4 y 9,0 gramos de NaCl en un vaso de precipitados de 1000 ml. Se disuelven los sólidos en 800 ml de agua calidad HPLC usando mezcla continua con una barra de agitación magnética. Usando un medidor de pH, se ajusta el pH de la solución a 6,8 con solución 4 N de KOH. Si el pH excede de 6,8, se ajusta con HCl concentrado. Se lleva el volumen final a 1 litro usando un cilindro graduado de 1000 ml. Se filtra la solución a través de una unidad de filtro de 0,22 ∀m.
Se transfiere a un frasco reactivo de vidrio de 1000 ml y se sonica mientras se desgasifica al vacío durante 5 +/-1 minuto. Se desgasifica antes de cada uso. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 1 mes. Hidróxido sódico 2 N (NaOH 2 N)
5 Se transfieren 20 ml de NaOH 10 N en un cilindro graduado de 100 ml. Se lleva el volumen hasta 100 ml con agua HPLC. Se transfiere la solución a un frasco reactivo de vidrio de 250 ml. Se mezcla bien por inversión. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 1 año. Se pesan 3,45 gramos de NaH2P4·H2O y 2,92 gramos de NaCl y se disuelven mezclando con una barra de agitación
10 en 900 ml de agua calidad HPLC. Usando un medidor de pH, se ajusta el pH de la solución a 7,4 con NaOH 2 N. Si el pH excede de 7,4, se ajusta con HCl concentrado.
Se lleva el volumen final a 1 litro usando un cilindro graduado de 1000 ml. Se filtra la solución a través de una unidad de filtro de 0,22 ∀m. Se almacena a 2 º -8 ºC durante hasta 6 meses.
15 Tampón de almacenamiento de columna (NaN3 al 0,05% p/v en agua) Se pesan 50 ! 5 mg de azida sódica y se añaden a un vaso de precipitados de 1000 ml con una barra de agitación magnética. Se añaden 500 ml de agua calidad HPLC al vaso de precipitados y se agita hasta la completa disolución. Se lleva el volumen a 1 l con agua. Se filtra la solución a través de una unidad de filtro de 0,22 ∀m y se vierte en un frasco
20 reactivo de HPLC de 1000 ml. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
Preparación de especies de alto peso molecular y patrones de idoneidad del sistema
Esto proporcionará una dilución de factor tres de material de referencia de CTLA4-Ig calentado a no calentado y una cantidad porcentual del área de la especie de alto peso molecular del 15% -30%. En un tubo de ensayo Falcon de
25 15 ml, se preparan aproximadamente 3 ml del material de referencia en 10,0 ! 1,0 mg/ml usando tampón de dilución de CTLA4-Ig. La concentración inicial de CTLA4-Ig es la de COA. Se hace la dilución de 10,0 ! 1,0 mg/ml a partir de ese valor. Se transfiere 1,0 ml del material de referencia diluido a un criovial 2,0 ml usando una pipeta de 1 ml, y se calienta en un baño de agua a 67 ! 2 ºC durante 45 ! 2 minutos. Se transfiere el material de referencia calentado preparado de nuevo al tubo de ensayo de 15 ml usando una pipeta de 1 ml. Suavemente se pipetea pipeta hacia
30 arriba y abajo un volumen de 1 ml de los contenidos del tubo de ensayo para un total de 10 veces. Este es el patrón de idoneidad del sistema. Condiciones de almacenamiento: Se preparan alícuotas de 150 ∀l del patrón de idoneidad del sistema en crioviales de 2,0 ml para su almacenamiento a -80 ! 5 ºC durante hasta 1 año. Se obtiene la concentración inicial del material referencia, y se hace la dilución de 10,0 ! 1,0 mg/ml a partir de ese valor. Se usa un mínimo de 100 ∀l de material de referencia y una cantidad apropiada de tampón de dilución para conseguir una
35 concentración final de 10,0 ! 1,0 mg/ml. Remítase a la siguiente ecuación para las diluciones
(Volumen de alícuota x concentración de partida)Tampón de dilución a añadir = – volumen de alícuota Concentración diana
Para la sustancia de fármaco CTLA4-Ig se hace la dilución de 10,0 ! 1,0 mg/ml a partir de la concentración de proteína usando un mínimo de una alícuota de 100 ∀l de la muestra y una cantidad apropiada del tampón de dilución para conseguir una concentración final de 10,0 ! 1,0 mg/ml. Remítase a la siguiente ecuación para las diluciones:
(0,1 ml x 50 mg/ml) – 0,1 ml = 0,4 ml de tampón de dilución10 mg/ml
40 Una vez diluidas a 10,0 ! 1,0 mg/ml, las muestras se pueden almacenar a 2 º -8 ºC durante hasta 24 horas. Para el producto de fármaco CTLA4-Ig se hace la dilución de 10,0 ! 1,0 mg/ml a partir de la concentración de proteína usando un mínimo de una alícuota de 200 ∀l de la muestra, y una cantidad apropiada del tampón de dilución para conseguir una concentración final de 10,0 + 1,0 mg/ml. Remítase a la siguiente ecuación para las diluciones:
(0,2 ml x 25 mg/ml) – 0,2 ml = 0,3 ml de tampón de dilución10 mg/ml
Se coloca la fase móvil en un depósito de disolvente y el agua calidad HPLC en otro. Se sonica y desgasifican al
45 vacío antes del procesamiento. Se enciende el detector y se deja 15 minutos para que se caliente antes del procesamiento. Antes de usar una nueva columna o la actual para el análisis, se enjuaga la columna con agua calidad HPLC durante al menos 20 minutos, seguido de equilibrado con tampón de fase móvil durante al menos 20 minutos. Se usa una caudal de 1,0 ml/min. Se descongelan una alícuota de 150 ∀l del patrón de idoneidad del sistema, se añade a un vial de inyector automático y se coloca el vial en el inyector automático. Se inyectan 20 ∀l del
50 patrón en las condiciones.
Se determina el porcentaje de especies de alto peso molecular que eluyen a aproximadamente 7,5 minutos de acuerdo con la siguiente fórmula: (En la siguiente fórmula, monómero realmente se refiere a dímero.)
(A)
% de área de la especie de alto peso molecular =
(A) + (B) x 100
Donde:
A = área del pico de la especie de alto peso molecular
B = área del pico del monómero
El porcentaje de área de las especies de alto peso molecular no debe ser inferior al 15%. Si es menor del 15%, se añaden especies adicionales de alto peso molecular concentradas al patrón de idoneidad del sistema anterior. Determinación de la resolución (R) y evaluación del tiempo de retención (R). Se inyectan 20 ∀l del patrón de idoneidad del sistema. Se calcula la resolución entre las especies de alto peso molecular (tiempo de retención de aproximadamente 7,5 minutos) y el pico de monómero (tiempo de retención de aproximadamente 8,7 minutos) usando la siguiente ecuación: (En la siguiente fórmula, quot;monómeroquot; realmente se refiere a dímero.)
2 (t2 -t1)Resolución (R) =
W2 + W1
Donde:
t1 = Tiempo de retención de la especie de alto peso molecular
t2 = Tiempo de retención del monómero
W1 = Anchura del pico de la especie de alto peso molecular
W2 = Anchura del pico de monómero
La anchura del pico se mide en minutos en la base del pico después de la extrapolación de los laterales relativamente rectos del pico hasta la línea basal. El tiempo de retención y la anchura del pico se miden en las mismas unidades. En una realización, (R) debe ser ∗ 1,2 y el tiempo de retención para el pico debe ser 8,7 ! 1,0 minutos.
Determinación de la cantidad de placas teóricas (N)
A partir del cromatograma del patrón de idoneidad del sistema, se determina la eficacia de la columna calculando la cantidad de placas teóricas (N) de acuerdo con la siguiente ecuación:
4 t 12
N 5 16 2/3 w 0
Donde:
t = es el tiempo de retención del monómero (en minutos) W = es la anchura (en minutos) en la línea basal del monómero obtenida por extrapolación de los laterales del pico hasta la línea basal.
Se hará un total de seis (6) inyecciones de material CTLA4-Ig. Se toma una alícuota de 200 ∀l del material de referencia de 10 mg/ml en un vial del inyector automático y se coloca el vial en el inyector automático y se inyecta seis veces. Se procesan los cromatogramas y se calcula el área del pico de dímero para cada cromatógrafo. Se suman las áreas de los picos de dímero a partir de los seis cromatógrafos y se calcula el primero, la desviación típica y el% DTR de acuerdo con las siguientes ecuaciones:
X1 +X2+ X3. . . Xn
nx
Donde:
X1,2,3 .... = un valor específico en un conjunto de datos
nx = un conjunto de valores (x)
5.4.4.2 Se calcula la desviación típica de la siguiente manera:
nx2 67x 2
9 89
nn 81
Donde:
n = número de valores (x) en un conjunto de datos x = un valor en un conjunto de datos
5.4.4.3 Se calcula el% de desviación típica relativa (DTR) de la siguiente manera:
Desviación típica% DTR = X 100 Media
Ejemplo de secuencia de inyección:
MUESTRA
INYECCIÓN
Blanco de tampón de dilución
1 inyección
Idoneidad del sistema
1 inyección
Material de referencia
6 inyecciones
Muestra nº 1
2 inyecciones
Muestra nº 2
2 inyecciones
Muestra nº 3
2 inyecciones
Material de referencia
1 inyección
Blanco de tampón de dilución
1 inyección
Integración de los picos
Se integran todas las áreas de los picos en el cromatograma de 5,5 a 11,8 minutos. Se amplía la línea basal del
10 cromatograma para asegurar que el área total de todas las especies de bajo PM y alto PM se incluyen en la integración. Se ignoran los picos de la muestra que corresponden a los picos en el control. El pico del volumen de inclusión (11,8-13,5 minutos) y los picos posteriores no se consideran en este cálculo. Sin embargo, si el área en el volumen de inclusión es del 0,1% o más de la superficie total, debe tenerse en cuenta. El pico de dímero eluye a 8,7 !1,0 minutos, el pico de la especie de alto peso molecular eluye a 7,5 !1,0 minutos, y las especies de bajo peso
15 molecular (por ejemplo, monómero, si está presente) eluirán después del pico de dímero. Cualquier pico que no sea la especie de alto peso molecular, dímero o las especies de bajo peso molecular que tena absorbancia a 280 nm en exceso del 0,1% del área total del pico debe señalarse. Se calculan los porcentajes de área de la siguiente manera: (La referencia a quot;monómero Abataceptquot; en este ejemplo se refiere a dímero CTLA4-Ig.)
(B)
7.2.1 % de área de la especie de alto peso molecular = x 100
(A) + (B) + (C)
(C)
7.2.2 % de área de la especie de bajo peso molecular = x 100
(A) + (B) + (C)
20 % de área de monómero = 100-(% de área de alto PM + % de área de bajo PM)
Donde:
A = Área del pico de monómero Abatacept. B = Área total de todos los picos con tiempos de retención menores del monómero Abatacept. C = Área total de todos los picos con tiempos de retención superiores al pico de monómero Abatacept
25 (excluyendo el volumen de inclusión).
Las muestras se separaron por cromatografía por exclusión de tamaño usando un Alliance® 2695 de Waters (Milford, MA) en dos columnas TSK Gel G3000SWXLTM de 7,8 x 300 mm (Tosoh Biosep, Montgomery, PA) colocadas en serie empleando una columna de seguridad de 40 x 6,0 mm. Se inyectaron 25 microlitros de cada muestra purificada y se separaron en condiciones isocráticas usando Na2HPO4 0,1 M, Na2SO4 0,1 M, pH 6,8 a 1,0
5 ml/min. Las muestras se detectaron a 280 nm usando un detector PDA 996 (serie de fotodiodo) (Waters, Milford, MA) y se analizaron usando el software de cromatografía Millennium 4.0TM (Waters, Milford, MA).
Los cromatogramas superpuestos de material de cadena sencilla nativa e inducida de la cromatografía por exclusión de tamaño analítica desnaturalizante en tándem muestran un tiempo medio de retención promedio (6 réplicas) de 27,96 ! 0,02 y 27,99 ! 0,02, respectivamente. Se encontró que el área del pico promedio para la cadena sencilla 10 nativa era 495525,0 ! 9589,6 y para la cadena sencilla inducida era 463311,8 ! 7997,2 (Tabla 13). Los espectros MALDI-TOF superpuestos de material de cadena sencilla nativa e inducida tienen picos que son bastante amplios con una anchura de línea basal de aproximadamente 15000 unidades de masa. Esto se espera debido a la heterogeneidad de la glucosilación en ambas muestras. Se usó el punto apical del pico de cadena sencilla en cada espectro de masas para calcular la masa media. Las masas promedio para la cadena sencilla de CTLA4-Ig nativa e
15 inducida son 45694,426 ! 297,735 y 45333,086 ! 264,778 unidades de masa, respectivamente, en base al análisis de seis réplicas (Tabla 14). Se espera que la masa de la cadena sencilla nativa sea mayor que la de la cadena sencilla inducida, porque en la cadena sencilla nativa existe una cisteína adicional (masa del resto 103 dalton) en la Cys146 de la SEC ID Nº 2, mientras que la cadena sencilla es el resultado de la reducción selectiva de un único puente disulfuro intercatenario seguido de alquilación que añade un grupo acetilo (masa 58 dalton).
20 Estos datos muestran que los materiales nativos e inducidos producen resultados equivalentes mediante cromatografía CET desnaturalizante en tándem y análisis MALDI-TOF. Estos resultados demuestran la comparabilidad entre los materiales de cadena sencilla de CTLA4-Ig nativa e inducida.
Tabla 13: Datos de HPLC CET de la cadena sencilla nativa e inducida
Réplica
Inducida Nativa
Tiempo de retención
Pico Tiempo de retención Área del pico
(min)
(|xV*s) (min) (|xV*s)
1
27,985 470199 27,968 505576
2
27,979 464424 27,941 499800
3
27,977 469509 27,934 505708
4
27,998 469081 27,954 482472
5
28,027 453103 27,991 490434
6
28,016 453555 27,985 489160
Promedio
27,997 463311,8 27,962 495525,0
Desviación tip.
0,021 7997,2 0,023 9589,6
% DTR
0,074 1,726 0,083 1,935
Tabla 14: Datos de espectrometría de masas MALDI-TOF de cadena sencilla nativa e inducida
Réplicas
CS inducida Masa de CS nativa
1
45397,896 45597,475
2
45432,199 45621,300
3
45256,929 45543,839
4
45433,849 45555,893
5
45381,812 45634,620
6
45348,376 45340,712
Promedio
45375,177 45548,973
Des. tip.
66,265 108,043
% DTR
0,15 0,24
25 La presencia de cisteínas dentro de una cadena polipeptídica permite la formación de enlaces disulfuro, que pueden ser intramoleculares o intermoleculares conduciendo a la formación de complejos proteicos diméricos o multiméricos. CTLA4-Ig existe como un dímero (en el que el dímero se compone de dos monómeros que tienen una cualquiera de las siguientes secuencias: (i) 26 a 383 de la SEC ID Nº 2, (ii) 26-382 de la SEC ID Nº 2; (iii) 27-383 de la SEC ID Nº 25 (iv) 26-382 de la SEC ID Nº 2), (v) 25-382 de la SEC ID Nº 2, y (vi) 25-383 de la SEC ID Nº 2
30 mantenidas unidas por un enlace disulfuro entre C146 en cada cadena. La reducción de este enlace disulfuro puede provocar la formación de dos cadenas proteicas equivalentes mantenidas juntas por fuerzas electrostáticas no covalentes. Cuando se somete a condiciones desnaturalizantes que superan o contrarrestan las fuerzas electrostáticas atrayentes, dicho CTLA4-Ig puede disociarse completamente produciendo dos estructuras proteicas idénticas de aproximadamente 46 kDa. La estructura resultante se menciona como cadena sencilla o monómero. La
5 presencia de la cadena sencilla puede controlarse por cromatografía por exclusión de tamaño en columna en tándem procesada en condiciones desnaturalizantes.
Una subpoblación de moléculas de CTLA4-Ig contiene una modificación en Cys146: el enlace disulfuro presente en la población mayoritaria se cambia a un aminoácido cisteína libre (mencionado como cisteinilación). El dímero CTLA4-Ig es predominantemente una proteína con un peso molecular de aproximadamente 92.000. Está compuesto por dos
10 cadenas polipeptídicas glucosiladas que se mantienen juntas por un enlace disulfuro intercatenario en Cys146 y las interacciones no covalentes (también mencionado como quot;dímeroquot; CTLA4-Ig). La proteína purificada existe como una población heterogénea y contiene modificaciones tales como glucosilaciones y variaciones en los extremos N-y Cterminales.
Existe una población distinta de moléculas de CTLA4-Ig, que carece del enlace de unión disulfuro intercatenario.
15 Esta población unida de forma no covalente existe dentro del pico de dímero frontal generado por cromatografía por exclusión de tamaño. Se encontró que el dímero frontal carecía del enlace disulfuro intercatenario. Las especies de CTLA4-Ig que carecen del enlace disulfuro intercatenario están modificadas por cisteinilación en Cys146, sucediendo dicha modificación en gt; 99% de las especies de cadena sencilla en base a los datos intactos de IEN-EM. La cisteinilación de Cys146 y el enriquecimiento de carbohidratos O-unidos son las dos modificaciones principales en las
20 especies de cadena sencilla de CTLA4-Ig. El dímero frontal se somete a cromatografía por exclusión de tamaño desnaturalizante que provoca el aislamiento del pico de CTLA4-Ig de cadena sencilla. El material de monómero frontal purificado se comparó con CTLA4-Ig con y sin extracción en fase sólida (SPE) y se analizó en MALDI. El monómero frontal purificado contiene dos especies dominantes: una especie principal en 47005 u para SPE-tratada
o 46897 u para no tratada; una especie minoritaria en 95.070 u para SPE-tratada o 96172 u para no tratada. El
25 material de CTLA4-Ig también contiene dos especies dominantes: una especie principal, en 91518 u para SPEtratado o 91143 u para no tratado; una especie minoritaria en 45660 u para SPE-tratado o 46014 u para no tratado.
ejemplo 1
ejemplo 2
Homogeneidad de tamaño
∗95,5% de área ∗95,5% de área
Dímero (HPLC)
∗97,0% de área ∗97,0% de área
Homogeneidad de tamaño (HPLC) especie de alto PM
#3,0% de área #2,0% de área #3,0% de área #2,0% de área
Homogeneidad de tamaño (HPLC) especie de bajo PM (monómero)
#0,5% de área #0,5% de área
La composición CTLA4-Ig, en una realización, tiene las siguientes características en cuanto al análisis de la homogeneidad de tamaño (HPLC) del dímero, especies de alto PM y especies de bajo PM (monómero, de cadena sencilla):
30 .∗97,0% de dímero .#2,0% de especies de alto PM .#0,5% de especies de bajo PM (por ejemplo, monómero, de cadena sencilla)
En otra realización, la composición de CTLA4-Ig tiene las siguientes cantidades característicos de cada especie:
.∗95,5% de dímero 35 .#3,0% de especies de alto PM .#0,5% de especies de bajo PM (por ejemplo, monómero, de cadena sencilla)
Resumen del análisis SE-HPLC del lotes de procedimiento CD-CH01
Procedimiento CD-CHO1 n=109
dímero
alto PM
Promedio (%) % CV Mínimo (%) Máximo (%) Intervalo de tolerancia del 95%
99,4 0,3% 98,4 99,8 ∗98,7 0,6 45,7% 0,2 1,6 #1,3
fabricada usando el procedimiento CD-CHO 1. El porcentaje de especies de alto PM varió del 0,2 al 1,6%. El valor promedio fue del 0,6% con un CV del 45,7%. El intervalo de tolerancia del 95% fue ∗ 98,7% para el dímero y # 1,3% para las especies de alto PM. El porcentaje de especies de alto PM de los lotes varió desde un valor mínimo del 0,4% hasta un valor máximo del 2,1%. El porcentaje promedio de las especies de alto PM fue del 0,8% con un % CV
5 del 40%. En todos los casos, las especies de bajo PM o monómero estuvieron por debajo del límite de detección (LD = 0,1%). El intervalo de tolerancia del 95% (para proporcionar una cobertura de área del 99% de la población) para CTLA4-Ig fabricado por el procedimiento DC-CHO1 fue # 1,3 y # 1,8% respectivamente, para las especies de alto PM. Los intervalos de tolerancia del 95% para el dímero en sustancia de fármaco del procedimiento de DC-CHO1 fueron del 98,7% y el 96,5%, respectivamente.
10 Sumario de los datos combinados para CTLA4-Ig
dímero (n=143) alto PM (n=141)a
Promedio (%) 99,3 0,6 % CV 46,9 0,5 Mínimo (%) 94,8 0,2 Máximo (%) 99,8 2,1 Intervalo de tolerancia del 95% ∗ 97,3 # 1,8 % CV (entre sitios) 0,3% 26,4% % CV (dentro del sitio) 0,5% 44,2% % CV (total del sitio) 0,6% 51,4%
La tabla anterior muestra que el porcentaje de especies de alto PM varió del 0,2 al 2,1% con un promedio del 0,6%. El dímero varió del 94,8% al 99,8% con un valor promedio del 99,3% y una precisión del 0,3%. La variación entre sitios, dentro del sitio y la variación total del sitio para el dímero estuvo dentro del 0,3 al 0,5%. La variación entre sitios para el alto PM fue del 26,4%. La variación dentro del sitio y total del sitio fue para el porcentaje de las
15 especies de alto PM del 44,2 y el 51,4%, respectivamente. El intervalo de tolerancia del 95% para el dímero (97,3%) y las especies de alto PM (1,8%) estaban dentro de la especificación.
Ejemplo 11: Construcción del vector
Construcción del vector de expresión pcSD: El vector de expresión, pcSD se construyó a partir del vector pcDNA3 disponible en el mercado (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se muestra en la FIG. 28. Se retiró el casete del gen de 20 resistencia a neomicina del plásmido pcDNA3 mediante digestión con la endonucleasa de restricción Nae I. La endonucleasa de restricción Nae I crea extremos romos. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y la estructura de 3,821 kb del vector pcDNA3 se purificó a partir del gel. Se aisló el fragmento de ADN que contenía el gen que codifica la dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr) y un promotor de SV40 del plásmido pSV2-dhfr por digestión del plásmido con las endonucleasas de restricción Pvu II y BamH I. El 25 fragmento de 1,93 kb que corresponde al casete del gen dhfr se separó y purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los extremos ahuecados 3-prima generados por digestión con BamH I se rellenaron usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para generar extremos romos. Este fragmento aislado se ligó a la estructura de extremos romos de 3,8 kb del vector pcDNA3 para crear el vector de expresión pcSD. Este vector de expresión tiene las siguientes características: un promotor de citomegalovirus (CMV) seguido por un sitio de clonación múltiple, una
30 señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción de la hormona de crecimiento bovina (BGH), una secuencia de ADNc de dhfr de ratón para la selección y la amplificación, y un gen de resistencia a ampicilina y el origen de replicación de pUC para la selección y el mantenimiento en Escherichia coli.
Construcción del vector de expresión pcSDhlfCTLA4-Ig: Se aisló un fragmento de ADN de 1,2 kilobases (kb) que contenía una secuencia que codifica una proteína CTLA4-Ig a partir del plásmido pCDM8-CTLA4-Ig por digestión
35 con las enzimas de restricción Hind III y Xba I. El fragmento Hind III/Xba I de 1,2 kb se ligó en el vector PiLN previamente digerido con las enzimas de restricción Hind III y Xba I. La construcción de plásmido resultante, denominada PiLN-huCTLA4-Ig, se muestra en la FIG. 21. El plásmido PiLN-huCTLA4-Ig se usó como fuente de la secuencia codificante de CTLA4-Ig usada en la construcción del vector final de expresión pcSDhuCTLA4-Ig.
El vector final para la expresión del gen de CTLA4-Ig se construyó como se muestra en la FIG. 29. Se aisló un
40 fragmento de ADN de 1,2 kb que contenía el gen de CTLA4-Ig a partir del plásmido PiLN-huCTLA4-Ig mediante un procedimiento de digestión de restricción de dos etapas. El plásmido PiLN-huCTLA4-Ig primero se digirió con la enzima de restricción Hind III. Los extremos ahuecados 3-prima resultantes se rellenaron por tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El plásmido después se digirió con la enzima de restricción Xba I para liberar el fragmento de 1,2 kb que contenía el gen de CTLA4-Ig. Este fragmento se purificó y se ligó al fragmento
45 EcoR V y Xba I aislado a partir de la digestión de restricción de pcSD. Los sitios de restricción de EcoR V y Xba I están localizados en el sitio de clonación múltiple de pcSD entre el promotor de CMV y un casete que contiene la señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción de la hormona de crecimiento bovino. Esto colocó el fragmento del gen de CTLA4-Ig bajo el control del promotor de CMV. Este plásmido se denomina pcSDhuCTLA4-Ig, y comprende la SEC lD Nº 1.
Ejemplo 12: Transfección del vector de expresión de CTLA4-Ig para obtener líneas celulares estables
Este Ejemplo y el Ejemplo 13 describen una población recién transfectada de células a partir de la cual se
5 seleccionaron y se expandieron clones individuales, y por tanto los clones expandidos son diferentes de las células depositadas en la ATCC con Nº de referencia CRL-10762. La línea celular CHO previa que alberga un vector de expresión que contiene ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a CTLA4-Ig (ADN que tiene el número de referencia de la ATCC 68629) se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.434.131. En resumen, un plásmido de expresión (por ejemplo, pCDM8) que contenía ADNc que se había depositado en la ATCC con el Nº
10 de referencia 68629, se transfectó por lipofección usando procedimientos convencionales en células CHO dhfr negativas para obtener líneas celulares que expresaban de manera estable CTLA4-Ig. La selección de líneas celulares CHO B7 positivas para la actividad de unión a B7 en el medio usando inmunotinción produjo un transfectante estable que expresaba CTLA4-Ig. Esta población heterogénea de células transfectadas se denominó línea celular de ovario de hámster chino, CTLA4-Ig-24 y se depositó en la ATCC según el Tratado de Budapest el 31
15 de mayo de 1991 con el número de referencia de la ATCC CRL-10762.
La línea celular de ovario de hámster chino, DG44, contiene una deleción del gen que codifica la enzima dihidrofolato reductasa. El plásmido de expresión pcSDhuCTLA4-Ig contiene una copia del gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr). La inserción del plásmido pcSDhuCTLA4-Ig en el genoma DG44 provoca la complementación funcional de la deleción de dhfr. Esta complementación funcional puede usarse para la selección de transfectantes
20 en presencia de metotrexato (MTX) y la amplificación de dhfr y genes adyacentes.
Se construyó la línea celular 1D5 secretora de CTLA4-Ig humano por transfección de la línea celular DG44 con el plásmido de expresión pcSDhuCTLA4-Ig como se muestra en la FIG. 29. El ADN plasmídico se introdujo en células DG44 por electroporación usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los transfectantes se seleccionaron seleccionados usando medio esencial mínimo (MEM; JRH Biosciences, Inc., Kansas) suplementado
25 con suero bovino fetal dializado al 5% (v/v). Los sobrenadantes de cultivo de los transfectantes se seleccionaron para la producción de IgG humana usando un procedimiento ELISA tipo sándwich. Se usó un anticuerpo de cabra específico de Fc anti-IgG humana como anticuerpo de captura. Se usó anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano rusticano para detectar la IgG humana. Los transfectantes que expresaban altos niveles del gen de CTLA4-Ig humano se seleccionaron para amplificación adicional.
30 La amplificación génica de los transfectantes seleccionados se consiguió mediante la adición de MTX al medio de cultivo a una concentración final de 100 nM. El MTX es un análogo de ácido fólico que actúa como inhibidor competitivo de la dihidrofolato reductasa. La adición de MTX al medio permitió la selección de los transfectantes que contenían múltiples copias del gen dhfr y elevados niveles de dihidrofolato reductasa. Se identificaron los transfectantes que también contenían múltiples copias del gen de CTLA4-Ig adyacente usando el procedimiento
35 ELISA específico de IgG humana. Se seleccionó un clon productor de CTLA4-Ig, denominado 1D5, para desarrollo adicional, en parte descrito en el Ejemplo 13.
Ejemplo 13: Subclonación de células transfectadas de forma estable
La línea celular 1D5 se sometió a clonación en agar blando. Los subclones derivados de la clonación de agar blando se analizaron para la producción de IgG humana usando el procedimiento ELISA. Se evaluaron los subclones
40 seleccionados para la producción de CTLA4-Ig y las propiedades de crecimiento. Se seleccionó el subclón principal, denominado 1D5-100A1.
La línea celular LD5-100A1 se adaptó desde medio DE (JRH Biosciences, Inc., Kansas, que contiene materias prima procedentes de fuentes animales, a un medio químicamente definido denominado CD-CHO (Cuadro 15). El medio CD-CHO es un medio libre de componentes animales patentado fabricado por Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.
45 Tabla 15: Composición del procedimiento y medio
Componente Concentración
Solubles ácidos I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Solubles ácidos II CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales II CD-CHO 25x 40,0 ml/l L-Glutamina 0,585 g/l Insulina r-humana (solución de 10 mg/ml) 0,1 ml/l
(continuación)
Metotrexato (solución a 20 mM) 5 ∀l/l Bicarbonato sódico 2,22 g/l Agua La necesaria Solución de HCl 1 N 0 -5 ml/l hasta ajustar el pH Solución de NaOH 10 N 0 -10 ml/l hasta ajustar el pH
La línea celular 1D5-100A1 se cultivó y se pasó en medio DE de acuerdo con el protocolo de cultivo tisular convencional. Las células después se transfirieron a un medio compuesto por medio DE al 50% y medio CD-CHO al 50%. Después de varios pases en este medio, las células se transfirieron a matraces T que contenían medio CD-CHO al 100%. Las células se cultivaron en medio de CD-CHO al 100% durante varios pases. Las células adaptadas
5 después se sometieron a clonación por dilución limitante.
Las células de la línea celular 1D5-100A1 adaptada a CD-CHO se clonaron por dilución limitante usando medios sin suero. Las células 1D5-100A1 se sembraron a una diana de 1 célula/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían medio MCDB suplementado. MCDB es un medio de formulación químicamente definido distribuido por Sigma-Aldrich, St Louis, MO. El medio MCDB se suplementó con glutamina 4 mM, 500 ∀g/ml de
10 insulina humana recombinante, MTX 100 nM y medio acondicionado al 10%. El medio condicionado era un sobrenadante esterilizado por filtración de un cultivo de la línea celular 1D5-100A1 adaptada a CD-CHO cultivada en medio MCDB.
Se identificaron los pocillos que contenían una sola colonia y se evaluaron los clones para la producción de CTLA4-Ig usando el procedimiento ELISA. Los clones seleccionados se expandieron de las placas de microtitulación de 96
15 pocillos a placas de cultivo celular de 6 pocillos. Los cultivos se expandieron adicionalmente a matraces T de 25 cm2 y después a frascos rotatorios.
Se evaluaron los cultivos en frascos rotatorios para el título de CTLA4-Ig, el contenido en ácido siálico de CTLA4-Ig, y el crecimiento. Se seleccionaron tres clones para evaluación adicional en biorreactores y caracterización adicional. Se usó una solución madre de investigación en vial congelado de la línea celular clonal 1D5-100A1.17 almacenada a
20 -80 ºC para generar un banco de células.
Ejemplo 14: Producción de CTLA4-Ig en biorreactores mediante un procedimiento semicontinuo
Cultivo a escala comercial de células de mamífero en suspensión que expresan CTLA4-Ig: Este ejemplo describe la producción de moléculas de CTLA4-Ig que comprenden monómeros de la SEC ID Nº 2, a partir de células CHO dhfrnegativas cultivadas en suspensión. Los procedimientos descritos en este ejemplo se pueden adaptar y extenderse
25 a la producción de otras proteínas recombinantes, incluyendo aunque sin limitación, proteínas segregadas, tales como citocinas y otras hormonas, proteínas segregadas que son miembros de la superfamilia de Ig o comprenden una parte de una proteína de la superfamilia de Ig, y en general cualquier proteína expresada en células CHO. Se muestra un diagrama de flujo del procedimiento para las etapas de cultivo de CTLA4-Ig en la FIG. 10.
Se usaron matraces de cultivo (por ejemplo, T-175 y matraces Erlenmeyer), frascos rotatorios, y bolsas para células
30 para las etapas de expansión del inóculo del procedimiento de cultivo de CTLA4-Ig para propagar en serie las células a partir de un vial congelado para proporcionar una cantidad suficiente de células viables para inocular un biorreactor de 20.000 l.
Se retira un único vial de células de la fase de vapor de un congelador de almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongela en un baño de agua a 37 ºC. La totalidad de los contenidos del vial se transfieren asépticamente a un 35 tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril. Se añade medio de CD-CHO para llevar el volumen final a 10 ml. La suspensión celular se centrifuga, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo celular CD-CHO. Las células resuspendidas se transfieren a un matraz T-175 que contiene 10 ml de medio de CD-CHO. Se determina la densidad de células viables y el porcentaje de viabilidad del cultivo en el matraz T-175. Se estableció un criterio para el porcentaje de viabilidad en esta etapa de ∗ 84%. Se añade medio
40 CD-CHO al matraz T-175 para conseguir una densidad de células viables diana de 1,7-2,6 x 105 células/ml.
El matraz T-175 se incuba a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante un máximo de cuatro días para conseguir una cantidad final de células diana de ∗ 6 x 106 células viables. Después de la etapa del matraz T175, el cultivo se expande usando una serie de matraces de agitación, frascos rotatorios de 1 l y 2 l, como se muestra en la FIG. 10. En cada pase, las células se siembran a una densidad diana de 2,0 x 105 células viables/ml,
45 en el que los cultivos están dirigidos a tener una viabilidad celular de cultivo final ∗ 80%. Los cultivos se incuban en medio CD-CHO a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante un máximo de cuatro días.
La expansión del cultivo sucede en una serie de bolsas para células (20 l, 100 l, y 200 l) para inocular adicionalmente un biorreactor de 1000 l. El material de cultivo celular de la etapa de expansión del inóculo en frascos rotatorios de 2 l se combina para inocular una bolsa para células de 20 l a una densidad de siembra diana de
2,0 x 105 células viables/ml. Se estableció una condición para la densidad de células viables final en la etapa de expansión del inóculo en frascos rotatorios de 2 l de 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y un porcentaje mínimo de viabilidad celular de ∗ 80%. Tras la inoculación, el cultivo en bolsa para células de 20 l se incuba en medio CD-CHO a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante un máximo de cuatro días. Para cada pase posterior (bolsas 5 para células de 100 l y 200 l), las células se siembran a una densidad diana de 2,0 x 105 células viables/ml, en el que los cultivos están dirigidos a tener una viabilidad celular de cultivo final ∗ 80%. Los cultivos se incubaron en medio CD-CHO a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante un máximo de cuatro días. Se establecieron valores ejemplares para la densidad final de células viables en la etapa de expansión del inóculo en bolsa para células de 20 l, 100 l, 200 l de 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y un porcentaje mínimo de viabilidad celular de ∗
10 80%. Estos valores ejemplares aseguran que se use una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de 1000 l.
El objetivo de las etapas de expansión del inóculo en biorreactores de siembra de 1000 l y 4000 l del procedimiento de CTLA4-Ig es proporcionar una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de producción de
20.000 l.
15 Los biorreactores de siembra funcionan en modo discontinuo usando un medio de cultivo celular CD-CHO. La temperatura, el pH, el oxígeno disuelto, la presión, la agitación y el caudal de gas para el aire, oxígeno y dióxido de carbono se controlan mediante un sistema de control distribuido (DCS) y proporcionan las condiciones para un crecimiento óptimo de la cultura en los biorreactores de siembra. Los biorreactores de siembra se hacen funcionar a 37 ºC. Las muestras de cultivo se retiran de los biorreactores de siembra para la determinación de la densidad de
20 células viables, el porcentaje de viabilidad, y las concentraciones de metabolitos.
El biorreactor de siembra de 1000 l se inocula con inóculo de la etapa de expansión en bolsa para células de 200 l a una densidad de células viables inicial diana de 1,0 a 3,0x105 células viables/ml. El cultivo se incuba en medio CD-CHO a 37 ºC durante un máximo de 5 días. Valores ejemplares para la densidad final de células viables en la etapa de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 1000 l es 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y el porcentaje mínimo de
25 viabilidad celular es ∗ 80%.
El biorreactor de siembra de 4000 l se inocula con inóculo de la etapa de expansión en biorreactor de siembra de 1000 l a una densidad de células viables inicial diana de 1,0 a 3,0 x 105 células viables/ml. El cultivo se incuba en medio CD-CHO a 37º C durante un máximo de 6 días. Valores ejemplares para la densidad final de células viables en la etapa de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 4000 l es de 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y el
30 porcentaje mínimo de viabilidad celular es ∗ 80%. Estos valores ejemplares aseguran que se use una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de producción de 20.000 l.
El biorreactor de siembra de 20.000 l se inocula con inóculo a partir de la etapa de expansión en biorreactor de siembra de 4000 l a una densidad de células viables inicial diana de 1,0 a 1,8 x 106 células viables/ml. El cultivo se incuba en medio CD-CHO a 37 ºC durante un máximo de 6 días. Valores ejemplares para la densidad final de 35 células viables en la etapa de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 20.000 l es de 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y el porcentaje mínimo de viabilidad celular es ∗ 80%. Estos valores ejemplares aseguran que se use una cantidad suficiente de células viables antes de iniciar la fase de producción en el biorreactor de producción de
20.000 l.
Producción a escala comercial de CTLA4-Ig: La fase de producción que sucede en un biorreactor de producción de
40 20.000 l produce proteína CTLA4-Ig tanto en alta cantidad como de alta calidad, lo que implica procesamientos de cultivo que tienen un desplazamiento de temperatura en dos etapas. El cultivo de 20.000 l que se incuba en medio de CD-CHO a 37 ºC durante un máximo de 6 días (como se ha descrito anteriormente) se somete a un desplazamiento de temperatura (desplazamiento T) de 37 ºC a 34 ºC en el día 6 (el final de la fase de crecimiento logarítmico). Doce horas después del desplazamiento de temperatura de 37 ºC a 34 ºC, el medio CD-CHO se
45 suplementa con un medio de alimentación eRDF modificado (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA; Tablas 16, 17), y esta alimentación se proporciona a diario al reactor de producción en forma de bolo (1% p/p).
Tabla 16: Composición del medio de alimentación eRDF
Componente Concentración
Medio eRDF-1 (Invitrogen Corp.) 16,47 g/kg Dextrosa 30,29 g/kg D-galactosa 12,38 g/kg L-Glutamina 4,02 g/kg Insulina r-humana (solución a 10 mg/ml) 0,98 ml/kg TC Yeastolate 4,90 g/kg Agua La necesaria Solución de HCl 1 N 0 -5 ml/kg hasta ajustar el pH Solución de NaOH 10 N 0 -2 ml/kg hasta ajustar el pH
Tabla 17: Composición del medio eRDF-1
Componente Concentración (mg/l)
Sulfato cúprico 5 H2O 0,0008 Sulfato ferroso 7 H2O 0,220 Sulfato de magnesio (MgSO4) 66.20 Sulfato de zinc 7 H2O 0,230 Piruvato sódico 110,0 Ácido DL-lipoico tióctico 0,050 Ácido linoleico 0,021 L-Alanina 6,68 L-Arginina 581,44 L-Asparagina 94,59 Ácido L-aspártico 39,93 L-Cistina 2 HCl 105,38 Ácido L-glutámico 39,7 Glicina 42,8 L-Histidina HCl-H2O 75,47 L-Isoleucina 157,40 L-Leucina 165,30 L-Lisina HCl 197,26 L-Metionina 49,24 L-Fenilalanina 74,30 L-Prolina 55,3 L-Hidroxiprolina 31,5 L-Serina 85,10 L-Treonina 110,8 L-Triptófano 18,40 L-Tirosina 2 Na 2H2O 108,10 L-Valina 108,9 Ácido para amino benzoico 0,51 Vitamina B12 0,339 Biotina 1,00 D-Pantotenato de Ca 1,29 Cloruro de colina 12,29 Ácido fólico 1,96 i-Inositol 46,84 Niacinamida 1,47 Piridoxal HCl 1,00 Piridoxina HCl 0,420 Riboflavina 0,21 Tiamina HCl 1,59 Putrescina 2HCl 0,020
El cultivo de 20.000 l se incuba en medio CD-CHO suplementado diariamente con medio de alimentación eRDF a 34 ºC durante un máximo de 4 días. En el día 10, el cultivo de 20.000 l se somete a un segundo desplazamiento de la T de 34 ºC a 32 ºC. El cultivo de producción de 20.000 l en el biorreactor de producción se mantuvo a 32 ºC durante un máximo de 8 días. En el día 18, se analizó una muestra de cultivo para los siguientes valores ejemplares: la densidad de células viables en la etapa de producción en biorreactor de siembra de 20.000 l es 3,0 a 8,0 x 106 células/ml; el porcentaje mínimo de viabilidad celular ∗ 38%; la proporción molar final de ácido siálico (descrita en otra parte) es ∗ 6; y el título final de proteína CTLA4-Ig es de 0,5 a 1,3 g/l. Estos valores ejemplares aseguran que se produzca un producto proteico de calidad y en cantidad suficiente por la línea celular CHO recombinante y que el cultivo de células de mamífero de 20.000 l está listo para recogerse.
Al cultivo en el biorreactor durante la fase de producción se le da una alimentación diaria de bolo usando medio eRDF modificado (Tabla 16, 17), de la siguiente manera: comenzando 12 horas después del desplazamiento de temperatura inicial (37 ºC a 34 ºC), se añadió un mínimo de volumen de cultivo al 1% como medio de alimentación; si el nivel de glucosa caía por debajo de 3 g/l, se añade un volumen calculado para llevar el nivel de glucosa de nuevo a 3 g/l.
La fase de producción tuvo una duración de 18 días en la escala de 20.000 l. Las muestras se tomaron en una base diaria desde el biorreactor de producción para el análisis. Por ejemplo, una muestra usada para el recuento de células se tiñó con azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO). El recuento celular y la determinación de la viabilidad celular se realizaron usando un hemocitómetro para contar las células viables teñidas al microscopio. Para el análisis de metabolitos, se centrifugó una alícuota de muestra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4 ºC) para sedimentar las células. El sobrenadante se analizó para el título de proteína, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO2, pCO2, amoniaco, y LDH, usando técnicas y protocolos practicados de forma convencional en la técnica.
Ejemplo 15: Purificación de CTLA4-Ig recombinante
Cromatografía de intercambio aniónico QXL para la purificación de CTLA4-Ig: La etapa de cromatografía de intercambio aniónico en el procedimiento de CTLA4-Ig usa la resina de cromatografía de intercambio aniónico Q Sepharose Extreme Load (QXL). Esta resina la suministra GE Healthcare, Waukesha, WI (antiguamente Amersham Biosciences). La etapa de cromatografía QXL es capturar y concentrar la dímero CTLA4-Ig a partir del material en proceso de las etapas de operación de recogida para su posterior procesamiento corriente abajo.
Se compacta una columna de 1,0-2,0 m de diámetro interno con resina QXL hasta una altura de 17 a 30 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 643 l a 1018 l. La columna se cualifica para su uso determinando la altura equivalente a una placa teórica (HETP) y la asimetría (As) de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna QXL.
La operación de la columna QXL se realiza a temperatura ambiente. El caldo de cultivo celular aclarado se carga en una columna QXL equilibrada. La etapa de cromatografía de QXL se realiza usando un caudal máximo de 99,4 L/min. Se mantiene la presión de entrada de la columna por debajo de 241,25 kPa (35 psig). La carga máxima de proteína CTLA4-Ig para la columna QXL es 28 gramos de CTLA4-Ig por litro de resina.
La columna de cromatografía QXL primero se desinfecta con una solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se realiza usando de 2 a 4 volúmenes de columna (CV) de la solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se completa cuando la conductividad del efluente de la columna es igual a 169 ! 33 mS/cm y la columna se mantiene durante 60 a 120 minutos.
Después de la etapa de desinfección, se equilibra la columna con un tampón HEPES 75 mM, cloruro sódico 360 mM, pH 8,0. El equilibrado se completa cuando se han pasado un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado a través de la columna y el pH del efluente es 8,0 ! 0,2 y la conductividad del efluente es 13,4 ! 1,0 mS/cm.
El material en proceso de la etapa de operación de recogida se carga en la columna QXL. La columna se lava con un mínimo de 10 CV de tampón de lavado (HEPES 75 mM, NaCl 360 mM, pH 8,0), y se mide la absorbancia a 280 nm (A280) del efluente de la columna al final de la etapa de lavado. Después se eluye CTLA4-Ig de la columna con un tampón HEPES 25 mM, NaCl 325 mM o NaCl 850 mM, pH 7,0. El eluato se desvía hacia un recipiente de recogida cuando la A280 aumenta a ∗ 0,02 unidades de absorbancia (UA) por encima del valor de UA al final de la etapa de lavado. El eluato se recogió hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuye hasta un valor de # 1,0 UA.
Se recoge un producto de dímero CTLA4-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4-Ig que es ∗ 8, y está presente una combinación de material de alto peso molecular de CTLA4-Ig a # 25,7%. El material de alto peso molecular de CTLA4-Ig, que incluye tetrámeros, después puede purificarse adicionalmente para su uso como una sustancia diferente para los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento.
CIH en fenil Sepharose FF para la purificación de CTLA4-Ig: La etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) usa la resina Fenil Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Waukesha, WI (antiguamente Amersham Biosciences)). La etapa de CIH reduce el nivel de material de alto peso molecular de CTLA4-Ig presente en la combinación de productos de QXL. El dímero CTLA4-Ig no se une a la resina de CIH en las condiciones de carga usadas para la etapa de CIH.
Se compacta una columna de 1,0 a 2,0 m de diámetro interno con resina Fenil Sepharose Fast Flow a una altura de 18 a 22 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 680 a 852 l. La columna se cualifica para su uso determinando la HETP y As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna de CIH.
La operación de la columna de CIH se realiza a temperatura ambiente. La combinación de eluato de la etapa de la columna QXL se carga sin tratamiento adicional en la columna de CIH equilibrada. La etapa de CIH se ejecuta a un caudal máximo de 65,4 l/min y a una presión de funcionamiento de # 89,61 kPa (13 psig). La carga máxima de proteína CTLA4-Ig aplicada a la columna de CIH es 10,0 g de proteína CTLA4-Ig por litro de resina. Pueden emplearse ciclos múltiples de la etapa de CIH en base a la cantidad de proteína CTLA4-Ig presente en la combinación de eluato QXL.
La columna de CIH primero se desinfecta con una solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se completa cuando se han pasado de 2 a 4 CV de la solución de hidróxido sódico 1 N a través de la columna. La columna se mantiene entonces durante 60 a 120 minutos para asegurar la desinfección.
Después de la etapa de desinfección, la columna se equilibra con un tampón HEPES 75 mM, cloruro sódico 2,55 M, pH 7,0. El equilibrado se completa cuando se han pasado un mínimo de 3 CV del tampón de equilibrado a través de la columna y el pH del efluente es 7,0 ! 0,3 y la conductividad es de 71,5 a 75,5 mS/m.
El eluato de la etapa de QXL se aplica a la columna de CIH equilibrada. La columna después se lava con el tampón de búsqueda de equilibrio hasta que la A280 del efluente disminuye hasta entre 0,8 y 1,0 UA. El efluente contiene proteína CTLA4-Ig de cada ciclo de la etapa de CIH se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m en un recipiente de recogida de acero inoxidable común. Esta combinación de productos de CIH se mantiene en el recipiente de recogida a 2 º a 8 ºC. El tiempo máximo de mantenimiento en el recipiente de recogida es de 3 días.
Se recoge un producto de dímero CTLA4-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4-Ig, y está presente una combinación de material de alto peso molecular de CTLA4-Ig a # 2,5%.
Cromatografía de afinidad de Proteína A recombinante para la purificación de CTLA4-lg: La resina de afinidad de Proteína A recombinante Sepharose Fast Flow (rPA) usada en el procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente abajo se obtiene de GE Healthcare (Waukesha, WI (antiguamente Amersham Biosciences)). La etapa de cromatografía en columna de rPA purifica adicionalmente la proteína CTLA4-Ig. Esta etapa elimina el ADN y las proteínas de la célula huésped incluyendo la proteína quimiotáctica 1 de monocitos (MCP-1).
Se compacta una columna de 80 a 140 cm de diámetro interno con resina de rPA hasta una altura de 18 a 25 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 339 a 372 l. La columna se cualifica para su uso determinando la HETP y la As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna. La cantidad máxima de usos para la resina de rPA establecida en un estudio de vida útil de la resina es 60.
La operación de la columna de rPA se realiza a temperatura ambiente. La combinación de productos de inactivación viral se carga en la columna de rPA equilibrada. La etapa de rPA se hace funcionar a un caudal máximo de 26,7 l/min y una presión de funcionamiento de # 89,61 kPa (13 psig). La carga máxima de proteína CTLA4-Ig aplicada a la columna de rPA es 25 g de proteína CTLA4-Ig por litro de resina.
La columna de rPA se equilibra con un tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, pH 8,0. El equilibrado se completa cuando se han pasado un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado a través de la columna y los valores de pH y conductividad del efluente están entre 7,8 a 8,2 y de 23,0 a 27,0 mS/cm, respectivamente.
La combinación de productos de la etapa de inactivación viral se aplica a la columna de rPA equilibrada. La etapa de cromatografía en rPA incluye dos etapas de lavado. La primera etapa de lavado se realiza usando un mínimo de 5 CV de un tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH 8,0 para retirar el material débilmente unido de la columna de rPA. La segunda etapa de lavado se realiza usando un tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, pH 8,0. La segunda etapa de lavado usa un mínimo de 5 CV para eliminar el Triton X-100 residual de la columna de rPA.
La proteína CTLA4-Ig se eluye de la columna de cromatografía de rPA con un tampón glicina 100 mM, pH 3,5. El eluato se desvía hacia un recipiente de recogida cuando la A280 aumenta hasta ∗ 0,2 UA por encima de la línea basal. El efluente de la columna se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m en un recipiente de recogida equipado con un agitador. El eluato se recoge hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuye hasta un valor de # 0,2 UA. El pH de la combinación de eluato se ajusta a pH 7,5 ! 0,2 con tampón HEPES 2 M, pH 8,0. La combinación de productos de la etapa de cromatografía en rPA se mantiene a 2 º a 8 ºC durante un máximo de 3 días.
Se recoge un producto de dímero CTLA4-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4-Ig que es ∗ 8; está presente una combinación de material de alto peso molecular de CTLA4-Ig en # 2,5%; y está presente una combinación de MCP-1 de # 38 ng/ml.
Cromatografía de intercambio aniónico QFF para la purificación de CTLA4-Ig: La etapa de cromatografía de intercambio aniónico en el procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente abajo usa una resina de cromatografía de intercambio aniónico Q Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare (Waukesha, WI (antiguamente Amersham Biosciences). El objetivo de la etapa de cromatografía QFF es reducir los niveles de proteína A residual y proporcionar una reducción adicional del ADN de la célula huésped de la combinación de productos de la etapa de filtración viral. La etapa de la columna QFF también se usa para controlar la proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig de la combinación de productos de la etapa de cromatografía QFF y para proporcionar un control adicional de los niveles de material de alto PM de CTLA4-Ig en proceso. El punto de control principal en el proceso para la reducción de material de alto PM de CTLA4-Ig es la etapa de CIH.
Se compacta una columna de 60 a 140 cm de diámetro interno con resina QFF hasta una altura de 28 a 35 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 536 a 667 l. La columna se cualifica para su uso determinando la HETP y la As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna.
La operación de la columna QFF se realiza a temperatura ambiente. La combinación de productos de la etapa de filtración viral se carga en la columna QFF equilibrada. La etapa QFF se hace funcionar a un caudal máximo de 38,7 l/min y una presión de funcionamiento de ≥ 241,25 kPa (35 psig). La carga máxima de proteína CTLA4-Ig aplicada a la columna de QFF es 25 g de proteína CTLA4-Ig por litro de resina.
La columna de cromatografía de QFF primero se desinfecta con una solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se realiza usando de 2 a 4 CV de la solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se completa cuando la conductividad del efluente de la columna es igual a 136 a 202 mS/cm y la columna se mantiene durante 60 a 120 minutos.
Después de la etapa de desinfección, la columna se equilibra con un tampón HEPES 25 mM, cloruro sódico 100 mM, pH 8,0. El equilibrado se completa cuando se han pasado un mínimo de 4 CV de tampón de equilibrado a través de la columna y el pH del efluente es de 7,7 a 8,3 y la conductividad es de 10,5 a 12,9 mS/cm.
La combinación de productos de etapa de filtración viral contenida en bolsas de bioprocesos se transfiere a un recipiente de recogida de acero inoxidable estéril.
La combinación de productos de la etapa de filtración viral se aplica a la columna QFF equilibrada. La etapa de cromatografía en QFF incluye dos etapas de lavado. La primera etapa de lavado se realiza usando un mínimo de 5,0 CV de un tampón HEPES 25 mM, NaCl 120 mM, pH 8,0. La segunda etapa de lavado se realiza usando un mínimo de 5,0 CV de un tampón HEPES 25 mM, NaCl 130 mM, pH 8,0.
El dímero CTLA4-Ig se eluye de la columna de cromatografía QFF usando un tampón HEPES 25 mM, NaCl 200 mM, pH 8,0. La recogida de eluato se inicia cuando la A280 del efluente comienza a aumentar. Durante la elución, el efluente de la columna se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m en el recipiente de recogida de acero inoxidable. El eluato se recoge hasta que la absorbancia del borde de salida del pico de elución disminuye hasta # 0,2 UA por encima de la línea basal. El recipiente de recogida después se enfría hasta 2 º a 8 ºC. El tiempo de mantenimiento máximo para la combinación de productos de la etapa de cromatografía QFF a 2 º a 8 ºC es de 3 días.
Se recoge un producto de dímero CTLA4-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4-Ig; está presente una combinación de material de alto peso molecular de CTLA4-Ig a # 2,5%; está presente una combinación de material de bajo peso molecular de CTLA4-Ig (por ejemplo monómero de CTLA4-Ig) a # 0,5%; y está presente una combinación de MCP-1 de # 9,5 ng/ml.
Se usa el sistema Pall Filtron TFF en la etapa de concentración y diafiltración del procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente abajo. El objetivo de esta etapa es concentrar la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF de 45 a 55 g/l e intercambiar el tampón de elución usado en la etapa de cromatografía en QFF con el tampón final usado para composiciones de CTLA4-Ig. La combinación de productos de proteína CTLA4-Ig concentrada se transfiere a través de un filtro de fluoruro de polivinilideno de 0,2 ∀m y en una bolsa de bioprocesos de de 50 l.
Ejemplo 16: Determinación de la proporción molar de CTLA4-Ig de monosacáridos amino
Este ejemplo proporciona procedimientos para obtener proporciones molares de monosacáridos amino (N-acetil galactosamina, N-acetil glucosamina) a proteína en muestras de CTLA4-Ig.
Instrumentación: Sistema de electroforesis capilar Beckman P/ACE MDQ CE System, sistema de detección de fluorescencia inducida por láser (LIF) Detector Beckman (acoplado con P/ACE MDQ), capilar no recubierto (d.i. 25 ∀m; d.e. 360 ∀m), de 27 a 31 cm de longitud total para acomodar MDQ P/ACE o 55 10 Polymicro Technologies, Nº de catálogo TSP025375; mezcladora Maxi-Mix Thermolyne, (Nº de catálogo VWR 58810-185)
Reactivos:
Solución de hidrólisis (solución acuosa de HCl 4 N) Se añaden 160 ml de HCl 6 N y 80 ml de agua calidad HPLC a un frasco de vidrio de 250 ml. Se agita para mezclar bien. Se almacena a 2-8 ºC durante hasta 6 meses. Solución de derivatización I (solución acuosa de APTS 0,1 M) Se añaden 192 ∀l de agua calidad HPLC a 10 mg de APTS en polvo en un vial de vidrio. Se agita con vórtice el vial 5-10 segundos para disolver completamente el APTS. Se almacena a -20 ºC durante hasta un año. Solución de derivatización II (ácido acético 1 M y NaBH3CN 0,25 M) Se diluyen 20 ∀l de ácido acético con 320 ∀l de agua calidad HPLC (dilución de factor 17) en un tubo de centrífuga de 0,4 ml para preparar una solución de ácido acético 1 M. Se pesan 2,0 ! 0,5 mg de NaBH3CN en un vial criogénico. Usando la siguiente fórmula, se añade un volumen apropiado de la solución de ácido acético 1 M para preparar NaBH3CN 0,25 M. Volumen (∀l) = 103 x (peso de NaBH3CN en mg)/(62,84 g/mol x 0,25 mol/l)
. El cianoborohidruro sódico (NaBH3CN) debe almacenarse en la oscuridad en un desecador. . Se recomienda subdividir el reactivo en una serie de crioviales de 2,0 ml para su almacenamiento para evitar la apertura repetida del frasco de reactivo original de la siguiente manera: . Se pesan 1,0 g ! 0,2 mg de cianoborohidruro sódico en un criovial de 2,0 ml. Se forman alícuotas de todo el contenido de cianoborohidruro sódico del frasco original de esta manera. . Se tapan herméticamente y se etiquetan los crioviales secuencialmente (1, 2, 3, etc.) junto con el nombre del reactivo, número de lote y una fecha de caducidad de 6 meses. . Los viales deben sellarse con parafilm para evitar la humedad. . Se pesa cianoborohidruro sódico para la Solución de derivatización II no más de tres veces del mismo criovial. Se toma nota de esto y del número de secuencia del criovial en la hoja de trabajo de laboratorio. . Puede aparecer un pico de reactivo observado en el perfil de EC o un mal etiquetado después de la apertura repetida del criovial o con ese lote particular de cianoborohidruro sódico. Si esto afecta a los resultados, se desecha el criovial que se está usando y se pesa reactivo de un criovial con el siguiente número de secuencia o de un nuevo lote de cianoborohidruro sódico.
Tampón de re-acetilación (bicarbonato sódico 25 mM, pH 9,5)
Se pesan 0,210 ! 0,02 g de bicarbonato sódico en un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml limpio. Se añaden 90 ml de agua calidad HPLC, y se mezclan en una placa de agitación hasta que las sales se disuelven completamente. Se ajusta el pH a 9,5 ! 0,1 con NaOH 10 N. Se añade agua calidad HPLC para hacer un volumen final de 100 ml. Se filtra (etapa 1.26) la solución y se almacena a temperatura ambiente durante hasta 3 meses.
Tampón de procesamiento (tetraborato sódico 60 ! 5 mM, pH 9.25)
Se pesan 1,21 ! 0,02 g de tetraborato sódico en un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml limpio. Se añaden 90 ml de agua calidad HPLC, y se mezclan en una placa de agitación hasta que las sales se disuelven completamente. Se ajusta el pH a 9,25 ! 0,10 con NaOH 10 N. Se añade agua calidad HPLC para hacer un volumen final de 100 ml para una concentración final de 60 ! 5 mM. Para una solución 55 mM, se pesan 1,11 g (! 0,02) de tetraborato sódico y se siguen las instrucciones anteriores para la disolución y titulación. Para una solución 65 mM, se pesan 1,31 g (! 0,02) de tetraborato sódico y se siguen las instrucciones anteriores para la disolución y titulación. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 3 meses. Se prepara tampón nuevo si la resolución del pico se ve afectada (valor R lt;1,0). Opcional: Se diluye solución de tampón tetraborato (MicroSolv) añadiendo 120 ml de agua ultra pura a 80 ml de tampón tetraborato sódico 150 mM para una concentración final de 60 mM (! 5 mM). Se titula con NaOH 10 N para llevar el pH de la solución a 9,25 (! 0,1). Para una solución de tetraborato 55 mM, se diluyen 66 ml de tampón tetraborato sódico 150 mM en 114 ml de agua ultra pura. Se titula igual que anteriormente. Para una solución de tetraborato 65 mM, se diluyen 78 ml de tampón tetraborato sódico 150 mM en 102 ml de agua ultra pura. Se titula igual que anteriormente. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 3 meses. Se prepara tampón nuevo si la resolución del pico se ve afectada (valor R lt;1,0).
Soluciones de aclarado capilar
Solución de NaOH N
Se añade 1 ml de solución de NaOH 10 N a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 9 ml de agua
calidad HPLC. Se mezcla bien por agitación con vórtice 5-10 segundos. Se almacena a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
Solución de HCl N:
Se añade 1 ml de solución de HCl 6 N a un tubo graduado de plástico de 15 ml que contiene 5 ml de agua calidad HPLC. Se mezcla bien por agitación con vórtice 5-10 segundos. Se almacena la solución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. 3.6.3 Solución de metanol al 80%: Se añaden 8 ml de metanol calidad HPLC a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 2 ml de agua calidad HPLC. Se mezcla bien por agitación con vórtice 5-10 segundos. Se almacena la solución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
Soluciones madre patrón de monosacárido
N-Acetil glucosamina (GalNAc)
Se pesan de forma precisa 5 ! 1 mg de GalNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Se añade 1 ml de agua calidad HPLC y se mezcla bien agitando con vórtice hasta que se disuelve. Se registra la concentración exacta de la solución (mg/ml).
N-Acetil galactosamina (GlcNAc)
Se pesan de forma precisa 5 ! 1 mg de GIcNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Se añade 1 ml de agua calidad HPLC y se mezcla bien agitando con vórtice hasta que se disuelve. Se registra la concentración exacta de la solución (mg/ml).
N-Acetil manosamina (ManNAc)
Se pesan de forma precisa 5 ! 1 mg de ManNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Se añade 1 ml de agua calidad HPLC y se mezcla bien agitando con vórtice hasta que se disuelva. Se registra la concentración exacta de la solución (mg/ml). Se almacenan las soluciones madre patrón de monosacárido a -20 ºC durante hasta 1 año.
Solución de trabajo de monosacárido I: Solución de trabajo de patrón interno
Se diluye la solución madre de ManNAc 100 veces con agua calidad HPLC añadiendo 20 ∀l de solución madre de ManNAc en un ml vial criogénico de 2 ml que ya contiene 1980 ∀l de agua calidad HPLC. Se agita con vórtice de aproximadamente 5 a 10 segundos. Se almacena la solución de trabajo de patrón interno a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Solución de trabajo de monosacárido II: Solución de trabajo de patrón de mezcla amino
En un vial criogénico de 2,0 ml que contiene 1960 ∀l de agua calidad HPLC, se añaden 20 ∀l de soluciones madre de GalNAc y GIcNAc, respectivamente. Se agita con vórtice de aproximadamente 5 a 10 segundos. Se almacena la solución de trabajo de patrón de mezcla amino a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Soluciones de muestra y material de referencia.
Se descongelan las muestras de proteína congeladas a 2-8 ºC y se mezclan suavemente por inversión. Se diluyen tanto muestras como el material de referencia con agua calidad HPLC a aproximadamente 1,0 mg/ml. Se toma nota de la concentración a tres cifras significativas.
Condiciones de procesamiento de EC
Tampón de procesamiento (etapa 2.5) tetraborato sódico 60 mM, pH 9,25 Temperatura del cartucho capilar 25 ºC Voltaje de 25 a 30 kV, modo positivo Condiciones del detector, detector LIF, excitación: 488 nm, emisión: 520 nm. Inyección de la muestra, modo de inyección a presión, 20 s a 3,45 kPa (0,5 PSI) Tiempo de procesamiento 10 minutos Almacenamiento de las muestras 10 ºC
Procedimiento
Nota: Se usa una pipeta de 10 ∀l y micro puntas para transferir volúmenes de muestra de 10 ∀l y se usan pipetas del tamaño adecuado para transferir otros reactivos (véanse los intervalos en las etapas 2.10 a 2.14).
Hidrólisis
En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, se añaden 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 200 ∀l de solución hidrólisis 4 N (etapa 3.1). Esto sirve como blanco del sistema. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, se añaden 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 10 ∀l de la solución patrón de mezcla amino (etapa 3.9). Se añaden adicionalmente 200 ∀l de solución de hidrólisis 4 N. Esto sirve como patrón de monosacárido para la cuantificación y la idoneidad del sistema. Se prepara por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, se añaden 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 10 ∀l de solución de material de referencia de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml). Se añaden adicionalmente 200 ∀l de solución de HCl 4 N. Se prepara por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, se añaden 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 10 ∀l de solución de muestra (aproximadamente 1 mg/ml). Se añaden adicionalmente 200 ∀l de solución de HCl 4 N. Se prepara por duplicado. Se agitan las muestras con vórtice durante aproximadamente 10 segundos y se centrifugan durante aproximadamente 5-10 segundos. Se colocan las muestras en una gradilla de viales de 96 posiciones y se incuba en un horno a 95 ºC durante 6 horas. Después de la hidrólisis, se colocan las muestras hidrolizadas a -20 ºC durante 10 minutos para que se enfríen. Se centrifugan brevemente las muestras hidrolizadas hasta obtener algún condensado en el fondo del tubo (5-10 segundos a alta velocidad). Se evaporan las muestras a sequedad en SpeedVac.
Nota: Se apaga el calor del SpeedVac y se establece la velocidad de evaporación a quot;Bajaquot;.
Se reconstituye cada muestra con 100 ∀l de agua calidad HPLC y se agita 10-15 segundos. Se evaporan las muestras a sequedad en SpeedVac.
Nota: Se apaga el calor del SpeedVac y se establece la velocidad de evaporación a quot;Bajaquot;.
Re-acetilación
Se reconstituye cada muestra con 10 ∀l de tampón de re-acetilación M6 y se agita 5-10 segundos para mezclar bien. Se añaden 4 ∀l de reactivo de re-acetilación M3 en cada tubo. Se agita con vórtice durante 5-10 segundos. Se incuba en hielo durante 30 minutos.
Nota: El tampón de re-acetilación (M6) y de reactivo (M3) pueden remplazarse respectivamente con NaHCO3 25 mM (se añaden 20 ∀l) preparado en el sitio y anhídrido acético (se añaden 4 ∀l).
Se evaporan las muestras a sequedad en SpeedVac.
Nota: Se apaga el calor del SpeedVac y se establece la velocidad de evaporación a quot;Bajaquot;.
Se reconstituye cada muestra con 100 ∀l de agua calidad HPLC y se agita 10-15 segundos. Se vaporan las muestras a sequedad en SpeedVac.
Nota: Se apaga el calor del SpeedVac y se establece la velocidad de evaporación a quot;Bajaquot;.
Derivatización
Se coloca la microcentrífuga en el horno para que se equilibre a la temperatura del horno de 55 ºC. Se reconstituye cada muestra con 10 ∀l de solución de derivatización I (solución de APTS 0,1 M, etapa 3.2). Se agita con vórtice aproximadamente 5-10 segundos. Se añaden 5 ∀l de la solución de derivatización II (HAc 1 M y NaBH3CN 0,25 M, etapa 3.3). Se agita con vórtice aproximadamente 5-10 segundos y se centrifuga. Se cargan rápidamente los viales de muestra en la centrífuga precalentada, y se coloca la centrífuga de nuevo en el horno a 55 ºC. Se incuba durante 3 h con centrifugación a 2000 rpm. Esto evita la condensación de disolvente en la superficie del vial.
Preparación de la instrumentación
Al instalar un nuevo capilar, se aclara en modo de alta presión (551,43 kPa (80 PSI)) usando las siguientes etapas:
NaOH 1 N durante 20 minutos. Agua calidad HPLC durante 10 minutos. Tampón de tetraborato sódico 60 mM durante 10 minutos.
Operación
Antes de cada operación, se ejecutan las secuencias de lavado/aclarado para aclarar el capilar. A continuación, se procesa el patrón de idoneidad del sistema (patrón de monosacárido) para asegurar que el sistema es adecuado. Usando NaOH 1 N puede grabarse el interior de los capilares de diferentes proveedores y provocar un desplazamiento en los tiempos de migración a lo largo de la carrera. Si esto hace que el tiempo de migración del último pico (GlcNAc) sea de más de 10,0 minutos, puede ser necesario remplazar NaOH 0,1 N con NaOH 0,1 N
o agua de calidad para HPLC para el aclarado de la etapa 2. Cuando se usa un capilar equivalente y el procedimiento de lavado anterior no es adecuado puede ser necesario usar metanol al 80% y/o HCl 1 N para que el último pico (GlcNAc) esté dentro de los valores ejemplares de 10,0 minutos.
Preparación para inyección
Después de la derivatización, se deja que las muestras se enfríen hasta temperatura ambiente. Se centrifugan aproximadamente 10 segundos a temperatura ambiente, hasta que se obtiene un condensado en el fondo del
5 tubo. Se añaden 85 ∀l de agua calidad HPLC a cada tubo para llevar el volumen final de cada muestra a 100 ∀l. Se agita con vórtice durante 5-10 segundos. Se transfieren 10 ∀l de muestra de cada tubo a un micro vial de EC y se añaden 190 ∀l de agua calidad HPLC para cada tubo. Se agita con vórtice durante 5-10 segundos.
10 Etapas de aclarado y secuencia de inyección:
Nota: Por cada cuatro inyecciones, se cambia el tampón de procesamiento de EC con tampón de procesamiento de EC recién preparado (debido al efecto de agotamiento iónico). El aclarado del capilar se realiza a 275,71 kPa (40 psi).
Etapa
Descripción Tiempo deprocesamiento(min)
1 (Aclarado)
Agua calidad HPLC 1
2 (Aclarado)
remítase a la sección 5.4.2.3 NaOH 1 N o NaOH 0,1 N 3
O
agua calidad HPLC
1
Nota: Cuando se usa agua HPLC para el aclarado de la etapa 2, pueden combinarse las etapas 1, 2, y 3 en una única ejecución de 3 minutos.
3 (Aclarado)
agua calidad HPLC 1
4 (Aclarado)
Tampón de procesamiento de tetraborato sódico 60 mM 5
5 (Aclarado)
Blanco (Marcador de patrón interno) 10
6 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
7 (Aclarado)
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 1) 10
8 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
9
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 1) 10
10 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
11
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 2) 10
12 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
13
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 2) 10
14 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
15
Prep. CTLA4-Ig 1 10
16 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
17
Prep. CTLA-Ig 2 10
18 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
19
Prep. 1 de muestra 1 10
(continuación) 5
Etapa
Descripción Tiempo deprocesamiento(min)
20 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
21
Prep. 1 de muestra 1 10
22 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
23
Prep. 2 de muestra 1 10
24 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
25
Prep. 2 de muestra 1 10
26 (Aclarado)
Repetir 1-4 18
27
Prep. 1 de muestra 2 10
28 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
29
Prep. 1 de muestra 2 10
30 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
31
Prep. 2 de muestra 2 10
32 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
33
Prep. 2 de muestra 2 10
34 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
35
Prep. 1 de muestra 3 15
36 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
37
Prep. 1 de muestra 3 10
38 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
39
Prep. 2 de muestra 3 10
40 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
41
Prep. 2 de muestra 3 10
42 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
43
Prep. de material CTLA4-Ig 1 10
44 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
45
Prep. de material CTLA4-Ig 2 10
46 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
47
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 1) 10
48 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
49
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 1) 10
50
Repetir 1-4 10
51
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 2) 10
40 (continuación)
Etapa
Descripción Tiempo deprocesamiento(min)
52
Repetir 1-4 10
53
Idoneidad del sistema (Prep. patrón mono 2) 10
Idoneidad del sistema
Nota: Los valores de idoneidad del sistema se determinan usando la primera inyección del patrón de idoneidad del sistema salvo que se especifique otra cosa.
El electroferograma de la primera idoneidad del sistema debe ser similar al mostrado en la Figura 81, donde el pico 1 es GalNAc, el pico 2 es ManNAc; el pico 3 es GIcNAc.
Nota: Cuando tienen que usarse instrumentos de EC diferentes al Beckman PACE MDO, la longitud del capilar puede ser diferente a la especificada en este procedimiento debido a las diversas configuraciones de los cartuchos que alojan el capilar de separación. Esto causaría variaciones en el tiempo de migración del analito, así como en la intensidad del pico.
La resolución entre dos picos vecinos se calcula para el primer patrón de idoneidad del sistema por el instrumento de acuerdo con la siguiente ecuación:
2(t2 -t1)R = (W1 + W2)
Donde:
R = resolución
t2, t1 = tiempos de migración de los dos picos vecinos respectivamente
W1, W2 = anchuras de pico en la línea basal de los dos picos vecinos respectivamente
El valor de R debe ser ∗ 1.0. Si R lt;1,0, se aclara el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, se remplaza el tampón antiguo con tampón de procesamiento recién preparado o se remplaza el capilar. Para la última inyección de idoneidad del sistema, el último pico (GlcNAc) debe tener un factor de cola lt;1,4 usando la siguiente fórmula:
T = W0,05/2f
Donde:
T = factor de cola W0,05 = anchura del pico al 5% de la altura F = anchura del pico frontal en el máximo del pico
Si T ∗ 1,4, se aclara el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, se remplaza el tampón antiguo con tampón de procesamiento recién preparado o se remplaza el capilar. Las inyecciones replicadas muestran los siguientes valores ejemplares:
■
Proporción de área de pico de GIcNAc frente a MaNAc: DTR # 10% (calculado en la etapa 7.1)
■
El tiempo de migración de GIcNAc debe ser # 10,0 minutos
■
El perfil debe ser equivalente a la Figura 81, donde se observan los tres picos y el patrón interno (ManNAc) es el pico número 2.
Si no se alcanza alguno de los valores ejemplares antes de ensayar las muestras, primero se aumenta el voltaje si el tiempo de migración de GlcNAc es mayor de 10,0 minutos. A continuación, si la proporción de área de pico es gt; 10%, se prepara tampón de EC reciente asegurándose de su pH o se remplaza el capilar. Después de ajustar el instrumento, se repiten las inyecciones de idoneidad del sistema. Cuando se analiza el perfil del pico, si se produce una disminución significativa de la altura del pico de ManNAc, se comprueba que el cable de fibra óptica en el módulo LIF no está desalineado.
El porcentaje de DTR del patrón de monosacárido se determina comparando las proporciones de área de pico del patrón interno y los componentes del patrón de monosacárido. Se divide el área del pico de cada componente de monosacárido por el área del pico del patrón interno para cada inyección de patrón de monosacárido. Se calcula el porcentaje de DTR para GalNAc y GIcNAc para los dos patrones intercalados. La DTR debe ser # 10%. Si este valor ejemplar promediado no se cumple, entonces debe aclararse el capilar o remplazarse como anteriormente.
Cálculos
Cálculo de la proporción de área de pico de GalNAc y GIcNAc respecto al patrón interno (ManNAc). Se usa en inyecciones replicadas de los cuatro primeros patrones de idoneidad del sistema con el fin de cumplir los valores ejemplares anteriores y se realizan los mismos cálculos en todos los patrones de idoneidad del sistema intercalados inyectados antes y después de la(s) muestra (s).
Proporción de área de pico = Se divide el área del pico de cada componente de monosacárido (GlcNAc, GalNAc) por el área del pico del patrón interno (ManNAc) para cada patrón de idoneidad del sistema inyectado
área del pico de monosacáridoProporción de área de pico = área del pico de MaNAc
Se calcula la media de las proporciones de área de pico de GIcNAc y GalNAc en los patrones de idoneidad del sistema. También se calcula la desviación típica (DT) y el porcentaje de desviación típica relativa (% DTR)
Valores ejemplares: DTR para la proporción de área de pico de GIcNAc #10%.
Dos patrones de idoneidad del sistema intercalados inyectados antes y después de la(s) muestra (s): Porcentaje de DTR para la proporción de área de pico de GlcNAc y GalNAc #10%. Si este valor ejemplar promediado no se cumple (DTR gt; 10%), entonces el capilar tiene que volver a aclararse con los procedimientos de aclarado y tienen que procesarse de nuevo las muestras y los patrones de monosacárido intercalados. Si el valor ejemplar promediado sigue sin cumplirse, se remplaza el capilar y se aclara. Se procesan las muestras y los patrones de monosacárido intercalados de nuevo.
nx2 67x 2
9 89
Desviación típica =
n(n 81)
Donde:
n = número de mediciones en la muestra x = mediciones individuales
Desviación típica% DTR = x 100 Área del pico medida promedio
Se calcula la proporción molar de GalNAc/Proteína:
AGalNAc x AManNAc0 x VGalNAc0 x CGalNAc0 x PMAbataceptRGalNAc = AManNAc x AGalNAc0 x Vp x Cp x PMGlcNAc
Donde:
RGalNAc = proporción molar de GalNAc frente a proteína AGalNAc = área del pico (∀V·s) de GalNAc en la muestra AManNAc = área del pico (∀V·s) de ManNAc en la muestra AManNAc0 = área del pico (∀V·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido AGalNAc0 = área del pico (∀V·s) promedio de GalNAc en patrón de monosacárido VGalNAc0 = volumen de GalNAc contenido en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en
μl) CGalNAc0 = concentración de GalNAc contenida en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis
(en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) PMAbatacept = Peso molecular del material de referencia Abatacept de conformidad con el certificado de análisis
(COA) PMGlcNAc = Peso molecular de GalNAc (221,2 dalton)
Intercalado de patrones
Cuando se calculan las proporciones molares de material CTLA4-Ig y muestras, se usan los ocho patrones de idoneidad del sistema intercalados. Se promedian las áreas de los picos para su inclusión en esta ecuación. Esto tiene que usarse para las tres primeras muestras. Para todas las demás muestras, se usa siembre el área del pico promedio de los siguientes cuatro patrones de monosacárido intercalados y los cuatro patrones de monosacárido intercalados previos para los cálculos de la proporción molar.
AGlcNAc x AManNAc0 x VGlcNAc0 x CGlcNAc0 x PMCTLA4-Ig RGlcNAc = AManNAc x AGlcNAc0 x Vp x Cp x PMGlcNAc
Donde:
5 RGlcNAc = proporción molar de GlcNAc frente a proteína AGlcNAc = área del pico (∀V·s) de GlcNAc en la muestra AManNAc = área del pico (∀V·s) de ManNAc en la muestra AManNAc0 = área del pico (∀V·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido AGlcNAc0 = área del pico (∀V·s) promedio de GlcNAc en patrón de monosacárido
10 VGlcNAc0 = volumen de GlcNAc contenido en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl) CGlcNAc0 = concentración de GlcNAc contenida en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) 15 Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml)
PMCTLA4-Ig = Peso molecular del material de referencia de CTLA4-Ig
PMGlcNAc = Peso molecular de GlcNAc (221,2 dalton)
Valores ejemplares. El porcentaje de DTR para las dos proporciones de área de pico de los patrones de idoneidad del sistema amino no debe exceder el 10%. Las proporciones molares promedio para monosacáridos amino en el
20 material de referencia deben estar dentro de los intervalos especificados en la Tabla directamente a continuación. Para cada componente, el % DTR para los cuatro resultados (inyección duplicada de preparaciones duplicadas) debe ser lt;/= 25%.
Tabla -Intervalo proporción molar del material de referencia de CTLA4-Ig
Monosacárido
Intervalo
GalNAc
2,0-3,2
GlcNAc
18-32
Ejemplo 17: Determinación de la proporción molar de aminomonosacáridos (GalNAc y GlcNAc) por 25 electroforesis capilar (EC)
En una realización, la composición de CTLA4-Ig tiene la característica de tener de aproximadamente 15-35 moles de GlcNAc/mol de proteína y de aproximadamente 1,7-3,6 moles de GalNac/moles de proteína. El siguiente ejemplo describe un procedimiento para determinar estas proporciones molares.
Reactivos: Solución de hidrólisis (HCl 4 N); solución de derivatización I (solución acuosa de sal trisódica del ácido 8
30 amino-1,3,6, trisulfónico (APTS), 0,1 M); solución de derivatización II (NaBH3CN 0,25 M en ácido acético 1 M); tampón de re-acetilación (bicarbonato sódico 25 mM, pH 9,5); tampón de procesamiento (tetraborato sódico 60 ! 5 mM, pH 9,25), soluciones de aclarado capilar (NaOH 1 N; HCl 1 N, metanol al 80%); soluciones madre patrón de monosacáridos de GalNAc, GlcNAc y ManNAc a la concentración de 5 mg/ml; solución de trabajo de monosacárido
I: la solución de trabajo de patrón interno es una dilución de factor 100 de la solución madre de ManNAc; solución de
35 trabajo de monosacárido II: soluciones de trabajo de patrón de mezcla amino, dilución de factor 100 de las soluciones madre de GalNAc y GlcNAc.
Instrumentación: el sistema de EC es el Beckman P/ACE MDQ CE Sytem; Detector: sistema de detección inducido por láser (LIF) Beckman acoplado con P/ACE MDQ), capilar sin recubrir (d.i. 25 ∀m, d.e. 360 ∀m) de 27-31 cm de longitud total para acomodar P/ACE MDQ.
40 Condiciones de procesamiento de electroforesis capilar: tampón de procesamiento (tetraborato sódico 60 mM, pH 9,25), temperatura del cartucho capilar: 25 ºC, Voltaje: 25-30 kV, modo positivo, condiciones del detector: detector LIF, excitación a 488 nm, emisión a 520 nm, inyección de la muestra: modo de inyección a presión, 20s a 3,45 kPa (0,5 psi), tiempo de procesamiento: 10 min.; almacenamiento de la muestra: 10 ºC.
Hidrólisis: Se mezclaron 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 200 ∀l de HCl 4 N para hacer el blanco del 45 sistema. Se mezclaron 100 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 10 ∀l de solución de patrón de mezcla amino con
200 ∀l de HCl 4 N para hacer el patrón de monosacárido. Se mezclaron 10 ∀l de solución de trabajo de ManNAc y 10 ∀l de dímero CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml) con 200 ∀l de HCl 4 N para hacer la muestra de ensayo. Todos los tubos se agitaron con vórtice durante 10 segundos, y se centrifugaron durante 10 segundos, seguido de incubación a 95 ºC durante 6 horas. Después de la etapa de hidrólisis, las muestras se colocaron a -20 ºC durante 10 minutos para que se enfriaran. Las muestras se centrifugaron durante 10 segundos y se evaporaron a sequedad en SpeedVac.
Re-acetilación: Se reconstituyeron las muestras hidrolizadas y secas con 100 ∀l de agua calidad HPLC. Las muestras reconstituidas se re-acetilaron mediante la adición de 10 ∀l de tampón de re-N-acetilación M6 (Glyko) y 4 ∀l de reactivo de re-acetilación M3 (Glyko), seguido de mezcla y con incubación en hielo (30 min.). Las muestras se centrifugaron durante 10 segundos y se evaporaron a sequedad en SpeedVac.
Derivatización: Se equilibraron las muestras reconstituidas (100 ∀l de agua calidad HPLC) a 55 ºC, seguido de la adición de 10 ∀l de solución de derivatización l que, una breve mezcla, y la adición de 5 ∀l de solución de derivatización II. Las muestras se cargaron en una centrífuga pre-calentada y se incubaron durante 3 horas a 55 ºC con centrifugación a 2000 rpm.
Inyección de EC: El volumen final de las muestras después de la derivatización se llevó a 100 ∀l mediante la adición de agua de calidad HPLC, y se transfirieron 10 ∀l de muestras a un vial de micro EC con 190 ∀l de agua calidad HPLC. Antes de las inyecciones de muestra el cartucho de EC se lavó extensivamente con agua calidad HPLC (tiempo de procesamiento de 1-3 min.), seguido de un equilibrado con tampón de procesamiento (tiempo de procesamiento de 5 min.). Después del aclarado inicial, se inyectaron los patrones de monosacárido y las muestras para su análisis en el cartucho de EC (tiempo de procesamiento de 10 min.). Después de procesar la inyección de cada patrón o muestra de ensayo, se aclaró el cartucho de EC y se equilibró con agua calidad HPLC y tampón de procesamiento. El electroferograma de la idoneidad del sistema debe ser similar a la FIG. 30.
Cálculos: Se calcula la proporción de área de pico de GalNAc y GlcNAc en relación con el patrón interno de ManNAc.
Proporción de área de pico = área del pico de monosacárido (GalNAc o GlcNAc)/área del pico de ManNAc, en el que la desviación típica relativa (DTR) para la proporción de área de pico es igual o menor del 10%.
Cálculo de la proporción de monosacárido (por ejemplo GalNAc) a proteína CTLA4-Ig:
ProporciónGalNAc = (AGalNAc x AManNAcO x VGalNAcO x CGalNAcO x PMCTLA4-lg dímero) / (AManNAc x AGalNAcO x Vp x Cp x PMGalNAc)
ProporciónGalNAc = proporción molar de GalNAc frente a proteína
AGalNAc = área del pico (∀V·s) en muestra de GalNAc
AManNAc = área del pico (∀V·s) en muestra de ManNAc
AManNAcO = área del pico (∀V·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido
AGalNAcO = área del pico (∀V·s) promedio de GalNAc en patrón de monosacárido
VGalNAcO = volumen de GalNAc contenido en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl)
CGalNAcO = concentración de GalNAc contenida en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp = volumen de muestra de proteína usado para la hidrólisis (en μl)
Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml)
PM CTLA4-Ig = Peso molecular del dímero CTLA4-Ig
PMGalNAc = 221,2 dalton.
Tabla 18: Proporción molar media de monosacárido a moléculas o dímero CTLA4-Ig
MONOSACÁRIDO
INTERVALO
GalNAc
2,0-3,2
GlcNAc
18-32
Ejemplo 18: Determinación de la proporción molar de monosacáridos neutros (manosa, fucosa y galactosa) por electroforesis capilar (EC)
Reactivos: Solución de hidrólisis (ácido trifluoroacético (TFA) 2 M); solución de derivatización I (solución acuosa de sal trisódica del ácido 8-amino-1,3,6, trisulfónico (APTS) 0,1 M); solución de derivatización II (NaBH3CN 0,25 M en
5 ácido acético 1 M); tampón de procesamiento tetraborato sódico (60 ! 5 mM, pH 9,25), soluciones de aclarado capilar (NaOH 1 N; HCl 1 N, metanol al 80%); soluciones madre de patrón de monosacáridos de manosa (Man), fucosa (Fuc), galactosa (Gal) y xilosa (Xyl) a una concentración de 5 mg/ml; solución de trabajo de monosacárido I: la solución de trabajo de patrón interno es la dilución de factor 100 de la solución madre de Xyl; solución de trabajo de monosacárido II: soluciones de trabajo de mezcla neutra, dilución de factor 100 de las soluciones madre de Man, Fuc y Gal.
Instrumentación: El sistema de EC es Beckman P/ACE MDQ CE Sytem; Detector: sistema de detección inducido por láser (LIF) Beckman acoplado con P/ACE MDQ), capilar sin recubrir (d.i. 25 ∀m, d.e. 360 ∀m) de 27-31 cm de longitud total para acomodar P/ACE MDQ.
Condiciones de procesamiento de electroforesis capilar: tampón de procesamiento (tetraborato sódico 60 mM, pH
15 9,25), temperatura del cartucho capilar: 25 ºC, voltaje: 25-30 kV, modo positivo, condiciones del detector: detector LIF, excitación a 488 nm, emisión a 520 nm, inyección de la muestra: modo de inyección a presión, 20s a 3,45 kPa (0,5 psi), tiempo de procesamiento: 10 min., almacenamiento de la muestra: 10 ºC.
Hidrólisis: Se mezclaron 10 ∀l de solución de trabajo de xilosa y 200 ∀l de TFA 2 M para hacer el blanco del sistema. Se mezclaron 10 ∀l de solución de trabajo de xilosa y 10 ∀l de la solución de patrón de mezcla neutra con 200 ∀l de TFA 2 M para hacer el patrón de monosacárido. Se mezclaron 10 ∀l de solución de trabajo de xilosa y 10 ∀l de dímero CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml) con 200 ∀l de TFA 2 M para hacer la muestra de ensayo. Todos los tubos se agitaron con vórtice durante 10 segundos, y se centrifugaron durante 10 segundos, seguido de incubación a 95 ºC durante 6 horas. Después de la etapa de hidrólisis, las muestras se colocaron a -20 ºC durante 10 min. para enfriarlas. Las muestras se centrifugaron durante 10 segundos y se evaporaron a sequedad en SpeedVac.
25 Derivatización: Las muestras se reconstituyeron con 100 ∀l de agua calidad HPLC y se equilibraron 55 ºC, seguido de la adición de 10 ∀l de solución de derivatización, una breve mezcla, y la adición de 5 ∀l de solución de derivatización II. Las muestras se cargaron en una centrífuga pre-calentada y se incubaron durante 3 horas a 55 ºC, con centrifugación a 2000 rpm.
Inyección de EE: El volumen final de las muestras después de la derivatización se llevó a 100 ∀l por adición de agua de calidad HPLC, y se transfirieron 10 ∀l de las muestras a un microvial de EC con 190 ∀l de agua calidad HPLC. Antes de las inyecciones de muestra el cartucho de EC se aclaró extensivamente con agua calidad HPLC (tiempo de procesamiento de 1-3 min.), seguido de un equilibrado con tampón de procesamiento (tiempo de procesamiento de 5 min.). Tras el aclarado inicial, se inyectaron los patrones de monosacárido y las muestras para el análisis en el cartucho de EC (tiempo de procesamiento de 15 min.). Después del procesamiento de la inyección de cada patrón o
35 muestra de ensayo, se aclaró el cartucho de EC y se equilibró con agua calidad HPLC y tampón de procesamiento. El electroferograma de la idoneidad del sistema debe ser similar a la FIG. 31.
Cálculos: Se calcula la proporción de área de pico de Man, Gal y Fuc en relación con el patrón interno de xilosa.
Proporción de área de pico= área del pico de monosacárido (Gal, Fuc o Man)/área del pico de xilosa,
en el que la desviación típica relativa (DTR) para la proporción de área de pico es igual o menor del 10%.
Cálculo de la proporción de monosacárido (por ejemplo, Man) a proteína CTLA4-Ig:
ProporciónMan = (AMan xAXylO xVManO xCManO xPM CTLA4-lg dímero) / (AXyl xAManO x Vp x Cp x PMMan)
ProporciónMan = proporción molar de Man frente a proteína
AMan = área del pico (∀V·s) de Man en la muestra
AXyl = área del pico (∀V·s) de Xyl en la muestra
45 AXylO = área del pico (∀V·s) promedio de Xyl en el patrón de monosacárido
AManO = área del pico (∀V·s) promedio de Man en el patrón de monosacárido
VManO = volumen de manosa contenido en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl)
CManO = concentración de manosa contenida en la solución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp = volumen de muestra de proteína usado para la hidrólisis (en μ) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) PM CTLA4-Ig = Peso molecular de dímero CTLA4-Ig PMMan = 180,2 dalton.
