KR20160145789A

KR20160145789A - 초기 ra를 갖는 대상체에서의 무약물 완화를 달성하기 위한 ctla4 화합물의 용도

Info

Publication number: KR20160145789A
Application number: KR1020167032495A
Authority: KR
Inventors: 체탄 카리에카르
Original assignee: 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-12-20
Also published as: US20170042972A1; AU2015249656A1; WO2015164595A1; CN106456712A; EA201692126A1; SG11201608848XA; BR112016023450A2; CA2947217A1; US20200069772A1; MX2016013611A; IL248421A0; JP2017513903A; EP3134109A1

Abstract

본 발명은 무약물 완화의 달성을 필요로 하는 초기 RA를 갖는 대상체에게 류마티스 관절염에 대한 질환 활성 점수 계산표 (DAS)-규정 완화가 달성될 때까지 유효량의 가용성 CTLA4 분자를 투여한 다음 RA 요법을 철회함으로써 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

초기 RA를 갖는 대상체에서의 무약물 완화를 달성하기 위한 CTLA4 화합물의 용도 {USE OF CTLA4 COMPOUND FOR ACHIEVING DRUG-FREE REMISSION IN SUBJECTS WITH EARLY RA}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2014년 4월 25일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/984,287을 우선권 주장하며; 상기 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 류마티스 관절염 (RA), 예를 들어 초기 류마티스 관절염 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 무약물 완화의 달성을 필요로 하는 초기 RA를 갖는 대상체에게 류마티스 관절염에 대한 질환 활성 점수 계산표 (DAS)-규정 완화가 달성될 때까지 유효량의 가용성 CTLA4 분자를 투여한 다음 RA 요법을 철회함으로써 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

류마티스 관절염 (RA)은 전세계 인구의 대략 1%에서 이환되는 가장 흔한 염증성 관절염이다 (Wolfe, F., "The epidemiology of drug treatment failure in rheumatoid arthritis", Baillieres Clin. Rheumatol., 9(4):619-632 (Nov. 1995)). 여성이 남성과 비교하여 질환이 발생할 가능성이 2-3배 더 많고, 생애의 40대 내지 60대에 발생률이 최고이다 (Hochberg, M.C. et al., "Epidemiology of rheumatoid arthritis: update", Epidemiol. Rev., 12:247-252 (1990); Markenson, J.A., "Worldwide trends in the socioeconomic impact and long-term prognosis of rheumatoid arthritis", Semin. Arthritis Rheum., 21(2 Suppl. 1):4-12 (Oct. 1991); Spector, T.D., "Rheumatoid arthritis", Rheum. Dis. Clin. North Am., 16(3):513-537 (Aug. 1990); 및 Zvaifler, N.J., "Etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis", in Arthritis and Allied Conditions, pp. 723-736, McCarty, D.J. et al., eds., Lea & Febiger, Philadelphia (1993)). RA는 활막 관절에 이환되는 중증 염증 때문에 임상적으로 인식되지만, 또한 빈번한 관절외 징후가 있는 전신 질환이다. RA의 자연 병력은 불행하게도 관절 파괴, 신체 기능 손상 및 건강 관련 삶의 질의 불량함을 특징으로 한다.

관절 파괴가 RA에서 초기에 발생한다는 과학적 증거가 증가하고 있다. 대상체 중 90% 초과에서 RA 진단 후 2년 이내에 통상적인 방사선촬영에 의해 관절 손상의 증거가 나타난다 (Emery, P., "The Optimal Management of Early Rheumatoid Disease: The Key to Preventing Disability", Br. J. Rheum., 33:765-768 (1994)). 관절 손상은 보다 감도가 높은 기술, 예컨대 MRI 또는 초음파를 사용하여 증상 발병의 수주 이내에 검출될 수 있다 (McGonagle, D. et al., "The relationship between synovitis and bone changes in early untreated rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum.,42:1706-1711 (1999) 및 Wakefield, R.J. et al., "The value of sonography in the detection of bone erosion in patients with rheumatoid arthritis: A comparative study with conventional radiography", Arthritis Rheum., 43:2761-2770 (2000)). 이들 발견은 RA에서 초기에 골 및 연골 상실을 야기하는 염증 과정을 효과적으로 억제할 수 있는 요법에 대한 필요성을 생성 및 증가시켰고, RA의 보다 이른 진단 및 치료를 점점 더 강조하였다.