Tabla 19: Proporción molar media de monosacáridos a moléculas o dímero CTLA4-Ig
MONOSACÁRIDO
INTERVALO
Manosa
10 -20
Fucosa
4,2 -7,0
Galactosa
9,2 -17
Ejemplo 19: Producción de CTLA4A29YL104E-Ig
CTLA4A29YL104E-Ig es una proteína de fusión diseñada por ingeniería genética, que consiste en el dominio de unión funcional de CTLA-4 humano modificado y el dominio Fc de inmunoglobulina humana de la clase IgG1. Se hicieron
10 dos sustituciones de aminoácidos en la región de unión a B7 del dominio CTLA-4 (L104E y A29Y) para generar esta molécula. Está compuesta por dos cadenas polipeptídicas glucosiladas de 357 aminoácidos cada una. Existe como dímero covalente unido a través de un enlace disulfuro intercatenario. CTLA4A29YL104E-Ig tiene una masa promedio de aproximadamente 91.800 Da determinada por asistida por espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
15 CTLA4A29YL104E-Ig es una forma modificada de CTLA4-Ig. La modificación consiste en mutaciones puntuales que dan como resultado dos sustituciones de aminoácidos (L104E y A29Y). En relación con CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig se une a CD80 (B7-1) con ~ 2 veces mayor avidez, y se une a CD86 (B7-2) con ~ 4 veces mayor avidez. CTLA4A29YL104E-Ig es aproximadamente 10 veces más eficaz que el abatacept en la inhibición de la proliferación de linfocitos T, la producción de citocinas, y la eliminación CD28-dependiente de células diana mediante células
20 citolíticas naturales. CTLA4A29YL104E-Ig provoca una inhibición moderada de la proliferación mediada por B7-1 de linfocitos T pero es notablemente más potente en el bloqueo de la proliferación mediada por B7-2 de linfocitos T. Este ejemplo describe la producción de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que comprenden la SEC ID Nº 4. Los procedimientos descritos en este ejemplo pueden adaptarse y extenderse a la producción de otras proteínas recombinantes, incluyendo aunque sin limitación, proteínas segregadas tales como citocinas y otras hormonas,
25 proteínas segregadas que son miembros de la superfamilia de Ig o comprenden una parte de una proteína de la superfamilia de Ig, y en general cualquier proteína expresada en células CHO.
Se muestra un diagrama de flujo del procedimiento para las etapas de cultivo de CTLA4A29YL104E-Ig en la FIG. 24. CTLA4A29YL104E-Ig se produce en biorreactores de producción de 5000 l con un volumen de trabajo aproximado de 4000 l. Se produce un lote de sustancia de fármaco a partir de un único biorreactor de producción derivado de un
30 único vial de un banco de células. El procedimiento de producción implica tres fases que consisten en expansión del inóculo, cultivo celular de producción y purificación corriente abajo. La fase de expansión del inóculo se realiza usando un medio sin componentes animales. La fase de cultivo celular de producción también se realiza en medio sin componentes animales con la excepción del uso de D-galactosa.
Medio de cultivo celular. Todos los medios se preparan en vasos de medio limpios del tamaño adecuado y se
35 esterilizan por filtración. La composición del medio utilizado para la expansión del inóculo se presenta en la siguiente Tabla.
Medio basal de crecimiento celular del inóculo
Componente Concentración
CD-CHO, Ácido concentrado 25x 40 ml/l
40 Solubles I CD-CHO, Ácido concentrado 25x 40 ml/l
Solubles II CD-CHO, Sales concentradas I 25x 40 ml/l CD-CHO, Sales concentradas II 25x 40 ml/l L-glutamina 0,88 g/l
35 (continuación)
Componente Concentración Bicarbonato sódico 2,22 g/l Insulina humana recombinante (10 mg/ml) 0,1 ml/l Metotrexato (20 mM) 0,05 ml/l
Medio basal de crecimiento celular en biorreactor de siembra y producción
Componente
Concentración
CD-CHO, Ácido concentrado 25x Solubles I
40 ml/l
CD-CHO, Ácido concentrado 25x Solubles II
40 ml/l
CD-CHO, Sales concentradas I 25x
40 ml/l
CD-CHO, Sales concentradas II 25x
40 ml/l
L-glutamina
1,32 g/l
Bicarbonato sódico
2,22 g/l
Insulina humana recombinante (10 mg/ml)
0,1 ml/l
Medio de alimentación en biorreactor de producción
Componente
Concentración
eRDF en polvo
25,2 g/l
Dextrosa
30,9 g/l
D-galactosa
12,5 g/l
L-glutamina
4,1 g/l
Insulina humana recombinante (10 mg/ml)
1,0 ml/l
Sulfato de dextrano (añadido como suministro en bolo)
50 mg/l
Expansión del inóculo
Se descongela un vial congelado del banco de células a una temperatura controlada y se centrifuga para retirar los medios crioprotectores. Las células se resuspenden en medio de inoculación y se recuperan en un matraz T. Una viabilidad celular mínima después de la descongelación del 80% es un valor ejemplar. Se controlan la temperatura y el dióxido de carbono durante la etapa de incubación en matraz T. El matraz T se incuba hasta que se obtiene una cantidad de células viables de 1,0 x 107 células, y los contenidos se transfieren a un matraz de agitación. El cultivo se expande a través de una serie de matraces de agitación hasta alcanzar el volumen de inóculo requerido. El intervalo de densidad de siembra para los pases en matraz de agitación es 1,0 a 3,0 x 105 células viables/ml. Se controlan la temperatura, el dióxido de carbono, y la velocidad del agitador durante las etapas de incubación en matraz de agitación. Los cultivos en matraz de agitación se combinan en un recipiente de transferencia de inóculo estéril tras alcanzar un intervalo de densidad de células viables de 1,5 a 3,0 x 106 células/ml. Se transfieren aproximadamente 20 litros de la etapa de expansión del inóculo en matraz de agitación final al biorreactor de siembra de 140 l para conseguir un intervalo de densidad celular inicial de 0,2 a 1,0 x 106 células viables/ml.
Operación del biorreactor de siembra
Se hace funcionar un biorreactor de siembra de 140 l con un volumen de trabajo de aproximadamente 90 litros en modo discontinuo. Se vigilan y controlan la temperatura, el pH, la presión, y la concentración de oxígeno disuelto en el biorreactor de siembra de 140 l usando un sistema de control distribuido (DCS). Se obtienen muestras diariamente del biorreactor de siembra de 140 l para controlar el crecimiento celular. El intervalo de densidad de siembra del biorreactor de siembra de 140 l es de 0,2 a 1,0 x 106 células viables/ml. El cultivo en biorreactor de siembra se usa para inocular un biorreactor de siembra de 1100 l cuando se consigue una densidad de células viables de ∗ 1,5 x 106 células/ml. La duración de la etapa del biorreactor de siembra de 140 l es de aproximadamente 3 días. La densidad diana inicial de células viables en el biorreactor de siembra de 1100 l es de 0,4 a 1,5 x 106 células viables/ml.
El biorreactor de siembra de 1100 l contiene un volumen de cultivo inicial de 260 litros. El biorreactor de siembra de 1100 l funciona en modo discontinuo. Se vigilan y controlan la temperatura, el pH, la presión, y la concentración de oxígeno disuelto en el biorreactor de siembra de 1100 l usando un DCS. El volumen del cultivo se aumenta hasta 900 litros con medio basal cuando la densidad de células viables ha alcanzado∗ 1,5 x 106 células/ml. Se obtienen muestras diariamente del biorreactor de siembra de 1100 l para controlar el crecimiento celular. El cultivo en biorreactor de siembra de 1100 l se usa para inocular un biorreactor de producción de 5000 l cuando se consigue una densidad de células viables de ∗ 2,0 x 106 células/ml. La duración de la etapa del biorreactor de siembra de 1100 l es de aproximadamente 4 días. La densidad diana inicial de células viables en el biorreactor de producción de 5000 l es de 0,4 a 1,5 x 106 células viables/ml.
Operación del biorreactor de producción
El biorreactor de producción de 5000 l contiene un volumen de cultivo inicial de 3000 litros. El biorreactor de producción de 5000 l se hace funcionar en modo semicontinuo con la temperatura, el pH, la presión, y la concentración de oxígeno disuelto vigilados y controlados mediante un DCS. Se añade un bolo de sulfato de dextrano al cultivo a aproximadamente 72 horas. Durante la operación del biorreactor de producción, se desplaza el punto establecido de temperatura de cultivo de 37 º a 34 ºC a las 144 ! 8 horas. El desplazamiento de la temperatura y la adición de sulfato de dextrano se realizan para prolongar la duración de la elevada viabilidad celular en la etapa del biorreactor de producción de 5000 l. Se obtienen muestras del biorreactor para controlar el crecimiento y la viabilidad celular, la concentración de glucosa, lactato y amoniaco. Las muestras también se ensayan para la concentración de CTLA4A29YL104E-Ig y la proporción de ácido siálico a proteína CTLA4A29YL104E-Ig. El medio de alimentación se añade al biorreactor para mantener una concentración de glucosa deseada. El criterio principal de recogida del biorreactor de producción es la proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4A29YL104E-Ig. El biorreactor de producción se recoge a una proporción molar diana de ácido siálico a proteína CTLA4A29YL104E-Ig de ∗ 6. La duración de la etapa en biorreactor de producción de 5000 l es de aproximadamente 14 días. El volumen de recogida del biorreactor de producción de 5000 l es de aproximadamente 4000 litros.
Retirada de células y concentración del producto
Las células se retiran del caldo de cultivo por microfiltración de flujo tangencial usando membranas de 0,65 ∀m. El permeado de microfiltración se concentra por ultrafiltración de flujo tangencial usando membranas de punto de corte de 30 kDa de peso molecular nominal (NMWCO). La presión transmembrana y los caudales se controlan durante las etapas de microfiltración y ultrafiltración. El concentrado después se pasa a través de una serie de filtros de membrana, con una filtración final a través de un filtro de un solo uso de 0,2 ∀m. El pH del concentrado se ajusta a 8,0 mediante la adición de una solución de Tris 0,5 M. Los filtros de microfiltración y ultrafiltración son multi-uso. Los filtros de microfiltración se limpian con hipoclorito sódico y Triton X-100 y se almacenan en ácido fosfórico. Los filtros de ultrafiltración se limpian con hipoclorito sódico e hidróxido sódico y después se almacenan en hidróxido sódico.
Ejemplo 20 Purificación de CTLA4A29YL104E-Ig recombinante
Ejemplo 20-A: Se muestra un ejemplo de un procedimiento de purificación de CTLA4A29YL104E-Ig en el siguiente diagrama de flujo y se proporciona una descripción de un procedimiento de purificación mediante este ejemplo.
Inactivación viral
Se ajusta el pH del material de recogida concentrado y aclarado a 8,0 mediante la adición de una solución de Tris 0,5 M. Se inactivan los agentes virales adventicios potenciales mediante la adición de Triton X-100 al 20% a una 5 concentración final del 0,5% (v/v). La solución de proteína tratada con Triton X-100 se mezcla durante ∗ 2 horas.
Cromatografía de afinidad
Se usa cromatografía de afinidad usando una columna de resina de MabSelect Proteína A (GE Healthcare, antiguamente conocido como Amersham Biosciences) para capturar la proteína CTLA4A29YL104E-Ig a partir del material en el procedimiento de la etapa de inactivación viral y para separar la proteína belatacept de la mayoría de
10 las impurezas.
La columna de MabSelect Proteína A se equilibra con tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. La capacidad de unión dinámica de la resina de afinidad es de 25 g de proteína CTLA4A29YL104E-Ig por litro de resina a una velocidad lineal de 350 cm/hora. El lecho de la columna de 157 l es capaz de unirse a aproximadamente 3,9 kg de proteína CTLA4A29YL104E-Ig.
15 El material tratado con Triton X-100 en el procedimiento se aplica a la columna de MabSelect Proteína A, y la columna se lava con un mínimo de 3 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrado para retirar las impurezas débilmente retenidas. Estas impurezas incluyen la citocina proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-I) y Triton X-100. La proteína CTLA4A29YL104E-Ig se eluye a continuación de la columna con un tampón glicina 250 mM, pH 3,0. La proteína CTLA429YL104E-Ig eluye como un pico estrecho en aproximadamente 2 a 3 CV de tampón de
20 elución y se recoge en un tanque que contiene tampón HEPES 2 M, pH 7,5 para aumentar el pH rápidamente y minimizar de este modo la formación de la especie de alto peso molecular (alto PM) belatacept.
Cromatografía de intercambio aniónico
Se usa cromatografía de intercambio aniónico usando resina Q-Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) principalmente para enriquecer la cantidad de especies más altamente sialiladas de la proteína CTLA4A29YL104E-Ig. La combinación de productos de belatacept de pH ajustado procedente de la columna de MabSelect Proteína A se diluye aproximadamente dos veces con agua para inyección (WFI) antes de la aplicación a la columna de QFF.
La columna de QFF se equilibra con tampón HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Se aplica la combinación de productos de la etapa de MabSelect Proteína A de pH y conductividad ajustados a la columna de QFF, y se lava la columna con un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado para retirar las impurezas débilmente unidas. La columna después se lava con tampón HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, pH 7,0, para retirar las especies de proteína CTLA4A29YL104E-Ig con bajo contenido de ácido siálico. Las especies más altamente sialiladas de la proteína CTLA4A29YL104E-Ig se eluyen posteriormente de la columna usando # 5 CV de tampón HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,0.
Cromatografía de interacción hidrófoba
Se usa cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) usando resina Fenil Toyopearl 650M (Tosoh Biosciences) principalmente para reducir la cantidad de especies de alto PM de CTLA4A29YL104E-Ig en la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF. Antes de la aplicación a la columna de CIH, se diluye la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF con tampón HEPES5 50 mM pH 7,0 y tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 3,6 M, pH 7,0 para conseguir una conductividad de aproximadamente 135 mS/cm y una concentración de CTLA4A29YL104E-Ig de # 1 g/l en la combinación de productos de QFF.
La columna de CIH se equilibra con tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0. La combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF de CTLA4A29YL104E-Ig de concentración y la conductividad ajustadas se aplica a la columna. La columna después se lava con tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0 para retirar las impurezas débilmente unidas. La proteína CTLA4A29YL104E-Ig se eluye de la columna de CIH usando tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 0,55 M, pH 7,0.
Filtración viral
La concentración y la diafiltración de la combinación de productos de CTLA4A29YL104E-Ig de la etapa de CIH se consigue por ultrafiltración (UF). La etapa de UF utiliza una membrana NMWCO de 30 kDa y un tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5. La etapa de UF va seguida por una etapa de filtración viral usando una membrana Planova de 15 nm (Asahi Kasei). La combinación de productos de proteína CTLA4A29YL104E-Ig se ajusta entonces a una concentración de proteína de 25 g/l por UF usando una membrana NMWCO de 30 kDa.
Desinfección y almacenamiento de las columnas
La columna de cromatografía de MabSelect Proteína A se desinfecta usando solución de NaOH 0,1 N, se lava con tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 para disminuir el pH, y después se almacena en etanol al 20% a 2 º a 8 ºC. La columna de cromatografía de QFF se desinfecta con una solución de NaOH 1 N y se almacena en una solución de NaOH 0,1 N a temperatura ambiente. La columna de CIH se desinfecta con una solución de NaOH 0,1 N, se lava con etanol al 20%, y se almacena en etanol al 20% a temperatura ambiente.
Ejemplo 20-B: A continuación un ejemplo adicional de dicho procedimiento de purificación:
Inactivación viral
El pH del material de recogida concentrado y aclarado se ajusta a 8,0 mediante la adición de una solución de Tris 0,5 M. Se inactivan los agentes virales adventicios potenciales mediante la adición de Triton X-100 al 20% a una concentración final del 0,5% (v/v). La solución de proteína tratado con Triton X-100 se mezcla durante ∗ 2 horas.
Cromatografía de afinidad con Proteína A para la purificación de CTLA4A29YL104E-Ig: Se usa cromatografía de afinidad usando una columna de resina de MabSelect Proteína A (GE Healthcare, antiguamente conocido como Amersham Biosciences) para capturar CTLA4A29YL104E-Ig a partir del material en el procedimiento de la etapa de inactivación viral y para separar CTLA4A29YL104E-Ig de la mayoría de las impurezas.
Se compacta una columna de 140 cm de diámetro interno con resina MabSelect PrA hasta una altura de 18 a 25 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 339 a 372 l. La columna se cualifica para su uso determinando la HETP y de la As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna.
La operación de la columna de MabSelect PrA se realiza a temperatura ambiente. La combinación de productos de inactivación viral se carga en la columna de MabSelect PrA equilibrada. La etapa de MabSelect PrA se hace funcionar a una caudal máximo de 26,7 l/min y una presión de funcionamiento de # 89,61 kPa (13 psig). La carga máxima de proteína CTLA4A29YL104E-Ig aplicada a la columna de MabSelect PrA es de 25 g de proteína CTLA4A29YL104E-Ig por litro de resina a una velocidad lineal de 350 cm/hora. El lecho de la columna es capaz de unirse a aproximadamente 3,9 kg de proteína CTLA4A29YL104E-Ig.
La columna de MabSelect PrA se equilibra con tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. El equilibrado se completa cuando se ha pasado un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado a través de la columna y los valores de pH y conductividad del efluente están entre 7,3 a 7,7 y 14,5 a 17,5 mS/cm, respectivamente.
El material en el procedimiento tratado con Triton X-100 se aplica a la columna de MabSelect PrA equilibrada. La columna se lava con un mínimo de 3 CV de tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH 7,5 para retirar las impurezas débilmente retenidas de la columna de MabSelect PrA. Estas impurezas incluyen la citocina proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1) y Triton X-100. Las posteriores etapas de lavado se realizan usando tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 para retirar el Triton X-100 residual de la columna de MabSelect PrA.
La CTLA4A29YL104E-Ig se eluye de la columna de cromatografía de MabSelect PrA con tampón glicina 250 mM, pH 3,0. El eluato se desvía hacia un recipiente de recogida cuando la A280 aumenta hasta ∗ 0,2 UA por encima de la línea basal. El efluente de la columna se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m en un recipiente de recogida equipado con un agitador. El eluato se recoge hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuye hasta un valor de # 0,2 UA. La CTLA4A29YL104E-Ig se eluye como un pico estrecho en aproximadamente 2 a 3 CV de tampón de elución. El pH de la combinación de eluato se ajusta a pH 7,5 ! 0,2 con tampón HEPES 2 M, pH 7,5 para aumentar el pH rápidamente y minimizar de este modo la formación de especies de alto peso molecular (alto PM) de CTLA4A29YL104E-Ig. La combinación de productos de la etapa de cromatografía en MabSelect PrA se mantiene a temperatura ambiente durante un máximo de 5 días. La combinación de productos puede enfriarse para su almacenamiento; el perfil de estabilidad de CTLA4A29YL104E-Ig fue el mismo a 5 ºC y 22 ºC. El producto puede almacenarse durante hasta 5 días.
Se recoge un producto de dímero CTLA4A29YL104E-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4A29YL104E-Ig que es de aproximadamente 6, o de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6.
Cromatografía de intercambio aniónico en QFF para la purificación de CTLA4A29YL104E-Ig: Se usa cromatografía de intercambio aniónico usando resina Q-Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) principalmente para enriquecer la cantidad de las especies más altamente sialilados de CTLA4A29YL104E-Ig, así como para reducir los niveles de proteína A residual. La combinación de productos de CTLA4A29YL104E-Ig de pH ajustado de la columna de MabSelect proteína A se diluye aproximadamente dos veces con agua para inyección (WFI) antes de la aplicación a la columna de QFF.
Se compacta una columna de 80 cm de diámetro interno de resina QFF hasta una altura de 27 a 35 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 136 a 176 l. La columna se cualificado para su uso determinando la HETP y la As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una asimetría (As) de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna.
La operación de la columna de QFF se realiza a temperatura ambiente. La columna de QFF se equilibra con un tampón HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. La combinación de productos de ala etapa de MabSelect proteína A de pH y conductividad ajustados se aplica a la columna de QFF. La etapa de QFF se hace funcionar a un caudal máximo de 16,4 l/min (196 cm/h) y una presión de funcionamiento máxima de 241,25 kPa (35 psi).
La columna se desinfecta tanto antes como después de su uso con una solución de NaOH 1 N. Se pasa un mínimo de 2 volúmenes de columna de la solución de hidróxido sódico sobre la columna. La columna se mantiene entonces estática durante 60 a 120 minutos. El intervalo de conductividad aceptable para la solución y el efluente de la columna es de 136 a 202 mS/cm.
La columna se equilibra con un mínimo de 5 volúmenes de columna de tampón HEPES5 50 mM, cloruro sódico 50 mM, pH 7,0. Los intervalos de pH y conductividad de este tampón son de 6,8 a 7,2 y de 5,0 a 7,0 mS/cm, respectivamente. Estos intervalos también se usan para determinar si la columna está equilibrada.
La combinación de productos de la etapa de MabSelect proteína A de pH y conductividad ajustados se aplica a la columna de QFF, y la columna se lava con un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado para retirar las impurezas débilmente unidas. La columna se lava después con tampón HEPES 50 mM, NaCl 135 mM, pH 7,0, para retirar las especies de CTLA4A29YL104E-Ig con bajo contenido de ácido siálico.
Las especies más altamente sialiladas de CTLA4A29YL104E-Ig se eluyen de la columna de cromatografía en QFF usando un tampón HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,0. La recogida de material eluido se inicia cuando el tampón de elución se aplica por primera vez a la columna. Durante la elución, el efluente de la columna se filtra a través de un filtro de 0,2 ∀m en el recipiente de recogida. El eluato se recoge hasta que la absorbancia del borde de salida del pico de elución disminuye hasta # 0,2 UA por encima de la línea basal. La CTLA4A29YL104E-Ig se eluye de la columna usando lt;5 CV de tampón HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,0. El recipiente de recogida se enfría entonces hasta 2 º a 8 ºC. El tiempo de mantenimiento máximo para la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFFa 2 º a 8 ºC es de 3 días.
Se recoge un producto de dímero CTLA4A29YL104E-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4A29YL104E-Ig que es de aproximadamente 6, o de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6.
CIH en Fenil Sepharose FF para la purificación de CTLA4A29YL104E-Ig: Se usa cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) usando resina Toyopearl Fenil 650M (Tosoh Biosciences) principalmente para reducir la cantidad de especies de alto PM de CTLA4A29YL104E-Ig en la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF.
Se compacta una columna de 100 cm de diámetro interno de resina Fenil Sepharose Fenil 650M hasta una altura de 18 a 22 cm, lo que representa un volumen de aproximadamente 141 a 173 l. La columna se cualificado para su uso determinando la HETP y la As de la columna compactada. Se emplea una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna de CIH.
La operación de la columna de CIH se realiza a temperatura ambiente. Antes de la aplicación a la columna de CIH, la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF se diluye con tampón HEPES 50 mM, pH 7,0 y tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 3,6 M, pH 7,0 para conseguir una conductividad de aproximadamente 135 mS/cm y una concentración de CTLA4A29YL104E-Ig de # 1 g/l en la combinación de productos de QFF. La etapa de CIH se hace funcionar a un caudal máximo de 22,7 l/min (173 cm/h) y a una presión de funcionamiento máxima de 31,08 kPa (45 psi). Pueden emplearse ciclos múltiples de la etapa de CIH en base a la cantidad de CTLA4A29YL104E-Ig presente en la combinación de eluato de QXL.
La columna de CIH se desinfecta primero con una solución de hidróxido sódico 1 N. La desinfección se completa cuando se han pasado de 2 a 4 CV de la solución de hidróxido sódico 1 N a través de la columna. La columna se mantiene entonces durante 60 a 120 minutos para asegurar la desinfección.
Después de la etapa de desinfección, la columna de CIH se equilibra con tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0. El equilibrado se completa cuando se han pasado un mínimo de 3 CV de tampón de equilibrado a través de la columna y el pH del efluente es 7,0 ! 0,3 y la conductividad de aproximadamente 135 mS/cm.
La combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF de CTLA4A29YL104E-Ig de concentración y conductividad ajustadas se aplica a la columna. La columna se lava entonces con tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0 para retirar las impurezas débilmente unidas. La CTLA4A29YL104E-Ig se eluye de la columna de CIH usando tampón HEPES 50 mM, sulfato de amonio 0,55 M, pH 7,0. Esta combinación de productos de CIH se mantiene en el recipiente de recogida a 2 º a 8 ºC. El tiempo máximo de mantenimiento en el recipiente de recogida es de 3 días.
Está presente un producto de dímero CTLA4A29YL104E-Ig con una proporción molar de moles de ácido siálico a moles de proteína CTLA4A29YL104E-Ig que es de aproximadamente 6, o de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,6; está presente una combinación de material de alto peso molecular de CTLA4A29YL104E-Ig a # 2,5%; está presente una combinación de material de bajo peso molecular de CTLA4A29YL104E-Ig (por ejemplo CTLA4A29YL104E-Ig monómero) a # 0,5%; y está presente una combinación de MCP-1 a # 9,5 ng/ml.
Filtración viral. La concentración y la diafiltración de la combinación de productos de CTLA4A29YL104E-Ig de la etapa de CIH se consigue por ultrafiltración (UF). La etapa de UF utiliza una membrana NMWCO de 30 kDa y un tampón NaH2PO4 25 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5. La etapa de UF viene seguida por una etapa de filtración viral usando una membrana Planova de 15 nm (Asahi Kasei). La combinación de productos de CTLA4A29YL104E-Ig se ajusta entonces a una concentración de proteína de 25 g/l por UF usando una membrana NMWCO de 30 kDa.
Se usa el sistema Pall Filtron TFF en la etapa de concentración y diafiltración del procedimiento de producción corriente debajo de CTLA4A29YL104E-Ig. El objetivo de esta etapa es concentrar la combinación de productos de la etapa de cromatografía CIH hasta 45 a 55 g/l e intercambiar el tampón de elución usado en la etapa de cromatografía CIH con el tampón final usado para composiciones de CTLA4A29YL104E-Ig. La combinación de productos de CTLA4A29YL104E-Ig concentrada se transfiere a través de un filtro de fluoruro de polivinilideno de 0,2 ∀m y en una bolsa de bioprocesos de 50 l.
CTLA4A29YL104E-Ig co-Ejemplo 21: Actividad biológica -determinación de la unión bio-específica dereceptores de B-7Ig por resonancia de plasmón superficial
Resonancia de plasmón superficial (unión de B7)
Este procedimiento mide la unión de CTLA4A29YL104E-Ig a un co-receptor representativo de B7 por resonancia de plasmón superficial. Se inmoviliza B7Ig a alta densidad mediante grupos amino primarios a la superficie de un chip sensor CM5 activado. Se diluye el material CTLA4A29YL104E-Ig, los controles de calidad, y las muestras a concentraciones entre 0,125 y 8 ng/ml y se inyectan sobre la superficie de B7Ig para generar sensogramas de unión. La velocidad inicial (pendiente) de la unión de CTLA4A29YL104E-Ig a B7lg inmovilizado se mide en condiciones limitadas de transferencia de masa (difusión) sobre esta superficie de B7Ig. La tasa de unión inicial en unidades de
resonancia por segundo (UR/s) se correlaciona directamente con la concentración activa. Las tasas de unión de las muestras se convierten en una concentración activa usando la curva del patrón de referencia donde la tasa de unión de un material CTLA4A29YL104E-Ig se representa gráficamente frente a la concentración. Los resultados finales se expresaron como porcentaje de unión de la muestra en relación con el material CTLA4A29YL104E-Ig.
Se detectó la presencia de la región Fc de IgG1 humana en CTLA4A29YL104E-Ig usando la resonancia de plasmón superficial (RPS). La RPS permite la medición de las interacciones bioespecíficas a tiempo real. Se inmovilizó covalentemente un fragmento de anticuerpo específico para la región Fc de IgG humana (F (ab')2 de cabra anti-Fc de IgG humana) sobre la superficie de un chip sensor. La unión de muestras de CTLA4A29YL104E-Ig se detectó midiendo la respuesta obtenida sobre esta superficie, en comparación con una superficie no modificada del chip sensor. Los resultados en unidades de resonancia unidas para el Procedimiento B, Procedimiento C y la mezcla de Co-mezcla son comparables como se muestra en la FIG. 6 y en la Tabla 23.
Tabla 23. Detección de Fc de IgG humana en lotes de sustancia de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig usando RPS
Nº lote
UR unidas a anticuerpo anti-Fc UR unidas a superficie no modificada
Lote A
1295 1
Lote B
1309 1
Co-mezcla
1268 1
Ensayo de inhibición de IL 2 en células humanas
El procedimiento se basa en la inhibición de la producción de IL-2 a partir de linfocitos T por CTLA4A29YL104E-Ig cuando se estimulan células con anti-CD3 y linfocitos B. Se coestimulan linfocitos T Jurkat, transfectados con el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de IL-2 con linfocitos B Daudi y anti-CD3 en presencia de diversas concentraciones de CTLA4A29YL104E-Ig. La co-estimulación activa el promotor de IL-2, que a su vez produce la proteína luciferasa. La señal luminiscente resultante se mide usando un sistema de ensayo de luciferasa. En este sistema, CTLA4A29YL104E-Ig produce una disminución dependiente de la dosis de la actividad luciferasa.
Los resultados para el Lote 000929-278 del procedimiento B, el Lote 224818-2004-007 del procedimiento C y el Lote 55128-162 de co-mezcla son comparables, como se muestra en la Tabla 24. Los valores de CE50, los factores de pendiente, y asíntotas superior e inferior son similares para las tres muestras, dentro de una desviación típica. Esto indica que CTLA4A29YL104E-Ig del procedimiento C y del procedimiento B se comportan de forma comparable en el ensayo de potencia in vitro.
Tabla 24. Comparación de la actividad luciferasa mediada por el promotor de IL-2 en el bioensayo de potencia in vitro. Parámetros de la curva de respuesta a dosis.
Nº lote
CE50 (ng/ml) Factor de pendiente Asíntota superior Asíntota inferior
(CPS)
(CPS)
Procedimiento A
19,1 ! 1,9 -0,91 ! 0,06 85.000 ! 15.000 30.000 ! 6.000
Co-mezcla
21,5 ! 2,7 -0,93 ! 0,08 88.000 ! 16.000 29.000 ! 5.000
Procedimiento B
21,8 ! 1,4 -0,91 ! 0,09 81.000 ! 17.000 27.000 ! 7.000
Materiales:
-Chip sensor CM5, Biacore calidad certificada (Nº de catálogo BR-1000-13) -Tampón HBS-EP BIA certificado HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, 0,005% v/v -Tensioactivo P20 Biacore (Nº de catálogo BR-1001-88) -Kit de acoplamiento amina BIA Certificado 15 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 750 mg de clorhidrato de 1-etil
3-(3 dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 10,5 ml de etanolamina HCl Biacore (Nº de catálogo BR-1000-50) -Instrumento Biacore C con un ordenador PC compatible Biacore (Nº de catálogo BR-1100-51) -Software de Control Biacore C, proporcionado con el instrumento Biacore C, versión 1.0.1
Kit de acoplamiento amina BIA Certificado: El kit contiene un vial de cada uno de: 115 mg de NHS, 750 mg de EDC, y 10,5 ml de etanolamina. Se prepara cada vial de acuerdo a las directrices del fabricante. Se forman alícuotas de volúmenes de 200 ∀l de las soluciones de NHS y EDC en viales de plástico/vidrio individuales de tamaño apropiado y se tapan. Estas soluciones son estables durante 2 meses cuando se almacenan a -20 ºC. Se forman alícuotas de 200 ∀l de etanolamina en viales de plástico/vidrio individuales de tamaño apropiado y se tapan. Esta solución se almacena a 2-8 ºC y es estable de acuerdo con las directrices del fabricante.
Para asegurar una buena unión a la celda de flujo, se usará una celda de flujo para una semana o 286 inyecciones, lo que suceda primero. Se inmovilizará una nueva celda de flujo al inicio de cada semana. Inmovilización de B7.1 Ig
de la preparación para el ensayo de muestras. NOTA: Se forman alícuotas de 200 ∀l de todas las soluciones en tubos Biacore de 7 mm para el análisis. Se descongela un vial que contiene B7.1 Ig a temperatura ambiente. Se diluye B7.1 Ig usando tampón acetato 10 mM pH 5,0 (1,7) para conseguir una masa superficial entre 3000-9000 Unidades de Resonancia (UR). Se descongela un vial (200 ∀l) de cada uno de EDC y NHS a temperatura ambiente. 5 Se retira etanolamina HCl de la nevera y se permite que se caliente a temperatura ambiente. Desde el software Biacore: Se abre el proyecto publicado quot;Inmovilización de B7 Igquot; seleccionado desde el quot;Asistente de inmovilización.quot; Se abre el archivo publicado quot;B7 Immob.blwquot;. Se siguen los pasos del asistente y se confirma o cambia la selección pinchando en quot;Siguientequot;. En la sección quot;Información del usuarioquot;, se selecciona la celda de flujo y se proporciona información experimental en la pestaña de quot;Notebookquot;. Se colocan los viales de reactivo y ligando en la gradilla
10 estante de muestra como se ha indicado. Se revisan las instrucciones. Se guarda el archivo de plantilla como: B7 Immob BIOQC# Iniciales de la fecha del chip # celda de flujo #.blw. Se inicia la inmovilización pinchando en quot;Inicioquot;. Se guarda el archivo de resultados como: B7 Immob BIOQC Iniciales de la fecha del chip # celda de flujo #.blr. Cuando se finaliza el ensayo, se imprimen los resultados del asistente y el sensograma.
Ejemplo 22: Análisis del contenido de carbohidratos de una composición de CTLA4A29YL104E-Ig, mapeo 15 tríptico de los péptidos y EIE
Mapeo de péptidos de digestión tríptica
En este procedimiento de digestión con tripsina, se desnaturalizan muestras de CTLA4A29YL104E-Ig usando guanidina-HCl, y se reducen y alquilan con DTT e IAA. Las muestras se desalan usando una columna NAP-5 y se digieren con tripsina. La mezcla de digestión se separa por cromatografía en fase inversa (C 18) y los picos se detectan por
20 absorbancia UV a 215 nm.
REACTIVOS: Solución A de fase móvil (ácido trifluoroacético (TFA) al 0,02% en agua (v/v)); solución B de fase móvil (TFA al 0,02% en ACN (acetonitrilo) al 95% y agua al 5% (v/v)); agente de alquilación (yodoacetamida (IAA) 200 mM); tampón de dilución (Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8,0); tampón de desnaturalización (guanidina 8 M, Tris 50 mM, pH 8,0); tampón de digestión (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0); agente reductor (DTT 100 mM).
25 INSTRUMENTACIÓN: (puede usarse instrumentación equivalente) columnas NAP-5 (Amersham, Nº de catálogo 170853-02); calentador de columna de HPLC, sistema de HPLC Waters Alliance con calentador de columna y detector UV.
Visión general del procedimiento
30 Reducción y alquilación: Las muestras (por ejemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) se diluyeron a 10 mg/ml añadiendo agua hasta un volumen final de 100 ∀l (1 mg). Se añadieron 560 ∀l de tampón de desnaturalización y 35 ∀l de agente reductor (DTT 100 mM) a las muestras de 100 ∀l, se mezclaron y se centrifugaron en una microcentrífuga durante 3 segundos. Después las muestras se incubaron a 50 ºC durante 20 minutos ! 2 minutos. Después se añadieron 35 ∀l de agente alquilante (IAA 200 mM) a cada muestra, y se mezclaron de nuevo, y se centrifugaron en
35 una microcentrífuga durante 3 segundos. Las muestras después se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron a 50 ºC durante 20 min. ! 2 minutos. Después de equilibrar las columnas NAP-5 vertiendo 3 volúmenes de columna (aproximadamente 7-8 ml) de tampón de digestión, se vertieron 500 ∀l de las mezclas reducidas y alquiladas sobre
las columnas NAP-5, permitiendo que el líquido escurriera a través la columna. Después se recogieron las muestras de las columnas NAP-5 eluyendo la muestra fuera de la columna con 1 ml de tampón de digestión.
Digestión: Las muestras se digirieron con 20 ∀l de tripsina (0,5 pg/pl) en un baño de agua a 38 ºC durante 4 horas (! 0,5 h). Tras completarse la digestión, las muestras se acidificaron con 2,5 ∀l de TFA. Las muestras después se colocaron en viales de inyector automático para el análisis posterior.
Procedimiento de instrumentos: El procedimiento de instrumentos se muestra a continuación:
Tiempo (min) Flujo (ml/min) Fase Móvil A Fase móvil B
0 0,7 100 0
17 0,7 83 17
27 0,7 78 22
42 0,7 73 27
58 0,7 65 35
74 0,7 52 48
79 0,7 0 100
84 0,7 1000
88 0,7 1000
La columna se equilibró con tampón de fase móvil A al 100% durante 25 minutos antes de la primera inyección. Se controló la absorbancia UV a 215 nm mientras se mantenía la temperatura de la columna a 37 ºC y la temperatura del inyector automático a 4 ºC. Se procesó un blanco de tampón de fase móvil A antes del primer patrón de idoneidad del sistema, seguido después de ello por una única inyección de 50 ∀l de cada muestra. Debe intercalarse una inyección de material de referencia cada seis inyecciones de muestra.
Número de placas teóricas: La eficacia de la columna, evaluada como el número de placas teóricas, se puede medir cuantitativamente usando el tiempo de retención y la anchura del pico de acuerdo con la ecuación:
4 t 12
N 5 16 2/3 w 0
Donde:
quot;wquot; es la anchura del pico en la línea basal medida por la extrapolación de los laterales relativamente rectos hasta la línea basal, quot;tquot; es el tiempo de retención del pico medido desde el momento de la inyección hasta el momento de elución del máximo del pico.
Si N lt;50000, se re-equilibra la columna.
Resolución: Se determina la resolución (R) entre 2 picos, por ejemplo el pico T2 y el pico T12 como se indica en la FIG. 32, determinar determinarse usando la siguiente ecuación:
26t2 8 t 7R 56w1 : w 12 7
Dónde:
t1, t2 = tiempos de retención de los fragmentos de pico T2 y pico T12, respectivamente w1, w2 = anchura del pico definida en la tangente en la línea basal de los picos con tiempos de retención t1 y t2, respectivamente.
Si R lt;1,5, la columna debe re-equilibrarse y si el problema persiste, la columna debe remplazarse.
La FIG. 32 y la Tabla 25 muestran los fragmentos de péptidos obtenidos a partir de una digestión con tripsina de CTLA4A29YL104E-Ig. La región muestra los péptidos T7 y T9 en ~ 50 minutos a veces refleja la digestión incompleta de la muestra y los picos pueden mostrar diferentes cualidades de un día a otro; sin embargo, dentro de un procesamiento todas las muestras muestran comparabilidad.

Tabla 25: Fragmentos de péptidos trípticos de CTLA4A29YL104E-Ig
Fragmento
Resto Masa Masa Secuencia
Nº
Nº
teórica observada peptídica
T1
1-14 1465,8 1464,8 MHVAQPAVVLASSR
T2
15-28 1485,7 1484,8 GIASFVCEYASPGK
T3
29-33 666,3 666,4 YTEVR
T4
34-38 586,7 586,4 VTVLR
T5a
39-83c 4900,4 --d QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSI
CTGTSSGNQVNLTIQGLR
T6
84-93 1171,4 1170,5 AMDTGLYICK
T7b
94-128c 3983,5 --d VELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPD
SDQEPK
T8b
129-132 435,4 ND SSDK
T9b
133-158c 3345,7 --d THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK
T10
159-165 834,9 834,5 DTLMISR
T11
166-184 2140,3 2138,5 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK
T12
185-198 1677,8 1677,8 FNWYVDGVEVHNAK
T13
199-202 500,6 500,3 TKPR
T14a
203-211c 1189,2 --d EEQYNSTYR
T15
212-227 1808,1 1808 VVSVLTVLHQDWLNGK
T16
228-230 438,5 438,2 EYK
T17
231-232 307,4 ND CK
T18
233-236 446,5 ND VSNK
T19
237-244 838,0 837,4 ALPAPIEK
T20
245-248 447,5 447,2 TISK
T21
249-250 217,2 ND AK
T22
251-254 456,5 456,3 GQPR
T23
255-265 1286,4 1285,6 EPQVYTLPPSR
T24
266-270 604,7 604,3 DELTK
T25
271-280 1161,4 1160,7 NQVSLTCLVK
T26
281-302 2544,7 2544 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
T27
303-319 1874,1 1873,9 TTPPVLDSDGSFFLYSK
T28
320-324 574,7 574,3 LTVDK
T29
325-326 261,28 ND SR
T30
327-349 2803,09 2802,1 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
T31
350-356 659,7 659,2 SLSLSPG
T6
84-93 1171,4 1170,5 AMDTGLYICK
T7b
94-128c 3983,5 --d VELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPD
SDQEPK
T8b
129-132 435,4 ND SSDK
T9b
133-158c 3345,7 --d THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK
T10
159-165 834,9 834,5 DTLMISR
T11
166-184 2140,3 2138,5 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK
T12
185-198 1677,8 1677,8 FNWYVDGVEVHNAK
T13
199-202 500,6 500,3 TKPR
T14a
203-211c 1189,2 --d EEQYNSTYR
T15
212-227 1808,1 1808 VVSVLTVLHQDWLNGK
T16
228-230 438,5 438,2 EYK
T17
231-232 307,4 ND CK
T18
233-236 446,5 ND VSNK
(continuación) Fragmento Resto Masa Masa Secuencia Nº Nº teórica observada peptídica
T19 237-244 838,0 837,4 ALPAPIEK
5 T20 245-248 447,5 447,2 TISK T21 249-250 217,2 ND AK T22 251-254 456,5 456,3 GQPR T23 255-265 1286,4 1285,6 EPQVYTLPPSR T24 266-270 604,7 604,3 DELTK
10 T25 271-280 1161,4 1160,7 NQVSLTCLVK T26 281-302 2544,7 2544 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T27 303-319 1874,1 1873,9 TTPPVLDSDGSFFLYSK T28 320-324 574,7 574,3 LTVDK T29 325-326 261,28 ND SR
15 T30 327-349 2803,09 2802,1 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK T31 350-356 659,7 659,2 SLSLSPG
a Péptidos con carbohidrato ligado a N
b Péptidos con carbohidrato ligado a O
c Las masas para T5, T7, T9 y T14 son masas sin los restos de carbohidrato 20 d Se observaron varias masas correspondientes a péptidos glucosilados
Isoelectroenfoque
Para evaluar los puntos isoeléctricos (pI) de las diversas isoformas de CTLA4A29YL104E-Ig tanto en la sustancia de fármaco como en el producto de fármaco se usa isoelectroenfoque (IEE). Este procedimiento usa placas Pharmacia Biotech Ampholine® PAG en gradiente de pH de 4,0-6,5 y un sistema de electroforesis de lecho plano Multiphore II. 25 Las muestras (por ejemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) se diluyen en agua Milli-Q y se cargan directamente sobre el gel usando tiras de aplicación de muestra. El gel se enfoca durante 2,5 horas en voltaje creciente usando una tira de cátodo impregnada de %-alanina 100 mM y una tira de ánodo impregnada de ácido glutámico 100 mM/ácido fosfórico 500 mM. Después del isoelectroenfoque, el gel se fija usando ácido sulfosalicílico/ácido tricloroacético y después se tiñe usando un sistema de tinción con azul de Coomassie. Después de la tinción, el gel húmedo se guarda en un
30 archivo de imagen digital usando un densitómetro basado en láser a una resolución espacial de 50 o 100 ∀m con hasta 4096 niveles de resolución de densidad óptica. CTLA4A29YL104E-Ig se enfoca en 10 a 15 bandas que varían desde un pI de 4,5 a 5,5.
El isoelectroenfoque de la CTLA4A29YL104E-Ig nativa en un gel (pH 4,0 a 6,5) genera un patrón de bandas similar en el intervalo de pI de 4,6 a 5,5 para el Lote 224818-2004-007 del procedimiento C, el Lote 000929-287 del 35 procedimiento B y el Lote 55128-162 de co-mezcla como se muestra en la FIG. 12. Este procedimiento muestra que los materiales de los procedimientos B y C son comparables cuando se analizan en el mismo gel de EIE.
Los patrones de isoelectroenfoque deben distinguirse fácilmente del fondo (véase la FIG. 12).
Patrón de proteína pI
Lectina de lenteja 8,65
8,45
Mioglobina de caballo 7,35
6,85
Conalbúmina 5,90
Lactoglobulina 5,20
Inhibidor de tripsina de Soja 4,55
Amiloglucosidasa 3,50
CTLA4A29YL104E-Ig se identifica como múltiples bandas (gt; 10) que tienen un intervalo de pI de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5 (FIG. 32).
40 CTLA4A29YL104E-Ig es una glucoproteína de fusión de CTLA4-Ig de segunda generación, que consiste en el dominio de unión a ligando modificado del antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4) y la región constante de la cadena
pesada de IgG1 humana. Esta nueva molécula tiene aplicación terapéutica como inmunosupresor. CTLA4A29YL104E-Ig contiene múltiples isoformas de carga que se pueden resolver por isoelectroenfoque (IEE). Se ha desarrollado un procedimiento de IEE para el análisis de la sustancia de fármaco y el producto de fármaco de CTLA429YL104E-Ig. Este procedimiento se usa para examinar CTLA4A29YL104E-Ig en un sistema de electroforesis de lecho plano Ampholine® Multiphore II en placa PAG de pH 4,0-6,5. La sustancia fármaco, el producto de fármaco y el material de referencia de CTLA4A29YL104E-Ig se diluyen en agua Milli-Q y se cargan directamente en el gel. El gel se enfoca durante 2,5 horas a voltaje creciente con una tira de cátodo impregnada de %-alanina 100 mM y una tira de ánodo impregnada de ácido glutámico 100 nM/ácido fosfórico 500 mM. Después del isoelectroenfoque, el gel se fija y se tiñe con azul de Coomassie. El gel teñido se escanea por densitometría láser y se realiza el análisis semi-cuantitativo de las bandas del gel en el archivo de imagen digital.
Materiales:
Gel Ampholine PAG Plate pH 4,0-6,5 Tiras de electrodos de EIE de 6 x 280 mm Piezas de aplicación de muestra
GE Healthcare (Nº de catálogo 80-1124-81) GE Healthcare (Nº de catálogo 80-1004-40) GE Healthcare (Nº de catálogo 80-1129-46)
Equipo:
Sistema de electroforesis Multiphor II Placa de enfriamiento de 125 x 260 mm Fuente de alimentación BioRad Circulador termostático Agitador orbital Densitómetro personal SI Software ImageQuantTL Preparación del reactivo:
GE Healthcare (Nº de catálogo 18-1018/06) GE Healthcare (Nº de catálogo 80-1106-54) NOVEX (modelo básico 3540) (Modelo PAC3000) VWR (Modelo 13271-074/1160 1160A) IKA (Modelo KS250/260) GE Healthcare (Modelo 375) GE Healthcare
Solución tampón del ánodo (100 ml): Ácido glutámico 0,1 M en ácido fosfórico 0,5 M, 3,4 ml de ácido fosfórico al 85%; 1,47 ! 0,02 g de ácido glutámico; agua Milli-Q. Se añade ácido glutámico a 50 ml de agua Milli-Q. Se añade ácido fosfórico al 85% y CS hasta 100 ml, se agita para mezclar. Se asigna una fecha de caducidad de 6 meses y se almacena a 4 ºC.
Solución tampón del cátodo (100 ml): %-alanina 0,1 M, 0,9 ! 0,02 g de %-alanina, agua Milli-Q. Reactivo CS hasta 100 ml con agua Milli-Q, se agita para mezclar. Se asigna una fecha de caducidad de 6 meses y se almacena a 4 ºC.
Solución de fijación (2000 ml): ácido 5-sulfosalicílico al 3,5% en ácido tricloroacético al 12%, 240 ! 5,0 g de ácido tricloroacético, 70 ! 2,0 g de ácido 5-sulfosalicílico, agua Milli-Q. Se combinan los reactivos y CS hasta 2000 ml con agua Milli-Q. Se asigna una fecha de caducidad de 3 meses, y se almacena a temperatura ambiente.
Aparato y preparación de gel. Se conecte la plataforma de refrigeración de la unidad de electroforesis Multiphore II al circulador termostático Multi-Temp y se establece la temperatura a 10 ºC. Se deja que el circulador alcance los 10 ! 2ºC. Se retire el gel de la nevera. Usando unas tijeras, se corta cuidadosamente a lo largo de los cuatro lados de la envoltura con cuidado de no cortar el gel/soporte del gel. Se añade aproximadamente 1,0 ml de agua Milli-Q a un borde de la plataforma de refrigeración. Se coloca un extremo del gel/soporte del gel en el agua de modo que el agua se mueve a través de todo el borde del gel. Se aplica cuidadosamente el gel a través de la plataforma de refrigeración, evitando la formación de burbujas de aire. Se retira la película transparente de la superficie del gel. Se remoja cada tira de electrodo con aproximadamente 3,0 ml de la solución de electrodo apropiada (Tabla directamente a continuación). Se aplican las tiras de electrodo aproximadamente a 10 mm de los bordes superior e inferior del gel. Se coloca la tira de cátodo lo más cerca posible a los marcas (-) y la tira de ánodo lo más cerca posible de las marcas [□(+) sobre la plataforma de refrigeración. Después de haber aplicado las tiras de electrodo, se cortan las tiras para encajar el gel, evitando el contacto con el soporte del gel.
Soluciones de electrodo y ajustes de los parámetros de electroforesis
Intervalo de pH
Solución de ánodo Solución de cátodo Voltaje(V) Corriente (mA) Potencia (W) Tiempo(h)
4,0-6,5
Ácido glutámico 0,1 M en H3PO4 0,5 M %-Alanina 0,1 M 2000 25 25 2,5
los parámetros de electroforesis definidos en la Tabla directamente anterior, se pre-enfoca el gel hasta que el voltaje alcanza los 300 V.
Marcado de pI de EIE y preparación del control de tinción. Se reconstituye el marcador de pI de EIE con 100 ∀l de agua Milli-Q. Se reconstituye el control tinción II anhidrasa carbónica con 1000 ∀l de agua Milli-Q para hacer una solución madre de 1,0 mg/ml. Se añaden 10 ∀l de solución madre (1,0 mg/ml) a 90 ∀l de agua Milli-Q para una concentración de carga final de 0,10 mg/ml.
Preparación de la muestra. Se diluye el material de referencia y las muestras de CTLA4A29YL104E-Ig a una concentración de 2 mg/ml. Ejemplo: Si la muestra de CTLA4-A29YL104E-Ig tiene una concentración de 25 mg/ml, se usa la siguiente dilución para preparar la concentración de carga final de 2 mg/ml:
10 l (de 25 mg/ml) + 115 ∀l de agua Milli-Q = 2 mg/ml
NOTA: Si la concentración de la muestra es # 2,0 mg/ml, entonces se carga la muestra sin diluir.
Carga del gel. Se cargan los geles para facilitar la identificación de las muestras en base al patrón de desplazamiento. No se carga el gel simétricamente. Se carga el marcador de pI de EIE, el control de tinción, el material de referencia de CTLA4A29YL104E-Ig, las muestras de CTLA4A29YL104E-Ig como se resumen con la tabla directamente a continuación. Se cargan todas las muestras sobre las piezas de aplicación de muestra.
Patrón de carga del gel
Carril
Descripción Concentración de carga (∀g/∀l) Volumen de carga (∀l) Carga de proteína (∀g)
1
Marcador de pI de EIE* - 10,0 -
2
Marcador de pI de EIE - 10,0 -
3
Material de referencia de CTLA4A29YL104E -Ig 2,0 10,0 20
4
Muestra 1 2,0 10,0 20
5
Control de tinción 0,10 10,0 1,0
6
Muestra 2 2,0 10,0 20
7
Material de referencia de CTLA4A29YL104E -Ig 2,0 10,0 20
8
Marcador de pI de EIE - 10,0 -
* La carga de marcador de pI de EIE en el carril 1 es necesaria para definir la orientación del gel. Se comienza el patrón de carga en el carril 2 y se repite el patrón de carga para muestras adicionales. El marcador de pI de EIE se debe cargar por lo menos uno de cada diez carriles (Ejemplo: MRS1S2S3S4S5S6RM; M marcador, R -material de referencia, Sx -muestra).
Procesamiento del gel. Se coloca el portaelectrodo en la unidad Multiphor II y se alinean los electrodos con el centro de las tiras de electrodo sobre el gel. Se conectan los dos electrodos del portaelectrodo a la unidad base y se coloca la tapa de seguridad en posición. Usando cinta adhesiva, se cubren los agujeros de la tapa de seguridad para evitar que el gel se seque. Se conectan los electrodos a la fuente de alimentación. Se ejecuta la electroforesis al voltaje, corriente y potencia apropiados. Cuando se completa la electroforesis, se apaga la fuente de alimentación y se retira la cubierta de seguridad y el portaelectrodo. Se retiran con cuidado las tiras de electrodo y las piezas de aplicación de muestra del gel. Se retira todo el gel y el soporte del gel de la placa de refrigeración y se coloca en una placa PyrexTM de 280 x 180 x 40 mm que contiene 200 ml de solución de fijación. Se cubre la placa con envoltorio de plástico y se coloca en un agitador orbital a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos. NOTA: El gel debe fijarse durante un máximo de 1 hora. Cuando se completa la fijación, se lava el gel 3 veces durante 5 minutos cada vez con aproximadamente 200 ml de agua Milli-Q. Se mezcla la solución de reactivo de tinción de azul GelCode invirtiendo el frasco varias veces. Es importante mezclar el reactivo de tinción antes de dispensarlo para asegurarse de que se usa una muestra homogénea del reactivo. Se añaden aproximadamente 200 ml del reactivo de tinción a la placa. Se cubre la placa con envoltorio de plástico y se coloca en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 18 a 20 horas para conseguir un revelado óptimo de las bandas. Cuando la tinción está completa, se lava el gel remplazando el reactivo de tinción con aproximadamente 200 ml de agua Milli-Q. Se realiza un mínimo de 3 cambios de agua durante un periodo de 1-2 horas para obtener resultados óptimos.
Escaneo del gel y análisis. Se escanea el gel usando los parámetros de escaneo definidos en la Tabla directamente anterior. El análisis del gel se realiza en el archivo de imagen escaneada.
Parámetros de escaneo del gel y análisis
Parámetros de escaneo
Ajustes
Tamaño del píxel de escaneo
100
Resolución digital del escaneo
12 bits
Parámetros de detección de bandas
Pendiente mínima
100 inicial
Reducción del ruido
10 inicial
% de pico máximo
0 inicial
% de anchura del carril
Establecer al 90%
NOTA: La Tabla 3 resume las directrices generales para el análisis de imágenes de gel. Remítase al manual ImageQuant TL (v2003.03) y a las instrucciones que aparecen en pantalla para obtener información detallada sobre el ajuste apropiado de cada parámetro de detección de bandas.
Se abre un archivo de imagen de gel (datos escaneado sin procesar) de lt;Análisis de gel 1Dgt; en ImageQuantTL. Se va a lt;Contrastegt; en la barra de herramientas y se baja el parámetro de lt;Histograma de imagengt; hasta que todas las bandas son claramente visibles. Se selecciona lt;Creación de carrilgt; y se selecciona lt;Manualgt; para establecer el 5 lt;Número de carrilesgt; a analizar. Se ajusta el lt;% de anchura el carrilgt; hasta el 100% para cubrir los carriles del gel. Se alinean apropiadamente los carriles individuales si es necesario. Se usa el procedimiento de lt;Bola rodantegt; para restar el fondo. Esto no es crítico para el análisis de imágenes de gel de EIE. Se detectan las bandas usando los valores de lt;Pendiente mínimagt; inicial, lt;Reducción del ruidogt; lt;% de pico máximogt; enumerados en la Tabla 3. El ajuste de estos valores es necesario para identificar con precisión las bandas. Se corrige manualmente cualquier
10 banda perdida y las bandas mal identificadas. Se calcula el valor pI de la banda usando el marcador de pI patrón de los marcadores marcados enumerados en la Sección de idoneidad del sistema para el gel de pH/pI 4,0-6,5. No se realizan las etapas de calibrado y normalización. Se exportan los datos contenidos en la ventana Mediciones a una hoja de Excel para su posterior cálculo y presentación de informes. Se importan los datos de Excel a la hoja de cálculo validada para realizar el análisis cuantitativo para informar de los resultados.
15 IDONEIDAD DEL SISTEMA. Deben distinguirse fácilmente los patrones de isoelectroenfoque (marcadores de pI) del fondo y deben presentar una distorsión limitada por inspección visual de la imagen escaneada del gel (véase la Tabla directamente a continuación para los marcadores enumerados de pI).
Patrones de isoelectroenfoque
Proteína
Valor de pI
Tripsinógeno
9,30
Lectina de lenteja, básica
8,65
Lectina de lenteja, media
8,45
Lectina de lenteja, ácida
8,15
Mioglobina, básica
7,35
Mioglobina, ácida
6,85
Anhidrasa carbónica B (humana)
6,55
Anhidrasa carbónica B (bovina)
5,85
B-Lactoglobulina A
5,20
Inhibidor de tripsina de soja
4,55
Rojo de metilo (colorante)
3,75
Amiloglucosidasa
3,50
NOTA: No todos los patrones de isoelectroenfoque aparecerán en el gel porque el intervalo de pH/pI del gel es 4,0-6,5. Los marcadores pI a 3,50, 4,55, 5,20, y 5,85 deben identificarse y marcarse en el gel.
El patrón de bandas del material de referencia de CTLA4A29YL104E-Ig y artículos de ensayo debe presentar una distorsión limitada por inspección visual de la imagen escaneada del gel. Se usa un control de tinción de anhidrasa carbónica II (pI 5,4) a un bajo nivel de carga de proteína (1,0 ∀g) para demostrar la tinción consistente del gel. La banda debe distinguirse fácilmente del fondo por inspección visual de la imagen escaneada del gel. El material de
5 referencia de CTLA4A29YL104E-Ig debe contener de 8 a 15 bandas con una intensidad de la banda ∗ 1,0% dentro del intervalo de pI de 4,5 a 5,6. Las bandas del material de referencia de CTLA4A29YL104E-Ig dentro del intervalo de pI de 4,5 a 5,6 deben tener una intensidad porcentual cumulativa de ∗ 95%.
CÁLCULO DE DATOS. La siguiente ecuación se utiliza para el cálculo de la intensidad porcentual cumulativa de muestras de CTLA4A29YL104E-Ig en relación con el material de referencia:
% de intensidad de la banda de muestra (pI 4,5-5,6) Intensidad porcentual cumulativa = x 100 % de intensidad de banda de referencia (pI 4,5-5,6)
10 Ejemplo: Si la muestra tiene un % de intensidad de banda (pI 4,5-5,6) del 95% y el material de referencia tiene un % de intensidad de banda (pI 4,5-5,6) del 100%, el % de intensidad cumulativa será del 95%.
El material de CTLA4A29YL104E-Ig en una realización tendrá bandas con una intensidad porcentual cumulativa de ∗ 1,0% dentro del intervalo de pI de 4,5-5,6. El material de CTLA4A29YL104E-Ig tiene una intensidad porcentual cumulativa con respecto a la de material de referencia de CTLA429YL104E-Ig dentro del intervalo de pI de 4,5 a 5,6.
15 Ejemplo 23: Transfección y generación de líneas celulares
Antes de la electroporación, se linealizó el vector de expresión pDL6LEA29Y con enzima BstBI para producir salientes compatibles de 4 pb. El vector linealizado y el ADN portador de esperma de arenque extraído (como portador) se co-precipitaron con etanol y se resuspendieron asépticamente en medio PF CHO (JRH Biosciences) para la electroporación en células DG44.
20 Después de la electroporación, las células se dejaron recuperar en medio no selectivo. Las células se sembraron después en placas de 96 pocillos en medios selectivos de PF CHO que contenían 500 ng/ml de recombulina (Gibco), L-glutamina 4 mM (Gibco) y metotrexato (ICN).
Se eligieron líneas celulares productoras de CTLA4A29YL104E-Ig de esta siembra para la amplificación de la expresión usando la siguiente progresión de concentraciones de metotrexato (MTX) añadidas a los medios:
25 20 nM ; 50 nM) ; 100 Nm9 ; 250 nM ; 500 nM ; 1∀M de MTX.
Se integra el plásmido de expresión de CTLA4A29YL104E-Ig completo en el genoma de la célula.
Selección de la línea celular de producción
Se aisló la línea celular de producción final GF 1.1.9 después de dos rondas de clonación por dilución límite de las líneas celulares de pocillo maestro amplificado, de mejor rendimiento. La selección de la línea celular GF 1.1.9 se
30 basó en el patrón de crecimiento, el título, y el producto que contiene una cantidad reducida de componente de alto peso molecular y mayor contenido de ácido siálico en relación con el material producido a partir de los otros clones.
Ejemplo 24: Caracterización genética de CTLA4A29YL104E-Ig
Estudios de estabilidad genómica
Se usaron el ADN y el ARN aislado de células derivadas de un banco de células para el análisis de hibridación de
35 Southern y Northern, y la secuenciación del ADNc para una secuencia codificante de CTLA429YL104E-Ig. Los resultados se compararon con los resultados obtenidos a partir de CTLA429YL104E-Ig.
Los resultados para el análisis de hibridación de Northern, y la estimación de la secuenciación de ADNc se presentan a continuación.
Análisis de hibridación de Northern
40 Se expandió un cultivo inoculado con células del banco de células y se usó para aislar el ARN para el análisis de hibridación de Northern. El cultivo preparado representa células aproximadamente 27 generaciones más allá de la edad de células in vitro usada en el procedimiento de producción de CTLA429YL104E-Ig. Se extrajo el ARN total de las células derivadas del banco de células CTLA4A29YL104E-Ig y de las células procedentes de células CTLA4A29YL104E -Ig expandidas. También se usó un control para utiliza el ARN total de la línea celular CHO parental también en estos
45 experimentos. Se sometieron aproximadamente 5 ∀g de ARN total a electroforesis en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes. El ARN en el gel se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con un fragmento de ADN HindIII/XbaI de 1,2 kb marcado con 32P que contenía el gen de CTLA4A29YL104E-Ig. El fragmento de ADN de HindIII/XbaI de 1,2 kb usado para la sonda se aisló del plásmido pD16LEA29Y.
Se detectó una especie de ARNm de aproximadamente 1,7 kilobases que hibridaba con la sonda del gen de CTLA4A29YL104E-Ig en la muestra de ARN total a partir del banco de células como se muestra en la FIG. 33. El panel A y el panel B mostrados en la FIG. 33 representan el gel teñido con bromuro de etidio de agarosa y el autorradiograma correspondiente, respectivamente.
Estos resultados indican que se expresa solamente un transcrito que codifica CTLA4A29YL104E-Ig en cultivos derivados del banco de células expandido de CTLA4A29YL104E-Ig. Además, no se observaron cambios detectables en el transcrito de ARNm de CTLA4A29YL104E-Ig en estas muestras en comparación con los resultados obtenidos usando el banco de células.
Ejemplo 25: Cromatografía por exclusión de tamaño
Se ha desarrollado un procedimiento de exclusión de tamaño para analizar composiciones de CTLA4A29YL104E-Ig usando una columna TosoHaas TSK-3000 SWXL de 7,8 mm x 300 mm equipada con una columna de seguridad con detección a 280 nm. Se evalúa CTLA4A29YL104E-Ig para la homogeneidad del producto incluyendo las especies de monómero (de cadena sencilla), dímero, o de alto peso molecular (por ejemplo, tetrámero). El procedimiento muestra buena precisión (lt;2%) a una concentración nominal de , 10 mg/ml y es lineal de ~ 0,5-15 mg/ml (r2 = 0,999). El LD (límite de detección) es de ~ 2,26 lt;g/ml y el LC (límite de cuantificación) es ~ 7,53 lt;g/ml. Estas moléculas solubles de CTLA4-Ig son proteínas de fusión que consisten en el dominio de unión a ligando del antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4) y la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana con potencial aplicación terapéutica como inmunosupresores. Estos compuestos ejercen sus efectos fisiológicos a través de la unión a antígenos B7 (CD80 y CD86) en la superficie de diversas células presentadoras de antígeno (APC), bloqueando de este modo la interacción funcional de B7.1 y B7.2 con CD28 en la superficie de linfocitos T. Este bloqueo provoca la supresión de la activación de linfocitos T, y por tanto, la respuesta inmune. Aunque LEA29Y difiere solamente de CTLA4Ig en dos restos de aminoácidos, Leu104 -glu y Ala29 -Try, las moléculas tienen avidez significativamente diferente hacia los antígenos B7.1 y B7.2. LEA29Y muestra una avidez de 5 a 10 veces mayor por la forma humana de B7.2 (CD86), y avidez similar por B7.1 humana (CD80), en comparación con el CTLA4Ig precursor.
Se usa cromatografía por exclusión de tamaño con una columna TSK-3000 SWXL (7,8 mm x 300 mm) equipada con una columna de seguridad y detección a 280 nm para analizar la sustancia de fármaco CTLA4A29YL104E-Ig para la homogeneidad. Se diferencian especies de CTLA4A29YL104E-Ig dímero, de alto peso molecular (alto PM) y bajo peso molecular (bajo PM).
Se usa cromatografía por exclusión por tamaño (CET) para evaluar CTLA4A29YL104E-Ig para la homogeneidad del producto. Las FIG. 34A-C muestran el cromatograma CET de CTLA4A29YL104E-Ig para el procedimiento B, el procedimiento C y el lote de co-mezcla. La CET de CTLA4A29YL104E-Ig indica que el material del procedimiento C es en un 99,8 por ciento del área dímero, un 0,2 por ciento del área especies de alto PM y ninguna especies detectables detectable de bajo PM. Estos resultados son comparables con el material del procedimiento B (dímero 97,4 por ciento del área, alto PM 2,6 por ciento del área, y bajo PM lt; LD).
Reactivos: KOH 4N (100 ml); patrón de idoneidad del sistema (marcadores de peso molecular disueltos en agua calidad HPLC); tampón de procesamiento de fase móvil (KH2PO4 0,2 M, NaCl al 0,9%, pH 6,8); NaOH 4 N; tampón de dilución (NaH2PO4-H2O 25 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5)
INSTRUMENTACIÓN Y CONDICIONES -Puede sustituirse instrumentación equivalente:
Tipo de bomba Waters Modelo 600 Columna Toso Haas 5: m TSK 3000 SWXL, 300 mm x 7,8 m D.I. Hewlett
Packard, (Nº de catálogo 79912S3-597) equipada con columna de
seguridad 5: m TSK 3000 SWXL, 40 mm x 6,0 mm D.I., Hewlett
Packard, (Nº de catálogo 79912S3-527) Detector Waters Modelo 486. Deben permitirse 15 minutos de calentamiento Longitud de onda 280 nm Caudal 1 ml/min Sistema de integración VG Multichrom Sistema de inyección Inyector automático Waters Modelo 717 Plus equipado con refrigeración
a 4 ºC Volumen de inyección 20 ml Concentración de ensayo diana 10 mg/ml Fase móvil KH2PO4 0,2 M, NaCl al 0,9%, pH 6,8 con KOH Tiempo de procesamiento del ensayo 20 min. Temperatura de la columna ambiente Tiempo de retención CTLA4A29YL104E-Ig ~ 8,5min ! 0,5 min, especies de alto peso molecular a
~ 7,5 min ! 0,5 min
Se prepararon patrones y las muestras (10 mg/ml) como volúmenes de 50 ml en viales de inyector automático etiquetados. Las muestras se prepararon por duplicado.
CÁLCULOS
Determinación de la resolución (R) y evaluación del tiempo de retención: Se inyectan 20 ml de patrones de idoneidad del sistema para calcular la resolución entre 2 picos de un cromatograma generado usando dichos 5 patrones (por ejemplo, un pico, pico 1, que tiene un tiempo de retención ~ 8,5 minutos y un segundo pico, pico 2, que tiene un tiempo de retención ~ 10 minutos), usando la siguiente ecuación:
2(t2 -t1)Resolución (R) = W2 + W1
Donde:
t1 = Tiempo de retención del pico 1
10 t2 = Tiempo de retención del pico 2 W1 = Anchura del pico 1 W2 = Anchura del pico 2
2(t2 -t1) 2(10,07 – 8,52)Resolución (R) = = = 2,12 1,3 W2+ W1 0,57 + 0,86
La anchura del pico es igual a la anchura (en minutos) en la base del pico después de la extrapolación de los 15 laterales relativamente rectos del pico hasta la línea basal. El tiempo de retención y las anchuras de pico se miden en las mismas unidades.
R debe ser = 1,3 y el tiempo de retención para el pico debe ser ~ 8,5 V 0,5 minutos.
Determinación del número de placas teóricas: A partir del cromatograma del patrón de idoneidad del sistema, puede determinarse la eficacia de la columna calculando el número de placas teóricas de acuerdo con la siguiente 20 ecuación:
4 t 12
N 5 16 2/3 w 0
Donde:
(t) = es el tiempo de retención del pico 2 (en minutos)
(w) = es la anchura (en minutos) en la línea basal del pico 2 obtenida mediante la extrapolación de los laterales 25 del pico hasta la línea basal como se observa en la Figura 1.
N debe ser = 2500.
Integración de los picos: Se integraron las áreas de los picos en el cromatograma (por ejemplo, FIG. 34A-C.). El pico de dímero CTLA4A29YL104E-Ig está a ~ 8,5 minutos y el pico de las especies de alto peso molecular está a ~ 7,4 minutos.
30 Los porcentajes de área se pueden calcular de acuerdo con las siguientes fórmulas:
% de área de dímero M
100 -(% de área de especies de alto peso molecular + % de área de especies de bajo peso molecular)
(B)% de área de especies de alto peso molecular = x 100
(A) + (B) + (C)
(C)% de área de especies de bajo peso molecular = x 100
(A) + (B) + (C)
Donde:
A = área del pico de dímero CTLA4A29YL104E-Ig B = área total de todos los picos con tiempos de retención menores que el dímero CTLA4A29YL104E-Ig C = área total de todos los picos con tiempos de retención mayores que el pico de dímero CTLA4A29YL104E-Ig
(excluyendo el volumen de inclusión).
Se determina el % DTR de los recuentos de área total (excluyendo el volumen de inclusión). El % DTR del total de recuentos de área debe ser del 2% o menos. Si el área es lt;2,707 recuentos de área, se informa de los resultados como # LD (límite de detección) (~ 2.26 ∀g/ml). Si los recuentos de área están entre 2707-9014, se informa de los resultados como # LC (límite de cuantificación) (~ 7,53 pg/ml). Si los recuentos de área son 3 9014, se informa de los resultados en la décima más cercana de un porcentaje.
Ejemplo 26: SDS-PAGE y enlaces disulfuro
Electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida
Se usa un procedimiento de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) para el análisis de CTLA429YL104E-Ig como ensayo de pureza. Las muestras se preparan en un tampón de muestra Tris-HCl (pH 6,8), SDS, sacarosa, y azul de bromofenol en presencia (reducido) o ausencia (no reducido) de ditiotreitol (DTT). Las muestras se colocan en un baño de agua a 80 ºC durante dos minutos y se someten a electroforesis en geles premoldeados, de poliacrilamida en gradiente (4-20%) y SDS usando un tampón de procesamiento de Tris-glicina SDS. Después de la electroforesis, los geles se fijan y se tiñen usando azul de Coomassie o un sistema de tinción con plata. Se observa CTLA4A29YL104E-Ig no reducido como una banda grande con un peso molecular aparente aproximado de , 104 kD. Se observa CTLA4A29YL104E-Ig como una banda principal con un peso molecular aparente aproximado de ~ 53 kD.
Las muestras del Lote 000929-278 del procedimiento B, el Lote 224818-2004-007 del procedimiento C y el Lote 551218-162 de co-mezcla se resolvieron por electroforesis usando geles de SDS-PAGE en gradiente del 4-20% en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles se tiñeron por separado, con Coomassie o tinción de plata como se muestra en la FIG. 35 y la FIG. 36. La SDS-PAGE de CTLA4A29YL104E-Ig no reducida mostró una banda principal a aproximadamente 104 kDa que representan el monómero intacto. También se observaron tres bandas menores, que no se ven fácilmente en las reproducciones electrónicas, a , 200, 65 y 53 kDa. Las muestras reducidas de CTLA4A29YL104E-Ig muestran una banda principal a aproximadamente 53 kDa que representa la forma de cadena sencilla y una banda menor a , 150 kDa. Esta comparación muestra que los tres materiales ensayados son comparables cuando se analizan en el mismo gel.
Enlaces disulfuro
Se caracterizan los enlaces disulfuro para la sustancia de fármaco del procedimiento C usando el Lote 224818-2004
007. Cada cadena de CTLA4A29YL104E-Ig contiene nueve cisteínas. Éstas son Cys21, Cys48, Cys66, Cys92, Cys120, Cys171, Cys231, Cys277 y Cys335. Se usó mapeo de péptidos con CL/EM/EM en línea, de CTLA4A29YL104E-Ig tanto reducido como no reducido para identificar los sitios de enlaces disulfuro intra-e intermoleculares en CTLA4A29YL104E-Ig. Se muestra una lista de los péptidos obtenidos a partir del mapeo de péptidos de CTLA4A29YL104E-Ig no reducido junto con el PM esperado y observado en la Tabla 27.
La desaparición de ciertos picos en el mapa de péptidos no reducidos y la aparición de nuevos picos en el mapa de péptidos reducidos proporcionó evidencias de tres péptidos enlazados por disulfuro: T2-T6, T11-T17, y T25-T30 que corresponden a los enlaces disulfuro de Cys21-Cys92, Cys171-Cys231 y Cys277-Cys335. Los péptidos T5 y T7 tienen un peso molecular relativamente alto y contienen carbohidratos ligados a N, lo que hace que sea difícil localizar enlaces disulfuro. Para generar péptidos más cortos y libres de carbohidratos, se digirió CTLA429YL104E-Ig con una mezcla de tripsina y quimotripsina. Como resultado de la escisión adicional con quimotripsina, T7 se acortó de un péptido de 35 aminoácidos a un péptido de 15 aminoácido, denominado T7'-T7', en que está retirado el hidrato de carbono unido a N. El péptido T7'-T7' unido por disulfuro aparece en el mapa no reducido (véase la FIG. 37). La EM/EM sobre T7'-T7' confirmó su secuencia y su enlace disulfuro intercatenario en Cys120-Cys120.
Tabla 27. Secuencia peptídica y PM de péptidos unidos por disulfuro de digestión con tripsina de CTLA429YL104E-Ig en condiciones no reductoras
Enlace Secuencia PM PM disulfuro teórico observado
T2-T6 (C21-2539,2 2539,6 C29)
2328,1 2328,4 T11-T17 (C171-C231)
T25-T30 (C277-3844,8 3846,3 C335)
T5 (C48-C66) Glucopéptidoa
T7-T7 (C120-Glucopéptido C120)
a Los péptidos T5 y T7-T7 dan lugar a varias masas debido a la heterogeneidad de la glucosilación ligada a N lo que hace difícil localizar los enlaces disulfuro.
El tratamiento con una mezcla de tripsina y quimotripsina también provocó la formación de fragmentos, que correspondían a versiones más cortas de otros péptidos con enlaces disulfuro que se observaron en la hidrólisis de CTLA4A29YL104E-Ig por tripsina solamente. Éstos se muestran en la Tabla 28.
Tabla 28. Secuencia peptídica y PM de péptidos unidos por disulfuro de CTLA429YL104E-Ig con digestión (tripsina y quimotripsina)
Enlace disulfuro
Secuencia PM teórico PM observado
T2'-T6' (C21-C29)
872,4 872,4
T11-T17 (C171-C231) T25'-T30' (C277-C335) T7'-T7' (C120-C120) T5 (C48-C66)
2328,1 2328,6 984,5 984,5 3333,5 3333,2 glucopéptido
10 La digestión de CTLA4A29YL104E-Ig con una mezcla de tripsina y quimotripsina estableció el emparejamiento disulfuro 189
en T7-T7 y confirmó los enlaces disulfuro observados con la digestión por tripsina solamente. Sin embargo, esta mezcla de enzimas no tenía ningún efecto sobre el péptido T5, que también es un glucopéptido. Para eliminar los carbohidratos ligados a N de T5, se digirió CTLA429YL104E-Ig con una mezcla de tripsina y elastasa, como se muestra en la FIG. 38. Esta mezcla de enzimas hidrolizaba T5 en cuatro sitios diferentes generando un péptido más corto denominado (T5'-T5'') como se muestra en la Tabla 29. Este péptido generado tenía la masa esperada de 1259 Da y contiene el enlace disulfuro correspondiente a Cys46-Cys66. El perfil de mapa de péptidos obtenido a partir de la hidrólisis de CTLA4A29YL104E-Ig no reducido por una mezcla de tripsina y elastasa se muestra en la FIG. 38 y la secuencia del péptido T5'-T5'' está en la Tabla 29.
Tabla 29: Secuencia peptídica y PM del péptido T5'-T5'' obtenido por digestión de CTLA4A29YL104E-Ig con una mezcla de tripsina y elastasa
Enlace disulfuro Secuencia PM teórico PM observado
T5 (C48-C66) glucopéptido
Los resultados indican que CTLA4A29YL104E-Ig tiene cuatro enlaces disulfuro intramoleculares en las posiciones Cys21-Cys92 (T2-T6), Cys48-Cys66 (que corresponden a un único péptido T5), Cys171-Cys231 (T11-T17) y Cys277-Cys335 (T25-T30) y un enlace disulfuro intercatenario en las posiciones Cys120-Cys120 (T7-T7). Los datos representan los dieciocho restos de cisteína. No se observó ningún mal apareamiento.
Ejemplo 27: Formulación de CTLA4A29YL104E-Ig
CTLA4A29YL104E-Ig para inyección, 100 mg/vial es un liofilizado estéril no pirógeno. La composición del producto de fármaco se da en la Tabla 30. Es una torta completa o fragmentada de color blanco a blancuzco proporcionada en viales de vidrio tipo I con tapones de butilo gris y sellados con precintos de aluminio. Este producto incluye un 10% de sobrellenado para dar cuenta de la retención del vial, la aguja y la jeringa.
Antes de la administración, se constituye CTLA4A29YL104E-Ig para inyección, 100 mg/vial con 4,2 ml de agua estéril para inyección, USP para producir una concentración de 25 mg/ml. Puede diluirse adicionalmente hasta una concentración tan baja como 1 mg/ml con dextrosa para inyección al 5%, USP o cloruro sódico inyectable al 0,9%, USP. Las soluciones constituidas y diluidas son transparentes, incoloras y esencialmente libres de materia particulada en inspección visual.
Tabla 30. Composición de CTLA4A29YL104E-Ig para inyección, 100 mg/vial
Componente Función Cantidad por vial (mg)
CTLA4A29YL104E-Ig
Principio activo 110a Sacarosa Lioprotector 220 Fosfato sódico monobásico monohidrato Agente tamponante 15,18 Cloruro sódico Ajuste de fuerza iónica 2,55 Hidróxido sódico 1 N Ajuste del pH Hasta 7,5 ! 2 Ácido clorhídrico 1 N Ajuste del pH Hasta 7,5 ! 2 Agua para inyecciónb Disolvente c.s. hasta 5,5 ml
a Cada vial contiene un 10% de sobrellenado para la retención del vial, la aguja y la jeringa de la solución reconstituida.
b Retirada durante la liofilización
Se determinó que la temperatura de transición vítrea de la solución congelada para secarse por congelación era 28,9 ºC. Se realizaron estudios de secado por congelación a diversas temperaturas de conservación para determinar la temperatura de conservación más alta posible permitida durante el secado principal, sin comprometer la calidad del producto. En base a estos estudios, se seleccionó una temperatura de conservación de -20 ºC para la etapa de secado principal durante el secado por congelación de CTLA4A29YL104E-Ig. Al final del ciclo de secado por congelación, los viales se tapan a presión reducida.
El procedimiento de producción implica congelar viales que contienen solución a granel para liofilización (con excipientes apropiados) en una cámara de secado por congelación, seguido de sublimación del agua congelada a temperatura y presión controladas. Las condiciones de temperatura y presión en la cámara se optimizan para obtener una sublimación eficaz sin comprometer la calidad del producto.
Se estudió la compatibilidad de la solución con diversas superficies de contacto de productos y componentes de envasado. Se encontró que la solución era compatible con acero inoxidable 316L, tubos de silicona, AcrodiscTM, HT Tuffryn (polisulfona), membranas de filtro de PVDF (fluoruro de polivinileno) Millipore y el sistema de cierre de recipientes seleccionado.
CTLA4A29YL104E-Ig para inyección, 100 mg/vial se envasa en viales de vidrio de 15 cc con tubo de sílex Tipo I y se tapan con un tapón de 20 mm Daikyo de butilo gris D-21-7-S/B2-TR recubierto con fluoro-resina y se sella con un precinto de aluminio extraíble de 20 mm.
La selección del vial para CTLA4A29YL104E-Ig para inyección se basó en el volumen de llenado de 5,5 ml para asegurar un secado por congelación eficaz y la selección del tapón de 20 mm Daikyo de butilo gris D-21-7-S/B2-TR recubierto con fluoro-resina se basó en los datos de compatibilidad.
Se han realizado estudios extensivos de compatibilidad con el tiempo de uso. CTLA4A29YL104E-Ig para inyección 100 mg/ml cuando se constituye a 25 mg/ml de agua estéril para inyección puede almacenarse a temperaturas ambiente de 15 º-25 ºC (59 º-77 ºF) y a luz ambiente durante 24 horas. La solución constituida cuando se diluye adicionalmente a 1 mg/ml o 10 mg/ml con cloruro sódico inyectable al 0,9% (solución salina normal/NS) o con dextrosa al 5% (D5W) y se almacena en una bolsa de PVC o Intra Via sin PVC a temperaturas ambiente de 15 º-25 ºC (59 º-77 ºF) y a luz ambiente, no muestra pérdida de potencia o aumento de las especies de alto peso molecular durante un período de 24 horas. La solución diluida debe filtrarse a través de un filtro de celulosa/acetato mixto de 0,2 ∀m o 1,2 ∀m antes de la administración. La solución diluida es compatible con y filtros de celulosa/acetato mixtos de 0,2 ∀m y 1,2 ∀m
El producto es incompatible con silicona. Interacciona con silicona formando partículas visibles. Por lo tanto, debe evitarse el contacto con superficies tratadas con silicona tales como jeringas siliconadas.
Ejemplo 28: Procedimiento de producción de CTLA4-Ig
CTLA4-Ig se produce como una proteína segregada en cultivo celular a gran escala usando una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). El procedimiento de producción de CTLA4-Ig se inicia usando una serie de etapas de expansión del inóculo en matraz y biorreactores de siembra. Se usan los contenidos de un biorreactor de siembra final para inocular un biorreactor de producción de 5000 l. La recogida del cultivo celular desde el biorreactor de producción de 5000 l se aclara y se concentra por microfiltración y ultrafiltración. El material de recogida libre de células se ajusta para el pH y la conductividad en la preparación para el procesamiento corriente abajo. CTLA4-Ig se purificó usando una serie de etapas de cromatografía y filtración. El procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente abajo incluye dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba y una etapa de cromatografía de afinidad. El propósito de estas etapas es purificar la proteína CTLA4-Ig, eliminar el material de alto peso molecular de CTLA4-Ig y controlar el contenido de ácido siálico de la sustancia de fármaco de CTLA4-Ig. Las etapas de procesamiento corriente abajo también incluyen una etapa de inactivación viral y una etapa de filtración viral para eliminar los agentes virales adventicios potenciales. La sustancia de fármaco de CTLA4-Ig purificada se carga en frascos de policarbonato de 2 l y se congela a una temperatura diana de -70 ºC antes de su almacenamiento a una temperatura diana de -40 ºC. La sustancia de fármaco congelada se descongela.
El ácido N-acetilneuramínico (NANA) es la especie de ácido siálico principal presente en la sustancia de fármaco de CTLA4-Ig. Las referencias al ácido siálico en toda esta sección se refieren específicamente a esta especie. También están presentes niveles menores de ácido N-glucolilneuramínico (NGNA) en la sustancia de fármaco de CTLA4-Ig. Se determinan los niveles tanto de NANA como de NGNA para la sustancia de fármaco final de CTLA4-Ig. A continuación se muestra un diagrama de flujo del procedimiento para el procedimiento de producción de CTLA4-Ig.
La CTLA4-Ig se produce en biorreactores de producción de 5000 l con un volumen de trabajo aproximado de 4300 l. Un lote de sustancia de fármaco de CTLA4-Ig se prepara a partir de un único biorreactor de producción derivado de un único vial del banco de células. El procedimiento de producción de cultivo celular corriente arriba se inicia usando 5 un único vial de células de un banco de células. El vial se descongela y se utiliza todo el contenido para sembrar un matraz T que contiene medio de crecimiento de cultivo celular. Las células después se expanden en una serie de matraces de agitación. Los matraces de la etapa final de expansión del inóculo en matraces de agitación se usan para inocular el biorreactor de siembra de 140 l. El biorreactor de siembra de 140 l tiene un volumen de trabajo de aproximadamente 100 l. Los contenidos del biorreactor de siembra de 140 l se usan para inocular el biorreactor de 10 siembra de 1100 l. El biorreactor de siembra de 1100 l tiene un volumen de trabajo de aproximadamente 600 l. Los contenidos del biorreactor de siembra de 1100 l se usan para sembrar el biorreactor de producción de 5000 l. Las células se cultivan en el biorreactor de producción de 5000 l durante aproximadamente 14 días. Después de la etapa en el biorreactor de producción, el caldo de cultivo celular de un único biorreactor se transfiere a un recipiente de recogida para su procesamiento adicional. Se usa una unidad de microfiltración de flujo tangencial (MF) para separar
15 la proteína CTLA4-Ig segregada de las células huésped y los desechos celulares. El permeado de MF que contiene la proteína CTLA4-Ig se concentra a continuación por ultrafiltración (UF) y se ajusta para el pH y la conductividad en la preparación para la primera etapa de cromatografía.
La purificación y las etapas de procesamiento corriente abajo para la sustancia de fármaco de CTLA4-Ig consisten en cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrófoba (CIH), inactivación viral, cromatografía de afinidad, concentración por UF de flujo tangencial y diafiltración, filtración viral, una segunda cromatografía de intercambio aniónico y concentración por UF y diafiltración. La etapa de CIH utiliza múltiples ciclos por lote de CTLA4-Ig dependiendo de la cantidad de CTLA4-Ig a procesar. El material en el procedimiento de los múltiples ciclos de etapa de CIH se combina para la posterior etapa de inactivación viral. El material en el
5 procedimiento de lotes diferentes no se combina. Pueden usarse múltiples filtros virales en paralelo para procesar un único lote de CTLA4-Ig. Después de la filtración viral, los filtrados se combinan para su procesamiento adicional.
Cada lote de CTLA4-Ig se filtra a través de un filtro de 0,2 ∀m en frascos de policarbonato de 2 l (PC) y se almacena temporalmente a 2 º a 8 ºC. Los frascos de PC de 2 l de CTLA4-Ig se congelan a una temperatura diana de -70 ºC y después se almacenan a una temperatura diana de -40 ºC. Los frascos de sustancia de fármaco se descongelan en
10 una incubadora a 22 º a 24 ºC y se enfrían hasta 2 º a 8 ºC antes de su envío.
Producción
CTLA4-Ig se produce en cultivo celular a gran escala usando una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). El procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente arriba se inicia con la descongelación de un vial congelado de un banco de células. El cultivo se propaga en un matraz T, seguido por una serie de cultivos en matraz de agitación. 15 Estos cultivos se transfieren a un biorreactor de siembra de 140 l. El cultivo del biorreactor de siembra de 140 l se transfiere a un biorreactor de siembra de 1100 l. El cultivo del biorreactor de siembra de 1100 l se usa para inocular un biorreactor de producción de 5000 l. El biorreactor de producción se recoge principalmente en base a una proporción molar diana de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig. La recogida del cultivo de celular se aclara y se concentra usando una combinación de microfiltración (MF) y ultrafiltración (UF). Por último, el material de recogida
20 libre de células concentrado se ajusta para conseguir una conductividad y un pH especificados en la preparación para el procesamiento corriente abajo.
Cultivo celular y preparación de los medios de alimentación
Se pesan y miden los componentes sólidos y líquidos de los medios. Se usan dos medios de cultivo celular en el procedimiento. El medio 127-G se usa en las etapas de matraz T, matraz de agitación, biorreactor de siembra y 25 biorreactor de producción. El medio 117-E se usa como medio de alimentación en la etapa de biorreactor de producción. La composición del medio 127-G se muestra en la tabla directamente a continuación.
Componente Concentración
Solubles ácidos I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Solubles ácidos II CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales II CD-CHO 25x 40,0 ml/l L-Glutamina 0,585 g/l Insulina r-humana (solución de 10 mg/ml) 0,1 ml/l Metotrexato (solución a 20 mM) 5 ∀l/l Bicarbonato sódico 2,22 g/l Agua para inyección La necesaria Solución de HCl 1 N 0 -5 ml/l hasta ajustar el pH Solución de NaOH 10 N 0 -10 ml/l hasta ajustar el pH
La composición del medio 117-E se muestra a continuación. La composición del medio e-RDF-1 es la siguiente:
Componente
Concentración
Medio eRDF-1 (Invitrogen Corp.)
16,47 g/kg
Dextrosa
30,29 g/kg
D-galactosa
12,38 g/kg
L-Glutamina
4,02 g/kg
Insulina r-humana (solución a 10 mg/ml)
0,98 ml/kg
TC Yeastolate
4,90 g/kg
Agua para inyección
La necesaria
Solución de HCl 1 N
0 -5 ml/kg hasta ajustar el pH
Solución de NaOH 10 N
0 -2 ml/kg hasta ajustar el pH
Componente
Concentración (mg/l)
Sulfato cúprico 5 H2O
0,0008
Sulfato ferroso 7 H2O
0,220
Sulfato de magnesio (MgSO4)
66.20
Sulfato de zinc 7 H2O
0,230
Piruvato sódico
110,0
Ácido DL-lipoico tióctico
0,050
Ácido linoleico
0,021
L-Alanina
6,68
L-Arginina
581,44
L-Asparagina
94,59
Ácido L-aspártico
39,93
L-Cistina 2 HCl
105,38
Ácido L-glutámico
39,7
Glicina
42,8
L-Histidina HCl-H2O
75,47
L-Isoleucina
157,40
L-Leucina
165,30
L-Lisina HCl
197,26
L-Metionina
49,24
L-Fenilalanina
74,30
L-Prolina
55,3
L-Hidroxiprolina
31,5
L-Serina
85,10
L-Treonina
110,8
L-Triptófano
18,40
L-Tirosina 2 Na 2H2O
108,10
L-Valina
108,9
Ácido para amino benzoico
0,51
Vitamina B12
0,339
Biotina
1,00
D-Pantotenato de Ca
1,29
La tabla se prosigue a continuación:
Componente
Concentración (mg/l)
Cloruro de colina
12,29
Ácido fólico
1,96
i-Inositol
46,84
Niacinamida
1,47
Piridoxal HCl
1,00
Piridoxina HCl
0,420
Riboflavina
0,21
Tiamina HCl
1,59
Putrescina 2HCl
0,020
El medio de cultivo celular 127-G usado en el matraz T y los matraces de agitación en el procedimiento se prepara en recipientes medianos equipados con un agitador para mezclar y un vidrio de visión graduado para la determinación del volumen. El tamaño del lote del Medio 127-G usado en las etapas de expansión del inóculo en matraz T y matraces de agitación es de 75 l. El medio 127-G se prepara usando agua para inyección (WFI). Los componentes sólidos y líquidos del medio se añaden al WFI. El medio se mezcla durante el período de tiempo requerido después de la adición de cada componente. Se añade WFI para llevar el medio al volumen final del lote de 75 l. Se extrae una muestra de la preparación de medio final y se mide la concentración de glucosa, el pH y la osmolalidad de la muestra para asegurar que el medio cumple los criterios de aceptación definidos. El medio se filtra a través de un filtro de 0,2 ∀m y se dispensa en frascos de tereftalato de polietilenglicol (PETG) estériles. El medio 127-G preparado para las etapas de expansión del inóculo en matraz T y matraces de agitación se almacena a 2 º a 8 ºC durante un máximo de 42 días. El medio 127-G para las etapas en biorreactor de siembra de 140 l y 1100 l se prepara en recipientes equipados con un agitador para mezclar. El tamaño de lote del medio 127-G usado en la etapa del biorreactor de siembra de 140 l es de 120 l. El recipiente usado para preparar el medio para el biorreactor de siembra de 140 l está equipado con un vidrio de visión graduado para la determinación del volumen. El tamaño del lote del medio 127-G usado en la etapa de birreactor de siembra de 1100 l es de 600 kg. El recipiente usado para preparar el medio para el biorreactor de siembra de 1100 l está equipado con un transmisor de presión diferencial para la determinación del peso.