정상 활막은 관절 공간을 둘러싸고 분리시키는 조직이다. 대식세포-유사 및 섬유모세포-유사 활막세포로 구성된 세포의 내층이 희소 수의 수지상 세포, 섬유모세포, 비만 세포 및 혈관 구조를 함유하는 얇은 결합 조직 기질을 덮고 있다 (Konttinen, Y.T. et al., "Characterization of the immunocompetent cells of rheumatoid synovium from tissue sections and eluates", Arthritis Rheum., 24(1):71-79 (Jan. 1981)).

RA에서, 활막 조직은 현저하게 비후되고 팽윤된다. 질환이 진행함에 따라, 활막세포가 점차 증식하고 동원될 뿐만 아니라 활막 내로 염증 세포가 동원된다 (Konttinen, Y.T. et al., "Characterization of the immunocompetent cells of rheumatoid synovium from tissue sections and eluates", Arthritis Rheum., 24(1):71-79 (Jan. 1981)). 활막 내 침윤 백혈구 중 최대 50%는 T-림프구, 주로 활성화/기억 표현형을 갖는 CD4+ T 세포이다 (Konttinen, Y.T. et al., "Characterization of the immunocompetent cells of rheumatoid synovium from tissue sections and eluates", Arthritis Rheum., 24(1):71-79 (Jan. 1981); Forre, O. et al., "Augmented numbers of HLA-DR-positive T lymphocytes in the synovial fluid and synovial tissue of subjects with rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis: in vivo-activated T lymphocytes are potent stimulators in the mixed lymphocyte reaction", Scand. J. Immunol., 15(2):227-231 (Feb. 1982); Van-Boxel, J.A. et al., "Predominantly T-cell infiltrate in rheumatoid synovial membranes", N. Engl. J. Med., 293(11):517-520 (Sept. 1975); Kidd, B.L. et al., "Immunohistological features of synovitis in ankylosing spondylitis: a comparison with rheumatoid arthritis", Ann. Rheum. Dis., 48(2):92-98 (Feb. 1989); Cush, J.J. et al., "Phenotypic analysis of synovial tissue and peripheral blood lymphocytes isolated from subjects with rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 31(10):230-238 (Oct. 1988); Laffon, A. et al., "Upregulated expression and function of VLA-4 fibronectin receptors on human activated T cells in rheumatoid arthritis", J. Clin. Invest., 88(2):546-552 (Aug. 1991); 및 Klareskog, L. et al., "Relationship between HLA DR expressing cells and T lymphocytes of different subsets in rheumatoid synovial tissue", Scand. J. Immunol., 15(5):501-507 (May 1981)). 단핵구/대식세포 기원의 세포가 또한 류마티스 활막에서 현저해지며, 세포의 최대 20%를 구성하고, 또한 활성화된 표현형을 나타낸다 (Firestein, G.S. et al., "How important are T cells in chronic rheumatoid synovitis?", Arthritis Rheum., 33(6):768-773 (Jun. 1990) 및 Firestein, G.S. et al., "Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid", J. Immunol., 144(9):3347-3353 (May 1, 1990)). 류마티스 활막 내 단핵구/대식세포-유사 세포는 다수의 염증유발 분자, 예를 들어 시토카인 IL-1, TNF-α, IL-6, GM-CSF, 뿐만 아니라 단백질분해 효소, 예를 들어 콜라게나제 및 매트릭스 메탈로프로테이나제를 생산한다. B-세포, 형질 세포 및 호중구는 류마티스 활막 내 세포의 5% 미만을 구성하지만, 호중구는 활액 내에서 현저하다 (Konttinen, Y.T. et al., "Characterization of the immunocompetent cells of rheumatoid synovium from tissue sections and eluates", Arthritis Rheum., 24(1):71-79 (Jan. 1981); Forre, O. et al., "Augmented numbers of HLA-DR-positive T lymphocytes in the synovial fluid and synovial tissue of subjects with rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis: in vivo-activated T lymphocytes are potent stimulators in the mixed lymphocyte reaction", Scand. J. Immunol., 15(2):227-231 (Feb. 1982); 및 Firestein, G.S. et al., "Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid", J. Immunol., 144(9):3347-3353 (May 1, 1990)).

활막 증식 및 염증이 진전됨에 따라, 혈관 염증성 활막 조직의 팽창성 덩어리는 판누스로 칭해진다. 판누스는 관절 연골 침습 및 골 파괴를 초래한다. 활성화된 T 세포의 산물이 판누스의 형성 및 팽창 배후의 유도 인자인 것으로 보인다 (Zvaifler, N.J. et al., "Alternative models of joint destruction in rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 37(6):783-789 (Jun. 1994)).

류마티스 활막 내 단핵구/대식세포-유사 세포 및 수지상 세포는 부류 II MHC뿐만 아니라 공동자극 분자, 예컨대 CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2)를 모두 발현하고, 아마도 항원 제시 세포로서 기능한다 (Balsa, A. et al., "Differential expression of the costimulatory molecules B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) in rheumatoid synovial tissue", Br. J. Rheumatol., 35(1):33-37 (Jan. 1996); Liu, M.F. et al., "The presence of costimulatory molecules CD86 and CD28 in rheumatoid arthritis synovium", Arthritis Rheum., 39(1):110-114 (Jan. 1996); Ranheim, E.A. et al., "Elevated expression of CD80 (B7/BB1) and other accessory molecules on synovial fluid mononuclear cell subsets in rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 37(11):1637-1646 (Nov. 1994); Sfikakis, P.P. et al., "Expression of CD28, CTLA4, CD80, and CD86 molecules in subjects with autoimmune rheumatic diseases: implications for immunotherapy", Clin. Immunol. Immunopathol., 83(3):195-198 (Jun. 1997); 및 Thomas, R. et al., "Functional differentiation of dendritic cells in rheumatoid arthritis: role of CD86 in the synovium", J. Immunol., 156(8):3074-3086 (Apr. 15, 1996)). CD28을 발현하는 활성화된 CD4+ T 세포는 류마티스 활막 내 현저한 침윤 세포 유형이고, 통상적으로 부류 II MHC 및 공동자극 분자를 발현하는 세포에 인접하게 발견된다. 이는 활막 염증의 발병기전에서 T 세포 활성화/공동자극에 대한 중요한 역할을 시사한다. 이는 활성화된 T 세포가 활막세포 및 파골세포와의 세포 대 세포 접촉을 통해 또는 분비된 시토카인의 작용에 의해 RA에서 활막염 및 골 파괴를 유도하는데 중요한 인자라는 실험 관찰과 일치한다. 종합해보면, 이들 관찰은 활성화된 T 세포 및 CD28을 통해 전달된 공동자극 신호가 RA의 면역병리상태를 유도하는데 핵심 역할을 한다는 것을 시사한다.