Los volúmenes requeridos de medio 127-G se transfieren a los biorreactores de siembra de 140 l y 1100 l a través filtro consecutivos de 0,2 ocm y 0,1 ∀m. El medio 127-G preparado para las etapas de biorreactor de siembra de 140 l y 1100 l puede mantenerse a 37 ºC durante un máximo de 48 horas. El medio puede mantenerse a 4 ºC durante 84 horas adicionales.
Preparación de los medios 127-G y 117-E de cultivo celular usados en una etapa de biorreactor de producción de 5000 l.
El medio 127-G para la etapa del biorreactor de producción de 5000 l se prepara en un recipiente de preparación de medio equipado con un agitador y un transmisor de presión diferencial para la determinación del peso. El tamaño del lote del medio 127-G usado en la etapa del biorreactor de producción de 5000 l es de 2900 kg. El volumen requerido de medio 127-G se transfiere al biorreactor de producción de 5000 l a través filtros consecutivos de 0,2 ∀m y 0,1 ∀m. El medio 127-G preparado para la etapa de biorreactor de producción de 5000 l se puede mantener a 37 ºC durante un máximo de 48 horas. El medio puede mantenerse a 4 ºC durante 84 horas adicionales.
El medio de alimentación 117-E se prepara en un recipiente de preparación de medio equipado con un agitador para mezclar y un transmisor de presión diferencial para la determinación del peso. El tamaño del lote del medio 117-E usado en la etapa de biorreactor de producción de 5000 l es de 1800 kg. Los componentes del medio 117-E se añaden a un peso especificado de WFI en el recipiente de preparación del medio. El medio se mezcla durante el período de tiempo requerido después de la adición de cada componente. Se añade WFI para llevar el medio al peso final especificado. Se retira una muestra de la preparación de medio final y se miden la concentración de glucosa, el pH y la osmolalidad de la muestra para asegurar que el medio cumple los criterios de aceptación definidos. El volumen requerido de medio 117-E se transfiere a un tanque de retención de medio de alimentación a través filtros consecutivos de 0,2 ∀m y 0,1 gt;m. El medio 117-E preparado para la etapa de biorreactor de producción de 5000 l se puede mantener a 37 ºC durante un máximo de 2 días. El medio puede mantenerse a 4 ºC durante 4 días adicionales.
Etapas de expansión del inóculo en matraz T y etapas de expansión del inóculo en matraz de agitación
El objetivo de las etapas de expansión del inóculo en matraz T y matraz de agitación del procedimiento de producción de CTLA4-Ig es propagar en serie las células del vial de banco de células para proporcionar una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de siembra de 140 l. Se retira un único vial del banco de células de la fase de vapor de un congelador de almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongela en un baño de agua a 37 ºC. Los contenidos completos del vial se transfieren asépticamente a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril. Se añade medio 127-G para llevar el volumen final a 10 ml. La suspensión celular se centrifuga, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo celular 127-G. Las células resuspendidas se transfieren a un matraz T-175 que contiene 10 ml de medio 127-G. Se determinan la densidad de células viables y el porcentaje de viabilidad del cultivo en el matraz T-175. Se estableció el porcentaje de viabilidad en esta etapa de ∗ 84%. Se añade medio 127-G al matraz T-175 para conseguir una densidad diana de células viables de 2,1 x 105 células/ml.
El matraz T-175 se incuba a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante un máximo de cuatro días para conseguir una cantidad diana de células de 1,80 x 107 células viables. Después de la etapa en matraz T-175, el cultivo se expande usando una serie de etapas en matraces de agitación de 0,25 l, 1 l y 3 l. En cada pase, las células se siembran a una densidad diana de 2,0 x 105 células viables/ml. Los cultivos en matraz de agitación se incuban a 37 ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 6%.
El material de cultivo celular de la etapa de expansión del inóculo en matraz de agitación de 3 l final se combina en un recipiente de transferencia de inóculo de 20 l esterilizado. Se estableció la densidad final de células viables en la etapa de expansión del inóculo en matraz de agitación de 3 l de 1,0 a 2,0 x 106 células/ml y un porcentaje mínimo de viabilidad celular de ∗ 80%. Estos valores ejemplares aseguran que se use una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de siembra de 140 l. Se usa un volumen total de 12 l a 18 l del cultivo celular combinado procedente de la etapa final de expansión del inóculo en matraz de agitación de 3 l para inocular el biorreactor de siembra de 140 l.
Etapas de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 140 l y 1100 l
El objetivo de las etapas de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 140 l y 1100 l del procedimiento de producción de CTLA4-Ig es proporcionar una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de producción de 5000 l. Los biorreactores de siembra se hacen funcionar en modo discontinuo usando el medio de cultivo celular 127-G. Se controlan la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto, la presión, la agitación y el caudal de gas para el aire, el oxígeno, y el dióxido de carbono mediante un sistema de control distribuido (DCS) y proporcionan las condiciones para un crecimiento óptimo del cultivo en los biorreactores de siembra. Los biorreactores de siembra se hacen funcionar a 37 ºC. Se retiran muestras de cultivo de los biorreactores de siembra para la determinación de la densidad de células viables, el porcentaje de viabilidad y las concentraciones de metabolitos.
El biorreactor de siembra de 140 l se inocula con inóculo combinado de la etapa de expansión del inóculo en matraz de agitación de 3 l a una densidad diana de células viables inicial de 2,0 x 105 células/ml. Se estableció la densidad final de células viables en la etapa de expansión del inóculo en biorreactor de siembra de 1100 l de 1,0 a 2,5 x 106 células/ml y un porcentaje mínimo de viabilidad celular de ∗ 80%. Estos criterios de aceptación aseguran que se use una cantidad suficiente de células viables para inocular el biorreactor de producción de 5000 l. El cultivo celular del biorreactor de siembra de 1100 l se transfiere al biorreactor de producción de 5000 l para conseguir una densidad diana de células viables inicial de 1,5 x 105 células/ml.
Etapa de biorreactor de producción
El objetivo de la etapa del biorreactor de producción de 5000 l es expandir la cantidad de células viables y producir la proteína CTLA4-Ig. La duración de la etapa del biorreactor de producción es de aproximadamente 14 días. El inóculo del biorreactor de siembra de 1100 l se siembra en un biorreactor de producción de 5000 l que contiene medio de cultivo celular 127-G. El biorreactor de producción se hace funcionar en modo semicontinuo. Se controlan la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto, la presión, la agitación y el caudal de gas para el aire, el oxígeno, y el dióxido de carbono por el DCS y proporcionan las condiciones para un crecimiento óptimo del cultivo y la producción de la proteína CTLA4-Ig en el biorreactor de producción.
Se usa una estrategia de control de la temperatura de tres fases durante la etapa en biorreactor de producción de 5000 l para optimizar el crecimiento celular y la producción de CTLA4-Ig. La temperatura de incubación inicial del biorreactor de producción se controla a 37 ºC para conseguir un crecimiento celular óptimo. La temperatura se disminuye hasta 34 ºC cuando se consigue una densidad de células viables de 4,0 x 106 células/ml en el biorreactor de producción o a las 144 horas desde el momento de la inoculación, lo que ocurra primero. La temperatura se disminuye hasta 32 ºC a las 240 horas y se mantiene a 32 ºC hasta la recogida. Se obtienen muestras diarias del biorreactor de producción de 5000 l para controlar el crecimiento celular, la viabilidad celular, las concentraciones de metabolitos, el título de CTLA4-Ig y la proporción molar de ácido siálico a CTLA4-Ig a proteína.
El suministro de medio 117-E al biorreactor de producción se inicia entre 12 a 24 horas desde el momento de la inoculación. Medio 117-E se añade diariamente para conseguir una diana del 1% (v/v) de medio de alimentación para el volumen de cultivo o un volumen suficiente del medio de alimentación 117-E para llevar la concentración de glucosa a 3 g/l. Esta estrategia de suministro proporciona suficientes niveles de glucosa y otros nutrientes al cultivo para soportar la producción de proteína CTLA4-Ig durante la etapa en biorreactor de producción.
El medio 117-E se suplementa con D-galactosa para promover el aumento de la glucosilación de la proteína CTLA4-Ig. La suplementación con galactosa provoca un aumento en el contenido terminal de ácido siálico de la proteína CTLA4-Ig. La proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig es un importante criterio de recogida en el procedimiento de producción de CTLA4-Ig.
También se usa una estrategia de tres fases para controlar el oxígeno disuelto y la velocidad de agitación en el biorreactor de producción. La velocidad de agitación inicial de 30 rpm asegura la uniformidad de las condiciones físicas y evita la sedimentación de las células dentro del biorreactor de producción de 5000 l. El punto de ajuste de oxígeno disuelto inicial del 40% asegura la disponibilidad de niveles suficientes de oxígeno disuelto para soportar el crecimiento del cultivo en el biorreactor de producción. Los puntos de ajuste para el oxígeno disuelto y la velocidad de agitación se aumentan a las 96 horas desde el momento de la inoculación hasta el 50% y 40 rpm, respectivamente. A las 120 horas desde el momento de la inoculación, los puntos de ajuste para el oxígeno disuelto y la velocidad de agitación se aumentan adicionalmente hasta el 60% y 50 rpm, respectivamente. Esta estrategia asegura niveles suficientes de oxígeno disuelto para mantener el cultivo celular durante la etapa en biorreactor de producción. El título de proteína CTLA4-Ig aumenta durante el transcurso de la etapa en biorreactor de producción. La viabilidad del cultivo se controla durante todo el transcurso de esta etapa. La proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig se controla dos veces al día a partir de 6 días desde el momento de la inoculación hasta el momento de la recogida. La proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig es tiene un pico en aproximadamente 10 alrededor de 8 días desde el momento de la inoculación y luego disminuye gradualmente durante el resto de la etapa en biorreactor de producción. El criterio principal de recogida para el biorreactor de producción es la proporción molar de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig. El biorreactor de producción se recoge a
5 una proporción molar diana de ácido siálico a proteína CTLA4-Ig de 8,0.
También se estableció un valor mínimo de viabilidad celular del 38% para la recogida del cultivo. Estos criterios de recogida aseguran la consistencia del material de recogida en el procedimiento para el procesamiento corriente abajo en la sustancia fármaco de CTLA4-lg. El número total de generaciones celulares desde el inicio de la expansión del inóculo hasta la recogida del biorreactor de producción en el procedimiento de producción de CTLA4
10 Ig corriente arriba es de aproximadamente 38 generaciones. La línea celular usada en el procedimiento demostró ser estable durante 105 generaciones en un estudio de estabilidad de la línea celular.
Etapas de la operación de recogida
El objetivo de las etapas de la operación de recogida es eliminar las células y los desechos celulares del material de recogida y concentrar la corriente en el procedimiento que contiene la proteína CTLA4-Ig para su posterior 15 procesamiento corriente abajo. Los sistemas de MF y UF se desinfectan antes de procesar el material de recogida. Los sistemas de MF y UF se enjuagan con una solución de ácido peracético. Los sistemas de UF y MF después se tratan con una solución de lejía y una solución de hidróxido sódico, respectivamente. Por último, los sistemas de MF y UF se enjuagan con WFI hasta que se consigue una conductividad de # 3 ∀S/cm en el retenido y el permeado. El caldo de cultivo celular del biorreactor de producción de 5000 l se transfiere a un recipiente de recogida. Se usa MF 20 de flujo tangencial con membranas de fluoruro de polivinilideno de 0,65 ∀m para la retirada de las células y los desechos celulares del material de recogida en el procedimiento que contiene la proteína CTLA4-Ig. El permeado de MF libre de células se recoge en un recipiente de permeado. El permeado de MF libre de células se concentra simultáneamente por UF de flujo tangencial usando membranas de polietersulfona de 30 kilodalton (kDa) de punto de corte de peso molecular nominal. El permeado de UF se usa como medio de diafiltración para la etapa del 25 procedimiento de MF. Se usa una solución de ácido fosfórico 0,1 N para el almacenamiento del sistema de MF. Se usa una solución de hidróxido sódico 0,1 N para el almacenamiento del sistema de UF. La temperatura, los caudales del permeado y el retenido y las presiones transmembrana se vigilan y controlan durante la operación de MF y UF. Los caudales se miden por caudalímetros en línea presentes en los patines de filtración. Se usan sensores para medir la presión y la temperatura. Se estableció el caudal del retenido de MF de 163 a 235 l/min y la presión
30 transmembrana de MF de # 26,19 kPa (3,8 psig). Estos valores aseguran la consistencia en el rendimiento de las etapas de la operación de recogida.
La etapa final en la operación de recogida es un ajuste del pH y la conductividad del material de recogida en el procedimiento aclarado y concentrado. El pH y la conductividad del material de recogida en el procedimiento concentrado se ajustan para la captura de la proteína CTLA4-Ig durante la primera etapa de procesamiento por
35 cromatografía corriente abajo. El pH se ajusta a 8,0 mediante la adición de una solución 2 M de Tris y la conductividad del permeado concentrado se reduce a 10 mS/cm mediante la adición de WFI. El material de recogida en el proceso concentrado y ajustado se filtra después a través de tres alojamientos de filtro paralelos y uno consecutivo que contienen filtros desechables de 0,2 ∀m y se transfiere a un tanque de compensación en el área de purificación corriente abajo.
40 Tabla 31: Composición del medio CD-CHO
Componente Concentración
Solubles ácidos I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Solubles ácidos II CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales I CD-CHO 25x 40,0 ml/l Sales II CD-CHO 25x 40,0 ml/l L-Glutamina 0,585 g/l Insulina r-humana (solución de 10 mg/ml) 0,1 ml/l Metotrexato (solución de 25 mg/ml) 0,0018 ml/l Bicarbonato sódico 2,22 g/l Agua para inyección La necesaria Solución de HCl 1 N La necesaria hasta ajustar el pH Solución de NaOH 10 N La necesaria hasta ajustar el pH
Tabla 32: Composición del medio de alimentación eRDF
Componente
Concentración
Medio eRDF-1
16,80 g/l
Dextrosa
30,9 g/l
D-Galactosa
12,6 g/l
L-Glutamina
4,10 g/l
Insulina r-humana (solución a 10 mg/ml)
1,00 ml/l
TC Yeastolate
5 g/l
Agua para inyección
La necesaria
Solución de HCl 1 N
La necesaria hasta ajustar el pH
Solución de NaOH 10 N
La necesaria hasta ajustar el pH
Tabla 33: Composición del medio CD-CHO modificado al 50%
Componente
Concentración
Solubles ácidos I CD-CHO 25x
20,0 ml/l
Solubles ácidos II CD-CHO 25x
20,0 ml/l
Sales I CD-CHO 25x
20,0 ml/l
Sales II CD-CHO 25x
20,0 ml/l
D-Galactosa
0,4 g/l
Insulina r-humana (solución de 10 mg/ml)
0,05 ml/l
Metotrexato (solución de 25 mg/ml)
0,0018 ml/l
Bicarbonato sódico
1,11 g/l
Agua para inyección
La necesaria
Solución de HCl 1 N
La necesaria hasta ajustar el pH
Solución de NaOH 10 N
La necesaria hasta ajustar el pH
Ejemplo 29 -Procedimiento de purificación de CTLA4-Ig
El material de pH y conductividad ajustados final de la etapa de la operación de recogida descrito en el Ejemplo 28 se procesa primero usando una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. La combinación de productos de esta primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico se procesa después usando una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba. El material que contiene CTLA4-Ig se trata entonces con Triton X-100 para inactivar los agentes virales adventicios potenciales. El material tratado con Triton X-100 se procesa usando una etapa de cromatografía de afinidad por proteína A recombinante. La combinación de productos de la etapa de cromatografía con proteína A recombinante se concentra y se diafiltra. Después se realiza una etapa de filtración viral para retirar los agentes virales adventicios potenciales. El filtrado se purifica adicionalmente usando una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Por último, la proteína CTLA4-Ig purificada se concentra y se somete a diafiltración en el tampón de sustancia de fármaco final.
CTLA4-Ig es una proteína de fusión modificada por ingeniería genética que consiste en el dominio de unión funcional del antígeno-4 de linfocito T humano citotóxico y el dominio Fc de la inmunoglobulina monoclonal humana de la clase IgG1. El dímero CTLA4-Ig está compuesto por dos cadenas polipeptídicas glucosiladas homólogas de aproximadamente 46 kDa que están cada una unida covalentemente a través de un único enlace disulfuro. Se muestra un diagrama de flujo del procedimiento para las etapas pasos corriente abajo del procedimiento de producción de CTLA4-Ig. CTLA4-lg se produce en biorreactores de producción de 5000 l usando una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Se realizan etapas cromatográficas y de filtración en el procedimiento de producción de CTLA4-Ig corriente abajo a temperatura ambiente. El material en el procedimiento se almacena a 2 a 8 ºC entre las etapas de procesamiento. El procedimiento corriente abajo se inicia con la recepción del material de recogida en el procedimiento de las etapas de la operación de recogida. Este material se procesa primero a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico usando resina Q SepharoseTM Extreme Load (QXL). La columna QXL funciona capturando la proteína CTLA4-Ig del material de recogida. La etapa de captura en columna QXL también consigue una reducción de volumen para su procesamiento adicional corriente abajo.
La combinación de productos de QXL se pasa a través de una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) que utiliza una resina Fenil Sepharose Fast Flow. Durante esta etapa, se une el material de alto peso
molecular (alto PM) de CLTA4-Ig y proteínas de las células huésped de ovario de hámster chino (CHOP) a la columna. La proteína dímero CLTA4-Ig no se une a la resina de CIH y pasa a través de la columna. Tras la etapa de CIH, se realiza una inactivación viral (VI) usando detergente Triton® X-100 para inactivar los agentes virales adventicios potenciales. La siguiente etapa utiliza una columna de afinidad de Sepharose Fast Flow de Proteína A 5 recombinante (rPA). En esta etapa de cromatografía, se reducen los niveles de CHOP y de proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1). La etapa de rPA se define como una etapa de aclaramiento viral. Tras la etapa de cromatografía de afinidad, la proteína CLTA4-Ig se concentra y se dializa usando membranas de ultrafiltración (UF) de 30 kDa y se procesa a través filtros PlanovaTM de 15 nm para retirar los agentes adventicios potenciales. Tras completarse la etapa de filtración viral (VF), se procesa la proteína CLTA4-Ig en una segunda columna de
10 intercambio aniónico usando resina Q Sepharose Fast Flow (QFF). La etapa de cromatografía en QFF reduce los niveles de proteína A recombinante residual y ADN. La etapa de QFF se define como una etapa de aclaramiento viral. Por último, se concentra la proteína CLTA4-Ig y se diafiltra usando una membrana de UF de 30 kDa frente a una solución de fosfato sódico 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5. La sustancia de fármaco de CLTA4-lg se filtra después a través de un filtro de 0,2 ∀m antes de la etapa de llenado final.
Las impurezas relacionadas con el procedimiento CHOP, MCP-1, proteína A recombinante residual, ADN y Triton X100 se reducen en etapas de procesamiento corriente abajo específicas del procedimiento de producción de CTLA4-Ig. Se establecen PP con límites de acción en el punto de control principal en el procedimiento para cada impureza. Se identifican 3 combinaciones de productos CHOP y MCP-1 como PP para el la etapa de cromatografía en rPA. La 20 combinación de productos del ligando proteína A recombinante residual, ADN y Triton X-100 se identifica como PP para la etapa de cromatografía en QFF. En base a la estructura conocida y a la retención cromatográfica de la insulina, las etapas de CIH, rPA y QFF deben proporcionar una eliminación significativa de la insulina en base a modos ortogonales de interacción. Además, la insulina, con un peso molecular de 5,8 kDa, debe aclararse mediante las tres etapas de concentración/diafiltración de 30 kDa en el procedimiento de recogida y corriente abajo. La etapa 25 de rPA proporciona una eliminación gt; 3,0 log10 de metotrexato (MTX). Además, el MTX, con un peso molecular de 0,455 kDa, debe aclararse mediante las tres etapas de concentración/diafiltración de 30 kDa en el procedimiento de recogida y corriente abajo. La insulina y el MTX se añaden a los medios de fermentación en cantidades fijas y se consumen como una función del metabolismo celular durante el procedimiento de fermentación de 5000 l antes del procesamiento corriente abajo. La insulina y el MTX se miden en múltiples puntos en el procedimiento corriente
abajo. Los niveles de insulina y MTX en cada uno de estos puntos han estado por debajo del nivel de cuantificación para los anteriores procesamientos completados.
Tampones: El objetivo de la preparación del tampón es producir tampones de procesamiento corriente abajo que cumplan los valores ejemplares, los límites de acción y los límites de alerta. Una calidad consistente del tampón es 5 esencial para asegurar un funcionamiento cromatográfico reproducible. Las etapas corriente abajo del procedimiento CD-CHO1 de CTLA4-Ig requieren 17 tampones y soluciones. Los tampones y las soluciones se preparan y se usan para etapas de procesamiento específicas dentro de un lote. Los tampones que tienen contacto con el material de CTLA4-Ig en el procedimiento se consideran tampones de procedimiento significativos. Los tampones en contacto con el producto incluyen tampones de equilibrado, lavado, elución y ajuste de la combinación de productos. Los 10 tampones y soluciones usados en etapas limpieza y desinfección y en el ensayo funcional de los detectores de luz ultravioleta (UV) en los patines de cromatografía tienen amplios intervalos de especificación. Debido a los amplios intervalos de especificación para estos tampones y soluciones y la ausencia de contacto con el producto, no se designan PP para estos tampones y soluciones. Se resumen los PP definidos para los diez tampones en contacto con el producto y los valores ejemplares correspondientes. El límite máximo de tiempo de mantenimiento para estos 15 tampones es de tres días, y se deriva de los estudios de mantenimiento de recipientes de tampón, y tiene el apoyo de los estudios de estabilidad de tampón. Los tampones en contacto con el producto también tienen PP designados con límites de alerta correspondientes. Se presentan los PP y límites de alerta correspondientes para estos tampones. Los tampones y soluciones que no están en contacto con el material CTLA4-Ig en el procedimiento tienen PP designado con límites de alerta o acción y se presentan. Los tampones y soluciones en contacto con el producto
20 no se ensayan para endotoxinas porque son soluciones de desinfección o tampones de limpieza de resinas de cromatografía o soluciones que van seguidas por las etapas de desinfección de columna.
Etapa de cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Extreme Load.
La cromatografía de intercambio aniónico se realiza usando resina QXL de GE Healthcare (antiguamente Amersham Biosciences). Se compacta una columna de 1,0 m de diámetro interno con resina QXL hasta una altura de 17 a 24 25 cm, lo que representa un volumen de 133 a 188 l. La columna se cualifica para su uso determinando la altura equivalente a una placa teórica (HETP) y la asimetría (As) de la columna compactada. Se requiere una HETP de 0,02 a 0,08 cm y una As de 0,8 a 1,2 para la cualificación de la columna QXL. La columna QXL funciona capturando la proteína CTLA4-Ig del material de recogida en el procedimiento. La etapa de captura de QXL también consigue una reducción del volumen para su procesamiento adicional corriente abajo. La operación de la columna QXL se 30 lleva realiza a temperatura ambiente. El caldo de cultivo celular aclarado se carga en una columna QXL equilibrada. La etapa de cromatografía en QXL se realiza usando un caudal máximo de 28 l/min. La presión de entrada de la columna se mantiene por debajo de 241,25 kPa (35 psig). La carga máxima de proteína abatacept para la columna QXL es 28 gramos de abatacept por litro de resina. La columna se prepara por equilibrado con tampón HEPES 25 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0. Después del equilibrado de la columna, el material de recogida se carga en la columna
35 con control continua de la absorción UV del efluente a 280 nm. Después de la aplicación de la carga, la columna se lavó con tampón HEPES 25 mM, NaCl 120 mM, pH 8,0. La proteína CTLA4-Ig se eluye de la columna con tampón HEPES 25 mM, NaCl 850 mM, pH 7,0. La tabla directamente a continuación muestra los parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en Q Sepharose Extreme Load.
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límites de acción Criterios de aceptación
Carga de proteínaa,b
N/Ac NA # 28 g/lresina
Carga biológica en la combinación de productos
N/A N/A lt;1 ufc/ml
Endotoxinas en la combinación de productos
N/A N/A # 5,0 UE/ml
El tiempo de mantenimiento de recogida asegura la consistencia del procedimiento con los límites de alerta
40 establecidos. Al parámetro de carga biológica de la combinación de productos de pre-filtración se le asignan límites provisionales de alerta y de acción de lt;10 ufc/ml y lt;100 ufc/ml, respectivamente. Los seis PP de QXL definidos por límites de acción son la altura de la columna, el caudal, la conductividad del tampón de lavado, la densidad óptica final del pico de elución (DO), el rendimiento de la etapa y de la carga biológica de la carga. El intervalo de altura de la columna se estableció para proporcionar un volumen suficiente de resina para capturar el producto del material de
45 recogida. Los límites de acción para este parámetro se establecieron a partir de los datos. El caudal es un factor importante para asegurar la consistencia y el funcionamiento de una etapa cromatográfica. Se define para la etapa de QXL como un PP con un límite de acción máximo. La conductividad del tampón de lavado se establece para retirar las impurezas débilmente unidas de la resina QXL. Estudios de intervalos a menor escala determinaron que este parámetro es un factor importante en el mantenimiento de la consistencia de la etapa de QXL. La DO final del
50 pico de elución se define para minimizar el nivel de material de alto PM de CTLA4-Ig en la combinación de productos. El material de alto PM de CTLA4-Ig eluye al final del pico de elución. Los límites de acción del rendimiento de la etapa aseguran la consistencia del procedimiento para la etapa de QXL. Se establecieron los límites de acción para los PP de caudal, DO final del pico de elución y rendimiento de la etapa. A la carga biológica de la carga se le asigna un límite de acción de lt;1 ufc/ml. Doce de los PP de QXL están definidos por límites de alerta expuestos.
Se controlan los valores de pH y conductividad del tampón en el procedimiento. Los tampones que no cumplen los valores ejemplares de pH y conductividad en el momento de la preparación se rechazan y se desecha el lote de 5 tampón. Para la etapa de QXL, se definen la conductividad y el pH del tampón de equilibrado, el pH del tampón de lavado, y la conductividad y el pH del tampón de elución. Presión de entrada de la columna garantiza la consistencia durante la etapa de cromatografía de unión y elución. La etapa de QXL se realiza a un límite máximo de presión de 241,25 kPa (35 psig). El límite de presión de 241,25 kPa (35 psig) se emplea para evitar la compresión de la resina QXL de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La conductividad de la combinación de productos es un PP 10 con un límite de alerta. A la conductividad de la combinación de productos se le asigna un límite de alerta para asegurar que el material de alto PM de CTLA4-Ig y CHOP en la combinación de productos de QXL se unen de forma eficaz a la columna de CIH posterior. Se establecieron límites de alerta de 58,5 a 69,1 mS/cm. Al título de la combinación de productos, a la proporción molar de ácido siálico (SA) a ácido N-acetilneuramínico (NANA), al material de alto PM de CTLA4-Ig y CHOP se les asignan límites de alerta para asegurar la consistencia del
15 procedimiento. Se establecieron límites de alerta del título y SA de la combinación de productos.
El material en el procedimiento de la etapa de operación de recogida se carga en la columna QXL. La columna se lava con un mínimo de 10 CV de tampón de lavado (HEPES 25 mM, NaCl 120 mM, pH 8,0), y se mide la absorbancia a 280 nm (A280) del efluente de la columna al final de la etapa de lavado. Después se eluye el abatacept de la columna con un tampón HEPES 25 mM, NaCl 850 mM, pH 7,0. El eluato se desvía hacia un recipiente de 20 recogida cuando la A280 aumenta hasta ∗ 0,02 unidades de absorbancia (UA) por encima del valor UA al final de la etapa de lavado. El eluato se recoge hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuye hasta un valor de # 1,0 UA. Se añade tampón de elución directamente al recipiente de recogida de eluato para conseguir un peso diana de 600 ! 10 kg del eluato. Se usa una velocidad de agitación de 30 ! 5 rpm en el recipiente de recogida de eluato para asegurar que los contenidos se mezclan bien. Después de un periodo de mezcla de ∗ 5 minutos, se
25 filtran los contenidos del recipiente de recogida a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m directamente en un recipiente de retención. Se añaden 50 kg adicionales de tampón de elución al recipiente de recogida y después se filtran a través del filtro de acetato de celulosa de 0,2 ∀m en el mismo recipiente de retención. Los contenidos del recipiente de mantenimiento se almacenan a 2 º a 8 ºC durante hasta 72 horas.
Tabla 5. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en Q Sepharose Extreme Load
Parámetroa
Punto establecido/valor diana Límite de alerta Límite de acción
Tiempo de mantenimiento de recogidab
N/A’’ # 10 horas # 24 horas
Carga biológica de la combinación de productos pre-filtraciónd
N/A lt; 10 ufc/ml lt; 100 ufc/ml
Altura de la columnac
N/A N/A 17 -24 cm
Caudal
15 -28 l/min N/A lt; 28 l/min
Conductividad del tampón de lavadof
N/A N/A 11,0 -15,0 mS/cm
DO final del pico de elución
1,00 UAg N/A 0,97 -1,03 UAb
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 69 -107%
Carga biológica de la cargai
N/A N/A lt; 1 ufc/ml
Conductividad del tampón de equilibrado
N/A 10,7 -12,7 mS/cm N/A
pH del tampón de equilibrado
N/A 7,8 -8,2 N/A
pH del tampón de lavado
N/A 7,7 -8,3 N/A
Conductividad del tampón de elución
N/A 69,8 -71,1 mS/cm N/A
pH del tampón de elución
N/A 6,7 -7,3 N/A
Tiempo de cargai
N/A # 6 horas N/A
Presión de entrada de la columna
N/A # 241,25 kPa (35 psig) N/A
Conductividad de la combinación de productosk
N/A 58,5 -69,1 mS/cm N/A
Título de la combinación de productos
N/A ≥ 2,0 g/l N/A
Etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose Fast Flow
El objetivo principal de la etapa de CIH es reducir el nivel de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig (por ejemplo, tetrámero) presentes en la combinación de productos de QXL. El tetrámero CTLA4-Ig no se une a la resina de CIH en las condiciones de carga utilizadas para la etapa de CIH.
La etapa de CIH se realiza usando una resina Fenil Sepharose Fast Flow de GE Healthcare. La columna de CIH se une a material de alto PM de CTLA4-Ig y CHOP, reduciendo de este modo sus concentraciones en la corriente de proteína CTLA4-Ig. La columna de CIH se prepara por equilibrado con tampón HEPES 25 mM, NaCl 850 mM, pH 7,0. La combinación de productos de CTLA4-Ig de la etapa de QXL se aplica a la columna equilibrada. Después de la aplicación de la carga, se aplica tampón HEPES 25 mM, NaCl 850 mM, pH 7,0 a la columna. Se recoge CTLA4-Ig de la columna en el flujo saliente y las fracciones siguiente de la columna. La columna de CIH se hace funcionar en múltiples ciclos para procesar un único lote de CTLA4-Ig en función de la masa total de CTLA4-Ig en la combinación de productos de QXL. La columna se limpia y desinfecta entre ciclos y lotes.
El PP de la carga biológica de la carga de CIH se define por límites de alerta y de acción. Al PP de la carga biológica de la carga de CIH se le asignan límites provisionales de alerta y la acción de lt;10 ufc/ml y lt;100 ufc/ml, respectivamente. Los cinco valores de CIH definidos para la columna son altura de la columna, caudal, DO final siguiente, rendimiento de la etapa y tiempo de mantenimiento de la carga. La altura de la columna se determinó para proporcionar volumen de resina suficiente para procesar la combinación de elución de la columna QXL en uno, dos o tres ciclos por lote. Los límites de acción para este parámetro se establecieron a partir de los datos. El caudal es un factor importante para asegurar la consistencia y el funcionamiento de una etapa cromatográfica. Se define para la etapa de CIH como un parámetro del procedimiento con un límite de acción máximo. La DO final siguiente se define para minimizar el nivel de material de alto PM de CTLA4-Ig en la combinación de productos. El material de alto PM de CTLA4-Ig eluye al final del pico de producto. Rendimiento de la etapa del procedimiento asegura la consistencia del procedimiento para la etapa de CIH. Se establecieron los límites de acción para los PP de caudal, DO final siguiente y rendimiento de la etapa. Los límites de acción para el tiempo de mantenimiento de la carga aseguran la consistencia del procedimiento. El límite de acción para el PP de tiempo de mantenimiento de la carga de # 5 días está apoyado por los estudios de tiempo de mantenimiento en recipiente de producto y el estudio de estabilidad bioquímica. Se definen nueve PP de CIH por límites de alerta presentados. Los parámetros de pH y conductividad del tampón en el procedimiento corriente abajo se identifican como PP con límites de alerta. Los tampones que no cumplen los valores ejemplares de pH y conductividad en el momento de la preparación se rechazan y se descarta el lote de tampón. Para la etapa de CIH, la conductividad y el pH del tampón de equilibrado/persecución se definen como PP con límites de alerta.
La presión de entrada de la columna asegura la consistencia durante la etapa de cromatografía. La etapa de CIH se realiza a un límite de presión máxima de 89,61 kPa (13 psig). El límite de presión de 89,61 kPa (13 psig) se emplea para evitar la compresión de la resina de CIH, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los límites de alerta del título de la combinación de productos y SA aseguran la consistencia del procedimiento y se establecieron en el informe PAR 12. Al ADN, CHOP y MCP-1 de la combinación del producto se les asignan límites de alerta en esta etapa para facilitar la cuantificación de su eliminación en la etapa de rPA posterior.
Tabla 7. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose Fast Flow
Parámetrosa
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Carga biológica de la cargab
N/Ac lt; 10 ufc/ml lt; 100 ufc/ml
Altura de la columnad
N/A N/A 18-22 cm
Caudal
7,6 -18 l/min N/A # 18 l/min
DO final siguiente
1,0 UAc N/A 0,8 -1,0 UAc
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 55 -79%
Tiempo de mantenimiento de la carga
N/A N/A # 5 días
Conductividad del tampón de equilibrado/persecución
N/A 71,5-75,5 mS/cm N/A
pH del tampón de equilibrado/persecución
N/A 6,7-7,3 N/A
Temperatura del tanque de carga
22 ºC 19 -25 ºC N/A
Presión de entrada de la columna
N/A # 89,61 kPa (13 psig) N/A
Título de la combinación de productos
N/A ∗ 1,0 g/l N/A
Tabla 7. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose Fast Flow (continuación)
Parámetrosa
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Proporción molar SA NANA de la combinación de productos
N/A 6,8-11,4 N/A
CHOP de la combinación de productosf
N/A # 6600 ng/ml N/A
ADN de la combinación de productosf
N/A # 45,000,000 pg/ml N/A
MCP-1 de la combinación de productoso
N/A # 5600 ng/ml N/A
La información se obtuvo de la Tabla 2 en el informe final PAR: Purificación.
Etapa de inactivación viral: La inactivación de agentes virales adventicios potenciales en la combinación de productos de la etapa de CIH se consigue mediante la adición de Triton X-100 al 20% hasta una concentración final del 0,5% (v/v). La solución tratada con detergente se mezcla y se mantiene a 22 ! 3 ºC durante una a cuatro horas antes de proceder a la siguiente etapa. Se presentan los cinco PP definidos para la etapa VI. El límite superior del parámetro de adición de Triton X-100 al 20% es 3,8%. Véase la Tabla directamente a continuación que muestra los parámetros del procedimiento para la etapa de inactivación viral.
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de acción Criterios de aceptación
Adición de Triton X-100 al 20%a,b
2,5% (% de volumen de la combinación de CIH) N/Ac 1,3 -3,8% (% de volumen de la combinación de CIH)
Duración de la mezclad
N/A N/Ac ∗ 20 minutos
Velocidad de agitaciónd
30 rpm 25-35 ∗ 20 rpm
Carga biológica de la combinación de productosb
N/A N/A lt; 1 ufc/ml
Endotoxinas en la combinación de productosb,c
N/A N/A # 5,0 UE/ml
Tabla 9. Parámetros del procedimiento para la etapa de inactivación viral
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Temperatura del tanque en la adición de Triton X100a,b
22 ºC 19 -25 ºC 2-25 ºC
Tiempo de mantenimiento de la cargac
N/Ad N/A # 5 días
Tiempo de incubación de Triton X-100a,b
N/A N/A 1 -4 horas
Rendimiento de la etapaa
N/A N/A 94 -108%
aLa información se obtuvo de la Tabla 3 en el informe final PAR: Purificación12
10 Etapa de afinidad en proteína A recombinante Sepharose Fast Flow.
La cromatografía de afinidad se realiza usando una resina de rPA inmovilizada de GE Healthcare. La etapa de cromatografía en rPA purifica adicionalmente la proteína CTLA4-Ig reduciendo los niveles de CHOP, MCP-1 y los agentes virales adventicios potenciales. La columna de cromatografía de afinidad se equilibra con tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, pH 8,0. Después del equilibrado de la columna, se aplica el material tratado con Triton X-100 de 15 la etapa VI a la columna de cromatografía de afinidad. La columna se lava primero con tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH 8,0, seguido de un segundo lavado con tampón Tris 25 mM, NaCl 250 mM, pH 8,0. La proteína CTLA4-Ig eluye de la columna con tampón glicina 100 mM, pH 3,5. El pH de la combinación de productos de la columna de afinidad se ajustó a 7,5 ! 0,2 con tampón HEPES 2 M, pH 8,0. Los cuatro PP definidos para la etapa de rPA se presentan en la Tabla 10. La etapa de cromatografía en rPA se identificó como una tapa de 20 aclaramiento viral, por tanto, la altura del lecho de columna se estableció como un nuevo PP con valores ejemplares de 21 a 25 cm. CHOP de la combinación de productos y MCP-1 de la combinación de productos se identificaron previamente como PP para la etapa de rPA. Estas impurezas se redefinieron como PP con límites de acción. Véase la tabla directamente a continuación que muestra los parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía
en proteína A recombinante Sepharose Fast Flow.
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de acción Criterios de aceptación
Altura de la columna
N/Ac N/A 21 -25 cm
Carga de proteína
N/A N/A # 25 g/lresina
Carga biológica de la combinación de productos
N/A N/A lt; 1 ufc/ml
Endotoxinas de la combinación de productos
N/A N/A # 0,50 UE/ml
Tres PP para la etapa de rPA se definen por límites tanto de alerta como de acción, presentados. El tiempo de mantenimiento de la carga asegura la consistencia del procedimiento con límites de alerta establecidos en el informe PAR. Los límites de acción para el tiempo de mantenimiento de la carga aseguran la consistencia del procedimiento. 5 El límite de acción para el PP de tiempo de mantenimiento de la carga de # 48 horas está apoyado por los estudios de tiempo de mantenimiento en recipiente de producto y el estudio de la estabilidad bioquímica. Estudios de intervalos identificaron el pH del tampón de elución como un factor significativo que afecta al nivel de material de alto PM de CTLA4-Ig en la combinación de productos de rPA. Se establecieron los límites de alerta para el pH del tampón de elución. El límite de acción para el pH del tampón de elución se estableció a partir del estudio de
10 intervalos de baja escala. Al PP de la carga biológica de la carga de rPA se le asignaron límites provisionales de alerta y acción de lt;10 ufc/ml y lt;100 ufc/ml respectivamente.
Los siete PP de rPA definidos por los límites de acción son la presión de entrada de la columna, el caudal, el rendimiento de la etapa, el pH inicial de la combinación de productos, el alto PM de la combinación de productos, el CHOP de la combinación de producto y el MCP-1 de la combinación de productos. El límite de presión de # 89,61 15 kPa (13 psig) se emplea para evitar la compresión de la resina de rPA de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El caudal es un factor importante para asegurar la consistencia y el funcionamiento de una etapa cromatográfica. Se define para la etapa de rPA como un PP con un límite de acción máximo. Los límites de acción para el rendimiento de la etapa y el pH inicial de la combinación de productos asegura la consistencia del procedimiento para la etapa de rPA. Se establecieron límites de acción para el caudal y el pH inicial de la 20 combinación de productos. La formación potencial de material de alto PM de CTLA4-Ig durante el pico de elución requiere la definición de un límite de acción de # 2,5% para este parámetro. El intervalo del límite de acción del 66 al 108% fue establecido usando la media ! 3 datos de desviación típica a partir de un único lote de resina rPA. Este intervalo es consistente con los rendimientos de la etapa observados en el estudio de vida útil de la resina. Las impurezas relacionadas con el procedimiento CHOP y MCP-1 se identificaron previamente como PP para la etapa 25 de rPA. En este informe, estas impurezas se redefinieron como PP con límites de acción. CHOP y MCP-1 de la combinación de productos se definen como CQA con valores ejemplares para asegurar el control de estas impurezas relacionadas con el procedimiento. Doce de los PP de rPA están definidos por límites de alerta presentados. Los parámetros de pH y conductividad del tampón en el procedimiento corriente abajo se identifican como PP con límites de alerta. Los tampones que no cumplen los valores ejemplares de pH y conductividad en el
30 momento de la preparación se rechazan y se descarta el lote de tampón. Para la etapa de rPA, la conductividad y el pH del tampón de equilibrado/lavado 2, la conductividad y el pH del tampón de lavado 1, y la conductividad del tampón de elución se definen como PP con límites de alerta.
Tabla 11. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en proteína A recombinante FastFlow
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Tiempo de mantenimiento de la carga
N/A # 43 horas # 48 horas
pH del tampón de elución
N/A 3,4 -3,7 3,2 -3,8
Carga biológica de la carga
N/A lt; 10 ufc/ml lt; 100 ufc/ml
Presión de entrada de la columna
N/A N/A # 89,61 kPa (13 psig)
Caudal
6,7 -9,6 l/min N/A # 9,6 l/min
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 66 -108%
pH inicial de la combinación de productos
N/A N/A ∗ 5,8
Alto PM de la combinación de productos
N/A N/A # 2,5%
CHOP de la combinación de productos
N/A N/A # 380 ng/ml
(Continuación)
Parámetro
Punto establecido/valor diana Límite de alerta Límite de acción
MCP-1 de la combinación de productos
N/A N/A # 38 ng/ml
Conductividad del tampón de equilibrado/lavado 2
N/A 23,0 -27,0 mS/cm N/A
pH del tampón de equilibrado/lavado 2
N/A 7,8 -8,2 N/A
Conductividad del tampón de lavado 1
N/A 22,2 -27,4 mS/cm N/A
pH del tampón de lavado 1
N/A 7,7 -8,3 N/A
Conductividad del tampón de elución
N/A 0,5 -1,5 mS/cm N/A
pH final de la combinación de productos
7,5 7,3 -7,7 N/A
Título de la combinación de productos
N/A ∗ 6,0 g/l N/A
Proporción molar SA NANA de la combinación de productos
N/A 8,0 -11,0 N/A
Volumen de la combinación de productos después del ajuste de pH
N/A 127 -294 kg N/A
Tabla 11. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en proteína A recombinante Fast Flow (continuación)
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
ADN de la combinación de productos
N/A # 47000 pg/ml N/A
Proteína A recombinante residual de la combinación de productos
N/A # 160 ng/ml N/A
Triton X-100 de la combinación de productos
N/A # 4,0 μg/ml N/A
5 Etapa de concentración/diafiltración y filtración viral. Después de la elución de la columna de rPA, la combinación de productos se concentra para conseguir un volumen diana dentro de un límite de concentración de CTLA4-Ig. El concentrado después se somete luego a diafiltración con tampón HEPES 25 mM, 100 mM NaCl, pH 8,0 usando un sistema de UF con membranas de 30 kDa de punto de corte de peso molecular nominal (NMWC). Después de la diafiltración, se usa un tren de filtro para retirar las partículas virales adventicias potenciales. El tren
10 de filtro consiste en un filtro de 0,2 ∀m, un filtro de 0,1 ∀m y filtros de membrana de 15 nm (Planova filtro 15N). Los filtros usados en la etapa de VF (0,2 pm, 0,1 ∀m, y 15 nm) son filtros de un solo uso. El límite superior del intervalo para la concentración post-UF de CTLA4-Ig y la presión diferencial del Planova se aumentaron en base al aclaramiento viral demostrado usando estas condiciones. Véase la siguiente tabla siguiente para mostrar los parámetros del procedimiento para la etapa de filtración viral.
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de acción Criterios de aceptación
Concentración de Abatacept post-UF
N/A N/A 6,0 -22 g/L
Proporción de volumen de carga a área superficial
# 36 kg/m2 N/A # 100 kg/m2
Presión diferencial de Planova
N/A N/A # 96,50 kPa (14 psi)
Carga biológica de la combinación de productos
N/A N/A lt; 1 ufc/ml
Endotoxinas de la combinación de productos
N/A N/A # 0,50 UE/ml
Tabla 13. Parámetros del procedimiento para la etapa de filtración viral
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Carga biológica de la combinación de productos de UF I
N/A lt; 10 ufc/ml lt; 100 ufc/ml
Volúmenes de diafiltración
N/A N/A ∗ 5,0
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 86 -114%
Tiempo de mantenimiento de la carga
N/A N/A # 5 días
Presión de suministro de UF
N/A # 241,25 kPa (35 psig) N/A
Flujo del retenido de UF
N/A 2,5 -7,5 l/min N/A
Conductividad del filtrado
N/A 10,7 -12,7 mS/cm N/A
Etapa de cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Fast Flow.
El objetivo de la etapa de cromatografía en QFF es reducir los niveles de proteína A residuales y proporcionar una reducción adicional del ADN célula huésped de la combinación de productos de la etapa de filtración viral. La etapa de la columna QFF también se usa para controlar la proporción molar de ácido siálico a moléculas o proteína CTLA4-Ig de la combinación de productos de la etapa de cromatografía en QFF y para proporcionar un control adicional de los niveles de material de alto PM. La etapa de cromatografía de intercambio aniónico en QFF también puede retirar la proteína A recombinante residual, el ADN de la célula huésped, Triton X-100 y los agentes virales adventicios potenciales.
La cromatografía de intercambio aniónico se realiza usando resina QFF de GE Healthcare. La columna de QFF se equilibra con tampón HEPES 25 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0. Después del equilibrado de la columna, se aplica el filtrado de Planova a la columna de QFF. La columna se lava primero con tampón HEPES 25 mM, NaCl 120 mM, pH 8,0 seguido de un segundo lavado con tampón HEPES 25 mM, NaCl 130 mM, pH 8,0. La proteína CTLA4-Ig se eluye de la columna con tampón HEPES 25 mM, NaCl 200 mM, pH 8,0.
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de acción Criterios de aceptación
Altura de la columna
N/A N/A 28 -35cm
Carga de proteína
N/A N/A # 25 g/lresina
Carga biológica de la combinación de productos
N/A N/A lt; 1 ufc/ml
Endotoxinas de la combinación de productos
N/A N/A # 0,50 UE/ml
El valor de la carga biológica en la carga de QFF es lt;10 ufc/ml o lt; 100 ufc/ml, respectivamente. Los doce PP de QFF definidos por límites de acción son el caudal, conductividad del tampón de lavado 2, la conductividad del tampón de elución, el tiempo de mantenimiento de la carga, el rendimiento de la etapa, y los niveles de proteína A residual, ADN, Triton X-100, SA, alto PM, CHOP y MCP-1 en el combinación de productos de QFF. El caudal es un factor a tener en cuenta para asegurar la consistencia y funcionamiento de una etapa cromatográfica. Se define para la etapa de QFF como un parámetro del procedimiento con un límite de acción máximo establecido en el informe PAR. Los valores de conductividad de la tampones de lavado 2 y de elución son PP con límites de acción, debido a que son importantes en la determinación de rendimiento de la etapa y la calidad del producto. Los límites de actuación para estos parámetros se determinaron durante estudios de intervalos a baja escala de QFF. Los límites de acción para el tiempo de mantenimiento de la carga aseguran la consistencia del procedimiento. El límite de acción para el PP del tiempo de mantenimiento de la carga de # 5 días está apoyado por estudios de tiempo de mantenimiento en recipiente de producto y un estudio de estabilidad bioquímica. El rendimiento de la etapa asegura la consistencia del procedimiento para la etapa QFF. Los parámetros de calidad, SA, alto PM, CHOP y MCP-1 en la combinación de productos deben controlarse estrechamente en la etapa cromatográfica final. Se establecieron los límites de acción para el rendimiento de la etapa, y el nivel de SA, CHOP y MCP-1 en la combinación de productos de QFF. Las impurezas relacionadas con el procedimiento proteína A residual, ADN y Triton X-100 se identificaron previamente como PP para la etapa de QFF. Estas impurezas se redefinieron como PP con límites de acción. La proteína A residual, el ADN y el Triton X-100 se definen como CQA con valores ejemplares para asegurar el control de estas impurezas relacionadas con el procedimiento. En este ejemplo, se revisó el límite de acción para alto PM de la combinación de productos de # 2,5 a # 2,0%.
Los parámetros de pH y conductividad del tampón en el procedimiento corriente abajo se identifican como PP con límites de alerta. Los tampones que no cumplen los valores ejemplares de pH y conductividad en el momento de la preparación se rechazan y se descarta el lote de tampón. Para la etapa de QFF la conductividad y el pH del tampón de equilibrado, la conductividad y el pH del tampón de lavado 1, el pH tampón de lavado 2 y el pH del tampón de elución se definen como PP con límites de alerta. Se establecieron estos límites. La presión de entrada de la
5 columna asegura la consistencia durante la etapa de cromatografía de unión y elución. La etapa de QFF se realiza a un límite de presión máxima de 241,25 kPa (35 psig) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A los parámetros de volumen de tampón de lavado 1, volumen de tampón de lavado 2, título de la combinación de productos y volumen de la combinación de productos se les asignan límites de alerta 12 para asegurar la consistencia del procedimiento.
10 Tabla 15. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en Q Sepharose Fast Flow
Parámetro
Punto establecido/valordiana Límite de alerta Límite de acción
Carga biológica de la carga
N/A lt; 10 ufc/ml lt; 100 ufc/ml
Caudal
4,8 -8,7 l/min N/A # 8,7 l/min
Conductividad del tampón de lavado 2
N/A N/A 12,8 -15,2 mS/cm
Conductividad del tampón de elución
N/A N/A 18,5 -20,9 mS/cm
Tiempo de mantenimiento de la carga
N/A N/A # 5 días
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 65 -104%
Proteína A recombinante residual en la combinación de productos
N/A N/A # 9,5 ng/ml
ADN en la combinación de productos
N/A N/A # 20 pg/ml
(Triton X-100 en la combinación de productos
N/A N/A # 4,0 ∀g/ml
Proporción molar SA NANA de la combinación de productos
N/A N/A 8,0 -11,9
Alto PM de la combinación de productos
N/A N/A # 2,0%
CHOP de la combinación de productos
N/A N/A # 95 ng/ml
MCP-1 de la combinación de productos
N/A N/A # 9,5 ng/ml
Conductividad del tampón de equilibrado
N/A 10,5 -12,9 mS/cm N/A
pH del tampón de equilibrado
N/A 7,7 -8,3 N/A
Conductividad del tampón de lavado 1
N/A 12,4 -14,4 mS/cm N/A
Tabla 15. Parámetros del procedimiento para la etapa de cromatografía en Q Sepharose Fast Flow(continuación)
Parámetro
Punto establecido/valor diana Límite de alerta Límite de acción
pH del tampón de lavado 1
N/A 7,7 -8,3 N/A
pH del tampón de lavado 2
N/A 7,7 -8,3 N/A
pH del tampón de elución
N/A 7,7 -8,3 N/A
Presión de entrada de la columna
N/A # 241,25 kPa (35 psig) N/A
Volumen del tampón de lavado 1
N/A 5,0 -5,3 CV N/A
Volumen del tampón de lavado 2
N/A 5,0 -5,4 CV N/A
Título de la combinación de productos
N/A ∗ 0,65 g/L N/A
Volumen de la combinación de productos
N/A # 800 kg N/A
Etapas de concentración/diafiltración y llenado. La combinación de productos de la etapa de cromatografía de
15 intercambio aniónico en QFF se concentró y se sometió a diafiltración con tampón fosfato sódico 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5 usando un sistema de UF con membranas NMWC de 30 kDa. El concentrado diafiltrado se filtra a través de un filtro de 0,2 ∀m en recipientes estériles y se almacena a 2 a 8 ºC. La sustancia de fármaco puede congelarse a -70 ºC y se almacena a -40 ºC si es necesario. Se presenta el único PP definido para la etapa de concentración/diafiltración y llenado. Véase la tabla directamente a continuación que muestra los parámetros del
20 procedimiento para las etapas de concentración/diafiltración y llenado de la sustancia de fármaco.
Parámetros
Punto establecido/diana Límite de acción Criterios de aceptación
Concentración final
50 g/l 48 -52 g/l 45 -55 g/l
Al PP de carga biológica de la combinación de productos de UF II se le asignan límites provisionales de alerta y acción de lt; 10 ufc/ml y lt; 50 ufc/ml, respectivamente. Los seis PP definidos por los límites de acción para la etapa de concentración/diafiltración y llenado son los volúmenes de diafiltración, la conductividad y pH del filtrado, el rendimiento de la etapa, el tiempo de mantenimiento de la carga y el rendimiento del procedimiento como se presenta. Se estableció el límite inferior de volúmenes de diafiltración para asegurar el completo intercambio de tampón de la proteína CTLA4-Ig al tampón de sustancia de fármaco final, antes de la etapa de llenado. La conductividad del filtrado y el pH del filtrado aseguran adicionalmente una formulación de sustancia de fármaco consistente. El rendimiento de la etapa asegura la consistencia del procedimiento para la etapa de concentración/diafiltración y llenado. Se establecieron los límites de acción para los volúmenes de diafiltración, conductividad y pH del filtrado, y el rendimiento de la etapa. Los límites de acción para el tiempo de mantenimiento de la carga aseguran la consistencia del procedimiento. El tiempo de mantenimiento de la carga de UF II de # 5 días está apoyado por los estudios de tiempo de mantenimiento en recipiente de producto y el estudio de estabilidad bioquímica. Se recomendó un límite de acción del rendimiento del procedimiento del 20 al 62%. Dos PP están definidos por límites de alerta para asegurar la consistencia del procedimiento para la etapa, como se presenta.
Tabla 17. Parámetros del procedimiento para las etapas de concentración/diafiltración y llenado de lasustancia de fármaco
Parámetros
Punto establecido Límite de alerta Límite de acción
Carga biológica de la combinación de productos de UF II
N/Ac lt; 10 ufc/ml lt; 50 ufc/ml
Volúmenes de diafiltración
N/A N/A gt; 5,0
Conductividad del filtrado
N/A N/A 8,3 -10,3 mS/cm
pH del filtrado
N/A N/A 7,3 -7,7
Rendimiento de la etapa
N/A N/A 73 -110%
Tiempo de mantenimiento de la carga
N/A N/A # 5 días
Rendimiento del procedimiento
N/A N/A 20 -62%
Presión de suministro de UF
N/A # 241,25 kPa (35 psig) N/A
Flujo del retenido de UF
N/A 2,5 -7,5 l/min N/A
Ejemplo 30: Etapa de llenado final de sustancia de fármaco
Después de completar la etapa de concentración y diafiltración II de CTLA4-Ig, la sustancia de fármaco de CTLA4-Ig se llena desde la bolsa de bioprocesos de 300 l en frascos pre-esterilizados PC Biotainer de 2 l y 10 l en un entorno de clase 100.
El exterior de cada frasco se desinfecta con una solución de isopropanol al 70%. Se retira el precinto de alrededor del tapón de cada frasco y se tara el frasco antes del llenado. Se registra un cálculo en el registro de lotes para asegurar que el peso de llenado está entre 500 gramos a 1950 gramos para frascos de 2 l y entre 7500 gramos a 10200 gramos para frascos de 10 l. La sustancia de fármaco se dispensa usando una bomba peristáltica en los frascos Biotainer a través de filtro de un solo uso de 0,45/0,2 ∀m y la campana de llenado. Los frascos se tapan y se aprietan los tapones a un ajuste de par de torsión especificado. El tapón de cada frasco llenado se sella con cinta adhesiva y se rubrica y fecha la cinta. Cada frasco se etiqueta con la información de identificación, así como la fecha de llenado, el número secuencial del frasco llenado dentro del lote y las iniciales del operario.
Durante el procedimiento de llenado, se realiza un control microbiano del aire y la superficie y recuentos de partículas. Se obtienen muestras de sustancia de fármaco durante la operación de llenado. Se obtiene una muestra antes del llenado del primer frasco para el ensayo de endotoxinas. Se obtienen muestras adicionales para enfados de endotoxinas en el medio y al final del procedimiento de llenado. Durante el procedimiento de llenado, se obtiene una muestra para el ensayo de liberación de la sustancia de fármaco.
Ejemplo 31: Estudios de inmunogenicidad
CTLA4-Ig es una proteína de fusión soluble que consiste en el dominio extracelular del antígeno 4 asociado a linfocito humano T citotóxico humano (CTLA-4) unido a la parte Fc modificada (bisagra, dominios CH2 y CH3) de inmunoglobulina humana (Ig) G1. Es el primero de una nueva clase de agentes aprobados para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) que modula selectivamente la señal co-estimuladora CD80/CD86:CD28 empleada para la activación completa de linfocitos T. En la AR, se postula que un antígeno desconocido se presenta a través del complejo principal de histocompatibilidad y activa los linfocitos T autorreactivos en presencia de una señal coestimuladora. Posteriormente, los linfocitos T activados reclutan y activan las células inmunes corriente abajo, orquestando y perpetuando los procesos celulares que conducen a la inflamación y destrucción de las articulaciones (Choy y Panayi (2001) N Engl J Med, 344 (12):907-916).
5 Los agentes biológicos recombinantes terapéuticos, tales como CTLA4-Ig, pueden ser inmunogénicos y por lo tanto pueden tener el potencial de provocar una respuesta de anticuerpos. La inmunogenicidad contra agentes biológicos teóricamente puede afectar a la seguridad, la eficacia y la farmacocinética. El aclaramiento mediado por anticuerpos de una terapia biológica puede resultar en una reducción en los niveles de fármaco, provocando una eficacia disminuida. La respuesta de anticuerpos también puede evitar que el fármaco se una a su diana farmacológica, lo
10 que también disminuirá la eficacia. Esto puede llevar a la necesidad de aumento de la dosis con el tiempo -el llamado arrastre de dosis. Se ha informado de arrastre de dosis con el uso prolongado del anticuerpo anti-TNF, infliximab, en el tratamiento de la AR (Anderson (2005) Semin Arthritis Rheum, 34 (5 Supl. 1): 19-22) y esto se ha señalado recientemente como un resultado de los anticuerpos anti-infliximab que conducen a una reducción de la eficacia clínica en algunos pacientes (Haraoui y col., (2006) J Rheumatol, 33 (1): 31-36).
15 Aquí, se examinó la formación de anticuerpos anti-CTLA4-Ig y anti-CTLA-4, y su potencial efecto sobre la eficacia y la seguridad del tratamiento con CTLA4-Ig. Dado que CTLA4-Ig probablemente inhibe una respuesta inmune contra sí mismo, en base a su actividad como modulador selectivo de la co-estimulación y las respuestas observadas en modelos no clínicos, también se examinó el efecto de la pérdida de 1-2 dosis o la interrupción de la terapia a nivel de inmunogenicidad. Finalmente, se ensayaron muestras seropositivas para la actividad de anticuerpos neutralizantes.
20 Materiales y procedimientos
Estudios evaluados
Para determinar si CTLA4-Ig induce una respuesta inmunogénica en pacientes con AR, se evaluó la respuesta de anticuerpos a través de múltiples ensayos clínicos en fase II y III, comprendiendo seis periodos de estudio DB y cuatro OL en 2.237 pacientes con AR, lo que incluía pacientes que tenían una respuesta inadecuada a metotrexato
25 (MTX) o a terapia anti-TNF. Un estudio (fase IIa) también evaluó CTLA4-Ig para el tratamiento de la AR como monoterapia (Tabla 40). Las muestras generalmente se evaluaron pre-estudio, durante todo el tratamiento, y 56 y/u 85 días después de la última dosis para permitir tiempo para el aclarado de CTLA4-Ig.
Tabla 40. Resumen de los estudios incluidos en esta evaluación
Nº de pacientesasignadosaleatoriamente y tratados con CTLA4-Ig
Total
Fase Nº de estudio
Diseño del estudio Terapia anti-reumática antecedente Paciente en el grupocomparador 10 mg/kgo dosis fija Otras dosis (mg/kg)
Ensayo en pacientes con AR con una respuesta inadecuada a MTX
Fase II IM101 100
Aleatorizado, de rango de dosis, controlado con placebo, ensayo DB en pacientes con AR activa estando en tratamiento con MTX Días 1-180: MTX (10-30 mg/sem.) Día 181-360: Ajuste permitido (+ 1 terapia para AR no biológica diferente) 119 115 105 (2,0) 339
Fase III IM101 102
Aleatorizado, controlado con placebo, DB en pacientes con AR activa estando en tratamiento con MTX Días 1-169: MTX (10-30 mg/sem.) Días 170-365: Ajuste permitido (+ 1 terapia para AR no biológica diferente) 219 433 0 652
Ensayos en pacientes con AR con una respuesta inadecuada a agentes bloqueantes de TNF
(Continuación) 5
Nº de pacientesasignadosaleatoriamente ytratados con CTLA4-Ig
Total
Fase Nº de estudio
Diseño del estudio Terapia anti-reumática antecedente Paciente en el grupocomparador 10 mg/kgo dosis fija Otras dosis (mg/kg)
Fase III IM101 029
Aleatorizado, controlado con placebo, ensayo DB en pacientes con AR activa en tratamiento previo con DMARD que han fracasado en terapia con agentes bloqueantes de TNF debido a la ausencia de eficacia Días 1-169: Cualquier terapia para AR no biológica o anakinra 133 258 0 391
Estudio se seguridad en AR
Fase III IM101 031
Aleatorizado, controlado con placebo, estudio de seguridad DB en pacientes con AR (con o sin comorbilidades preexistentes) en tratamiento previo con DMARD y/o agentes biológicos Días 1-85: Dosis estables: ± terapia no biológica para AR ± terapia biológica para AR Días 86-365: Ajuste permitido: ± terapia no biológica para AR ± terapia biológica para AR 482 959 0 1441
Otros estudios de apoyo
Fase II IM101 101
Aleatorizado, controlado con placebo, ensayo DB en pacientes con AR activa estando en tratamiento con ETAN Días 1-180: ETAN (25 mg 2x/sem.) Días 181-360: Ajuste permitido (± ETAN, + 1 DMARD no biológico) 36 0 85 (2,0) 121
Fase IIa IM103 002
Aleatorizado, de rango de dosis, controlado con placebo, ensayo DB en pacientes de con AR que han fracasado con al menos 1 DMARD o ETAN; 85 días: seguimiento hasta el día 169 Ninguno 32 33 26 (0,5) 32 (2,0) 122
Ensayos de PK en pacientes sanos en programa de AR
Fase II IM101 017
OL, no controlado, una dosis. Estudio de PK en pacientes sanos Ninguno 0 30 0 30
Extensiones OL en AR
Fase II IM101 100
OL, ensayo no controlado; 84, 68, y 67 pacientes de DB previo grupos de 10 mg/kg, 2 mg/kg, y placebo, respectivamente Día 361+: MTX ! 1 terapia no biológica para AR 0 219* 0 219
Extensiones OL en AR
Fase II IM101 101
OL, ensayo no controlado; 58 y 22 pacientes de DB previo grupos de 2 mg/kg y placebo, respectivamente Día 361 + : ! ETAN ! 1 terapia no biológica para AR 0 80* 0 80
35 (Continuación)
Nº de pacientesasignadosaleatoriamente ytratados con CTLA4-Ig
Total
Fase Nº de estudio
Diseño del estudio Terapia anti-reumática antecedente Paciente en el grupocomparador 10 mg/kgo dosis fija Otras dosis (mg/kg)
Fase III IM101 029
OL, ensayo no controlado; 218 y 99 pacientes de DB previo grupos de 10 mg/kg, y placebo, respectivamente Días 170 +: Cualquier terapia para AR no biológica o anakinra 0 317* 0 317
Fase III IM1011 02 OL
OL, ensayo no controlado; 378 y 161 pacientes de DB previo grupos de 10 mg/kg y placebo, respectivamente Día 360 + MTX (10-30 mg/sem.) + 1 terapia no biológica para AR 0 539* 0 539
AR = artritis reumatoide; MTX = metotrexato; DB = doble ciego; TNF = Factor de necrosis tumoral; DMARD = medicamento antirreumático modificador de la enfermedad; ETAN = etanercept; OL = abierto; PK = farmacocinético * Los sujetos en los períodos no controlados OL son un subconjunto de los que completaron los periodos de estudios controlados con placebo DB
Se examinaron la incidencia y el tipo de acontecimientos adversos (AA) pre-infusión pre-especificados, los AA globales y los acontecimientos adversos graves (AAG) y los abandonos en pacientes que desarrollaron una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA4-Ig o CTLA-4. También se examinó el efecto de la inmunogenicidad sobre la eficacia evaluando las respuestas del American College of Rheumatology (ACR) 20 y del cuestionario de evaluación de salud en pacientes con una respuesta de anticuerpos positiva.
Ensayos de inmunogenicidad
Formatos de ensayo básicos: Debido a la alta reactividad cruzada pre-existente dirigida contra la parte Fc de CTLA4-Ig en suero humano, particularmente en poblaciones con AR, se usaron dos ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) de formato directo para evaluar la respuesta de anticuerpos. El ensayo anti-CTLA4-Ig midió la respuesta de anticuerpos a todas las partes de la molécula, pero tenía una sensibilidad más baja. El ensayo anti-CTLA-4 midió la respuesta de anticuerpos contra la parte CTLA-4 solamente, retirando la región Ig y confiriendo de este modo una mayor sensibilidad. Ambos ensayos se usaron en un formato de título de punto final (EPT) (Ensayo A) o un formato de selección (Ensayo B).
Formato de ensayo A: Procedimientos de ensayo de inmunogenicidad clínica en fase II doble ciego
El ensayo anti-CTLA4-Ig y el ensayo anti-CTLA-4 usados durante los ensayos de AR en fase II se mencionaron colectivamente como Ensayo A. En el ensayo A, se adsorbió CTLA4-Ig o CTLA-4 sobre placas de microtitulación de 96 pocillos que después se incubaron con suero de ensayo (diluciones seriadas de factor 3 empezando en 1:10). Los anticuerpos unidos se detectaron usando un cóctel de anticuerpos anti-humano conjugados con fosfatasa alcalina (Southern Biotech, Birmingham, EEUU) y se visualizaron usando un sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP). Dado que no se dispone de anticuerpos anti-CTLA4-Ig humanos o suero de control positivo, estos ensayos se validaron con antisueros específicos para CTLA4-Ig generados en un mono cynomolgus. Los resultados de cada ensayo se expresaron como valores de EPT. Un paciente se consideró que se había seroconvertido cuando su EPT aumentaba en dos o más diluciones en serie (∗ 9 veces) con respecto al EPT predosis (día 1) del individuo.
Formato de ensayo B: Procedimientos de ensayo de inmunogenicidad clínica en fase III y fase II de etiqueta abierta
Para los ensayos en fase III, y períodos OL en fase II de 2 años, se modificaron los ensayos tanto anti-CTLA4-Ig como anti-CTLA-4 para reducir el fondo no específico, mejorar la sensibilidad, y el procedimiento para determinar la positividad se cambió y se mencionó colectivamente como Ensayo B. Estos ensayos también se validaron usando anticuerpos específicos para CTLA4-Ig purificadas a partir de anti-suero de mono cynomolgus. Para cada ELISA, se incubaron placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con CTLA4-Ig (0,25 ∀g/ml) o CTLA-4 (0,5 ∀g/ml), con suero de ensayo diluido 1:400 durante 2 horas a 22 ! 5 ºC (anti-CTLA4-Ig) o diluido 1:25 durante 2 horas a 32-40 ºC (anti-CTLA-4). Después de la incubación principal, se detectaron anticuerpos unidos con un cóctel de anticuerpos anti-humano conjugados con peroxidasa de rábano rusticano (HRP), seguido por el sustrato tetrametilbenzidina.
Los resultados para el ensayo anti-CTLA4-Ig se expresaron como una proporción post-/pre-calculada dividiendo los valores de DO de la muestra post-dosis por el valor de DO de la muestra pre-dosis correspondiente analizados en la misma placa. La positividad se basó en los valores de corte establecidos usando muestras de pacientes con AR tratados con placebo. Si el valor de la proporción era menor que el punto de corte, la muestra se considera negativa y se presentaba como un valor de título lt;400. Cualquier valor que excedía este punto de corte se consideraba condicionalmente positivo.
Los resultados para el ensayo anti-CTLA-4 se expresaron como un valor de 'proporción 1' calculado dividiendo la DO media de muestras de suero de los pacientes por la DO media del control negativo en la misma placa. La positividad se basó en valores establecidos usando suero combinado de pacientes con AR tratados con placebo como control negativo. Si el valor era menor que el punto de corte especificado, la muestra se consideraba negativa y se presentaba como un valor de título de lt;25. Cualquier valor que excedía este punto de corte se consideraba condicionalmente positivo.
Análisis de confirmación
Las muestras condicionalmente positivas identificadas en cada ensayo (anti-CTLA4-Ig y anti-CTLA-4) y en cada formato de ensayo (ensayos A y B), se evaluaron en un ensayo de inmunoagotamiento para determinar la especificidad de la respuesta. Se pre-incubaron muestras positivas anti-CTLA4-Ig con aproximadamente 40 ∀g/ml de CTLA4-Ig (la parte CTLA-4 de la molécula), otra proteína de fusión con Ig no relacionada (CD40Ig) o una proteína no relacionada (ovoalbúmina) para identificar la región de la molécula contra la cual puede estar dirigida la reactividad anti-CTLA4-Ig (CTLA-4, Ig o región de unión). Las muestras positivas anti-CTLA-4 se pre-incubaron de manera similar con CTLA4-Ig, la parte CTLA-4 u ovoalbúmina para confirmar la especificidad de la reactividad anti-CTLA-4. Después de la pre-incubación, todas las muestras se volvieron a analizar en el mismo formato de ensayo original descrito anteriormente. Las muestras donde la pre-incubación dio como resultado una reducción ∗ 30% en la DO de la muestra pre-incubada en comparación con la muestra no tratada, se consideraron positivos confirmados. Si se confirmaba, las muestras se titulaban para identificar la dilución de suero que daba como resultado un valor de proporción igual al punto de corte del ensayo particular y este valor se presentó como EPT.
Evaluaciones actividad neutralizante del anticuerpo
Se realizó un bioensayo para evaluar la capacidad de las muestras de pacientes con anticuerpos específicos de fármaco contra CTLA-4 para inhibir o neutralizar la actividad de CTLA4-Ig (inhibir la unión a CD80/86), evitando su unión a CD80/86 en la superficie de linfocitos T. Se co-estimularon transfectantes estables de linfocitos T Jurkat que expresaban un gen de luciferasa bajo el control de promotor de interleuquina (IL)-2 con los linfocitos B Daudi en presencia de anticuerpo anti-CD3. Esta co-estimulación, mediada a través de la interacción entre CD28 en el linfocito T Jurkat y CD80/86 en el linfocito B Daudi en combinación con anticuerpo anti-CD3, activa el promotor de IL2, lo que conduce a un aumento de la transcripción del gen de la luciferasa y, por lo tanto, a un aumento de expresión de la proteína luciferasa. La señal luminiscente se mide usando un sistema de ensayo de luciferasa. Dado que CTLA4-Ig bloquea la interacción CD80/86:CD28, la adición de CTLA4-Ig a la mezcla celular bloquea esta activación del promotor de IL-2 y disminuye la luminiscencia, mientras que la preincubación con un anticuerpo neutralizante restauraría las interacciones de co-estimulación y provocarían un aumento en la luminiscencia.
Se evaluó la actividad del anticuerpo neutralizante de CTLA4-Ig de determinando la respuesta de CTLA4-Ig a concentraciones de 0,1, 0,25 ó 0,5 ∀g/ml en el bioensayo en presencia de suero seropositivo post-dosis 1:25 y comparándola estadísticamente con la respuesta en presencia de su correspondiente muestra del Día 1. Se usó un anticuerpo monoclonal murino anti-CTLA-4 humano (11D4) con actividad neutralizante de CTLA4-Ig en el bioensayo como control positivo en cada procedimiento analítico. Debido a las limitaciones inherentes en el procedimiento de ensayo de bioensayo, pudieron evaluarse solamente las muestras post-dosis con niveles existentes de CTLA4-Ig # 1 ∀g/ml, dado que los niveles más altos de fármaco interferían con la respuesta neutralizante, y una dilución de muestra adicional disminuiría la sensibilidad del ensayo.
Evaluación farmacocinética
Se realizó un análisis farmacocinético de población (POPPK) en los datos de muestras séricas de pacientes de los períodos DB de los ensayos en fase II/III donde se confirmó una respuesta inmune positiva. El modelo POPPK validado se aplicó a datos individuales de concentración de suero de los pacientes y se obtuvieron estimaciones bayesiana máximas a posteriori de valores de los parámetros farmacocinéticos individuales. Los valores de distribución del aclaramiento, las estimaciones de volumen, el área bajo la curva (AUC) en estado estacionario y la concentración mínima del fármaco en el cuerpo después de que la dosificación (Cmin) para estos pacientes se compararon con la distribución de estos valores en un conjunto mayor de datos de pacientes de los mismos ensayos que no desarrollaron una respuesta inmune.
Resultados
Incidencia de respuestas anti-CTLA4-Ig y anti-CTLA-4
Un total de 2.237 pacientes tenía muestras suero tanto pre-como post-medida inicial y fueron elegibles para la evaluación. De éstos, 62 (2,8%) pacientes tenían evidencias de una respuesta anti-CTLA4-Ig o anti-CTLA-4, tal
como se determina usando el ensayo A o B (FIG. 39). Ninguno de los pacientes demostró una respuesta inmune contra los dominios tanto Fc como CTLA-4 de CTLA4-Ig. Tres pacientes tuvieron una respuesta contra la región de unión. Cuando se usó el ensayo B más sensible, se detectó una respuesta de anticuerpos contra CTLA4-Ig en 60 de
1.990 pacientes (3,0%) (FIG. 39).
De los pacientes evaluados en los estudios en fase III (n = 1.764), 203 interrumpieron la terapia con CTLA4-Ig durante los períodos DB u OL, o no entraron en el posterior período de estudio OL y tenían sueros recogidos 56 y/o 85 días después de la interrupción de la terapia. De los 203 pacientes, 15 (7,4%) tenían una respuesta inmunopositiva contra CTLA4-Ig (toda la molécula, n = 5, 2,5%) o CTLA-4 (n = 10, 4,9%, Tabla 42). De los restantes
1.561 pacientes con AR que completaron el período DB de la Fase III y continuaron en tratamiento OL, 40 (2,6%) tuvieron una respuesta positiva de anticuerpos durante los períodos DB u OL: 33 (2,1%) contra CTLA4-Ig y 7 (0,4%) contra CTLA-4. De forma interesante, en el estudio en Fase IIa de CTLA4-Ig como monoterapia, ningún paciente se seroconvirtió para CTLA4-Ig o la parte CTLA-4 de la molécula; sin embargo, se empleó el formato de ensayo A menos sensible.
Un total de 191 pacientes tenían un período de más de 30 días sin CTLA4-Ig entre su participación en los períodos DB y OL. De éstos, 3 (1,6%) pacientes tuvieron una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA4-Ig y 1 (0,5%) paciente tuvo una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA-4 durante el período OL (Tabla 41). También se analizaron los sueros de 587 pacientes con AR que perdieron 1-2 dosis de la medicación del estudio y volvieron a empezar en cualquier momento durante el estudio. De estos pacientes, 15 (2,6%) demostraron una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA4-Ig y siete (1,2%) tuvieron una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA-4 (Tabla 41).
Tabla 41. Número (%) de pacientes seropositivos con uso interrumpido de CTLA4-Ig
Descripción de la interrupción en el uso programado deCTLA4-Ig
Número de respuestas positivas/número evaluadas (%)
Anti-CTLA4-Ig
Anti-CTLA-4 Total
1-2 dosis perdidas y reinicio del uso de CTLA4-Ig
15/587 (2,6) 7/587 (1,2) 22/587 (3,7)
gt;30 días sin CTLA4-Ig entre los periodos DB y OL
3/191 (1,6%) 1/191 (0,5%) 4/191 (2,1%)
Interrupción durante la fase III del DB (sueros recogidos 56 y 85 días después de la dosificación)
5/203 (2,5) 10/203 (4,9) 15/203 (7,4)
CTLA-4 = Antígeno-4 asociado a linfocito T citotóxico; DB = doble ciego; OL = etiqueta abierta
Efecto de metotrexato concomitante sobre la inmunogenicidad
Un total de 2.451 pacientes recibieron MTX concomitante y 493 pacientes no lo hicieron. En general, el porcentaje de pacientes con una respuesta de anticuerpos positiva contra CTLA4-Ig fue generalmente similar si recibían MTX concomitante o no (2,3% frente al 1,4%) (Tabla 42).
Tabla 42. Número de pacientes (%) con respuestas anti-CTLA4-Ig o anti-CTLA-4 con o sin recibir tratamiento concomitante con metotrexato.
Tratamiento concomitante
Número de pacientes positivos/número evaluados (%)
Anti-CTLA4-Ig
Anti-CTLA-4 Total
Metotrexato
40/2451 (1,6) 16/2451 (0,6) 56/2451 (2,3)
No metotrexato
2/493 (0,4) 5/493 (1,0) 7/493 (1,4)
CTLA-4 = Antígeno-4 asociado a linfocito T citotóxico
Impacto de la inmunogenicidad en la seguridad y la eficacia de CTLA4-Ig
Se evaluaron las tasas de AA, AAG, AA peri-infusión para todos los pacientes positivos y no se observó ninguna relación entre la inmunogenicidad y la seguridad. Asimismo, no se observó ninguna relación entre la inmunogenicidad y la eficacia; sin embargo, la interpretación de estos datos está restringida debido al número limitado de pacientes con seroconversión.
Actividad neutralizante de anticuerpos anti-CTLA-4
Veinticuatro muestras de suero de 20 pacientes se confirmaron positivas para reactividad anti-CTLA-4 en el ensayo de exploración de anticuerpos anti-CTLA-4. De éstas, 14 muestras (recogidas de 13 pacientes) cumplieron los valores ejemplares (# 1 ∀g/ml de CTLA4-Ig) para la evaluación en el bioensayo de neutralización. De estas 13 muestras, 1 fue positiva en el día 56 y 10 fueron positivas en el día 85 post-dosis. Nueve de las 14 muestras (tomadas de 8 pacientes) mostraron actividad de anticuerpo neutralizante. Con la excepción de la septicemia en un paciente, no hubo AA médicamente significativos informado en estos pacientes en, o cerca de, el momento de seroconversión que se consideran relacionados o posiblemente relacionados con la terapia en estos ocho pacientes. No se recogieron datos de eficacia durante el período posterior a la interrupción del estudio (56 y 85 días después de la interrupción), un período en que el número predominante de muestras era adecuado para la evaluación de anticuerpos neutralizantes. Por tanto, no fue posible evaluar los efectos de los anticuerpos neutralizantes sobre la eficacia.
Evaluación farmacocinética
Se estimaron parámetros farmacocinéticos para 31 de los 32 pacientes que tuvieron una respuesta positiva de anticuerpos durante el período BD de los ensayos en fase II/III. Las muestras de suero para el análisis PK no se recogieron necesariamente en el día en que se documentó una respuesta inmune positiva. El modelado PK de población de los datos de los pacientes de los períodos de estudio DB sugirió que los parámetros PK predichos en los 31 pacientes inmunopositivos eran comparables a los de una población más grande de pacientes (n = 386) sin una respuesta inmune positiva. Las concentraciones séricas valle en el día de estudio durante el período de DB en que se documentó seroconversión, variaron de 1,16-24,21 ∀g/ml, con la mayoría de las concentraciones séricas entre 5-20 ∀g/ml. La seroconversión no parece afectar a los niveles valle en suero. La distribución de aclaramiento y el volumen del compartimiento central por el estado de inmunogenicidad se muestra en la FIG. 40.
Ensayo de electroquimioluminiscencia MSD. En un esfuerzo por mejorar la sensibilidad del ensayo de inmunogenicidad de unión y la capacidad de detectar anticuerpos en presencia de fármaco (tolerancia de fármaco), se está desarrollando una nueva generación de ensayos de inmunogenicidad para controlar los anticuerpos antifármaco contra CTLA4-Ig empleando la tecnología de Descubrimiento en Meso-Escala (MSD). Esta nueva tecnología usa un marcador que emite luz tras estimulación electroquímica iniciado en la superficie del electrodo de una microplaca. El formato MSD ha demostrado tener una sensibilidad mejorada y una mejor capacidad para detectar anticuerpos en presencia de fármaco en comparación con el formato ELISA. Esta tecnología en fase de solución permite que el fármaco marcado compita de manera más eficaz con el fármaco en el suero, y tiene un mayor intervalo dinámico, relación señal a ruido, y capacidad de superficie aumentada sobre el formato ELISA. A diferencia de los ELISA actuales que usan la parte CTLA4 de la molécula o la molécula completa como reactivo de captura, el nuevo ensayo es un ensayo de puente que emplea una molécula CTLA4-Ig biotinilada y marcada con rutenio que se incuba con las muestras de los pacientes antes de añadirse a una placa MSD recubierta con avidina. La señal de electroquimioluminiscencia emitida por la marca de rutenio se mide usando un instrumento MSD. Las muestras positivas, basadas en el punto de corte del ensayo validado, se evaluarán adicionalmente por inmunoagotamiento con CTLA4-Ig, CTLA4-T o CD40Ig en el ensayo MSD para confirmar la positividad y demostrar contra qué parte de la molécula CTLA4-Ig está dirigida la respuesta inmunogénica, y se define el título de punto final.
Ejemplo 32: Parámetros farmacocinéticos en monos
A seis monos cynomolgus hembra por grupo se les administró una dosis intravenosa única de 10 mg/kg de CTLA4-Ig producido a partir del procedimiento DC-CHO1. Un grupo de control de seis monos hembra recibió solución salina (1 ml/kg). Para evaluar la bioactividad de CTLA4-Ig, todos los monos se inmunizaron por vía intramuscular con 10 mg/animal del antígeno dependiente de linfocito T hemocianina de lapa californiana (KLH) en 30 minutos antes de la dosificación.
Se observó a los animales durante 6 semanas después del tratamiento. Se obtuvieron muestras de sangre antes de la dosis; a los 3 y 30 min.; a las 1, 2, 4, 8, 24, y 48 h; y en los días 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, y 43 después de la dosis para determinar y comparar los perfiles farmacocinéticos. En el informe farmacocinético, estos días de estudio corresponden a los días 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, y 42, respectivamente. Las muestras de suero se analizaron para CTLA4-Ig por un procedimiento ELISA. Se recogió una muestra de sangre comparable de animales de control en los mismos días y, cuando procedía, se usó para evaluar la respuesta de anticuerpos anti-KLH. La evaluación de la formación de anticuerpos específicos para CTLA4-Ig se realizó en suero obtenido de animales tratados con CTLA4-Ig antes del estudio y semanalmente a partir de entonces. Se determinó la formación de anticuerpos específicos para KLH en muestras de suero obtenidas de todos los animales antes de la inmunización y después de eso aproximadamente cada semana durante 4 semanas después de la inmunización. Valores ejemplares adicionales para la evaluación incluyeron la supervivencia, los signos clínicos, las exploraciones física (incluyendo evaluaciones neurológicas, de la frecuencia respiratoria y de auscultación), el peso corporal, la temperatura corporal y el consumo de alimentos.
Se realizaron evaluaciones clínico-patológicas antes del estudio y en el día 45. Todos los animales se devolvieron a la reserva después de completarse el estudio.
Tabla 43. Parámetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig producido a partir de un procedimiento descrito en el presente documento.
Procedimiento BMS-188667 Cmax (∀g/ml) ABC(0-T)b T-HALF (H) CTL (ml/h/kg) Vss (ml/kg) (número de lote) (∀g.h/ml)
CD-CHO1 330,22 (53,52) 19916,75 (3123,04) 121,47 (19,57) 0,50 (0,08) 73,40 (12,59)
(lote nº MQJ611)
Aparecieron respuestas de anticuerpos específicos de fármaco en el día 29 o después del mismo en tres de los seis monos tratados con el material del procedimiento CD-CHO1 (Tabla 43; FIG. 41). Aumentos (20%) del nitrógeno de 5 urea en sangre (BUN) y disminuciones (14%) en el potasio sérico mínimos en monos tratados con el material del procedimiento DC-CHO1 no fueron fisiológica o toxicológicamente significativos ya que los valores estaban sólo ligeramente fuera de los intervalos históricos de control y, para BUN, no había un aumento concomitante en la creatinina sérica presente. No se observaron otros cambios en los parámetros de patología clínica. Se observó una supresión marcada de la respuesta de anticuerpos KLH (∗ 94% de la respuesta de control del pico) en monos a los
10 que se había administrado el material del procedimiento DC-CHO1. La inmunogenicidad estuvo notablemente retardada hasta que los niveles séricos de CTLA4-Ig cayeron por debajo de los niveles de inmunosupresores de aproximadamente 1 ∀g/ml en el día 29 o después del mismo.
Patología clínica. Se recogieron muestras de sangre de la vena femoral de animales en ayunas antes de la dosificación (día -13) y después de la última exanguinación farmacocinética (día 45). Se realizaron análisis de orina 15 en orina recogida durante un período de 18 horas antes del estudio (día -13) y después de la última toma de muestras farmacocinéticas (día 45). Se determinaron los siguientes parámetros analíticos: Hematología: hemoglobina, hematocrito, recuento de eritrocitos, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración media de hemoglobina corpuscular, recuento de reticulocitos, recuentos de leucocitos totales y diferenciales, recuento de plaquetas, y evaluación de la morfología celular en frotis de sangre periférica. 20 Coagulación: se determinaron el tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, y fibrinógeno en plasma. Química en suero: se determinaron el nitrógeno de urea, creatinina, glucosa, colesterol total, proteína total, albúmina, globulinas, proporción albúmina/globulina, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fosfatasa alcalina, bilirrubina total, triglicéridos, gamma glutamil transferasa, sodio, potasio, calcio, cloruro, y fósforo. Análisis de orina: de determinaron la producción, gravedad específica, pH, color y aspecto, y las determinaciones
25 cualitativas de glucosa, proteína, cetonas, bilirrubina, sangre oculta y urobilinógeno. Los sedimentos urinarios se examinaron microscópicamente.
Respuesta de anticuerpos específicos. Aparecieron respuestas de anticuerpos específicos de fármaco de magnitud comparable en tres de los seis monos tratados con el material del procedimiento DC-CHO1, en el día 29 o después del mismo. Como se esperaba, la inmunogenicidad con el procedimiento estuvo marcadamente retardada hasta que
30 los niveles séricos de CTLA4-Ig cayeron por debajo de los niveles inmunosupresores de aproximadamente 1 ∀g/ml en el día 29 o después del mismo. Las respuestas medias de anticuerpos específicos para CTLA4-Ig para los monos a los que se dio material del procedimiento CD-CHO1 se volvieron positivas el día 36 y alcanzaron su punto máximo en el día 43 (el último punto temporal evaluado). Los títulos de los anticuerpos del pico en monos individuales a los que se dio los materiales del procedimiento CD-CHO1 variaron de 23 a 10.448.
35 Ejemplo 33: Disgregación en columna
El procedimiento de disgregación a través de una resina de cromatografía de afinidad es útil y tiene aplicabilidad para todas las moléculas recombinantes basadas en IgG-Fc producidas en células de mamífero. Pueden usarse caótropos para alterar la proteína o el material de alto peso molecular. Esta disgregación puede hacerse en columna para cualquiera de dichas proteínas. Este ejemplo proporciona un procedimiento para realizar el procedimiento de
40 disgregación de un material ejemplar: es decir, CTLA4-Ig.
El material de alto peso molecular (alto PM) de CTLA4-Ig producida en el biorreactor de producción puede convertirse parcialmente en el dímero CTLA4-Ig funcional mediante el uso de agentes caotrópicos en solución (modo discontinuo) o junto con la etapa de cromatografía de afinidad (modo en columna). Este procedimiento se conoce como quot;disgregaciónquot;. En base a los estudios de caracterización analítica de material CTLA4-Ig disgregado, el
45 material disgregado parece ser bioquímicamente comparable con el material de control no sometido al procedimiento de disgregación.
En un procedimiento de fermentación que produce moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento, de aproximadamente el 20 al 25% de la proteína CTLA4-Ig resultante puede estar en forma de material de alto PM (es decir, agregado). La recuperación de una parte de este material como dímero funcional, por lo tanto, tiene el
50 potencial de una mejora global del rendimiento del procedimiento de gt; 10%.
Procedimiento de disgregación en modo discontinuo
La disgregación se ha demostrado en modo discontinuo (en solución) por tratamiento con concentraciones moderadas de agentes caotrópicos tales como clorhidrato de guanidina o urea seguido por dilución rápida en un tampón de replegamiento de bajo contenido salino para ayudar a la molécula a obtener su conformación nativa.
El CTLA4-Ig purificado usando Proteína A (resina usada MabSelect) se ajustó a una concentración final de ~ 4 -5
5 mg/ml a usar como material de partida para estos experimentos discontinuos. Después, esto se poso en contacto en una proporción volumétrica 1:1 con tampones caotrópicos concentrados 2x para conseguir una concentración final de caótropo 1 -3 M (para clorhidrato de guanidina) y 2 -7 M (para urea). Fueron eficaces concentraciones de clorhidrato de guanidina gt; 2 M y concentraciones de urea gt; = 4 M para causar la disgregación del material de alto PM de CTLA4-Ig. La fase móvil usada para estos experimentos fue un sistema tamponado con fosfato a un intervalo
10 de pH de 6,5 a 7,0. La reacción de disgregación se interrumpió mediante dilución rápida (en una proporción volumétrica de 1:5) en un tampón de replegamiento consistente en Tris 50 mM, NaCl 25 mM, pH 8,5. En experimentos de disgregación discontinua, del 50 al 60% del material de alto PM se convierte en dímero CTLA4-Ig con un rendimiento de etapa gt; 95%. La disminución en el nivel de material de alto PM observado después de la etapa de disgregación se muestra en la FIG. 42.
15 Procedimiento de disgregación en columna
Para superar las limitaciones potenciales del tanque y de mezcla durante el aumento en escala del procedimiento de disgregación discontinuo, se evaluó un procedimiento que combinaba la etapa de captura con proteína A y la etapa de disgregación. Este procedimiento implicaba el uso de la solución caotrópica como tampón de elución para la etapa de proteína A seguido por la recogida de la combinación de elución en el tampón de replegamiento/dilución.
20 Se observó un rendimiento similar en la eficacia de disgregación usando procedimientos los discontinuos y en columna. El procedimiento de disgregación en columna tendría la ventaja distintiva de disminuir la cantidad de etapas de procesamiento. Los detalles experimentales para la etapa de Proteína A usando la etapa de disgregación en columna se resumen en la siguiente tabla. Resina usada: MabSelect (de GE Healthcare), altura del lecho de columna: 20-25 cm
Etapa
Tampón Volumen de tampón Tiempo de residencia(min)
Equilibrado
Fosfato 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 gt; 3CV A continuarse hasta que el pH y la conductividad del efluente están cercanos a los del tampón de equilibrado o hasta que ya no hay cambio en el pH y la conductividad con cada volumen progresivo de columna del tampón usado 5
Carga de columna
Fluido de cultivo celular recogido gt; 30 g / 1 de resina 5
Lavado
Fosfato 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 gt; 3CV A continuar hasta que la absorbancia haya vuelto a lt; 0,2 UA 5
Elución
Fosfato 25 mM, GdHCl 2,65 M, pH 6,5 (! 0,2) La recogida del pico se inicia cuando la absorbancia alcanza 0,2 UA por enzima de la línea basal La recogida del pico finaliza cuando la absorbancia vuelve a 0,2 UA por encima de la línea basal 10
Dilución del pico
Tris 50 mM, NaCl 25 mM, pH 8,5 El pico de elución tiene que recogerse inmediatamente en el tampón de dilución en una proporción volumétrica de 1:5. N/A
Limpieza de la columna
NaOH 0,1 N ~ 3 CV) 5
Almacenamiento de la columna
Etanol al 20% ~ 3CV 5
25 Viabilidad de la incorporación en el procedimiento aguas abajo Se realizó un tren de purificación de 3 columnas de muestra para generar material de procedimiento final con y sin uso de una etapa de desagregación de proteína A sobre la columna. Los rendimientos de la etapa cromatográfica
obtenidos de los dos trenes de purificación se proporcionan en la Tabla 44. Tabla 44. Rendimientos cromatográficos para el procedimiento de 3 columnas con y sin desagregación
Etapa de procedimiento
Rendimiento de la etapa (%)
Procedimiento de 3 columnas (control)
Procedimiento de 3 columnas con etapade desagregación sobre la columna
Proteína A
95 95
HIC
60 69
AEX
84 87
Rendimiento cromatográfico global
48 58
La incorporación de la etapa de desagregación en un procedimiento de 3 columnas de muestra produjo una mejora de aproximadamente el 10% en el rendimiento del procedimiento. Los conjuntos de productos de las secuencias de dos procedimientos se analizaron para evaluar la comparabilidad bioquímica del material de CTLA4-Ig resultante.
Los análisis de N-glucano por MALDI-TOF de los dos conjuntos de productos se muestran en la FIG. 43. Basándose en este análisis, el material parece comparable. Este resultado de MALDI-TOF se confirmó usando un procedimiento de ensayo de N-glucano basado en HPLC. Los análisis de HPLC demostraron una diferencia lt; 1,7% en el pico de ácido siálico biantenario entre el control y el material del procedimiento final desagregado.
También se realizó mapeo de péptidos trípticos en los dos conjuntos de productos para cuantificar el porcentaje de péptidos desamidados y oxidados presentes en el material purificado. Los resultados (resumidos en la Tabla 45) demostraron niveles de desamidación y oxidación comparables para las dos muestras.
Tabla 45. Resultados del mapeo de péptidos
Muestra
Sitio de desamidación de T26 (%de área) Sitio de oxidación de T6 (%de área)
Procedimiento de 3 columnas de control
0,76 0,35
Procedimiento de 3 columnas con etapa de desagregación
0,69 0,33
Material patrón (5 g/l)
0,94 0,37
Adicionalmente, los resultados del ensayo de unión a B7 fueron del 101% y 98% para el control y material desagregado sobre la columna, respectivamente.
Un procedimiento para desagregar moléculas recombinantes basadas en IgG-Fc, tales como aquellas producidas por células de mamíferos, que comprende la etapa de poner en contacto una composición que comprende tales moléculas en forma agregada con un agente caotrópico (tal como clorhidrato de guanidina o urea) en una cantidad y durante un tiempo suficiente para desagregar al menos una parte de tales moléculas agregadas, opcionalmente seguido de poner en contacto dicha porción de moléculas desagregadas con un agente de replegamiento y/o extinción (tal como por dilución rápida en un tampón de replegamiento de bajo contenido en sal para ayudar a tales moléculas a ganar conformación nativa). El contacto con el agente caotrópico puede llevarse a cabo, por ejemplo, en modo de lotes, semilotes o continuo, además de, por ejemplo, en disolución (tal como en modo de lotes), o conjuntamente con una etapa cromatográfica, tal como durante una etapa de cromatografía por afinidad (modo sobre columna).
Un procedimiento que combina una purificación sobre columna, tal como una etapa de captura de proteína A, con el procedimiento de desagregación anteriormente mencionado puede potenciar la eficiencia del procedimiento global. Las moléculas recombinantes basadas en IgG-Fc, tales como aquellas producidas por células de mamíferos, pueden desagregarse mediante un procedimiento que comprende la etapa de poner en contacto una composición que comprende tales moléculas en forma agregada con un agente caotrópico (tal como clorhidrato de guanidina o urea) en una cantidad y durante un tiempo suficiente para desagregar al menos una parte de dichas moléculas agregadas, en el que dicha puesta en contacto se produce sobre una columna de cromatografía, tal como en la que dicho agente caotrópico se emplea en disolución para la elución de dicha columna (tal como el tampón de elución para una columna de proteína A), opcionalmente seguido de poner en contacto dicha porción desagregada de moléculas con un agente de replegamiento y/o extinción tal como por dilución rápida en un tampón de replegamiento de bajo contenido en sal para ayudar a que la molécula gane la conformación nativa).
La composición que va a ponerse en contacto con tal agente caotrópico puede comprender moléculas recombinantes basadas en IgG-Fc en formas distintas de una forma agregada (tal como formas unicatenarias o dímeros), además de comprender dichas moléculas en forma agregada.
Las moléculas basadas en IgG-Fc son glucoproteínas, concretamente las moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento.
EJEMPLO 34: Farmacocinética
Un estudio de fase 2B, multicentro, aleatorizado, de doble ciego, controlado por placebo para evaluar la seguridad y eficacia clínica de dos dosis diferentes de CTLA4-Ig administrada intravenosamente a sujetos con artritis reumatoide activa mientras que reciben metrotrexato: En este estudio, los sujetos recibieron CTLA4-Ig a 2 dosis diferentes (2 y 10 mg/kg) o placebo en combinación con MTX. CTLA4-Ig se produjo según un procedimiento descrito en el presente documento, y se suministró en viales individuales que contenían 200 mg de CTLA4-Ig. CTLA4-Ig se administró IV a sujetos los días 1, 15 y 30, y cada 30 días después durante un año. La PK de múltiples dosis se derivó de los datos de concentración en suero frente al tiempo obtenidos durante el intervalo de dosificación entre los días 60 y 90 de sujetos que se enrolaron en un subestudio PK específico de sitio. Para los sujetos en el subestudio PK se recogieron muestras de sangre antes de la dosificación en el día 60, y para un perfil PK a partir del día 60 a 30 minutos (correspondiendo con el final de la infusión de CTLA4-Tg), 4 horas después del inicio de la infusión, y semanalmente después hasta el día 90. Se enroló un total de 90 sujetos para participar en el subestudio PK. Sin embargo, los perfiles PK completos entre el intervalo de dosificación del día 60 a 90 se obtuvieron de 29 sujetos (15 sujetos dosificados a 2 mg/kg; 14 sujetos dosificados a 10 mg/kg).
Un resumen de los parámetros PK se presenta en la Tabla 46. Los resultados del estudio mostraron que tanto Cmáx como ABC(TAU), en la que TAU = 30 días, aumentaron de un modo proporcional a la dosis. Para dosis nominales que aumentan en la relación de 1: 5, las medias geométricas de Cmáx aumentaron en la relación de 1: 5,2, mientras que la media geométrica para ABC (TAU) aumentó en la relación de 1: 5,0. Además, los valores t1/2, CLT y Vss parecieron ser independientes de la dosis. En estos sujetos con AR, los valores medios de t1/2, CLT y Vss fueron aproximadamente 13 días, ~ 0,2 ml/h/kg y -0,07 l/kg, respectivamente. El pequeño Vss indica que CTLA4-Ig está confinada principalmente en el volumen de fluido extracelular. Basándose en el esquema de dosificación de la dosificación a 2 y 4 semanas después de la primera infusión, entonces una vez al mes después, las condiciones en estado estacionario para CTLA4-Ig se alcanzaron por la tercera dosis mensual. Por tanto, como resultado del esquema de dosificación, las concentraciones en suero fueron superiores a las concentraciones mínimas en estado estacionario durante los 2 primeros meses de tratamiento. La comparación de los valores mínimos (Cmín) en los días 60, 90 y 180 indicó que CTLA4-Ig no parece acumularse tras la dosificación mensual. Los valores en estado estacionario de Cmín media para todos los sujetos que recibieron dosis IV mensuales de 2 y 10 mg/kg de CTLA4-Ig oscilaron entre 4,4 y 6,7 μg/ml y 22,0 y 28,7 μg/ml, respectivamente.

Tabla 46. Resumen de múltiples estudios PK en sujetos con artritis reumatoide
Objetivo del estudio
Diseño del estudio Nº sujetos Edad: (Media. Dosis de tratamiento Parámetros farmacocinéticos de Abatacept
(M/Fem)
intervalo) (mg/kg) Geometría media (% deCV) Media (DE)
Cmáx (μg/ml)
AUEC (TAU)(μg·h/ml) t1/2 (días) CLT (ml/h/kg) Vss (l/kg)
Evaluar la eficacia, seguridad, dosis PK múltiples y potencial inmunogénico de dosis intravenosamente administradas de abatacept
Estudio aleatorizado, de doble ciego, controlado por placebo, de múltiples dosis. Infusión IV de 30 minutos 29 (18/11) 54 (34-83) 20 (N = 15) 54,9 (29) 9573,5 (30) 13,5 (5,9) 0,23 (0,13) 0,07 (0,04)
10,0 (N = 14)
284,2 (23) 47624,2 (31) 13,1 (5,3) 0,22 (0,09) 0,07 (0,03)
En pacientes con AR, después de múltiples infusiones intravenosas, la farmacocinética de CTLA4-Ig mostró aumentos proporcionales de Cmáx y ABC con respecto al intervalo de dosis de 2 mg/kg a 10 mg/kg. A 10 mg/kg, la concentración en suero pareció alcanzar un estado estacionario en el día 60 con una concentración mínima media (intervalo) de 24 (1-66) mcg/ml. No se produjo acumulación sistémica de CTLA4-Ig tras el tratamiento repetido continuado con 10 mg/kg a intervalos mensuales en pacientes con AR.
Los análisis farmacocinéticos de la población en pacientes con AR revelaron que había una tendencia hacia mayor eliminación de CTLA4-Ig con peso corporal creciente. La edad y el seño (cuando se corrigieron para el peso corporal) no afectaron la eliminación. Metrotrexato concomitante (MTX), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides y agentes de bloqueo de TNF no influyeron en la eliminación de CTLA4-Ig.
EJEMPLO 35: Determinación de la proporción molar de manosa, fucosa y galactosa por EC
Se ha desarrollado un procedimiento de electroforesis capilar para el análisis cuantitativo del contenido de monosacárido neutro en LEA2 CTLA4A29IL104E-Ig. Los monosacáridos neutros, que incluyen manosa, fucosa y galactosa, son liberados de muestras de CTLA4A29IL104E-Ig por hidrólisis ácida a una condición de alta temperatura (ácido trifluoroacético 2 M, 6 horas a 95 ºC). Los monosacáridos neutros liberados se marcan entonces fluorescentemente con ácido aminopirenotrisulfónico (APTS), en presencia de ácido acético como catalizador, y NaBH3CN como reactivo reductor (APTS 67 mM, HAc 330 mM, NaBH3CN 83 mM, 3 horas a 55 ºC). Se añade xilosa a cada muestra y sirve de patrón interno. La relación del área pico de cada monosacárido neutro contra la del patrón interno se utiliza para la cuantificación.
Reactivos: Disolución de hidrólisis (ácido trifluoroacético 2 M (TFA)); disolución de derivatización I (ácido 8-amino1,3,6-trisulfónico 0,1 M, disolución acuosa de sal de trisodio (APTS)); disolución de derivatización II (NaBH3CN 0,25 M en ácido acético 1 M); tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 ± 5 mM, pH 9,25); disoluciones de aclarado capilar (NaOH 1 N; HCI 1 N; 80% de metanol); disoluciones madre patrón de monosacárido de manosa (Man), fucosa (Fuc), galactosa (Gal) y xilosa (Xil) a concentración de 10 mg/ml; disolución de trabajo de monosacárido I: la disolución de trabajo de patrón interno es una dilución de 100 veces la disolución madre de Xil; disolución de trabajo de monosacárido II: disoluciones de trabajo patrón de mezcla neutra, dilución de 100 veces de disoluciones madre de Man, Fuc y Gal.
Instrumentación: El sistema de EC es el sistema de EC Beckman P/ACE MDQ; detector: sistema de detección inducido por láser (LIF) de Beckman acoplado a P/ACE MDQ; capilar sin recubrir (d.i. 25 μm, d.e. 360 μm) de 27-31 cm de longitud total para acomodar P/ACE MDQ.
Condiciones de ejecución de la electroforesis capilar: Tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 mM, pH 9,25); temperatura del cartucho del capilar: 25 ºC; voltaje: 25-30 kV, modo positivo; condición de detector: detector LIF, excitación a 488 nm, emisión a 520 m; inyección de muestra: modo de inyección de presión, 20 s a 3,5 kPa (0,5 PSI); tiempo de ejecución: 10 min; almacenamiento de muestras: 10 ºC.
Hidrólisis: Se mezclaron 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 200 μl de TFA 2 M para preparar el blanco del sistema. Se mezclaron 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 10 μl de disolución patrón de mezcla neutra con 200 μl de TFA 2 M para preparar el patrón de monosacárido. Se mezclaron 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 10 μl de muestra (por ejemplo, CTLA4A29IL104E-Ig, aproximadamente 1 mg/ml) con 200 μl de TFA 2 M para preparar la muestra de prueba. Todos los tubos se removieron con vórtex durante 10 s, y se centrifugaron durante 10 s, seguido de incubación a 95 ºC durante 6 horas. Después de la etapa de hidrólisis, las muestras se dispusieron a -20 ºC durante 10 min para enfriarlas. Las muestras se centrifugaron durante 10 s y se evaporaron a sequedad en SpeedVac.
Derivatización: Las muestras se reconstituyeron con 10 μl de disolución de derivatización I. La muestra se mezcló brevemente, y se añadieron 5 μl de disolución de derivatización II. Las muestras se cargaron en una centrífuga precalentada y se incubaron durante 3 horas a 55 ºC mientras que se centrifugaban a 2000 rpm.
Inyección en EC: El volumen final de las muestras después de la derivatización se llevó a 100 μl mediante la adición de agua de calidad para HPLC, y 10 μl de muestras se transfirieron a un microvial de EC con 190 μl de agua de calidad para HPLC. Antes de las inyecciones de muestra, el cartucho de EC se aclaró ampliamente con agua de calidad para HPLC (tiempo de ejecución de 1-3 min), seguido de un aclarado equilibrante con tampón de electroforesis (tiempo de ejecución de 5 min). Tras el aclarado inicial, los patrones de monosacárido y las muestras para análisis se inyectaron en el cartucho de EC (tiempo de ejecución de 15 min). Tras la ejecución de la inyección de cada patrón o muestra de prueba, el cartucho de EC se aclaró y se equilibró con agua de calidad para HPLC y tampón de electroforesis (Tabla 51). El electroferograma de la idoneidad del sistema debe ser similar a la FIG. 45, en la que el pico 1 es manosa; el pico 2 es xilosa; el pico 3 es fucosa; y el pico 4 es galactosa.

Tabla 51. Procedimiento del instrumento
Tiempo
Evento Valor Duración Resumen Descripción
Aclarado -Presión
276,0 kPa 3,00 min seguir adelante Aclarado con agua
Aclarado -Presión
276,0 kPa 5,00 min seguir adelante Aclarado en tampón de electroforesis
Inyección -Presión
3,5 kPa 20,00 s control manual, seguir adelante Inyección
0,00 min
Separación -voltaje 30 kV 15,00 min rampa de 0,17 min, polaridad normal Separación
0,05 min
Corrección automática a cero
15,00 min
Parada Datos
15,00 min
Fin
IDONEIDAD DEL SISTEMA:
El electroferograma de la idoneidad del sistema debe ser similar al mostrado en la FIG. 45, en la que el pico 1 es manosa; el pico 2 es xilosa; el pico 3 es fucosa; y el pico 4 es galactosa.
5 Si se usan instrumentos de EC distintos del sistema MDQ de Beckman, la longitud del capilar puede ser diferente a la especificada en este procedimiento. Esto producirá variaciones en el tiempo de migración del analito, además de la intensidad del pico. Pero el patrón pico de los analitos de monosacárido debe permanecer el mismo.
La resolución entre dos picos vecinos para el primer patrón de idoneidad del sistema puede calcularse según la siguiente ecuación:
en la que
R: resolución t2, t1: tiempos de migración de los dos picos vecinos, respectivamente W1, W2: anchuras de los picos en la base de los dos picos vecinos, respectivamente
15 El valor de R debe ser ≥ 1,0. Si R lt; 1,0, aclarar el capilar usando las secuencias de lavado/aclarado. Si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de ejecución recientemente preparado o sustituir el capilar.
Para la última inyección de idoneidad del sistema, el último pico (galactosa) debe tener un factor de cola lt;1,4 usando la siguiente fórmula:
T = W0,05/2f
20 en la que:
T: factor de cola W0,05: anchura del pico al 5% de altura
f: anchura del frente del pico al máximo del pico
Si T ≥ 1,4, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón
25 antiguo con tampón de electroforesis recientemente preparado o sustituir el capilar. La relación del área del pico de galactosa y xilosa debe tener una DER de ≤10%. El tiempo de migración de galactosa necesita ser ≤15,0 minutos. El perfil del electroferograma debe ser equivalente a la FIG. 45.
El porcentaje de DER del patrón de monosacárido puede determinarse comparando las relaciones del área del pico de componentes de patrón interno y patrón de monosacárido dividiendo el área del pico para cada componente de
30 monosacárido entre el área del pico del patrón interno para cada inyección de patrón de monosacárido. El porcentaje de DER puede calcularse para manosa, fucosa y galactosa. La DER debe ser ≤10%.
Determinación de las relaciones molares de monosacáridos neutros con respecto a proteína
Las relaciones del área del pico de monosacáridos neutros (por ejemplo, Man, Gal y Fuc) con respecto al patrón interno de xilosa pueden calcularse según las fórmulas proporcionadas más adelante con el fin de determinar las 35 relaciones molares de cada monosacárido neutro con respecto a proteína. Por ejemplo, la relación del área del pico
es igual a un área del pico de monosacárido (Gal, Fuc o Man) dividida entre el área del pico de xilosa, siendo la desviación estándar relativa (DER) para la relación del área del pico igual o inferior al 10%. Las siguientes ecuaciones pueden usarse para calcular lo siguiente:
Para la proporción molar de manosa/proteína:
A ? A ? V ? C ? MW
man xil0 man0 man0 LEA29Y
R 5man Axil ? Aman0 ? Vp ? Cp ? 180,2
en la que
Rman: proporción molar de manosa frente a proteína
Aman: área del pico (μV·s) de manosa en la muestra
Axil: área del pico (μV·s) de xilosa en la muestra
Axy10: área del pico (μV·s) promedio de xilosa en patrón de monosacárido
Aman0: área del pico (μV·s) promedio de manosa en patrón de monosacárido
Vman0: volumen de manosa contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la
hidrólisis (en μl)
Cman0: concentración de manosa contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada
para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp: volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl)
Cp: concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml)
MWLEA129Y: peso molecular de LEA29Y (o CTLA4A29IL104E-Ig) (91.232 Da)
MW de manosa: 180,2 dalton.
Para la proporción molar de fucosa/proteína:
A ? A ? V ? C ? MW
fuc xil0 fuc0 fuc0 LEA29Y
Rfuc 5 A ? A ? V ? C ? 164,2
xil fuc0p p
en la que
Rfc: proporción molar de fucosa frente a proteína
Afuc: área del pico (μV·s) de fucosa en la muestra
Axil: área del pico (μV·s) de xilosa en la muestra
Axil0: área del pico (μV·s) promedio de xilosa en patrón de monosacárido
Afuc0: área del pico promedio (μV·s) de fucosa en patrón de monosacárido
Vfuc0: volumen de fucosa contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la
hidrólisis (en μl)
Cfuc0: concentración de fucosa contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada
para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp: volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl)
Cp: concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml)
MWLEA29Y: peso molecular de LEA29Y (o CTLA4A29IL104E-Ig) (91.232 Da)
MW de fucosa: 164,2 dalton.
Para la proporción molar de galactosa/proteína:
A ? A ? V ? C ? MW
gal xil0 gal0 gal0 LEA29Y
R 5
gal A ? A ? V ? C ? 180,2
galgal0p p
en la que
Rgal: proporción molar de galactosa frente a proteína
Agal: área del pico (μV·s) de galactosa en la muestra
Axil: área del pico (μV·s) de xilosa en la muestra
Axil0: área del pico (μV·s) promedio de xilosa en patrón de monosacárido
Agal0: área del pico (μV·s) promedio de galactosa en patrón de monosacárido
Vgal0: volumen de galactosa contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para
la hidrólisis (en μl)
Cgal0: concentración de galactosa contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada
para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp: volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp: concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWLEA29Y: peso molecular de LEA29Y (o CTLA4A29IL104E-Ig) (91.232 Da) MW galactosa: 180,2 dalton.
Tabla 52: Proporción molar media de monosacárido con respecto a proteína CTLA4A29IL104E-Ig.
MONOSACÁRIDO
INTERVALO
Manosa
11-23
Fucosa
4,2-7,5
Galactosa
9,2-18
EJEMPLO 36: Determinación de la proporción molar de GalNAc y GlcNAc por EC
Se ha desarrollado un procedimiento de electroforesis capilar para el análisis cuantitativo de contenido de aminomonosacárido en CTLA4A29IL104E-Ig, una glucoproteína con 6 sitios de glucosilación ligados en N y al menos 1 sitio de glucosilación ligado en O. Los aminomonosacáridos, que incluyen N-acetilgalactosamina (GalNAc) y Nacetilglucosamina (GlcNAc), son liberados de la muestra de CTLA4A29IL104E-Ig por hidrólisis ácida a una condición de alta temperatura (HCl 4 N, 6 horas a 95 ºC). Los aminomonosacáridos liberados pasan por una etapa de reacetilación incubando con anhídrido acético sobre hielo durante media hora. Entonces se marcan fluorescentemente con ácido aminopirenotrisulfónico (APTS), en presencia de ácido acético como catalizador, y NaBH3CN como reactivo reductor (APTS 67 mM, HAc 330 mM, NaBH3CN 83 mM, 3 horas a 55 ºC). Se añade N-acetilmanosamina a cada muestra y sirve de patrón interno. La relación del área del pico de cada aminomonosacárido contra la del patrón interno se utiliza para cuantificación.
Reactivos: Disolución de hidrólisis (HCl 4 N); disolución de derivatización I (ácido 8-amino-1,3,6-trisulfónico 0,1 M, disolución acuosa de sal de trisodio (APTS)); disolución de derivatización II (NaBH3CN 0,25 M en ácido acético 1 M); tampón de re-acetilación (bicarbonato sódico 25 mM, pH 9,5); tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 ± 5 mM, pH 9,25); disoluciones de aclarado capilar (NaOH 1 N; HCl 1 N; 80% de metanol); disoluciones madre patrón de monosacárido de GalNAc, GlcNAc y ManNAc a concentración de 10 mg/ml; disolución de trabajo de monosacárido I: la disolución de trabajo de patrón interno es dilución de 100 veces de disolución madre de ManNAc; disolución de trabajo de monosacárido II: disoluciones de trabajo de patrón de mezcla de amino, dilución de 100 veces de disoluciones madre de GalNAc y GlcNAc.
Instrumentación: El sistema de EC es el sistema de EC P/ACE MDQ de Beckman; detector: sistema de detección inducido por láser (LIF) de Beckman acoplado con P/ACE MDQ.
Condiciones de ejecución de la electroforesis capilar: Tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 mM, pH 9,25); temperatura del cartucho del capilar: 25 ºC; voltaje: 25-30 kV, modo positivo; condición del detector: detector LIF, excitación a 488 nm, emisión a 520 nm; inyección de muestra: modo de inyección de la presión, 20 s a 0,5 PSI; tiempo de ejecución: 10 min; almacenamiento de muestras: 10 ºC.
Hidrólisis: 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 200 μl de HCl 4 N se mezclaron para preparar el blanco del sistema. 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 10 μl de disolución patrón de mezcla de amino se mezclaron con 200 μl de HCl 4 N para preparar el patrón de monosacárido. 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 10 μl de muestra (por ejemplo, muestra de CTLA4A29IL104E-Ig, etc.; aproximadamente 1 mg/ml) se mezclaron con 200 μl de HCl 4 N para preparar la muestra de prueba. Todos los tubos se removieron con vórtex durante 10 s y se centrifugaron durante 10 s, seguido de incubación a 95 ºC durante 6 horas. Después de la etapa de hidrólisis, las muestras se dispusieron a -20 ºC durante 10 min para enfriarse. Las muestras se centrifugaron durante 10 s y se evaporaron a sequedad en SpeedVac.
Re-acetilación: Muestras hidrolizadas y secadas se reconstituyeron con 20 μl de tampón de re-acetilación y 4 μl de anhídrido acético, seguido de mezcla y con incubación sobre hielo (30 min). Las muestras se centrifugaron durante 10 s y se evaporaron a sequedad en SpeedVac. La muestra se reconstituyó cada una con 100 μl de agua de calidad para HPLC y se evaporaron a sequedad con SpeedVac.
Derivatización: Las muestras reconstituidas (10 μl de disolución de derivatización I HPLC) se proveyeron con 5 μl de disolución de derivatización II. Después de la mezcla, las muestras se cargaron en una centrífuga precalentada y se incubaron durante 3 horas a 55 ºC mientras que se centrifugaban a 2000 rpm.
Inyección de EC: El volumen final de las muestras después de la derivatización se llevó a 100 μl mediante la adición de agua de calidad para HPLC, y muestras de 10 μl se transfirieron a un microvial de EC con 190 μl de agua de calidad para HPLC. Antes de las inyecciones de muestra, el cartucho de EC se aclaró ampliamente con agua de calidad para HPLC (tiempo de ejecución de 1-3 min), seguido de un aclarado equilibrante con tampón de electroforesis (tiempo de ejecución de 5 min). Tras el aclarado inicial, los patrones de monosacárido y muestras para análisis se inyectaron en el cartucho de EC (tiempo de ejecución de 10 min). Tras la ejecución de inyección de cada patrón o muestra de prueba, el cartucho de EC se aclaró y se equilibró con agua de calidad para HPLC y tampón de electroforesis. El electoferograma de idoneidad del sistema debe ser similar a la FIG. 46, en la que el pico 1 es GalNAc; el pico 2 es ManNAc; y el pico 3 es GlcNAc.
Tabla 53. Procedimiento del instrumento
Tiempo
Evento Valor Duración Resumen Descripción
Aclarado -Presión
276 kPa 3,00 min seguir adelante Aclarado con agua
Aclarado -Presión
276 kPa 5,00 min seguir adelante Aclarado con tampón de electroforesis
Inyección -Presión
3,45 kPa 20,00 s control manual, seguir adelante Inyección
0,00 min
Separación -Voltaje 30 kV 10,00 min rampa de 0,17 min, polaridad normal Separación
0,05 min
Corrección automática a cero
10,00 min
Parada Datos
10,00 min
Fin
5 IDONEIDAD DEL SISTEMA:
El electroferograma de idoneidad del sistema debe ser similar al mostrado en la FIG. 46, en la que el pico 1 es GalNAc; el pico 2 es ManNAc; y el pico 3 es GlcNAc
Si se usan instrumentos de EC distintos del sistema MDQ de Beckman, la longitud del capilar puede ser diferente a la especificada en este procedimiento. Esto producirá variaciones en el tiempo de migración del analito, además de
10 la intensidad del pico. Pero el patrón pico de los analitos de monosacárido debe permanecer el mismo.
La resolución entre dos picos vecinos para el primer patrón de idoneidad del sistema puede calcularse según la siguiente ecuación:
en la que
15 R: resolución t2, t1: tiempos de migración de los dos picos vecinos, respectivamente W1, W2: anchuras de los picos en la base de los dos picos vecinos, respectivamente
El valor de R debe ser ≥ 1,0. Si R lt; 1,0, aclarar el capilar usando las secuencias de lavado/aclarado. Si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de ejecución recientemente preparado o sustituir el capilar.
20 Para la última inyección de idoneidad del sistema, el último pico (GlcNAc) debe tener un factor de cola lt;1,4 usando la siguiente fórmula:
T = W0,05/2f
en la que:
T: factor de cola 25 W0,05: anchura del pico al 5% de altura
f: anchura del frente del pico al máximo del pico
Si T ≥ 1,4, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de electroforesis recientemente preparado o sustituir el capilar. Las relaciones del área del pico de GlcNAc y ManNAc deben tener una DER de ≤ 10%. El tiempo de migración de GlcNAc debe ser ≤ 10,0 minutos.
30 El perfil del electroferograma debe ser equivalente a la FIG. 46.
El porcentaje de DER del patrón de monosacárido puede determinarse comparando las relaciones del área del pico de componentes de patrón interno y patrón de monosacárido dividiendo el área del pico para cada componente de monosacárido entre el área del pico del patrón interno para cada inyección de patrón de monosacárido. El porcentaje de DER puede calcularse para GalNAc y GlcNAc. La DER debe ser ≤ 10%.
Determinación de las relaciones molares de aminomonosacáridos con respecto a proteína
Las relaciones del área del pico de aminomonosacáridos (por ejemplo, GalNAc y GlcNAc) con respecto al patrón interno ManNAc pueden calcularse según las fórmulas proporcionadas más adelante con el fin de determinar las relaciones molares de cada aminomonosacárido con respecto a proteína. Por ejemplo, la relación del área del pico es igual a un área del pico de monosacárido (GalNAc o GlcNAc) dividida entre el área del pico de ManNAc, siendo la desviación estándar relativa (DER) para la relación del área de pico igual o inferior al 10%. Las siguientes ecuaciones pueden usarse para calcular lo siguiente
Para la proporción molar de GalNAc/proteína:
A ? A ?V ? C ? MW
GalNAc ManNAc0 GalNAc0 GalNAc0 LEA29Y
R 5
GalNAc
AManNAc ? AGalNAc0 ?Vp ? Cp ? 221,2
en la que,
RGalNAc: proporción molar de GalNAc frente a proteína AGalNA: área del pico (μV·s) de GalNAc en la muestra AManNAc: área del pico (μV·s) de ManNAc en la muestra AManNAc0: área del pico (μV·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido AGalNAc0: área del pico (μV·s) promedio de GalNAc en patrón de monosacárido VGalNAc0: volumen de GalNAc contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl) CGalNAc0: concentración de GalNAc contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml) Vp: volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp: concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWLEA29Y: peso molecular de LEA29Y (o CTLA4A29IL104E-Ig) (91.232 Da) MW GalNAc: 221,2 Dalton.
Para la proporción molar de GlcNAc/proteína:
A ? A ? V ? C ? MW
GlcNAc ManNAc0 GlcNAc0 GlcNAc0 LEA29Y
R 5
GlcNAc
AManNAc ? AGlcNAc0 ?Vp ? Cp ? 221,2
en la que
RGlcNAc: proporción molar de GlcNAc frente a proteína AGlcNAc: área del pico (μV·s) de GlcNAc en la muestra AManNAc: área del pico (μV·s) de ManNAc en la muestra AManNAc0: área del pico (μV·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido AGlcNAc0: área del pico (μV·s) promedio de GlcNAc en patrón de monosacárido VGlcNAc0: volumen de GlcNAc contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl) CGlcNAc0: concentración de GlcNAc contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml) Vp: volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp: concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWLEA29Y: peso molecular de LEA29Y (o CTLA4A29IL104E-Ig) (91.232 Da) MW GlcNAc: 221,2 Dalton
Tabla 54: Proporción molar media de moles de monosacárido con respecto a moles de proteína CTLA4A29IL104E-Ig
MONOSACÁRIDO
INTERVALO
GalNAc
2,0-3,2
GlcNAc
18-32
EJEMPLO 37: PERFILADO DE HIDRATOS DE CARBONO DE OLIGOSACÁRIDOS LIGADO EN N DE CTLA4A29L104E-Ig POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO DE ALTA RESOLUCIÓN
Las estructuras de hidrato de carbono presentes en glucoproteínas pueden afectar su función y eliminación in vivo. Es por tanto importante monitorizar la consistencia estructural de los hidratos de carbono de lotes 45 recombinantemente producidos de glucoproteínas. Aquí se monitorizan hidratos de carbono ligados en N (ligados en
asparagina) presentes en CTLA4A29IL104E-Ig. En este procedimiento, oligosacáridos se escinden por digestión enzimática con PNGasa F (péptido: N-glucosidasa F), se separan por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) y se monitorizan por detección electroquímica (amperiometría integrada). El cromatograma generado es el perfil de hidratos de carbono ligados en N, en el que los perfiles de muestras de CTLA4A29IL104E-Ig
5 deben ser similares a tales.
Reactivos para fases móviles para el aislamiento de oligosacáridos por HPLC de fase inversa y en carbón grafitizado: Eluyente 1 (0,05% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua de calidad para HPLC); eluyente 2: (0,05% de TFA en 60% de acetonitrilo (ACN), 40% de agua para HPLC (60:40, ACN: H2O); eluyente 3: 0,05% de TFA en 40% de acetonitrilo, 40% de isopropanol (IPA), 20% de agua para HPLC (40:40:20, ACN: IPA:H2O)).
10 Reactivos para la preparación de fases móviles para el perfilado de hidratos de carbono de oligosacáridos de HPAEC: Eluyente 1: acetato sódico 500 mM (NaOAc); eluyente 2: hidróxido sódico 400 mM (NaOH); agua Milli-Q; hidróxido sódico 4 M (aproximadamente NaOH 4 M); tampón fosfato de sodio 50 mM, 0,02% de azida de sodio, pH = 7,5; disolución madre de trabajo de enzima PNGasa F en tampón fosfato de sodio 50 mM, 0,02% de azida de sodio, pH = 7,5; disolución madre de estaquiosa (1,25 mg/ml); patrón de idoneidad del sistema estaquiosa (12,5 μg/ml).
15 INSTRUMENTACIÓN Y CONDICIONES -(Puede sustituirse con instrumentación equivalente)
Instrumentación:
Sistema de HPLC Alliance equipado con un inyector automático de Waters Corporation temperatura controlada calibrado (37 ºC), un aparato con válvula de inyección Rheodyne y detector de UV
Selector de 6 columnas Synergi Phenomenex (nº de catálogo AV0-6080)
Columna 1: Luna 5μ, C 18(2) 4,6 x 150 mm Phenomenex (nº de catálogo 00F-4252-E0)
Columna 2: HyperCarb 5μ 4,6 mm x 100 mm Phenomenex (nº de catálogo CHO-3301)
El sistema de HPLC DX-500 de Dionex incluye: Dionex Corporation
Bomba de gradiente GP50
Inyector automático AS50 (refrigerado)
Módulo de desgasificación del eluyente
Cromatografía de líquidos
Módulo
Detector ED40
DX-LAN
Software PeakNet (versión 5.1 o actualización) en sistema informático
adecuado
Columna: CarboPac PA-1 4 x 250 mm Dionex Corporation (nº de catálogo 35391)
Precolumna: CarboPac PA-1 4 x 50 mm Dionex Corporation (nº de catálogo 43096)
Sistema de recogida de datos Millennium Versión 3.2
Preparación de muestras: A un tubo Eppendorf de 1,7 ml se añadieron 80 μl de tampón fosfato de Na 50 mM que contiene 0,02% de azida de Na, pH 7, y 80 μl de muestra (∼25 μg/μl para un total de 2 mg de CTLA4A29IL104E-Ig, etc.)
20 seguido de 16 μl de 10X tampón desnaturalizante (5% de SDS, 10% de β-mercaptoetanol). Las muestras se mezclaron minuciosamente y posteriormente se hirvieron durante 2 minutos para desnaturalizar las proteínas. Los viales se enfriaron a temperatura ambiente, luego se añadieron 16 μl de NP40 (10%) y 40 μl de disolución madre de trabajo PNGasa F y posteriormente se mezclaron. Después las muestras se incubaron a 37 ºC durante 24 ± 2 horas, se transfirieron a un vial de inyector automático de HPLC, listo para la inyección en el instrumento de HPLC.
25 Condiciones de cromatografía para el aislamiento de oligosacáridos:
Temperatura de la columna Ambiente (22-25 ºC)
Programa de caudal Inicial a 30,0 min 1,0 ml/min 30,0 a 35,0 min, 1,0-2,0 '' 35,0 a 40,0 min, 2,0-1,0 '' 40,0 a 50,0 min, 1,0 '' 50,0 a 60,0 min, 1,0-0,1 ''
Fases móviles y condiciones de gradiente del programa de gradientes
1: 0,05% de TFA Tiempo
2: 0,05% de TFA en ACN/H2O (60:40) (min) % de 1 % de % de 3 2
3: 0,05% de TFA en ACN/IPA/H2O (40/40/20) Inicial 100 0 0 15,00 80 20 0 15,01 0 100 0 25,00 0 100 0 30,00 0 0 100 35,00 0 0 100 40,00 100 0 0 50,00 100 0 0 60,01 100 0 0
Temperatura del inyector automático 37 ºC Volumen de inyección 100 μl Tiempo de ejecución 50 minutos Tiempo de recogida de datos 50 minutos
Eventos de conmutación en columna para la válvula de conmutación de 6 columnas y el aparato Rheodyne de Waters
Tiempo Evento Función
Alliance min Inicial Conmutador1 Desactivar Inicial Conmutador Activar
2 Inicial Conmutador Activar 3 Inicial Conmutador Desactivar 4 11,0 Conmutador Activar 4 30,0 Conmutador Desactivar 4 30,0 Conmutador Activar 1 30,0 Conmutador Desactivar 2 40,0 Conmutador Activar 2 40,0 Conmutador Desactivar 1
Condiciones de cromatografía para el perfil de oligo por cromatografía de intercambio aniónico:
Temperatura de la Ambiente (22-25 ºC) columna
Caudal 1 ml/min
Fases móviles y Programa de gradientes condiciones del gradiente
*el segundo valor para algunas etapas de gradiente más adelante indica el grado al que el gradiente puede modificarse con el fin de ajustar el tiempo de retención del patrón de idoneidad del sistema
1: NaOAc 500 mM Tiempo
2: NaOH 400 mM (min) % de 1 % de 2 % de 3
3: Agua Milli-Q Inicial 0 50-35 50-65 0,0 0 50-35 50-65 1,0 0 50-35 50-65 2,0 4 50-40 46-56 60,0 4550 5 61,0 0 5050 80,0 0 5050
Parámetros del detector ED40
Modo Amperiometría integrada
Potenciales aplicados Tiempo Pot. Integ. 0,00 +0,05 0,20 +0,05 Principio 0,40 +0,05 Fin 0,41 +0,75 0,60 +0,75 0,61 -0,15 1,00 -0,15
Intervalo 200 nC
Parámetros de salida analógica Salida = compensado
Posición cero = 5% de la escala completa
Escala completa de voltios = 1,0 v Tiempo de aclarado = 1 s Polaridad = +
Temperatura del inyector automático 4 ºC Volumen de inyección 30 μl
Tiempo de ejecución 80 minutos
Tiempo de retención aproximado (TR; minutos) según TR del patrón de idoneidad del sistema (IS) IS:
Tiempo de retención aproximado (min) 9,6
Pico 1A:
10,5
Pico 1B:
11,5
Pico 1C:
12,5
Pico 1D:
13,5
Pico 1E:
15,0
Pico 2:
24,5
Pico 3:
37,5
Las muestras de CTLA4A29IL104E-Ig pueden tener un perfil de hidratos de carbono representado en el cromatograma de la FIG. 47. Los tiempos de retención de cada dominio, como se identifican en la FIG. 47, deben ser
aproximadamente:
Dominio I (pico 1A, 1B, 1C, 1D y 1E) Dominio II:
10-17 min 21-29 min
Dominio III:
33-43 min
Dominio IV:
48-56 min
Los tiempos de retención son dependientes del sistema y deben desplazarse similarmente a la estaquiosa.
Cálculos
Platos teóricos (N): El número de platos teóricos (N) puede determinarse basándose en el pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace mediante el sistema de análisis de datos Millennium o también puede hacerse manualmente.
10 en la que:
t: tiempo de retención medido desde el momento de inyección hasta el momento de elución del pico a la máxima altura.
W: anchura del pico por extrapolación de los lados a la base.
N debe ser ≥ 6000. Si el número de platos es inferior a 6000, la columna debe sustituirse.
15 Factor de cola (T): El factor de cola de la columna (T) puede calcularse basándose en el pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace mediante el sistema de análisis de datos Millennium o también puede hacerse manualmente.
T = (W0,05 / 2f)
en la que: 20 W0,05: anchura del pico al 5% de altura (0,05h).
f: la medición (anchura) desde el borde frontal del pico en W0,05 hasta el centro del pico a la máxima altura.
T debe ser ≤ 1,2. Si el factor de cola es superior a 1,2, la composición tampón debe evaluarse, la columna debe sustituirse o limpiarse.
% del área del dominio:
Dominio I: Suma de las áreas de los picos a tiempos de retención aproximados de 10 -15 minutos (picos 1A-1E; por ejemplo, FIG. 47) Dominio II: Suma de los picos de 21 -27 minutos Dominio III: Suma de los picos de 34 -40 minutos Dominio IV: Área de los picos para los picos a 45 -56 minutos
Área del domin io individual
% del área del domin io 5 x 100%
Suma de todas las áreas del domin io
Porcentaje de área del pico principal: El % de área del pico para cada uno de los cinco picos principales puede calcularse para lo siguiente usando la siguiente ecuación: Picos 1A, 1B, 1C, 2 (dos especies no resueltas), 3 (dos especies no resueltas) y 4.
Área del pico para pico individual
Porcentaje del área del pico 5 x 100%
Suma detodaslas áreasdelos dominios
EJEMPLO 38: IDENTIFICACIÓN ELECTROFORÉTICA CAPILAR DE CTLA4A29IL104E-Ig EN PRINCIPIO ACTIVO Y MEDICAMENTO
CTLA4A29IL104E-Ig es una glucoproteína soluble en agua con actividad inmunodepresora. Se usó un procedimiento de electroforesis capilar usando un capilar de sílice fundida sin recubrir para la identificación de CTLA4A29IL104E-Ig. Las muestras (por ejemplo, CTLA4A29IL104E-Ig, etc.) se calientan durante 5 minutos a 70 ºC y luego se analizan inmediatamente por detección UV fijada a 214 nm para confirmar la identificación.
Adicionalmente, una mezcla 1:1 de material de CTLA4A29IL104E-Ig y CTLA4-Ig se mezcló e inyectó para confirmar que las dos proteínas podrían separarse y diferenciarse. Este procedimiento puede distinguir entre CTLA4A29ILl04E-Ig de CTLA4-Ig comparando el tiempo de migración del material de CTLA4A29IL104E-Ig con la muestra.
EQUIPO (puede sustituirse por equipo equivalente): Instrumento de electroforesis capilar Beckman P/ACE MDQ Módulo de detector UV a 214 nm Capilar Polymicro Technologies Inc., 360 μm de d.e./75 μm de d.i., sin recubrir (nº
de pieza 2000019, TSP075375) Window maker de capilares MicroSolve Technology (nº de catálogo 07200-S) REACTIVOS y DISOLUCIONES: Tampón de electroforesis (borato de sodio 14,4 mM; dodecilsulfato de sodio 17,3 mM; 2,0% de acetonitrilo); tampón de dilución fosfato (fosfato de sodio 22,3 mM, dibásico; fosfato de sodio 4,2 mM, monobásico; cloruro sódico 53,4 mM); tampón de dilución borato (NaBO2 83,5 mM, pH 9,6); disoluciones de trabajo de referencia o muestra (10 ± 1 mg/ml de muestra en tampón de dilución fosfato); disoluciones de referencia o de inyección de muestra (10,0 μl de muestra + 50 μl de tampón de dilución borato); muestra 1:1 de disolución de mezcla de CTLA4-Ig-CTLA4A29IL104E-Ig (10,0 μl de muestra de CTLA4-Ig + 10,0 μl de muestra de CTLA4A29IL104E-Ig + 50 μl de tampón de dilución borato); disolución de inyección. CONDICIONES DE EJECUCIÓN:
Longitud de onda del detector de UV 214 nm
Tasa de datos 4 Hz
Anchura del pico (puntos) 16-25
Inyección 10 segundos (3,4 kPa)
Longitud total * ∼ 60 cm
Longitud eficaz del capilar ** ∼ 50 cm
Temperatura del cartucho del capilar 15 ºC
Voltaje 19 kV-23 kV
Tiempo de ejecución 15 minutos
* Longitud total: desde la entrada hasta la salida del capilar ** Longitud eficaz: desde la entrada del capilar hasta la ventana de detección
El tiempo de migración de la muestra de CTLA4-Ig del pico principal es aproximadamente 11,0 ± 0,4 minutos. El tiempo de migración de la muestra de CTLA4A29IL104E-Ig del pico principal es aproximadamente 12,0 ± 0,4 minutos. Los tiempos de migración del pico principal entre cada muestra deben estar separados al menos 0,6 minutos (FIG.
48).
EJEMPLO 39: Hidrólisis y análisis por HPLC para la determinación del contenido de ácido Nacetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico en CTLA4A29IL104E-Ig
El grado de sialilación en proteínas recombinantes puede afectar la farmacocinética y tasa de eliminación. 5 CTLA4A29IL104E-Ig es una proteína recombinante que posee tanto sitios de hidrato de carbono ligados en N como en
O. Los glicanos que ocupan estos sitios poseen grados variables de sialilación. Además de la heterogeneidad estructural de su sialilación, el contenido de ácido siálico individual podría variar de lote a lote. Por tanto, se obtiene una medida global de la relación de ácido siálico con respecto a proteína.
Se examinó el contenido de ácido N-acetilneuramínico (NANA) y ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) presente en
CTLA4A29IL104E-Ig. Los
10 ácidos siálicos se liberan de la proteína por hidrólisis ácida y luego se marcan fluorescentemente con DMB. Los ácidos siálicos marcados se separan en una columna C-18 de RP-HPLC y se cuantifican a partir de un factor de respuesta de un patrón de ácido siálico ejecutado simultáneamente. El análisis de datos y los valores informados (como proporción molar de NANA o NGNA con respecto a proteína) se especifican dentro de este procedimiento de ejemplo. Este ejemplo describe el procedimiento usado para determinar la cantidad
15 de ácido N-acetilneuramínico (NANA) y ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) presente en CTLA4A29IL104E-Ig. Los ácidos siálicos se liberan de la proteína por hidrólisis ácida. Los NANA y NGNA liberados se marcan entonces fluorescentemente con 1,2-diamino-4,5-metilen-dioxibenceno (DMB). Los ácidos siálicos marcados se separan en una columna C-18 de RP-HPLC y se detectan por detección fluorescente (Ex = 373 nm, Em = 448 nm). NANA y NGNA se cuantifican basándose en los factores de respuesta de patrones de NANA y NGNA ejecutados
20 simultáneamente. Los resultados de prueba se informan como proporción molar (RM) de NANA y NGNA con respecto a proteína, respectivamente.
Reactivos y disoluciones: H2SO4 1,0 M; H2SO4 50 mM; reactivo de marcado de fluorescencia (hidrosulfito de sodio (Na2S2O4) 18 mM, 7% de 2-mercaptoetanol, diclorhidrato de 1,2-diamino-4,5-metilen-dioxibenceno 7 mM (DMB)); tampón de electroforesis de fase móvil A (20% de metanol); tampón de electroforesis de fase móvil B (70% de
25 metanol); disolución patrón de ácido N-acetilneuramínico (1 mg/ml); disolución patrón de ácido N-glicolilneuramínico (1 mg/ml); patrones de idoneidad del sistema (50 μl de las disoluciones de NANA o NGNA en 900 μl de agua); disoluciones de muestra (por ejemplo, 2 mg/ml de CTLA4A29IL104E-Ig, etc.); disolución patrón de disolución madre de trabajo de NANA (disolución madre diluida a 50 μg/ml); disolución patrón de disolución madre de trabajo de NGNA (disolución madre diluida a 50 μg/ml).
30 Hidrólisis: Se tomaron alícuotas de 20 μl de cada patrón de NANA, patrón de NGNA, CTLA4A29IL104E-Ig y disolución patrón de idoneidad del sistema en tubos de centrífuga de 1,5 ml separados y a cada vial se añadieron 200 μl de disolución 50 mM de ácido sulfúrico. El contenido se mezcló cuidadosamente y se incubó a 80EC durante 1 hora V 5 minutos. Cuando la hidrólisis se completa, las muestras se centrifugaron rápidamente.
Marcado de fluorescencia: Se añadió reactivo de marcado de fluorescencia (200 μl) a cada muestra y se mezcló
35 minuciosamente. Las muestras se incubaron entonces en la oscuridad a 80EC durante 45 ∀ 5 y posteriormente se enfriaron.
INSTRUMENTACIÓN Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS (puede sustituirse por instrumentación equivalente):
Sistema ternario de bombas Hewlett Packard modelo 1090
Columna RP C-18 HPLC, 4,6 x 50 mm, 3 μ Jones Chromatography (nº de catálogo 4M5313)
Detector de fluorescencia Hewlett Packard modelo 1046A
Inyector automático Hewlett Packard modelo 1090 equipado con refrigeración a 4 ºC
Sistema de integración VG/Multichrom
HPLC Chemstation (serie DOS) Hewlett Packard
Parámetros cromatográficos
Flujo: 1,0 ml/min Fase móvil A: 20% de MeOH/agua Fase móvil B: 70% de MeOH/agua
Gradiente lineal: Tiempo % de A % de B
0,01 98 2,0 1,0 98 2,0 4,0 90 1,0
(Continuación)
Gradiente lineal: Tiempo % de A % de B 4,01 98 2,0 6,00 98 2,0
Volumen de inyección: 10 μl Tiempo de ejecución: 6 min Temperatura de la columna: Temperatura ambiente Tiempo de retención (NANA): 3,1 ∀ 0,5 min Tiempo de retención (NGNA): 2,3 ∀ 0,5 min Presión máx.: 300 bar Longitud de onda de excitación: 373 nm Longitud de onda de emisión: 448 nm Ganancia de PMT: 8
Sistema de HPLC: Módulo de separación Waters 2690/2695 o equivalente. Detector de fluorescencia: Detector de fluorescencia de múltiples longitudes de onda Waters 2475 o
equivalente
Adquisición de datos: Waters Millennium 32 o Empower.
Columna: Luna 5 μ, C 18, 100 A, 150 x 4,6 mm, Phenomenex (nº de catálogo 00F-4252-
E0)
Bloque térmico digital WVR (nº de catálogo 13259-056) o equivalente
Minicentrífuga WVR (modelo nº C-1200) o equivalente
Fase móvil A: 10% (v/v) de MeOH/90% de agua
Fase móvil B: 70% (v/v) de MeOH/30% de agua
Caudal: 1 ml/min
Volumen de inyección: 10 μl
Tiempo de ejecución: 30 min
Temperatura de la columna: Temperatura ambiente
Longitud de onda de excitación: 373 nm
Longitud de onda de emisión: 448 nm
Ganancia: 1
Gradiente de elución:
Tiempo Flujo % de A % de B Curva
Inicial 1,0 85,0 15,0 * 20,00 1,0 85,0 15,0 6 20,50 1,0 0,0 100,0 6 25,00 1,0 0,0 100,0 6 25,50 1,0 85,0 15,0 6 30,00 1,0 85,0 15,0 6 35,00 0,05 0,0 100,0 11 Preparación de patrones de ácido siálico (∼ 5 mM). Patrón de ácido N-acetilneuramínico (NANA, MW = 309,3) (∼ 5 mM). Pesar con exactitud 154,5 ± 1,0 mg de ácido N-acetilneuramínico en un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver y c.s.p. hasta el volumen con agua DI, mezclar bien. Separar en alícuotas la disolución en viales criogénicos de 2 ml.
Wt(mg) x PConc(mM ) 5 309,3 x 100( ml )
P = Pureza de NANA – de COA del vendedor (es decir, 99% = 0,99).
Patrón de ácido N-glicolilneuramínico (NGNA, MW = 325,7) (∼ 0,25 mM). Pesar con exactitud 8,0 ± 1,0 mg de ácido N-glicolilneuramínico en un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver y c.s.p. hasta el volumen con agua DI, mezclar bien. Separar en alícuotas la disolución en un vial criogénico de 2 ml.
Wt(mg) x PConc(mM ) 5 328,7 x 100( ml )
P = Pureza de NGNA -de COA del vendedor (es decir, 99% = 0,99). Los patrones de ácido siálico separados en alícuotas pueden almacenarse a -20 ºC durante hasta seis meses.
Preparación de la mezcla patrón de ácido siálico. Mezcla patrón de ácido siálico para idoneidad del sistema y cuantificación (NANA 50 μM, NGNA 1 μM). Añadir 1 ml de NANA 5 mM, 400 μl de NGNA 0,25 mM a un matraz volumétrico de 100 ml. C.S.P. hasta el volumen con agua DI y mezclar bien. Separar en alícuotas la mezcla patrón de ácido siálico en viales criogénicos de 2 ml. La mezcla patrón de ácido siálico separada en alícuotas puede almacenarse a -20 ºC durante hasta seis meses.
Preparación de muestras y de material de referencia. Descongelar muestras de proteína congeladas a 2-8 ºC, mezclar bien. Diluir tanto las muestras como el material de referencia a aproximadamente 0,5 mg/ml de CTLA4A29IL104E-Ig (por ejemplo, Conc. de proteína = 25,0 mg/ml, añadir 50,0 μl de proteína a 2450 μl de agua). Centrifugar las muestras de prueba y el material de referencia diluidos durante 5 minutos a 10.000 rpm con el fin de eliminar partículas.
Hidrólisis. Blanco: A un tubo de centrífuga de 2,0 ml añadir 50 μl de agua DI y 200 μl de ácido sulfúrico 50 mM. Esto sirve de blanco. Patrón de ácido siálico para idoneidad del sistema y cuantificación. A un tubo de centrífuga de 2,0 ml añadir 50 μl de mezcla patrón de ácido siálico y 200 μl de ácido sulfúrico 50 mM. Preparar por duplicado. Indicar como Patr1 y Patr2. Material de referencia: A un tubo de centrífuga de 2,0 ml añadir 50 μl de material de referencia CTLA4A29IL104E-Ig diluido (∼0,5 mg/ml) y 200 μl de ácido sulfúrico 50 mM. Preparar por duplicado, indicar como MR1 y MR2. Muestras de prueba: A un tubo de centrífuga de 2,0 ml añadir 50 μl de principio activo CTLA4A29IL104E-Ig diluido (-0,5 mg/ml) y 200 μl de ácido sulfúrico 50 mM. Preparar por duplicado. Indicar como M1-1, M1-2; M2-1, M22; M3-1, M3-2; etc. Remover con vórtex las muestras durante aproximadamente 5 segundos y centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos. Poner las muestras en un bloque térmico e incubar a 80 ºC ± 5 ºC durante 1 hora ±5 minutos. Dejar que las muestras hidrolizadas se enfríen a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente las muestras hidrolizadas para forzar a que condensen en el tubo (∼ 10 segundos a alta velocidad).
Derivatización. Precalentar el bloque térmico a 80 ºC ± 5 ºC. Añadir 200 μl de reactivo de marcado de fluorescencia a cada muestra hidrolizada. Remover con vórtex aproximadamente 5 segundos y centrifugar cuatro ∼ 10 segundos. Poner las muestras en un bloque térmico a 80 ºC ± 5 ºC durante 40 ± 5 minutos. Cubrir el bloque térmico con lámina de aluminio, ya que la disolución de marcado es sensible a la luz. Dejar que las muestras derivatizadas se enfríen a temperatura ambiente. Remover con vórtex y centrifugar las muestras durante aproximadamente 10 segundos para forzar a que condensen en el tubo.
Preparación para inyección. Asegurar que la columna se equilibre con fase móvil antes del análisis. Transferir muestra suficiente (100 -200 μl) de cada tubo de centrífuga a un vial de inyector automático con inserto limitado. Una carga de inyector automático típico para inyecciones de 10 muestras es del siguiente modo:
Muestra nº
Descripción Nº de inyecciones
1
Blanco
1
2
Patr1
2
3
Patr1 2
4
Patr2 2
5
MR1 1
6
MR2 1
7
M1-1 1
8
M1-2 1
9
M2-1 1
10
M2-2 1
11
M3-1 1
12
M3-2 1
13
S4-1 1
14
S4-2 1
15
Patr1 1
16
Patr2 1
en la que Patr1 y Patr2 son las preparaciones de disolución de mezcla patrón de ácido siálico; MR1 y MR2 son las preparaciones para muestras de control; y M es una inyección de muestra. Las cuatro primeras (Muestra nº 2 y 3) de las inyecciones de patrón de ácido siálico (Patr1) se usarán para fines de idoneidad del sistema. Las cuatro inyecciones de Muestra nº 3 (Patr1) y Muestra nº 4 (Patr2) se usarán para cálculo. Para inyecciones de muestra adicionales, repetir la carga del inyector automático 5 a 16.
IDONEIDAD DEL SISTEMA. El perfil del cromatograma de las muestras de idoneidad del sistema debe ser similar al cromatograma mostrado en la Figura 49. Para la primera inyección de patrón de idoneidad del sistema (Patr1), las resoluciones USP (R) para NGNA y NANA deben ser ≥ 1,5. Cuatro inyecciones del patrón de idoneidad del sistema (Patr1) deben cumplir los siguientes valores ejemplares: La DER del área del pico para NANA debe ser ≤ 5%. La DER del área del pico para NGNA debe ser ≤ 10%. El tiempo de migración del pico de NGNA debe eluirse en 11,3 ± 2,0 minutos. El tiempo de migración del pico de NANA debe eluirse en 16,0 ± 2,5 minutos. La DER del área del pico de cuatro inyecciones patrón (Patr1, Muestra nº 3) y (Patr2, Muestra nº 4) debe ser ≤ 10%. La DER del área del pico de todas las inyecciones patrón de agrupamiento de la secuencia debe ser ≤15%.
Preparación del sistema de HPLC: Se equilibraron columnas con 98% de tampón A y 2% de tampón B a 1 ml/min durante 15 minutos. Se inyectaron 10 μl de disolución de idoneidad del sistema fluorescentemente marcada en el sistema. La resolución del pico y el número de platos teóricos puede entonces calcularse usando las siguientes ecuaciones:
en la que:
R= Resolución T1= Tiempo de retención (min) de ácido N-glicolilneuramínico T2= Tiempo de retención (min) de ácido N-acetilneuramínico W1= Anchura del pico en la base de ácido N-glicolilneuramínico (min) W2= Anchura del pico en la base de NANA (min)
La resolución valor debe ser ∃1,5.
El número de platos teóricos puede calcularse usando la siguiente ecuación:
en la que:
N = Número de platos teóricos
T2 = Tiempo de retención (min) de ácido N-acetilneuramínico
W2 = Anchura del pico en la base de ácido N-acetilneuramínico (min)
El número de platos teóricos debe ser 2000. El cromatograma del perfil de hidrólisis de CTLA4A29IL104E-Ig debe ser similar a la FIG. 49.
Se analizaron muestras por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) en el siguiente orden: primero se inyectaron patrones de NANA y NGNA, seguido de inyección de muestras, por duplicado si fuera necesario (por ejemplo, CTLA4A29IL104E-Ig, etc.). Después del análisis de muestras, la columna se lavó con fase móvil B durante 20 minutos a 0,5 ml/minuto. Si se necesitara, la columna puede invertirse.
Determinación de la proporción molar (RM) de ácido siálico (NANA o NGNA) con respecto a proteína
La proporción molar de ácidos siálicos con respecto a proteína puede calcularse por el software Millennium o Empower.
Factor de dilución:
D 5 Vproteína : Vagua
V
proteína
en la que
V proteína = volumen de disolución madre de proteína añadida (μl),
V agua = volumen de agua añadida (μl) Concentración de disolución de trabajo de proteína (proteína usada para hidrólisis) (μM):
C1
A280 6
C 5 ?? 10
proteína
MW D
belatacept
en la que
Cproteína = Concentración de la disolución de trabajo de proteína (μM), CA280 = Concentración a A280 de la disolución madre de proteína (mg/ml), 5 MW CTLA4A29IL104E-Ig = peso molecular de CTLA4A29IL104E-Ig, 91232 Da.
Concentración de ácidos siálicos en la disolución de trabajo de proteína (μM):
Au
C 5 C ?
desconocida patrón
A
patrón
en la que
Cdesconocida = Concentración de ácido siálico (NANA o NGNA) en la muestra desconocida
10 Cpatrón = Concentración de ácido siálico (NANA o NGNA) en el patrón (μM) Au = Área del pico de ácido siálico (NANA o NGNA) en la muestra desconocida Apatrón = Área del pico de ácido siálico (NANA o NGNA) en la proporción molar de patrón (R.M.) de ácido siálico (NANA o NGNA) con respecto a proteína:
C
desconocida
RM 5
C
proteína
15 Cálculo de la proporción molar total de ácido siálico con respecto a proteína (TSA):
TSA = proporción molar de NANA + proporción molar NGNA
La desviación estándar relativa para los recuentos de área de los dos patrones de NANA de agrupamiento debe ser lt; 10%. La desviación estándar relativa para los recuentos de área de dos patrones de NGNA de agrupamiento debe ser lt; 10%. La desviación estándar relativa para los recuentos de área de dos hidrolizados independientes debe ser
20 lt; 10%.
En una realización, las relaciones molares promedio para ácidos siálicos en CTLA4A29IL104E-Ig deben estar dentro de los intervalos especificados en la tabla directamente a continuación.
Intervalo de proporción molar de material de CTLA4A29IL104E-Ig
Monosacárido
Intervalo
NANA
5,0 -10,0
NGNA
lt; 1,5
El % de deviación de la proporción molar para ácidos siálicos en el material de referencia y muestras para las dos 25 muestras de preparación debe ser ≤ 15%, ≤ 20%, ≤ 25%, ≤ 30%, o ≤ 35%.
EJEMPLO 40: UN BIOENSAYO BASADO EN CÉLULAS IN VITRO PARA CTLA4A29L104E-Ig
Los linfocitos T requieren dos señales para la activación y posterior proliferación. La primera señal se proporciona por la interacción de un péptido antigénico con el complejo TCR-CD3. La segunda señal co-estimulante se produce por la interacción entre CD28 sobre el linfocito T y la proteína B7 sobre una célula presentadora de antígeno. Tras la
30 recepción de estas dos señales, los linfocitos T secretan la citocina interleucina 2 (IL-2). La liberación de IL-2 conduce a activación y proliferación celular. CTLA4A29IL104E-Ig, un compuesto inmunosupresor soluble, también se une a la proteína B7 sobre la célula presentadora de antígeno, bloqueando así la interacción funcional con CD28 y previniendo la señal co-estimulante que es necesaria para la producción de IL-2.
En este procedimiento, linfocitos T de Jurkat transfectados con el gen luciferasa, bajo el control del promotor de IL-2,
35 se co-estimulan con linfocitos B de Daudi en presencia de anti-CD3. La co-estimulación activa el promotor de IL-2, que a su vez produce proteína luciferasa. La señal luminiscente resultante se mide usando un sistema de ensayo de luciferasa. En este sistema, CTLA4A29IL104E-Ig produce una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa.
Este procedimiento examina el efecto de CTLA4A29IL104E-Ig sobre la señal co-estimulante necesaria para la 40 producción de IL-2. La presencia de CTLA4A29IL104E-Ig soluble previene la señalización entre el linfocito T y la célula presentadora de antígeno. Sin esta señal, IL-2 no se produce, previniendo así la expansión clónica de linfocitos T. Se creó un vector con el gen luciferasa usando el promotor de IL-2. Los linfocitos T de Jurkat se transfectaron entonces con este vector indicador. Se seleccionó un clon positivo, Jurkat.CA, y se usó en el procedimiento.
Este bioensayo implica estimular linfocitos T transfectados (Jurkat.CA) con anti-CD3 y linfocitos B (Daudi). La co
5 estimulación proporcionada por los linfocitos B se inhibe mediante la adición de CTLA4A29IL104E-Ig. Las células de Jurkat.CA y de Daudi se siembran en los pocillos de una placa de fondo plano opaca blanca de 96 pocillos y se estimula con anti-CD3 en presencia de diferentes concentraciones de CTLA4A29IL104E-Ig. Después de una incubación de 16 a 20 horas a 37 ºC, los pocillos se ensayan para actividad de luciferasa. La inhibición de la co-estimulación por CTLA4A29IL104E-Ig se considera una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa.
10 REACTIVOS: Medio de cultivo celular de Daudi (10% de suero bovino fetal, 1% de MeM-piruvato de sodio en RPMI 1640); medio de cultivo celular de Jurkat.CA (10% de suero bovino, 1% de MeM-piruvato de sodio, 400 μg/ml de geneticina en RPMI 1640); medio de bioensayo (0,2 μg/ml de anticuerpo anti-CD3 y 1% de disolución de penicilinaestreptomicina en medio de cultivo celular de Daudi); disolución de luciferasa Bright-Glo del sistema de ensayo (Promega, nº de catálogo E2620).
15 INSTRUMENTACIÓN: Microscopio invertido Diaphot 200 de Nikon; luminómetro TopCount NXT de Packard; manipulador de líquidos Genesis de Tecan; contador de células Vi-Cell de Coulter; Zymark RapidPlate-96.
Procedimiento
Preparación de disoluciones de trabajo: 3 ml de disoluciones de CTLA4A29IL104E-Ig (5000 ng/ml) en medios de bioensayo.
Medio de cultivo celular de Daudi. Añadir 300 ml de RPMI 1640 a una unidad de filtro de Corning de 1 l. Luego añadir 100 ml de suero bovino fetal y 10 ml de MEM-piruvato de sodio. Añadir suficiente RPMI 1640 para preparar 1 litro. Filtrar y guardar a 4 ºC durante hasta un mes.
Medio de cultivo celular de Jurkat.Ca. Añadir 300 ml de RPMI 1640 a una unidad de filtro de Corning de 1 l. Luego añadir 100 ml de suero bovino, 10 ml de MEM-piruvato de sodio y 8 ml de geneticina a 50 mg/ml (la concentración final es 400 μg/ml). Añadir suficiente RPMI 1640 para preparar 1 litro. Filtrar y guardar a 4 ºC durante hasta un mes.
Medio de bioensayo. Añadir 100 ml de medio de cultivo celular de Daudi (2.1) a una botella de medio de 100 ml. Luego añadir anticuerpo anti-CD3 a una concentración de 0,2 μg/ml y 1 ml de disolución de penicilina-estreptomicina (1.11). Mezclar suavemente por inversiones y guardar a temperatura ambiente durante no más de 8 horas.
Disolución de luciferasa Bright-Glo. Preparar la disolución, como se describe en el sistema (1.21), añadiendo tampón de ensayo al sustrato de luciferasa y mezclar por inversión. El reactivo debe usarse en el plazo de 2 horas o guardarse a -20 ºC y protegerse de la luz durante hasta 4 semanas.
Mantenimiento de líneas celulares. Determinar el número de células por ml para tanto las líneas celulares de Jurkat.CA como de Daudi contando con un contador de células. Las células deben estar entre 1 x 105 y 1,5 x 106 células/ml. Combinar 12 x 106 células de Jurkat.CA y 12 x 106 células de Daudi en un tubo de centrífuga estéril. Centrifugar las células a ∼125 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender minuciosamente las células en 9 ml de medio de cultivo celular de Daudi (2.1) pipeteando suavemente repetidamente con una pipeta serológica hasta que no sean visibles grumos de células dando una concentración de 2,7 x106 células/ml. Verificar la concentración de células contando células en un contador de células. Sembrar las células resuspendidas en los pocillos de una placa de 96 pocillos (1.3) a 75 ml por pocillo (200.000 células por pocillo). Incubar la placa en puntos fijados de la estufa de incubación de 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad mientras que se preparan los patrones, controles de calidad y muestras. Preparación de las concentraciones nominales de CTLA4A29IL104E-Ig para los patrones, controles de calidad y muestras 1 y 2. Preparar 3 ml de disolución de trabajo del material CTLA4A29IL104E-Ig a 5000 ng/ml en medio de bioensayo (2.3) para su uso en la curva patrón. Preparar 3 ml de disolución de trabajo del material CTLA4A29IL104E-Ig a 5000 ng/ml en medio de bioensayo (2.3) para su uso en la curva de control de calidad. Preparar 3 ml de cada una de las dos disoluciones de trabajo de la muestra de CTLA4A29IL104E-Ig a 5000 ng/ml en medio de bioensayo (2.3) para su uso en las curvas de muestra (pueden usarse concentraciones aproximadas para muestras de CTLA4A29IL104E-Ig para preparar las curvas de 8 puntos y pueden corregirse valores de potencia relativa como se describe en 5.5 cuando la concentración determinada está disponible).
Se hicieron curvas de ocho puntos para el patrón, control de calidad y muestras a las concentraciones de 5000, 200, 100, 50, 25, 10, 5, y 0,1 ng/ml de CTLA4A29IL104E-Ig como se muestra en la Tabla 55 más adelante para concentraciones finales en el ensayo, después de dilución doble en la placa, de 2500, 100, 50, 25, 12,5, 5, 2,5 y 0,05 ng/ml.
Tabla 55. Diluciones usadas para generar curvas patrón.
Punto de la curva
Curva patrón Control de calidad Muestra 1 Muestra 2
1
5000 ng/ml 5000 ng/ml 5000 ng/ml 5000 ng/ml
2
200 200 200 200
3
100 100 100 100
4
50 50 50 50
5
25 25 25 25
6
10 10 10 10
7
5 5 5 5
8
0,1 0,1 0,1 0,1
Pueden usarse dos mapas de placas. El mapa de placas al azar requiere el uso de un manipulador de líquidos para el sistema. El mapa de placas ordenadas tiene triplicados adyacentes y cada punto de la curva para los artículos de prueba se añadidos en una disposición ordenada secuencial. Para el mapa de placas al azar, añadir 75 μl de cada disolución (4.8) a los pocillos apropiados de la placa que contiene células (4.5) como se muestra en el mapa de la placa más adelante. Para el mapa de placas ordenadas, añadir 75 μl de cada disolución (4.8) a los pocillos apropiados de dos placas que contienen células (4.5) como se muestra en el mapa de la placa a continuación.
Cerrar el (las) placa(s) con TopSeal-A (1.22). Asegurar que el cierre sea estanco in situ. No debe haber espacios de aire. Incubar la(s) placa(s) en puntos fijados de la estufa de incubación de 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad durante 16 a 20 horas. Equilibrar la(s) placa(s) y disolución de luciferasa Bright-Glo (2.4) a la temperatura del instrumento. Añadir 150 μl de disolución de luciferasa Bright-Glo a cada pocillo simultáneamente y mezclar. Poner la
5 placa en TopCount NXT inmediatamente después de mezclar para equilibrar en la oscuridad durante 10 minutos. Medir la señal luminiscente en TopCount NXT usando una integración de 1 segundo por pocillo o según convenga para el tipo particular de luminómetro usado. Se registra la salida de TopCount NXT. Si se usa el mapa de placas ordenadas, dos placas se leerán. La primera placa (vertical) se leerá con el pocillo A1 en la esquina izquierda superior. La segunda placa (invertida) se leerá con el pocillo A1 en la esquina derecha inferior.
10 Sistema de mapas de placas al azar del bioensayo:
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
CC 0,05 Muestra1 12,5 Patrón 0,05 Patrón 2500 CC 12,5 Patrón 100 Patrón 5 Muestra2 5 Muestra2 12,5 Patrón 2,5 Muestra1 12,5 Patrón 25
B
Patrón 5 Muestra2 25 Muestra1 5 Muestra1 0,05 Muestra1 12,5 CC 2,5 Patrón 0,05 CC 2500 Muestra1 25 CC 25 CC 5 Muestra2 100
C
Muestra2 5 Patrón 100 CC 5 Patrón 2,5 CC 0,05 CC 5 Muestra2 100 Muestra1 0,05 CC 100 Muestra1 100 CC 50 Patrón 5
D
Muestra1 100 Muestra2 12,5 Muestra1 50 CC 50 Muestra1 2500 Muestra2 2500 Muestra1 2,5 Patrón 25 Muestra2 5 CC 2500 Patrón 100 Muestra1 50
E
CC 100 Muestra2 100 CC 25 Muestra2 2500 Muestra2 12,5 Muestra2 50 Patrón 2500 Muestra1 25 Muestra1 5 Muestra1 2,5 Muestra1 0,05 Muestra2 2,5
F
CC 2500 Patrón 12,5 Muestra1 2,5 Patrón 25 Patrón 12,5 Muestra1 5 Patrón 2,5 Muestra2 2,5 Muestra2 0,05 Patrón 2500 CC 2,5 Muestra2 50
G
CC 2,5 Muestra2 50 Muestra2 0,05 Muestra1 25 Muestra2 0,05 CC 50 Muestra1 100 CC 100 Patrón 0,05 CC 0,05 Muestra1 2500 Muestra2 2500
H
Patrón 50 Muestra1 2500 Muestra2 2,5 CC 12,5 CC 25 Muestra2 25 Muestra1 50 Patrón 50 Patrón 50 CC 12,5 Muestra2 25 Patrón 12,5
Patrón: Patrón de 2500 a 0,05 ng/ml de concentración final en el pocillo. CC: Control de calidad de 2500 a 0,05 ng/ml ml de concentración final en el pocillo. Muestra1, Muestra2: Muestras 1 a 2 de 2500 a 0,05 ng/ml ml de concentración final en el pocillo.
Sistema de mapas de placas ordenadas del bioensayo:
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
Patrón 2500 Patrón 2500 Patrón 2500 Patrón 100 Patrón 100 Patrón 100 Patrón 50 Patrón 50 Patrón 50 Patrón 25 Patrón 25 Patrón 25
B
Patrón 12,5 Patrón 12,5 Patrón 12,5 Patrón 5 Patrón 5 Patrón 5 Patrón 2,5 Patrón 2,5 Patrón 2,5 Patrón 0,05 Patrón 0,05 Patrón 0,05
C
CC 2500 CC 2500 CC 2500 CC 100 CC 100 CC 100 CC 50 CC 50 CC 50 CC 25 CC 25 CC 25
D
CC 12,5 CC 12,5 CC 12,5 CC 5 CC 5 CC 5 CC 2,5 CC 2,5 CC 2,5 CC 0,05 CC 0,05 CC 0,05
E
Muestra1 2500 Muestra1 2500 Muestra1 2500 Muestra1 100 Muestra1 100 Muestra1 100 Muestra1 50 Muestra1 50 Muestra1 50 Muestra1 25 Muestra1 25 Muestra1 25
F
Muestra1 12,5 Muestra1 12,5 Muestra1 12,5 Muestra1 5 Muestra1 5 Muestra1 5 Muestra1 2,5 Muestra1 2,5 Muestra1 2,5 Muestra1 0,05 Muestra1 0,05 Muestra1 0,05
G
Muestra2 2500 Muestra2 2500 Muestra2 2500 Muestra2 100 Muestra2 100 Muestra2 100 Muestra2 50 Muestra2 50 Muestra2 50 Muestra2 25 Muestra2 25 Muestra2 25
H
Muestra2 12,5 Muestra2 12,5 Muestra2 12,5 Muestra2 5 Muestra2 5 Muestra2 5 Muestra2 2,5 Muestra2 2,5 Muestra2 2,5 Muestra2 0,05 Muestra2 0,05 Muestra2 0,05
Patrón: Patrón de 2500 a 0,05 ng/ml ml de concentración final en el pocillo. CC: Control de calidad de 2500 a 0,05 ng/ml ml de concentración final en el pocillo. Muestra1, Muestra2: Muestras 1 a 2 de 2500 a 0,05 ng/ml ml de concentración final en el pocillo.
Se añadieron 200.000 células por pocillo a una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad. Se combinaron 12 x 106 células de Jurkat.CA y 12 x 106 células de Daudi en un tubo de centrífuga estéril. Las células se centrifugaron a ∼125 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron minuciosamente en 9 ml de medio de cultivo de células de Daudi pipeteando suavemente repetidamente con una 5 pipeta serológica hasta que no fueron visibles grupos de células dando una concentración de 2,7 x 106 células/ml. 75 μl de cada disolución de la Tabla 55 se añadieron a los pocillos apropiados de la placa que contenían las células. La(s) placa(s) se tapó (taparon) entonces con TopSeal-A y se incubaron a 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad durante 16 a 20 horas. Después de equilibrar las placas y la disolución de luciferasa Bright-Glo a la temperatura del instrumento se añadieron 150 μl de disolución de luciferasa Bright-Glo a cada pocillo simultáneamente y se
10 mezclaron. Una placa se coloca entonces en TopCount NXT inmediatamente después de mezclar para el equilibrio en la oscuridad durante 10 minutos. La señal luminiscente se midió entonces en TopCount NXT usando una integración de 1 segundo por pocillo o según conviniera para el tipo particular de luminómetro usado.
Se registró la salida de TopCount NXT, se leyó en un programa de análisis de patrones y los datos se transformaron haciendo su logaritmo (base 10). Los datos transformados de cada artículo se ajustaron a un modelo logístico de
15 cuatro parámetros como se muestra en la siguiente ecuación:
en la que:
A es la meseta superior de la curva, D es la meseta inferior de la curva, B es el factor de pendiente y C es la concentración que produce un efecto igual al promedio de A y D.
20 Una R2 estadística, y una prueba de la F de falta de ajuste, pueden calcularse para cada artículo. También puede calcularse una relación del mínimo, máximo y pendiente de los artículos de prueba con respecto al material patrón. Además, también pueden calcularse los intervalos de confianza para las relaciones.
La potencia relativa de cada artículo se determinó ajustando una única ecuación a los datos del artículo de interés combinado con los datos del artículo de referencia.
en la que:
Los parámetros A, B y D son comunes para tanto el artículo de referencia como de prueba y CR es el parámetro de referencia, CA es el parámetro del artículo de prueba y la relación CR/CA es la potencia relativa. El superíndice I es una variable indicadora. Se fija igual a 1 si los datos proceden del artículo de interés y
30 0 si los datos proceden del material patrón.
La potencia relativa de cada artículo de prueba se tradujo a una escala de porcentaje y la potencia relativa se facilitó como salida del programa.
Ajuste de los valores de potencia relativa obtenidos con concentraciones aproximadas: Debido al retraso de tiempo entre la recepción de la muestra y la obtención de una concentración de proteína precisa, una muestra puede
35 probarse en el ensayo a una concentración aproximada y ajustarse los resultados cuando se determine la concentración precisa. Este ajuste se realiza usando la Ecuación 2 de más adelante en la que la potencia relativa determinada en el ensayo se multiplica por la relación de la concentración de CTLA4A29IL104E-Ig usada para fijar el ensayo a la concentración de muestra de CTLA4A29IL104E-Ig determinada.
Ecuación 2:
Potencia relativa inf ormada *Concentración usada40 Potencia relativa inf ormable 5 Concentración determinada
Ejemplo:
La muestra se probó a una concentración de proteína de 25 mg/ml en el ensayo.
La potencia relativa determinada fue del 105%.
Se determinó que la concentración de CTLA4A29IL104E-Ig determinada era 25,5 mg/ml
Potencia relativa informable = (105 * 25) / 25,5 = 103%
Material patrón: El valor de CE50 para el patrón de la salida debe estar entre 5 y 35 ng/ml. La diferencia entre 2500 ng/ml y 0,05 ng/ml de patrones de concentración (intervalo) debe ser ≥40.000 recuentos por segundo (RCP). El valor de R al cuadrado para la referencia debe ser superior a 0,95.
Los valores de potencia relativa del artículo de prueba en la Tabla 9 deben estar entre el 25 y el 175% del patrón de referencia, que es el intervalo del ensayo. Si los valores de potencia relativa están fuera de este intervalo, entonces la muestra debe diluirse o concentrarse con el fin de que se encuentran dentro de este intervalo y la muestra se reanalice.
Línea de linfocitos B de Daudi:
Fuente: Se obtuvieron células de Daudi de ATCC. Se generó un banco maestro que comprendió 64 viales. Se creó un banco de trabajo a partir de un vial del banco maestro después de 4 pases (NOTA: Pase 0 se considera la descongelación y luego se hicieron 3 pases adicionales antes de la generación del banco de trabajo).
Medios: Se cultivan células de Daudi en medio RPMI 1640 (que contiene HEPES y L-glutamina) complementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de piruvato de sodio.
Condiciones de la estufa de incubación: Las células se mantienen en un matraz T ventilado a 37 ºC, 5% de CO2 y 70-90% de humedad.
Protocolo de descongelación: Un vial de células se saca de un congelador de líquido nitrógeno y se descongela en un baño de agua a 37 ºC. El contenido se mezcla con 10 ml de medio de cultivo. Las células se cuentan y luego se recogen por centrifugación a 125 x g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, el sobrenadante se elimina y las células se suspenden en medio fresco a 3 x 105 células viables/ml. Se define que las células están en el pase 0 en este momento.
Propiedades de crecimiento: La línea celular crece en suspensión.
Subcultivo: Los cultivos se mantienen por pase de dos veces a la semana con no más de 5 días entre pases. Las células se someten a pases en un matraz T ventilado con medio fresco entre 0,5 x 105 y 2 x 105 células viables/l. Las células no deben alcanzar una densidad superior a 1,5 x 106 células/ml. Las células deben ser viables más del 80% como se evalúa por tinción con azul de tripano. La fecha y el número de pase deben etiquetarse sobre el matraz T después del pase.
Tiempos de duplicación: El tiempo de duplicación oscila de 18 a 26 horas.
Limitaciones de pases: Las células de un banco de trabajo deben pasarse 3 veces antes de usarse en el bioensayo, es decir, deben estar en el pase 3 o superior. Las células solo deben permanecer en cultivo durante 20 pases. En ese momento debe descongelarse un nuevo vial de trabajo.
Protocolo de congelación: Las células se congelan de 5 a 10 x 106 células / ml en un criovial. El medio crioprotector se prepara suplementando medio de cultivo completo con 5% (v/v) de DMSO. Las células se congelan a una tasa de 1 ºC/minuto hasta que alcanzan la temperatura del nitrógeno líquido (∼190 ºC).
Línea de linfocitos T de Jurkat.CA:
Fuente: Se transfectaron linfocitos T de Jurkat con un plásmido que codifica una molécula de CTLA4-Ig. Se creó un banco de trabajo a partir de un vial del banco maestro después de 3 pases (NOTA: Pase 0 se considera ladescongelación y luego se hicieron 2 pases adicionales antes de la generación del banco de trabajo).
Medios: Se cultivan células de Jurkat.CA en medio RPMI 1640 (que contiene HEPES y L-glutamina) complementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de piruvato de sodio complementado con geneticina (sulfato de G418) a una concentración final de 400 μg/ml.
Condiciones de la estufa de incubación: Las células se mantienen en un matraz T ventilado a 37 ºC, 5% de CO2 y 70-90% de humedad.
Protocolo de descongelación: Un vial de células se saca de un congelador de líquido nitrógeno y se descongela en un baño de agua a 37 ºC. El contenido se mezcla con 10 ml de medio de cultivo. Las células se cuentan y luego se recogen por centrifugación a 125 x g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, el sobrenadante se elimina y las células se suspenden en medio fresco a 3 x 105 células viables/ml. Se define que las células están en el pase 0 en este momento.
Propiedades de crecimiento: La línea celular crece en suspensión.
Subcultivo: Los cultivos se mantienen por pase de dos veces a la semana con no más de 5 días entre pases. Las células se someten a pases en un matraz T ventilado con medio fresco entre 0,5 x 105 y 2 x 105 células viables/l. Las células no deben alcanzar una densidad superior a 1,5 x 106 células/ml. Las células deben ser viables más del 80% como se evalúa por tinción con azul de tripano. La fecha y el número de pase deben etiquetarse sobre el matraz T después del pase.
Tiempos de duplicación: El tiempo de duplicación oscila de 18 a 26 horas.
Limitaciones de pases: Las células de un banco de trabajo deben pasarse 3 veces antes de usarse en el bioensayo, es decir, deben estar en el pase 3 o superior. Las células solo deben permanecer en cultivo durante 20 pases. En ese momento debe descongelarse un nuevo vial de trabajo.
Protocolo de congelación: Las células se congelan de 5 a 10 x 106 células / ml en un criovial. El medio crioprotector se prepara suplementando medio de cultivo completo con 5% (v/v) de DMSO. Las células se congelan a una tasa de 1 ºC/minuto hasta que alcanzan la temperatura del nitrógeno líquido (∼190 ºC).
EJEMPLO 41: Determinación de la unión bio-específica de CTLA4A29IL104E-Ig al receptor de B7.1-Ig por resonancia de plasmones superficiales (BIAcore)
La unión relativa de muestras de CTLA4A29IL104E-Ig al receptor de B7.1-Ig se midió por resonancia de plasmones superficiales usando el instrumento BIAcore. En este ensayo, CTLA4A29Y104E-Ig se une a una proteína de fusión de inmunoglobulina B7.1-Ig derivada de la proteína de la membrana celular de APC B7.1. Después de inmovilizar el receptor de B7.1-Ig a una alta densidad sobre la superficie de un chip sensor activado, material de CTLA4A29IL104E-Ig, controles de calidad y muestras se diluyen para generar sensogramas de unión. La tasa de unión inicial (pendiente)/unidades de resonancia (UR) unidas de CTLA4A29IL104E-Ig para la superficie de B7.1-Ig inmovilizada se mide bajo las condiciones limitadas de transferencia de masa (difusión) sobre esta superficie de B7.1-Ig de alta densidad. La tasa de unión inicial en unidades de resonancia por segundo (UR's) se correlaciona directamente con la concentración bioactiva. Las tasas de unión de muestras se calculan en una concentración activa usando la curva patrón de referencia en la que la tasa de unión de un material de CTLA4A29IL104E-Ig se representa contra la concentración. Los resultados finales se expresan o bien por porcentaje de unión de muestra con respecto a material de CTLA4A29Y104E-Ig o bien como una concentración.
REACTIVOS: Kit de acoplamiento de amina certificado por BIA (el kit contiene un vial de cada uno: 115 mg de Nhidroxisuccinimida (NHS), 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetilo) (EDC) y etanolamina); tampón de regeneración (citrato de sodio 10 mM, NaCl 100 mM, pH 4,0);
INSTRUMENTACIÓN: Instrumento BIAcore C con un ordenador compatible PC (BIAcore (nº de catálogo BR-110051)); software de control BIAcore C versión 1.0.2; software de evaluación de BIAcore 1.0; placa de microtitulación de 96 pocillos de BIAcore U-shape BIAcore (nº de catálogo BR-1005-03); sellante de placas láminas para microplacas de 96 pocillos BIAcore (nº de catálogo BR-1005-78).
MATERIALES
Chip sensor CM5, calidad certificada BIAcore AB (nº de catálogo BR-1000-12) Manual del instrumento BIAcore® C BIAcore (nº de catálogo BR-1005-11) Tampón HBS certificado por BIA HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl BIAcore (nº de catálogo BR1001-88)
150 mM, EDTA 3,4 mM, 0,005% en v/v de tensioactivo P20 Disolución BIAnormalizante (disolución al 40% de glicerol) BIAcore AB (nº de catálogo BR-1002-22) Kit de acoplamiento de amina certificado por BIA 115 mg de N-BIAcore (nº de catálogo BR-1000-50)
hidroxisuccinimida 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetilo) Cloruro sódico (NaCl) Sigma (nº de catálogo S-9888) Tampón acetato pH 5,0 BIAcore (nº de catálogo BR-1003-51) Citrato de sodio (C6H3Na3O) Sigma (nº de catálogo S-4641) Ácido clorhídrico (HCl) Fisher Scientific (nº de catálogo A144-212) Kit de mantenimiento de BIAcore BIAcore (nº de catálogo BR-1006-67)
REACTIVOS
Kit de acoplamiento de amina certificado por BIA. El kit contiene un vial de cada uno: 115 mg de Nhidroxisuccinimida, 750 mg de N-etil-N'-(3-dimetilo) y etanolamina. Separar en alícuotas cada disolución según indicaciones del fabricante y guardar como se indica a continuación:
Guardar alícuotas de 11,5 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS) a -20 ºC. Esta alícuota congelada caduca 2 meses desde la fecha de preparación. Guardar las alícuotas de 75 mg/ml de clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a -20 ºC. Esta alícuota congelada caduca 2 meses desde la fecha de preparación. Guardar las alícuotas de etanolamina-HCl 1,0 M a pH 8,5 a -20 ºC. Esta alícuota congelada caduca 2 meses desde la fecha de preparación. Tampón de regeneración (citrato de sodio 10 mM, NaCl 100 mM, pH 4,0). Pesar analíticamente 1,5 ± 0,1 g de citrato de sodio y 2,9 ± 0,1 g de NaCl. Añadir a 500 ml de agua Milli-Q y ajustar el pH a 4,0 con HCl 1 N. Filtrar la disolución con un filtro de 0,22 μm, luego separar en alícuotas los 500 ml en tubos cónicos de 45 ml/50 ml. La disolución caduca 6 meses desde la fecha de preparación cuando se guarda a 2-8 ºC.
INSTRUMENTACIÓN
Instrumento BIAcore C con un ordenador compatible PC
BIAcore (nº de catálogo BR-1100-51)
Software de control BIAcore C:
BIAcore, como se proporciona con el instrumento
BIAcore C, versión 1.0.2
Software de evaluación
BIAcore, como se proporciona con el BIAcore C, versión 1.0 instrumento
pH-metro
ORION, Modelo 720A+
PREPARACIÓN DEL CHIP SENSOR. Insertar un nuevo chip sensor CM5 en el puerto del casete sobre la unidad detectora del instrumento. Preparar el sistema como se describe en el manual de BIAcore C usando tampón HBS-EP.
OPERACIÓN DEL INSTRUMENTO BIAcore C PARA LA FUNCIÓN DE PROCEDIMIENTO. El instrumento BIAcore C está controlado desde un ordenador PC compatible bajo entorno de Microsoft Windows con el software de control BIAcore C. Se remite a las instrucciones de trabajo “Operación del instrumento BIAcore C” y “Calibración y mantenimiento del instrumento BIAcore C” para el uso y mantenimiento del instrumento BIAcore C.
PROCEDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN DE B7.1-Ig
Preparación de B7.1-Ig: Un vial que contiene B7.1-Ig se descongeló a 22,5 ± 5 ºC y se diluyó a una concentración que inmoviliza 3000-9000 UR, usando tampón acetato 10 mM a pH 5,0 como diluyente. Se descongelaron un vial de cada uno de EDC, NHS y etanolamina del kit de acoplamiento de amina como se ha descrito. Los viales de reactivo y ligando se colocaron entonces en la gradilla de muestras como se enseña por el programa BIAcore, y la inmovilización se inició según las instrucciones del instrumento BIAcore.
PREPARACIÓN DE LA CURVA PATRÓN DE CTLA4A29IL104E-Ig
Patrones y muestras (tales como CTLA4A29IL104E-Ig, etc.) se descongelaron a temperatura ambiente. Los patrones usados para generar una curva patrón se diluyeron a las concentraciones diana de la curva patrón (250, 500, 1000, 2000, 4000 y 8000 ng/ml).