초기 RA에서 엄격하게 제어되는 경우에 질환의 과정을 변경시키는 "기회의 창"이 존재할 수 있으며, 이는 염증 과정이 보다 잘 확립되어 있으면 감소한다 (Cush, J.J., "Early rheumatoid arthritis - is there a window of opportunity?", J. Rheumatol. (Suppl.), 80:1-7 (2007)). 이는 초기 RA에서 단계적 증대 요법에 대한 생물학적 질환-조절 항류마티스 약물 (DMARD) 및 통상적인 합성 (cs)DMARD의 조합의 사용에 대한 결정을 보조할 수 있다 (Singh, J.A. et al., "2012 update of the 2008 American College of Rheumatology recommendations for the use of disease-modifying antirheumatic drugs and biologic agents in the treatment of rheumatoid arthritis", Arthritis Care Res. (Hoboken), 64:625-639 (2012)). RA가 잘 제어된다면, 면역조절 의약의 철회 후에 완화를 지속하는 능력은 질환 조절의 지표일 것이다.

RA 요법의 철회 또는 점감 후 완화는 초기 RA에서 중요한 목표이다. 이전 연구는 수많은 생물학적 작용제에 의한 다양한 치료 철회 패러다임을 조사하였지만, 모든 RA 치료의 급속한 철회 후 지속적 완화를 입증하지는 못했다 (Huizinga, T. et al., "Clinical and radiographic outcomes at two years and the effect of tocilizumab discontinuation following sustained remission in the second year of the ACT-RAY study", Ann. Rheum. Dis., 72(Suppl 3):63 (2013); Quinn, M.A. et al., "Very early treatment with infliximab in addition to methotrexate in early, poor-prognosis rheumatoid arthritis reduces magnetic resonance imaging evidence of synovitis and damage, with sustained benefit after infliximab withdrawal", Arthritis Rheum., 52:27-35 (2005); van den Broek, M. et al., "Discontinuation of infliximab and potential predictors of persistent low disease activity in patients with early rheumatoid arthritis and disease activity score-steered therapy", Ann. Rheum. Dis., 70:1389-1394 (2011); Villeneuve, E. et al., "Preliminary results of a multicentre randomized controlled trial of etanercept and methotrexate to induce remission in patients with newly diagnosed inflammatory arthritis", Arthritis Rheum., 63:S960-S961 (2011)). 대부분의 항종양 괴사 인자 철회 연구는 MTX를 유지하였거나 또는 생물제제를 절반 용량으로 유지하였다 (Detert, J. et al., "Induction therapy with adalimumab plus methotrexate for 24 weeks followed by methotrexate monotherapy up to week 48 versus methotrexate therapy alone for DMARD-naive patients with early rheumatoid arthritis", Ann. Rheum. Dis., 72:844-850 (2013); Emery, P. et al., "Assessing maintenance of remission after withdrawal of etanercept plus methotrexate, methotrexate alone, or placebo in early rheumatoid arthritis patients who achieved remission with etanercept and methotrexate", Arthritis Rheum., 65(Suppl 10):2689 (2013); Nam, J.L. et al., "Remission induction comparing infliximab and high-dose intravenous steroid, followed by treat-to-target: a double-blind, randomized, controlled trial in new-onset, treatment-naive, rheumatoid arthritis", Ann. Rheum. Dis., 73:75-85 (2014); Nishimoto, N. et al., "Drug free REmission/low disease activity after cessation of tocilizumab (Actemra) Monotherapy (DREAM) study", Mod. Rheumatol., 24:17-25 (2014); Smolen, J.S. et al., "Maintenance, reduction, or withdrawal of etanercept after treatment with etanercept and methotrexate in patients with moderate rheumatoid arthritis", Lancet, 381:918-929 (2013); Smolen, J.S. et al., "Adjustment of therapy in rheumatoid arthritis on the basis of achievement of stable low disease activity with adalimumab plus methotrexate or methotrexate alone", Lancet, 383:321-332 (2014)).

모든 요법을 철회하고 완전한 무약물 완화를 유지하는 접근법은 환자를 위한 이상적인 치료 이익이다. 추가로, 의사는, 특히 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 환자가 장래에 확인될 수 있는 경우에, 초기 RA를 갖는 환자를 치료하는 경제적 부담을 정당화시킬 수 있다.