Para la dilución de una muestra patrón (tal como una disolución madre de material de CTLA4A29IL104E-Ig) y la concentración fue 25 mg/ml, podrían realizarse las siguientes diluciones:
i. Diluir 1/50 (500 μg/ml) añadiendo 20 μl a 980 μl de HBS-EP
ii. Diluir a 16 μg/ml añadiendo 30 μl de 500 μg/ml a 908 μl de HBS-EP
iii. Diluir seriadamente en 1/2 etapas (500 μl de dilución previa + 500 μl de HBS-EP) hasta 250 ng/ml
Cada patrón puede analizarse en inyecciones por duplicado que darán 2 valores de pendiente.
MUESTRAS DE CONTROL DE CALIDAD. Las muestras de control de calidad (CC) de CTLA4A29Y104E-Ig se preparan en tampón HBS-EP a los tres niveles de concentración diana de 750, 2500 y 5000 ng/ml y se congelan en viales de plástico de 7 mm como alícuotas de 200 μl a -80 ºC. Las concentraciones de CTLA4A29IL104E-Ig en las muestras de CC se determinan en tres experimentos de análisis de concentración independiente usando este procedimiento. En cada experimento todas las inyecciones de muestra de CC deben ser aceptables, detectándose dentro del ± 20% de las concentraciones nominales. Las muestras de CC clasificadas y congeladas caducan 6 meses después de la preparación. En el día de un experimento, descongelar un vial de cada una de las tres muestras de CC a temperatura ambiente. Poner las muestras de CC en las posiciones de gradilla de muestra como se describe en el asistente del procedimiento y analizar cada CC con inyecciones por triplicado. Alternativamente, los CC pueden prepararse frescos en el día del análisis.
MUESTRAS DE PRUEBA DE CTLA4A29Y104E-Ig. Muestras de CTLA4A29IlI04E-Ig tienen que diluirse a una concentración dentro del intervalo del ensayo (entre 750 y 5000 ng/ml). La muestra con una concentración de CTLA4A29IL104E-Ig aproximada conocida debe diluirse a una concentración diana de 2000 ng/ml. Después de descongelar las muestras a temperatura ambiente se diluyen a una concentración diana de 2000 ng/ml usando tampón HBS-EP. Pueden prepararse diluciones de muestras para análisis en tanto tubos de ensayo de polipropileno certificados de BIAcore como en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Lo siguiente es un ejemplo de la dilución de una muestra de prueba de CTLA4A29IL104E-Ig:
Después de descongelar las muestras a temperatura ambiente, muestras de CTLA4A29IL104E-Ig se diluyeron a una concentración dentro del intervalo del ensayo (tal como entre 750 ng/ml y 5000 ng/ml). Las muestras con concentración de CTLA4A29IL104E-Ig aproximada conocida deben diluirse a una concentración diana de 2000 ng/ml usando tampón HBS-EP en tanto tubos de ensayo de polipropileno certificados de BIAcore como en una placa de microtitulación de 96 pocillos.
Lo siguiente fue un ejemplo para la dilución de una muestra de CTLA4A29IL104E-Ig (concentración = 25,0 mg/ml):
i. Diluir 1/50 (500 μg/ml) añadiendo 20 μl a 980 μl de HBS-EP
ii. Diluir 1/25 (20 μg/ml) añadiendo 30 μl de 500 μg/ml a 720 μl de HBS-EP
iii. Diluir 1/10 (2 μg/ml) añadiendo 100 μl de 20 μg/ml a 900 μl de HBS-EP
Remover con vórtex cada dilución a velocidad moderada durante 2-4 segundos. Las muestras se preparan por triplicado (tres diluciones independientes de la disolución de muestra madre), y cada dilución se analiza con una inyección. Las muestras se prepararon por triplicado (tres diluciones independientes de la disolución de muestra madre), y cada dilución se analizó con una inyección.
ANÁLISIS INICIAL USANDO EL SOFTWARE BIACORE C: Abrir software de control BIAcore C y seleccionar Archivo-gt;Proyecto-gt;Publicado-gt;8164-2 -gt; Asistente del Análisis de Concentración, hacer clic en “Siguiente” y seleccionar una plantilla publicada apropiada para el análisis a realizar, por ejemplo “Análisis de concentración de muestra de CTLA4A29IL104E-Ig.blw”. Entrar el máximo número de muestras para el análisis planeado. Este número de muestras incluye duplicados, así, por ejemplo, para analizar 8 muestras por triplicado debe entrarse el número 24. Seleccionar la celda de flujo (1-4) sobre la que se inmovilizó el ligando de B7.1-Ig. Hacer clic en “Siguiente” y entrar ID de muestra, factores de dilución y número de duplicados. Hacer clic en “Siguiente” y comprobar las posiciones de los viales. En este momento, las posiciones de los viales pueden moverse a las localizaciones deseadas. Hacer clic en “Siguiente” y confirmar los parámetros y elecciones para el ensayo en la pantalla “Preparación para el Análisis”. Hacer clic en “Siguiente” para desplazar hacia abajo. Poner los patrones, CC, disoluciones de regeneración y muestras de prueba en las posiciones apropiadas. Hacer clic en “Inicio” para iniciar el análisis.
EVALUACIÓN DE DATOS. Iniciar el software BIAcore C y abrir el archivo de BIAcore ***.blr que se generó. Entonces seleccionar “Resultados del asistente” del menú “Vista” para evaluar los datos.
Valores ejemplares para la superficie de B7.1-Ig
La masa de B7.1-Ig inmovilizada sobre una celda de flujo activada se expresó como UR (unidades de resonancia). La masa superficial debe ser entre 3000 y 9000 UR para el rendimiento óptimo del ensayo. Si la masa superficial no cumple este valor ilustrativo, puede hacerse un ajuste del tiempo de activación (inyección de EDC/NHS) o la concentración de B7.1-Ig y puede inmovilizarse otra celda de flujo.
Valores ejemplares para el desplazamiento del nivel inicial
El desplazamiento del nivel inicial de cada ejecución se calculó como el porcentaje de cambio del nivel inicial (“valores de respuesta absolutos”) entre cada ciclo con respecto a la masa superficial inmovilizada del ligando. El mayor porcentaje de cambio entre cualesquiera dos ciclos de la ejecución debe ser ≤ 5,0%. Por ejemplo: si el nivel inicial en el ciclo 20 = 13500 UR, el nivel inicial en el ciclo 23 = 13650 UR, y la densidad superficial de B7.1-Ig = 6000 UR, entonces el desplazamiento del nivel inicial = (13650-13500)/6000 x 100 = 2,5%.
Valores ejemplares para los patrones
Los valores ejemplares se aplican a las concentraciones de la curva patrón a o por encima de 500 ng/ml. El coeficiente de variación (% de CV) de los valores en cada valores de pendiente en cada concentración de patrón usada para determinar la curva patrón debe estar dentro de ± 10%. Los valores de concentración calculados medios (ng/ml) a cada concentración de patrón deben estar dentro del 15% del valor diana (nominal). La diferencia entre la concentración calculada y la diana (concentración nominal) puede dividirse entra la concentración diana (nominal) y multiplicarse por 100. Por ejemplo, a patrón 500 ng/ml, la concentración calculada por BIAcore C es 510 ng/ml. El % de deviación se calculará del siguiente modo: (510 ng / ml -500 ng / ml) / 500 ng/ml x 100% = 2,0%.
Valores ejemplares para muestras de CC: El % de CV de los valores de concentración calculados por triplicado para cada concentración diana de muestra de CC debe estar dentro de ± 10%. Los resultados de muestras de CC deben estar dentro de ± 15% de sus valores diana respectivos durante al menos siete de las nueve determinaciones de
CC. La diferencia en los valores de pendiente entre la primera y la última inyección de CC al nivel de 2500 ng/ml debe estar dentro de ± 5,0%. Por ejemplo, si el primer valor de pendiente es 10,366 UR/s y el último valor de pendiente es 10,230 UR/s, el porcentaje de diferencia será el siguiente:
(10,366 – 10,230) / 10,366 x 100% = 1,3%
Valores ejemplares para muestras de prueba
El % de CV de las observaciones por triplicado obtenidas para cada concentración diana de muestra de prueba debe estar dentro del 20%. Los valores de pendiente para una muestra deben estar en el intervalo del procedimiento: pendiente promedio en la muestra de control de calidad 1 ≤ pendiente promedio de la muestra ≤ pendiente promedio de la muestra de control calidad 3.
CÁLCULOS DE RESULTADOS DE MUESTRAS
Para determinar el porcentaje de unión de una muestra de prueba con respecto al material de CTLA4A29IL104E-Ig, el valor de concentración para cada muestra de prueba se calcula a partir de la curva patrón en ng/ml. El asistente de resultados de la instrumentación BIAcore calcula la concentración de CTLA4A29IL104E-Ig en la muestra sin diluir en mg/ml basándose en el factor de dilución entrado para cada muestra.
Determinación del porcentaje de unión: El valor de concentración medio calculado para cada muestra probada puede multiplicarse por 100 y dividirse entre la concentración de proteína indicada de la muestra como se ha determinado por la absorbancia medida a 280 nm (A280). El valor puede entonces informarse al número entero más próximo como porcentaje de unión con respecto a muestras patrón. Por ejemplo, la muestra se diluyó un factor de dilución de 12.500 (concentración de proteína de muestra de aproximadamente 25 mg/ml). La concentración de CTLA4A29Y104E-Ig promedio calculada a partir de las inyecciones por triplicado de la muestra es 25,3 mg/ml. La A280 para la muestra es 24,2 mg/ml. El porcentaje de unión calculado con respecto a muestras patrón pueden ser del siguiente modo: 25,3 mg/ml / 24,2 mg/ml x 100% = 104,545 %.
Plantilla del asistente de inmovilización de CTLA4A29IL104E-Ig
Parámetros de inyección de la inmovilización
EDC/ NHS
B7.1-Ig Etanolamina Citrato
Tiempo de contacto (min)
7 7 6 2
Caudal (μl/min)
5 5 5 10
Volumen de inyección (μl)
35 35 30 20
Puntos del informe de inmovilización
ID
Tiempo(s) Antes /Después Inicio de / Final de Inyección Tipo Con respecto a Ventana (s) Informe
Línea base
10 Antes Inicio de 1ª iny Resp abs -- 5 No
Activación
10 Antes Inicio de 2ª iny Resp rel Línea base 5 No
Nivel de inmovilización
85 Después Final de 3ª iny Resp rel Línea base 5 Sí
Ejemplo 42: Correlaciones entre datos analíticos de hidratos de carbono de CTLA4-Ig y datos farmacocinéticos
Las estructuras de hidratos de carbono sobre CTLA4-Ig desempeñan una función importante en la farmacocinética (PK) de la composición terapéutica de CTLA4-Ig. Se han desarrollado varios procedimientos analíticos para caracterizar estas estructuras de hidratos de carbono. Dos parámetros analíticos se correlacionan bien con la tasa de eliminación: la relación de ácido siálico (NANA) con respecto a la proteína CTLA4-Ig y el porcentaje de dominio III y IV del perfil de hidratos de carbono. Un tercer parámetro (la relación de galactosa con respecto a manosa del análisis de monosacáridos) también parece correlacionarse bien. Por ejemplo, las especificaciones para estos Una etapa importante en el procedimiento de fermentación de CTLA4-Ig puede ser la selección de parámetros de recogida que maximizará el rendimiento (título) del producto final que comprende características especificadas en el presente documento (véase la Tabla 6). Uno de los parámetros (relación de NANA:proteína) es suficientemente rápido y preciso para usarse como uno de los parámetros de recogida. Una proporción molar diana de NANA con respecto a proteína CTLA4-Ig de aproximadamente 8,0 puede asegurar que la mayoría de las recogidas tendrán una relación de NANA gt;7,0. Los potenciamientos durante la purificación pueden producir posteriormente moléculas de CTLA4-Ig con una relación de NANA gt;9,0.
parámetros pueden ser:
Relación de NANA:proteína CTLA4-Ig
≥ 8,0
Perfil de hidratos de carbono
Dominios III y IV ≥ 25% (Procedimiento 1)
Relación de galactosa:manosa
≥ 0,65
CTLA4-Ig es una glucoproteína con varios sitios de glucosilación ligados en N y ligados en O. Las estructuras de hidratos de carbono ligadas en N son normalmente bi-o tri-antenarias y, si están completamente sialiladas, terminan con los hidratos de carbono NANA-Gal-GlcNAc. La mayoría de las moléculas están solo parcialmente sialiladas y contienen algunas cadenas de hidrato de carbono que terminan con Gal o GlcNAc. La ausencia de residuos de ácido siálico terminal (NANA) es un factor que conduce a aumentar las tasas de exposición de la corriente sanguínea. En este ejemplo, los datos se presentan indicando que la galactosa terminal también proporciona alguna protección de la rápida eliminación.
Un parámetro primario usado para evaluar la glucosilación es la proporción molar de NANA:proteína CTLA4-Ig. Estudios PK en mono habían mostrado que podría lograrse eliminación aceptable usando moléculas de CTLA4-Ig con una relación de NANA de 6,9. El primer lote de material de CTLA4-Ig del Procedimiento Y (composición de CTLA4-Ig obtenida del Procedimiento Y) probado en monos tuvo una relación de NANA de 7,1. Sorprendentemente, se encontró que se eliminaba dos veces más rápidamente que el material de CTLA4-Ig con una relación de NANA de 6,9. Una revisión del análisis de monosacáridos de las dos muestras indicó que el material del Procedimiento X tuvo significativamente más galactosa que el material de Procedimiento de CD-CHO. Se desarrolló un procedimiento que incluía galactosa en la alimentación (CD-CHO1). Las CTLA4-Ig producidas por este procedimiento tuvieron mayores niveles de tanto galactosa como de ácido siálico que el material del Procedimiento Y. Los datos analíticos y PK o para material del Procedimiento de CD-CHO1 se tratan más adelante y se compararon con el material del Procedimiento Y y el Procedimiento X.
Procedimientos analíticos
El ensayo del perfil de hidratos de carbono consiste en la eliminación enzimática de las estructuras de hidrato de carbono enteras y su separación por cromatografía de intercambio aniónico. Los picos de hidrato de carbono se resuelven en cuatro o cinco agrupaciones (“dominios”) basadas ampliamente en el número de residuos de ácido siálico en cada estructura. El dominio I está ampliamente asialilado, el dominio II está monosialilado, el dominio III está di-sialilado, el dominio IV está tri-sialilado y el dominio V está tetra-sialilado. El área bajo cada pico o dominio puede determinarse e informarse como un porcentaje del área total bajo todos los picos.
La tasa de eliminación se determinó inyectando monos por triplicado con 10 mg/kg de CTLA4-Ig, luego siguiendo la disminución en la concentración en suero durante un periodo de 28 días. La tasa de eliminación está relacionada con el “área bajo la curva” medida o ABC. El ABC está relacionada con la eliminación, una mayor tasa de eliminación está relacionada con una menor ABC y una menor tasa de eliminación con un mayor valor de ABC. Valores mayores representan eliminación más lenta de CTLA4-Ig.
La FIG. 50 representa varias de las muchas estructuras de hidratos de carbono ligados en N encontradas en proteínas de mamífero. Todas las cadenas comparten una estructura central común que contiene dos GlcNAc y tres residuos de manosa. De este núcleo se extienden dos a cuatro cadenas que consiste en una de tres estructuras: GlcNAc-Gal-NANA, -GlcNAc-Gal o -GlcNAc (FIG. 50, estructuras (1), (2) y (3)). Suponiendo que el ácido siálico (NANA) terminal sea responsable de reducir la eliminación de la proteína de la circulación sanguínea. Llegó por sorpresa que la tasa de eliminación de CTLA4-Ig se duplicó en un estudio PK en mono (Tabla 56) aún cuando la relación de NANA siguió siendo la misma (Tabla 56 -muestras M1 de CTLA4-Ig y CTLA4-Ig (-) Gal, respectivamente, en las FIGS. 51-52). Una diferencia observada entre las muestras, preparadas en diferentes medios, fue la proporción molar de galactosa con respecto a proteína, que fue significativamente mayor en la muestra preparada mediante el Procedimiento X que por el Procedimiento Y (CTLA4-Ig). Esto sugirió que la tasa de eliminación se determinó principalmente por residuos de GlcNAc terminales, y que la galactosa terminal podría proporcionar alguna protección. Para aumentar la galactosilación de CTLA4-Ig se añadió galactosa a la alimentación para el Procedimiento Y. El nuevo procedimiento (CD-CHO1; M2 de CTLA4-Ig en las FIGS. 51-52) aumentó significativamente tanto las relaciones molares de galactosa como de NANA de CTLA4-Ig en los biorreactores.
Se han llevado a cabo más estudios PK en mono. Éstos han incluido producto de CTLA4-Ig producido por los tres procedimientos diferentes (Procedimiento X, Procedimiento Y y el Procedimiento de CD-CHO1; M1 de CTLA4-Ig, CTLA4-Ig (-) Gal y M2 de CTLA4-Ig, respectivamente, en las FIGS. 51-52). Además, se ha probado CTLA4-Ig con muy baja relación de NANA (recuperado de una etapa de lavado en el procedimiento de purificación; véase la FIG. 62). Los datos analíticos y PK de todas las muestras probadas hasta la fecha se recopilan en la Tabla 56. En el estudio PK más reciente (Tabla 56) se evaluó CTLA4-Ig producida de una ejecución por fermentación del Procedimiento Y prolongada (S3 de CTLA4-Ig).
La FIG. 51 muestra la correlación entre la relación de NANA y los valores PK de ABC en mono para todas las muestras en los cuatro estudios. Muestras preparadas por el Procedimiento Y (véase CTLA4-Ig (-) Gal en la FIG. 51) y el Procedimiento de CD-CHO1 (M2 de CTLA4-Ig en la FIG. 51) mostraron una fuerte correlación entre estos parámetros que indica que la relación de NANA tiene un impacto significativo sobre la tasa de eliminación de 5 CTLA4-Ig. El análisis de la línea de tendencia para estos puntos indica que a NANA = 9, CTLA4-Ig preparada por el procedimiento Y (CTLA4-Ig (-) Gal) o de CD-CHO1 (M2 de CTLA4-Ig) se eliminará a aproximadamente la misma tasa que el material del Procedimiento X (M1 de CTLA4-Ig). Reducir la relación de NANA a 8 reduce el ABC en la PK en mono aproximadamente el 25%, mientras que aumentar la relación a 10 aumenta el ABC aproximadamente el 25%. Aunque hay una fuerte correlación entre NANA y ABC dentro del contexto de los Procedimientos Y (CTLA4-Ig
10 (-) Gal) y CD-CHO1 (M2 de CTLA4-Ig), es importante recordar que NANA = 7 para material de X (M1 de CTLA4-Ig) con la misma tasa de eliminación que material de CD-CHO1 (M2 de CTLA4-Ig) con una relación de NANA de 9. Por tanto, la relación de NANA no es únicamente responsable de la determinación de la tasa de eliminación de CTLA4-Ig.
Tabla 56. Evaluación de hidratos de carbono de CTLA4-Ig. M-1 indica que el material de CTLA4-Ig se analizó
15 usando el Procedimiento 1, M-2 indica que el material de CTLA4-Ig se analizó usando un Procedimiento 2 ligeramente diferente. “PA” indica material que es una muestra purificada en proteína A de caldo de fermentación.
Procedimiento de fermentación Procedimiento X ENSAYO PARÁMETRO MEDIA DE
Procedimiento Y MEDIA DE Procedimiento Y MEDIA DE
Ácido siálico NANA:PROT 6,9
7,1 6,9
Perfil de hidratos de carbono % dominio 1 (PA) % dominio 2 (PA) % dominio 3 (PA) % dominio 4 (PA)
% dominio 1 (M-1) 42,4%
49,1% 43,1%
% dominio 2 (M-1) 28,2%
31,1% 32,8%
% dominio 3 (M-1) 21,1%
15,9% 19,7%
% dominio 4 (M-1) 7,4%
3,8% 3,7%
Análisis de Manosa 17,3
17,2 15,0
monosacáridos Fucosa 5,7
5,7 6,7
Galactosa 13,1
8,1 9,1
GalNAc 2,7
3,4 3,2
GalNAc 19,9
21,3 26,3
Gal:Man 75,7%
47,1% 60,7%
PK en mono Gal:GlcNAc 65,8%
38,0% 34,6%
DS02051-1 ABC (h*∀g/ml) 17060 1171
8832 2203
PK en mono DS02051-2 ABC (h*∀g/ml) 15753 4395
7765 1247
PK en mono DS02051-3 ABC (h*∀g/ml) 15459
PK en mono DS03228 ABC (h*∀g/ml)
(continuación) (continuación)
Procedimiento de fermentación ENSAYO PARÁMETRO
Procedimiento Y MEDIA DE CD-CH01 MEDIA DE
Ácido siálico NANA:PROT (M-2)
7,3 9,9
Perfil de % de dominio 1 (PA)
36,0%
hidratos de carbono % de dominio 2 (PA)
35,6%
% de dominio 3 (PA)
23,1%
% de dominio 4 (PA)
5,2%
% de dominio 1 (M-1)
42,9% 33,6%
% de dominio 2 (M-1)
33,5% 31,6%
% de dominio 3 (M-1)
18,4% 27,5%
% de dominio 4 (M-1)
3,6% 5,9%
Análisis de Manosa
19,6 18,0
monosacáridos Fucosa
4,6 4,8
Galactosa
11,1 15,8
GalNAc
3,3 3,3
GalNAc
21,9 22,3
Gal:Man
56,6% 87,8%
PK en mono DS02051-1 Gal:GlcNAc ABC (h*∀g/ml)
50,7% 70,9%
PK en mono DS02051-2 ABC (h*∀g/ml)
7266 787 20445 2425
PK en mono DS02051-3 ABC (h*∀g/ml)
PK en mono DS03228 ABC (h*∀g/ml)
Procedimiento de fermentación ENSAYO PARÁMETRO
Procedimiento X MEDIA DE (d12) CD-CH01 MEDIA DE (d16) CD-CH01 MEDIA DE
Ácido siálico NANA:PROT
2,3 9,8 8,8
Perfil de % dominio 1 (PA)
63,8% 34,1% 42,0%
hidratos de % dominio 2 (PA)
26,5% 28,3% 30,1%
carbono % dominio 3 (PA)
7,3% 25,7% 22,4%
% dominio 4 (PA)
2,4% 10,7% 5,3%
% dominio 1 (M-1)
34,8% 38,2%
% dominio 2 (M-1)
28,7% 34,8%
% dominio 3 (M-1)
30,1% 22,5%
% dominio 4 (M-1)
6,1% 4,3%
% dominio 1 (M-2)
37,8% 44,4%
% dominio 2 (M-2)
34,5% 32,8%
% dominio 3 (M-2)
22,8% 19,6%
% dominio 4 (M-2)
5,0% 3,2%
Procedimiento de fermentación
Procedimiento X (d12) CD-CH01 (d16) CD-CH01
ENSAYO PARÁMETRO
MEDIA DE MEDIA DE MEDIA DE
Análisis de Manosa
17,9 13,6 14,5
monosacáridos Fucosa
5,5 5,4 5,3
Galactosa
4,1 12,8 11,4
GalNAc
2,9 2,1 2,2
GalNAc
22,0 26,3 19,9
Gal:Man
22,9% 94,1% 78,6%
PK en mono DS02051-1 Gal:GlcNAc ABC (h*∀g/ml)
18,6% 48,7% 57,3%
PK en mono DS02051-2 ABC (h*∀g/ml)
2337 414
PK en mono DS02051-3 ABC (h*∀g/ml)
20707 15779
PK en mono DS03228 ABC (h*∀g/ml)
Procedimiento de fermentación ENSAYO PARÁMETRO
(d14) Procedimiento X MEDIA DE (d16) CD-CH01 MEDIA DE (d16) M3 de CTLA4-Ig CD-CH01 MEDIA DE
Ácido siálico NANA:PROT (BAS)
10,0 10,3 7,9
Perfil de % dominio 1 (PA)
38,6% 41,3% 56,2%
hidratos de % dominio 2 (PA)
30,1% 32,2% 26,9%
carbono % dominio 3 (PA)
23,1% 21,9% 13,1%
% dominio 4 (PA)
7,6% 4,6% 3,7%
% dominio 1 (M-1)
39,5% 49,0%
% dominio 2 (M-1)
31,8% 29,1%
% dominio 3 (M-1)
21,9% 15,7%
% dominio 4 (M-1)
7,8% 6,3%
% dominio 1 (M-2)
38,2% 36,2% 47,1%
% dominio 2 (M-2)
33,7% 34,3% 33,6%
% dominio 3 (M-2)
24,6% 21,1% 14,5%
% dominio 4 (M-2)
3,6% 8,4% 4,8%
Análisis de Manosa
14,8 14,7 11,8
monosacáridos Fucosa
5,3 4,9 5,7
Galactosa
13,0 12,6 11,5
GalNAc
2,2 2,2 2,3
GalNAc
20,2 16,3 28,4
Gal:Man
87,8% 85,7% 97,5%
PK en mono DS02051-1 Gal:GlcNAc ABC (h*∀g/ml)
64,6% 77,3% 40,5%
PK en mono DS02051-2 ABC (h*∀g/ml)
PK en mono DS02051-3 ABC (h*∀g/ml)
18750
PK en mono DS03228 ABC (h*∀g/ml)
17739 2546 9425 1504
Se realizó otro estudio PK en mono (Tabla 56) para comparar las tasas de eliminación de CTLA4-Ig producidas por los tres procedimientos diferentes (Procedimiento X, Procedimiento Y y Procedimiento de CD-CHO1). Además, CTLA4-Ig con una relación muy baja de NANA (recuperado de una etapa de lavado en el procedimiento de purificación (PA)) se incluyó en el estudio. CTLA4-Ig preparada por el procedimiento de CD-CHO en tanto biorreactores de 50 l como de 5000 l tuvo relaciones molares de NANA próximas a las del material del Procedimiento X, y en el estudio PK, ambos tuvieron valores de ABC de aproximadamente la mitad del valor del Procedimiento X. CTLA4-Ig producidas por el Procedimiento de CD-CHO1 tuvieron una mayor relación de NANA que el material de Procedimiento X (9,9 frente a 6,9) y un valor de ABC de aproximadamente el 30% superior, que indica una tasa de eliminación más lenta. El material de lavado escasamente sialilado y galactosilado (NANA = 2,3) se eliminó extremadamente rápidamente (ABC = 2337 h-μg/ml frente a 15753 para el material del Procedimiento X).
Otro estudio PK en monos (Tabla 56) comparó CTLA4-Ig preparada por el Procedimiento de CD-CHO1 en biorreactores de 5.000 l y recogidas en diferentes días. Durante el transcurso de una ejecución de la fermentación, la relación de NANA normalmente es máxima aproximadamente en el día 8, luego disminuye gradualmente. De dos ejecuciones, se tomaron alícuotas en los días 12, 14 y 16, luego se purificaron. Después de la purificación, las relaciones de NANA oscilaron de 8,8 a 10,0. Las muestras del día 12 y 14 (NANA = 9,8 y 10,0, respectivamente) tuvieron valores de ABC el 20-30% superiores a los del material del Procedimiento X. La muestra del día 16 (NANA = 8,8) tuvo un valor de ABC casi idéntico al material del Procedimiento X.
Otra herramienta analítica para evaluar la glucosilación de CTLA4-Ig es el perfil de hidratos de carbono. Estructuras de hidratos de carbono ligados en N enteras se eliminan enzimáticamente y se separan por HPLC de intercambio aniónico. Se genera un gran número de picos que se resuelven en cuatro o cinco dominios (véanse las FIGS. 5862). Los dominios I y II son estructuras ampliamente asialiladas y mono-sialiladas, mientras que los dominios III y IV y V son estructuras ampliamente di-y tri-y tetrasialiladas.
Se observó empíricamente que el porcentaje del perfil total en los dominios III y IV se correlacionó bien con el ABC para todas las muestras, que incluye el material del Procedimiento X (FIG. 52). Se espera que la mayoría de las estructuras en estos dominios estén completamente sialiladas y galactosiladas. Usando los datos del grupo M-1, un porcentaje del dominio III y IV de aproximadamente el 29% debe tener la misma tasa de eliminación que el material del Procedimiento X. Los datos del dominio III y IV del Procedimiento 2 son normalmente aproximadamente el 4% inferiores (21% frente al 25%) a los datos generados por el Procedimiento 1.
Además, también se observó que el porcentaje del perfil total en los dominios I y II se correlacionaba bien con el ABC para todas las muestras (FIG. 57). Se espera que la mayoría de las estructuras en estos dominios sean estructuras ampliamente asialiladas y mono-sialiladas. La FIG. 57 muestra que la tasa de eliminación fue mayor en la muestras con un menor porcentaje de dominios I y II frente a aquellas muestras con un mayor porcentaje de dominios I y II. La disminuida glucosilación de los dominios I y II se correlaciona con la presencia supuestamente elevada de péptidos glucosilados en los dominios III y IV.
Aunque la proporción molar de ácido siálico con respecto a proteína se ha usado tradicionalmente para predecir la tasa de eliminación para CTLA4-Ig, se han producido diferentes moléculas de fermentación con la misma relación de NANA pero diferentes tasas de eliminación en estudios PK en monos. Para desarrollar una mejor forma para predecir tasas de eliminación, se evaluaron dos otros conjuntos de datos analíticos (análisis de monosacáridos y perfil de hidratos de carbono) y se compararon con datos PK en monos. El parámetro analítico más predictivo fue el grado de galactosilación de CTLA4-Ig. Para reducir la variabilidad analítica de este ensayo, la proporción molar de galactosa se normalizó a la proporción molar de manosa. La relación de Gal:Man resultante se correlacionó bien con los resultados de ABC del estudio PK en monos para todas las muestras, incluyendo el material del Procedimiento
X. Este resultado está de acuerdo con un modelo de que la tasa de eliminación de CTLA4-Ig se determina principalmente por el número de residuos de GlcNAc terminales expuestos sobre la molécula. Si este modelo es correcto, el grado de galactosilación debe predecir tasas de eliminación mejores que la sialilación. Para asegurar comparabilidad farmacocinética (ABC gt; 75% de material del Procedimiento X), se recomienda una especificación para la relación de galactosa con respecto a manosa de Gal:Man gt; 0,65 para principio activo de CTLA4-Ig a granel purificado (BDS).
Cuando solo se analiza material preparado por el Procedimiento Y o Procedimiento de CD-CHO1, la proporción molar de NANA con respecto a proteína puede predecir tasas de eliminación con exactitud. Esta relación no se aplica, sin embargo, a material preparado por el Procedimiento X. Para ser comparable al material del Procedimiento X, CTLA4-Ig preparada por el Procedimiento Y o el Procedimiento de CD-CHO1 debe tener una relación de NANA 2 unidades mayor (NANA = 9 para CD-CHO1 es comparable a NANA = 7 para el material del Procedimiento X). Debido a que el ensayo de ácido siálico es preciso y tiene un rápido tiempo de entrega de los resultados, es útil como herramienta analítica en el procedimiento para monitorizar la calidad de la CTLA4-Ig durante una ejecución de fermentación.
Para mantener farmacocinética comparable (ABC gt; 75% de referencia), se recomienda una especificación de NANA gt; 8 para BDS purificado. Este valor también representa una diana razonable para recoger las ejecuciones de fermentación. Debido a que el procedimiento de purificación puede aumentar la relación de ácido siálico por al menos 2 unidades, fijar la diana de recogida a NANA = 8 asegurará un valor de recogida real de al menos NANA =
7. El procedimiento de purificación puede aumentar este valor a al menos NANA = 9, que es comparable al material del Procedimiento X y muy por encima de la especificación mínima recomendada anteriormente mencionada del BDS.
El perfil de hidratos de carbono también predijo los resultados PK en monos para tanto el material del Procedimiento X como el material del Procedimiento Y cuando el porcentaje del área bajo los dominios III y IV se comparó con el ABC. Los dominios III y IV consisten ampliamente en estructuras de hidratos de carbono completamente sialiladas y galactosiladas.
Los datos en la Tabla 56 pueden presentarse adicionalmente de manera que se muestre una correlación entre el valor de ABC, el valor de NANA, el valor de Gal y el porcentaje total de la suma del ABC de los dominios II y IV. Véase a continuación:
ABC
NANA Gal Suma de los dominios III y IV
2,337
2,3 4,1 9,7
8,832
7,1 8,1 19,7
7,266
7,3 11,1 22,0
9,425
7,9 11,5 22,0
7,765
6,9 9,1 23,4
15,779
8,8 11,4 26,8
18,750
10 13,0 28,2
17,060 15,753 15,459
6,9 13,1 28,5
17,739
10,3 12,6 29,7
20,445
9,9 15,8 33,4
20,707
9,8 12,8 36,2
Esta tabla anterior muestra que hay una correlación entre la suma de los dominios III (y IV) y el desenlace PK de la composición. El ABC de los dominios III y IV y V está directamente relacionada con la proporción molar de NANA y Gal con respecto a los moles de proteína CTLA4-Ig. Por tanto, las composiciones respectivas se caracterizan porque su perfil de hidratos de carbono contiene una suma de los dominios III y IV, o una suma de los dominios III, IV y V del 18 a aproximadamente el 37% de ABC. En una realización, la suma de los dominios II, IV y V es de aproximadamente el 19 a aproximadamente el 36, es de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 35, es de aproximadamente el 21 a aproximadamente el 34, es de aproximadamente el 22 a aproximadamente el 33, es de aproximadamente el 23 a aproximadamente el 32, es de aproximadamente el 24 a aproximadamente el 31, es de aproximadamente el 25 a aproximadamente el 30, es de aproximadamente el 26 a aproximadamente el 29, es de aproximadamente el 27 a aproximadamente el 28% de ABC. En una realización, las composiciones de CTLA4-Ig se caracterizan porque el dominio III tiene un % de ABC del total del 19 ± 4; y el dominio IV tiene un % de ABC del total del 7 ± 4.
Ejemplo 43: Mapeo de péptidos trípticos de CTLA4-Ig
CTLA4-Ig derivada de células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas es una glucoproteína con una masa molecular de aproximadamente 92500 Dalton. El mapeo de péptidos es un procedimiento altamente sensitivo para determinar la identidad de la estructura primaria de una proteína y es útil en la detección de modificaciones postraduccionales. La proteína se desnaturaliza usando guanidina-HCl, se reduce y se alquila usando DTT y IAA. La proteína se desala usando columnas de NAP-5 y la mezcla de digestión se analiza por cromatografía de fase inversa (C 18). La detección del pico se hace por absorbancia de UV a 215 nm.
REACTIVOS: Disolución de fase móvil A (0,02% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua (v/v)); disolución de fase móvil B (0,02% de TFA en 95% de ACN (acetonitrilo) y 5% de agua (v/v)); agente alquilante (yodoacetamida 200 mM (IAA)); tampón de dilución (Tris 100 mM, NaCl 25 mM, pH 8,0); tampón desnaturalizante (guanidina 8 M, TRIS 50 mM, pH 8,0); tampón de digestión (TRIS 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0); agente reductor (DTT 100 mM).
INSTRUMENTACIÓN: (puede usarse instrumentación equivalente) Columnas NAP-5 (Amersham, cat. nº 17-085302); calentador de columna de HPLC; sistema de HPLC Alliance de Waters con calentador de columna y detector de UV.
Reducción y alquilación: Muestras (por ejemplo, CTLA4A29IL104E-Ig, patrones, etc.) se diluyeron a 10 mg/ml añadiendo
5 agua a un volumen final de 100 μl (1 mg). Se añadieron 560 μl de tampón desnaturalizante y 35 μl de agente reductor (DTT 100 mM) a las muestras de 100 μl, se mezclaron y se centrifugaron en una microcentrífuga durante 3 segundos. Las muestras se incubaron entonces a 50 ºC durante 20 minutos ± 2 minutos. Entonces se añadieron 35 μl de agente alquilante (IAA 200 mM) a cada muestra, y de nuevo se mezclaron las muestras, y se centrifugaron en una microcentrífuga durante 3 segundos. Las muestras se incubaron posteriormente a 50 ºC durante 20 min ± 2
10 minutos, en la oscuridad. Después de equilibrar las columnas NAP-5 vertiendo 3 volúmenes de columna (aproximadamente 7-8 ml) de tampón de digestión, 500 μl de las mezclas reducidas y alquiladas se vertieron sobre las columnas NAP-5, permitiendo que el líquido drenara a través de la columna. Las muestras se recogieron entonces de las columnas NAP-5 eluyendo muestra de la columna con 1 ml de tampón de digestión.
Digestión: Las muestras se digirieron con 20 μl de tripsina (0,5 μg/μl) en un baño de agua a 38 ºC durante 4 horas (±
15 0,5 h). Tras completarse la digestión, las muestras se acidificaron con 2,5 μl de TFA. Las muestras se colocaron entonces en viales de inyector automático para el posterior análisis.
Procedimiento del instrumento: El procedimiento del instrumento se muestra a continuación:
Tiempo (min) Flujo (ml/min) Fase móvil A Fase móvil B
0 0,7 100 0
170,783 17
270,778 22
420,773 27
580,765 35
740,752 48
790,7 0 100
84 0,7100 0
88 0,7100 0
La columna se equilibró con 100% de tampón de fase móvil A durante 25 minutos antes de la primera inyección. La absorbancia de UV se monitorizó a 215 nm mientras que la temperatura de la columna se mantuvo a 37 ºC y la 20 temperatura del inyector automático a 4 ºC. Un blanco de tampón de fase móvil A se ejecutó antes del primer patrón de idoneidad del sistema, después seguido de una única inyección de 50 μl de cada muestra. Una inyección de material de referencia debe agrupar seis inyecciones de muestra. El cromatograma del mapa del péptido generado para una muestra de CTLA4-Ig se representa por la FIG. 53. Las diferencias del tiempo de retención para los picos T2, T3, T15 y T19 (FIG. 53 y Tabla 57) entre los cromatogramas del material de referencia inicial y de agrupamiento
25 debe ser ± 0,5 min.
Tabla 57. Fragmentos teóricamente esperados de CTLA4-Ig digerida con tripsina
Fragmentonº
Residuo nº Masa monoisotópica Masa promedio Secuencia
T1
1-14 1464,8 1465,7 MHVAQPAVVLASSR
T2
15-28 1484,7 1485,6 GIASFVCEYASPGK
T3
29-33 574,3 574,6 ATEVR
T4
34-38 586,4 586,7 VTVLR
T5*
39-83 4895,2 4898,3
T6
84-93 1170,5 1171,4 AMDTGLYICK
T7*
94-128 3993,9 3996,4
T8**
129-132 435,2 435,4 SSDK
T9**
133-158 2687,4 2689,1 THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK
T10
159-165 834,4 835,0 DTLMISR
T11
166-184 2138,0 2139,3 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK
(continuación)
Fragmentonº
Residuo nº Masa monoisotópica Masa promedio Secuencia
T12
185-198 1676,8 1677,8 FNWYVDGVEVHNAK
T13
199-202 500,3 500,6 TKPR
T14*
203-211 1188,5 1189,2 EEQYNSTYR
T15
212-227 1807,0 1808,1 VVSVLTVLHQDWLNGK
T16
228-230 438,2 438,5 EYK
T17
231-232 306,1 306,3 CK
T18
233-236 446,2 446,5 VSNK
T19
237-244 837,5 838,0 ALPAPIEK
T20
245-248 447,3 447,5 TISK
T21
249-250 217,1 217,3 AK
T22
251-254 456,2 456,5 GQPR
T23
255-265 1285,7 1286,5 EPQVYTLPPSR
T24
266-270 604,3 604,7 DELTK
T25
271-280 1160,6 1161,4 NQVSLTCLVK
T26
281-302 2543,1 2544,7 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
T27
303-319 1872,9 1874,1 TTPPVLDSDGSFFLYSK
T28
320-324 574,3 574,7 LTVDK
T29
325-326 261,1 261,3 SR
T30
327-349 2800,3 2802,1 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
T31
350-356 659,3 659,7 SLSLSPG
* Contiene hidrato de carbono ligado en N ** Contiene hidrato de carbono ligado en O
Número de platos teóricos: La eficiencia de la columna, evaluada como el número de platos teóricos, puede medirse cuantitativamente usando el tiempo de retención y la anchura del pico según la Ecuación:
5 en la que: “w” es la anchura del pico en la base medida extrapolando los lados relativamente rectos a la base, “t” es el tiempo de retención del pico medido desde el momento de inyección hasta el momento de elución del máximo del pico. 10 Si N lt;50000, re-equilibrar la columna. Resolución: La resolución (R) entre 2 picos, por ejemplo, el pico T30 y el pico T12 como se indica en la FIG. 53, puede determinarse usando la siguiente ecuación:
en la que: 15 t1, t2 = tiempos de retención de fragmentos del pico T30 y el pico T12, respectivamente
w1, w2 = anchura del pico definida por la tangente en la base de los picos con tiempos de retención t1 y t2, respectivamente. Si R lt; 1,5, la columna debe re-equilibrarse y si el problema persiste la columna debe sustituirse. Valores ejemplares: La diferencia entre las áreas relativas de los picos para los picos T3, T15 y T19 en el artículo de
prueba y el material de referencia debe ser ≤ 10,0 %. El área relativa del pico de un pico se define como el área del pico expresada como un porcentaje del área del pico del pico T2. La diferencia entre las áreas relativas de los picos del artículo de prueba y la referencia de idoneidad del sistema inicial se obtiene como se muestra a continuación. El área relativa del pico (RSX) puede calcularse para cada uno de los picos T3, T15 y T19 en el cromatograma del artículo de prueba usando la fórmula:
en la que:
RSX = área relativa del pico del pico X en el cromatograma
ASX = área del pico X en la muestra y
AS2 = área del pico T2 en la muestra.
Similarmente, las áreas relativas de los picos (RRX) pueden calcularse para cada uno de los picos T3, T15 y T19 en el cromatograma del patrón. La diferencia entre las áreas relativas de los picos en la muestra y el patrón (DX) puede calcularse posteriormente usando la fórmula:
Si un único pico adicional está presente en la muestra, la altura relativa del pico para ese pico en comparación con el pico T11 puede determinarse usando la siguiente fórmula:
Altura relativa del pico RT = (HT/H11) * 100
en la que HT = altura del pico con tiempo de retención t min H11 = altura del pico T11, el pico más alto en el cromatograma.
En una realización, si la altura relativa del pico del nuevo pico es ≤5,0%, entonces el perfil se considera que es coherente con el perfil del patrón de CTLA4-Ig. Si la altura relativa del pico del nuevo pico es gt;5,0%, entonces el perfil se considera que no es coherente con el perfil del material patrón de CTAL4-Ig.
Se adquirieron datos del porcentaje de oxidación usando un ensayo de mapeo tríptico por RP-HPLC que cuantifica el porcentaje del área de oxidación de Met85 en la proteína con respecto a sulfóxido de metionina. El porcentaje de oxidación en el procedimiento se obtiene midiendo las áreas pico UV en el mapa tríptico por RP-HPLC para el péptido tríptico T6, que comprende los residuos 84-93 que contiene Met85, y el péptido tríptico oxidado correspondiente, T6ox, que contiene Met(O)85. El porcentaje del área de oxidación de Met85 a Met(O)85 es proporcional al porcentaje de área del pico de T6ox:
Porcentaje de oxidación = 100 * AT6ox / (AT6ox + AT6)
en la que AT6 = área del pico para péptido tríptico T6 (84-93). AT6ox = área del pico para péptido tríptico T6ox, Met(O)85(84-93).
Se adquirieron datos del porcentaje de desamidación usando un ensayo de mapeo tríptico por RP-HPLC que cuantifica el porcentaje del área de oxidación de desamidación en el ensayo que se obtiene midiendo las áreas pico UV en el mapa tríptico por RP-HPLC para el péptido tríptico T26, que comprende los residuos 281-302 que contienen Asn294, y el péptido tríptico desamidado correspondiente, T26desam1, que contiene isoAsp294. El porcentaje del área de desamidación de Asn294 a isoAsp294, entonces, es proporcional al porcentaje de área del pico de T26desam1:
A
T26desam1
Porcentaje dedesamidación 5 100* A : A : A : A : A
T26 T26desam1 T26desam2 T26desam3 T26desam4
en la que AT26 = área del pico para T26, (281-302) AT26deam1 = área del pico para T26desam1, isoAsp294(281-302). AT26deam2 = área del pico para T26desam2, Asp299 (281-302). AT26deam3 = área del pico para T26desam3, Asp294(281-302). AT26deam4 = área del pico para T26desam4, Asu294(281-302).
EJEMPLO 44: Perfilado de hidratos de carbono de oligosacáridos ligados en N de CTLA4-Ig porcromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección electroquímica
Las estructuras de hidratos de carbono presentes en glucoproteínas pueden afectar su función y eliminación in vivo.
Es por tanto importante monitorizar la coherencia estructural de los hidratos de carbono de lotes recombinantemente producidos de glucoproteínas. CTLA4-Ig es una proteína recombinante que contiene tanto sitios de glucosilación ligados en N como ligados en O (ligados en serina). Aquí se monitorizan hidratos de carbono ligados en N (ligados en asparagina) presentes sobre CTLA4-Ig. En este procedimiento, los oligosacáridos se escinden por digestión
5 enzimática con PNGasa F (péptido: N-glucosidasa F), luego se aíslan por HPLC de fase inversa en un sistema de dos columnas, se separan por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) y se monitorizan por detección electroquímica (amperiometría integrada). El cromatograma generado es el perfil de hidratos de carbono ligados en N, en el que los perfiles de muestras de CTLA4-Ig deben ser similares a tales.
Este procedimiento describe el procedimiento para determinar el perfil de oligosacáridos de HPAEC de
10 oligosacáridos ligados en N liberados de muestras de CTLA4-Ig. Un fin del procedimiento es proporcionar perfiles cromatográficos de oligosacáridos ligados en N de principio activo de CTLA4-Ig que puedan usarse para análisis comparativo entre. La glucosilación sobre CTLA4-Ig contiene oligosacáridos ligados en N. Estos oligosacáridos se liberan por hidrólisis enzimática con PNGasa F durante el transcurso de 22 horas. Los oligosacáridos libres se perfilan usando cromatografía de intercambio aniónico a alto pH empleando detección electroquímica. Los perfiles
15 de oligosacáridos de principio activo se evalúan contra muestras simultáneamente ejecutadas de material de referencia. Los resultados se informan como porcentaje de desviación de dominios seleccionados y picos de los mismos picos en los patrones de referencia.
% de dif
Porcentaje de diferencia
% de DER
Porcentaje de desviación relativa
HPAEC
Cromatografía de intercambio aniónico a alto pH
HPLC
Cromatografía líquida de alta resolución
NaOAc
Acetato de sodio
NaOH
Hidróxido sódico
PNGasa F
Péptido: N-glucosidasa F
MATERIALES. Pueden sustituirse materiales equivalentes, a menos que se especifique de otro modo.
Viales de recuperación total Waters con tapones de Waters Corporation, nº de catálogo 186000234 PTFE/silicona unidos
Dispositivos de filtración centrífuga Microcon YM 10 Millipore, nº de catálogo 42407
RapiGest SF Waters Corporation, nº de catálogo 186001861
INSTRUMENTACIÓN Y CONDICIONES. Puede usarse instrumentación equivalente, a menos que se especifique de 20 otro modo.
Instrumentación:
Sistema de HPLC Alliance Waters Corporation
equipado con: inyector automático (refrigerado), módulo de desgasificación del eluyente Detector electroquímico modelo 2465 Columna: CarboPac PA-1 4 x 250 mm Dionex Corporation, nº de catálogo 35391 Precolumna: CarboPac PA-1 4 50 mm x Dionex Corporation, nº de catálogo 43096 Sistema de recogida de datos Empower Versión 3.2 o versión de BMS
simultáneamente validada Condiciones de cromatografía para perfil de oligosacáridos por cromatografía de intercambio aniónico
Temperatura de la columna 29 ºC
Caudal 1 ml/min
Fases móviles y condiciones del gradiente Programa de gradientes 1 NaOAc: 500 mM Tiempo
2: NaOH 400 mM (min) % de 1 % de 2 % de 3
3: Agua de calidad para HPLC Inicial 0 30 70 0,0 0 3070 11,0 0 3070 12,0 4 3066
(continuación)
20,0 10 30 60 80,0 45 30 25 81,0 0 3070 100 0 3070
Parámetros de Waters 2465
Modo Pulso
Parámetros de Empower Intervalo= 5 μA
E1= +0,05V E2= +0,75V E3= -0,15V t1 =400 ms t2=200 ms t3=400 ms Tiempo de muestreo (ts)=100 ms Constante de tiempo (filtro) t=0,1 s Desplazamiento del intervalo = 5% Polaridad + Temperatura = 29 ºC
NOTA: Equilibrar la columna y el detector con la fase móvil inicial al caudal del análisis durante aproximadamente 2 horas, o hasta que el nivel inicial sea estable antes de hacer las inyecciones.
Temperatura del inyector automático
fijar a: 4 ºC Volumen de inyección 60 μl
Tiempo de ejecución 100 minutos
Tiempos de retención aproximados (TR; minutos) de picos dominantes en cada dominio (véase la Figura 1); los valores puede variar dependiendo del TR del patrón de idoneidad del sistema (IS)
TR aproximados (min) IS: 18,5 Pico 1A: 20,0 Pico 1B: 20,8 Pico 1C: 21,4 Pico 1D: 22,4 Pico 1E: 23,1 Pico 2 31,5 Pico 3: 44,8 Pico 4: 58,5 5
Limpieza de electrodos (Waters 2465). Seguir las instrucciones de limpieza en el manual del detector. Usar la suspensión de diamante proporcionada en el kit de la celda de flujo para limpiar la superficie del (de los) electrodo(s). Si la limpieza no da resultados aceptables, sustituir los electrodos con un nuevo kit de celda de flujo. Re-construir la celda de flujo usando un nuevo separador (50 μm).
10 REACTIVOS. NOTA: Etiquetar y documentar todas las preparaciones de reactivos según procedimientos del departamento.
Preparación de fases móviles para el perfilado de hidratos de carbono de oligosacáridos por HPAEC.
Eluyente de HPAEC 1: Acetato sódico 500 mM (NaOAc). Pesar 20,5 1 ± 0,05 g de acetato sódico (anhidro) en una probeta graduada de 500 ml que contiene 400 ml de agua de calidad para HPLC. Enrasar a 500 ml con agua de calidad para HPLC y agitar durante 5 minutos usando una pipeta serológica de plástico hasta que se mezcle completamente. Filtrar la disolución a través de un filtro de nailon de 0,2 μm. Transferir a una botella de eluyente de
5 1 l. Tapar la botella sin apretar y burbujear con helio durante 20 minutos. Apretar la tapa y presurizar la botella con helio. Guardar la disolución a temperatura ambiente bajo helio durante hasta tres semanas.
Eluyente de HPAEC 2: Hidróxido sódico 400 mM (NaOH). Usando una probeta graduada de 1 l, medir 960 ml de agua de calidad para HPLC y transferir a una botella de eluyente de 1 l limpia. Usando una pipeta de plástico serológica, añadir 40,0 ml de NaOH 10 N directamente a la botella de eluyente y mezclar el eluyente arremolinando. Tapar la botella sin apretar y burbujear con helio durante 20 minutos. Apretar la tapa y presurizar la botella con helio. Guardar la disolución a temperatura ambiente bajo helio durante hasta tres semanas.
Eluyente de HPAEC 3: Agua de calidad para HPLC. Llenar una botella de eluyente de 1 l con aproximadamente 1 l de agua de calidad para HPLC. Poner la botella de eluyente sobre el sistema, tapar sin apretar y burbujear durante aproximadamente 20 minutos. Apretar la tapa y presurizar la botella con helio. Guardar la disolución a temperatura
15 ambiente bajo helio durante hasta tres semanas.
Tampón fosfato de sodio 50 mM, 0,02% de azida de sodio, pH = 7,5. La azida de sodio (NaN3) debe manipularse con cuidado para evitar la inhalación (tóxica) y el contacto con la piel (irritante). Consultar la hoja de MSDS para requisitos adicionales. Después de pesar la NaN3, el área de la balanza debe limpiarse minuciosamente.
NaH2PO4 • H2O 6,9 g
Na N3 0,2 g
H2O volumen final de 1,0 litro
Pesar 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 • H2O y 0,2 g de NaN3 y disolver en 800 ml de H2O de calidad para HPLC en una botella de reactivo de 1 l usando mezcla continua con una barra de agitación magnética. Usando un pH-metro, ajustar el pH de la disolución a 7,5 usando NaOH 10 M. Llevar el volumen final a 1,0 litro usando una probeta graduada de 1 l. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta seis meses. Disolución madre de trabajo de la enzima PNGasa F en tampón fosfato de sodio 50 mM, 0,02% de azida de sodio, pH = 7,5.
Tampón fosfato de sodio 50 mM
25 0,02% de azida de sodio, pH = 7,5. 1,8 ml PNGasa F del kit, nº de catálogo P0704L 0,2 ml
Pipetear 1,8 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM, 0,02% de azida de sodio, pH 7,5 en un vial criogénico de 1,8 ml. Añadir 0,2 ml de PNGasa F del kit y mezclar minuciosamente. Guardar la disolución a -20 ºC o menos durante hasta seis meses. La disolución puede separarse en alícuotas antes de congelarse.
Patrón externo de idoneidad del sistema. Disolución madre de estaquiosa (1,25 mg/ml): Pesar 0,125 g de estaquiosa sobre un papel de pesada. Usar una balanza analítica y transferir a un matraz volumétrico de 100 ml. Enrasar con agua de calidad para HPLC y mezclar minuciosamente. Separar en alícuotas en porciones de 2 ml en crioviales Nalgene. Guardar la disolución a -20 ºC o menos durante hasta seis meses.
Patrón de idoneidad del sistema de estaquiosa (12,5 μg/ml): Pipetear 1 ml de disolución madre 1,25 mg/ml a un
35 matraz volumétrico de 100 ml. Enrasar con agua de calidad para HPLC y mezclar minuciosamente. Separar en alícuotas en porciones de 200 μl en tubos Microfuge de 0,65 ml. Poner los tubos en caja de almacenamiento apropiadamente etiquetada. Guardar la disolución de idoneidad del sistema a -20 ºC o menos durante hasta seis meses.
PATRÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS.
Preparación del material de referencia. A un vial que contiene 1 mg de RapiGest SF liofilizado añadir 625 μl de tampón fosfato de Na 50 mM que contiene 0,02% de azida de Na, pH 7,5. NOTA: Debe usarse un único conjunto de RapiGest SF que contiene tampón para todas las muestras dentro de un conjunto de muestras. Pueden reconstituirse y combinarse varios viales de RapiGest SF para proporcionar volumen adecuado. Añadir a un tubo Eppendorf de 0,65 ml 120 μl de tampón que contiene RapiGest SF. Añadir 40 μl de material de referencia (~ 50
45 mg/ml). La concentración de RapiGest SF final debe ser del 0,12% en peso/volumen. Añadir 40 μl de la disolución madre de trabajo de PNGasa F, mezclar minuciosamente, centrifugar la muestra y poner a 38 ± 2 ºC durante 22 ± 2 horas (baño de agua o el compartimento del inyector automático Alliance). Pipetear la muestra en un filtro centrífugo Microcon YM-10 y centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Poner 200 μl de agua para HPLC en el filtro y aclarar en el filtrado centrifugando durante 30 minutos adicionales a 13.000 g. Remover con vórtex el filtrado combinado durante 15 segundos y centrifugar la muestra durante 10 segundos. Usar una pipeta para transferir la disolución resultante (~ 380 μl) a un vial de inyector automático de recuperación total de HPLC.
Preparación de muestras: A un tubo Eppendorf de 0,65 ml añadir 120 μl del tampón que contiene RapiGest SF.
Añadir 40 μl de muestra de proteína (este volumen debe ser igual a entre 1 y 2 mg de CTLA4-Ig). La concentración de RapiGest SF final debe ser del 0,12% en peso/volumen. Añadir 40 μl de la disolución madre de trabajo de PNGasa F, mezclar minuciosamente con vórtex durante 10 segundos. Centrifugar la muestra y ponerla a 38 ± 2 ºC durante 22 ± 2 horas (baño de agua o el compartimento del inyector automático Alliance). Pipetear la muestra en un filtro centrífugo Microcon YM-10 y centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Poner 200 μl de agua para HPLC en el filtro y aclarar en el filtrado centrifugando durante 30 minutos adicionales a 13.000 g. Remover con vórtex los filtrados combinados durante 15 segundos y centrifugar la muestra durante 10 segundos. Transferir la disolución resultante (~ 380 μl) a un vial de inyector automático de HPLC de recuperación total.
Estabilización de la celda del detector electroquímico: Inyectar 30 μl del patrón externo de idoneidad del sistema de estaquiosa (12,5 μg/ml). Asegurar que la altura del pico para estaquiosa sea ≥ 800 nA. Asegurar que no hay excesivo ruido eléctrico de la celda y el nivel inicial es plano.
Si la sensibilidad de estaquiosa o el nivel inicial es inaceptable, comprobar la composición del tampón, limpiar el electrodo o sustituir el electrodo. Si está presente excesivo ruido, comprobar la celda para asegurar la eliminación de todas las burbujas de aire. Volver a estabilizar la celda y volver a inyectar el patrón de estaquiosa. Si persisten los problemas, tome otras acciones apropiadas o póngase en contacto con su supervisor.
Platos teóricos (N): Determinar el número de platos teóricos (N) basándose en el pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace mediante el sistema de análisis de datos Empower o también puede hacerse manualmente.
EN LA QUE:
t: tiempo de retención medido desde el momento de inyección hasta el momento de elución del pico a la máxima altura
W: anchura del pico por extrapolación de los lados a la base. N debe ser ≥ 6000. Si el recuento de platos es inferior a 6000, ajustar el gradiente de ejecución o sustituir
la columna. Factor de cola (T): Determinar el factor de cola (T) de la columna basándose en el pico de estaquiosa usando la siguiente fórmula. Esto se hace mediante el sistema de análisis de datos EMPOWER o también puede hacerse manualmente.
T = (W0,05/2f)
EN LA QUE:
W0,05: anchura del pico al 5% de altura (0,05h).
f: la medición (anchura) desde el borde frontal del pico a W0,05 hasta el vértice del pico.
T debe ser ≤ 1,2. Si el factor de cola es superior a 1,2, comprobar la composición del tampón, sustituir la columna o limpiar la columna y re-inyectar patrón de idoneidad del sistema.
Verificación del tiempo de retención del patrón de idoneidad del sistema de estaquiosa: El tiempo de retención depende del sistema. El patrón de idoneidad del sistema de estaquiosa debe presentar un tiempo de retención de 18,5 ± 2,0 minutos.
Material de referencia de CTLA4-Ig -Observar el perfil de hidratos de carbono desde el primer material de referencia de agrupamiento inyectado antes de la inyección de muestras. El perfil de hidratos de carbono debe ser similar al mostrado en la Figura 68. Los tiempos de retención absolutos dependen del sistema. Asegurar que la diferencia en los tiempos de retención entre el primer el pico en el dominio I (pico 1A) y el pico principal en el dominio III (pico 3) sea entre 22 minutos y 28 minutos. Si la delineación de picos no se parece a la obtenida en la Figura 68, tomar acciones apropiadas (por ejemplo, comprobar la función del instrumento, limpiar la columna, comprobar/sustituir tampones, sustituir columna) y re-evaluar. El siguiente procedimiento puede usarse para limpiar la columna: apagar la celda y limpiar la columna con 80% de eluyente 1, 20% de eluyente 2 durante 5 minutos, seguido de 50% de eluyente 1, 50% de eluyente 2 durante 10 minutos. Re-equilibrar la columna y la celda (con la celda encendida) a condiciones iniciales y re-evaluar.
SECUENCIA DE INYECCIÓN:
Fijar la secuencia de inyección de oligosacáridos aislados del siguiente modo:
Patrón de estaquiosa (30 μl)
Material de referencia (60 μl)
Muestra(s) (60 μl)
Material de referencia (60 μl) Se recomienda que ≤ cinco muestras se ejecuten entre inyecciones de material de referencia de agrupamiento.
ANÁLISIS DE DATOS: Procesar los cromatogramas. Procesar los cromatogramas para el material de referencia y muestras en EMPOWER. Fijar los parámetros de integración de manera que la delineación del pico y el nivel inicial sea similar al mostrado en la Figura 68, las líneas de integración pueden necesitar ser colocadas manualmente. Realizar cálculos para áreas relativas de dominios y áreas relativas de picos (véanse las tablas incluidas en la Breve descripción de la Fig. 68 y al final de este ejemplo). Determinar los valores promedio para estos parámetros para el material de referencia y para cada muestra si se hicieron inyecciones por duplicado.
Para el material de referencia, determinar la desviación relativa para los dominios I, II, III, picos 1A y 1B para cada duplicado con respecto al promedio de todos los duplicados.
Comparación de perfiles de muestra con perfiles de materiales de referencia.
Comparación visual. Determinar si tanto las muestras como el material de referencia tienen el mismo número de dominios y picos primarios. Los picos primarios son aquellos picos marcados en la descripción de la Figura 68 (picos 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 y 4). Comparación relativa de la cuantificación. Comparar las áreas relativas de muestras (dominios I, II, y III y picos 1A, y 1B; si se hicieron inyecciones por duplicado de muestras, usar sus valores promedio) con las áreas relativas promedio de las inyecciones de material de referencia de agrupamiento. Determinar la diferencia relativa de estas áreas de los valores del material de referencia promedio.
Cálculos. % de área del dominio (área relativa del dominio): Calcular el % de área del dominio para los dominios de los perfiles para el material de referencia y muestras. Se remite a la Figura 68 para patrón de las áreas de dominios. Siguiendo el ejemplo en la Figura 68, calcular el porcentaje de relaciones del dominio usando la siguiente información y fórmula (los tiempos de retención dependen del sistema y reflejan el resultado en la Figura 68:
Dominio I: Suma de las áreas de los picos a tiempos de retención aproximados de 18-24 minutos (Picos 1A
1E)
Dominio II: Suma de los picos de 26-38 minutos
Dominio III: Suma de los picos de 39-50 minutos
Dominio IV: Suma de los picos de 51-64 minutos
Dominio V: Suma de los picos de 65-75 minutos
NOTA: Las ventanas de los tiempos de retención para dominios se desplazarán según variaciones en el rendimiento cromatográfico diario. Por consiguiente, ajustar los tiempos.
Áreadel dominio individual
%deáreadel dominio 5 x100%
Suma detodas las áreas delos dominios
Para los dominios I-III, calcular también los valores promedio en las inyecciones de material de referencia de agrupamiento, además de en las muestras si se hacen inyecciones por duplicado.
% del área del pico (área relativa del pico). Calcular el % del área del pico para los picos 1A, 1B, 1C y 3 de los perfiles para el material de referencia y muestras. Se remite a la Figura 68 para patrón de las áreas de los picos; los tiempos de retención son dependientes del sistema. Calcular el porcentaje de relaciones de picos usando la siguiente información y fórmula:
Áreadel pico individual
%deárea del pico 5 x100%
Suma de todas las áreas de los dominios
Para cada uno de los picos 1A y 1B, calcular también los valores promedio en las inyecciones de material de referencia de agrupamiento, además de en las muestras si se hacen inyecciones por duplicado.
Cálculo de la diferencia de porcentaje de los valores de material de referencia promedio. Usar la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de diferencias en áreas relativas promedio de los dominios I-III, picos 1A y 1B de muestras en comparación con material de referencia:
% de dif = |MR –M| / MR x 100
EN LA QUE:
MR = valor del área relativa promedio de interés para material de referencia
M = valor del área relativa promedio de interés para una muestra
| | = valor absoluto
Resultados: Los resultados que van a informarse son el porcentaje de diferencia calculado del material de referencia para el dominio I, dominio II, dominio II, el pico 1A y el pico 1B. Incluyen un cromatograma representativo integrado para tanto el material de referencia como la muestra. Incluyen los porcentajes de área relativa de los dominios I-III y los picos 1A y 1B a un décimo de un porcentaje para tanto la muestra como el material de referencia (promedio de inyecciones de agrupamiento). Adicionalmente, para cada una de las inyecciones de material de referencia de agrupamiento, el % de las áreas de los dominios para el dominio I, II y III y % de las áreas de los picos para el pico
5 1A y 1 B debe ser estar dentro del 15% de sus valores promedio.
Las Figuras 57-62, 68, 76 y 82-84 muestran datos resultantes de perfiles de oligosacárido ligados en N como se describe en el presente documento. La Figura 68 representa un perfil de oligosacáridos ligados en N típico (dominios I, II, III, IV y V, y picos 1A y 1B dentro del 5% de los promedios de los lotes). Los picos 1A, 1B y 1C representan las estructuras de asialo-oligosacáridos ligados en N de G0, G1 y G2.
10 La Figura 68 muestra un perfil de hidratos de carbono ligados en N típico para una CTLA4-Ig
Dominio / pico
Tiempo de retención (minutos) Porcentaje del área Altura del pico con respecto al pico más alto Porcentaje de área del dominio del pico parental Composición del dominio
Dominio I
19,413 31,3 5 picos
Dominio II
29,076 33,2 5 picos
Dominio III
42,819 24 5 picos
Dominio IV
55,899 9,4 6 picos
Dominio V
67,546 2,2 6 picos
Pico 1A
19,413 7,3 89,8 23,3
Pico 1B
20,29 10,7 100 34,2
Pico 1C
21,032 8,8 94,3 28,1
Pico 1D
21,925 2,8 27,5 8,95
Pico 1E
22,685 1,7 11,8 5,43
Pico 2
30,763 18,3 88,9 55,1
Pico 3
43,823 14,5 57,8 60,4
Pico 4
57,368 4,4 20,1 46,8
composición. La tabla directamente anterior muestra los datos tabulados para el perfil de oligosacárido ligados en N de CTLA4-Ig.
La tabla directamente a continuación muestra intervalos observados de CTLA4-Ig.
Dominio / pico
% de área mínimo % de área máximo
Dominio I
24,5 35,2
Dominio II
26,3 34,1
Dominio III
21,9 31,5
Dominio IV +V
7,9 18,6
El pico 1A
4,5 11,2
El pico 1B
8,7 11,8
EJEMPLO 45: UN BIOENSAYO BASADO EN CÉLULAS IN VITRO PARA CTLA4-Ig
15 Los linfocitos T requieren dos señales para la activación y posterior proliferación. La primera señal se proporciona por la interacción de un péptido antigénico con el complejo TCR-CD3. La segunda señal co-estimulante se produce con la interacción entre CD28 sobre el linfocito T y la proteína B7 sobre una célula presentadora de antígeno. Tras la recepción de estas dos señales, los linfocitos T secretan la citocina Interleucina 2 (IL-2). La liberación de IL-2 conduce a activación y proliferación celular. CTLA4-Ig, un compuesto inmunosupresor soluble, también se une a la
20 proteína B7 sobre la célula presentadora de antígeno, bloqueando así la interacción funcional con CD28 y previniendo la señal co-estimulante que es necesaria para la producción de IL-2.
En este procedimiento, linfocitos T de Jurkat transfectados con el gen luciferasa, bajo el control del promotor de IL-2, se co-estimulan con linfocitos B de Daudi en presencia de anti-CD3. La co-estimulación activa el promotor de IL-2, que a su vez produce proteína luciferasa. La señal luminiscente resultante se mide usando un sistema de ensayo de 25 luciferasa. En este sistema, CTLA4-Ig produce una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa.
Este procedimiento examina el efecto de CTLA4-Ig sobre la señal co-estimulante necesaria para la producción de IL2. La presencia de CTLA4-Ig soluble previene la señalización entre el linfocito T y la célula presentadora de antígeno. Sin esta señal, IL-2 no se produce, previniendo así la expansión clónica de linfocitos T. Se creó un vector con el gen luciferasa usando el promotor de IL-2. Los linfocitos T de Jurkat se transfectaron entonces con este vector indicador. Se seleccionó un clon positivo, Jurkat.CA, y se usó en el procedimiento.
5 Este bioensayo implica estimular linfocitos T transfectados (Jurkat.CA) con anti-CD3 y linfocitos B (Daudi). La coestimulación proporcionada por los linfocitos B se inhibe mediante la adición de CTLA4-Ig. Las células de Jurkat.CA y de Daudi se siembran en los pocillos de una placa de fondo plano opaca blanca de 96 pocillos y se estimula con anti-CD3 en presencia de diferentes concentraciones de CTLA4-Ig. Después de una incubación de 16 a 20 horas a 37 ºC, los pocillos se ensayan para actividad de luciferasa. La inhibición de la co-estimulación por CTLA4-Ig se
10 considera una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa.
REACTIVOS: Medio de cultivo celular de Daudi (10% de suero bovino fetal, 1% de MEM-piruvato de sodio en RPMI 1640); medio de cultivo celular de Jurkat.Ca (10% de suero bovino, 1% de MEM-piruvato de sodio, 400 μg/ml de geneticina en RPMI 1640); medio de bioensayo (0,2 μg/ml de anticuerpo anti-CD3 y 1% de disolución de penicilinaestreptomicina en medio de cultivo celular de Daudi); disolución de luciferasa Bright-Glo del sistema de ensayo
15 (Promega, nº de catálogo E2620).
INSTRUMENTACIÓN: Microscopio invertido Diaphot 200 de Nikon; luminómetro TopCount NXT de Packard; manipulador de líquidos Genesis de Tecan; contador de células Vi-Cell de Coulter; Zymark RapidPlate-96.
Diagrama de flujo del procedimiento:
Preparación de disoluciones de trabajo: 3 ml de disoluciones de CTLA4-Ig (5000 ng/ml) en medio de bioensayo.
Se hicieron curvas de ocho puntos para el patrón, control de calidad y muestras a las concentraciones de 100, 4, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 y 0,002 μg/ml de CTLA4-Ig como se muestra en la Tabla 58 más adelante para concentraciones finales en el ensayo, después dilución doble en la placa, de 50, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05 y 0,001 μg/ml.
Tabla 58. Diluciones usadas para generar curvas patrón.
Punto de la curva
Curva patrón Control de calidad Muestra 1 Muestra 2
1
100 μg/ml 100 μg/ml 100 μg/ml 100 μg/ml
2
4 4 4 4
3
2 2 2 2
4
1 1 1 1
5
0,5 0,5 0,5 0,5
6
0,2 0,2 0,2 0,2
7
0,1 0,1 0,1 0,1
8
0,002 0,002 0,002 0,002
Se añadieron 200.000 células por pocillo a una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad. Se combinaron 12 x 106 células de Jurkat.CA y 12 x 106 células de Daudi en un tubo de centrífuga estéril. Las células se centrifugaron a ~125 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron minuciosamente en 9 ml de medio de cultivo de células de Daudi pipeteando suavemente repetidamente con una 10 pipeta serológica hasta que no fueron visibles grupos de células dando una concentración de 2,7 x106 células/ml. 75 μl de cada disolución de la Tabla 58 se añadieron a los pocillos apropiados de la placa que contenían las células. La(s) placa(s) se tapó (taparon) entonces con TopSeal-A y se incubaron a 37 ºC, 5% de CO2 y 85% de humedad durante 16 a 20 horas. Después de equilibrar las placas y la disolución de luciferasa Bright-Glo a la temperatura del instrumento se añadieron 150 μl de disolución de luciferasa Bright-Glo a cada pocillo simultáneamente y se
15 mezclaron. Una placa se coloca entonces en TopCount NXT inmediatamente después de mezclar para el equilibrio en la oscuridad durante 10 minutos. La señal luminiscente se midió entonces en TopCount NXT usando una integración de 1 segundo por pocillo o según conviniera para el tipo particular de luminómetro usado.
Se registró la salida de TopCount NXT, se leyó en un programa de análisis de patrones y los datos se transformaron haciendo su logaritmo (base 10). Los datos transformados de cada artículo se ajustaron a un modelo logístico de
20 cuatro parámetros como se muestra en la siguiente ecuación:
en la que:
A es la meseta superior de la curva, D es la meseta inferior de la curva, B es el factor de pendiente y C es la concentración que produce un efecto igual al promedio de A y D.
25 Una R2 estadística, y una prueba de la F de falta de ajuste, pueden calcularse para cada artículo. También puede calcularse una relación del mínimo, máximo y pendiente de los artículos de prueba con respecto al material patrón. Además, también pueden calcularse los intervalos de confianza para las relaciones.
La potencia relativa de cada artículo se determinó ajustando una única ecuación a los datos del artículo de interés combinado con los datos del artículo de referencia.
en la que: Los parámetros A, B y D son comunes para tanto el artículo de referencia como de prueba y
CR es el parámetro de referencia, CA es el parámetro del artículo de prueba y la relación CR/CA es la potencia relativa. El superíndice I es una variable indicadora. Se fija igual a 1 si los datos proceden del artículo de interés y 0 si los datos proceden del material de CTLA4-Ig.
La potencia relativa de cada artículo de prueba se tradujo a una escala de porcentaje y la potencia relativa se facilitó como salida del programa.
Los ocho resultados de potencia relativa de la salida de cada uno de los ocho conjuntos de datos analizados pueden promediarse y la desviación estándar puede calcularse usando las Ecuaciones 3 y 4, respectivamente. El resultado promedio se informa como “porcentaje de potencia relativa” redondeado al número entero más próximo.
en la que:
8 es el número de mediciones de potencia
x = mediciones individuales
Ajuste de los valores de potencia relativa obtenidos con concentraciones aproximadas: Debido al retraso de tiempo
15 entre la recepción de la muestra y la obtención de una concentración de proteína precisa, una muestra puede probarse en el ensayo a una concentración aproximada y ajustarse los resultados cuando se determine la concentración precisa. Este ajuste se realiza usando la Ecuación 5 de más adelante en la que la potencia relativa determinada en el ensayo se multiplica por la relación de la concentración de CTLA4-Ig usada para fijar el ensayo a la concentración de muestra de CTLA4-Ig determinada.
20 Ecuación 5:
Potencia relativa inf ormada *Concentración usadaPotencia relativa inf ormable 5 Concentracióndeterminada
Ejemplo: La muestra se probó a una concentración de proteína de 25 mg/ml en el ensayo. La potencia relativa determinada fue del 105%.
25 Se determinó que la concentración de CTLA4-Ig era 25,5 mg/ml Potencia relativa informable = (105 * 25) / 25,5 = 103%
Los valores de potencia relativa del artículo de prueba deben estar entre el 25 y el 175% del patrón de referencia, que es el intervalo del ensayo. Si los valores de la potencia relativa están fuera de este intervalo, entonces la muestra debe diluirse o concentrarse con el fin de que se encuentran dentro de este intervalo y la muestra se
30 reanalice.
EJEMPLO 46: CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE OLIGOSACÁRIDOS LIGADOS EN O
La glucosilación ligada en O de CTLA4-Ig se caracterizó por mapeo de péptidos, seguido de EM/EM-ESI, y por MALDI-TOF.
Análisis de T8 y T9 por mapeo de péptidos con EM/EM-ESI
35 Se realizó una versión modificada del manual del procedimiento de digestión tríptica con EM/EM-ESI en línea usando un espectrómetro de masas Finnigan Ion Trap con el fin de caracterizar los glucopéptidos ligados en O T8 y T9 (se remite a la Tabla 59 para la identidad de péptidos).
La FIG. 63 muestra el mapa de péptidos trípticos de CTLA4-Ig que indica que T8 se eluye al final del frente de disolvente, y T9 se eluye en el hombro de T27.
40 El espectro de masas completo del péptido T8 se muestra en la FIG. 64, en el que el pico 436,2 se corresponde con el MW esperado del péptido sin modificar individualmente cargado T8, y el pico 1092,2 se corresponde con el MW del T8 glucosilado individualmente cargado. La masa correspondiente al pico principal y su estructura (T8-HexNAcHex-NeuAc) se muestra en la Tabla 61.

Tabla 61. Estructuras de oligosacáridos del péptido T8
Glucopéptido
Masa esperada en Daltons Masa observada en Daltons
T8 sin modificar
435 436,2 [M+H]+
1092 1092,2 [M+H]+
El espectro de masas completo del péptido T9 se muestra en la FIG. 65, en la que iones doblemente y triplemente
5 cargados en los glucopéptidos aparecen, correspondientemente a un intervalo de glucoformas heterogéneas. El pico principal 1115,9 se corresponde con el MW de T9 triplemente cargado glucosilado con HexNAc-Hex-NeuAc. Los picos 1213,0 y 1334,8 se corresponden con pesos moleculares de T9 triplemente cargado, glucosilado con HexNAc(NeuAc)-Hex-NeuAc y (HexNAc-Hex-NeuAc)2, respectivamente (Tabla 62). La glucoforma dominante es T9HexNAc-Hex-NeuAc monosialilada mientras que las otras glucoformas están presentes a una abundancia mucho
10 menor.
Tabla 3.2.S.3.1.4.1.T04: Estructuras de oligosacárido del péptido T9
Glucopéptido
Masa esperada en Daltons Masa observada en Daltons
T9 sin modificar
2689 1345,1 [M+2H]2+
3345 1115,9 [M+3H]3+
3637 1213,0 [M+3H]3+
4002 1334,8 [M+3H]3+
Con el fin de determinar sitios ligados en O, el mapeo de péptidos de CTLA4-Ig se realizó como se describe
15 previamente en el Ejemplo 4 y la fracción T8-9 (debido a digestión incompleta por tripsina) se recogió y se sometió a secuenciación de Edman. Los datos de secuenciación mostraron que en el 1º ciclo aparece un pico adicional, además de Ser. El tiempo de retención del pico adicional no concuerda con el de ninguno de los aminoácidos patrón, sugiriendo que Ser en la posición 1 en T8 (Ser 129) se modifica y contiene glucanos ligados en O. La aparición de tanto Ser como el pico adicional indican que Ser está parcialmente modificada. Esto está de acuerdo
20 con los datos de EM para T8. Los experimentos de secuenciación también revelan el sitio ligado en O en T9 como Ser 139. En conclusión, dos sitios ligados en O de glucosilación se identificaron en residuos de aminoácidos de serina 129 y serina 139. El glucano predominante unido a los dos sitios es HexNAc-Hex-NeuAc.
Análisis de MALDI-TOF del péptido T9
El análisis de MALDI-TOF del péptido T9 demuestra la presencia de varias glucoformas (FIG. 66). El pico con un MW de 2690,8 es coherente con el fragmento de T9. El pico con un MW de 2893,7 se correlaciona con T9 más HexNAc. El pico con un MW de 3055,7 se correlaciona con T9 más HexNAc-Hex. El pico con un MW de 3345,8 indica T9 más HexNAc-Hex-NANA. Se detectaron galactosa y N-acetilgalactosamina en T9 basándose en el análisis de monosacáridos, por tanto, se propone que las principales especies ligadas en O en T9 son GalNAc-Gal-NANA. El análisis de MALDI-TOF del péptido T8 no se realizó debido a bajos rendimientos de recuperación.
EJEMPLO 47: VARIANTES DE OXIDACIÓN Y DESAMIDACIÓN EN CTLA4-Ig
La oxidación y la desamidación son variantes de producto comunes de péptidos y proteínas. Pueden producirse durante fermentación, recogida / clarificación de células, purificación, almacenamiento de principio activo / medicamento y durante el análisis de muestras.
La oxidación de proteínas se caracteriza normalmente por la adición química de uno o más átomos de oxígeno a la proteína. Varios aminoácidos, Met, Cys, Tyr, His y Trp, son más susceptibles a la oxidación en comparación con otros aminoácidos naturales. El aminoácido con el mayor grado de susceptibilidad a la oxidación es la metionina. La mayoría de las oxidaciones de proteínas identificadas hasta la fecha han sido la oxidación de metionina a la variante de sulfóxido. La oxidación en proteínas puede producirse por varios mecanismos diferentes. El mecanismo común de oxidación se produce a partir de la exposición a luz o catálisis de metales de transición.
La desamidación es la pérdida de NH3 de una proteína formando un producto intermedio de succinimida que puede experimentar hidrólisis. El producto intermedio de succinimida produce una disminución de la masa de 17 u del péptido parental. La posterior hidrólisis produce un aumento de la masa de 18 u. El aislamiento del producto intermedio de succinimida es difícil debido a la inestabilidad bajo condiciones acuosas. Como tal, la desamidación es normalmente detectable como aumento de masa de 1 u. La desamidación de una asparagina produce tanto ácido aspártico como isoaspártico. Los parámetros que afectan la tasa de desamidación incluyen pH, temperatura, constante dieléctrica del disolvente, fuerza iónica, secuencia primaria, conformación de polipéptidos locales y estructura terciaria. Los residuos de aminoácidos adyacentes a Asn en la cadena de péptidos afectan las tasas de desamidación. La Gly y Ser que siguen a Asn en secuencias de proteínas producen una mayor susceptibilidad a desamidación.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Muestra: Patrón de CTLA4-Ig
Mapeo de péptidos con tripsina/Asp-N/tripsina y quimiotripsina de CTLA4-Ig: Las proteínas se desnaturalizaron y se redujeron en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contiene guanidina 6 M y ditiotreitol 5 mM (DTT). Después de 20 minutos de incubación a 50 ºC se añadió yodoacetamida (IAM) a una concentración final de 10 mM y la muestra se incubó en la oscuridad a 50 ºC durante 20 minutos adicionales. La mezcla reducida y alquilada se cargó sobre una columna NAP-5, y luego se eluyó con Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0. Se añadió tripsina de calidad para secuencia (2% en peso/peso, enzima : proteína) y se incubó durante 4 horas a 37 ºC. En el caso de digestión con Asp-N se añadió Asp-N de calidad para secuencia (4% en peso/peso, enzima : proteína) y la muestra se incubó durante 16 horas a 37 ºC.
En el caso de digestión con tripsina y quimiotripsina, la proteína estuvo en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5. Se añadió tripsina de calidad para secuencia (4%, peso/peso, enzima : proteína) y la muestra se incubó durante 4 horas a 37 ºC. Se añadió quimiotripsina (4%, peso/peso, enzima : proteína) y la muestra se incubó durante 16 horas a 37 ºC. Las muestras se guardaron a -20 ºC después de la digestión.
Las mezclas de péptidos se separaron por elución en gradiente de una columna C 18 de Atlantis (2,1 x 250 mm) sobre una estación de trabajo de HPLC Alliance de Waters (Waters, Milford, MA) a 0,120 ml/min. La columna se conectó directamente al micro Q-Tof (Waters, Milford, MA) equipado con una fuente de pulverización por ionización por electropulverización y se recogieron los espectros de masas. En el caso del mapeo de péptidos con Asp-N, las mezclas de péptidos se separaron sobre una columna Varian C18 (4,6 x 250 mm) a 0,7 ml/min usando la misma estación de trabajo de HPLC. Las columnas se equilibraron con disolvente A (0,02% de TFA en agua) y los péptidos se eluyeron aumentando la concentración de disolvente B (95% de acetonitrilo/0,02% de TFA en agua). Se usó una válvula fraccionadora post-columna para dirigir el 15% del flujo a micro Q-Tof. El instrumento se ejecutó en el modo positivo (m/z 100-2000). El voltaje del capilar se fijó a 3000 V.
Análisis por EM/EM de péptidos: Las fracciones de cromatografía de fase inversa se recogieron y se infundieron en micro Q-Tof a un caudal de 20 μl / minuto. Los espectros de EM/EM se adquirieron usando una energía de colisión optimizada para el péptido individual (que oscila de 25 a 42 eV).
RESULTADOS
Oxidación de CTLA4-Ig: CTLA4-Ig tiene siete metioninas por cadena individual: Met1, Met53, Met54, Met85, Met97, Met162 y Met338. Se usó papeo de péptidos para identificar las variantes de producto oxidativo en cada uno de estos sitios. Las oxidaciones de Met1, Met85 y Met162 se identifican usando la técnica de mapeo de péptidos trípticos (FIG. 67A-B). No se detecta oxidación de Met338. Los fragmentos trípticos que contienen Met53, Met54 o Met97 son péptidos
grandes que contienen hidratos de carbono ligados en N heterogéneos. Estos péptidos no son aceptados para identificación y cuantificación relativa de oxidación. Por tanto, se realizó proteólisis usando múltiples enzimas, que produce péptidos no glucosilados más cortos. El péptido Asp-N EVCAATYMMGN (46-56) y el péptido tríptico / quimiotríptico MYPPPY (97-102) se usan para determinar la oxidación de Met53, Met54 y Met97. La cuantificación 5 relativa de la oxidación de metionina se calcula según el porcentaje de área del pico de los cromatogramas de iones extraídos. Las cantidades relativas de péptidos oxidados se enumeran en la Tabla 63. Se detecta la oxidación de seis de las siete metioninas de CTLA4-Ig por cadena individual. Los picos A y B son las formas individualmente oxidadas del péptido EVCAATYMMGN (46-56) (pico 3). Los péptidos de los picos 2A y 2B son isóbaros y tienen un aumento de masa de 16 u en comparación con la masa de péptidos sin modificar. Cada el pico representa oxidación
10 en diferente Met. El grado de la oxidación es diferente en los dos sitios.
Tabla 63. La oxidación de Met en CTLA4-Ig
Met
Péptido Masa esperada no oxidada Masa observada no oxidada Masa esperada oxidada Masa observada oxidada Porcentaje de oxidación
1
AT1: AMHVAQPAVVLASSR 768,9 (+2) 768,9 776,91 (+2) 776,9 0,9
1
T1: MHVAQPAVVLASSR 733,4 (+2) 733,4 741,4 (+2) 741,4 2,4
53
D5: EVCAATYMMGN 1246,5 1246,6 1262,5 1262,5 3,4
54
D5: EVCAATYMMGN 1246,5 1246,6 1262,5 1262,6 4,3
85
T6: AMDTGLYICK 1171,6 1171,5 1187,6 1187,5 1,0
97
MYPPPY 767,3 767,9 783,3 783,9 1,5
162
T10: DTLMISR 835,4 835,4 851,4 851,4 1,7
338
T30: WQQGDVFSCSVMHEALHNHYTQK 1401,1 (+2) 1401,1 1409,1 (+2)
*Debido a la menor contribución de oxidación de AT1, el porcentaje de oxidación de AT1 no se incluye en el cálculo de la cantidad estimada de oxidación de CTLA4-Ig.
Se calcula que la cantidad estimada total de oxidación de metionina de CTLA4-Ig es del 2,0% para CTLA4-Ig. Esto se calcula sumando el porcentaje de oxidación total en cada sitio y dividiendo entre el número total de metioninas, que es siete. El análisis por EM/EM se realizó sobre los péptidos oxidados y nativos enumerados en la Tabla 63.
15 Todos los péptidos, con la excepción de D5, se secuencian usando EM/EM. El aminoácido oxidado se determina por la diferencia de masa dentro de las series de iones b e y. Los espectros de EM/EM del péptido T1 oxidado y nativo implican los iones precursores doblemente cargados a m/z 741,4 y 733,4. La diferencia de masa es 8 u (para el estado de doble carga), que es 16 u cuando se corrigió para el estado de carga. El péptido tríptico T1 (1-14) contiene el residuo de Met1. El péptido nativo y su derivado oxidado se separan en el nivel inicial por cromatografía
20 de fase inversa. El cromatograma iónico para iones doblemente cargados de T1 y sus derivados se muestra en la FIG. 67A-B. Las series de iones b e y son los iones predominantes producidos en la disociación inducida por la colisión. Los iones y6-y13 tienen las mismas masas iónicas modificadas y sin modificar. El ión b2 del péptido oxidado es 16 u superior al ión b2 correspondiente del péptido nativo. Las series de iones b e y tomadas conjuntamente con las masas de péptidos identifican a la metionina 1 como el aminoácido modificado en el péptido
25 T1. De la misma forma se identifican oxidaciones de Met en los péptidos AT1, T6, T10 y MYPPPY (97-102).
Desamidación de CTLA4-Ig: CTLA4-Ig tiene 15 asparaginas por cadena individual. Se sabe que tres asparaginas se unen a estructuras de hidratos de carbono ligados en N. El mapeo de péptidos se usó para identificar y cuantificar relativamente la desamidación que se produce en los otros 12 residuos de Asn. Las desamidaciones de Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 y Asn344 se identifican por el mapeo de péptidos trípticos por EM/CL (Tabla 64). La
30 cuantificación relativa de la desamidación de asparaginas se calcula según el porcentaje de áreas de picos de los cromatogramas de iones extraídos. Las cantidades relativas de péptidos desamidados se enumeran en la Tabla 64. Se calcula que la cantidad estimada total de desamidación de asparaginas de CTLA4-Ig es del 0,3% para CTLA4-Ig. Esto se calcula añadiendo el porcentaje total de desamidación en cada sitio y dividiendo entre 15. El análisis de EM/EM se realizó sobre los péptidos desamidados y nativos enumerados en la Tabla 64.
35 Tabla 64. La desamidación de Asn en CTLA4-Ig
Asn
Péptido Masa esperada no desamidada Masa observada no desamidada Masa esperada desamidada Masa observada desamidada Porcentaje de desamidación
186
T12: FNWYVDGVEVHNAK 839,4 (+2) 839,4 839,9 (+2) 839,9 0,9
225
904,5 (+2) 904,5 905,0 (+2) 905,0 / 905,0 1,5/0,8
271
T25: NQVSLTCLVK 1161,6 1161,7 1162. 6 1162,7 0,3
294
1272,6 (+2) 1272,6 1273,1 (+2) 1273,1 1,2
344
1401,1 (+2) 1401,2 1401,6 (+2) 1401,7 0,2
El aminoácido desamidado se determina por la diferencia de masa dentro de las series de iones b e y. Por ejemplo, si hay dos picos desamidados para el péptido T15 – masas 905,0 u, el pico 1 eluye antes que el pico nativo; el pico 3 eluye después del pico nativo. Los péptidos trípticos y sus formas desamidadas se separan en el nivel inicial sobre la columna de fase inversa. El análisis de EM/EM se realizó sobre los péptidos trípticos y los péptidos desamidados se enumeran en la Tabla 64. Los picos 1-3 contienen los mismos iones y1 y y2, que indica entonces que los aminoácidos del extremo C son los mismos para los tres picos; sin embargo, los iones y3-y14 de los picos 1 y 3 son 1 u superior a los iones correspondientes del pico 2. La diferencia de masa entre y2 y y3 es 114 u para el pico 2; esto se corresponde con un residuo de Asn. Las 115 u para los picos 1 y 3 es un aumento de masa de 1 u en comparación con la masa del residuo de Asn; esto se corresponde con tanto ácido aspártico como isoaspártico. De la misma forma se identificaron desamidaciones en T12, T25, T26 y T30 y los iones de fragmento identifican los sitios de modificación.
Las desamidaciones de asparagina y las oxidaciones de metionina se determinan a partir de análisis de EM/CL y EM/CL/EM de la escisión de endopeptidasa de CTLA4-Ig. Las modificaciones se identifican por desplazamientos en las masas entre los péptidos modificados y sin modificar. Los aminoácidos modificados se identifican por secuenciación de EM/EM. Seis oxidaciones de metionina y cinco desamidaciones de asparagina por cadena individual están presentes en el material de CTLA4-Ig en un pequeño porcentaje. Se encuentra que todas las Met1, Met53, Met54, Met85, Met97 y Met162 de CTLA4-Ig se oxidan. Se encuentra que estas oxidaciones determinadas a partir de CTLA4-Ig son inferiores al 2,5% de todas las metioninas de CTLA4-Ig. Se encuentra que todas las Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 y Asn344 de CTLA4-Ig se desamidan en bajas cantidades. Se encuentra que estas desamidaciones determinadas a partir CTLA4-Ig son inferiores al 0,5% de todas las asparaginas de CTLA4-Ig.
Ejemplo 48 -Ensayos de endotoxina bacteriana para CTLA4-Ig y CTLA4A29IL104E-Ig
En una realización, el principio activo de la composición de CTLA4-Ig tiene menos de o igual a 0,15 UE/mg de endotoxina bacteriana. CTLA4-Ig se ensaya para la presencia de endotoxinas bacterianas usando la técnica de coagulación del gen de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) basada en USPlt;85gt;. En la preparación y aplicación del ensayo, tómense precauciones en la manipulación de los especímenes con el fin de evitar contaminación microbiana macroscópica; tratar cualquier recipiente o utensilio empleado para destruir endotoxinas externas que puedan estar presentes sobre sus superficies tales como calentando en un horno de calor seco usando un ciclo validado.
Reactivo de LAL: (Associates of Cape Cod, Inc.-o equivalente) Limulus liofilizado
El reactivo de lisado de amebocitos (LAL) tal como Pyrotell debe almacenarse según instrucciones del fabricante. El reactivo de LAL reconstituido puede mantenerse congelado durante no más de un mes, y no debe descongelarse o congelarse más de una vez.
Patrones de endotoxina: (Associates of Cape Cod, Inc.-o equivalente) La endotoxina patrón de control (EPC) usada en las pruebas debe ser identificable y se normaliza contra endotoxina patrón de referencia (RSE). Guardar recipientes sin reconstituir de endotoxina en un refrigerador; una vez reconstituida, pueden mantenerse a 2 º-8 ºC durante no más de 14 días, a menos que la validación para periodos prolongados muestre reactividad adecuada.
Prueba de lotes de producción
La falta de inhibición o potenciamiento del producto del procedimiento de LAL debe ser validada para cada formulación de fármaco. La prueba de lotes de producción se realiza usando tres unidades individuales que representan el principio, la mitad y el fin de la producción. Estas unidades pueden ejecutarse individualmente o agruparse. Debe incluirse un control de producto positivo representativo de la muestra a la concentración de prueba, inoculada con dos veces la cantidad de EPC (o RSE) como la sensibilidad marcada del lisado, para una prueba válida. Ajustar el pH de manera que el producto final/disolución de lisado esté en el intervalo de 6,0 a 8,0, usando HCl libre de endotoxinas estéril, NaOH o tampón adecuado. En algunas situaciones puede ser útil usar un agente de tamponamiento tal como Pyrosol como alternativa al ajuste del pH. Se remite a las indicaciones del fabricante para uso específico.
Uso de agente de tamponamiento para reconstitución del lisado
Se usa un agente de tamponamiento tal como Pyrosol (Associates of Cape Cod, Inc.) para reconstituir el lisado usado para la prueba y se diseña para amplificar la capacidad de tamponamiento del lisado. El lisado reconstituido con Pyrosol puede usarse para probar muestras o diluciones de muestras que de otro modo pueden requerir el ajuste de pH con ácido o base o que precipitan con el ajuste de pH. Cuando se combina con la muestra de prueba, el lisado reconstituido con Pyrosol da un color rosa para indicar que el pH está en el intervalo para una prueba válida. Si está fuera de ese intervalo, el color será amarillo o púrpura; en este caso, la muestra de prueba requeriría ajuste del pH adicional. Los procedimientos específicos dictarán el uso de Pyrosol para la reconstitución de lisado.
Uso de tampón inhibidor de glucanos para la reconstitución de lisado
Se usa un tampón inhibidor de glucanos tal como Glucashield (Associates of Cape Cod, Inc.) para reconstituir el lisado usado para la prueba y se diseña para bloquear la posible interferencia de glucanos. El lisado reconstituido con Glucashield puede usarse para probar muestras o diluciones de muestras que pueden contener contaminación por glucanos. La interferencia de la contaminación de glucanos puede dar positivos falsos en ciertos materiales de prueba, así el uso de un lisado reconstituido con Glucashield puede bloquear o reducir la interferencia, permitiendo un número reducido de positivos falsos. Los procedimientos específicos dictarán el uso de Glucashield para la reconstitución de lisados.
Diluciones de muestras
Si fuera necesario aproximar el nivel de concentración de endotoxinas en la muestra, preparar una serie aproximada de diluciones de la muestra en agua libre de endotoxinas estéril. Remover con vórtex y añadir 0,1 ml de cada preparación que va a probarse a cada uno de dos tubos de ensayo de vidrio de 10 x 75 mm libres de endotoxinas estéril.
Preparación de disoluciones patrón de endotoxinas para la curva patrón
Reconstituir el vial de endotoxina con agua libre de endotoxinas según las instrucciones del fabricante. Mezclar el vial vigorosamente en una mezcladora de vórtex intermitentemente durante 30 minutos. Preservar el concentrado en un refrigerador a 2º-8 ºC durante no más de 4 semanas. Mezclar vigorosamente usando una mezcladora de vórtex durante no menos de 3 minutos antes de uso. Consultar el Certificado de Análisis del fabricante para verificar la concentración de la disolución madre de endotoxinas, y preparar una serie de diluciones de endotoxina patrón, diseñada para agrupar el punto final, tal como en el siguiente ejemplo:
0,5 ml (1000 UE/ml) + 9,5 ml de agua libre de endotoxinas = 50 UE/ml
5,0 ml (50 UE/ml) + 5,0 ml de agua libre de endotoxinas = 25 UE/ml
1,0 ml (25 UE/ml) + 9,0 ml de agua libre de endotoxinas = 2,5 UE/ml
1,0 ml (2,5 UE/ml) + 9,0 ml de agua libre de endotoxinas = 0,25 UE/ml
5,0 ml (0,25 UE/ml) + 5,0 ml de agua libre de endotoxinas = 0,125 UE/ml
5,0 ml (0,125 UE/ml) + 5,0 ml de agua libre de endotoxinas = 0,06 UE/ml
5,0 ml (0,06 UE/ml) + 5,0 ml de agua libre de endotoxinas = 0,03 UE/ml
5,0 ml (0,03 UE/ml) + 5,0 ml de agua libre de endotoxinas = 0,015 UE/ml
Asegurarse de remover vigorosamente con vórtex cada dilución durante al menos 30 segundos antes de proceder a la siguiente dilución. Incluir un control de agua negativo del diluyente usado. Remover con vórtex y añadir 0,1 ml de cada una de las concentraciones de 0,125 UE/ml, 0,06 UE/ml, 0,03 UE/ml, 0,015 UE/ml (o curva alternativa) y el control de agua negativo, a cada uno de dos tubos de ensayo de vidrio de 10 x 75 mm libres de endotoxinas estériles para proporcionar dos curvas duplicadas.
Preparación de la disolución de reactivo de LAL
Sacar el reactivo de LAL liofilizado del congelador. Añadir asépticamente 5,0 ml de agua libre de endotoxinas (a menos que se indique de otro modo por un procedimiento específico para usar un tampón de reconstitución) al vial. Agitar con movimientos circulares o rodar el vial para disolver el reactivo.
Preparación de control de producto positivo
Todos los productos deben probarse con un control de producto positivo. Se remite al procedimiento específico aplicable para instrucciones sobre la preparación del control positivo. Si no se proporcionan instrucciones, preparar el control de producto positivo para que contenga una adición de endotoxina a 2X el nivel de sensibilidad del lisado, en combinación con el producto a su nivel de prueba. Cuando se prueba agua para inyección o agua para procedimientos de alta calidad, usar una dilución del patrón de endotoxina reconstituido de manera que cuando se añada a la muestra la concentración de endotoxina sea 2X la sensibilidad de la disolución de LAL. Por ejemplo, si la sensibilidad del lisado = 0,06 UE/ml, añadir 0,1 ml de una disolución de endotoxina de 2,5 UE/ml a 1,9 ml de muestra de prueba (en la forma que se añade a la disolución de LAL) = 0,125 UE/ml. El volumen de la disolución de endotoxina no es superior a 0,1 ml y la dilución global no es inferior a 1:20.
Procedimiento de prueba
1.
Dispensar asépticamente 0,1 ml de la disolución del reactivo de LAL a cada uno de los tubos de muestra de prueba y tubos de patrón de endotoxina, siendo cuidadosos de no contaminar de forma cruzada entre los tubos. NOTA: Poner cualquier reactivo restante en un congelador a aproximadamente menos 10 ºC a menos 25 ºC.
2.
Se remite al prospecto del lisado específico para las instrucciones de mezcla de la mezcla de producto-lisado.
3.
Poner cada tubo en un dispositivo de incubación tal como un baño de agua o bloque térmico mantenido a 37º ± 1 ºC. Registrar el tiempo de inicio de la incubación y la temperatura del baño de agua o bloque térmico.
4.
Incubar cada tubo, sin tocar, durante 60 ± 2 minutos.
5.
Tras la incubación, registrar el tiempo final de incubación y observar cada tubo invirtiendo suavemente el tubo 180º. Un resultado positivo se indica por un gel firme que se mantiene firme cuando se invierte cuidadosamente, un resultado negativo se caracteriza por la ausencia de un gel tal, o por formación de un gel viscoso que no mantiene su integridad. Manipular los tubos cuidadosamente y evitar someterlos a vibraciones que podrían producir observaciones negativas falsas.
Evaluación
La menor concentración en cada serie de duplicados que da un resultado positivo se llama el punto final. Calcular el punto final medio geométrico para la prueba por el siguiente procedimiento: Media geométrica = el anti-logaritmo de la suma logarítmica de los puntos finales de gelación dividido entre el número de ensayos de punto final duplicados. La prueba es válida siempre que el punto final medio geométrico esté dentro de una dilución doble de la sensibilidad del lisado marcado, el control de producto positivo sea positivo y el control de agua negativo sea negativo. Determinar el nivel de endotoxina bacteriana aproximada en o sobre el artículo de prueba comparando la sensibilidad del lisado marcado con los resultados positivos o negativos acoplados a los factores de dilución del artículo probado. El artículo cumple los requisitos de la prueba si no hay formación de un gel firme al nivel de endotoxina especificado en las monografías individuales o especificación.
Procedimiento para CTLA4A29IL104E-Ig
Este procedimiento se usa para cuantificar endotoxinas bacterianas en muestras de principio activo de CTLA4A29IL104E-Ig y medicamente usando el procedimiento de LAL turbidimétrico cinético. Los resultados se informan como UE/ml y UE/mg de equivalente de medicamento.
Términos:
LAL – Lisado de amebocitos de Limulus
EPC -Endotoxina patrón de control
UE -Unidades de endotoxina de la Farmacopea estadounidense
UE/mg -Unidades de endotoxina de la Farmacopea estadounidense por miligramo
UE/ml-Unidades de endotoxina de la Farmacopea estadounidense por mililitro
ARL -Agua para reactivo de LAL
Disolución turbidimétrica de lisado de amebocitos de Limulus (Pyrotell-T®). Dejar que los viales de Pyrotell-T® y PyroSol® se calienten a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de abrirlos. Quitar el sello metálico de Pyrotell-T® y quitar asépticamente el tapón. Reconstituir Pyrotell-T® con 5,0 ml de tampón de reconstitución PyroSol®. Agitar con movimientos circulares la botella suavemente para mezclar hasta que se disuelva completamente. Reconstituir el tampón inmediatamente antes de uso. Pyrotell-T® reconstituido puede mantenerse a 2-8 ºC durante no más de 24 horas. Cubrir la tapa del recipiente con una capa de Parafilm®.
Disolución de endotoxina patrón de control. Dejar que el vial de EPC (1.2) se caliente a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de abrirlo. Quitar el sello metálico del vial y quitar asépticamente el tapón. Levantar cuidadosamente el tapón justo lo suficiente para permitir que entre el aire, rompiendo así el vacío. Reconstituir la endotoxina patrón de control (EPC) con 5,0 ml de ARL (1.4). Sellar con Parafilm®. Remover con vórtex vigorosamente durante un minuto, a intervalos de 5-10 minutos durante un intervalo de 30-60 minutos a temperatura ambiente. EPC está entonces lista para su uso. Se remite al certificado de análisis del fabricante para obtener la potencia de la endotoxina patrón de control (EPC) en UE-USP por vial frente al lote específico de Pyrotell-T®. Calcular las UE-USP/ml de la EPC en el vial. La EPC reconstituida puede mantenerse a 2-8 ºC durante 30 días.
5 Después de cada uso, sellar el recipiente con Parafilm® nuevo.
Ejemplo:
Para un vial que tiene una potencia de 6.000 UE-USP/vial reconstituidas con 5,0 ml de ARL, la potencia sería
1.200 UE-USP/ml.
6.000UE/vial
Potencia 5 5 1.200UE/ml
5,0ml
10 Fijar los parámetro del ensayo en el software Pyrosoft-11®. Parámetros generales. Fijar los parámetros en la Tabla de información general de la prueba como se muestra en la siguiente tabla.
Información general de la prueba
Parámetro
Valor
Intervalo de temperatura válido mín.
36,5
Intervalo de temperatura válido máx.
37,5
Intervalo para la recuperación de adiciones mín.
50
Intervalo para la recuperación de adiciones máx.
200
DO umbral (mAbs)
20
DO guardada máx. (mAbs)
100
Tiempo de prueba máximo (min)
120
Nivel inicial de adyuvante activo
Comprobar
Final automático
Sin comprobar
Comprobar control negativo
Sin comprobar
Opciones
Parámetro
Valor
Marcar Coeficiente de correlación
Comprobado
Mostrar Coeficiente de correlación
No comprobado
Marcar Coeficiente de variación
No comprobado
Extrapolar más allá
No comprobado
ID de la prueba automática
No comprobado
Mostrar Resultados aprobados/suspensos
Comprobado
Impresión automática
No comprobado
Asignaciones de tubos -Ejemplo
Tubo nº
Descripción de la muestra Concentración de patrón/adiciones Unidades Dilución de muestra *
Control negativo
UE/ml
Control negativo
UE/ml
Patrón
0,064 UE/ml
Patrón
0,064 UE/ml
Patrón
0,032 UE/ml
Patrón
0,032 UE/ml
Patrón
0,016 UE/ml
Patrón
0,016 UE/ml
Patrón
0,008 UE/ml
Patrón
0,008 UE/ml
Patrón
0,004 UE/ml
Patrón
0,004 UE/ml
Patrón
0,002 UE/ml
Patrón
0,002 UE/ml
Muestra 1
UE/ml 1:1
Muestra 1
UE/ml 1:1
Muestra 1 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 1 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 2
UE/ml 1:1
Muestra 2
UE/ml 1:1
Muestra 2 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 2 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 3
UE/ml 1:1
Muestra 3
UE/ml 1:1
Muestra 3 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 3 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 4
UE/ml 1:1
Muestra 4
UE/ml 1:1
Muestra 4 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Muestra 4 Adición
0,016 UE/ml 1:1
Control de agua positivo
0,016 UE/ml
Control de agua positivo
0,016 UE/ml
Preparar concentraciones de la curva patrón. Preparar disolución madre de trabajo de endotoxina patrón de control (EPC, 2.2) a 4 UE-USP/ml. Preparar una disolución de trabajo de EPC a una potencia de 4 UE/ml. Calcular el volumen de ARL necesaria para la dilución usando la Ecuación 1. Añadir 20 μl de disolución de EPC (2.2) a la cantidad apropiada (Ecuación 1) de ARL (1,4) en un tubo de poliestireno (1.9). Remover con vórtex la dilución durante 30 segundos.
Ejemplo:
Para disolución de EPC a una potencia de 1.200 UE/ml añadir 20 μl de disolución de EPC a 5.980 μl de ARL.
∀
20 l*1.200UE/ml 20 l
Preparar disolución madre de trabajo de EPC a 0,64 UE/ml. Preparar una disolución de trabajo de EPC a una 10 potencia de 0,64 UE-USP/ml añadiendo 1,6 ml de disolución madre de EPC a 4 UE-USP/ml a 8,4 ml de ARL en un tubo de poliestireno. Remover con vórtex durante 30 segundos.
Preparar disoluciones madre de patrón. Se preparan disoluciones madre patrón a 0,128, 0,064, 0,032, 0,016, 0,008 y 0,004 UE/ml a partir de la disolución de trabajo de EPC en tubos de poliestirenos. Remover con vórtex cada tubo
∀
durante 30 segundos después de la dilución. Un esquema de dilución se muestra en la siguiente tabla.
15 Esquema de dilución para disoluciones madre patrón
4 3
1 0
Volumen ARL
5
8
4UE/ml
Volumen (μl) de concentración (UE/ml)
ARL (ml) Concentración de la disolución madre final (UE/ml)*
2 ml de 0,64 UE/ml de disolución
8 0,128
4 ml de 0,128 UE/ml de disolución
4 0,064
4 ml de 0,064 UE/ml de disolución
4 0,032
4 ml de 0,032 UE/ml de disolución
4 0,016
4 ml de 0,016 UE/ml de disolución
4 0,008
4 ml de 0,008 UE/ml de disolución
4 0,004
* La dilución doble final se produce en los tubos de reacción.
Preparación de muestras. Preparación de muestras de principio activo. Preparar una dilución de muestra a 0,25 mg/ml. Calcular el volumen de ARL necesario para la dilución usando la ecuación de más adelante. Quitar cuidadosamente la tapa del recipiente de muestra y añadir 50 μl de muestra a la cantidad apropiada (ecuación de
20 más adelante) de ARL en un tubo de poliestireno para preparar a 0,25 mg/ml de disolución. Remover con vórtex la muestra durante 30 segundos. Cubrir la parte superior del recipiente de muestra con capa de Parafilm®.
Ejemplo:
Para una muestra que tiene una concentración de 24,7 mg/ml añadir 50 μl (0,05 ml) de muestra a 4,89 ml de agua
25 Ecuación 2:
4 3
20,05*Concentración deproteína (mg /ml)
1 0
∀
0,05 l
Preparación de muestras liófilas de medicamento. NOTA: Un único lote de medicamento consiste en tres muestras separadas, “principio”, “mitad” y “fin”. Reconstituir un vial de medicamento con agua para reactivo de LAL según las especificaciones de la Identificación de Producto (IP). Diluir la muestra reconstituida a 0,25 mg/ml. Calcular el
30 volumen de ARL necesario para la dilución usando la Ecuación 2. Cuidadosamente quitar la tapa del recipiente de muestra y añadir 50 μl de muestra a la cantidad apropiada (Ecuación 2) de ARL en un tubo de poliestireno para preparar una disolución de 0,25 mg/ml. Remover con vórtex la muestra durante 30 segundos. Cubrir la tapa del recipiente de muestra con Parafilm®.
Preparación de muestras listas para usar de medicamento. Diluir la muestra a 0,25 mg/ml. Calcular el volumen de
Volumen de ARL(ml)
5
8
0,25mg /ml
ARL necesario para la dilución usando la Ecuación 3. Quitar cuidadosamente la tapa del recipiente de muestra y añadir 10 μl de muestra a la cantidad apropiada (Ecuación 3) de ARL en un tubo de poliestireno para preparar una disolución de 0,25 mg/ml. Remover con vórtex la muestra durante 30 segundos. Cubrir la tapa del recipiente de muestra con Parafilm®.
5 Ejemplo:
Para una muestra que tiene una concentración de 125,0 mg/ml añadir 10 μl (0,01 ml) de muestra a 4,99 ml de agua
Ecuación 3:
4 0,01*Concentracióndeproteína(mg/ml)1
Volumen de ARL(ml) 522 8 0,01∀l
3 0,25mg/ml 0
10 Placebo listo para usar de medicamento. Diluir el placebo (como si fuera a una concentración de proteína de medicamento nominal de 125 mg/ml) a 0,25 mg/ml. Esto es equivalente a una dilución 1:500. Calcular el volumen de ARL necesario para la dilución usando la Ecuación 3. Quitar cuidadosamente la tapa del recipiente de muestra y añadir 10 μl de muestra a la cantidad apropiada (Ecuación 3) de ARL en un tubo de poliestireno para preparar una disolución equivalente de 0,25 mg/ml.
15 Control de agua positivo. El control positivo se prepara a partir de la curva patrón añadiendo 100 μl de 0,032 UE/ml de patrón a 100 μl de ARL en los tubos de reacción.
Parámetros de los tubos de reacción -Ejemplo
Tubo nº
Descripción Conc. de disolución madre patrón (UE/ml) Patrón/ muestras (μl) ARL (μl) Disolución de adiciones (μl) Conc. final (UE/ml)
1
Control negativo - 0 200 0 0,000
2
Control negativo - 0 200 0 0,000
3
Patrón 1 0,004 100 100 0 0,002
4
Patrón 1 0,004 100 100 0 0,002
5
Patrón 2 0,008 100 100 0 0,004
6
Patrón 2 0,008 100 100 0 0,004
7
Patrón 3 0,016 100 100 0 0,008
8
Patrón 3 0,016 100 100 0 0,008
9
Patrón 4 0,032 100 100 0 0,016
10
Patrón 4 0,032 100 100 0 0,016
11
Patrón 5 0,064 100 100 0 0,032
12
Patrón 5 0,064 100 100 0 0,032
13
Patrón 6 0,128 100 100 0 0,064
14
Patrón 6 0,128 100 100 0 0,064
15
Muestra 1 - 100 100 0 desconocida
16
Muestra 1 - 100 100 0 desconocida
17
Muestra 1 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
18
Muestra 1 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
19
Muestra 2 - 100 100 0 desconocida
20
Muestra 2 - 100 100 0 desconocida
21
Muestra 2 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
(continuación)
Tubo nº
Descripción Conc. de disolución madre patrón (UE/ml) Patrón/muestras (μl) ARL (μl) Disolución de adiciones (μl) Conc. final (UE/ml)
22
Muestra 2 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
23
Muestra 3 - 100 100 0 desconocida
24
Muestra 3 - 100 100 0 desconocida
25
Muestra 3 Adición - 100 0 100 Constitutiva +0,016
26
Muestra 3 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
27
Muestra 4 - 100 100 0 desconocida
28
Muestra 4 - 100 100 0 desconocida
29
Muestra 4 Adición - 100 0 100 Constitutiva + 0,016
30
Muestra 4 Adición - 100 0 100 Constitutiva +0,016
31
Control de agua positivo 0,032 0 100 100 0,016
32
Control de agua positivo 0,032 0 100 100 0,016
Añadir reactivo de Pyrotell-T®. Añadir 50 μl de la disolución de Pyrotell-T® a cada tubo de reacción (control negativo, patrones, muestras, muestras enriquecidas y control de agua positivo) con un pipeteador de repetición. Remover con 5 vórtex cada tubo durante 1-2 segundos, e insertarlo en el pocillo asignado (Tabla 1) en el instrumento Pyros Kinetix.
ANÁLISIS DE DATOS.
Análisis. El software PyroSoft®-11 realizará un análisis automático de todos los patrones, controles y muestras e informará de los resultados de las muestras en UE/ml al completarse la ejecución. Cada muestra por duplicado se informa como un valor medio de las dos. Si uno de los tubos de un valor de par duplicado no es detectado por el
10 software PyroSoft®-11, ese tubo puede excluirse de posteriores análisis de datos, y los resultados se recalculan. La recuperación de adiciones (muestra control positiva) se calculará basándose en la cantidad de endotoxina en la muestra más la cantidad de endotoxina enriquecida en la muestra (0,016 UE/ml).
Convertir el valor de UE/ml en el valor de UE/mg de muestra de principio activo o medicamento diluido
Los datos sin procesar se generan como UE/ml y se informan como UE/mg de proteína. Para convertir UE/ml a
15 UE/mg, dividir el valor de endotoxina (UE/ml) entre la concentración de proteína (0,125 mg/ml). Los resultados se informan a una cifra significativa.
Ejemplo:
Para una muestra que tiene 0,23 UE/ml en el ensayo, el valor en UE/mg informable será 2 UE/mg (1,8 redondeado a una cifra significativa).
4 3
0,23UE/ml
1 0
5
1,84UE/mg
5
2UE/mg
0,125mg /ml
Resultado para muestra de principio activo. El resultado se determina a una cifra significativa. El LC del ensayo es 0,02 UE/mg. Si la muestra es ≤0,02 UE/mg, el resultado informable es [lt;LC, (LC=0,02 UE/mg)]. Resultado para muestra de medicamento. La media de las tres muestras para cada lote de medicamento (“principio”, “mitad” y “fin”) en UE/mg es el resultado informable para muestras de medicamento con una cifra significativa. Para el caso en el 25 que la una o más de las muestras para un lote sea lt;LC (0,02 UE/mg), el valor de 0,02 UE/mg se usará para calcular
la media. Si el resultado informable medio es ≤0,02 UE/mg, el resultado informable es [lt;LC, (LC = 0,02 UE/mg)]. Ejemplo:
Muestra de un lote de medicamentos
Valor UE/mg
Principio
lt;LC = 0,02 UE/mg
Mitad
0,023
Fin
0,031
Valor informable (media)
0,02 UE/mg
Para este ejemplo, el placebo de medicamento se informaría como: 3 UE/ml, equivalente a 0,02 UE/mg a una 5 concentración de medicamento nominal de 125 mg/ml.
Idoneidad del sistema. Las muestras de principio activo deben recibirse en recipientes de poliestireno a 2-8 ºC. Si las muestras se reciben en diferentes recipientes a una temperatura diferente, no pueden usarse en el ensayo. El coeficiente de determinación para la curva patrón (r2) debe ser ≥0,99. Si el valor de r2 es lt;0,99, el ensayo no es válido y debe repetirse. La concentración de endotoxinas medida media para el control negativo debe ser lt;0,002 10 UE/ml. Si el control negativo es ≥0,002 UE/ml, el ensayo no es válido y debe repetirse. El valor de muestras enriquecidas debe estar dentro del intervalo del 50 -200% del valor esperado. Si el valor de muestras enriquecidas es ≤49 % o ≥201% del valor esperado, el ensayo no es válido y debe repetirse. La concentración de endotoxinas medida media para el control de agua positivo debe estar dentro del intervalo del 50-200% de la misma concentración en la curva patrón. Si el valor de control de agua positivo es ≤49 % o ≥201% del valor esperado, el
15 ensayo no es válido y debe repetirse. Los valores de endotoxina para las muestras deben estar dentro del intervalo de la curva patrón de endotoxina (entre 0,002 y 0,064 UE-USP/ml). Si las muestras son lt;0,002 UE/ml, están por debajo del LC del ensayo e informado por la sección 5.4. Si las muestras tienen gt;0,064 UE-USP/ml, las muestras deben diluirse adicionalmente en el intervalo del ensayo.
Ejemplo 49 – Prueba de límites microbianos (biocarga) para CTLA4-Ig
20 Este procedimiento proporciona procedimientos de prueba para la estimación del número de microorganismos aerobios viables presentes y para la libertad de especies microbianas designadas. En una realización, la composición de CTLA4-Ig debe tener biocarga a un nivel de ≤1 UFC/10 ml. En la preparación y en la aplicación de las pruebas, téngase en cuenta las precauciones asépticas en la manipulación de los especímenes. El término “Crecimiento” se define como la presencia y supuesta proliferación de microorganismos viables. La validez de los
25 resultados de prueba se basa ampliamente en la demostración de que los especímenes de prueba a los que se aplican no inhiben, por sí mismos, el crecimiento, bajo las condiciones de prueba, de microorganismos que pueden estar presentes. Esta demostración debe incluir la exposición de especímenes apropiadamente preparados del material que va a probarse a cultivos viables separados de organismos de exposición apropiados para asegurar que la prueba no inhibirá el crecimiento de estas clases de organismo, en caso de que estén presentes en el material
30 probado. Esa porción de cualquier producto de beta-lactama que se usa para la prueba debe tratarse con cantidad adecuada de penicilinasa según los procedimientos validados.
Fluidos y medios diluyentes
1. Preparación de medios de cultivo y fluidos diluyentes. Pueden prepararse medios de cultivo y fluidos diluyentes, o pueden usarse medios de cultivo deshidratados a condición de que, cuando se reconstituyan como se indica por el 35 fabricante o distribuidor, tengan componentes similares y/o den medios comparables a aquellos obtenidos a partir de las fórmulas facilitadas en el presente documento. En la preparación de medios por las fórmulas, disolver los sólidos solubles en el agua, usando calor si fuera necesario, para efectuar la disolución completa, y añadir disoluciones de ácido clorhídrico o hidróxido sódico en cantidades suficientes para dar el pH deseado en el medio cuando está listo para su uso. Los medios van a esterilizarse en un autoclave usando un procedimiento de esterilización validado.
40 Determinar el pH después de la esterilización a 25º ± 2 ºC.
Promoción del crecimiento
a) Cada lote de medio esterilizado en autoclave se prueba para su capacidad promotora del crecimiento inoculando recipientes de ensayo duplicados de cada medio con menos de 100 microorganismos e incubando según las condiciones especificadas más adelante. Los organismos no deben tener más de 5 pases del cultivo originalmente
45 recibido de la ATCC.
b) El medio de prueba es satisfactorio si las pruebas de crecimiento aparecen en el plazo de 48-72 horas para bacterias y 5 días para hongos. La prueba de promoción del crecimiento puede realizarse simultáneamente con el uso del medio de prueba para probar materiales. Sin embargo, la prueba de materiales se considera no válida si esta prueba de promoción del crecimiento no es satisfactoria.
Microorganismos de prueba para su uso en pruebas de promoción del crecimiento de medios
PRUEBA
MEDIO MICROORGANISMOS DE PRUEBA: ATCC nº TEMPERATURA DE INCUBACIÓN
Recuento total
microbiano aerobio TSA (1) Staphylococcus aureus o: Micrococcus luteus 6538 9341 30 º-35 ºC 30 º-35 ºC
(2) Bacillus subtilis
6633 30 º-35 ºC
(3) Escherichia coli
8739 30 º-35 ºC
Recuento de mohos y levaduras combinado total
SDA (1) Candida albicans (2) Aspergillus niger 10231 16404 20 º-25 ºC 20 º-25 ºC
Ausencia aeruginosa
de Pseudomonas TSB (1) Pseudomonas aeruginosa 9027 30 º-35 ºC
Ausencia aureus
de Staphylococcus TSB (1) Staphyloccocus aureus 6538 30 º-35 ºC
Ausencia de Salmonella
FLM (1) Salmonella choleraesuis 13311 30 º-35 ºC
o: Salmonella typhimurium*
30 º-35 ºC
Ausencia de Escherichia coli
FLM (1) Escherichia coli 8739 30 º-35 ºC
* También pueden ser adecuadas otras especies de Salmonella no patógenas.
Procedimiento para el recuento microbiano aerobio total o recuento de mohos y levaduras combinado total
5 a) Preparación de muestras. A menos que se indique de otro modo por el procedimiento específico, preparar el espécimen para probar del siguiente modo. Se remite a la sección apropiada más adelante para información adicional referente a medios y procedimientos de incubación dependiendo de la prueba que se realice.
i) Polvos a granel y materiales de partida -Disolver o suspender 10 gramos o 10 ml de muestra en 90 ml de tampón fosfato estéril a pH 7,2. Mezclar bien y transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
10 ii) Cápsulas -Transferir asépticamente 2 cubiertas de cápsula y su contenido a 20 ml de tampón fosfato estéril a pH 7,2. Calentar en un baño de agua (aproximadamente 45 ºC) durante aproximadamente 10 minutos. Agitar vigorosamente hasta que la suspensión sea uniforme, y transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
iii) Polvos para suspensión -Reconstituir la muestra según las indicaciones de la etiqueta usando tampón fosfato estéril a pH 7,2 como diluyente. Agitar bien y transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
15 iv) Disoluciones/suspensiones -Transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
v) Comprimidos -Transferir 4 comprimidos (los comprimidos duros deben pulverizarse primero con un mortero y pistilo estériles) a 20 ml de tampón fosfato estéril a pH 7,2. Agitar bien hasta que los comprimidos se disgreguen o disuelvan completamente, y transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
vi) Cubiertas de cápsula -Transferir 25 cubiertas de cápsula a 100 ml de tampón fosfato estéril a pH 7,2 y calentar
20 en un baño de agua (aproximadamente 45 ºC) durante aproximadamente 15 minutos, agitar intermitentemente para disolver. Agitar bien y transferir 1,0 ml a cada una de dos placas de Petri estériles.
vii) Pomadas -En un recipiente estéril, reunir aproximadamente 5 ml de cada una de 3 muestras tomadas a lo largo del lote y mezclar. Transferir 0,1 ml de esta muestra reunida a cada una de diez placas de Petri. Extender la muestra sobre la superficie de los medios con la ayuda de una varilla de vidrio doblada estéril (palo de hockey). Usar una
25 varilla estéril separada para incubar cada placa como se describe en “Recuento aerobio total”.
b) Filtración en membrana. Como una alternativa a los procedimientos de siembra por vertido puede usarse un procedimiento de prueba de filtración en membrana validado adecuado. Éste puede ser especialmente útil para productos que contienen sustancias inhibidoras.
c) Volver a probar. Con el fin de confirmar un resultado dudoso por cualquiera de los siguientes procedimientos, puede realizarse una nueva prueba usando dos veces y media (mínimo) el tamaño de muestra inicial, con ajustes apropiados de diluyente.
Prueba para el recuento microbiano aerobio total
1.
Preparar las muestras que van a probarse como se ha descrito. A cada placa añadir 1 5-20 ml de TSA estéril que se ha fundido y enfriado a aproximadamente 45 ºC. Cubrir cada disco, e inclinar o agitar suavemente con movimientos circulares el disco para mezclar la muestra con el agar y permitir que el contenido solidifique a temperatura ambiente. Invertir las placas e incubar durante 48 a 72 horas a 30 º-35 ºC.
2.
Tras la incubación, examinar las placas para crecimiento usando un dispositivo de aumentos tal como un contador de colonias Quebec, contar el número de colonias y calcular los resultados en una base unitaria (por comprimido, cápsula, ml, gramo, etc.) como se ha designado en la especificación de materiales y evaluar la aceptabilidad contra la especificación de materiales.
3.
Adicionalmente caracterizar la contaminación bacteriana por gramo de cepa y morfología microscópica. Someter las bacterias Gram-negativas y los cocos Gram-positivos a pruebas bioquímicas (o medios adecuados alternativos de identificación).
Nota: Cuando se cuentan colonias, con el fin de facilitar la diferenciación de crecimiento colonial del material que se prueba, a veces es aconsejable usar una disolución al 2% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) como agente potenciador para observar el crecimiento microbiano. El TTC es un indicador de oxidación-reducción incoloro que vira a rojo cuando se hidrogena por la reducción de azúcares encontrados en células vivas, virando así la colonia a un color rojo oscuro. Para usar TTC, inundar la placa de Petri con aproximadamente 1 ml de la disolución al 2% e incubar la placa a 30 º-35 ºC durante aproximadamente 2 horas. Las colonias microbianas resaltarán rápidamente de otro material presente en la placa y pueden contarse más fácilmente.
C. Prueba para recuento de mohos y levaduras combinado total. 1. Preparar las muestras que van a probarse como se ha descrito. A cada placa añadir 15-20 ml de SDA estéril que se ha fundido y enfriado a aproximadamente 45 ºC. Cubrir cada disco, e inclinar o agitar suavemente con movimientos circulares el disco para mezclar la muestra con el agar y permitir que el contenido solidifique a temperatura ambiente. Invertir las placas e incubar durante 5 a 7 días a 20 º-25 ºC. [NOTA: No alterar las placas durante la incubación, debido a que la dispersión del moho dentro de la placa podría dar un mayor recuento del en realidad presente.].
2.
Tras la incubación, examinar las placas para crecimiento usando un dispositivo de aumentos tal como un contador de colonias Quebec, contar el número de colonias y calcular los resultados en una base unitaria (por comprimido, cápsula, ml, gramo, etc.) como se ha designado en la especificación de materiales y evaluar la aceptabilidad contra la especificación de materiales.
3.
Adicionalmente caracterizar la contaminación fúngica por morfología macroscópica y microscópica. Cuando corresponda, someter las levaduras a pruebas bioquímicas (o medios adecuados alternativos de identificación).
Procedimiento para probar la ausencia de organismos inaceptables
a) Preparación de muestras -A menos que se indique de otro modo por el procedimiento específico, preparar la muestra para la prueba como se ha descrito anteriormente en la sección de preparación de muestras para Aerobios totales y Mohos y levaduras combinados totales. Se remite a la sección apropiada más adelante para información adicional dependiendo de la prueba que se realice.
b) Filtración en membrana -Como una alternativa a los procedimientos de enriquecimiento previo puede usarse un procedimiento de prueba de filtración en membrana validado adecuado. Éste puede ser especialmente útil para productos que contienen sustancias inhibidoras.
c) Volver a probar -Con el fin de confirmar un resultado dudoso por cualquiera de los siguientes procedimientos, puede realizarse una nueva prueba usando dos veces y media (mínimo) el tamaño de muestra inicial, con ajustes apropiados de diluyente.
B. Prueba para la ausencia de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Añadir a la muestra TSB para preparar 100 ml, mezclar e incubar durante 24-48 horas a 30 º-35 ºC. Examinar el medio para crecimiento, y si están presentes, usando un bucle de inoculación, pasar una parte a un medio selectivo, incubar y examinar para las características enumeradas más adelante (pueden sustituirse kits de identificación comercialmente disponibles por las pruebas de reacción individuales):
Características de Staphylococcus aureus:
Medio: Vogel-Johnson Manitol salado Baird-Parker
Morfología: colonias negras rodeadas colonias amarillas con colonias negras brillantes rodeadas de zonas amarillas zonas amarillas de zonas claras de 2-5 mm
Prueba de positiva positiva positiva coagulasa*:
Tinción Gram: cocos positivos cocos positivos cocos positivos (agrupaciones) (agrupaciones) (agrupaciones)
*Transferir colonias sospechosas representativas del agar selectivo a tubos individuales que contienen 0,5 ml de plasma de mamífero (preferentemente conejo o caballo), incubar a 37 ºC, examinar a las 3-4 horas y posteriormente a intervalos adecuados hasta 24 horas para coagulación.
Características de Pseudomonas aeruginosa
Medio:
Centrimida PSF* PSP*
Morfología:
verdosa incolora a amarillenta verdosa
Fluorescencia en luz UV:
verdosa amarillenta azul
Oxidasa**:
positivo positiva positiva
Tinción Gram:
bacilos negativos bacilos negativos bacilos negativos
* Para la prueba de pigmento, pasar colonias sospechosas representativas del agar Centrimida a placas de PSF y PSP. Cubrir e incubar a 35 º ± 2 ºC durante un mínimo tres días. Examinar las placas bajo luz UV.
** Para la prueba de oxidasa, confirmar cualquier colonia sospechosa transfiriendo tiras o placas impregnadas con diclorhidrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina; si no hay desarrollo de un color rosa que cambie a púrpura, la muestra cumple los requisitos para ausencia de Pseudomonas aeruginosa. Obsérvese que también pueden usarse kits de prueba comercialmente disponibles que han demostrado que tienen éxito en una forma aceptable
5 Si no se observa crecimiento, o si ninguna de las colonias encontradas se ajusta al conjunto de características enumeradas en las tablas anteriores, la muestra cumple los requisitos de la prueba para ausencia de ese organismo.
Prueba para ausencia de especies de Salmonella y Escherichia coli
Transferir la muestra a un recipiente estéril que contenga un total 100 ml de medio de lactosa fluida e incubar a 30 º35 ºC durante 24-48 horas. Agitar suavemente y examinar para crecimiento (los kits de identificación comercialmente 10 disponibles pueden sustituirse por las pruebas de reacción individuales).
a) Salmonella -Si está presente crecimiento en el medio de lactosa fluido:
1.
Transferir porciones de 1,0 ml a tubos de 10 ml de medio de selenito-cistina fluido y medio de tetrationato fluido, mezclar e incubar a 30 º-35 ºC durante 24-48 horas.
2.
Por medio de un bucle de inoculación, pasar porciones de ambos medios sobre medio agar Brilliant Green, medio
15 agar xilosa-lisina-desoxicolato y medio agar de sulfito de bismuto. Cubrir, invertir e incubar a 30 º-35 ºC durante 2448 horas y examinar las características morfológicas enumeradas a continuación:
Características de Salmonella
Medio: Brilliant Green Xilosa-lisina-Sulfito de desoxicolato bismuto
Morfología: Pequeñas, transparentes, incoloras o de rosas a blancas rojo, con o sin Negro o opacas (frecuentemente rodeadas por zona de roja a rosa) centros negros verde
3. Puede realizarse identificación adicional transfiriendo colonias sospechosas a un tubo de fondo-pico de flauta de medio agar triple azúcar-hierro pasando primero la superficie del pico de flauta y luego clavando el alambre bien debajo de la superficie. Incubar a 30 º-35 ºC durante 24-48 horas y examinar. Si ningún tubo muestra pruebas de pico de flauta alcalino (rojo) y fondos ácidos (amarillos) (con o sin ennegrecimiento concomitante del fondo), la muestra cumple los requisitos de la prueba para ausencia del género Salmonella.
b) Escherichia coli -Si está presente crecimiento en el medio de lactosa fluida: 1. Por medio de un bucle de inoculación, pasar una parte a medio agar MacConkey. Cubrir, invertir e incubar a 30 º-35 ºC durante 24-48 horas.
2.
Si ninguna de las colonias resultantes muestra un aspecto rojo ladrillo (con una posible zona alrededor de bilis precipitada) y son bacilos Gram-negativos (cocos-bacilos), la muestra cumple los requisitos de la prueba para ausencia de Escherichia coli.
3.
Si las colonias coinciden con esta descripción, transferirlas a medio agar levine-eosina-azul de metileno. Cubrir las placas, invertirlas e incubar a 30 º-35 ºC durante 24-48 horas. Si ninguna de las colonias presenta tanto un brillo metálico característico bajo luz reflejada como un aspecto negro azulado bajo luz transmitida, la muestra cumple los requisitos de la prueba para ausencia de Escherichia coli.
Fórmulas de medios
1. Tampón fosfato a pH 7,2
a) Disolución madre: Fosfato potásico monobásico 34,0 g; agua (destilada o desionizada) 1000 ml; hidróxido sódico TS 175 ml. Disolver 34 gramos de fosfato potásico monobásico en aproximadamente 500 ml de agua contenida en un matraz volumétrico de 1000 ml. Ajustar a pH 7,1-7,3 mediante la adición de hidróxido sódico TS (aproximadamente 175 ml), añadir agua al volumen y mezclar. Esterilizar y guardar bajo refrigeración (2 º-8 ºC) hasta que se use.
b) Disolución de trabajo. Para su uso, diluir la disolución madre con agua a una relación de 1 a 800 y esterilizar.
2.
TSA (Agar de tripticasa de soja/agar digerido con soja-caseína). Digestión pancreática de caseína 15,0 g; digestión papaica de harina de soja 5,0 g; cloruro sódico 5,0 g; agar 15,0 g; agua 1000 ml; pH después de esterilización: 7,3 ± 0,2.
3.
TSB (Caldo de tripticasa de soja / caldo digerido con soja-caseína). Digestión pancreática de caseína 17,0 g; digestión papaica de harina de soja 5,0 g; cloruro sódico 5,0 g; fosfato potásico dibásico 2,5 g; dextrosa 2,5 g; agua 1000 ml; pH después de la esterilización: 7,3 ± 0,2; 4. SDA (agar de Sabouraud-dextrosa); dextrosa 40 g; mezcla de partes iguales de digestión péptica de tejido animal y digestión pancreática de caseína 10,0 g; agar 15,0 g; agua 1000 ml; mezclar y hervir para efectuar la disolución; pH después de la esterilización: 5,6 ± 0,2.
5. FLM (medio de lactosa fluida). Extracto de carne 3,0 g; digestión pancreática de gelatina 5,0 g; lactosa 5,0 g; agua 1000 ml; enfriar tan rápido como sea posible después de la esterilización. pH después de la esterilización: 7,1 ± 0,2.
Ejemplo 50 – Análisis en gel de isoelectroenfoque de CTLA4-Ig
El fin de este ejemplo es determinar el punto isoeléctrico, número de isoformas y microheterogeneidad de CTLA4-Ig.
Materiales
Kit de calibración de IEF (pH 3 a 10), (Amersham Pharmacia, nº de catálogo 17-0471-01) o (pH 2,5 a 6,5), (Amersham Pharmacia, nº de catálogo 17-0472-01).
Gel Ampholine PAGplate: pH 4,0 a 6,5, (Amersham Pharmacia, nº de catálogo 80-1124-81).
Aplicadores de muestra IEF (Amersham Pharmacia, nº de catálogo 80-1129-46).
Tiras de electrodo IEF (Amersham Pharmacia, nº de catálogo 80-1104-40).
Ácido fosfórico (85%), (EMD, nº de catálogo PX0995-6).
Equipo
Sistema de electroforesis Multiphor II (GE Healthcare, nº de catálogo 18-1018-06).
Preparación de reactivos
Disolución de tampón del ánodo (ácido glutámico 0,1 M en ácido fosfórico 0,5 M) (mechas impregnadas con éste se colocan sobre el lado (+) del bloque).
Ejemplo:
3,4 ml de ácido fosfórico al 85%.
1,47 g ± 0,02 g de ácido glutámico.
Agua de calidad para HPLC.
Combinar los reactivos anteriores en una probeta graduada de 100 ml, enrasar a 100 ml con agua de calidad
para HPLC, tapar e invertir varias veces para mezclar. Guardar la disolución a 2-8 ºC durante hasta seis meses. Disolución de tampón de cátodo (β-alanina 0,1 M) (mechas impregnadas con éste se colocan sobre el lado (-) del
bloque). Ejemplo:
0,9 g ± 0,02 g de β-alanina.
Agua de calidad para HPLC.
Combinar los reactivos anteriores en una probeta graduada de 100 ml, enrasar a 100 ml con agua de calidad
para HPLC, tapar e invertir varias veces para mezclar.
Guardar la disolución a 2-8 ºC durante seis meses.
Fijar la disolución (3,5% de ácido 5-sulfosalicílico en 12% de ácido tricloroacético). Ejemplo:
240 g ± 5,0 g de ácido tricloroacético.
70 g ± 2,0 g de ácido 5-sulfosalicílico.
2000 ml de HPLC agua.
Combinar los reactivos anteriores para preparar hasta 2000 ml de volumen.
Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta tres meses.
Disolución de tinción:
Mezclar la disolución de reactivo GelCode Blue inmediatamente antes de uso invirtiendo suavemente y rodando
la botella varias veces.
Nota: Es importante mezclar el reactivo de tinción antes de verter o dispensar para asegurar que se usa una
muestra de reactivo homogénea. Preparación de control de tinción: Reconstituir la anhidrasa carbónica II con agua de calidad para HPLC para preparar 1,0 mg/ml de disolución madre. 10 μl de disolución madre se combinan con 90 μl de agua de calidad para HPLC para conseguir una disolución de
trabajo de 0,10 μg/μl. Cargar 10 μl de la disolución de 0,10 μg/μl sobre el gel (1,0 μg de carga).
Procedimiento
Dilución de muestras Preparar una disolución de muestra de 20 μg/10 μl y material de referencia en HPLC agua.
Concentracióndeseada (2∀g/∀l) x200∀l 5∀ldemuestra añadida aun volumen final de 200∀lConcentracióndemuestra (50∀g/∀l)
Ejemplo:
2∀g/∀l x200∀l 5 0,04x200∀l 5 8∀ldemuestra (añadir 192∀ldeagua para HPLC)50∀g/∀l
Aparato y preparación del gel
Conectar la placa de refrigeración de la unidad de electroforesis Multiphore II al circulador termostático y fijar la 5 temperatura a 10 ± 2 ºC.
Nota: Dejar el circulador al menos 20 minutos para alcanzar la temperatura anterior.
Sacar el gel del refrigerador. Cortar cuidadosamente a lo largo de los lados del sobre asegurándose de no cortar el gel/soporte del gel.
Añadir aproximadamente 1,0 ml de agua de calidad para HPLC a un borde de la plataforma de refrigeración.
10 Poner un borde del gel/soporte del gel en el agua de forma que la acción capilar lleve el agua a través de todo el borde del gel. Lentamente, asegurarse de que no quedan atrapadas burbujas de aire, aplicar el gel a través de la plataforma de refrigeración. Si se necesita puede aplicar agua de calidad para HPLC adicional.
Quitar la película transparente de la superficie del gel.
Empapar un electrodo con disolución de tampón de ánodo y poner sobre el borde del gel más próximo a las marcas 15 (+) de la plataforma de refrigeración.
Empapar un electrodo en la disolución de tampón de cátodo y poner sobre el otro lado del gel, que está más próximo a las marcas (-) sobre la placa de refrigeración.
Después de aplicar las tiras de electrodo, cortar cuidadosamente el exceso usando una nueva hoja de afeitar, de manera que las tiras terminen en el borde del gel, y no el soporte del gel.
20 Aplicar trozos de aplicación de muestra sobre el lado más próximo a las marcas (-) sobre la plataforma de refrigeración, asegurándose de que haya buen contacto entre los trozos de aplicación de muestra y el gel. Nota: Asegurarse de que los aplicadores de muestra IEF no tocan la tira impregnada con el tampón de cátodo, no absorben tampón de cátodo y están suficientemente separadas para asegurar que cada muestra corre por separado. Los aplicadores de muestra deben colocarse firmemente sobre el gel inclinado.
25 Poner el portaelectrodos de la unidad Multiphor II y alinear los electrodos a lo largo del centro de las tiras de electrodo sobre el gel. Conectar los dos electrodos del portaelectrodos a la unidad base y poner la tapa de seguridad en posición. Usando cinta adhesiva, cubrir los orificios de la tapa de seguridad para prevenir que el gel se seque. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación.
Enfocar previamente el gel con la fuente de alimentación fijada a los siguientes parámetros, hasta que el voltaje 30 alcance ≥300 V.
Tabla 1: Parámetros de la fuente de alimentación para enfocar previamente geles de IEF
Parámetros de ejecución
Ajuste
Voltaje (parámetro variable)
2000 voltios máximo
Corriente (parámetro constante)
25 mAmp
Potencia (parámetro constante)
25 vatios
Carga de gel
Después de enfocar previamente el gel, apagar la fuente de alimentación, quitar la tapa de seguridad, desconectar 35 los electrodos y quitar el portaelectrodos de la unidad Multiphor II.
Cargar las muestras sobre los aplicadores de muestra en una secuencia específica. Para este procedimiento, asegurarse de que el lado de la tira del tapón de cátodo (-) sea el más próximo al analizador.
Las muestras se cargan de derecha a izquierda. Primero hacer dos o más aplicaciones de los patrones de calibración de IEF (carriles 1 y 2), uno del material de referencia (carril 3), uno de la muestra de prueba nº 1 (carril 4), 40 uno de la preparación de control de tinción (carril 5), uno de la muestra de prueba nº 2 (carril 6), uno del material de
referencia (carril 7) y uno del patrón de calibración de IEF (carril 8).
Añadir la tercera y cuarta muestra aplicando una aplicación de material de referencia (carril 9), una aplicación de muestra de prueba nº 3 (carril 10), una aplicación de la preparación de control de tinción (carril 11), una aplicación de muestra de prueba nº 4 (carril 12), una aplicación de material de referencia (carril 13) y una aplicación de patrón de calibración de IEF (carril 14). La quinta y sexta muestras se aplican repitiendo el mismo patrón que las muestras 3 y 4, usando los carriles 15 a 20. El patrón de carga de muestra se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2 -Dilución de muestras y patrón de carga de gel
Carril
Descripción Concentración de trabajo(μg/μl) Volumen de carga(μl) Carga de proteína(μg)
1
Marcador de pI de IEF* - 10 -
2
Marcador de pI de IEF - 10 -
3
Material de referencia 2,0 10 20
4
Muestra 1 2,0 10 20
5
Control de tinción 0,10 10 1,0
6
Muestra 2 2,0 10 20
7
Material de referencia 2,0 10 20
8
Marcador de pI de IEF - 10 -
9
Material de referencia 2,0 10 20
10
Muestra 3 2,0 10 20
11
Control de tinción 0,10 10 1,0
12
Muestra 4 2,0 10 20
13
Material de referencia 2,0 10 20
14
Marcador de pI de IEF - 1,0 -
15
Material de referencia 2,0 10 20
16
Muestra 5 2,0 10 20
17
Control de tinción 0,10 10 1,0
18
Muestra 6 2,0 10 20
1,9
Material de referencia 2,0 10 20
20
Marcador de pI de IEF - 10 -
Electroforesis. Cuando el gel se carga, poner el portaelectrodos de la unidad Multiphor II y alinear los electrodos a lo
10 largo del centro de las tiras de electrodo sobre el gel. Conectar los dos electrodos del portaelectrodos a la unidad base y poner la tapa de seguridad en posición. Usando cinta adhesiva, cubrir los orificios de la tapa de seguridad para prevenir que el gel se seque. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación. Fijar ´los parámetros apropiados de voltaje, corriente y potencia y empezar la ejecución.
Tabla 3: Parámetros de la fuente de alimentación para ejecutar los geles de IEF.
Parámetros de ejecución
Ajuste
Voltaje (parámetro variable)
2000 voltios máximo
Corriente (parámetro constante)
25 mAmp
Potencia (parámetro constante)
25 vatios
Tiempo (parámetro constante)
2,5 horas
Después de ejecutar el gel, apagar la fuente de alimentación, quitar la tapa de seguridad, desconectar los electrodos y quitar el portaelectrodos de la unidad Multiphor II. Quitar cuidadosamente las tiras de electrodo y los aplicadores de muestra del gel.
Nota: Puede ponerse el gel en placa directamente en la disolución fijadora y dejar las tiras de electrodo y trozos de 20 aplicación flotar en el gel.
Quitar el gel/soporte de gel de la placa de refrigeración y poner en un disco plano que contiene un volumen suficiente de disolución fijadora (etapa 3.3) para mantener el gel húmedo. Cubrir con envoltura de plástico y poner sobre una plataforma orbital e incubar 20 -60 minutos. Registrar el tiempo de inicio y parada en la hoja de cálculo de IEF.
5 NOTA: Los geles de IEF dejados en fijador durante mucho tiempo se deslaminan algunas veces. Esto se evita limitando el tiempo en fijador a aproximadamente una hora.
4.5 Tinción del gel
Después de fijar, aclarar el gel 3 x 5 minutos con un volumen suficiente de agua de calidad para HPLC para mantener el gel húmedo. Registrar los tiempos de inicio y parada en la hoja de cálculo de IEF.
10 Después de mezclar la disolución de reactivo de tinción GelCode Blue antes de uso (etapa 3.4), poner el gel en un volumen suficiente de la tinción para mantener el gel húmedo. Incubar 15-24 horas en un recipiente fuertemente cerrado, para prevenir la evaporación de reactivo. Registrar los tiempos de inicio y parada en la hoja de cálculo de IEF.
Los geles teñidos se destiñen sustituyendo la disolución de tinción con agua de calidad para HPLC. Aclarar el gel
15 con al menos tres cambios de agua durante un periodo de 1-2 horas. Registrar los tiempos de inicio y parada en la hoja de cálculo de IEF. Después de desteñir, el gel está listo para el escaneo.
Nota: Pueden requerirse lavados adicionales para reducir la tinción de fondo sobre el gel de IEF. Idoneidad del sistema
Los patrones de isoelectroenfoque deben distinguirse fácilmente del fondo. Los patrones de proteína que migran a
20 valores de pI entre 4,0 y 6,5 son visibles en el gel. Los patrones de proteína con pI que está fuera de este intervalo no son visibles en el gel. Se identifican marcadores de pI a 3,50, 4,55, 5,20 y 5,85 y se etiquetan sobre la imagen del gel.
Tabla 4: Componentes de los patrones de calibración de IEF.
Patrón de proteína
pI
Tripsinógeno
9,30
Banda básica de lentil-lectina
8,65
Banda media de lentil-lectina
8,45
Banda ácida de lentil-lectina
8,15
Banda básica de mioglobina
7,35
Banda ácida de mioglobina
6,85
Anhidrasa carbónica B humana
6,55
Anhidrasa carbónica B bovina
5,85
β-Lactoglobulina A
5,20
Inhibidor de tripsina de soja
4,55
Amiloglucósido
3,50
25 Se usa un control de tinción de patrón de anhidrasa carbónica II (pI 5,4) a un bajo nivel de carga de proteína (1,0 μg) para la visualización de la consistencia de la tinción del gel. Esta banda debe distinguirse fácilmente del fondo por inspección visual de la imagen de gel escaneada.
El material de referencia de CTLA4-Ig debe enumerarse en 10-22 bandas dentro del intervalo de pI de 4,3 a 5,6.
El porcentaje acumulado de intensidad de las bandas más importantes del material de CTLA4-Ig de referencia debe 30 ser ≥90% dentro del intervalo de pI de 4,3 a 5,3.
Para material de referencia, confirmar por inspección visual que hay tres bandas importantes enfocadas entre los marcadores de pI 4,5 -5,2 (véase la figura para el principal patrón de bandas).
Escaneo y análisis del gel
Después de la electroforesis y tinción, todos los geles se escanean usando un densitómetro. Los archivos de imágenes se almacenan en el disco duro local del ordenador/red y se archivan mediante la red de área local. El análisis de imágenes de gel escaneadas se realiza usando el software ImageQuant TL (v2003.03). Los parámetros de escaneo y análisis se enumeran en la Tabla 5. Los escaneos se generan y se cuantifican usando procedimientos del departamento.
Tabla 5 -Parámetros de escaneo y análisis de geles
Parámetros de escaneo
Ajuste
Tamaño de píxel del escaneo
100
Resolución digital del escaneo
12 bits
Parámetros de detección de bandas
Pendiente mínima
Inicial 100
Reducción del ruido
Inicial 10
% de pico máximo
Inicial 0
% de anchura del carril
Fijar al 90%
Nota: Los procedimientos anteriores proporcionan etapas básicas para el análisis de imágenes de geles. Se definen los parámetros de escaneo en la tabla. Los parámetros de detección de bandas en la tabla son ajustes iniciales sugeridos. El ajuste de los parámetros de detección de bandas puede ser necesario para identificar con exactitud bandas debido a cambios en las propiedades físicas de gel (tales como encogimiento del gel después de á tinción/destinción) y alteración de la forma y desplazamiento de la banda de gel. Corregir manualmente cualquier banda perdida o erróneamente identificada.
Escanear los geles usando los parámetros de escaneo definidos en la tabla. Todos los análisis y evaluaciones del gel se hacen a partir de la imagen escaneada. Abrir un archivo de imagen de gel (datos sin procesar escaneados) de lt;Análisis de gel 1Dgt; en ImageQuantTL. Ir a lt;Contrastegt; en la barra de herramientas y bajar el parámetro lt;Histograma de imágenesgt; hasta que todas las bandas sean claramente visibles. Seleccionar lt;Creación de carrilgt; y elegir lt;Manualgt; para fijar el lt;Número de carrilesgt; a analizar. Ajustar lt;% de anchura del carrilgt; hasta el 100% para cubrir los carriles de gel. Alinear apropiadamente carriles individuales si fuera necesario. Usar el procedimiento de lt;Bola rodantegt; para restar el fondo. Detectar bandas usando los ajustes iniciales lt;Pendiente mínimagt;, lt;Reducción de ruido gt;, lt;% de pico máximogt; enumerados en la Tabla 3. El ajuste de estos valores es necesario para identificar con exactitud bandas. Calcular el valor de pI de la banda usando el marcador de pI patrón de los marcadores marcados enumerados en la sección de idoneidad del sistema para el gel de pH/pI 4,0-6,5. Saltarse las etapas de calibración y normalización. Enumerar el número de bandas dentro del intervalo de pI de 4,3 a 5,6. Exportar los resultados a una hoja de Excel para la posterior documentación y presentación. Cálculo del porcentaje acumulado de intensidad de muestras con respecto a material de referencia. Nota: El porcentaje acumulado de intensidad para una muestra es el porcentaje de bandas que migran dentro del intervalo de pI de 4,35,3, con respecto al 100% de de todas las bandas presentes en el carril. La siguiente ecuación debe usarse para el cálculo del porcentaje acumulado de intensidad de muestras con respecto al material de referencia:
%de intensidad de bandas de la muestra (pI 4,38 5,3)
Porcentaje relativo demuestra (%) 5 x100
%de intensidad debandas de referencia (pI 4,38 5,3)
Nota: Con referencia al patrón de carga de gel, el material de referencia a continuación de la muestra debe usarse para el cálculo. Si el material de referencia tiene un valor acumulado del 100% y la muestra tiene un valor del 95%, el porcentaje relativo de la muestra es 95/100* 100 = 95%. Si la referencia tiene un valor acumulado del 95% y la muestra tiene un valor del 100%, el porcentaje relativo de la muestra es 100/95* 100 = 105%.
Presentación de resultados
Informar del número de bandas enumeradas dentro del pI de intervalo 4,3 -5,6. Informar del porcentaje acumulado de intensidad con respecto al de material de referencia de CTLA4-Ig dentro del intervalo de pI de 4,3 -5,3 (véase la figura para un ejemplo de la presentación para el análisis de gel de IEF cuantitativo definido en este procedimiento). Confirmar por inspección visual que hay tres bandas principales enfocadas entre los marcadores de pI 4,5 -5,2 con respecto al material de referencia (véase la Figura 1 para el principal patrón de bandas) e informar del número de bandas principales observadas dentro de marcadores de pI 4,5 -5,2. Confirmar por inspección visual que no hay nuevas bandas significativas entre los marcadores de pI 4,5 -5,2 con respecto al material de referencia.
En ciertas realizaciones, los resultados de este procedimiento mostrarán bandas en un intervalo de pI de 4,3 -5,6, o 4,3 -5,3, siendo allí identificadas de 10 a 22 bandas, con la intensidad de bandas acumulada del 90 -110%. En otra realización, el intervalo de pI es de 4,5 -5,2 con 3 bandas principales. En otra realización, el intervalo de pI es 4,3 5,6 con 10 a 22 bandas. En otra realización, el intervalo de pI es 4,3 -5,3 con una intensidad de bandas acumulada del 95 -105%. En otra realización, el intervalo de pI es de 4,5 -5,2 con 2 bandas importantes.
Ejemplo 51: SDS-PAGE de CTLA4-Ig
El ejemplo muestra el examen de CTLA4-Ig bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras por SDS-PAGE.
Materiales
Tampón de muestra Tris-glicina (Tris-Gly) SDS 2X (Invitrogen, nº de catálogo LC2676).
Agente reductor de muestras NuPAGE” 10X (Invitrogen, nº de catálogo NP0004).
4-20% de gel de Tris-Glicina -1,0 mm x 12 pocillos (Invitrogen, nº de catálogo EC60252BOX).
Tampón de electroforesis Tris-glicina SDS 10X (Invitrogen, nº de catálogo LC2675).
Patrón sin teñir de amplio intervalo Mark12™ (Invitrogen, nº de catálogo LC5677).
Reactivo de tinción GelCode Blue (azul de Coomassie), (Pierce, nº de catálogo 24590: 500 ml, nº de catálogo 24592: 3,5 l).
Kit de tinción II SilverSnap® (tinción con plata) (Pierce, nº de catálogo 24612).
Instrumentación:
Xcell SureLock Mini Cell (Invitrogen, nº de catálogo EI0001).
Fuente de alimentación para electroforesis (OWL Separation Systems, nº de catálogo OSP-300).
Reactivos:
Disolución fijadora para azul de Coomassie (50% de metanol y 7% de ácido acético en agua de calidad para HPLC).
Ejemplo:
A un recipiente graduado apropiadamente dimensionado que contiene una barra de agitación:
Añadir 500 ml de metanol.
Añadir 70 ml de ácido acético.
Ajustar volumen a 1000 ml con agua de calidad para HPLC.
Guardar a temperatura ambiente durante hasta seis meses.
Teñir con azul de Coomassie (GelCode Blue).
Usar directamente del recipiente. Añadir suficiente cantidad para cubrir el gel,
aproximadamente 50 ml para un mini gel (10 x 10 cm) en una bandeja pequeña.
Guardar a 2-8 ºC durante hasta un año.
Tinción con disolución fijadora de plata (30% de etanol y 10% de ácido acético en agua de calidad para HPLC).
A un recipiente graduado apropiadamente dimensionado que contiene una barra de agitación: Añadir 300 ml de etanol. Añadir 100 ml de ácido acético. Ajustar el volumen a 1000 ml con agua de calidad para HPLC. Mezclar la disolución y guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta seis meses. Disolución de lavado del gel (10% de etanol).
A un tubo de centrífuga de 50 ml: Añadir 1,0 ml de potenciador (kit de tinción con plata). Añadir 50 ml de tinción con plata (kit de tinción con plata). Tapar el tubo y mezclar suavemente removiendo con vórtex durante 3 a 5 segundos. Disolución de trabajo reveladora. Preparar inmediatamente antes de uso.
A un tubo de centrífuga de 50 ml: Añadir 1 ml de potenciador (kit de tinción con plata). Añadir 50 ml de revelador (kit de tinción con plata). Tapar el tubo y mezclar suavemente removiendo con vórtex durante 3 a 5 segundos. 1 X tampón de electroforesis de Tris-glicina-SDS. Preparar el día de uso. A una probeta graduada: Añadir 900 ml de agua de calidad para HPLC. Añadir 100 ml de 10X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS. Combinar los reactivos anteriores, cubrir con Parafilm e invertir varias veces para mezclar.
Control de tinción. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC a un vial que contiene 2 mg de inhibidor de tripsina (control de tinción). Esto dará una disolución madre de 2 μg/μl estable durante seis meses a -200 ºC. Para prevenir la degradación debido a numerosos ciclos de congelación-descongelación, transferir alícuotas de 50 μl a pequeños tubos y guardar a -200 ºC. Añadir 25 μl de disolución madre a 75 μl de agua de calidad para HPLC para dar una disolución 0,5 μg/ul. Añadir 40 μl de la disolución 0,5 μg/μl a 160 μl de agua de calidad para HPLC dando una concentración de 0,1 μg/μl. Añadir 10 μl de la disolución 0,1 μg/μl, 50 μl de 2X tampón de muestra Tris-Gly y 40 μl de agua de calidad para HPLC a un tubo de microcentrífuga. La concentración final del control de tinción de inhibidor de
5 tripsina es 0,01 μg/μl. Las muestras analizadas para liberación y teñidas con azul de Coomassie se cargan a una concentración de 10 mg por 10 μl.
Para geles de azul de Coomassie, diluir el material de referencia y muestra en agua de calidad para HPLC a una concentración de 10 μg/μl. Ejemplo: Añadir 80 μl de disolución 50 μg/μl de muestra de material de referencia + 320 μl de agua de calidad para HPLC. Para muestras no reducidas, añadir 10 μl de la concentración de disolución 10 10 μg/μl a 50 μl de 2X tampón de muestra Tris-Gly, y 40 μl de agua de calidad para HPLC en un tubo de microcentrífuga. Para muestras reducidas, añadir 10 μl de la disolución 10 μg/μl a 50 μl de 2X tampón de muestra Tris-Gly, 30 μl de agua de calidad para HPLC y 10 μl de 10X agente reductor. Para tinción con geles teñidos con plata, diluir adicionalmente la disolución 10 μg/μl a 1 μg/μl en agua de calidad para HPLC. Ejemplo: Añadir 40 μl de disolución 10 μg/μl + 360 μl de agua de calidad para HPLC. Para muestras no reducidas, añadir 10 μl de la
15 disolución 1 μg/μl a 50 μl de 2X tampón de muestra Tris-Gly, y 40 μl de agua de calidad para HPLC en un tubo de microcentrífuga. Para las muestras reducidas, añadir 10 μl de la disolución 1 μg/μl, 50 μl de 2X muestra de Tris-Gly, 30 μl de agua de calidad para HPLC y 10 μl de 10X agente reductor a un tubo de microcentrífuga. Para el blanco, combinar 50 μl de 2X tampón de muestra Tris-Gly y 50 μl de agua de calidad para HPLC en un tubo de microcentrífuga.
20 Tabla 6: El intervalo de peso molecular (kDa) para bandas de proteínas menores esperadas que pueden estarpresentes en muestras de abatacept reducidas y no reducidas
Descripción de banda(s)
No reducidas (kDa) Reducidas (kDa)
Banda(s) menor(es)
NA 15-45
Banda(s) menor(es)
30-70 NA
Banda(s) menor(es)
NA 80-155
Banda(s) menor(es)
175-230 175-200
Sacar el (los) gel(s) de su envoltorio y aclarar el exterior con agua de calidad para HPLC para eliminar trozos de poliacrilamida. Sacar cuidadosamente el peine de pocillos asegurándose que los pocillos se enderezan con una 25 punta de carga de gel si fuera necesario. Llenar los pocillos con agua de calidad para HPLC y darles golpecitos de manera que el agua se elimine de los pocillos. Repetir el aclarado de pocillos dos veces más. 5.2 Insertar geles en el aparato XCell de manera que la cara corta de la placa esté orientada hacia la cámara interna. Si solo está usándose un gel, insertar una placa de Plexiglas en la cara opuesta. Meter a presión el (los) gel(es) formando una cámara interna y externa. Llenar la cámara interna con 1X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS. Comprobar para fugas, 30 luego llenar la cámara externa con 1X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS. Todos los geles deben contener al menos un carril para blanco y un carril de marcador de peso molecular. Añadir un control de tinción para geles teñidos con azul de Coomassie solo. Usar puntas de carga de gel. Cargar al menos un “blanco” entre muestras reducidas y no reducidas. Tratar los marcadores de peso molecular como muestra reducidas. Esto ayudará a prevenir la reducción de las muestras no reducidas debido a la filtración del agente reductor. Poner la tapa del 35 aparato XCell y conectar los electrodos a la fuente de alimentación. Ajustar la corriente a 25 mAmps por gel, y ajustar el voltaje (v) y potencia (w) al máximo. Si corren dos geles, fijar la corriente a 50 mAmps. Ajustar la corriente cuando corren dos geles en un aparato, o múltiples aparatos XCell en la misma fuente de alimentación. Someter a electroforesis durante 60 ± 5 minutos o hasta que el frente de tampón se mueva al menos el 80% de la distancia de migración disponible. Registrar el tiempo de inicio y el tiempo de parada en la hoja de cálculo. Separar
40 cuidadosamente las dos placas de plástico que contienen el gel haciendo palanca con una cuchilla de gel. Después de la separación del gel, seguir el procedimiento para tinción.
Tinción con azul de Coomassie -Poner el gel en 50 ml de disolución fijadora de azul de Coomassie (50% de metanol y 7% de ácido acético) durante 15 minutos. Aclarar el gel 3 veces con ∼100 ml de agua de calidad para HPLC durante 5 minutos, durante un total de 15 minutos. Añadir la tinción de azul de Coomassie directamente al (a los)
45 gel(es) e incubar durante 15 a 24 horas. Los geles teñidos se destiñen reemplazando el reactivo de tinción de azul de Coomassie con 100 ml de agua de calidad para HPLC. Después de 1 hora de desteñir, el gel está listo para escanear.
Escaneo y análisis del gel. Después de la electroforesis y tinción, los geles se escanean usando un densitómetro. Los archivos de imágenes se almacenan en el disco duro local del ordenador y/o red y se archivan mediante la red
50 de área local. El análisis de imágenes de gel escaneadas se realiza usando el software ImageQuant TL (v2003.03). Los escaneos se generan y se cuantifican usando procedimientos del departamento.
Tabla 4: Parámetros de escaneo y análisis de geles
Parámetros de escaneo
Ajuste
Tamaño de píxel del escaneo
100
Resolución digital del escaneo
12 bits
Parámetros de detección de bandas
Pendiente mínima
Inicial 100
Reducción del ruido
Inicial 10
% de pico máximo
Inicial 0
% de anchura del carril
Fijar al 90%
Por inspección visual, la principal banda de CTLA4-Ig reducida deben aparecer como una banda ancha que migra a una posición proximal al marcador de peso molecular de 55.400 Da (deshidrogenasa glutámica).
5 Ejemplo 52 -DETERMINACIÓN DE IMPUREZAS DE PROTEÍNA DE CÉLULAS DE OVARIO DE HÁMSTER CHINO (CHO) EN PRINCIPIO ACTIVO DE CTLA4A29IL104E-Ig POR ELISA
Este ejemplo describe un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para cuantificar niveles de contaminación de proteínas de células huésped (PCH) residuales de CD-CHO1 en las muestras de prueba. Una IgG policlonal de conejo anti-PCH de CD-CHO1 se recubre primero sobre una placa de microtitulación. Los patrones de referencia de 10 PCH, controles de calidad y muestras de principio activo de CTLA4A29IL104E-Ig se incuban con la IgG de conejo anti-PCH de CD-CHO1 unida. Después de lavar las placas de microtitulación se añade anticuerpo policlonal de conejo anti-biotina-IgG de PCH de CD-CHO1, que se une a las PCH capturadas durante la etapa inicial. Las placas de microtitulación se lavan para eliminar cualquier anticuerpo policlonal sin unir. Se añade estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y la placa de microtitulación se lava de nuevo para eliminar cualquier anticuerpo conjugado sin unir. 15 Luego se añade cromógeno de TMB para dar una reacción colorimétrica. La reacción se termina con ácido sulfúrico y la absorbancia se mide a 450 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos. El color se revela en proporción a la cantidad de PCH capturada. Las concentraciones de muestra se determinan basándose en una curva patrón generada representando la absorbancia frente a la concentración de PCH en el intervalo de 4,11 ng/ml a 3000 ng/ml.
La línea de células de ovario de hámster chino (CHO) (DG44) se usa en la producción de CTLA4A29IL104E-Ig. Para la
20 producción de proteína de CD-CHO1 (PCH), células DG44 se transfectaron establemente con el vector recombinante pD16 y se cultivaron en medio CD-CHO1 complementado con galactosa y recombulina. Los anticuerpos policlonales para esta versión de ELISA se generaron en conejos blancos de Nueva Zelanda inmunizados con un concentrado del material de PCH de CD-CHO1. Los anticuerpos de conejo se purificaron por afinidad (proteína A), luego se dializaron en solución salina tamponada con fosfato y se concentraron.
25 Aproximadamente 50 mg de la fracción IgG de anticuerpo de conejo anti-CD-CHO1 se biotiniló usando química de éster N-hidroxisulfosuccinimida. El anticuerpo de conejo anti-CHO1 sin modificar se usa para recubrir placas de microtitulación de 96 pocillos. Captura PCH de CD-CHO1 que se detectan por los anticuerpos de conejo anti-CD-CHO1 biotinilados. El conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante se une a biotina y se usa una reacción colorimétrica con cromógeno de TMB para cuantificar PCH de CD-CHO1.
30 Este procedimiento se diseña para determinar cuantitativamente niveles residuales de proteínas de células huésped de CD-CHO1 por ELISA para la prueba de liberación de material de principio activo de CTLA4A29IL104E-Ig.
Se biotinila anticuerpo de conejo anti-CD-CHO1 usando un kit de biotinilación con 6-(biotinamido)-hexanoato de sulfosuccinimidilo como reactivo de biotinilación. Puede usarse el reactivo de biotinilación de PIERCE (producto nº 21335) con sulfo-NHS-LC-biotina. El anticuerpo se marca según las recomendaciones del fabricante en el manual suministrado con el reactivo de biotinilación. Después del marcado y separación en la columna de exclusión por tamaño suministrada, se determina la incorporación de biotina y la muestra se congela en alícuotas de 50 μl o más pequeñas a o por debajo de -70 ºC. La relación de biotina/IgG del producto final debe estar entre 2 y 4. Guardar a o por debajo de -70 ºC.
Recubrimiento de placas. Preparar una disolución de 8 μg/ml de IgG de conejo anti-PCH de CD-CHO1 purificada en tampón carbonato que va a usarse para el recubrimiento placas de microtitulación (se requieren 12 ml de disolución por placa de microtitulación). Añadir 100 μl de esta disolución a cada pocillo de una placa de microtitulación Immulon
5 4 usando un pipeteador multicanal calibrado. Cubrir la placa de microtitulación con Parafilm e incubar a 4 ºC durante 18 ± 2 horas.
Lavado y bloqueo de placas. Lavar la placa tres veces con tampón de lavado usando instrumento lavador de placas. Añadir 300 μl de SeaBlock a cada pocillo usando un pipeteador multicanal calibrado. Incubar la placa durante 1 hora a 22,5 ± 5 ºC. Preparar las concentraciones de patrones de referencia de proteína de CD-CHO1 y muestras de
10 control de calidad en tubos de polipropileno estériles graduados de 15 ml. Diluir el material de referencia y las muestras de control de calidad usando el diluyente Teknova (1.21). La concentración de patrón se prepara el día del experimento a las concentraciones enumeradas en el siguiente ejemplo:
Diluciones para muestras de curva patrón (Ejemplo de preparación diaria)
La concentración de disolución madre de proteína de CD-CHO1 es 5,7 mg/ml
Dilución A: 26,3 μl (5,7 mg/ml) + 4,973 ml de diluyente PTB = 30 μg/ml
Dilución B: 0,6 ml (30 μg/ml) + 5,4 ml de diluyente 3000 ng/ml
2 ml (3000 ng/ml) + 4 ml de diluyente 1000 ng/ml
2 ml (1000 ng/ml) + 4 ml de diluyente 333,3 ng/ml
2 ml (333,3 ng/ml) + 4 ml de diluyente 11 1,1 ng/ml
2 ml (111,1 ng/ml) + 4 ml de diluyente 37,0 ng/ml
2 ml (37,0 ng/ml) + 4 ml de diluyente 12,3 ng/ml
2 ml (12,3 ng/ml) + 4 ml de diluyente 4,11 ng/ml
0 + 4 ml de diluyente 0 ng/ml
15 Análisis de concentraciones de CC, almacenamiento y caducidad
Se preparan muestras de control de calidad (CC) a tres concentraciones diana diferentes (25, 100 y 700 ng/ml) y se usan frescas el día del análisis o se preparan en grandes cantidades y se guardan congeladas en alícuotas a o por debajo de -70 ºC. Las alícuotas congeladas se analizan en tres experimentos independientes. Los resultados promedio de los tres experimentos se informan en un Certificado de Análisis (COA) para cada una de las tres
20 muestras de CC. En el día del experimento, las muestras de CC congeladas se descongelan y se analizan como se describe más adelante. Después de descongelar cada muestra de CC se remueve con vórtex a velocidad media 2-4 segundos. Las muestras de CC congeladas caducan 6 meses después de la fecha de preparación. Se usan a su concentración nominal informada en el COA. CC recién preparado caduca 24 horas después de la preparación.
Diluciones para muestras de control de calidad (CC) (ejemplo)
Dilución A: 26,3 μl (5,7 mg/ml) + 4,973 ml de diluyente = 30 μg/ml
233 μl (30 μg/ml) + 9,767 ml de diluyente = 700 ng/ml (CC 1)
1,43 ml (700 ng/ml) + 8,57 ml de diluyente = 100 ng/ml (CC 2)
2,5 ml (100 ng/ml) + 7,5 ml de diluyente = 25 ng/ml (CC 3)
Preparación de muestras. Diluir muestras de principio activo a aproximadamente 12,5, 6,25 y 3,125 mg/ml.
Dilución A: 400 μl de muestra (∼25 mg/ml) + 400 μl de diluyente = 12,5 mg/ml Dilución B: 400 μl (∼12,5 mg/ml) + 400 μl de diluyente = 6,25 mg/ml Dilución C: 400 μl (∼6,25 mg/ml) + 400 μl de diluyente = 3,125 mg/ml
30 Lavado de placas. Lavar las placas tres veces con tampón de lavado usando lavador de placas. Añadir 100 μl por pocillo de cada concentración de patrón, muestras y las muestras de CC por triplicado a la placa bloqueada y lavada. Cada concentración de CC se añade dos veces a un total de seis pocillos por placa. Ver el mapa de placas en el anexo del procedimiento para la colocación sugerida. Incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5 ºC. Repetir la etapa lavando 5 veces. Diluir anti-PCH de CD-CHO1-biotina de conejo a 2 μg/ml en tampón Teknova. Remover con vórtex
35 la disolución aproximadamente 2-4 segundos a velocidad media. Añadir 100 μl por pocillo. Incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5 ºC. Repetir la etapa lavando 5 veces. Diluir estreptavidina-HRP (SA-HRP) apropiadamente en tampón
Teknova (ejemplo: una dilución 1/20.000 normalmente produce lecturas de absorbancia aceptables). Añadir 100 μl de dilución de SA-HRP a cada pocillo e incubar a 22,5 ± 5 ºC durante 1 hora. Sacar el cromógeno de TMB del refrigerador y decantar un mínimo de 10 ml por placa en un recipiente adecuado. Poner en una localización oscura y dejar que llegue a temperatura ambiente. Repetir la etapa lavando 5 veces. Añadir 100 μl de cromógeno de TMB a cada pocillo e incubar a 22,5 ± 5 ºC durante aproximadamente 2 minutos. Detener la reacción del cromógeno añadiendo 100 μl de H2SO4 1 N a cada pocillo. Añadir disolución de parada en el mismo orden a las placas y pocillos que se añadió el cromógeno para asegurar los mismos tiempos de reacción de cromógeno con la enzima en cada pocillo. Medir la absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en un lector de placas de 96 pocillos apropiado.
ANÁLISIS DE DATOS. La plantilla del programa Softmax “Plantilla de ELISA de CHO1.ppr” se fija para generar valores medios, desviaciones estándar, % de CV, concentraciones calculadas, parámetros de ajuste de curvas, etc. Curva patrón. Los datos del patrón de referencia se ajustan a una curva patrón usando una función de ajuste de cuatro parámetros:
en la que:
Y = valor de absorbancia (A450-A630)
A = valor de absorbancia correspondiente a la asíntota mínima
D = valor de absorbancia correspondiente a la asíntota máxima
C = absorbancia correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores de la asíntota máxima y mínima (punto de inflexión).
B = la pendiente en el punto de inflexión de la curva
X = concentración de PCH de CD-CHO1
La plantilla del programa Softmax “Plantilla de ELISA de CHO1.ppr” determina el coeficiente de correlación (R2) de la línea de regresión para los patrones usando la media calculada.
VALORES EJEMPLARES. Determinar si los resultados para patrones, CC y muestras cumplen los valores ejemplares enumerados a continuación. Valores ejemplares para los patrones. El coeficiente de correlación (R2) para la curva patrón debe ser ≥ 0,99. El fondo medio para la concentración de patrón cero ng/ml debe ser ≤ 0,2 unidades de absorbancia. Si dos o más de las siete concentraciones nominales de la curva patrón, excluyendo cero y concentraciones por debajo del LC (12,3 ng/ml), no cumplen las condiciones 6.1.4 y 6.1.5, el ensayo se considera no válido y debe repetirse. La media de los valores calculados (ng/ml) a cada concentración de patrón usada para determinar la curva patrón, excluyendo cero y concentraciones por debajo del LC (12,3 ng/ml), debe estar dentro del 20% del valor (nominal) diana. El coeficiente de variación (% de CV) de los valores de absorbancia por triplicado a cada concentración de patrón, excluyendo cero y concentraciones por debajo del LC (12,3 ng/ml), debe ser inferior al 20%. Para asegurar que están disponibles para el cálculo al menos dos puntos de datos congruentes, los patrones, controles de calidad y las muestras se cargan en pocillos por triplicado. Analizar cada valor por triplicado por separado. Omitir el valor que se encuentra más alejado de la diana. Recalcular la curva y reanalizar los valores ejemplares.
Ejemplo:
Valor diana (ng/ml) Valor actual (ng/ml)
25 12
El único valor que es el más alejado del valor diana de 25 ng/ml es 12 ng/ml. Eliminando el valor de 12 ng/ml de los valores triplicados, la media de los restantes valores cumple todos los valores ejemplares. Si se muestra que la media de los dos valores restantes todavía no cumple los valores ejemplares, entonces el punto individual se elimina y la curva se recalcula.
Ejemplo:
Valor diana (ng/ml) Valor actual (ng/ml)
25 5,0
5,5
El valor medio es gt; 20% de la diana independientemente de qué valor se elimine, por tanto, el punto individual se omite de la curva y la curva se recalculará.
5 Valores ejemplares para muestras de CC. Una muestra de CC es un conjunto de seis pocillos a la concentración establecida. Al menos cuatro de los seis pocillos para una muestra de CC deben estar dentro del 20% del nominal para que la muestra de CC sea aceptable. Las tres las muestras de CC deben ser aceptables. Si no se cumplen estos valores ejemplares, el ensayo debe repetirse.
Valores ejemplares para muestras de prueba. El valor de absorbancia para la muestra de prueba ensayada debe ser
10 inferior al mayor CC. Si el valor supera el del mayor CC, la muestra de prueba debe diluirse suficientemente de manera que se obtenga un valor medio entre 700 y 12,3 ng/ml. Al menos una de las tres diluciones de muestra (12,5, 6,25 y 3,125 mg/ml) debe estar dentro del intervalo de la curva patrón para un resultado informable, a menos que la absorbancia para todas las diluciones se encuentre por debajo del LC del ensayo. En ese caso, las muestras de prueba se informa como lt;LC. La media de los valores de absorbancia por triplicado de las diluciones de muestra
15 que son superiores al LC y que están dentro del intervalo del ensayo debe presentar un CV inferior al 20%.
CÁLCULO Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS DE CONCENTRACIÓN DE PCH DE CD-CHO1 EN MUESTRAS. Cálculo de concentración de PCH de CD-CHO1 en muestras. Multiplicar los resultados medios de la muestra por el factor de dilución apropiado (es decir, 2, 4 y 8) para obtener la concentración de PCH de CD-CHO1 en la muestra sin diluir en ng/ml para cada de una de las diluciones. Determinar la media para resultados de aquellas diluciones
20 que están dentro del intervalo del ensayo. Dividir el resultado entre la concentración de proteína CTLA4AZ9IL104E-Ig informada (mg/ml) para obtener la concentración de PCH de CD-CHO1 en ng/mg de CTLA4A29IL104E-Ig.
Cálculo de ejemplo:
Resultado medio de la muestra: 235 ng de PCH de CD-CHO1 /ml = 9,4 ng/mg
Conc. de proteína: 25,0 mg/ml
NOTA: ng de PCH de CD-CHO1 / mg de producto (ng/mg) es equivalente a partes por millón (ppm).
Ejemplo 53: DETERMINACIÓN DE NIVELES DE PROTEÍNA A EN CTLA4A29VL104E-Ig POR ELISA
25 Este enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) cuantifica niveles de contaminación de proteína A en muestras de prueba de CTLA4A29IL104E-Ig. Anti-proteína A de conejo se recubre primero sobre una placa de microtitulación. Los patrones de referencia de proteína A, controles de calidad, controles de recuperación y muestras de CTLA4A29IL104E-Ig se incuban con la IgG de conejo anti-proteína A unida. Después de lavar las placas de microtitulación se añade anticuerpo monoclonal IgG anti-proteína A de conejo biotinilado que se une a la proteína A capturada durante la
30 etapa inicial. Las placas de microtitulación se lavan para eliminar cualquier anticuerpo monoclonal sin unir. Entonces se añade estreptavidina-peroxidasa de rábano picante después de una hora de incubación; la placa de microtitulación se lava de nuevo para eliminar cualquier anticuerpo conjugado sin unir. Entonces se añade cromógeno de TMB dando una reacción colorimétrica. La reacción se termina con ácido sulfúrico y las densidades ópticas se miden a 450 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos. El color se revela en proporción a la cantidad
35 de proteína A capturada. Las concentraciones de muestra se determinan basándose en una curva patrón generada representando la densidad óptica frente a la concentración de proteína A en el intervalo de 0,188 ng/ml a 12 ng/ml.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
Recubrimiento de placas con anticuerpo de captura. Preparar una disolución 1 μg/ml de anticuerpo de conejo antiproteína A en tampón de recubrimiento y añadir 100 μl de la disolución a cada pocillo de una placa de microtitulación Costar. Incubar a 4 ºC durante 18 ± 2 horas.
Lavado y bloqueo de placas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado usando el lavador de placas. Añadir 200 μl de SuperBlock™ a cada pocillo. Incubar la placa de microtitulación durante 60 minutos a temperatura ambiente. Preparación de patrón de referencia. Preparar patrón de referencia mezclando la cantidad apropiada de material de referencia de proteína A en el volumen apropiado de tampón acetato. Remover con vórtex la disolución a velocidad media durante 2-4 segundos. Incubar muestras patrón de referencia, de control de calidad y de control de recuperación durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a placa de microtitulación.
Ejemplo: Material de referencia Proteína A, concentración de disolución madre 2,3 mg/ml
5 1:200 10 μl (2,3 mg/ml) + 1990 μl (tampón acetato) = 11500 ng/ml
1:479 10 μl (11500 ng/ml) + 4780 μl (tampón acetato) = 24 ng/ml
2 ml (24 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 12 ng/ml
2 ml (12 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 6 ng/ml
2 ml (6 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 3 ng/ml
10 2 ml (3 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 1,5 ng/ml
2 ml (1,5 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 0,75 ng/ml
2 ml (0,75 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 0,375 ng/ml
2 ml (0,375 ng/ml) + 2 ml (tampón acetato) = 0,188 ng/ml
0 ml + 2 ml (tampón acetato) = 0 ng/ml
15 Cada concentración de patrón se analiza por triplicado. Poner las muestras sobre placa de microtitulación como se describe en el anexo del procedimiento. Preparación de las muestras de control de calidad. Se preparan muestras de control de calidad (CC) de proteína A en tampón acetato a tres niveles de concentración diana de 0,5, 2 y 5 ng/ml. Se preparan tanto frescas en el día del experimento como en mayores cantidades y se congelan en alícuotas de 750 μl a ≤ -70 ºC. Las concentraciones de proteína A en las muestras de CC congeladas se predeterminan en
20 tres experimentos de ELISA de proteína A independientes usando este procedimiento y los resultados de concentración promedio se informan como las concentraciones de CC “nominales” en un Certificado de Análisis para cada muestra de CC.
En el día de un experimento, descongelar un vial de cada una de las tres muestras de CC a temperatura ambiente. Analizar cada concentración de CC dos veces (en dos análisis por triplicado por concentración). Poner las muestras
25 de CC sobre placa de microtitulación como se describe en el anexo del procedimiento.
Material de referencia Proteína A, 2,3 mg/ml
1:200 10 μl (2,3 mg/ml) + 1990 μl (tampón acetato) = 11500 ng/ml
1:479 10 μl (11500 ng/ml) + 4780 μl (tampón acetato) = 24 ng/ml
833,3 μl (24 ng/ml) + 3,166 ml (tampón acetato) = 5 ng/ml (CC1)
30 1,600 ml (5 ng/ml) + 2,4 ml (tampón acetato) = 2 ng/ml (CC2)
1 ml (2 ng/ml) + 3 ml (tampón acetato) = 0,5 ng/ml (CC3)
Preparación de las muestras de prueba. Preparar concentraciones de 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml y 0,625 mg/ml de las muestras de prueba de CTLA4A29IL104E-Ig en tubos de polipropileno mg/ml, y 0,625 mg/ml de las muestras de prueba de CTLA4A29IL104E-Ig en tubos de polipropileno usando tampón acetato (pH 3,5). Las muestras de prueba se incuban
35 durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente antes de añadir a la placa de microtitulación.
Lavado de placas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado usando el lavador de placas. El lavador de placas debe ajustarse para llenar los pocillos con 300 μl de tampón de lavado, tiempo de empapamiento cero. Añadir 100 μl de cada patrón de referencia, control de calidad, control de recuperación y muestras de prueba a cada pocillo e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Repetir la etapa. Diluir anticuerpo anti-proteína A biotinilado con
40 diluyente Teknova a una concentración deseada como se indica por optimización para cada nuevo lote. Por ejemplo, hacer la dilución 1:64.000 para el conjugado de anti-proteína A-biotina monoclonal, Remover con vórtex a velocidad media y añadir 100 μl a cada pocillo usando un pipeteador multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante una hora.