본 발명은 무약물 완화의 달성을 필요로 하는 초기 RA를 갖는 대상체에게 유효량의 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하여 DAS-규정 완화를 달성한 다음 RA 요법을 철회하는 것을 포함하는, 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 무약물 완화의 달성을 필요로 하는 초기 RA를 갖는 대상체에게 유효량의 CTLA4Ig 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하여 DAS-규정 완화를 달성한 다음 RA 요법을 철회하는 것을 포함하는, 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서 DAS-규정 완화는 12개월의 치료 후에 DAS28 (C-반응성 단백질[CRP])이 2.6 미만인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 CTLA4 제약 조성물은 125 mg/주로 피하로 투여되는 피하 제제이다.

본 발명은 또한 지속적 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 지속적 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 초기 RA를 갖는 대상체는 ≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절의 활성 임상 활막염, DAS28 (CRP) ≥ 3.2 및 항-시트룰린화 펩티드 (CCP)-2 항체 양성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 또한 무약물 완화 상태의 초기 RA를 갖는 대상체에서 손목 및 손의 미란, 골염 및/또는 활막염 점수화에 의해 평가된 바와 같은 구조적 손상을 억제하는데 사용될 수 있다.

도 1은 CTLA4-Ig 분자에 대한 발현 카세트의 일부분의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)을 제시한다. 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (서열식별번호: 2)을 또한 제시한다. 상기 발현 카세트로부터 생산될 수 있는 CTLA4-Ig 분자는 다음 잔기의 아미노산 서열을 갖는 분자를 포함한다: (i) 서열식별번호: 2의 26-383, (ii) 서열식별번호: 2의 26-382, (iii) 서열식별번호: 2의 27-383, 또는 (iv) 서열식별번호: 2의 26-382, 또는 임의로 (v) 서열식별번호: 2의 25-382, 또는 (vi) 서열식별번호: 2의 25-383. 발현 카세트는 하기 영역을 포함한다: (a) 온코스타틴(Oncostatin) M 신호 서열 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 11-88; 서열식별번호: 2의 아미노산 1-26); (b) 인간 CTLA4의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 89-463; 서열식별번호: 2의 아미노산 27-151); (c) 인간 IgG1 불변 영역의 변형된 부분 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 464-1159; 서열식별번호: 2의 아미노산 152-383), 예를 들어 변형된 힌지 영역 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열식별번호: 2의 아미노산 152-166), 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 509-838; 서열식별번호: 2의 아미노산 167-276), 및 인간 IgG1 CH3 도메인 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 839-1159; 서열식별번호: 2의 아미노산 277-383).
도 2는 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구의 연구 설계를 제시한다. CRP = C-반응성 단백질; DAS = 질환 활성 점수; MRI = 자기 공명 영상화; MTX = 메토트렉세이트; RA = 류마티스 관절염.