Diluir estreptavidina-peroxidasa de rábano picante con diluyente Teknova a una concentración deseada como se
45 indica por optimización para cada nuevo lote. Por ejemplo, hacer la dilución 1:80.000 para estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Remover con vórtex a velocidad media y añadir 100 μl a cada pocillo e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repetir la etapa, pero lavar cinco veces. Añadir 100 μl de cromógeno de TMB a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos. La densidad óptica para la mayor concentración para la curva patrón debe estar entre 0,980 y 1,400. Detener la reacción del cromógeno añadiendo 100 μl/pocillo de H2SO4 1 N. Añadir disolución de parada en el mismo orden a las placas y pocillos que se añadió el cromógeno para asegurar los mismos tiempos de reacción de cromógeno con la enzima en cada pocillo. Medir la absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en un lector de placas de 96 pocillos apropiado.
ANÁLISIS DE DATOS. Se remite a la plantilla del programa Softmax para el ELISA de proteína A ya que genera media, desviaciones estándar y % de CV, etc. Todos los cálculos realizados en las secciones de Análisis de datos se realizarán usando la Plantilla de ELISA de proteína A.ppr en SoftMax Pro.
Promediar los valores de absorbancia por triplicado (Abs) obtenidos para cada concentración de referencia y de muestra ensayada. Modelar los datos para los patrones de proteína A usando una regresión de cuatro parámetros sin ponderar de la forma:
en la que:
Abs = absorbancia mín = valor de absorbancia correspondiente a la asíntota mínima máx = valor de absorbancia correspondiente a la asíntota máxima ED50 = absorbancia correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores asintóticos máximos y mínimos B = la pendiente del punto de inflexión del ajuste de la curva C = concentración de proteína A
VALORES EJEMPLARES. Valores ejemplares para los patrones. Los valores ejemplares para los patrones se aplican a aquellos valores a o por encima del límite cuantitativo (LC), ya que los valores por debajo del LC se usan solo para ayudar a establecer los extremos de la curva. El coeficiente de determinación (R2) para la curva patrón debe ser ≥ 0,99. El fondo medio para el patrón de cero ng/ml debe ser ≤ 0,08 unidades de absorción. La media de los valores calculados (ng/ml) a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón, excepto cero y el LC, debe estar dentro del 15% del valor (nominal) diana. La media de los valores de absorbancia por triplicado del LC de la curva patrón debe presentar un % de CV inferior al 20% y estar dentro del 20% de la diana.
Ejemplo 54 -ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA SIMILAR A MCP-1 EN CTLA4A29IL104E-Ig
Este ELISA se realiza para determinar la concentración de proteína similar a MCP-1 en CTLA4A29IL104E-Ig. Las concentraciones de una curva patrón (0,4 a 25,6 ng/ml), control de calidad y muestras de prueba se aplican a placas de microtitulación absorbidas con anticuerpo de cabra anti-MCP-1 de ratón, y se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente (22,5 ± 5 ºC). Las placas se lavan, se añade anticuerpo secundario (IgG de conejo anti-MCP1 de rata) y se incuban durante 60 minutos a 22,5 ± 5 ºC. Las placas se lavan, se añade anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo y se incuban durante 30 minutos a 22,5 ± 5 ºC. Las placas se lavan y se añade cromógeno de TMB dando una reacción colorimétrica. Después de detener la reacción con H2SO4 1 N, las densidades ópticas se miden a 450 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos, y los datos se modelan usando una curva de regresión de 4 parámetros. La concentración de proteína similar a MCP-1 se calcula entonces para cada muestra de prueba con respecto al material de referencia de MCP-1. La concentración se informa en ng de proteína similar a MCP-1 por mg (partes por millón, ppm) de muestra dividiendo el resultado obtenido con respecto a la curva patrón y la concentración de muestras sin diluir. Este procedimiento permite la determinación de impurezas similares a MCP-1 en muestras biológicas derivadas de cultivo celular que incluyen principio activo purificado en el procedimiento, y medicamento. La proteína similar a MCP-1 puede estar presente en las muestras biológicas producidas en cultivo celular de ovario de hámster chino (CHO). Se identificaron dos anticuerpos policlonales que se unen a una impureza similar a MCP-1 purificada a partir de células CHO. Los anticuerpos están dirigidos contra MCP-1 murina y de rata (intacta) y ambos reaccionan de forma cruzada con proteína similar a MCP-1 de células CHO que se demuestra en este informe.
Recubrimiento de placas. Para recubrir, diluir anticuerpo de cabra anti-MCP-1 de ratón a 5 μg/ml con tampón de recubrimiento. Recubrir las placas con 100 μl/pocillo. Cubrir las placas con sellantes de placa e incubar a 22,5 ± 5 ºC durante 12 a 18 horas. Lavado de placas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado usando un lavador de placas. El lavador debe fijarse a tres lavados, 300 μl/pocillo con un tiempo de empapamiento de cero. Alternativamente, las placas pueden lavarse manualmente. Añadir 300 μl de disolución a cada pocillo de cada placa usando un pipeteador multicanal calibrado. Vaciar los pocillos dando golpecitos en un sumidero y transferir suavemente sobre toallas de papel. Repetir tres veces.
Bloqueo de placas. Añadir 300 μl de estabilizador del recubrimiento y bloquear el tampón a cada pocillo usando un pipeteador multicanal calibrado. Incubar las placas durante una a dos horas a 22,5 ± 5 ºC. Lavado y almacenamiento de placas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado como se describe bajo 4.2. Llenar las placas con 300 μl de tampón de recubrimiento por pocillo, cubrir con sellantes de placa y guardar en la oscuridad a 2-8 ºC durante hasta una semana.
Preparación de los patrones. A partir de la disolución madre de proteína similar a MCP-1, preparar una disolución de 25,6 ng/ml en PTB y diluir a partir de aquí en etapas de dilución seriada (1:2) a 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 y 0 ng/ml 5 usando PTB como diluyente. Alternativamente pueden usarse patrones congelados preparando una gran cantidad de patrones. Separar en alícuotas y guardar a -70 ºC a -80 ºC. Evitar congelación/descongelación repetida. Los patrones congelados necesitan clasificarse contra controles de calidad en tres ejecuciones de ELISA independientes. Los patrones congelados y CC deben ser aceptables en cada ejecución. Después de completarse las tres ejecuciones aceptables se concede un Certificado de Análisis. Los patrones congelados se usarán a sus
10 concentraciones nominales. Caducan 3 meses desde la fecha de preparación.
Ejemplo de una referencia de MCP-1 con una concentración de disolución madre de 0,97 mg/ml:
Preparar 2,5 ml de 5200 ng/ml en PTB:
13,4 ml de disolución madre + 2,487 ml de diluyente
b) Preparar 160 ml de 25,6 ng/ml en PTB:
15 788 ml de disolución madre + 160 ml de diluyente
Mezclar cada disolución removiendo con vórtex el tubo durante aproximadamente 2-3 segundos y luego invertir suavemente 2-3 veces.
Control de calidad. Los controles de calidad (CC) son proteína similar a MCP-1 preparada a concentraciones nominales de 17,7 ng/ml, 5,3 ng/ml y 1,2 ng/ml en PTB. Preparar una gran cantidad de CC, separar en alícuotas y 20 guardar a -70 ºC a -80 ºC durante hasta 3 meses. Evitar congelación/descongelación repetida. Los controles de calidad se clasifican contra curva patrón en tres ejecuciones de ELISA independientes. El CC debe ser aceptable en cada ejecución. Después de completarse tres ejecuciones aceptables, el resultado promedio para cada CC aceptable se informa y se concede un Certificado de Análisis. El CC se usará a sus concentraciones calculadas. Caducan tres meses desde la fecha de preparación. Ejemplo para preparar diluciones de CC congeladas a partir de
25 una referencia de MCP-1 con una concentración de disolución madre de 0,97 mg/ml:
a) Preparar 2,5 ml de 5200 ng/ml en PTB:
13,4 ml de disolución madre + 2,487 ml de diluyente
b) Preparar dilución final de muestras de control de calidad de proteína similar a MCP-1 del siguiente modo:
Concentración de MCP-1 (ng/ml)
5200 ng/ml de proteína similar aMCP-1 para añadir (μl) Cantidad de tampón PTBpara añadir (ml) Volumen total (ml)
17,7
409 119,6 120
5,3
122 119,9 120
1,2
28 120 120
30 Mezclar cada disolución removiendo con vórtex 2-3 segundos y luego invirtiendo suavemente 2-3 veces. Alternativamente, los CC pueden prepararse frescos el día del análisis.
Muestras de prueba. Las muestras de prueba se preparan añadiendo 200 μl de la muestra de prueba a 200 μl de
PTB y removiendo con vórtex durante 2 -4 segundos. Añadir patrones de referencia, controles de calidad (x2) y
muestras de prueba a la placa, por triplicado, 100 μl por pocillo e incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5 ºC (no usar 35 pocillos externos). Preparar anticuerpo de conejo secundario anti-MCP-1 de rata en tampón PTB a una
concentración de 2 μg/ml en volumen suficiente para placas usadas en el ensayo. Remover con vórtex la disolución
aproximadamente 2 -4 segundos. Repetir el lavado, pero lavar cinco veces. Añadir 100 μl de la disolución de
anticuerpo secundario a cada pocillo e incubar durante 60 minutos a 22,5 ± 5 ºC. Preparar disolución de conjugado
terciario de cabra anti-HRP de conejo (por ejemplo, dilución 1:20.000 o dilución apropiada) usando PTB como 40 diluyente. Remover con vórtex la disolución aproximadamente 2 -4 segundos. Repetir el lavado. Añadir 100 μl de
conjugado de HRP a cada pocillo e incubar a 22,5 ± 5 ºC en la oscuridad durante 30 minutos. Repetir el lavado.
Añadir 100 μl de TMB a cada pocillo e incubar a 22,5 ± 5 ºC en la oscuridad durante 3 -6 minutos o hasta que se
haya revelado el color apropiado. Detener la reacción del cromógeno añadiendo 100 μl de H2SO4 1 N en el mismo
orden que se hizo la adición de cromógeno. Leer las densidades ópticas a 450 nm con una longitud de onda de 45 referencia de 630 nm en un lector de placas de 96 pocillos apropiado.
REDUCCIÓN DE DATOS
Usar el software Softmax™ con el archivo de protocolo MCP-1.ppr para construir una curva patrón usando una regresión de cuatro parámetros sin ponderar de la forma.
en la que:
A = valor de absorbancia450 correspondiente a la asíntota mínima. D = valor de absorbancia450 correspondiente a la asíntota máxima. c = concentración correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores asintóticos máximos y
mínimos. b = la pendiente aproximada de la porción lineal de la curva. x = concentración de patrón de referencia.
Informar de resultados solo para muestras con datos aceptables para curvas patrón, controles de calidad y muestras de prueba.
Valores ejemplares para los patrones. Los valores ejemplares para los patrones se aplican a aquellos valores a o por encima del LC (0,8 ng/ml), ya que los valores por debajo del LC se usan solo para ayudar a establecer los extremos de la curva. El fondo medio (el patrón de cero ng/ml) debe ser ≤ 0,1 unidades de absorción. La concentración de MCP-1 (ng/ml) retrocalculada media a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón debe estar dentro del 15% del valor (nominal) diana. El coeficiente de varianza (% de CV) de los valores de A450 por triplicado a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón debe ser ≤ 15%. La media de los valores de A450 por triplicado al LC de la curva patrón debe presentan un % de CV de ≤ 20% y retrocalcularse a dentro del 20% de la diana (concentración nominal, 0,8 ng/ml). Cada valor del triplicado usado para calcular la media se analizará por separado. El valor que se encuentra más alejado de la media se omitirá, la curva se recalculará y los valores ejemplares se reanalizarán. Si se muestra que la media de los dos valores restantes todavía no cumple los valores ejemplares, entonces el punto individual se elimina y la curva se recalcula.
Valores ejemplares para muestras de CC. Una muestra de CC se define como un conjunto de tres pocillos a la concentración establecida, por tanto, para las tres concentraciones nominales establecidas en este procedimiento hay un total de seis muestras de CC. Las concentraciones retrocalculadas de al menos dos de los tres pocillos para una muestra de CC deben estar dentro del 20% de la concentración diana previamente determinada (véase COA) para que la muestra de CC sea aceptable. Al menos cuatro de las seis muestras de CC deben ser aceptables; dos de las seis muestras de CC (no dos a la misma concentración) pueden ser inaceptables y no más de 6 de las 18 muestras de pocillos de CC pueden desviarse más del 20% de las concentraciones diana respectivas. Si estos valores ejemplares no se cumplen, el ensayo debe repetirse.
Valores ejemplares para muestras de prueba. La concentración calculada media de MCP-1 debe ser inferior a la concentración del mayor CC. Si la concentración calculada media de MCP-1 es ≥ 0,8 ng/ml (el LC), el % de CV de las determinaciones por triplicado debe ser ≤ 20%. Si esta condición no se cumple, el resultado de muestra no es válido y debe repetirse. Si este criterio se cumple, la concentración promedio de MCP-1 se usa para calcular el resultado final. Si la concentración calculada de MCP-1 es lt; 0,8 ng/ml (LC), la muestra se informa como lt; LC y el valor “lt; 0,8 ng/ml” se usa en el cálculo del resultado final.
Ejemplo 55 -DETECCIÓN DE ADN DE CHO EN CTLA4A29IL104E-Ig Y CTLA4-Ig POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CUANTITATIVA
Este procedimiento se desarrolló para detectar ADN de CHO residual en las muestras de principio activo usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en tiempo real. La PCR es la replicación de una mezcla de ADN. Este ensayo usa una sonda fluorogénica para detectar un producto de PCR de CHO específico ya que se acumula durante el ensayo. La tasa de amplificación del producto de PCR es directamente proporcional a la cantidad de ADN de partida presente en la muestra.
Valor de conversión de ADN a picogramo / miligramo. El valor en pg/ml se divide entre la concentración de la muestra, determinada por absorbancia a 280 nm. Cálculo de ejemplo para una muestra que tiene una concentración de proteína de 50 mg/ml y un valor informado de BioReliance = 0,67 fg/μl. Etapa 1: Conversión a pg/ml = 0,67 pg/ml. Etapa 2: Conversión a pg/mg = (0,67 pg/ml / 50,0 mg/ml) = 0,013 pg/mg.
Ejemplo 56: ANÁLISIS de CTLA4A29IL104E-Ig POR SDS-PAGE
Este ejemplo describe el análisis de CTLA4A29IL104E-Ig para la evaluación de pureza para principio activo y medicamento de CTLA4A29IL104E-Ig. CTLA4A29IL104E-Ig es una proteína de fusión manipulada que consiste en un dominio de unión a ligando modificado de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y la región Fc(1 de IgG humana. CTLA4A29IL104E-Ig tiene un peso molecular de ∼92 kDaltons y un peso molecular aparente de 97 kDalton (no reducido) o 55 kDalton (reducido). La electroforesis de CTLA4A29IL104E-Ig en geles de SDS-poliacrilamida en gradiente del 4-20% separa las especies monoméricas principales de especies de mayor peso molecular
5 (agregados, dímeros y multímeros de mayor orden), además de cualquier especie de bajo peso molecular (fragmentos de degradación). El escaneo densitométrico y la cuantificación por ImageQuantTL™ de geles teñidos con azul de Coomassie da una medida de la pureza de la proteínas. Los resultados se informan como porcentaje de pureza de CTLA4A19IL104E-Ig bajo condiciones reducidas y no reducidas.
REACTIVOS
10 NOTA: Todos los reactivos pueden sustituirse con alternativas equivalentes. 1X tampón de electroforesis Trisglicina-SDS. Añadir 100 ml de 10X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS a una probeta graduada de 1 litro.
C.S.P. hasta 1 litro con agua Milli-Q o de calidad para HPLC. Cubrir, invertir varias veces para mezclar. Este reactivo debe prepararse el día del ensayo. NOTA: Preparar volumen adicional si se necesita.
Reactivo de tinción con azul de Coomassie. Mezclar la disolución de reactivo GelCode Blue inmediatamente antes
15 de uso invirtiéndola o inclinándola suavemente y girando la botella varias veces. Tal mezcla es especialmente importante si se usa el recipiente GelCode de 3,5 l con una bomba manual (nº de catálogo 24592). No agitar la botella para mezclar la disolución. NOTA: Es importante mezclar el reactivo de tinción antes de dispensarlo para asegurar que la disolución sea homogénea.
Disolución fijadora: 50% de metanol / 7% de ácido acético en agua. Combinar 500 ml metanol y 70 ml de ácido
20 acético en una probeta graduada de 1 litro. C.S.P. con agua Milli-Q a 1 litro y mezclar. La disolución fijadora es estable a temperatura ambiente durante hasta seis meses. NOTA: La disolución fijadora debe prepararse en una campana extractora química.
Preparación del control de tinción. Reconstituir el inhibidor de tripsina para preparar una disolución madre de 2 mg/ml usando agua Milli-Q. Preparar alícuotas de 50 μl y congelar a -30 ± 10 ºC durante hasta 6 meses. Usar el
25 siguiente plan de dilución para diluir la disolución de proteína madre a una concentración de trabajo:
25 μl de disolución madre + 75 μl de agua Milli-Q = 0,5 μg/μl
40 μl de 0,5 μg/μl + 160 μl de agua Milli-Q = 100 ng/μl
Usar la tabla directamente a continuación para preparar la disolución de carga de control de tinción.
Preparación de muestras para control de tinción
Preparación de control de tinción No Reducidas (μl)
Inhibidor de tripsina (100 ng/μl) 10 Tampón de muestra Tris-glicina-SDS (2X) 50 Agua Milli-Q 40 Volumen total 100
30 La carga de 10 μl de la preparación de control de tinción dará una carga de proteína de 100 ng. PREPARACIÓN DE PATRÓN Y DE MUESTRAS Cargar patrón para el procedimiento fijo, principio activo de GLP/GMP, medicamento, o muestras de estabilidad. Dilución para geles teñidos con azul de Coomassie. Diluir artículos de prueba y material de referencia a la
35 concentración de trabajo de 1,0 μg/μl y cargar tanto reducidas como no reducidas con marcadores de peso molecular como se describe directamente en la siguiente tabla.
Dilución de muestras y carga de gel para gel teñido con azul de Coomassie
Carga de
Condición Concentración de trabajo Volumen de
Carril Descripción proteína
(NR/R) (μg/μl) carga (μl)
(μg)
1 Muestras 1 NR 1,0 10 10 2 Material de referencia NR 1,0 10 10 3 Blanco1 NR 0,0 10 0 4 Muestra 1 R 1,0 10 10 5 Material de referencia R 1,0 10 10 6 Patrones de peso molecular R -10
(Continuación)
Carga de
Condición Volumen de
Descripción Concentración de trabajo (μg/μl) proteína
(NR/R) carga (μl)
(μg)
7
Material de referencia R 1,0 10 10
8
Muestra 2 R 1,0 10 10
9
Blanco1 NR 0,0 10 0
10
Material de referencia NR 1,0
10
10
11
Muestra 2 NR 1,0 10 10
12
Control de tinción NR 0,01 10 0,1
1 Blanco = Cargar 10 μl de 1 X tampón de muestra NR NOTA: La banda del control de la tinción se incluye en la imagen del gel escaneada para inspección visual para evaluar la idoneidad del sistema. La banda de control de la tinción está ausente en la imagen de gel recortada para mantener la coherencia de la información del gel.
Preparación y electroforesis de muestras. Dilución de muestras para una carga de proteína de 10 μg/carril. Seguir el
5 procedimiento de más adelante para preparar muestras para una carga de 10 μg/10 μl. Usar agua Milli-Q como diluyente, diluir las muestras de prueba y el material de referencia a 10 mg/ml de CTLA4A29IL104E-Ig. Pueden usarse concentraciones aproximadas para los cálculos. Por ejemplo: si una muestra de principio activo de CTLA4A29IL104E-Ig tiene una concentración de 25 mg/ml, preparar una dilución 1:2,5 (añadir 40 μl de muestra a 60 μl de agua Milli-Q). Seguir la tabla directamente más adelante para preparar la muestra final para electroforesis. Usar tubos Microfuge
10 para estas diluciones.
Dilución de muestras de prueba
Reactivo Reducidas (μl) No reducidas (μl)
Artículo de prueba a 10 mg/ml 10 10 Tampón de muestra Tris-glicina-SDS (2X) 50 50 Agente reductor NuPAGE (10X) 10 NA Agua Milli-Q 30 40 Volumen total 100 100
NOTA: Ajustar el volumen de disolución de proteína y agua Milli-Q según se necesite para lograr un volumen final de 100 μl. NOTA: Si la concentración de muestra es lt; 10 mg/ml, preparar la muestra final según la tabla anterior.
15 Ajustar el volumen de disolución de proteína y agua para maximizar la carga de proteína sobre el gel.
Calentamiento de muestras. Después de preparar diluciones de muestras, cerrar los tubos Microfuge y Remover con vórtex los tubos para mezclar la disolución. Calentar la(s) muestra(s) en un baño de agua a 80 ± 5 ºC durante 2,0 ± 0,5 minutos (usar cronómetro calibrado). Quitar la(s) muestra(s) del calor y dejarla(s) enfriar a temperatura ambiente. Invertir los tubos varias veces para eliminar condensación de la parte superior y los lados de los tubos.
20 Aparato y preparación de gel. Sacar el gel de su envoltorio y sacar cuidadosamente el peine asegurándose de que las paredes de los pocillos sean rectas. Los pocillos pueden ponerse rectos con una punta de carga de gel si fuera necesario. Insertar el gel en la unidad de electroforesis de manera que la placa de vidrio corta esté orientada hacia la cámara interna. Si solo va a ejecutarse un único gel, insertar un espaciador de Plexiglas en la cara opuesta. Meter a presión el (los) gel(es) para sellar la cámara interna de la cámara externa. Llenar completamente la cámara interna
25 con 1X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS. Comprobar para filtraciones, entonces llenar la cámara externa hasta el fondo de los pocillos con 1X tampón de electroforesis Tris-glicina SDS. Aclarar suavemente los pocillos usando una pipeta con 1X tampón de electroforesis Tris-glicina-SDS para eliminar cualquier acrilamida residual. Repetir el aclarado de pocillos hasta que los pocillos estén completamente claros y definidos.
Carga de muestra. Usar puntas de carga de gel, cargar cada pocillo con 10 μl de muestra. Llenar todos los carriles
30 de blanco con 10 μl de 1X tampón de muestra no reductor. Esto ayudará a prevenir la reducción de la muestra no reducida debido a la filtración del agente reductor y mantendrá una concentración similar de sales a través de todo el gel.
Electroforesis. Poner la tapa de la caja de gel y conectar los electrodos a la fuente de alimentación. Ajustar la corriente a 25 mAmps/gel (mA) y fijar el voltaje (v) y potencia (w) al máximo. NOTA: Los ajustes de la fuente de alimentación pueden variar de vendedor a vendedor. Ajustar los parámetros para lograr 25 mA/gel. Someter a electroforesis el gel durante 60 minutos o hasta que el frente del tampón de muestra colorante llegue justo al fondo del gel. Apagar la fuente de alimentación, desconectar los cables y sacar el (los) gel(es) del dispositivo. Separar cuidadosamente haciendo palanca en las placas de plástico. Mantener la placa de plástico con el gel unido sobre la
5 disolución fijadora apropiada para la técnica de tinción. Sumergir el gel en la disolución hasta que el gel se desplace de la placa de plástico.
Fijación del gel. NOTA: Todas las etapas se realizan a temperatura ambiente con balanceo suave en un agitador orbital. NOTA: Realizar la tinción en un recipiente fuertemente cerrado para prevenir la evaporación de reactivo. NOTA: Aunque el volumen citado puede usarse, es imprescindible que el gel esté completamente cubierto en todas 10 las etapas. El tamaño del gel y la bandeja de tinción deben tenerse en cuenta en la determinación de los volúmenes necesarios. Después de la electroforesis, añadir 50 ml de la disolución fijadora (50% de metanol/ 7% de disolución de ácido acético) durante 15 minutos. Aclarar el gel 3 veces durante 5 minutos cada vez con ∼100 ml de agua Milli-
Q. Mezclar la disolución de reactivo de tinción de Coomassie antes de uso y añadir 50 ml para un minigel de 8 x 10 cm. Puede requerirse reactivo adicional si se usa una bandeja mayor. Agitar suavemente la bandeja usando un
15 agitador orbital durante 20 ± 1 horas. Para consistencia, teñir todos los geles en la misma ejecución durante la misma duración. Desteñir reemplazando el reactivo de tinción de Coomassie con 100 ml de agua Milli-Q. Después de 1 hora de desteñir, el gel está listo para el escaneo.
ESCANEO Y ANÁLISIS DE GEL
Después de la electroforesis y tinción, todos los geles se escanean usando un densitómetro y se analizan usando el
20 software ImageQuantTL™. Los archivos de imágenes se almacenan en el disco duro local del ordenador y se archivan mediante la red de área local. Los parámetros de escaneo y análisis se enumeran en la tabla directamente a continuación.
Parámetros de escaneo y análisis de geles
Parámetros de escaneo Ajuste
Tamaño de píxel del escaneo 100 Resolución digital del escaneo 12 bits
Parámetros de detección de bandas
Corrección del fondo Radio fijado a 200
Pendiente mínima Inicial 500
Reducción del ruido Inicial 5
% de pico máximo Inicial 0
% de anchura del carril Fijar al 75%
NOTA: Los parámetros de escaneo en esta tabla no deben cambiarse durante el escaneo. Los parámetros de detección de bandas, % de anchura del carril (fijada a 75%) y corrección del fondo (fijada a 200 radios) son recomendados para todos los análisis de imágenes de gel escaneadas (cualquier cambio necesitará documentarse). Los parámetros de ajuste de pendiente mínima, reducción del ruido y % de pico máximo pueden ser necesarios para identificar con exactitud bandas debido a diferencias en las propiedades físicas del gel, tal como el encogimiento del gel después de tinción/destinción o diferencias en la forma de la forma de la banda de gel. Corregir manualmente cualquier banda perdida o erróneamente identificada. Se remite al manual de ImageQuantTL (v2003.03) e instrucciones en pantalla para información adicional para parámetros de detección de bandas.
Barrer el gel usando los parámetros de escaneo enumerados en la tabla anterior. Todos los análisis y evaluaciones
25 del gel deben hacerse a partir de la imagen escaneada. Abrir un archivo de imagen de gel (imagen escaneada) de lt;Análisis de gel 1Dgt; en el software ImageQuantTL. Ir a lt;Contrastegt; en la barra de herramientas y fijar el parámetro lt;Histograma de imágenes -Altogt; a 0,3 para potenciar la imagen del gel para la visualización clara de todas las bandas. NOTA: Esta etapa es para la fácil visualización de la imagen del gel para el posterior análisis y no tiene impacto sobre el resultado cuantitativo. No usar la imagen del gel potenciada con el fin de evaluación visual de las
30 bandas de gel o presentación del gel. Seleccionar lt;Creación de carrilgt; y elegir lt;Manualgt; para fijar el lt;Número de carrilesgt; a analizar. Ajustar lt;% de anchura del carrilgt; hasta el 75%. Alinear apropiadamente carriles individuales si fuera necesario. Usar el procedimiento de lt;Bola rodantegt; para restar el fondo. Para explicar con exactitud el fondo, fijar lt;Radiogt; a 200. Detectar bandas usando los ajustes iniciales lt;Pendiente mínimagt;, lt;Reducción de ruido gt;, lt;% de pico máximogt; enumerados en la Tabla 4. El ajuste de estos valores puede ser necesario para identificar con exactitud bandas. Evaluar manualmente cualquier banda perdida o erróneamente identificada. Determinar el peso molecular de la banda usando el marcador de peso molecular enumerado más adelante. Saltarse las etapas de
5 calibración y normalización. Exportar los resultados que incluyen los pesos moleculares, volumen de banda y % de banda a una hoja de cálculo de Excel para la posterior documentación y presentación. Once de los doce patrones de peso molecular enumerados en la Tabla 5 deben distinguirse fácilmente del fondo (Figura 79). Nota: La cadena B de insulina (3.500 Da) y la cadena A de insulina (2.500 Da) pueden aparecer como una única banda ancha o la cadena A de insulina puede no identificarse visualmente sobre el gel.
10 Señalar 12 patrones de peso molecular
Marcador de proteína Peso molecular (Daltons)
Miosina (músculo de conejo) 200.000 β-Galactosidasa (E. coli) 116.300 Fosforilasa B (músculo de conejo) 97.400 Albúmina de suero bovino 66.300 Deshidrogenasa glutámica (hígado bovino) 55.400 Lactato deshidrogenasa (músculo porcino) 36.500 Anhidrasa carbónica (eritrocito bovino) 31.000 Inhibidor de tripsina (soja) 21.500 Lisozima (clara de huevo) 14.400 Aprotinina (pulmón bovino) 6.000 Cadena B de insulina (páncreas bovino) 3.500 Cadena A de insulina (páncreas bovino) 2.500
En este ejemplo, las principales bandas del artículo de prueba, para tanto no reducidas (monómero) como reducidas (cadena individual), van a estar en la misma posición relativa sobre el gel que el material de referencia de CTLA4A29IL104E-Ig. Véase la Figura 79. El control de tinción del patrón inhibidor de tripsina de soja (21.500 Da) a 100 15 ng/carga debe ser visible en la imagen de gel escaneada (Figura 79, carril 12). Con la excepción de una banda menor bajo condición no reductora que comúnmente se observa (cadena individual) proximal al marcador de peso molecular de 55.400 Da, el porcentaje relativo de intensidad de cualquier banda adicional en el gel teñido con azul de Coomassie debe ser ≤ 2% para material de referencia. NOTA: Una estimación del peso molecular de la banda principal no puede determinarse con exactitud debido a su distribución no gausiana. La inspección visual del material 20 de referencia reducido es para dar una única banda ancha que migra a una posición proximal al marcador de peso molecular de 55.400 Da (véase la Figura 79). El porcentaje de pureza para la principal banda reducida debe ser ≥ 97%. La inspección visual de la banda principal del material de referencia no reducido debe dar una única banda ancha que migra a una posición proximal hacia los marcadores de peso molecular de 97.400 Da y 116.300 Da (Figura 79, carril 2). El porcentaje de pureza de la banda principal del material de referencia debe ser ≥ 97%. La
25 inspección visual de la banda principal del material de referencia no reducido debe dar una única banda ancha que migra a una posición proximal a los marcadores de peso molecular de 97.400 Da y 116.300 Da (Figura 79, carril 2). El porcentaje de pureza de la banda principal del material de referencia debe ser ≥ 97%.
Ejemplo 57 -UN PROCEDIMIENTO DE HPLC PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRITON X-100 EN CTLA4A29IL4E-Ig
30 Se determina Triton X-100 a nivel de bajas partes por millón (ppm) (lt;10 ppm) en muestra de proteínas de CTLA4A29IL104E-Ig por HPLC. El procedimiento implica extracción de Triton X-100 sobre medios de extracción en fase sólida seguido de lavado con agua para eliminar proteína residual y elución de Triton X-100 con acetonitrilo. El eluato de acetonitrilo se purifica por cromatografía usando una columna Hypersil C1 de Phenomenex y una fase móvil que consiste en acetonitrilo:agua (80:20). La detección es por UV a 225 nm. El procedimiento es lineal entre 1
35 22 ppm siendo el límite de detección 0,25 ppm. CTLA4A29IL104E-Ig, un posible agente inmunodepresor, es una proteína de fusión de segunda generación que consiste en el dominio de unión a ligando de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana. Triton X-100, un tensioactivo no iónico, se usa para la inactivación viral en la purificación de CTLA4A29IL104E-Ig. Aún cuando Triton X-100 se elimine, niveles residuales o ausencia del tensioactivo de la proteína necesitan establecerse para la calidad del producto y
40 fines reguladores. Para este fin se desarrolló un procedimiento que puede detectar y cuantificar niveles traza de Triton X-100. Triton X-100 se extrae de la proteína sobre un medio de SPE y se eluye con acetonitrilo para análisis por HPLC.
Preparación de patrones
Blanco. Cualquier muestra o patrón de referencia previamente analizado por este procedimiento y que se encuentra que no contiene niveles detectables de Triton X-100 puede usarse como blanco. La concentración de proteína en el blanco y la muestra debe ser similar. El blanco debe ejecutarse junto con la(s) muestra(s).
Disolución madre de patrón. Pesar con exactitud 10,0 ∀ 1,0 mg de Triton X-100 en un volumétrico de 100 ml y enrasar con agua y mezclar. NOTA: Triton X-100 se disuelve lentamente en agua. Examinar la disolución para disolución completa (normalmente después de 15 minutos) antes de uso. Triton X-100 es más viscoso que el agua, por lo que las cantidades sin disolver son visibles en presencia de agua.
Disolución patrón de trabajo. Añadir 25 μl de la disolución padrón madre de Triton X-100 en 0,5 ml del blanco de CTLA4A291L104E-Ig. Mezclar minuciosamente removiendo con vórtex u otros medios apropiados. Esta disolución patrón de trabajo contiene aproximadamente 5 ppm (o 5 μg/ml en peso/volumen) de Triton X-100. NOTA: Las disoluciones patrón debe prepararse frescas diariamente.
Preparación de muestras. La muestra se usa como tal. El blanco debe ejecutarse junto con la(s) muestra(s). Extracción de Triton X-100 de disoluciones patrón y de muestra. Las etapas de extracción descritas más adelante se realizan bajo un vacío de 3-5 pulgadas de Hg.
Activación de medios de extracción en fase sólida (SPE). Levantar la tapa del colector de vacío y poner los tubos de ensayo en la gradilla dentro del colector. Estos son tubos de ensayo “de desecho”. Volver a poner la tapa y poner tubos de SPE en el colector de vacío, asegurándose de que haya un tubo de ensayo “de desecho” debajo de cada tubo de SPE. Añadir un ml de acetonitrilo a cada tubo y aplicar vacío a los tubos hasta que todo el acetonitrilo haya pasado a través del lecho de medio. Repetir la etapa. Concentración de Triton X-100 sobre el medio de SPE de la matriz de patrón/muestra. En tubos de SPE activados separados, pipetear 0,50 de cada una de la disolución patrón de trabajo, muestras y blanco. Aplicar vacío a los tubos de SPE hasta que la disolución haya pasado completamente a través del lecho de medio. Eliminar la proteína residual del lecho de SPE. Añadir un ml de agua a cada tubo de SPE y aplicar vacío a los tubos hasta que el agua haya pasado a través del lecho de medio. Repetir la etapa. Eluir Triton X-100 del lecho de SPE. Apagar el vacío al colector para llevar la unidad a presión normal. Levantar suavemente la tapa del colector, con el patrón y tubos de SPE de muestra todavía sujetos. Reponer los tubos de ensayo “de desecho” con un conjunto de tubos de ensayo previamente etiquetados (para patrón, blanco y muestras) para recoger cualquier Triton X-100 que pueda eluir de los lechos de SPE en las siguientes etapas. Estos son los tubos de ensayo del eluato. Volver a poner la tapa del colector, asegurándose de que cada muestra, blanco y lecho de SPE patrón tenga el tubo de ensayo de eluato respectivo debajo. Añadir 0,50 ml de acetonitrilo a cada tubo de SPE y aplicar vacío a los tubos hasta que todo el acetonitrilo haya pasado a través del lecho de medio. Apagar el vacío al colector y levantar la tapa para recuperar los tubos de ensayo del eluato. Poner los eluatos de acetonitrilo del patrón, muestras y blanco en los viales del inyector automático para inyección en el sistema cromatográfico.
IDONEIDAD DEL SISTEMA
Equilibrar la columna/sistema con la fase móvil durante aproximadamente una hora antes de empezar las inyecciones. Obtener el cromatograma de la disolución patrón. El tiempo de retención para Triton X-100 debe ser 5 ∀1 minutos. La eficiencia de la columna para Triton X-100, evaluada como el número de platos teóricos, N, debe ser gt; 2000 platos/columna cuando
calculado según la siguiente ecuación:
en la que:
t es el tiempo de retención del pico de Triton X-100 y w es la anchura en la base del pico de Triton X-100 obtenida extrapolando los lados del pico a la base. Hacer al menos tres inyecciones de disolución patrón. El porcentaje de DER de los recuentos de área de las tres últimas inyecciones no debe ser superior al 3,0%.
Restar el cromatograma del blanco de los cromatogramas de patrón y muestra y proceder con los siguientes cálculos: Concentración de Triton X-100 (ppm) =
área de muestra x pesodeTritonX 8 100(mg)x0,5 ppmárea de patrón
en la que:
100∀g 1 25 microlitros 1 ml
0,5 5 XX X
1mg 100 ml 0,5 ml 1000 microlitros
Ejemplo 58 -Ensayo para determinar el contenido de ADN celular de CHO de la composición de CTLA4-Ig
Este procedimiento se desarrolló para detectar ADN de CHO residual en muestras de principio activo de CTLA4-Ig usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en tiempo real. La PCR es la replicación de una mezcla de ADN. Este ensayo usó una sonda fluorogénica para detectar un producto de PCR de CHO específico ya que se acumula durante el ensayo. La tasa de amplificación del producto de PCR es directamente proporcional a la cantidad de ADN de partida presente en la muestra. El objetivo es detectar la cantidad de ADN de CHO genómico en muestras de composiciones de CTLA4-Ig.
La muestra se analiza detectando ADN de CHO en muestras biológicas por análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Los cálculos se llevan a cabo y los resultados se informan con dos cifras significativas en las unidades de pg/mg. Si los resultados son inferiores al límite de cuantificación del ensayo, los resultados se informan como lt; LC y el LC del ensayo se registra. Hay una conversión de valor de ADN a picogramo / miligramo. El valor en pg/ml se divide entre la concentración de la muestra, determinada por absorbancia a 280 nm. Cálculo de ejemplo para una muestra que tiene una concentración de proteína de 50 mg/ml y un valor informado de BioReliance = 0,67 fg/μl. Etapa 1: Conversión a pg/ml = 0,67 pg/ml. Etapa 2: Conversión a pg/mg = (0,67 pg/ml / 50,0 mg/ml) = 0,013 pg/mg.
Ejemplo 59 -Determinación de proteína MCP-1 en muestras biológicas y en composiciones de CTLA4-Ig
El ejemplo explica procedimientos usados para cuantificar proteína similar a MCP-1 residual en las muestras biológicas y muestras de CTLA4-Ig.
Materiales:
Anticuerpo neutralizante de cabra anti-MCP-1 de R&D Systems (nº de catálogo AB-479-NA), guardar a -20 ºC ratón (JE anti-murino [MCP-1])
Anticuerpo de conejo anti-MCP-1 de rata Pepro Tech, (nº de catálogo 500-P76), guardar a -20 ºC
Conjugado de cabra anti-IgG de conejo (H+L)-HRP Southern Biotech (nº de catálogo 4050-05, guardar a 2-8 ºC
Reactivos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS, tampón fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,3 a 7,5). Preparar según indicaciones del fabricante en la botella. A un recipiente de tamaño suficiente, añadir agua de calidad para HPLC, pellas de PBS y una barra de agitación. En una placa con agitación mezclar hasta que las pellas y la sal se disuelvan. Ajustar a pH 7,3 a 7,5 según sea necesario con hidróxido sódico o ácido clorhídrico. Agitar hasta mezclar bien. Filtrar a través de una unidad de filtro de 0,22 μm desechable. Guardar la disolución a 2-8 ºC durante hasta 30 días desde la fecha de preparación.
MCP-1 (proteína-1 quimiotáctica de monocitos) es una proteína humana que desempeña una función en el reclutamiento de monocitos a sitios de lesión e infección. Una proteína puede considerarse similar a MCP-1 basándose en la homología y reactividad cruzada con anticuerpos contra MCP-1. Como los anticuerpos usados en el ELISA solo reconocen una parte de la proteína diana, formas truncadas de MCP-1 pueden reaccionar en el ensayo aún cuando no puedan ser técnicamente activas. Así, cualquier variante de MCP-1 de hámster que reacciona en el ensayo se cuantificará de manera que el ensayo detecte MCP-1 de longitud completa y cualquier variante de MCP-1 que contenga los epítopes correctos. Obsérvese que usando una mezcla de anticuerpos policlonales es más probable que se representen varios epítopes.
Disolución de lavado (tampón 1,0 mM, NaCl 137 mM, KCl 0,27 mM, pH 7,3 a 7,5 que contiene 0,01% v/v de Tween 20). A 4,0 l de agua destilada o de calidad para HPLC añadir una barra de agitación, 2 comprimidos de PBS, 28,8 g de NaCl y 0,4 ml de Tween 20. Mezclar suavemente hasta que se disuelvan todos los contenidos. Ajustar a pH 7,3 a 7,5 según sea necesario con hidróxido sódico o ácido clorhídrico. Guardar a 2-8 ºC durante hasta 30 días desde la fecha de preparación.
Diluyente (PBS, pH 7,3 a 7,5 que contiene 1% en peso/volumen de BSA y 0,05% en v/v de Tween 20). (Por favor, obsérvese que esto es una alternativa al uso de diluyente comercialmente disponible). A 4 l de solución salina tamponada con fosfato, añadir una barra de agitación, 40 g de BSA y 2 ml de Tween 20. Mezclar suavemente hasta que se disuelvan todos los contenidos. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm. Guardar a 2-8 ºC durante hasta 30 días desde la fecha de preparación cuando se guarda sin abrir o 7 días después de abrirse.
Reactivo de recubrimiento de placas. Reconstituir varios viales de anticuerpo de cabra anti-MCP-1 de ratón según instrucciones del fabricante, mezclar invirtiendo suavemente varias veces y combinar. Preparar alícuotas y guardar a -20 ºC durante hasta un año (no superar la fecha de caducidad del fabricante). Evitar congelación-descongelación repetida. Alternativamente, los viales de muestra liofilizados pueden almacenarse a -20 ºC durante más de seis
meses. Tras la reconstitución, el anticuerpo puede almacenarse a 2-4 ºC durante un mes. Reactivo secundario. Reconstituir un vial de anticuerpo de conejo anti-MCP-1 de rata según instrucciones del
fabricante, mezclar invirtiendo suavemente varias veces. La disolución se almacena a 2-8 ºC durante hasta cuatro semanas. Alternativamente los viales de muestra liofilizados son estables a -20 ºC durante más de un año. Reactivo terciario. Reunir varios viales de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (H+L)-HRP y mezclar invirtiendo
suavemente varias veces. Preparar alícuotas y guardar a -20 ºC durante hasta 2 años (no superar la fecha de caducidad del fabricante). Evitar congelación-descongelación repetida. Una vez descongelado, el vial puede almacenarse a 2 a 8 ºC durante hasta 30 días.
Preparación de patrones. A partir de la disolución madre de proteína similar a MCP-1, preparar una disolución 25,6 ng/ml en diluyente y diluir a partir de aquí en etapas de dilución seriada (2 veces) a 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8 y 0,4. El patrón de 0 ng/ml es diluyente sin diluir.
Ejemplo para preparar patrones usando material de referencia de MCP-1 con una concentración de disolución madre de 0,97 mg/ml: b) (Disolución A) Preparar 2,5 ml de 5200 ng/ml en diluyente: 13,4 ul de disolución madre + 2,487 ml de diluyente c) (Disolución B) Preparar 3,9 ml de 25,6 ng/ml en diluyente: 19,2 ul de disolución madre a + 3,881 ml de diluyente Preparar los patrones restantes usando los volúmenes definidos a continuación:
Disolución de trabajo Volumen (ml) Diluyente (ml) Concentración final (ng/ml)
25,6 ng/ml 1 ml 0 25,6 ng/ml 25,6 ng/ml 1 ml 1 ml 12,8 ng/ml 12,8 ng/ml 1 ml 1 ml 6,4 ng/ml 6,4 ng/ml 1 ml 1 ml 3,2 ng/ml 3,2 ng/ml 1 ml 1 ml 1,6 ng/ml 1,6 ng/ml 1 ml 1 ml 0,8 ng/ml 0,8 ng/ml 1 ml 1 ml 0,4 ng/ml
Mezclar cada disolución removiendo con vórtex a ajuste medio durante aproximadamente 2 -3 segundos y luego
invirtiendo suavemente 2 -3 veces. Preparación de muestras de control de calidad. Preparar muestras de control de calidad (CC) a partir de un vial de proteína similar a MCP-1 en diluyente. Preparar a 520 ng/ml de concentración de disolución madre a partir de la cual se preparan las siguientes muestras de control de calidad para congelación: 11,0 ng/ml, 5,3 ng/ml y 1,2 ng/ml. Diluir como se describe en la tabla más adelante.
Ejemplo para preparar CC usando material de referencia de MCP-1 con una concentración de disolución madre de 0,97 mg/ml:
a) (Disolución A) Preparar 2,5 ml de 5200 ng/ml en diluyente: 13,4 ul de disolución madre + 2,487 ml de diluyente b) (Disolución B) Preparar 5,0 ml de 520 ng/ml en diluyente: 500 ul de disolución madre + 4,500 ml de diluyente c) Preparar dilución final de muestras de CC de proteína similar a MCP-1 del siguiente modo:
Identificación de CC
Concentración de MCP-1 (ng/ml) Disolución B de CC para añadir (μl) Cantidad de diluyentepara añadir (ml) Volumen total (ml)
CC 1
11,0 106 4,894 5,0
CC 2
5,3 53 5,147 5,2
CC 3
1,2 12 5,188 5,2
Mezclar cada disolución removiendo con vórtex a ajuste medio durante aproximadamente 2 -3 segundos y luego invirtiendo suavemente 2 -3 veces.
Preparación de muestras de prueba. Cada muestra de prueba consiste en artículo de prueba diluido. Las muestras de prueba se preparan añadiendo 200 μl de la muestra de prueba a 200 μl de diluyente. Mezclar cada disolución removiendo con vórtex a velocidad media durante aproximadamente 2 -3 segundos y luego invirtiendo suavemente 2 -3 veces.
Procedimiento. Recubrimiento de placas. Diluir anticuerpo de cabra anti-MCP-de ratón a 5 μg/ml con PBS. Mezclar el anticuerpo y disolución de PBS removiendo con vórtex a ajuste medio durante aproximadamente 2 -3 segundos y luego invirtiendo suavemente 2 -3 veces. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de esta disolución a cada pocillo. Cubrir las placas con sellantes de placa e incubar a temperatura ambiente durante 12 a 18 horas. Lavar las placas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado usando un lavador de placas. Fijar el lavador a tres lavados, 300 μl/pocillo con un tiempo de empapamiento de cero. Alternativamente, las placas pueden lavarse manualmente. Añadir 300 μl de disolución de lavado a cada pocillo de cada placa usando un pipeteador multicanal. Vaciar los pocillos dando golpecitos en un sumidero y transferir suavemente sobre toallas de papel. Repetir tres veces. Bloqueo de placas. Añadir 300 μl de CSBB a cada pocillo usando un pipeteador multicanal. Incubar las placas durante aproximadamente 60 ± 10 minutos a temperatura ambiente. Adición de muestras. Añadir patrones de referencia, controles de calidad (dos conjuntos de cada concentración) y muestras de prueba a la placa, por triplicado, 100 μl/pocillo, e incubar durante aproximadamente 60 ± 10 minutos a temperatura ambiente. No usar pocillos externos. Preparar anticuerpo de conejo secundario anti-MCP-1 de rata. Diluir disolución madre de anticuerpo de conejo anti-MCP-1 de rata a 2 μg/ml o dilución apropiada (según la prueba de equivalencia de lotes o COA) en diluyente en volumen suficiente para placas usadas en el ensayo. Remover con vórtex la disolución aproximadamente 2 -4 segundos a velocidad media. Repetir el lavado de placas, pero lavar cinco veces. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de disolución de anticuerpo secundario a cada pocillo e incubar durante 60 ± 10 minutos a temperatura ambiente. Preparar disolución de conjugado terciario de cabra anti-HRP de conejo (0,5 μg/ml
o dilución apropiada) usando diluyente. Mezclar conjugado de HRP removiendo con vórtex a ajuste medio durante aproximadamente 2 -3 segundos y luego invirtiendo suavemente 2 -3 veces. Diluir a la concentración establecida según SOP del departamento para la cualificación de reactivos. Repetir el lavado de placas cinco veces. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de conjugado de HRP a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante aproximadamente 30 ± 5 minutos. Repetir el lavado de placas cinco veces. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de TMB a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante aproximadamente 2,5 -4 minutos. Usando una pipeta multicanal, detener la reacción de TMB añadiendo 100 μl de H2SO4 1,0 N en el mismo orden que se hizo la adición de TMB. Leer las densidades ópticas a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en un lector de placas de 96 pocillos.
Valores ejemplares. Los valores ejemplares para los patrones se aplican a aquellos valores a o por encima del límite cuantitativo (LC) (0,8 ng/ml), como valores por debajo del LC se usan solo para ayudar a establecer los extremos de la curva. El fondo medio, usando el siguiente cálculo (el patrón de cero ng/ml) debe ser ≤0,1 unidades de absorción.
en la que:
X1,2,3 = un valor específico en un conjunto de datos N = número de valores en un conjunto de datos
Cada concentración de patrón usada para determinar la curva patrón, excluyendo el cero, 0,4 y el LC (0,8 ng/ml), debe estar dentro del 15% del valor (nominal) diana. El coeficiente de varianza (% de CV) de los valores de AB450 por triplicado a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón, con la excepción de cero, 0,4 y el LC (0,8 ng/ml), debe ser ≤ 15%. La concentración calculada media de MCP-1 para una muestra de prueba de composición de CTLA4-Ig debe ser ≤ 11,0 ng/ml. Si la concentración calculada media de MCP-1 es ≥ 0,8 ng/ml (el LC del ensayo), calcular el % de CV de las determinaciones por triplicado y los valores ejemplares deben ser ≤ 20%. Si los valores ejemplares se cumplen, la concentración media de MCP-1 se usa para calcular ppm. Si la concentración calculada de MCP-1 es ≤ 0,8 ng/ml (LC del ensayo), la muestra se informa como lt; LC y el valor “lt; 0,8 ng/ml” se usa en el cálculo de ppm. El % de CV de la determinación por triplicado no se considera.
Una muestra de CC se define como un conjunto de tres pocillos a la concentración establecida, por tanto, para las tres concentraciones nominales establecidas en este procedimiento hay un total de seis muestras de CC. Las concentraciones de al menos dos de los tres pocillos para una muestra de CC deben ser del 20% de la concentración nominal establecida para que la muestra de CC sea aceptable. Al menos doce de las dieciocho determinaciones de muestra de CC deben estar dentro del 20% de sus valores diana respectivos. Seis de las dieciocho muestras de CC (no tres a la misma concentración) pueden desviarse más del 20% del valor nominal respectivo. Al menos cuatro de las seis muestras de CC deben ser aceptables. Se permite que dos sean inaceptables, a condición de que ambas no sean a la misma concentración.
Evaluación de datos. Usar el software Softmax™ con el archivo de protocolo MCP-1.ppr para construir una curva patrón usando una regresión de cuatro parámetros sin ponderar de la forma:
en la que:
5 A = valor de absorbancia450 correspondiente a la asíntota mínima. D = valor de absorbancia450 correspondiente a la asíntota máxima. c = concentración correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores asintóticos máximos y
mínimos. b = la pendiente aproximada de la porción lineal de la curva. 10 x = concentración de patrón de referencia.
Cálculos para la concentración de proteína similar a MCP-1. La cantidad de proteína similar a MCP-1 en la muestra de prueba puede calcularse usando el software del lector de placas Softmax. El ejemplo más adelante ilustra cómo pueden informarse los resultados finales. Se ensaya una dilución doble de cada muestra. La concentración calculada se multiplica por el factor de dilución apropiado (2) para dar la concentración en el artículo de prueba sin
15 diluir.
Ejemplos:
1) La muestra de prueba diluida es 10,0 ng/ml. La concentración de proteína similar a MCP-1 en el artículo de prueba sin diluir es: 10 ng/ml x 2 = 20 ng/ml de MCP-1
20 2) El resultado de muestra diluida es “lt;0,8 ng/ml”. La concentración de proteína similar a MCP-1 en el artículo de prueba sin diluir es: “lt;0,8 ng/ml” x 2 = “lt;1,6 ng/ml” de MCP-1
Para informar el resultado final en ng de proteína similar a MCP-1 por mg de muestra (ppm), dividir el resultado obtenido anteriormente entre la concentración de muestras sin diluir.
25 Ejemplos:
1) Concentración de proteína de muestra de prueba = 50 mg/ml Concentración de proteína similar a MCP-1 = 200 ng/ml: 200 ng/ml de MCP-1 / 50 mg/ml = 4 ng/mg La muestra se informa como 4 ppm (partes por millón)
30 2) Concentración de proteína de muestra de prueba = 50 mg/ml Concentración de proteína similar a MCP-1 = “lt;1,6 ng/ml”: “lt;1,6 ng/ml” de MCP-1 / 50 mg/ml = “lt;0,032 ng/mg” La muestra se informa como “lt;LC (lt;0,032 ppm)”
Ejemplo 60: Ensayo para la determinación de niveles residuales de proteína CD-CHO1 por ELISA para la 35 prueba de liberación del material de principio activo de CTLA4-Ig
Tampón carbonato. A un recipiente adecuado que contiene una barra de agitación añadir 200 ml con agua de calidad para HPLC, contenidos de 2 cápsulas de tampón carbonato. Usando una placa de agitación, mezclar hasta que el material esté en disolución. Usando un pH-metro ajustar el pH a 9,6 según sea necesario con tanto NaOH 1 N como H2SO4. Usando una placa de agitación, mezclar la disolución durante un mínimo de 5 minutos. Filtrar la
40 disolución a través de o H2SO4. Usando una placa de agitación, mezclar la disolución durante un mínimo de 5 minutos. Filtrar la disolución a través de un filtro de 0,22 μm. Guardar la disolución a 2 -8 ºC durante hasta 30 días y etiquetar según procedimientos del departamento.
Tampón de lavado (PBS que contienen 0,05% en v/v de Tween 20, pH 7,4). A una botella de 4 l de agua de calidad para HPLC añadir una barra de agitación, 20 comprimidos de PBS. Añadir 2 ml de Tween 20. Usando una placa de
45 agitación, mezclar hasta que el material esté en disolución. Usando un pH-metro ajustar el pH a 7,4 según sea necesario con tanto NaOH 1 N como HCl 1 N. Usando una placa de agitación, mezclar la disolución durante un mínimo de 5 minutos. Guardar la disolución a 2 -8 ºC durante hasta 30 días y etiquetar según procedimientos del departamento.
Estreptavidina-HRP. Añadir 0,5 ml de agua de calidad para HPLC a un vial de estreptavidina-HRP. Para mezclar, 50 tapar el vial y remover suavemente con vórtex durante aproximadamente 10 segundos. Añadir 0,5 ml de glicerol al
vial de estreptavidina-HRP. Mezclar. Comprobar la claridad de la disolución extrayendo disolución en una pipeta de Pasteur limpia. Si la disolución no es clara, mezclar según 3.3.2 y repetir 3.3.5 hasta que la disolución sea clara. Determinar el esquema de dilución apropiado que va a usarse para el lote de estreptavidina-HRP según procedimientos del departamento. Separar en alícuotas de volúmenes de 20 μl a tubos de tapa roscada de 0,5 ml. Tapar y poner en una caja de almacenamiento de células. Guardar la disolución a -20 ºC durante hasta 365 días y etiquetar según procedimientos del departamento.
Disolución de parada (H2SO4 1 N). En una campana extractora, poner un recipiente adecuado sobre una placa de agitación. Añadir una barra de agitación. Añadir 485,6 ml de agua de calidad para HPLC. Encender el sitio de agitación para empezar la agitación de agua. Lentamente añadir 14,4 ml de H2SO4 concentrado. La disolución es estable durante 90 días cuando se guarda a temperatura ambiente. Etiquetar la disolución según procedimientos del departamento.
Procedimiento de recubrimiento de placas. Preparar una disolución de 8 μg/ml de anticuerpo de conejo anti-CD CD CHO1 purificado en tampón carbonato que va a usarse para el recubrimiento de placas de microtitulación (se requieren 10 ml de disolución por placa de microtitulación). Añadir 100 μl de esta disolución a cada pocillo de una placa de microtitulación Immulon 4 usando un pipeteador multicanal. Cubrir la placa de microtitulación con Parafilm e incubar a 2 -8 ºC durante 18 ± 2 horas.
Lavado de placas. Lavar la placa tres veces con 300 μl de tampón de lavado usando instrumento lavador de placas. (Alternativamente, la placa puede lavarse manualmente usando un pipeteador multicanal.) Tras el último lavado, la placa debe darse la vuelta y golpearse contra una toalla de papel depositada sobre una superficie dura.
Bloqueo de placas. Usando una pipeta multicanal, añadir 300 μl de SeaBlock a cada pocillo. Incubar la placa en la oscuridad durante 1 hora (± 6 minutos) a temperatura ambiente. Las placas pueden tanto envolverse con lámina de aluminio como ponerse en una vitrina o cajón. Preparación de muestras de curva patrón usando diluyente Teknova en tubos de 15 ml de polipropileno estériles graduados según el siguiente esquema de dilución. Nota: El siguiente esquema de dilución es para 5 placas. Ajustar volúmenes según sea necesario para el número de placas en el ensayo. Obtener la concentración de proteína de la proteína patrón de referencia CD-CHO1 (patrón ref) del Certificado de Análisis (COA). Preparar una disolución de 30 μg/ml de patrón ref de proteína CD-CHO 1. Calcular el volumen requerido de patrón ref de proteína CD-CHO 1 para obtener una disolución de 30 μg/ml. El volumen de transferencia mínimo para el patrón ref de proteína CD-CHO 1 debe ser 10 μl.
Concentración deseada x Volumen deseado
Fórmula: Volumen 5
Concentración de materialdereferencia
Nota: Asegurar que las unidades sean compatibles.
Ejemplo:
30∀g/ml x10ml 5 12∀l25mg/ml
Calcular el volumen de diluyente restando el volumen requerido de patrón ref de proteína CD-CHO 1 del volumen deseado.
Fórmula:
(Volumen deseado) – (Volumen de patrón ref) = (Volumen de diluyente)
Ejemplo: 10,0 ml – 0,012 ml = 9,988 ml de diluyente
Añadir volumen calculado de patrón ref de proteína CD-CHO 1 a un tubo estéril de 15 ml que contiene volumen de diluyente calculado. Tapar el tubo y Remover con vórtex a un ajuste entre durante 2 -4 segundos. Preparar los restantes patrones. La siguiente tabla se muestra como un ejemplo:
Concentración de trabajo (ng/ml)
Volumen (ml) Diluyente (ml) Volumen total (ml) Concentración (ng/ml)
30.000
0,6 5,4 6,0 3.000
3.000
2,0 4,0 6,0 1.000
1.000
2,0 4,0 6,0 333,3
333,3
2,0 4,0 6,0 111,1
(continuación)
Concentración de trabajo(ng/ml)
Volumen (ml) Diluyente(ml) Volumen total (ml) Concentración (ng/ml)
111,1
2,0 4,0 6,0 37,0
37,0
2,0 4,0 6,0 12,3
12,3
4,0 2,0 6,0 8,2
NA
NA
4,0 4,0 0
Tapar el tubo tras cada etapa de dilución y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos antes de proceder con la siguiente etapa de dilución.
5 Preparar disoluciones de control de calidad (CC) usando el diluyente Teknova en tubos de polipropileno estériles graduados de 15 ml según el siguiente esquema de dilución. Obtener concentración de proteína del material de referencia de proteína CD-CHO 1 (Mat ref) del Certificado de Análisis (COA). Preparar a 30 μg/ml de disolución del patrón de referencia de proteína CD-CHO (Mat ref). Tapar el tubo y remover con vórtex a un ajuste entre durante 2 4 segundos. Preparar disoluciones de CC a las concentraciones de 700, 100 y 25 ng/ml. A continuación se muestra
10 un esquema de dilución de ejemplo:
Concentración de trabajo(ng/ml)
Volumen (ml) Diluyente(ml) Volumen total (ml) Concentración (ng/ml)
CC 1
30.000 0,233 9,767 10,0 700
CC 2
700 1,430 8,570 10,0 100
CC 3
100 2,500 7,500 10,0 25
Tapar el tubo para cada disolución de CC y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos. Pueden prepararse disoluciones de control de calidad frescas en el día del ensayo o pueden separarse en alícuotas y congelarse. Determinar la actual concentración de las tres disoluciones de CC en tres experimentos independientes. 15 Promediar los resultados de los tres experimentos para cada disolución de CC y conceder un COA para cada una de las tres disoluciones de CC. Estas concentraciones de CC experimentalmente determinadas van a usarse como valores diana cuando se realiza el análisis en muestras de CTLA4-Ig. Guardar disoluciones de CC en alícuotas listas para usar a -70 ºC. Las disoluciones de CC caducan 6 meses después de la preparación. Sacar las disoluciones de CC del almacenamiento en el día de ensayo y descongelar a temperatura ambiente. Remover con vórtex las
20 disoluciones de CC descongeladas a velocidad media durante 2-4 segundos antes de uso.
Preparación de muestras. Preparar aproximadamente una disolución de 12,5 mg/ml para cada muestra de CTLA4-Ig que vaya a analizarse en diluyente añadiendo 250 μl de muestra de principio activo a 750 DL de diluyente. Tapar el tubo y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos. Preparar una disolución de 6,25 mg/ml para cada muestra de CTLA4-Ig a analizar añadiendo 400 de la disolución de 12,5 mg/ml a un tubo que contiene 400 μl de 25 diluyente. Tapar el tubo y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos. Preparar una disolución de 3,125 mg/ml para cada muestra de CTLA4-Ig que va a analizarse añadiendo 400 de la disolución de 6,25 mg/ml a un tubo que contiene 400 μl de diluyente. Tapar el tubo y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos. Lavar la placa repitiendo la etapa de lavado. Añadir 100 μl por pocillo de cada concentración de patrón, muestras y disoluciones de CC por triplicado a la placa bloqueada y lavada. Cada disolución de CC se añade dos veces a un 30 total de seis pocillos por placa. Incubar durante 1 hora en la oscuridad (± 6 minutos) a temperatura ambiente. Repetir el lavado 5 veces. Sacar la estreptavidina-HRP del congelador y dejar que llegue a temperatura ambiente. Diluir anticuerpo de conejo anti-CD CHO1-biotina a 2 μg/ml en tampón Teknova. Remover con vórtex la disolución aproximadamente 2 -4 segundos a velocidad media. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl por pocillo. Incubar durante 1 hora (± 6 minutos) en la oscuridad a temperatura ambiente. Diluir estreptavidina-HRP a la 35 concentración establecida para su uso en el ensayo basándose en la clasificación del lote de reactivo según el procedimiento del departamento. Tapar y remover con vórtex la disolución aproximadamente 2 -4 segundos a velocidad media. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de dilución de estreptavidina-HRP a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora (± 6 minutos). Repetir. Usando una pipeta multicanal añadir 100 μl de cromógeno de TMB a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos (± 12 40 segundos). Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl/pocillo de disolución de parada (H2SO4 1 N). Añadir disolución de parada en el mismo orden a las placas y pocillos que se añadió el cromógeno para asegurar los mismos tiempos de reacción de cromógeno con la enzima en cada pocillo. Usando un lector de placas SpectraMax
Plus, medir la absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en un lector de placas de 96 pocillos apropiado.
Evaluación de datos. Se remite a la plantilla del programa Softmax ya que genera media, desviaciones estándar y % de CV, etc. Determinar cada valor ilustrativo usando los valores de absorbancia por triplicado obtenidos para cada referencia, CC y diluciones de muestras ensayadas. Generar curva patrón. Modelar los datos de patrón de referencia usando una regresión de cuatro parámetros de la forma.
en la que:
AB = Absorbancia a 450 nanómetros A = Valor de absorbancia correspondiente a la asíntota mínima D = Valor de absorbancia correspondiente a la asíntota máxima c = Concentración correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores asintóticos máximos y
mínimos B = la pendiente aproximada de la porción lineal de la curva x = Concentración de material de referencia de CD-CHO1
Determinar el coeficiente de determinación (R2) de la recta de regresión para los patrones usando la media calculada usando la fórmula anterior. Cálculo de la concentración de CD-CHO1 en las muestras. Multiplicar los resultados de la muestra medios por el factor de dilución apropiado (es decir, 4, 8 y 16) para obtener la concentración de CD-CHO1 en la muestra original en ng/ml. Dividir los resultados entre la concentración de proteína CTLA4-Ig (mg/ml) informada para obtener la concentración de CD-CHO1 en ng/mg de CTLA4-Ig. Determinar la media de todos los resultados, que está dentro del intervalo de la curva patrón. Calcular la concentración de proteína CD-CHO1 en la muestra sin diluir aplicando el factor de dilución. Para determinar la concentración de proteína CD-CHO1 con respecto a la concentración de muestra de CTLA4-Ig dividir entre la concentración sin diluir.
Cálculo de ejemplo:
Resultadodemuestramedio 235ngdeCDCHOP/ml
5 5 4,7ng/ml
Concentración deBMS8188667 50mg/ml
Nota: ng de CD CHO1/ mg de producto (ng/mg) es equivalente a partes por millón (ppm).
Valores ejemplares. Valores ejemplares para los patrones. El coeficiente de determinación (R2) para la curva patrón debe ser ≥ 0,99. El fondo medio para el patrón de cero ng/ml debe ser ≤ 0,10 unidades de absorción. La media de los valores calculados (ng/ml) a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón, excluyendo cero y concentraciones inferiores al LC (12,3 ng/ml), debe estar dentro del 20% del valor (nominal) diana, como se ha determinado por el software. El coeficiente de variación (% de CV) de los valores de absorbancia por triplicado a cada concentración de patrón usada para determinar la curva patrón, excluyendo cero y concentraciones inferiores al LC (12,3 ng/ml), debe ser inferior al 20%, como se ha determinado por el software. Para asegurar que al menos dos puntos de datos congruentes están disponibles para el cálculo, los patrones, controles de calidad y muestras se cargan en pocillos por triplicado. Analizar cada valor por triplicado por separado. Omitir el valor que se encuentre más lejos de la diana.
Ejemplo:
Valor diana (ng/ml) Valor actual (ng/ml)
50 25 48 49
El valor individual que está más alejado del valor diana de 50 ng/ml es 25 ng/ml. Eliminando el valor de 25 ng/ml del triplicado, la media de los restantes valores cumple todos los valores ejemplares.
Si se muestra que la media de los dos valores restantes todavía no cumple los valores ejemplares, entonces el punto individual se elimina y la curva se recalcula.
Ejemplo:
Valor diana (ng/ml) Valor actual (ng/ml)
50 10
10,5
El valor medio es gt;20% de la diana independientemente de qué valor se elimine, por tanto, el punto individual se omite de la curva y la curva se recalculará. Solo pueden eliminarse 2 puntos en la curva patrón.
Valores ejemplares para muestras de CC. Una muestra de CC se define como un conjunto de tres pocillos a la concentración establecida, por tanto, para las tres concentraciones nominales establecidas en este procedimiento hay un total de seis muestras de CC. Al menos dos de los tres pocillos para una muestra de CC deben estar dentro del 20% del nominal para que la muestra de CC sea aceptable. Al menos cuatro de las seis muestras de CC deben estar dentro del 20% de sus concentraciones diana respectivas; dos de las seis muestras de CC (no dos a la misma concentración) pueden superar el 20% de desviación de la nominal, como se calcula por el software. No más de 6 de los 18 pocillos de muestra de CC pueden desviarse más del 20% de las concentraciones diana respectivas.
Valores ejemplares para muestras de prueba. La absorbancia promedio para la muestra de prueba ensayada debe ser inferior al mayor punto en la curva patrón. Si la absorbancia promedio de la muestra supera la absorbancia promedio de 3000 ng/ml de patrón, la muestra de prueba debe diluirse suficientemente de manera que se obtenga una absorbancia media entre 3000 y 12,3 ng/ml. La absorbancia promedio de al menos una de las tres diluciones de muestras (12,5, 6,25 y 3,125 mg/ml) deben estar dentro del intervalo de la curva patrón para un resultado informable, a menos que la absorbancia promedio para todas las diluciones esté por debajo de la absorbancia promedio del LC (12,3 ng/ml de patrón). En ese caso, las muestras de prueba se informan como lt; LC. La media de los valores de absorbancia por triplicado de las diluciones de muestras que son superiores al LC y están dentro del intervalo de la curva patrón deben presentan un CV inferior al 20%, como se ha determinado por el software. Si tras la eliminación de una de las absorbancias por triplicado y el recálculo el CV es todavía gt; 20% o si dos diluciones de muestras tienen CV para la absorbancia superiores al 20% y están dentro del intervalo de la curva patrón, el análisis de esta muestra debe repetirse.
Ejemplo 61 -Ensayo para cantidad residual de Triton X-100 en composición de CTLA4-Ig.
Materiales
Viales de HPLC Waters, kit de viales de recuperación total, tapa roscada con tapones de PTFE/silicona pre-ranura unidas (Catálogo 186000385)
Nota: se requieren viales de vidrio
Tubos de extracción en fase sólida Waters OASIS HLB, 30 mg/lcc (nº de catálogo WAT094225)
Columna Thermo Electron Corp. SAS Hypersil, 5 μ, 4,6 x 250 mm (número de pieza 30505-254630)
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos Módulo de separaciones 2695 de Waters
Detector Detector de UV de longitud de onda dual 2487 de Waters
Procesador de columnas de SPE Colector de vacío JT Baker, modelo Spe-21
Balanza analítica Cualquier balanza que pueda pesar con exactitud 0,01 mg
Integración Sistema de datos Empower de Waters
Preparación de Reactivos
Preparación de fase móvil: Acetonitrilo: agua (80:20). Para 1 l, mezclar minuciosamente con una barra de agitación, 800 ml de acetonitrilo y 200 ml de agua purificada o de calidad para HPLC. Filtrar a través de un filtro de nailon de 0,2 μm. Desgasificar la fase móvil usando un desgasificador en línea tal como un sistema Alliance, o usando burbujeo de helio. Prepararla fresca diariamente.
NaOH 2 N. Pesar y transferir cuantitativamente 80 ± 1 g de NaOH sólido a un matraz de 1 l. Enrasar con agua purificada o de calidad para HPLC. Mezclar bien con barra de agitación y filtrar a través de un aparato de filtro de 0,22 μm. Alternativamente, diluir seriadamente disolución de NaOH 10 N. Guardar hasta 6 meses a temperatura ambiente.
Tampón de principio activo. Pesar y transferir cuantitativamente 3,45 g de NaH2PO4 · H2O y 2,92 g de NaCl a un matraz de 1 l. Añadir aproximadamente 800 ml de agua purificada o de calidad para HPLC. Mezclar bien con una barra de agitación y enrasar con agua purificada o de calidad para HPLC. Ajustar a pH 7,5 con NaOH 2 N. Filtrar la disolución a través de una unidad de filtro de 0,22 μm. Guardar hasta 4 meses a 4 ºC.
Preparación de blanco de muestra patrón. Cualquier muestra de CTLA4-Ig o material de referencia previamente analizado y que se encuentre que contiene niveles detectables de Triton X-100 puede usarse como blanco de
5 muestra. La proteína de blanco de muestra debe ejecutarse junto con la(s) muestras(s). Disolver Triton X-100 lentamente en agua. Examinar la disolución para disolución completa (normalmente después de 15 minutos) antes de uso. Triton X-100 es más viscoso que el agua, por lo que cantidades sin disolver son visibles en presencia de agua.
Preparación de 10,0 μg/ml de patrón nº 1 de disolución madre de Tritón TX-100. Pesar con exactitud 10,0 ± 1,0 mg
10 de Triton X-100 en un matraz volumétrico de 100 ml y enrasar con agua; y mezclar suavemente con una barra de agitación. Etiquetar como patrón A de disolución madre de Tritón TX-100. Tomar 10 ml de patrón A de disolución madre de Tritón TX-100 en un matraz volumétrico de 100 ml. Enrasar con agua. Etiquetar como patrón nº 1 de disolución madre de Tritón TX-100. Preparar fresco diariamente.
Preparación de 10,0 μg/ml de patrón nº 2 de disolución madre de TX100. Pesar con exactitud 10,0 ± 1,0 mg de
15 Triton X-100 en un matraz volumétrico de 100 ml y enrasar con agua; y mezclar suavemente con una barra de agitación. Etiquetar como patrón B de disolución madre de TX100. Tomar 10 ml de patrón A de disolución madre de TX100 a un matraz volumétrico de 100 ml. Enrasar con agua. Etiquetar como patrón nº 2 de disolución madre de TX100. Preparar fresco diariamente.
Preparación de disolución nº 1 de evaluación de idoneidad del sistema de TX100 (IS nº 1). A partir de patrón nº 1 de
20 disolución madre de TX100 preparar una disolución de 5,0 μg/ml de evaluación de idoneidad del sistema de TX100 diluyendo 300 μl de patrón nº 1 de disolución madre de TX100 con 300 μl de acetonitrilo. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
Preparación de disolución nº 2 de evaluación de idoneidad del sistema de TX100 (IS nº 2). A partir de patrón nº 2 de disolución madre de TX100 preparar una disolución de 5,0 μg/ml de evaluación de idoneidad del sistema de TX100
25 diluyendo 300 μl de patrón nº 1 de disolución madre de TX100 con 300 μl de acetonitrilo. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
Preparación de control de paso de TX100, patrón límite, control de fallo. A partir del patrón nº 1 de disolución madre de TX preparar la disolución identificada en la siguiente tabla.
Identificación de disolución
Procedimientos de dilución
Control de paso (0,4 μg/ml)
Diluir 20 μl con 480 ul de CTLA4-Ig DS
Patrón límite (0,5 μg/ml)
Diluir 25 ul con 475 ul de CTLA4-Ig DS
Control de fallo (0,6 μg/ml)
Diluir 30 μl con 470 μl de CTLA4-Ig DS
30 Preparación de muestra. La muestra se usa sin concentración o dilución. Procedimiento: Extracción de Triton X100 de disolución de patrón y de muestra. CUIDADO: Las etapas de extracción descritas más adelante se realizan bajo un vacío de 10,13 – 11,81 kPa de Hg.
Activación de medios de extracción en fase sólida (SPE). Levantar la tapa del colector de vacío y poner tubos de ensayo de 12 x 75 mm vacíos en la gradilla dentro del colector. Estos son tubos de ensayo “de desecho”. Volver a 35 poner la tapa y poner cartuchos de SPE en el colector de vacío, asegurándose de que haya un tubo de ensayo “de desecho” debajo de cada tubo de SPE. Añadir 1000 μl de acetonitrilo a cada cartucho de SPE y aplicar vacío hasta que todo el acetonitrilo haya pasado a través del lecho de medio. Repetir con 1000 μl adicionales de acetonitrilo. Añadir 500 μl de agua purificada o de calidad para HPLC a cada cartucho de SPE y aplicar vacío hasta que todo el agua haya pasado a través del lecho de medio. Repetir con 500 μl adicionales de agua purificada o de calidad para
40 HPLC.
Concentración de Triton X-100 sobre el medio de SPE para el patrón límite y controles. Pipetear 500 μl de cada uno del patrón límite, control de paso, blanco de control de fallo y muestras en cartuchos de SPE activados separados. Aplicar vacío a los tubos de SPE hasta que cada disolución haya pasado completamente a través del lecho de medio.
45 Eliminar la proteína residual del lecho de SPE. Añadir 1000 μl de agua a cada cartucho de SPE y aplicar vacío a los tubos hasta que el agua haya pasado a través del lecho de medio. Repetir la etapa con 1000 μl adicionales de agua.
Elución de Triton X-100 del lecho de SPE. Apagar el vacío al colector para liberar la presión de la unidad a cero. Levantar suavemente la tapa del colector, con los cartuchos de SPE todavía sujetos. Reponer los tubos de ensayo “de desecho” con un conjunto de tubos de ensayo de “eluato” previamente etiquetados o viales del inyector automático (patrón límite, control de paso, control de fallo, blanco y muestras previamente etiquetados) para recoger cualquier Triton X-100 que eluya de los lechos de SPE. Volver a poner la tapa del colector, asegurándose de que cada patrón límite, control de paso, control de fallo, blanco y muestras, cartucho de SPE tenga un tubo de ensayo de eluato respectivo, o vial de inyector automático, debajo. Añadir 500 μl de acetonitrilo a cada cartucho de SPE y
5 aplicar vacío a los tubos hasta que todo el acetonitrilo haya pasado a través del lecho de medio. Apagar el vacío al colector y levantar la tapa para recuperar los tubos de ensayo del eluato, o viales del inyector automático. Si se usan tubos de ensayo de eluato, poner los eluatos de acetonitrilo del patrón límite, control de paso, control de fallo, blanco y muestras en viales del inyector automático para la inyección en el sistema cromatográfico. Si se usan viales del inyector automático para recoger el eluato, poner los viales directamente en el sistema cromatográfico.
10 Condiciones de ejecución
Longitud de onda 225 nm
Sensibilidad 0,1 AUFS
Fase móvil Acetonitrilo:agua (80:20)
Caudal 0,8 ml/min
Volumen de inyección 25 μl
Temperatura de la columna Ambiente (20-25 ºC)
Tiempo de retención aproximado Triton X-100: 5,0 ± 1 minuto
Tiempo de ejecución total 10 minutos
Temperatura del inyector automático 10 ± 4 ºC
Idoneidad del sistema. Montar el sistema cromatográfico; dejar que se caliente la lámpara y se equilibre el sistema con fase móvil durante al menos una hora antes del análisis. Inyectar IS nº 1 un mínimo de cuatro veces. Usar la segunda inyección de IS nº 1 para todos los análisis de idoneidad del sistema, a menos que se especifique de otro
15 modo. El tiempo de retención para Triton X-100 debe ser 5,0 ± 1 minutos. La eficiencia de la columna para Triton X100, evaluada como el número de platos teóricos (N), debe ser ≥ 2000 platos/ columna cuando se calcula según la siguiente ecuación:
en la que:
20 t = tiempo de retención del pico de Triton X-100 medido desde el momento de inyección hasta el momento de elución del máximo del pico. w = anchura del pico de Triton X-100 medido extrapolando los lados del pico a la base.
La resolución entre el pico de Triton X-100 y el pico adyacente más próximo (si está presente) debe ser ≥1.
25 en la que:
t = tiempos de retención del pico de Triton X-100 y el pico adyacente en el patrón. W = anchuras correspondientes de las bases de los picos obtenidas extrapolando los lados de los picos a la base.
Calcular los factores de respuesta de las tres últimas inyecciones de IS nº 1 usando la siguiente ecuación:
en la que:
A = Área del pico de Triton X-100 W = Peso de Triton X-100 (en mg) usado en la preparación del patrón de disolución madre de TX 100 correspondiente
35 Los factores de respuesta de las tres últimas inyecciones de IS nº 1 deben tener una desviación estándar relativa (DER) de ≤ 10%. Calcular el % de DER usando la siguiente ecuación:
Desviación estándar
%de DER 5 x100
Media
en la que:
n = número de mediciones en la muestra x = mediciones individuales
Comparar el factor de respuesta de la única inyección de IS nº 2 con el factor de respuesta promedio de las tres últimas inyecciones de IS nº 1. El porcentaje de diferencia entre el factor de respuesta de IS nº 2 y el factor de respuesta promedio de las tres inyecciones de IS nº 1 debe por ≤10%. Calcular el porcentaje de diferencia usando la siguiente ecuación.
en la que:
RF1 = Factor de respuesta promedio de las tres inyecciones de IS nº 1
RF2 = Factor de respuesta de IS nº 2
Hacer una única inyección de blanco de muestra post-SPE. Si se encuentran niveles de Triton X-100, hacer dos inyecciones más del blanco de muestra. Si Triton X-100 está presente, desechar el principio activo de CTLA4-Ig y preparar nuevo patrón límite, y controles con un nuevo lote de principio activo de CTLA4-Ig previamente analizado y que se encuentre que no contiene niveles detectables de Triton X-100. Si no se cumplen los valores ejemplares anteriores, prolongar el equilibrio de la columna durante otra hora y reinyectar la disolución patrón. Si todavía no se cumplen los valores ejemplares, ejecutar las siguientes etapas. Comprobar para filtraciones asegurándose de que todas las conexiones de tubos sean fiables. Si el equilibrio prolongado no funciona, ajustar el contenido orgánico de la fase móvil y/o preparar un nuevo lote de fase móvil, y volver a preparar IS nº 1 e IS nº 2. Cambiar la columna si el equilibrio prolongado y/o el ajuste de fase móvil no hacen que se cumplan los valores ejemplares. Antes de repetir equilibrar durante al menos una hora.
Secuencia de inyección. Equilibrio preliminar del sistema de HPLC y ejecución satisfactoria de lo anterior. Hacer una única inyección de tampón de principio activo post-SPE, se remite a la sección anterior como blanco de calibración. Observar que no hay respuesta de Triton X-100. Si un pico está presente al tiempo de retención del pico de Triton X100, continuar inyectando el blanco hasta que no se observe respuesta. Hacer una única inyección de principio activo de CTLA4-Ig post-SPE, se remite a la sección anterior como blanco de muestra. Observar que no hay respuesta de Triton X-100. Este cromatograma se restará de los cromatogramas del patrón, control y muestra antes de realizar el procesamiento de datos. Hacer inyecciones por duplicado del control de paso, patrón límite, un control de fallo. Hacer una única inyección del tampón de principio activo, y no debe observarse respuesta de Triton X-100. Hacer inyecciones por duplicado de las muestras. Las inyecciones de muestra se agrupan en inyecciones por duplicado de patrón límite y una inyección del tampón de principio activo de manera que no haya más de 10 inyecciones de muestra entre patrón límite de agrupamiento e inyecciones de principio activo. El fin de la ejecución debe completarse con inyecciones por duplicado del patrón límite, y una inyección del blanco de tampón de principio activo.
Procesamiento de datos. Restar el cromatograma de la inyección del blanco de muestra de todos los cromatogramas de patrón, control y muestra antes de proceder con el procesamiento de datos. Asegurarse de que el pico de Triton X-100 en los cromatogramas de patrón límite, control y muestra esté apropiadamente integrado. El pico de Triton X-100 en la muestra, si está presente, debe estar dentro de la misma ventana de tiempo de retención que el patrón límite. Promediar el área del pico de cada conjunto de inyecciones por duplicado. Las inyecciones por duplicado deben tener un % de diferencia en el área del pico de ≤ 10%. Si una inyección por duplicado del patrón límite, control de paso o control de fallo no cumple este criterio, toda la ejecución se considera no válida y necesitará repetirse. Si las inyecciones por duplicado de la muestra no logran cumplir este criterio, la muestra se considera no válida y necesitará repetirse. Todas las otras muestras, control y patrones se consideran válidos en tanto que cumplan el criterio de ≤ 10%. El área de pico promediada para el pico de Triton X-100 en todos los patrones límite de agrupamiento, que incluye las inyecciones finales, debe estar dentro del 10% del área del pico promediada inicial del patrón límite. Si cualquier patrón límite intermedio no logra cumplir el requisito de comparación del 10%, todas las muestras analizadas después de pasar el patrón límite se consideran no válidas y deben volver a analizarse.
Evaluación de muestras de patrón límite, de control de paso, de control de fallo. Comparar las áreas del pico de Triton X-100 promediadas para el patrón límite, control de paso y control de fallo. El área del pico de la muestra de control de fallo debe ser superior al del patrón límite. El área del pico de la muestra de control de paso debe ser inferior al del patrón límite. Si ambas condiciones se cumplen, continuar con la evaluación de las muestras.
5 Evaluación de muestras. El área del pico de Triton X-100 promediada del patrón límite debe corregirse para explicar la cantidad de material pesado en la preparación del patrón nº 1 de disolución madre de Triton X-100, del siguiente modo:
AL = ALS x (10,00 mg/peso)
en la que:
10 AL = Área del pico corregida al límite de 0,5 μg/ml ALS = Área del pico de Triton X-100 promediada de los patrones límite de agrupamiento
Nota: AL es el área corregida al límite de 0,5 μg/ml y se usará para comparación con muestras.
Comparar el área del pico de Triton X-100 promedio de la muestra con AL. Si el área del pico ≤ AL, la muestra pasa la especificación. Si el área del pico gt; AL, la muestra suspende la especificación. Informar de los resultados que
15 pasan la especificación como “lt;0,50 ppm” o que suspenden la especificación como “gt;0,50 ppm” o como se requiera de otro modo por la costumbre de presentación.
Ejemplo 62 -Ensayo para cuantificar la cantidad de proteína A residual en material de principio activo de CTLA4-Ig.
Materiales
Anticuerpo de conejo anti-proteína A Sigma (nº de catálogo P3775)
Anticuerpo monoclonal anti-proteína A biotinilado Sigma (nº de catálogo B3150)
20 Reactivos
Tampón carbonato de recubrimiento. A un recipiente adecuado añadir: Añadir una barra de agitación. Añadir 500 ml de agua de calidad para HPLC o Millipore. Añadir contenidos de 5 cápsulas de carbonato. Agitar hasta mezclar bien. Comprobar y ajustar el pH a 9,6 ± 0,1 usando NaOH (1.16) o HCl (1.23). Verter la disolución en un sistema de esterilización por filtración de 500 ml. Aplicar a vacío para esterilizar por filtración la disolución. Bajo condiciones 25 asépticas quitar la unidad de filtro y tapar la botella. La disolución es estable durante 30 días cuando se guarda a 2 8 ºC. Etiquetar la disolución como “Tampón carbonato de recubrimiento”. Tampón de lavado: (PBS + 0,05% de Tween 20): A una botella de 4 l de agua de calidad para HPLC, o Millipore, añadir: Añadir una barra de agitación. Añadir 20 comprimidos de PBS. Añadir 2,0 ml de Tween 20. Comprobar y ajustar el pH a 7,4 ± 0,1 usando NaOH o HCl. Usando una placa de agitación, agitar hasta mezclar bien. La disolución es estable durante 30 días cuando se 30 guarda a 2 -8 ºC. Etiquetar la disolución como “Tampón de lavado”. Disolución de parada (H2SO4 1 N o usar ácido sulfúrico 1.000 normal de VWR sin diluir. En una campana extractora poner un recipiente adecuado sobre una placa de agitación: Añadir una barra de agitación. Añadir 485,6 ml de agua de calidad para HPLC, o Millipore. Encender la placa de agitación para empezar la agitación del agua. Lentamente añadir 14,4 ml de H2SO4 concentrado. La disolución es estable durante 30 días cuando se guarda a temperatura ambiente. Etiquetar el recipiente como
35 “Disolución de parada”.
Tampón acetato (ácido acético 0,5 M, cloruro sódico 0,1 M, 0,1% de Tween 20, pH 3,5). En una campana extractora poner un recipiente adecuado sobre una placa de agitación: Añadir una barra de agitación. Añadir 400 ml de agua de calidad para HPLC, o Millipore. Encender la placa de agitación para empezar la agitación de agua. Lentamente añadir 14,8 ml de ácido acético glacial concentrado. Agitar hasta mezclar bien. Añadir 2,9 g de cloruro sódico. Agitar
40 hasta mezclar bien. Comprobar y ajustar el pH a 3,5 ± 0,1 usando NaOH o HCl. Añadir 0,5 ml de Tween 20. Agitar hasta mezclar bien. Ajustar a un volumen final de 500 ml con agua de calidad para HPLC, o Millipore. Agitar hasta mezclar bien. La disolución es estable durante 30 días cuando se guarda a 2 -8 ºC. Etiquetar el recipiente como “Tampón acetato”.
Anticuerpo de conejo anti-proteína A. Sacar el vial del refrigerador y dejar que llegue a temperatura ambiente. Añadir
45 2,0 ml de agua de calidad para HPLC, o Millipore. Añadir alícuotas de 20 μl de volumen a tubos de tapa roscada de 0,5 ml. Tapar y poner en una caja de almacenamiento de células. La disolución es estable durante 365 días cuando se guarda a -20 ºC. Sacar el vial de anticuerpo anti-proteína A biotinilado del refrigerador y dejar que llegue a temperatura ambiente. Añadir 1,0 ml de agua de calidad para HPLC, o Millipore. Añadir alícuotas de 60 μl de volumen a tubos de tapa roscada de 2,0 ml. Tapar y poner en una caja de almacenamiento de células. La disolución
50 es estable durante 365 días cuando se guarda a -20 ºC.
Estreptavidina-HRP. Añadir 0,5 ml de agua de calidad para HPLC, o Millipore, a un vial de estreptavidina-HRP. Para mezclar, tapar el vial y remover suavemente con vórtex durante aproximadamente 10 segundos. Añadir 0,5 ml de glicerol al vial de estreptavidina-HRP. Tapar el vial e invertir suavemente el vial varias veces. Comprobar la claridad de la disolución extrayendo disolución en una pipeta de Pasteur limpia. Añadir alícuotas de 20 μl de volumen a tubos de tapa roscada de 0,5 ml. Tapar y poner en una caja de almacenamiento de células. La disolución es estable durante 365 días cuando se guarda a -20 ºC.
5 Preparación de patrón. Obtener concentración de proteína del material de referencia de proteína A (Mat ref) del Certificado de Análisis (COA). Preparar una disolución de 11.500 ng/ml de mat ref de proteína A, descongelar la disolución de proteína A madre a temperatura ambiente. Calcular el volumen requerido de mat ref de proteína A para obtener una disolución de 11.500 ng/ml. El volumen de transferencia mínimo debe ser 10 μl.
Fórmula:
Concentración deseada x Volumen deseado
10 Volumen 5 Concentración de materialdereferencia
Nota: Asegurar que las unidades sean compatibles.
Ejemplo:
2,3∀g/ml x10ml 5 92∀l
0,25mg/ml
Calcular el volumen de tampón acetato (3.4) restando el volumen requerido de mat ref de proteína A del volumen 15 deseado.
(Volumen deseado) – (Volumen de patrón de ref) = (Volumen de diluyente)
Ejemplo: 10,0 ml – 0,920 ml = 9,180 ml de diluyente
Añadir el volumen calculado de mat ref de proteína A a un tubo estéril de 15 ml que contiene volumen de tampón acetato calculado. Tapar el tubo. Agitar suavemente removiendo con vórtex (fijando 4 en Vortex Genie 2) durante 2
20 4 segundos. Preparar los restantes patrones usando los volúmenes definidos a continuación:
Concentración de trabajo (ng/ml)
Volumen de conc. de trabajo (ml) Tampónacetato (ml) Volumen total (ml) Concentración final (ng/ml)
2.300.000 (2,3 mg/ml)
0,010 1,990 2,0 11,500
11,500
0,010 4,780 4,790 24,0
24,0
2,0 2,0 4,0 12,0
12,0
2,0 2,0 4,0 6,00
6,00
2,0 2,0 4,0 3,00
3,00
2,0 2,0 4,0 1,50
1,50
2,0 2,0 4,0 0,75
0,75
2,0 2,0 4,0 0,375
0,375
2,0 2,0 4,0 0,188
N/A
N/A
2,0 2,0 0
Tapar el tubo tras cada etapa de dilución y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos antes de proceder con la siguiente etapa de dilución. Incubar el patrón de referencia y las muestras de control de calidad durante 10 minutos a temperatura ambiente antes la adición a placa de microtitulación. Cada concentración de
25 patrón se analiza en pocillos por triplicado.
Preparación de muestras de prueba. Preparar concentraciones de 5 mg/ml, 2,5 mg/ml y 1,25 mg/ml de las muestras de prueba de CTLA4-Ig en tubos de polipropileno usando tampón acetato. Descongelar la muestra de CTLA4-Ig a temperatura ambiente antes de uso para preparar diluciones. Calcular el volumen requerido de muestra de prueba para obtener una disolución de 5,0 mg/ml. El volumen de transferencia mínimo debe ser 10 μl.
Fórmula:
Concentración deseada x Volumen deseadoVolumen 5 Concentración de muestra deprueba
Ejemplo:
5,0∀g/ml x1,0ml
5 200∀l
25mg/ml
5 5.1.3 Calcular el volumen de tampón acetato restando el volumen requerido de la muestra de prueba del volumen deseado.
Fórmula: (Volumen deseado) – (Volumen de muestra de prueba) = (Volumen de diluyente)
Ejemplo: 1,0 ml – 0,200 ml = 0,800 ml de diluyente
Añadir volumen calculado de muestra de prueba a un tubo estéril de 15 ml que contiene el volumen de tampón
10 acetato calculado. Tapar el tubo y remover suavemente con vórtex (fijando 4 en Vortex Genie 2) durante 2 -4 segundos. Las muestras de prueba se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de añadir a la placa de microtitulación.
Preparación de muestras de control de calidad. Obtener concentración de proteína del material de referencia de proteína A del COA. Preparar una disolución de 11.500 ng/ml de mat ref de proteína A. Preparar muestras de control
15 de calidad (CC) como se describe en la siguiente tabla.
Concentración de trabajo (ng/ml)
Volumen de conc. de trabajo (ml) Tampón acetato (ml) Volumen total (ml) Concentración final (ng/ml)
2.300.000 (2,3 mg/ml)
0,010 1,990 2,0 11,500
11.500
0,010 4,780 4,790 24,0
24,0
0,8333 3,166 4,0 5,0 (CC1)
5,0
1,6 2,4 4,0 2,0 (CC1)
2,0
1,0 3,0 4,0 0,5 (CC1)
Añadir alícuotas de 700 μl de volumen a tubos de tapa roscada de 2,0 ml. Tapar y poner en una caja de almacenamiento de células. La disolución es estable durante 180 días cuando se guarda a -70 ºC o por debajo. Las concentraciones de proteína A en las muestras de CC tienen que predeterminarse: realizando 3 ensayos de ELISA
20 de proteína A independientes usando este procedimiento. Los 18 resultados (3 ensayos independientes por 6 pocillos por ensayo) se promediarán. La concentración de proteína A para cada muestra de CC se asignará a cada preparación. En el día de un experimento, descongelar un vial de cada una de las muestras de CC a temperatura ambiente, o preparar las muestras de CC frescas a partir de vial de disolución madre de proteína A. Remover suavemente con vórtex (fijando 4 en Vortex Genie 2) durante 2 -4 segundos.
25 Procedimiento. Recubrimiento de placas con anticuerpo de captura. Obtener la concentración de proteína del anticuerpo de conejo anti-proteína A del COA del fabricante. Calcular el volumen requerido de anticuerpo de conejo anti-proteína A para obtener 10 ml de una disolución de 100 μg/ml. El volumen de transferencia mínimo debe ser de 10 μl.
Fórmula:
Concentración deseada x Volumen deseado
30 Volumen 5 Concentración deanticuerpo
Nota: Asegurar que las unidades sean compatibles.
Ejemplo:
100∀g/ml x3ml 512∀l25mg/ml
Calcular el volumen de diluyente restando el volumen requerido de anticuerpo de conejo anti-proteína A del volumen deseado.
(Volumen deseado) – (Volumen de anticuerpo) = (Volumen de diluyente)
Ejemplo:
3,0 ml – 0,012 ml = 2,988 ml de diluyente
Añadir el volumen calculado de anticuerpo de conejo anti-proteína A a un tubo estéril de 15 ml, que contiene el volumen de diluyente calculado. Tapar el tubo y remover suavemente con vórtex durante 2 -4 segundos. Preparar una disolución de 1 μg/ml de anticuerpo de conejo anti-proteína A en tampón de recubrimiento, usando las fórmulas. Añadir 100 μl de la disolución a cada pocillo de una placa de microtitulación Immulon IV. Incubar a 2-8 ºC durante 18 ± 2 horas. Lavar las placas tres veces con disolución de lavado usando el lavador de placas con 300 μl de tampón de lavado y tiempo de empapamiento de cero. Las placas pueden lavarse alternativamente usando una pipeta multicanal. Usando una pipeta multicanal añadir 200 μl de SuperBlock™ a cada pocillo. Incubar la placa de microtitulación en la oscuridad durante 60 minutos a temperatura ambiente. Repetir el lavado. Añadir 100 μl de cada patrón de referencia, control de calidad y muestras de prueba a la placa de ensayo. Incubar la placa de microtitulación en la oscuridad durante 60 minutos ± 10 minutos, a temperatura ambiente. Repetir el lavado. Obtener la concentración de proteína del anticuerpo anti-proteína A-biotina del COA del fabricante. Preparar 1,0 ml de una disolución de 1,0 mg/ml de anticuerpo anti-proteína A-biotina en diluyente. Remover con vórtex a velocidad media. Añadir 50 μl de disolución de 1 mg/ml (7.9.1) a 0,950 ml de diluyente. Remover con vórtex a velocidad media. Añadir 150 μl de disolución de 50 μg/ml (7.9.3) a 14,850 ml de diluyente. Añadir 100 μl a cada pocillo usando un pipeteador multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos ± 10 minutos. Repetir el lavado. Diluir estreptavidina-HRP del siguiente modo: Añadir 10 μl de estreptavidina-HRP a 0,990 μl de diluyente para dar 0,01 mg/ml de estreptavidina-HRP. Remover con vórtex a velocidad media. Añadir 80 μl de 0,01 mg/ml de estreptavidina-HRP a 39,920 ml de diluyente. Remover con vórtex a velocidad media. Añadir 100 μl a cada pocillo usando un pipeteador multicanal. Incubar durante 30 minutos ± 5 minutos, a temperatura ambiente. Sacar TMB del refrigerador y decantar un mínimo de 10 ml por placa de TMB en un recipiente adecuado. Poner en una localización oscura y dejar que llegue a temperatura ambiente. Repetir el lavado, pero lavar cinco veces. Añadir 100 μl de cromógeno de TMB a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos ± 1 minuto. Detener la reacción del cromógeno añadiendo 100 μl/pocillo de disolución de parada. Añadir disolución de parada en el mismo orden a las placas y pocillos que se añadió el cromógeno. Asegurar los mismos tiempos de reacción de cromógeno con la enzima en cada pocillo. Medir la absorbancia (AB) a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm.
Valores ejemplares. Valores ejemplares para la curva patrón. Los valores ejemplares para los patrones se aplican a aquellos valores a o por encima del límite cuantitativo (LC), ya que los valores por debajo del LC solo se usan para ayudar a establecer los extremos de la curva. El coeficiente de determinación (R2) para la curva patrón debe ser ≥ 0,99, como se ha determinado por el software SoftMax PRO. El fondo medio para el patrón de cero ng/ml debe ser ≤0,08 unidades de absorción. La media de los valores calculados (ng/ml) a cada concentración de patrón usada para determinar la curva patrón, excepto cero y el LC, debe estar dentro del 15% del valor (nominal) diana, como se ha determinado por el software. El coeficiente de variación (% de CV) de los valores de AB450 por triplicado a cada concentración de patrón usado para determinar la curva patrón, excluyendo cero y LC, debe ser ≤15%, como se ha determinado por el software. La media de los valores de absorbancia por triplicado del LC de la curva patrón deben presentan un % de CV inferior al 20% y estar dentro del 20% de la diana, como se ha determinado por el software. Para asegurar que están disponibles para el cálculo al menos dos puntos de datos congruentes, los patrones, controles y muestras se cargan en pocillos por triplicado. Cada valor por triplicado usado para calcular la media se
analizará por separado.
Por ejemplo:
Valor diana (ng/ml) 2,5
Valor actual (ng/ml) 1,2 2,3 2,5
El único valor que es el más alejado del valor diana de 2,5 ng/ml es 1,2 ng/ml. Eliminando el valor de 1,2 ng/ml de los valores por triplicado, la media de los restantes valores cumple todos los valores ejemplares. Si, tras volver a calcular, otro punto no cumple los valores ejemplares, entonces el ensayo no es válido y debe volver a hacerse. Si se muestra que la media de los dos valores restantes todavía no cumple los valores ejemplares, entonces el punto individual (los 3 pocillos) se elimina y la curva se recalcula.
Valores ejemplares para muestras de CC. Una muestra de CC se define como un conjunto de tres pocillos a la concentración establecida, por tanto, para las tres concentraciones nominales establecidas en este procedimiento hay un total de seis muestras de CC (para un total de 18 pocillos). Al menos dos de los tres pocillos para una muestra de CC deben estar dentro del 20% del nominal para que la muestra de CC sea aceptable. Al menos cuatro de las seis muestras de CC deben ser aceptables; dos de las seis muestras de CC (no dos a la misma concentración) y no más de 6 de los 18 pocillos de muestra de CC pueden desviarse más del 20% de las
5 concentraciones diana respectivas.
Valores ejemplares para muestras de prueba. Cada uno de los valores por triplicado de la muestra de prueba ensayada debe estar dentro del 20% del valor medio a esa concentración, como se ha determinado por el software. Si dos o más valores de AB450 medios no pueden calcularse debido a que se encuentran por encima del mayor punto en la curva patrón, entonces la muestra debe volver a ensayarse a mayores diluciones hasta que al menos
10 dos de los tres valores se encuentren sobre la curva patrón. El % de CV de las observaciones por triplicado obtenidas para cada concentración diana de muestra de prueba debe ser ≤ 20%, como se ha determinado por el software.
Cálculos. Se remite a la plantilla del programa Softmax para el ELISA de proteína A, ya que genera media, desviaciones estándar y % de CV. Promediar los valores de absorbancia (AB) por triplicado obtenidos para cada
15 referencia y concentración de muestra ensayada. Modelar los datos de patrones de proteína A usando una regresión de cuatro parámetros sin ponderar de la forma:
en la que:
mín = valor de AB correspondiente a la asíntota mínima
20 máx = valor de AB correspondiente a la asíntota máxima ED50 = AB correspondiente a la mitad de la diferencia absoluta entre los valores asintóticos máximos y mínimos B = la pendiente aproximada de la porción lineal de la curva C = Concentración de Proteína A
Cálculo de concentración de proteína A en las muestras. Multiplicar los resultados de muestra medios por el factor
25 de dilución apropiado (es decir, 2, 4 y 8), para obtener la concentración de proteína A en la muestra original en ng/ml. Dividir los resultados entre la concentración de proteína CTLA4-Ig (mg/ml) informada para obtener la concentración de proteína A, en ng/mg, en CTLA4-Ig.
Cálculo de ejemplo:
Resultadodemuestramedio 235ngdeproteínaA/ml
5 5 4,7ng/mgConcentracióndeabatacept 50mg/ml
30 Nota: ng de proteína A/mg de CTLA4-Ig (ng/mg) es equivalente a partes por millón (ppm).
Cálculos para la concentración de proteína A en ng/ml de muestras. La cantidad de proteína A en las muestras de prueba se calcula usando el actual software Softmax usando la ecuación de regresión. Se ensayan tres diluciones de cada muestra. La concentración calculada se multiplica por el factor de dilución apropiado para dar la concentración en la muestra de prueba inicial.
35 Ejemplo:
La concentración de la muestra de prueba es 50 mg/ml.
Dilución de muestra Factor de dilución
5 mg/ml 10 2,5 mg/ml 20 1,25 mg/ml 40
5 mg/ml de muestra -Los datos de ELISA determinan que la concentración de proteína A es 10 ng/ml 10 ng/ml x 10 (factor de dilución) = 100 ng/ml de proteína A en la muestra de prueba 2,5 mg/ml de muestra -Los datos de ELISA determinan que la concentración de proteína A es 5,0 ng/ml 5 ng/ml x 20 (factor de dilución) = 100 ng/ml de proteína A en la muestra de prueba 1,25 mg/ml muestra -Los datos de ELISA determinan que la concentración de proteína A es 2,5 ng/ml 2,5 ng/ml x 40 (factor de dilución) = 100 ng/ml de proteína A en la muestra de prueba
Calcular la concentración media a partir de los tres valores.
Información de resultados. Los resultados pueden informarse en términos de “% en peso/peso de proteína total, ng de proteína A/mg de proteína total”, de otro modo denominado “ppm” (peso/peso).
Ejemplo:
0,0001% en peso/peso = 1 ng/mg = 1 ppm (peso/peso)
Cálculo de ejemplo:
0,0001mg/mldeproteína A x100% 5 2ng/mg 5 2ppm50mg/mldemuestra deprueba
Las muestras que producen un valor de AB450 más pequeño que la AB450 del LC (0,188 ng/ml) deben informarse como “inferior al LC”. Las muestras que producen un valor de AB450 mayor que la AB450 del LC (0,188 ng/ml) deben informarse al número entero más próximo como partes por millón (ppm).
Ejemplo:
La concentración de muestra es 50 mg/ml. La mayor concentración de muestra analizada es 5 mg/ml (dilución 1/10). La AB450 de la muestra es más pequeña que el LC. LC = 0,188 ng/ml ≤ 0,188 ng/5 mg ≤ 0,04 ng/mg Informar como “lt;, LC = 0,04 ppm”
Ejemplo 63: Procedimientos para obtener relaciones molares de aminomonosacáridos (Nacetilgalactosamina, N-acetilglucosamina) con respecto a proteína en muestras de principio activo de CTLA4-Ig.
Reactivos
Disolución de hidrólisis (disolución acuosa 4 N de HCl). Añadir 160 ml de HCl 6 N y 80 ml de agua de calidad para HPLC a una botella de vidrio de 250 ml. Agitar para mezclar bien. Guardar a 2-8 ºC durante hasta 6 meses. Disolución de derivatización 1 (disolución acuosa 0,1 M de APTS). Añadir 192 μl de agua de calidad para HPLC a 10 mg de polvo de APTS en un vial de vidrio. Remover con vórtex el vial 5-10 segundos para disolver completamente el APTS. Guardar a -20 ºC durante hasta un año.
Disolución de derivatización II (ácido acético 1 M y NaBH3CN 0,25 M). Diluir 20 μl de ácido acético con 320 μl de agua de calidad para HPLC (dilución de 17 veces) en un tubo de centrífuga de 0,4 ml para preparar una disolución 1 M de ácido acético. Pesar 2,0 ± 0,5 mg de NaBH3CN en un vial criogénico. Usando la siguiente fórmula, añadir un volumen apropiado de la disolución 1 M de ácido acético para preparar NaBH3CN 0,25 M. Volumen (μl) = 103 × peso de NaBH3CN en mg)/(62,84 g/moles × 0,25 moles/l). Nota: Preparar inmediatamente antes de uso. El cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN) debe almacenarse en la oscuridad en un desecador. Se recomienda subdividir el reactivo en una serie de crioviales de 2,0 ml para el almacenamiento para evitar abrir repetidamente la botella de reactivo original del siguiente modo: Pesar 1,0 g ± 0,2 mg de cianoborohidruro de sodio en un criovial de 2,0 ml. Separar en alícuotas el contenido de cianoborohidruro de sodio de la botella original de este modo. Tapar fuertemente y etiquetar los crioviales secuencialmente (1, 2, 3, etc.) junto con el nombre del reactivo, número de lote y una fecha de caducidad de 6 meses. Los viales deben cerrarse con Parafilm para evitar la humedad. Pesar cianoborohidruro de sodio para la disolución de derivatización II no más de tres veces del mismo criovial. Anotar esto y la secuencia del criovial en la hoja de cálculo del laboratorio. Tanto un pico de reactivo observado en el perfil de CE como el mal etiquetado pueden producirse después de la apertura repetida del criovial o con ese lote particular de cianoborohidruro de sodio. Si esto afecta los resultados, desechar el criovial que se usa y tanto pesar reactivo de un criovial con el siguiente número de secuencia como de un nuevo lote de cianoborohidruro de sodio.
Tampón de re-acetilación (bicarbonato sódico 25 mM, pH 9,5). Pesar 0,210 ± 0,02 g de bicarbonato sódico en un vaso de precipitados de vidrio limpio de 100 ml. Añadir 90 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar en una placa de agitación hasta que las sales estén completamente disueltas. Ajustar el pH a 9,5 ± 0,1 con NaOH 10 N. Añadir agua de calidad para HPLC para preparar el volumen final de 100 ml. Filtrar la disolución y guardar a temperatura ambiente durante hasta 3 meses. Tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 ± 5 mM, pH 9,25). Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sodio en un vaso de precipitados de vidrio limpio de 100 ml. Añadir 90 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar en una placa de agitación hasta que las sales estén completamente disueltas. Ajustar el pH a 9,25 ± 0,10 con NaOH 10 N. Añadir agua de calidad para HPLC para preparar el volumen final de 100 ml para una concentración final de 60 ± 5 mM. Para una disolución 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetraborato de sodio y seguir las instrucciones anteriores para disolver y valorar. Para una disolución 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02) de tetraborato de sodio y seguir las instrucciones anteriores para disolver y valorar. Guardar a temperatura ambiente
durante hasta 3 meses. Preparar tampón fresco si la resolución del pico (como se define en la sección de idoneidad del sistema) se afecta (valor de R lt; 1,0). Opcional: Diluir disolución de tampón tetraborato (MicroSolv) añadiendo 120 ml de agua ultrapura a 80 ml de tampón tetraborato de sodio 150 mM para una concentración final de 60 mM (± 5 mM). Valorar con NaOH 10 N para llevar la disolución a pH a 9,25 (± 0,1). Para una disolución 55 mM de tetraborato, diluir 66 ml de tampón tetraborato de sodio 150 mM en 114 ml de agua ultrapura. Valorar como antes. Para una disolución 65 mM de tetraborato, diluir 78 ml de tampón tetraborato de sodio 150 mM en 102 ml de agua ultrapura. Valorar como antes. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante un máximo de 3 meses. Preparar tampón fresco si la resolución del pico (como se define en la sección de idoneidad del sistema) se afecta (valor de R lt; 1,0).
Disoluciones de aclarado del capilar.
Disolución 1 N de NaOH: Añadir 1 ml de disolución 10 N de NaOH a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 9 ml de agua de calidad para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
Disolución 1 N de HCl: Añadir 1 ml de disolución 6 N de HCl a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 5 ml de agua de calidad para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. Disolución al 80% de metanol: Añadir 8 ml de metanol de calidad para HPLC a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 2 ml de agua de calidad para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
Disoluciones madre de patrón de monosacárido:
N-Acetilglucosamina (GalNAc). Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de GalNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex hasta que se disuelva. Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml).
N-Acetilgalactosamina (GlcNAc): Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de GlcNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex hasta que se disuelva. Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml).
N-Acetilmanosamina (ManNAc): Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de ManNAc en un vial criogénico de 2,0 ml. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex hasta que se disuelva. Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml).
Guardar las disoluciones madre de patrón de monosacárido a -20 ºC durante hasta 1 año:
Disolución de trabajo I de monosacárido: Disolución de trabajo de patrón interno. Diluir disolución madre de ManNAc 100 veces con agua de calidad para HPLC añadiendo 20 μl de disolución madre de ManNAc en un vial criogénico de 2 ml que ya contiene 1980 μl de agua de calidad para HPLC. Remover con vórtex aproximadamente 5 a 10 segundos. Guardar la disolución de trabajo de patrón interno a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Disolución de trabajo II de monosacárido: Disolución de trabajo de patrón de mezcla de amino. En un vial criogénico de 2,0 ml que contiene 1960 μl de agua de calidad para HPLC, añadir 20 μl de disoluciones madre de GalNAc y GlcNAc, respectivamente. Remover con vórtex aproximadamente 5 a 10 segundos. Guardar la disolución de trabajo de patrón de mezcla de amino a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Disoluciones de muestra y de material de referencia. Descongelar muestras de proteína congeladas a 2-8 ºC y mezclar suavemente por inversión. Diluir tanto las muestras como el material de referencia con agua de calidad para HPLC a aproximadamente 1,0 mg/ml. Anotar la concentración con tres cifras significativas.
Condiciones de ejecución de CE.
Tampón de electroforesis (etapa 2.5)
Tetraborato de sodio 60 mM, pH 9,25
Temperatura del cartucho del capilar
25 ºC
Voltaje
25-30 kV, modo positivo
Condición del detector
Detector LIF, excitación: 488 nm, emisión: 520 nm.
Inyección de muestra
Modo de inyección de presión, 20 s a 3,4 kPa
Tiempo de ejecución
10 minutos
Almacenamiento de muestras
10 ºC
Procedimiento
Hidrólisis. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 200 μl dedisolución 4 N de hidrólisis. Ésta sirve de blanco del sistema. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 10 μl de disolución patrón de mezcla de amino. Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 4 N de hidrólisis. Esta sirve de patrón de monosacárido para la cuantificación e idoneidad del sistema. Preparar por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 10 μl de disolución de material de referencia de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml). Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 4 N de HCl. Preparar por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de ManNAc y 10 μl de disolución de muestra (aproximadamente 1 mg/ml). Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 4 N de HCl. Preparar por duplicado. Remover con vórtex las muestras durante aproximadamente 10 segundos y centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos. Poner las muestras en una gradilla de viales de 96 posiciones e incubar en una estufa a 95 ºC durante 6 h. Después de la hidrólisis, poner las muestras hidrolizadas a -20 ºC durante 10 minutos para enfriar. Centrifugar brevemente las muestras hidrolizadas hasta que cualquier condensado se fuerce al fondo del tubo (5-10 segundos a alta velocidad). Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac. Reconstituir cada muestra con 100 μl de agua de calidad para HPLC y remover con vórtex 10-15 s. Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac.
Re-acetilación. Reconstituir cada muestra con 10 μl de tampón de re-acetilación M6 y remover con vórtex 5-10 s. Mezclar bien. Añadir 4 μl de reactivo de re-acetilación M3 en cada tubo. Remover con vórtex durante aproximadamente 5-10 segundos. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac. Reconstituir cada muestra con 100 μl de agua de calidad para HPLC y remover con vórtex 10-15 s. Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac.
Derivatización. Poner la microcentrífuga en la estufa para equilibrar a la temperatura de la estufa de 55 ºC. Reconstituir cada muestra con 10 μl de disolución de derivatización I (disolución 0,1 M de APTS). Remover con vórtex aproximadamente 5-10 segundos. Añadir 5 μl de la disolución de derivatización II (HAc 1 M y NaBH3CN 0,25 M). Remover con vórtex aproximadamente 5-10 segundos y centrifugar. Cargar rápidamente los viales de muestra en la centrífuga precalentada y poner la centrífuga de nuevo en la estufa de 55 ºC. Incubar durante 3 h mientras que se centrifuga a 2000 rpm. Esto evita la condensación de disolvente sobre la superficie del vial.
Preparación de la instrumentación.
5.4.1 Instalar un nuevo capilar, aclarar en modo de alta presión (80 PSI) usando las siguientes etapas: NaOH 1 N durante 20 minutos; agua de calidad para HPLC durante 10 minutos, tampón tetraborato de sodio 60 mM durante 10 minutos.
Operación diaria
Antes de cada operación del día, ejecutar las secuencias de lavado/aclarado para aclarar el capilar.
Luego ejecutar el patrón de idoneidad del sistema (patrón de monosacárido) para asegurar que el sistema sea adecuado.
Usando NaOH 1 N puede grabarse el interior de los capilares de diferentes vendedores y producir un desplazamiento en los tiempos de migración durante la ejecución. Si esto hace que el tiempo de migración del último pico (GlcNAc) sea superior a 10,0 minutos, puede ser necesario sustituir NaOH 1 N con NaOH 0,1 N o agua de calidad para HPLC para el aclarado de la etapa 2.
Si se usa un capilar equivalente y el procedimiento de lavado anterior no es adecuado, el uso de 80% de metanol y/o HCl 1 N puede ser necesario para que el último pico (GlcNAc) esté dentro de los valores ejemplares de 10,0 minutos.
Preparación para inyección
Después de la derivatización, dejar las muestras enfriar a temperatura ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos a temperatura ambiente, hasta que el condensado es forzado al fondo del tubo.
Añadir 85 μl de agua de calidad para HPLC a cada tubo para llevar el volumen final de cada muestra a 100 μl. Remover con vórtex durante 5-10 segundos.
Transferir 10 μl de muestra de cada tubo a un microvial de EC y añadir 190 μl de agua de calidad para HPLC a cada tubo. Remover con vórtex durante 5-10 segundos.
Etapas de aclarado y secuencia de inyección:
Nota: Cada cuatro inyecciones, cambiar el tampón de electroforesis de CE con tampón de electroforesis CE recientemente preparado (debido al efecto de agotamiento iónico). Realizar el aclarado del capilar a 40 psi.
Etapa
Descripción Tiempo deejecución(min)
1 (Aclarado)
Agua de calidad para HPLC 1
2 (Aclarado)
NaOH 1 N o NaOH 0,1 N 3
O
Agua de calidad para HPLC Nota: Si se usa agua de HPLC para el aclarado de la etapa 2, las etapas 1, 2 y 3 pueden combinarse en una única ejecución de 3 minutos.
1
3 (Aclarado)
Agua de calidad para HPLC 1
4 (Aclarado)
Tampón de electroforesis de tetraborato de sodio 60 mM 5
5 (Aclarado)
Blanco (Marcador de patrón interno) 10
6 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
7 (Aclarado)
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 10
8 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
9
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 10
10 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
11
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 10
12 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
13
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 10
14 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
15
Prep mat ref de CTLA4-Ig 1 10
16 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
17
Prep mat ref de CTLA4-Ig 2 10
18 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
19
Prep 1 de muestra 1 10
20 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
21
Prep 1 de muestra 1 10
22 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
23
Prep 2 de muestra 1 10
24 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
25
Prep 2 de muestra 1 10
26 (Aclarado)
Repetir 1-4 18
27
Prep 1 de muestra 2 10
28 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
29
Prep 1 de muestra 2 10
30 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
31
Prep 2 de muestra 2 10
32 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
(continuación)
Etapa
Descripción Tiempo deejecución(min)
33
Prep 2 de muestra 2 10
34 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
35
Prep 1 de muestra 3 15
36 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
37
Prep 1 de muestra 3 10
38 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
39
Prep 2 de muestra 3 10
40 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
41
Prep 2 de muestra 3 10
42 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
43
Prep I de material de referencia de CTLA4-Ig 10
44 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
45
Prep 2 de material de referencia de CTLA4-Ig 10
46 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
47
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 10
48 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
49
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 10
50
Repetir 1-4 10
51
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 10
52
Repetir 1-4 10
53
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 10
*Nota: Repetir la secuencia durante hasta tres muestras por duplicado y de agrupamiento con 2 inyecciones de cada preparación de patrón de monosacárido. Usar las ocho inyecciones de patrón de idoneidad del sistema para 5 muestras dispuestas en grupos de tres. Si la ejecución es superior a tres muestras, ejecutar las muestras adicionales como se muestra en la secuencia anterior empezando con la línea 19. Completar la secuencia ejecutando la idoneidad del sistema (Patrón de mono) como se muestra en las líneas 47 a 53 en la Tabla.
**Muestras de agrupamiento con dos inyecciones de cada preparación de material de referencia de CTLA4-Ig.
Idoneidad del sistema. Nota: Los valores de idoneidad del sistema se determinan usando la primera inyección de
10 patrón de idoneidad del sistema a menos que se especifique de otro modo. El electroferograma de la primera idoneidad del sistema debe ser similar al mostrado en la Figura 1, en el que el pico 1 es GalNAc; el pico 2 es ManNAc; el pico 3 es GlcNAc. Nota: Si van a usarse instrumentos de EC distintos de Beckman P/ACE MDQ, la longitud del capilar podría ser diferente de la especificada en este procedimiento debido a diversas configuraciones de cartuchos que contienen el capilar de separación. Esto produciría variaciones en el tiempo de migración del
15 analito, además de la intensidad del pico.
La resolución entre dos picos vecinos se calcula para el primer patrón de idoneidad del sistema por el instrumento según la siguiente ecuación:
en la que:
R = resolución t2, t1 = tiempos de migración de los dos picos vecinos, respectivamente W1, W2 = las anchuras de los picos en la base de los dos picos vecinos, respectivamente
El valor de R debe ser ≥ 1,0. Si R lt; 1,0, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de electroforesis recientemente preparado o sustituir el capilar.
Para la última inyección de idoneidad del sistema, el último pico (GlcNAc) debe tener un factor de cola lt;1,4 usando la siguiente fórmula:
T = W0,05/2f
en la que:
T = factor de cola W0,05 = anchura del pico al 5% de altura f = anchura del frente del pico al máximo del pico
Si T ≥ 1,4, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de ejecución recientemente preparado o sustituir el capilar.
6.1 Las inyecciones por duplicado de patrones de idoneidad del sistema deben cumplir los siguientes valores ejemplares:
■
Relación del área del pico de GlcNAc frente a ManNAc: DER ≤ 10% (calculada en la etapa 7.1)
■
El tiempo de migración de GlcNAc debe ser ≤ 10,0 minutos
■
El perfil debe ser equivalente a la Figura 1 en la que se observan los tres picos y el patrón interno (ManNAc) es el pico número 2.
Si no se cumple alguno de los valores ejemplares anteriores antes de probar las muestras, primero aumentar el voltaje si el tiempo de migración de GlcNAc es superior a 10,0 minutos. A continuación, si la relación del área de pico es gt; 10%, preparar tampón CE fresco asegurándose de su pH o sustituir el capilar. Después del ajuste del instrumento, repetir las inyecciones de idoneidad del sistema. Cuando se analiza el perfil del pico, si se produce una disminución significativa en la altura del pico de ManNac, comprobar para estar seguro que no se ha alineado erróneamente el cable de fibra óptica en el módulo de LIF.
Determinar el porcentaje de DER del patrón de monosacárido comparando las relaciones del área del pico de componentes de patrón interno y patrón de monosacárido. Dividir el área del pico para cada componente de monosacárido entre el área del pico del patrón interno para cada inyección de patrón de monosacárido. Calcular el porcentaje de DER para GalNAc y GlcNAc para los dos patrones entre agrupamiento. La DER debe ser ≤ 10%. Si este valor ilustrativo promedio no se cumple, entonces el capilar debe aclararse o sustituirse como antes.
Cálculos
Calcular la relación del área del pico de GaINAc y GIcNAc con respecto al patrón interno (ManNAc). Usar en inyecciones por duplicado de los primeros cuatro patrones de idoneidad del sistema de manera que cumplan los valores ejemplares y realizar los mismos cálculos en todos los patrones de idoneidad del sistema de agrupamiento, inyectados antes y después de la(s) muestra(s).
Relación del área de pico = Dividir el área del pico para cada componente de monosacárido (GlcNAc, GaINAc) entre el área del pico del patrón interno (ManNAc) para cada patrón de inyección de idoneidad del sistema.
área del pico demonosacáridoRelación del área depico 5 área del pico deMaNAc
Calcular una media de las relaciones del área del pico para GIcNAc y GaINAc en los patrones de idoneidad del sistema. Calcular también una desviación estándar (D.E.) y porcentaje de desviación estándar relativa (% de DER)
Valores ejemplares: DER para la relación del área del pico de GlcNAc ≤ 10%. Dos patrones de idoneidad del sistema, de agrupamiento, inyectados antes y después de la(s) muestra(s): Porcentaje de DER para la relación del área del pico de GIcNAc y GalNAc ≤ 10%.
Si este valor ilustrativo promedio no se cumple (DER gt; 10%), entonces el capilar necesita volver a aclararse con los procedimientos de aclarado y aquellas muestras y patrones de monosacárido de agrupamiento necesitan ejecutarse de nuevo. Si todavía no se cumple el valor ilustrativo promedio, sustituir el capilar y aclarar como se ha establecido. Ejecutar de nuevo las muestras y patrones de monosacárido de agrupamiento.
en la que: n = número de mediciones en la muestra x = mediciones individuales
Desviación estándar
%de DER 5 ?100
Área del pico medida promedio
Calcular la proporción molar de GaINAc/proteína:
en la que:
RGalNAc = proporción molar de GalNAc frente a proteína AGalNAc = área del pico (μV·s) de GalNAc en la muestra AManNAc = área del pico (μV·s) de ManNAc en la muestra AManNAc0 = área del pico (μV·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido AGalNAc0 = área del pico (μV·s) promedio de GalNAc en patrón de monosacárido VGalNAc0 = volumen de GaINAc contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis
(en μl) CGalNAc0 = concentración de GalNAc contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la
hidrólisis (en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWCTLA4-Ig = peso molecular del material de referencia de CTLA4-Ig MWGlcNAc = peso molecular de GalNAc (221,2 daltons)
Agrupación de patrones. Cuando se calculan relaciones molares de material de referencia de CTLA4-Ig y muestras, usar los ocho patrones de agrupamiento de idoneidad del sistema. Promediar las áreas de los picos para inclusión en esta ecuación. Ésta va a usarse para las primeras tres muestras. Para todas las otras muestras, usar siempre el área del pico promedio de los cuatro siguientes patrones de monosacárido de agrupamiento y los cuatro patrones de monosacárido de agrupamiento previos para los cálculos de proporción molar.
Calcular la proporción molar de GIcNAc/Proteína
en la que:
RGlcNAc = proporción molar de GlcNAc frente a proteína
AGlcNAc = área del pico (μV·s) de GlcNAc en la muestra
AManNAc = área del pico (μV·s) de ManNAc en la muestra
AManNAc0 = área del pico (μV·s) promedio de ManNAc en patrón de monosacárido
AGlcNAc0 = área del pico (μV·s) promedio de GIcNAc en patrón de monosacárido
VGlcNAc0 = volumen de GlcNAc contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl)
CGIcNAc0 = concentración de GIcNAc contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml)
Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl)
Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml)
MWCTLA4-Ig = peso molecular de material de referencia de CTLA4-Ig según COA
MWGlcNAc = peso molecular de GIcNAc (221,2 daltons) Valores ejemplares. El porcentaje de DER para las relaciones del área del pico de los dos patrones de idoneidad del sistema de amino de agrupamiento no debe superar el 10%. Las relaciones molares promedio para aminomonosacáridos en el material de referencia deben estar dentro de los intervalos especificados. Para cada componente, el % de DER para los cuatro resultados (inyección por duplicado de preparaciones por duplicado) debe ser lt;/= 25%.
Intervalo de proporción molar de material de referencia de CTLA4-Ig
Monosacárido
Intervalo
GalNAc
2,0-3,2
GlcNAc
18-32
Información de resultados. Informar el resultado promedio como el número de moléculas de GaINAc por molécula de CTLA4-Ig y número de moléculas de GlcNAc por molécula CTLA4-Ig. Informar los resultados de proporción molar
10 con dos cifras significativas. Para cada componente, el % de DER para los cuatro resultados (inyección por duplicado de preparaciones por duplicado) debe ser lt;/= 25%.
Ejemplo 64: Procedimientos para obtener relaciones molares de monosacáridos neutros (manosa, fucosa, galactosa) con respecto a proteína en muestras de principio activo de CTLA4-Ig.
Reactivos
15 Disolución de hidrólisis (disolución acuosa 2 M de TFA). Añadir 148 μl de TFA y 852 μl de agua de calidad para HPLC a un tubo de microcentrífuga de 1,7. Remover con vórtex durante 5-10 segundos. Escalar según se necesite. Preparar la disolución inmediatamente antes de uso.
Disolución de derivatización I (disolución acuosa 0,1 M de APTS). Añadir 192 μl de agua de calidad para HPLC a 10 mg de polvo de APTS en un vial de vidrio. Remover con vórtex la botella 5-10 segundos para disolver
20 completamente el APTS. Guardar a -20 ºC durante hasta un año.
Disolución de derivatización II (ácido acético 1 M y NaBH3CN 0,25 M). Diluir 20 μl ácido acético con 320 μl de agua de calidad para HPLC (dilución de 17 veces) en un tubo de centrífuga de 0,4 ml para preparar una disolución 1 M de ácido acético. Pesar 2,0 ± 0,5 mg de NaBH3CN en un vial criogénico. Usando la siguiente fórmula, añadir un volumen apropiado de la disolución 1 M de ácido acético para preparar NaBH3CN 0,25 M.
25 Volumen (μl) = 103 x (peso de NaBH3CN en mg)/62,84 g/moles x 0,25 moles/l)
. El cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN) debe almacenarse en la oscuridad en un desecador.
. Se recomienda subdividir el reactivo en una serie de crioviales de 2,0 ml para el almacenamiento para evitar abrir repetidamente la botella de reactivo original del siguiente modo:
. Pesar 1 g ± 0,2 mg de cianoborohidruro de sodio en un criovial de 2,0 ml. Separar en alícuotas el contenido 30 entero de cianoborohidruro de sodio de la botella original de este modo.
. Tapar fuertemente y etiquetar los crioviales secuencialmente (1, 2, 3, etc.) junto con el nombre del reactivo, número de lote y una fecha de caducidad de 6 meses.
. Los viales debe cerrarse con Parafilm para evitar la humedad.
. Pesar cianoborohidruro de sodio para la disolución de derivatización II no más de tres veces del mismo 35 criovial. Anotar esto y la secuencia del criovial en la hoja de cálculo del laboratorio.
. Tanto un pico de reactivo observado en el perfil de CE como el mal etiquetado pueden producirse después de la apertura repetida del criovial o con ese lote particular de cianoborohidruro de sodio. Si esto afecta los resultados, desechar el criovial que se usa y tanto pesar reactivo de un criovial con el siguiente número de secuencia como de un nuevo lote de cianoborohidruro de sodio.
40 Tampón de electroforesis (tetraborato de sodio 60 ± 5 mM, pH 9,25)
Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sodio en una botella de vidrio limpia de 100 ml.
Añadir 90 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar sobre una placa de agitación hasta que las sales se disuelvan completamente.
Ajustar el pH a 9,25 ± 0,10 con NaOH 10 N.
Añadir agua de calidad para HPLC para preparar el volumen final de 100 ml para una concentración final de 60 mM (± 5 mM). Para una disolución 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetraborato de sodio y seguir las instrucciones anteriores para
disolver y valorar.
Para una disolución 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02 g) de tetraborato de sodio y seguir las instrucciones anteriores para disolver y valorar. Guardar a temperatura ambiente durante hasta 3 meses. Preparar tampón fresco si la resolución del pico (como se
define en la sección de idoneidad del sistema) se afecta (valor de R lt; 1,0). Opcional: Diluir disolución de tampón tetraborato (MicroSolv) añadiendo 120 ml de agua ultrapura a 80 ml de tampón
tetraborato de sodio 150 mM para una concentración final de 60 mM (± 5 mM). Valorar con NaOH 10 N para llevar la disolución a pH a 9,25 (± 0,1). Para una disolución 55 mM de tetraborato, diluir 66 ml de tampón tetraborato de sodio 150 mM en 114 ml de agua
ultrapura. Valorar como antes.
Para una disolución 65 mM de tetraborato, diluir 78 ml de tampón tetraborato de sodio 150 mM en 102 ml de agua ultrapura. Valorar como antes. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante un máximo de 3 meses. Preparar tampón fresco si la
resolución del pico (como se define en la sección de idoneidad del sistema) se afecta (valor de R lt; 1,0). Disoluciones de aclarado del capilar Disolución 1 N de NaOH Añadir 1 ml de disolución 10 N de NaOH a un tubo de plástico graduado de 14 ml que contiene 9 ml de agua de
calidad para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. Disolución 1 N de HCl: Añadir 1 ml de disolución 6 N de HCl a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 5 ml de agua de calidad
para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. Disolución al 80% de metanol: Añadir 8 ml de metanol de calidad para HPLC a un tubo de plástico graduado de 15 ml que contiene 2 ml de agua de
calidad para HPLC. Mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta 6 meses. Disoluciones madre de patrón de monosacárido Manosa (Man) Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de manosa en un vial criogénico de 2,0 ml. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml). Fucosa (Fuc) Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de fucosa en un vial criogénico de 2,0 ml. Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s. Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml). Galactosa (Gal) Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de galactosa en un vial criogénico de 2,0 ml.
Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s.
Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml).
Xilosa (Xil)
Pesar con exactitud 5 ± 1 mg de xilosa en un 2,0 ml.
Añadir 1 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar bien removiendo con vórtex 5-10 s.
Registrar la concentración exacta de la disolución (mg/ml).
Guardar las disoluciones madre de patrón de monosacárido a -20 ºC durante hasta 1 año.
Disolución de trabajo I de monosacárido: Disolución de trabajo de patrón interno. Para preparar disolución de trabajo de patrón interno, diluir disolución madre de xilosa 100 veces con agua de calidad para HPLC añadiendo 20 μl de disolución madre de xilosa (3.6.4) en un vial criogénico de 2 ml, que ya contiene 1980 μl de agua de calidad para HPLC. Remover con vórtex durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Guardar esta disolución de trabajo de patrón interno a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Disolución de trabajo II de monosacárido: Disolución patrón de mezcla neutra de trabajo. En un vial criogénico de 2,0 ml que contiene 1940 μl de agua de calidad para HPLC, añadir 20 μl de disoluciones madre de manosa, fucosa y galactosa, respectivamente. Remover con vórtex durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Guardar esta disolución de trabajo de patrón interno a 2-8 ºC durante hasta 6 meses.
Disoluciones de muestra y de material de referencia. Descongelar muestras de proteína congeladas a 2-8 ºC y suavemente mezclar por inversión. Diluir tanto las muestras como el material de referencia con agua de calidad para HPLC a aproximadamente 1,0 mg/ml.
Condiciones de ejecución de CE
Tampón de electroforesis Tetraborato de sodio 60 mM, pH 9,25
Temperatura del cartucho del capilar 25 ºC
Voltaje 25-30 kV, modo positivo
Condición del detector Detector LIF, excitación: 488 nm, emisión: 520 nm
Inyección de muestra Modo de inyección de presión, 20 s a 0,5 PSI
Tiempo de ejecución 15 minutos
Almacenamiento de muestras 10 ºC
Procedimiento
Hidrólisis: En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 200 μl de disolución2 M de TFA. Ésta sirve de blanco del sistema. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 10 μl de disolución de trabajo patrón de mezcla neutra. Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 2 M de TFA y remover con vórtex durante 3-4 s. Ésta sirve de patrón de monosacárido para la cuantificación e idoneidad del sistema. Preparar por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 10 μl de disolución de material de referencia de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml). Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 2 M de TFA y remover con vórtex durante 3-4 s. Preparar por duplicado. En un tubo de centrífuga de 0,65 ml, añadir 10 μl de disolución de trabajo de xilosa y 10 μl de disolución de muestra (aproximadamente 1 mg/ml). Adicionalmente añadir 200 μl de disolución 2 M de TFA y remover con vórtex durante 3-4 s. Preparar por duplicado. Remover con vórtex las muestras durante aproximadamente 20 segundos y centrifugar durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Poner muestras en una gradilla de viales de 96 posiciones e incubar en una estufa a 95 ºC durante 6 h. Después de la hidrólisis, poner las muestras a -20 ºC durante 10 minutos para enfriarlas. Centrifugar brevemente las muestras hidrolizadas hasta que cualquier condensado se fuerce al fondo del tubo (5 a 10 segundos a alta velocidad). Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac. Reconstituir cada muestra con 100 μl de agua de calidad para HPLC y remover con vórtex 10-15 s. Evaporar las muestras a sequedad en SpeedVac.
Derivatización: Poner la microcentrífuga en la estufa para equilibrar a la temperatura de la estufa de 55 ºC. Reconstituir cada muestra con 10 μl de disolución de derivatización I (disolución 0,1 M de APTS). Remover con vórtex aproximadamente 5-10 segundos. Añadir 5 μl de la disolución de derivatización II (HAc 1 M y NaBH3CN 0,25 M). Remover con vórtex aproximadamente 5-10 segundos y centrifugar. Cargar rápidamente los viales de muestra en la centrífuga precalentada y poner la centrífuga de nuevo en la estufa de 55 ºC. Incubar durante 3 h mientras que se centrifuga a 2000 rpm. Esto evita la condensación de disolvente sobre la superficie del vial.
Preparación de la instrumentación: Instalar un nuevo capilar, aclarar en modo de alta presión (80 PSI) usando las siguientes etapas:
NaOH 1 N durante 20 minutos.
agua de calidad para HPLC durante 10 minutos.
5 tampón tetraborato de sodio 60 mM durante 10 minutos.
Ejecutar las secuencias de lavado/aclarado para aclarar el capilar. Luego ejecutar el patrón de idoneidad del sistema (patrón de monosacárido) para asegurar que el sistema es adecuado. Usando NaOH 1 N puede grabarse el interior de los capilares de diferentes vendedores y producir un desplazamiento en los tiempos de migración durante la ejecución. Si esto hace que el tiempo de migración del último pico (galactosa) sea superior a 15,0 minutos, puede
10 ser necesario sustituir NaOH 1 N con NaOH 0,1 N o agua de calidad para HPLC para el aclarado de la etapa 2. Si se usa un capilar equivalente y el procedimiento de lavado anterior no es adecuado, el uso de 80% de metanol y/o HCl 1 N puede ser necesario para que el último pico (galactosa) esté dentro de los valores ejemplares de 15,0 minutos.
Preparación para inyección: Después de la derivatización, dejar las muestras enfriar a temperatura ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos a temperatura ambiente, hasta que el condensado es forzado al fondo
15 del tubo. Añadir 85 μl de agua de calidad para HPLC a cada tubo para llevar el volumen final de cada muestra a 100 μl. Remover con vórtex durante 5-10 segundos. Transferir 10 μl de muestra de cada tubo a un microvial de EC y añadir 190 μl de agua de calidad para HPLC a cada tubo. Remover con vórtex durante 5-10 segundos.
Etapas de aclarado y secuencia de inyección:
Etapa
Descripción Tiempo deejecución(min)
1 (Aclarado)
Agua de calidad para HPLC 1
2 (Aclarado)
NaOH 1 N o NaOH 0,1 N 3
O
Agua de calidad para HPLC
1
Nota: Si se usa agua de HPLC para el aclarado de la etapa 2, las etapas 1, 2 y 3 pueden combinarse en una única ejecución de 3 minutos.
3 (Aclarado)
Agua de calidad para HPLC 1
4 (Aclarado)
Tampón de electroforesis de tetraborato de sodio 60 mM 5
5
Blanco (Marcador de patrón interno) 15
6 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
7
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 15
8 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
9
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 15
10 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
11
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 15
12 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
13
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 15
14 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
15
Prep mat ref de CTLA4-Ig 1
15
16 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
17
Prep 2 de material de referencia de CTLA4-Ig 15
18 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
19
Prep 1 de muestra 1 15
20 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
21
Prep 1 de muestra 1 15
22 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
23
Prep 2 de muestra 1 15
24 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
(continuación)
Etapa
Descripción Tiempo deejecución(min)
25
Prep 2 de muestra 1 15
26 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
27
Prep 1 de muestra 2 15
28 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
29
Prep 1 de muestra 2 15
30
Repetir 1-4 10
31
Prep 2 de muestra 2 15
32 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
33
Prep 2 de muestra 2 15
34 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
35
Prep 1 de muestra 3 15
36 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
37
Prep 1 de muestra 3 15
38 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
39
Prep 2 de muestra 3 15
40 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
41
Prep 2 de muestra 3 15
42 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
43
Prep 1 de material de referencia de CTLA4-Ig 15
44 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
45
Prep 2 de material de referencia de CTLA4-Ig 15
46 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
47
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 15
48 (Aclarado)
Repetir 1-4 10
49
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 1) 15
50
Repetir 1-4 10
51
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 15
52
Repetir 1-4 10
53
Idoneidad del sistema (Prep patrón de mono 2) 15
* Repetir la secuencia durante hasta tres muestras por duplicado y agrupar con 2 inyecciones de cada preparación de patrón de monosacárido. Usar las ocho inyecciones de patrón de idoneidad del sistema para muestras dispuestas
5 en grupos de tres. Si la ejecución es superior a tres muestras, ejecutar las muestras adicionales como se muestra en la secuencia anterior empezando con la línea 19.
** Agrupar muestras con dos inyecciones de cada preparación de material de referencia de CTLA4-Ig.
Idoneidad del sistema. El electroferograma de la primera idoneidad del sistema debe ser similar a aquel en el que el pico 1 es manosa; el pico 2 es xilosa; el pico 3 es fucosa; y el pico 4 es galactosa. Nota: Si van a usarse
10 instrumentos de EC distintos de Beckman P/ACE MDQ, debido a diversas configuraciones de cartuchos que contienen el capilar de separación, la longitud del capilar podría ser diferente de la especificada en este procedimiento. Esto produciría variaciones en el tiempo de migración del analito, además de la intensidad del pico.
La resolución entre dos picos vecinos se calcula para el primer patrón de idoneidad del sistema por el instrumento según la siguiente ecuación:
en la que:
R = resolución t2, t1 = tiempos de migración de los dos picos vecinos, respectivamente W1, W2 = las anchuras de los picos en la base de los dos picos vecinos, respectivamente
El valor de R debe ser ≥ 1,0. Si R lt; 1,0, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de ejecución recientemente preparado o sustituir el capilar.
Para la última inyección de idoneidad del sistema, el último pico (galactosa) debe tener un factor de cola lt; 1,4 usando la siguiente fórmula:
T = W0,05/2f
en la que:
T = factor de cola W0,05 = anchura del pico al 5% de altura f = anchura del frente del pico al máximo del pico
Si T ≥1,4, aclarar el capilar con las secuencias de lavado/aclarado; si el problema persiste, sustituir el tampón antiguo con tampón de ejecución recientemente preparado o sustituir el capilar.
La inyección por duplicado de los primeros cuatro patrones de idoneidad del sistema deben cumplir los siguientes valores ejemplares:
. Relación del área del pico de galactosa frente a xilosa: DER ≤10%.
. El tiempo de migración de galactosa necesita ser ≤15,0 minutos
. El perfil debe ser equivalente a la Figura 1 en la que se observan los cuatro picos y el patrón interno (xilosa) es el pico número 2.
Si no se cumple alguno de los valores ejemplares anteriores, aumentar primero el voltaje si el tiempo de migración de la galactosa es superior a 15,0 minutos. A continuación, si la relación del área de pico es gt; 10%, entonces preparar tampón CE fresco asegurándose de su pH o sustituir el capilar.
Después del ajuste del instrumento, repetir las inyecciones de idoneidad del sistema. Cuando se analiza el perfil del pico, si se produce una disminución significativa en la altura del pico de xilosa, comprobar para estar seguro que no se ha alineado erróneamente el cable de fibra óptica en el módulo de LIF. Determinar el porcentaje de DER del patrón de monosacárido comparando las relaciones del área del pico de componentes de patrón interno y patrón de monosacárido. Dividir el área del pico para cada componente de monosacárido entre el área del pico del patrón interno para cada inyección de patrón de monosacárido. Calcular el porcentaje de DER para manosa, fucosa y galactosa para los dos patrones de agrupamiento. La DER debe ser ≤ 10%. Si no se cumple este valor ilustrativo promedio, entonces el capilar debe aclararse o sustituirse como antes. Las muestras y patrones de monosacárido de agrupamiento necesitan repetirse.
Cálculos. Calcular la relación del área del pico de Man, Fuc y Gal con respecto al patrón interno (xilosa). Usar en inyecciones por duplicado de los primeros cuatro patrones de idoneidad del sistema de manera que cumplan los valores ejemplares y realizar los mismos cálculos en todos los patrones de idoneidad del sistema de agrupamiento, inyectados antes y después de la(s) muestra(s). Relación del área de pico = Dividir el área del pico para cada componente de monosacárido (Man, Fuc y Gal) entre el área del pico del patrón interno (xilosa) para cada patrón de inyección de idoneidad del sistema.
área del pico demonosacáridoRelación del área depico 5 área del pico de xilosa
Calcular una media de las relaciones del área de pico para Man, Fuc y Gal en los patrones de idoneidad del sistema. Calcular también una desviación estándar (D.E.) y porcentaje de desviación estándar relativa (% de DER). Valores ejemplares: DER para la relación del área del pico de galactosa ≤ 10%. Dos patrones de idoneidad del sistema, de agrupamiento, inyectados antes y después de la(s) muestra(s):
Porcentaje de DER para la relación del área del pico de Man, Fuc y Gal ≤ 10%.
Si no se cumple este valor ilustrativo promedio (DER gt; 10%), entonces el capilar necesita volver a aclararse con los procedimientos de aclarado y aquellas muestras y patrones de monosacárido de agrupamiento necesitan ejecutarse de nuevo. Si todavía no se cumple el valor ilustrativo promedio, sustituir el capilar y aclarar. Ejecutar de nuevo las muestras y patrones de monosacárido de agrupamiento.
en la que:
n = número de mediciones en la muestra x = mediciones individuales
Desviación estándar
%de DER 5?100
Área del pico medida promedio
Calcular la proporción molar de manosa/proteína
A xA xV xC xMW
Man Xil0 Man0 Man0 CTLA48IgRMan 5
A xA xV xC xMW
Xil Man0 p p Man
en la que:
RMan = proporción molar de manosa (Man) frente a proteína AMan = área del pico (μV·s) de Man en la muestra AXil = área del pico (μV·s) de xilosa (Xil) en la muestra AXil0 = área del pico (μV·s) promedio de Xil en patrón de monosacárido AMan0 = área del pico (μV·s) promedio de Man en patrón de monosacárido VMan0 = volumen de Man contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en μl) CMan0 = concentración de Man contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWCTLA4-Ig = peso molecular del material de referencia de CTLA4-Ig según Certificado de Análisis (COA) MWMan = peso molecular de manosa (180,2 daltons)
Agrupamiento de patrones. Cuando se calculan las relaciones molares de material de referencia de CTLA4-Ig y muestras, usar los ocho patrones agrupados de idoneidad del sistema. Promediar las áreas de los picos para inclusión en esta ecuación. Ésta va a usarse para las primeras tres muestras. Para todas las otras muestras, usar siempre el área del pico promedio de los cuatro siguientes patrones de monosacárido agrupados y los cuatro patrones de monosacárido agrupados previos para los cálculos de proporción molar.
Calcular la proporción molar de fucosa/proteína:
A xA xV xC xMW
Fuc Xil0 Fuc0 Fuc0 CTLA48IgRFuc 5
A xA xV xC xMW
Xil Fuc0 p p Fuc
en la que:
RFuc = proporción molar de fucosa (Fuc) frente a proteína AFuc = área del pico (μV·s) de Fuc en la muestra AXil = área del pico (μV·s) de xilosa (Xil) en la muestra AXil0 = área del pico (μV·s) promedio de Xil en patrón de monosacárido AFuc0 = área del pico (μV·s) promedio de Fuc en patrón de monosacárido VFuc0 = volumen de Fuc contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en
μl) CFuc0 = concentración de Fuc contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la
hidrólisis (en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWCTLA4-Ig = peso molecular de material de referencia de CTLA4-Ig según el Certificado de Análisis (COA) MWFuc = peso molecular de fucosa (164,2 daltons) Calcular la proporción molar de galactosa/proteína:
A xA xV xC xMW
Gal Xil0 Gal0 Gal0 CTLA48IgRGal 5
A xA xV xC xMW
Gal Gal0 p p Gal
en la que:
RGal = proporción molar de galactosa (Gal) frente a proteína
5 AGal = área del pico (μV·s) de Gal en la muestra AXil = área del pico (μV·s) de xilosa (Xil) en la muestra AXil0 = área del pico (μV·s) promedio de Xil en patrón de monosacárido AGal0 VGal0 = volumen de Gal contenido en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la hidrólisis (en
μl) 10 CGal0: = concentración de Gal contenida en la disolución de trabajo de monosacárido usada para la
hidrólisis (en mg/ml) Vp = volumen de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en μl) Cp = concentración de muestra de proteína usada para la hidrólisis (en mg/ml) MWCTLA4-Ig = peso molecular de material de referencia de CTLA4-Ig según Certificado de Análisis (COA)
15 MWGal = peso molecular de Gal (180,2 daltons)
Nota: Cuando se calculan las relaciones molares de material de referencia de CTLA4-Ig y muestras, usar el último patrón de idoneidad del sistema y la siguiente preparación de patrón de idoneidad del sistema agrupado. Promediar las áreas de los picos para inclusión en esta ecuación. Ésta va a usarse para las seis primeras muestras. Para todas las otras muestras, usar siempre el área del pico promedio de los dos patrones de monosacárido agrupados para los
20 cálculos de proporción molar .
Valores ejemplares. El porcentaje de DER para las relaciones del área del pico de los dos patrones de idoneidad del sistema neutro de agrupamiento no debe superar el 10%. Las relaciones molares promedio para monosacáridos neutros en el material de referencia pueden estar dentro de los intervalos especificados en la siguiente tabla. Para cada componente, el % de DER para los cuatro resultados (inyecciones por duplicado de preparaciones por
25 duplicado) debe ser lt;/= 25 %.
Intervalo de proporción molar de material de referencia de CTLA4-Ig
Monosacárido
Intervalo
Manosa
11-18
Fucosa
4,2-7,5
Galactosa
9,2-18
Información de resultados. Informar el resultado promedio como el número de moléculas de manosa por molécula de CTLA4-Ig, número de moléculas de fucosa por molécula de CTLA4-Ig y número de moléculas de galactosa por
30 molécula de CTLA4-Ig. Informar los resultados de proporción molar con dos cifras significativas. Para cada componente, el % de DER para los cuatro resultados (inyecciones por duplicado de preparaciones por duplicado) debe ser lt;/= 25%.
Ejemplo 65 -Cuantificación del mapeo tríptico de oxidación y desamidación de CTLA4-Ig
El fin del procedimiento es monitorizar la consistencia lote a lote de CTLA4-Ig usando un procedimiento de mapeo
35 de péptidos tríptico manual con detección y cuantificación específica de la oxidación de metionina y desamidación de asparagina. El mapeo de péptidos implica proteólisis u otra fragmentación de una proteína para crear un conjunto bien definido de fragmentos de péptidos que luego se analizan, normalmente por HPLC. El cromatograma o mapa de péptidos es muy sensible a incluso el más pequeño cambio en la estructura química de la proteína y es así útil para detectar y caracterizar modificaciones postraduccionales. La muestra de proteína de CTLA4-Ig se desnaturaliza
40 en tampón guanidina-HCl 8 M y los puentes disulfuro de cistina se reducen con ditiotreitol y se S-alquilan con yodoacetamida antes de la digestión con la enzima proteolítica, tripsina. La mezcla resultante de los péptidos trípticos se analiza entonces por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) con detección UV a 215 y 280 nm. Algunas abreviaturas se enumeran a continuación:
Asn
Asparagina
Asp
Ácido aspártico
Asu
Aminosuccinimida
isoAsp
Ácido isoaspártico
Met(O)
Sulfóxido de metionina
T26
Péptido tríptico (281-302)
T26desam1
Péptido tríptico isoAsp294 (281-302)
T26desam2
Péptido tríptico Asp299 (281-302)
T26desam3
Péptido tríptico Asp294 (281-302)
T26desam4
Péptido tríptico Asu294 (281-302)
T6
Péptido tríptico (84-93)
T6ox
Péptido tríptico Met(O)85(84-93)
PRODUCTOS QUÍMICOS Y REACTIVOS Fase móvil A -0,1% de TFA en agua de calidad para HPLC 5 Transferir el contenido entero de una ampolla de 1 ml de TFA a 1000 ml de agua de calidad para HPLC y mezclar
minuciosamente para preparar 0,1% de TFA (fase móvil A). El 0,1% de TFA puede almacenarse a temperatura ambiente durante hasta dos meses. Fase móvil B -0,1% de TFA en 80% de ACN y 20% de agua de calidad para HPLC Transferir el contenido entero de una ampolla de 1 ml de TFA a 800 ml de acetonitrilo y 200 ml de agua de calidad
10 para HPLC y mezclar minuciosamente para preparar 0,1% de TFA en 80% de ACN (fase móvil B) que puede almacenarse a temperatura ambiente durante hasta dos meses.
Tampón de dilución -TRIS 100 mM, NaCl 25 mM, pH 7,6 Disolver 14,0 g de Trizma Pre-Set Crystal a pH 7,6 y 1,46 g de NaCl en 1000 ml de agua de calidad para HPLC por agitación de la disolución sobre una placa de agitación magnética. Filtrar la disolución a través de una unidad de
15 filtro de 0,2 μm. Guardar la disolución a 2 a 8 ºC durante hasta dos meses. Tampón desnaturalizante -Guanidina 8 M, TRIS 50 mM, pH 8,0 Disolver 152,8 g de clorhidrato de guanidina y 1,4 g de Trizma Pre-Set Crystal a pH 8 en 90 ml de agua de calidad
para HPLC por agitación de la disolución sobre una placa de agitación magnética. Ajustar el pH a 8,0 con tanto HCl como NaOH y llevar al volumen final de 200 ml con agua de calidad para HPLC. Filtrar la disolución a través de filtro 20 de 0,2 μm. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta seis meses.
Tampón de digestión -TRIS 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 7,6 Disolver 7,0 g de Trizma Pre-Set Crystal a pH 7,6 y 1,47 g de CaCl2 en 1000 ml de agua de calidad para HPLC por agitación de la disolución sobre una placa de agitación magnética. Filtrar la disolución a través de un filtro de 0,2 μm. Guardar la disolución a 2 a 8 ºC durante hasta dos meses.
25 Agente reductor -ditiotreitol 200 mM (DTT)
A 30,8 ± 0,2 mg de DTT, añadir 1000 μl de agua inmediatamente antes de uso y remover con vórtex hasta que se disuelva. La disolución caduca 24 horas desde el momento de la preparación. Reactivo alquilante -yodoacetamida 400 mM (IAM) A 74,0 ± 0,5 mg de yodoacetamida, añadir 1000 μl de agua inmediatamente antes de uso y remover con vórtex
30 hasta que se disuelva. La disolución caduca 24 horas desde el momento de la preparación.
HCl 1,0 M
Diluir 8,7 ml de ácido clorhídrico concentrado en 100 ml con agua de calidad para HPLC. Guardar la disolución a temperatura ambiente durante hasta dos meses.
PATRONES Y CONTROLES
5 Patrón de péptido T6ox, 30 μM
El patrón sintético de péptido tríptico T6ox es Ala-Met(O)-Asp-Thr-Gly-Leu-Tyr-Ile-Cys-Lys • 2TFA, FW 1358,4, ~95% de pureza en peso. Guardar el sólido fuertemente cerrado a -20 ºC y siempre calentar hasta temperatura ambiente en un desecador para evitar la absorción de humedad. Pesar 1,0 ± 0,1 mg de T6ox, registrar el peso exacto y disolver en 1,50 ml de tampón de digestión. Añadir 40 ul de DTT 200 mM y poner a 37 ºC durante 20 min. Enfriar
10 hasta temperatura ambiente, añadir 48 μl de yodoacetamida 400 mM y alquilar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Diluir a un volumen final de 24,5 ml con tampón de digestión dando una disolución patrón 30 ± 3 μM. Guardar alícuotas de 1 ml del patrón T6ox 30 μM a -70 ºC durante hasta 24 meses.
Patrón de péptido T26desam1, 30 μM
El patrón sintético de péptido tríptico T26desam1 es Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-isoAsp
15 Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys • 2TFA, FW 2773,7, ~85% de pureza en peso. Guardar el sólido fuertemente cerrado a -20 ºC y siempre calentar hasta temperatura ambiente en un desecador para evitar la absorción de humedad. Pesar 1,0 ± 0,1 mg de T26desam1, registrar el peso exacto y disolver en 1 ml de 30% en v:v de acetonitrilo en tampón de digestión. Diluir a un volumen final de 10,7 ml dando una disolución patrón 30 ± 3 μM. Guardar alícuotas de 1 ml del patrón de T26desam1 30 μM a -70 ºC durante hasta 24 meses.
20 PREPARACIÓN DE PATRONES Y MUESTRAS
Reducción y alquilación
El intervalo de concentración de proteínas para el mapeo de péptidos es aproximadamente 20 mg/ml. Si la concentración de proteína es gt;20 mg/ml, diluir la muestra con tampón de dilución a una concentración final de aproximadamente 20 mg/ml. Preparar al menos 100 μl de disolución diluida. En un tubo de centrífuga de 1,7 ml 25 añadir 100 μl de 20 mg/ml (2 mg) de disolución de CTLA4-Ig (muestra o material de referencia) a 550 μl de tampón desnaturalizante. Añadir 35 μl de reactivo reductor 200 mM, removiendo con vórtex el tubo durante 3-5 segundos, luego centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar los tubos a 37 ºC durante 20 ± 2 minutos. Añadir 38,5 μl de reactivo alquilante 400 mM a cada tubo, removiendo con vórtex durante 3-5 segundos, luego centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 ± 2 30 minutos. Poner las columnas NAP-5 en un soporte. Usar una columna por muestra. Mientras que las muestras se incuban en IAM, equilibrar las columnas NAP-5 con 7,5 ml de tampón de digestión. Desechar el efluente por procedimientos del sitio. Añadir 500 μl de las mezclas reducidas y alquiladas sobre las columnas NAP-5, permitiendo que el líquido drene a través de la columna. Desechar el efluente por procedimientos del sitio. Añadir 1,0 ml de tampón de digestión a las columnas NAP-5 y recoger el efluente en tubos de centrífuga de 1,7 ml y mezclar
35 suavemente el efluente recogido.
Digestión. Reconstituir un vial de tripsina (20 μg) para cada ml de muestra o material de referencia que va a digerirse, más un vial de tripsina adicional, con 86 μl cada uno de tampón tripsina (suministrado con la enzima) para dar 0,25 μg/μl. Reunir el contenido de los viales de tripsina juntos en un vial. Digerir cada muestra con 80 μl de la disolución de tripsina anteriormente reunida por ml de muestra a 37 ºC durante 120 ± 12 minutos. Tras completarse 40 la digestión, acidificar las muestras con 40 μl de HCl 1,0 M por ml de muestra, y remover con vórtex durante 3-5 segundos. Pipetear 100 μl de cada una de las digestiones de muestras y el material de referencia en viales de inyector automático. Preparar un control de idoneidad del sistema adicional que contiene 95 μl de digestión de material de referencia mezclada con 5 μl de patrón de péptido T6ox 30 μM y 5 μl de patrón de péptido T26desam1 30 μM dando una digestión enriquecida con 5% de T6ox y 5% de T26desam1. Poner todos los viales en el inyector
45 automático a 5 ± 5 ºC para análisis de HPLC. Guardar todas las muestras de digestión restantes a -70 ºC.
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
La siguiente tabla muestra el caudal y el gradiente de cromatografía.
Tiempo (min)
Flujo (ml/min) Fase móvil A Fase móvil B
0
0,25 100
0
4
0,25 100 0
10
0,25 92 8
(continuación)
Tiempo (min)
Flujo (ml/min) Fase móvil A Fase móvil B
72
0,25 72 28
84
0,25 60 40
92
0,25 0 100
94
0,40 0 100
95
0,40 100 0
109
0,40 100 0
110
0,25 100 0
Equilibrar la columna a 55 ºC con 100% de fase móvil A durante al menos 25 minutos antes de la primera inyección. Monitorizar la absorbancia de UV a 215 nm y 280 nm. El tubo de la columna al detector debe tener un diámetro 5 interno de ≤ 5 0,01'' con el fin de minimizar el ensanchamiento de las bandas por difusión. Mantener la temperatura de la columna a 55 ± 2 ºC. Mantener la temperatura del inyector automático a 5 ± 5 ºC. La fase móvil A se usa como inyección de blanco. Reagrupar muestras (no más de diez por vez) con inyecciones de material de referencia. La tabla más adelante muestra la secuencia de inyección para los análisis cromatográficos. Obsérvese que todos los volúmenes de inyección son de 25 μl, excepto para la muestra de control, que consiste en material de referencia
10 enriquecido con 5% de patrones de péptido T6ox y 5% de T26desam1, para los cuales se inyectan 28 μl:
Vial nº
Inyección Nombre de la muestra Volumen de iny.(μl)
1
1
Blanco (fase móvil A) 25
2
1 Material de referencia 25
3
1 Muestra 1 25
4
1 Muestra 2 25
5
1 Muestra 3 25
6
1 Material de referencia enriquecido con 5% de T6ox y 5% de T26desam 1 28
2
1 Material de referencia 25
VALORES EJEMPLARES.
Valores ejemplares. El perfil de mapa de péptidos para el material de referencia debe ser visualmente comparable al cromatograma presentado en la Figura 1 con respecto al número, tamaño relativo y orden de elución de picos 15 significativos para las trazas de 215 nm y 280 nm. Las diferencias en los tiempos de retención para los picos T4, T25 y T27 en el material de referencia inicial y de agrupamiento no debe superar ± 0,5 minutos. El número de platos teóricos (N) debe ser ≥ 100.000. Si N lt; 100.000, re-equilibrar la columna. Si el problema persiste, sustituir la columna. La resolución (R) debe ser ≥ 1,5 para los picos T2 y T12. Si R lt; 1,5, re-equilibrar la columna. Si el problema persiste, sustituir la columna. El cromatograma a 280 nm del patrón de referencia enriquecido con 5% de
20 T6ox y T6desam1 debe mostrar un aumento para el pico de T6ox que eluye a ~33,0 min, como se muestra en la Figura 85. El cromatograma a 215 nm del patrón de referencia enriquecido con 5% de T6ox y T6desam 1 debe mostrar un aumento para el pico de T26desam que eluye a ~66,5 min, como se muestra en la Figura 87.
Valores ejemplares de muestra. Los cromatogramas de la primera inyección de material de referencia y la muestra deben ser visualmente equivalentes con respecto a número, tamaño relativo y orden de elución de picos
25 significativos para las trazas de 215 nm y 280 nm como se indica para los picos marcados en la Figura 85, con la excepción de picos oxidados y/o desamidados para T6ox y T26desam que se informan por separado. Los tiempos de retención para los picos T4, T25 y T27 en la muestra debe estar dentro de ± 0,5 minutos del tiempo de retención para los picos correspondientes de la primera inyección de material de referencia.
CÁLCULOS. NOTA: Usar los datos a 215 nm para estos cálculos a menos que se especifique de otro modo. Los tiempos de retención de los picos T4 T25 y T27 (Figura 85) en las ejecuciones de material de referencia de agrupamiento no deben diferenciarse más de 0,5 min (Figura 85).
Número de platos teóricos. La eficiencia de la columna, evaluada como el número de platos teóricos (N), se calcula usando el tiempo de retención y la anchura del pico T27 a partir de la ejecución del material de referencia (Figura 85), según la siguiente ecuación:
EN LA QUE:
w = la anchura del pico en la base medida extrapolando los lados relativamente rectos a la base. 10 t = el tiempo de retención del pico T27 medido desde el momento de inyección hasta el momento de elución del máximo del pico.
Resolución. La resolución (R) entre el pico T12 y el pico T2 (Figura 85) se calcula usando la siguiente ecuación:
EN LA QUE: 15 t1, t2 = tiempos de retención del pico T12 y el pico T2, respectivamente w1, w2 = anchura del pico definida por la tangente en la base de los picos con tiempos de retención t1 y t2, respectivamente. Para todas las muestras y patrones, calcular el porcentaje de oxidación de Met85 a partir de los datos del área del pico a 280 nm del siguiente modo: 20 Porcentaje de oxidación = 100 * AT6ox/ (AT6ox + AT6) EN LA QUE: AT6 = área del pico para T6, (84-93), en la traza a 280 nm AT6ox = área del pico para T6ox, Met(O)85(4-93), en la traza a 280 nm Para todas las muestras y patrones, calcular el porcentaje de desamidación de Asn294 para los datos del área del 25 pico a 215 nm como se muestra en la Figura 87:
A
T26desam1
Porcentaje dedesamidación 5 100*
A : A : A : A : A
T26 T26desam1 T26desam2 T26desam3 T26desam4
EN LA QUE:
AT26 = área del pico para T26, (281-302), en la traza a 215 nm AT26deam1 = área del pico para T26deam1, isoAsp294(281-302), en la traza a 215 nm
30 AT26deam2 = área del pico para T26deam2, Asp299 (281-302), en la traza a 215 nm AT26deam3 = área del pico para T26deam3, Asp294(281-302), en la traza a 215 nm AT26deam4 = área del pico para T26deam4, Asu294(281-302), en la traza a 215 nm
Fragmentos teóricamente esperados de la digestión tríptica de CTLA4-Ig (se remite a las Figura 85)
Fragmento Residuo Secuencia T1 1-14 MHVAQPAVVLASSR T2 15-28 GIASFVCEYASPGK T3 29-33 ATEVR T4 34-38 VTVLR T5* 39-83
T6 84-93 AMDTGLYICK
(continuación)
Fragmento Residuo Secuencia
T7* 94-128 VELMYPPPYILGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPK
T8** 129-132 SSDK
T9** 133-158 THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK
T10 159-165 DTLMISR
T11 166-184 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK
T12 185-198 FNWYVDGVEVHNAK
T13 199-202 TKPR
T14* 203-211 EEQYNSTYR
T15 212-227 VVSVLTVLHQDWLNGK
T16 228-230 EYK
T17 231-232 CK
T18 233-236 VSNK
T19 237-244 ALPAPIEK
T20 245-248 TISK
T21 249-250 AK
T22 251-254 GQPR
T23 255-265 EPQVYTLPPSR
T24 266-270 DELTK
T25 271-280 NQVSLTCLVK
T26 281-302 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
T27 303-319 TTPPVLDSDGSFFLYSK
T28 320-324 LTVDK
T29 325-326 SR
T30 327-349 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
T31 350-356 SLSLSPG
* Contiene hidrato de carbono ligado en N. ** Contiene hidrato de carbono ligado en O.
Ejemplo 66 – Estudios en humanos sanos de dosis única
Se usó un estudio de dosis única aleatorizado en un único sitio para evaluar la farmacocinética del procedimiento de
5 CTLA4-Ig (producida por CD-CHO1) en sujetos sanos. Trece (13) sujetos que cumplieron los valores ejemplares de inclusión y exclusión se admitieron a la unidad de estudio clínico y recibieron CTLA4-Ig producida por el procedimiento de CD-CHO1 como una única infusión intravenosa de 10 mg/kg durante 30 minutos. Cada sujeto se observó en la unidad de estudio clínico durante 24 horas tras la infusión. Las muestras de sangre se recogieron en momentos de tiempo especificados después de la dosificación durante hasta 71 días para la cuantificación de
10 CTLA4-Ig. Los sujetos se evaluaron en cuanto a la farmacocinética: Cmáx, Tmáx, ABC (INF), t1/2, CLT y Vss para cada sujeto se derivaron de la concentración en suero frente a los datos de tiempo. CTLA4-Ig se suministró como una formulación de 200 mg/vial. A los sujetos sanos se les administró una infusión IV de 30 minutos de 10 mg/kg de CTLA4-Ig. Las determinaciones de PK, seguridad y determinaciones inmunogénicas se evaluaron en momentos de tiempo especificados a lo largo del día 71 después de la dosificación.
15 PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS:
Tamaño de muestra: El tamaño de muestra de 13 sujetos proporcionó el 90% de confianza de que el cálculo estimado de la relación de media geométrica estaría dentro del 15% del valor real para Cmáx, y dentro del 10% del valor real para ABC(INF) para CTLA4-Ig. Análisis estadístico: Se resumieron demografía de sujetos, exámenes físicos, datos de laboratorio y constantes vitales. La incidencia de acontecimientos adversos se tabuló por sistema
20 de cuerpo y gravedad. Para Cmáx y ABC(INF) de CTLA4-Ig, los intervalos de confianza del 90% para las relaciones de medias geométricas de población para el procedimiento CD-CHO1 se calcularon a partir de los resultados de un análisis de varianza en log(Cmáx) y log(ABC).
RESULTADOS FARMACOCINÉTICOS: Los resultados farmacocinéticos se determinaron usando un programa de análisis no compartimental validado. Los parámetros farmacocinéticos se obtuvieron de 13 sujetos dosificados con CTLA4-Ig del procedimiento de CD-CHO. La siguiente tabla enumera los parámetros farmacocinéticos para CTLA4-Ig en sujetos sanos. La siguiente tabla muestra la estadística resumen para los parámetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig.
Parámetro farmacocinético
(N = 13)
Cmáx (μg ml) Media geométrica (CV%)
284,7 (23%)
ABC(INF) (μg·h/ml) Media geométrica (CV%)
44403,0 (18%)
Tmáx (h) Mediana (mín, máx)
0,50 (0,50, 2,00)
t1/2 (días) Media (SD)
16,68 (3,24)
CLT (ml/h/kg) Media (SD)
0,23 (0,04)
Vss (l/kg) Media (SD)
0,09 (0,02)
CTLA4-Ig tuvo valores de t1/2 medios de aproximadamente 17 días en sujetos sanos, de acuerdo con semividas obtenidas en sujetos con psoriasis (10 -18 días) y pacientes con artritis reumatoide (aproximadamente 13 días). Los valores de Vss medios observados de 0,09 a 0,10 l/kg indicaron que CTLA4-Ig se confinó principalmente en el
10 sistema vascular y no se distribuyó significativamente en espacios extravasculares.
La siguiente tabla muestra las concentraciones en suero (ng/ml) por sujeto.
Ensayo en suero para CTLA4-Ig
Se analizaron muestras de suero para CTLA4-Ig por un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) en un total de 25 ejecuciones analíticas. Todos los resultados analíticos cumplieron los valores ejemplares establecidos antes del
5 análisis de muestras, indicando que el procedimiento de ELISA era preciso y exacto para la cuantificación de CTLA4-Ig en muestras de estudio. Un resumen de los parámetros de la curva patrón y datos de CC medio para CTLA4-Ig en suero se presentan en la Tabla 48. La variabilidad entre y dentro de las ejecuciones de los CC analíticos para CTLA4-Ig fue del 4,5% y el 3,5% de CV, respectivamente. Las concentraciones observadas medias de las muestras de CC analíticas se desviaron menos de ± 8,9% de los valores nominales (Tabla 48).
10 Farmacocinética de CTLA4-Ig

Tabla 48: Resumen de datos de control de calidad para el ensayo de CTLA4-Ig en suero humano
Conc. nominal
Baja (3.000 ng/ml) Media (12.500 ng/ml) Alta (24.000 ng/ml)
Conc. observada media
2,866 13,608 24,526
% de desv
-4,5 8,9 2,2
Precisión entre ejecuciones (% de CV)
4,5 2,8 3,0
Precisión dentro de las ejecuciones (% de CV)
2,4 3,5 2,9
Variación total (% de CV)
5,1 4,5 4,2
n
75 75 75
Número de ejecuciones
25 25 25
La media y las desviaciones estándar para concentraciones en suero de CTLA4-Ig para todos los sujetos por procedimiento se presentan en la tabla directamente a continuación. Las concentraciones en suero de CTLA4-Ig medias frente a perfiles de tiempo durante 71 días se presentan en la FIG. 44.
Concentración en suero media frente a datos de tiempo para CTLA4-Ig (ng/ml)
Día
h min N Media DE % de CV
.
.
0 15 0,42 0,87 207,21
.
.
15 15 135475,0 28811,82 21,27
.
.
30 15 273867,9 71406,26 26,07
.
1 0 15 253311,5 43221,58 17,06
.
2 0 15 254479,4 39611,12 15,57
.
6 0 15 219082,5 44894,29 20,49
.
12 0 15 191885,0 45180,00 23,55
1
0 0 15 161732,2 28740,25 17,77
3
0 0 15 101411,4 18615,59 18,36
Día
h min N Media DE % de CV
7
0 0 15 59375,96 13598,10 22,90
14
0 0 15 33676,97 8148,64 24,20
21
0 0 15 21909,72 5226,77 23,86
28
0 0 15 17193,52 5145,61 29,93
42
0 0 15 8828,95 3246,22 36,77
56
0 0 15 5244,51 2621,36 49,98
70
0 0 15 2970,32 1811,64 60,99
Estadística resumen para los parámetros farmacocinéticos (Cmáx, ABC (INF), CLT, Vss, Tmáx y t1/2) se presentan en la Tabla 50. Los resultados indicaron que CTLA4-Ig producida a partir de un procedimiento descrito en el presente documento tuvo un valor de t1/2 medio de aproximadamente 17 días (intervalo de 7-25 días). Los valores de Vss observados de 0,09 a 0,10 l/kg indicaron que CTLA4-Ig se confinó principalmente al volumen del fluido extracelular.
Tabla 50: Estadística resumen para parámetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig producida mediante el procedimiento descrito en el presente documento
Formulación
Cmáx (μg/ml) Media geométrica (%de CV) ABC(INF) (μg·h/ml) Mediageométrica (% deCV) Eliminación (ml/h/kg) media(DE) Vss (l/kg) media (DE) Tmáx (h) mediana (mín, máx) t1/2 (días)media (DE)
Procedimiento (n = 13)
284,71 (23%) 44403,04 (18%) 0,23 (0,04) 0,09 (0,02) 0,50 (0,50, 2,00) 16,68 (3,24)
Los resultados indicaron que la t1/2 media para CTLA4-Ig producida por el procedimiento descrito en el presente 10 documento fue aproximadamente 17 días. Tanto los valores de eliminación como de volumen de distribución también se presentan en la Tabla 50.
La farmacocinética de CTLA4-Ig en sujetos adultos sanos después de una única infusión intravenosa de 10 mg/kg y en pacientes con AR después de múltiples infusiones intravenosas de 10 mg/kg se explica en la Tabla 47.
Tabla 47. Parámetros farmacocinéticos (media, intervalo) en sujetos sanos y pacientes con AR después de 15 infusión (infusiones) intravenosa(s) de 10 mg/kg
Parámetro PK
Sujetos sanos (después de dosis única de 10 mg/kg) n=13 Pacientes con AR (después de múltiples dosis de 10 mg/kg1) n=14
Concentración pico (Cmáx) [mcg/ml]
292 (175-427) 295 (171-398)
Semivida terminal (t1/2) [días]
16,7 (12-23) 13,1 (8-25)
Eliminación sistémica (CL) [ml/h/kg]
0,23 (0,16-0,30) 0,22 (0,13-0,47)
Volumen de distribución (Vss) [l/kg]
0,09 (0,06-0,13) 0,07 (0,02-0,13)
1 Se administraron múltiples infusiones intravenosas en los días 1, 15, 30, y mensualmente después.
Los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 anteriores se refieren en particular a la proteína CTLA4-Ig que tiene SEC ID Nº: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 18, y los Ejemplos 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
5 52, 53, 54, 55, 56, 57 anteriores se refieren en particular a la proteína CTLA4-Ig que tiene SEC ID Nº: 4, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Como se describe en la presente memoria descriptiva, los procedimientos que se refieren a, y usos de, estas proteínas en los Ejemplos son ilustrativos de los procedimientos de la invención.
Las composiciones ejemplares y no limitantes que comprenden las moléculas de CTLA4-Ig descritas en el presente documento incluyen dichas composiciones en las que:
10 (1) las moléculas de CTLA4-Ig comprenden una cualquiera o más de SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 18 y las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área menor que o igual a aproximadamente 5,0 de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig (o tetrámeros de CTLA4-Ig), determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica (un procedimiento de medición indicado en el Ejemplo 10). Más particularmente, dichas composiciones adicionalmente tienen una o más de las siguientes características:
15 no superar una cantidad máxima de endotoxina bacteriana de 0,35 UE/mg o de 76,8 UE/ml en las moléculas de CTLA4-Ig (pudiendo no tener endotoxina bacteriana); en el Ejemplo 48 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una carga biológica máxima de 1 UFC/10 ml o 1 UFC/ml (pudiendo no tener de carga biológica); en el Ejemplo 49 se indica un procedimiento para medir esta característica;
proporcionar (como moléculas de CTLA4-Ig o como dicha composición) (a) aproximadamente de 10 a 22 bandas con un intervalo de pl de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,6, intensidad de bandas acumulativa del 90%110% a un intervalo de pl de aproximadamente 4,3 a aproximadamente 5,3, y aproximadamente 3 bandas principales a un intervalo de pl de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,2 o (b) isoformas de CTLA4-Ig dominantes que tienen un pl que es menor que o igual a 5,1, y al menos el 90% de las moléculas de CTLA4-Ig presentan un pl menor que o igual a aproximadamente 5,3; en el Ejemplo 50 se indica un procedimiento para medir esta característica;
un porcentaje de área menor que o igual a 3,5 de las moléculas de CTLA4-Ig son especies oxidadas de las mismas, y un porcentaje de área menor que o igual a 2,5 de las moléculas de CTLA4-Ig son especies desaminadas de las mismas; en el Ejemplo 47 se indican procedimientos para medir estas características;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área mayor que o igual a 95,0 de dímeros de CTLA4-Ig, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; en el Ejemplo 10 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área menor que 5,0 de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig (o tetrámeros de CTLA4-Ig) determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; en el Ejemplo 10 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área menor que o igual a 0,5 de especies de bajo peso molecular (o monómeros de CTLA4-Ig) determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica, o un porcentaje de área menor que 0,5 de especies de bajo peso molecular (o monómeros de CTLA4-Ig) determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; en el Ejemplo 10 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de ADN de 2,5 picogramos/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o de 2,5 picogramos/mg de dímero de CTLA4-Ig (pudiendo no tener ADN); en el Ejemplo 58 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de MCP-1 de 3,0 ng/mg total en las moléculas de CTLA4-Ig, de 5 ppm, o de 5 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig (pudiendo no tener MCP-1); en el Ejemplo 59 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de proteínas de célula huésped (conocida también como proteína celular) de 25 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig o 50 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig (pudiendo no tener proteína celular huésped o proteína celular); en el Ejemplo 60 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad de máxima de Tritón X-100 de 1,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig (pudiendo no tener Tritón-X); en el Ejemplo 61 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de Proteína A de 5,0 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig (pudiendo no tener Proteína A); en el Ejemplo 62 se indica un procedimiento para medir esta características;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig) expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 15 a aproximadamente 35; en el Ejemplo 63 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de moléculas de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 3,6; en el Ejemplo 63 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 17; en el Ejemplo 64 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de roteína, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,3; en el Ejemplo 64 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 22; en el Ejemplo 64 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, mayor que o igual a 8,0, tal como de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 12,0; en el Ejemplo 16 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, mayor que o igual a 8,0, tal como de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 12,0; en el Ejemplo 16 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen glucosilación ligada a N de tal manera que el Domino I presenta un porcentaje de área de aproximadamente 24,5% a aproximadamente 35.2%, o el Domino II presenta un porcentaje de área de aproximadamente 26,3% a aproximadamente 34,1%, o el Dominio III presenta un porcentaje de área de aproximadamente 21,9% a aproximadamente 31,5%, o el Dominio IV y el Dominio V presentan un porcentaje de área de aproximadamente 7,9% a aproximadamente 18,6%; en el Ejemplo 44 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de NGNA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, mayor que o igual a 1,5; en el Ejemplo 16 se indica un procedimiento para medir esta característica.
Dichas composiciones pueden estar presentes en forma aislada o sustancialmente purificada. Dichas composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas o composiciones farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones pueden tener cualquier permutación o combinación de estas características:
(2) las moléculas de CTLA4-Ig comprenden una cualquiera o más de SEC ID Nº: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 24 (por ejemplo CTLA4A29YL104E-Ig), las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área menor que o igual a 5,0 de especies de alto peso molecular de CTLA4-Ig (o tetrámeros de CTLA4-Ig), determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica (en el Ejemplo 25 se indica un procedimiento para medir esto). Más particularmente dichas composiciones tienen adicionalmente una o más de las siguientes características;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área mayor que o igual a 95,0 de dímeros de CTLA4-Ig determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; en el Ejemplo 25 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen un porcentaje de área menor que o igual a 1,0 de especies de bajo peso molecular de CTLA4-Ig (o monómeros de CTLA4-Ig) determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica; en el Ejemplo 25 se indica un procedimiento para medir esta característica;
proporcionar (como moléculas de CTLA4-Ig o como dicha composición) aproximadamente 8-15 bandas con un intervalo de pl de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,6, y una intensidad de bandas acumulativa de 95%105% a un intervalo de pl de 4,5 a 5,6; en el Ejemplo 22 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de ADN de aproximadamente 2,5 pg/mg en las moléculas de CTLA4-Ig; en el Ejemplo 55 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de Proteína A de 50 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig; en el Ejemplo 53 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de MCP-1 de 5 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig; en el Ejemplo 54 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de proteína de célula huésped (conocida también como proteína celular) de 50 ng/mg en las moléculas de CTLA4-Ig; en el Ejemplo 52 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad máxima de endotoxina bacteriana de 0,42 UE/mg en las moléculas de CTLA4-Ig; en el Ejemplo 48 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una carga biológica máxima de 1 UFC/ml; en el Ejemplo 49 se indica un procedimiento para medir esta característica;
no superar una cantidad de máxima de Tritón X-100 de 2 ppm; en el Ejemplo 57 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, mayor que o igual a 5,0, tal como de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0 o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0; en el Ejemplo 39 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, mayor que o igual a 5,0, tal como de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0 o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0; en el Ejemplo 39 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de GalNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 4,0; en el Ejemplo 36 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de GlcNAc con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 14 a aproximadamente 35; en el Ejemplo 36 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de galactosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 14; en el Ejemplo 35 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de fucosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 1,7 a aproximadamente 9,3; en el Ejemplo 35 se indica un procedimiento para medir esta característica;
las moléculas de CTLA4-Ig tienen una proporción molar media de manosa con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig (o con respecto a los dímeros de CTLA4-Ig), expresada como moles/mol de proteína, de aproximadamente 9 a aproximadamente 18; en el Ejemplo 35 se indica un procedimiento para medir esta característica;
La invención proporciona dichas composiciones en forma aislada o sustancialmente purificada. Las proteínas y composiciones tienen cualquier permutación o combinación de estas características.
Los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 anteriores pertenecen en particular a la proteína de CTLA4-Ig de
(1) anterior, no obstante, como se describa en esta memoria descriptiva, los procedimientos que se refieren a, y usos de, dichas proteínas en estos Ejemplos son ilustrativos los de procedimientos de la invención.
Los Ejemplos 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57 anteriores pertenecen en particular a la proteína de CTLA4-Ig de (2) anterior, no obstante, como se describe en esta memoria descriptiva, los procedimientos que se refieren a, y usos de, dichas proteínas en estos Ejemplos son ilustrativos de los procedimientos de la invención.
LISTADO DE SECUENCIAS
lt;110gt; Bristol-Myers Squibb company
lt;120gt; COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCIÓN DE UNA COMPOSICIÓN
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lt;151gt;
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5
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10
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5 lt;400gt; 3
ESTA SECUENCIA SE DEJA INTENCIONADAMENTE EN BLANCO
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15 lt;210gt; 19
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lt;223gt; Oligonucleótido sintético
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20
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25
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lt;220gt; lt;221gt; MOD_ RES lt;222gt; (14) .. (14) lt;223gt; iso-Asp
45
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lt;223gt; Etiqueta sintética de His 6x
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lt;223gt; Péptido tríptico
lt;400gt; 77

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de obtención de una composición que comprende una población de moléculas de CTLA4-Ig aislada de un medio de cultivo líquido, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTLA4-Ig, en el que (1) las moléculas de CTLA4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido siálico, (2) el número de restos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varia en la población inicial, (3) la población inicial comprende dímeros y agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP-1, comprendiendo el procedimiento:
    (i)
    recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTLA4-Ig;
    (ii)
    separar las moléculas de CTLA4-Ig de los componentes celulares;
    (iii) utilizar la cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición;
    (iv)
    utilizar la cromatografía en columna para separar los dímeros de CTLA4-Ig de los agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig; y
    (v)
    utilizar la cromatografía en columna para separar las moléculas de CTLA4-Ig en dos o más fracciones, en el que al menos una fracción tiene una proporción molar más grande de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig en comparación con al menos la otra fracción;
    (vi)
    en las que las etapas (ii), (iii), (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dicha composición.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig mayor que, o igual a, 8,0.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por un porcentaje de área menor que, o igual a, 2,5 de especies de CTLA4-Ig de alto peso molecular, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición comprende una cantidad de MCP-1 menor que,
    o igual a, 3 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig mayor que, o igual a, 5,0.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por un porcentaje de área menor que, o igual a, 4,0 de especies de CTLA4-Ig de alto peso molecular, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición no comprende más de 5 ppm de MCP-1.
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