도 3은 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구에서 이용된 환자 배치 흐름도를 제시한다. MTX = 메토트렉세이트.
도 4A-D는 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구에서 시간 경과에 따른 효능 결과를 제시한다. 4A는 질환 활성 점수 (DAS)-규정 완화 (DAS28 [C-반응성 단백질, CRP] < 2.6)를 갖는 환자의 비율을 제시한다. 4B는 단순 질환 활성 지수 완화 (≤ 3.3)를 갖는 환자의 비율을 제시한다. 4C는 불린(Boolean) 완화 (압통 관절수 ≤ 1, 종창 관절수 ≤ 1, 질환 활성에 대한 환자의 전반적 평가 ≤ 1 [0-10 척도], 높은 감수성 CRP ≤ 1 mg/dL)를 갖는 환자의 비율을 제시한다. 4D는 주요 임상 반응 (임의의 기간에서 그 시점 전의 최소 연속 6개월 동안의 ACR 70 반응)을 제시한다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 완화 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 완화 사이에 발생한 경우에 완화로서 귀속시켰다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 ACR 반응 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 ACR 반응 사이에 발생한 경우에 ACR 반응으로서 귀속시켰다. ACR = 미국 류마티스학 학회, CRP = C-반응성 단백질, DAS = 질환 활성 점수, MTX = 메토트렉세이트, SDAI = 단순 질환 활성 지수.
도 5A-E는 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구에서 시간 경과에 따른 추가의 효능 결과를 제시한다. 5A는 임상 질환 활성 지수 완화 (≤ 2.8)를 갖는 환자의 비율을 제시한다. 5B는 미국 류마티스 학회 (ACR) 20을 갖는 환자의 비율을 제시한다. 5C는 ACR 50을 갖는 환자의 비율을 제시한다. 5D는 ACR 70을 갖는 환자의 비율을 제시한다. 5E는 ACR 90을 갖는 환자의 비율을 제시한다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 완화 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 완화 사이에 발생한 경우에 완화로서 귀속시켰다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 ACR 반응 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 ACR 반응 사이에 발생한 경우에 ACR 반응으로서 귀속시켰다. ACR = 미국 류마티스학 학회; CDAI = 임상 질환 활성 지수; MTX = 메토트렉세이트.
도 6은 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구의 철회 기간 동안 질환 활성 점수 (DAS)-규정 완화 (DAS28 [C-반응성 단백질; CRP] < 2.6) 상태의 환자의 비율을 제시한다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 완화 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 완화 사이에 발생한 경우에 완화로서 귀속시켰다.
도 7A-C는 실시예 III에 기재된 AVERT 임상 연구에서 대상체의 자기 공명 영상화를 통한 진행을 제시한다. 7A는 총 활막염 점수에서 기준선으로부터의 보정된 평균 변화를 제시한다. 7B는 총 골염 점수에서 기준선으로부터의 보정된 평균 변화를 제시한다. 7C는 총 미란 점수에서 기준선으로부터의 보정된 평균 변화를 제시한다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. MTX = 메토트렉세이트.

본원에서 이용되는 경우에:

용어 "CTLA4-Ig 분자" 또는 "CTLA4Ig 분자"는 CTLA4 세포외 도메인 또는 그의 부분 및 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분을 갖는 폴리펩티드를 적어도 포함하는 단백질 분자를 지칭한다. 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역은 야생형, 또는 돌연변이체 또는 변형된 것, 및 포유동물, 예를 들어 인간 또는 마우스의 것일 수 있다. 폴리펩티드는 추가의 단백질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 또한 다량체 형태의 폴리펩티드, 예컨대 이량체, 사량체 및 육량체를 지칭할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 또한 CD80 및/또는 CD86에 결합할 수 있다.

용어 "B7-1"은 CD80을 지칭하고; 용어 "B7-2"는 CD86을 지칭하고; 용어 "B7"은 B7-1 및 B7-2 둘 다 (CD80 및 CD86)를 지칭한다. 용어 "B7-1-Ig" 또는 "B7-1Ig"는 CD80-Ig를 지칭하고; 용어 "B7-2-Ig" 또는 "B7-2Ig"는 CD86-Ig를 지칭한다.

한 실시양태에서, "CTLA4Ig" 또는 "아바타셉트"는 다음 잔기의 아미노산 서열을 갖는 단백질 분자를 지칭한다: (i) 서열식별번호: 2의 26-383, (ii) 서열식별번호: 2의 26-382; (iii) 서열식별번호: 2의 27-383, 또는 (iv) 서열식별번호: 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열식별번호: 2의 25-382, 또는 (vi) 서열식별번호: 2의 25-383. 단량체 형태에서 이들 단백질은 "서열식별번호: 2 단량체" 또는 "서열식별번호: 2 서열을 갖는" 단량체로 본원에서 지칭될 수 있다. 이들 서열식별번호: 2 단량체는 이량체화될 수 있으며, 이에 따라 이량체 조합은, 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: (i) 및 (i); (i) 및 (ii); (i) 및 (iii); (i) 및 (iv); (i) 및 (v); (i) 및 (vi); (ii) 및 (ii); (ii) 및 (iii); (ii) 및 (iv); (ii) 및 (v); (ii) 및 (vi); (iii) 및 (iii); (iii) 및 (iv); (iii) 및 (v); (iii) 및 (vi); (iv) 및 (iv); (iv) 및 (v); (iv) 및 (vi); (v) 및 (v); (v) 및 (vi); 및 (vi) 및 (vi). 이들 상이한 이량체 조합은 또한 서로 회합되어 사량체 CTLA4Ig 분자를 형성할 수 있다. 이들 단량체, 이량체, 사량체 및 다른 다량체는 "서열식별번호: 2 단백질" 또는 "서열식별번호: 2 서열을 갖는" 단백질로 본원에서 지칭될 수 있다. (서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 CTLA4Ig를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약의 규정 하에서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC); 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러바드 10801)에 1991년 5월 31일에 기탁되었고, ATCC 수탁번호 ATCC 68629를 부여받았으며; 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 CTLA4Ig를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주는 1991년 5월 31일에 ATCC 식별 번호 CRL-10762로 기탁되었다).

"약물 물질"은 최종 약물 제품의 제제화에 이용된 출발 물질을 지칭한다. 전형적인 CTLA4Ig 약물 물질 조성물은 20 mg/ml 내지 60 mg/ml의 단백질 농도, 6 내지 8의 pH 및 < 5%의 %HMW 종을 포함한다.

"제제화된 벌크 용액"은 용기에 충전하기 전의 최종 제제, 예컨대 동결건조를 위해 바이알에 충전하기 전의 제제화된 용액, 또는 SC 주사를 위해 시린지에 충전하기 전의 제제화된 용액을 지칭한다.

"약물 제품"은 동결건조된 약물 제품에서와 같이 사용 전에 재구성되거나; 액체 약물 제품에서와 같이 사용 전에 추가로 희석되거나; SC 용액 약물 제품에서와 같이 그대로 이용될 수 있는 용기 내에 포장된 최종 제제를 지칭한다.

"건강 설문지 평가 (HAQ)"는 환자를 질환 활성의 증상에 대해 평가하기 위해 사용된 질문의 세트를 지칭한다. 이들 증상은 의사에 의해 평가 시에 그의 신체 웰빙 및 기능, 질환 활성 및 장애에 관한 자기-기입식 설문지에서 각각의 환자에 의해 평가된 관절 종창, 관절 압통, 염증, 조조 강직, 질환 활성 및 장애, 및 통증을 포함하였다 (Fries, J.F. et al., J. Rheumatol., 9:789-793 (1982)).

"의료 결과 연구 단축 서식-36 (SF-36)"은 건강-관련 삶의 질 (HRQOL)에 대한 요법의 영향을 평가하기 위해 사용된 서식을 지칭한다. SF-36은 4개의 신체 영역 및 4개의 정신 영역 (신체 기능, 신체적 역할, 신체 통증, 전반적 건강, 활력, 사회적 기능, 감정적 및 정신 건강)을 포함하는 36개의 항목으로 이루어진다. 이들 개별 영역은 0 내지 100의 범위 (여기서 점수가 높을수록 보다 나은 삶의 질을 나타냄)의 신체 및 정신 성분 요약 점수를 도출하기 위해 사용된다.

용어 "ACR"은 미국 류마티스 학회에 의해 확립된 기준에 기초한 임상 반응 연구를 지칭한다. ACR 코어 데이터 세트 및 반응 정의는 하기 표 1에 기재되어 있다. 대상체는 압통 및 종창 관절수에서 20 퍼센트 개선, 및 측정된 5개의 나머지 증상, 예컨대 환자 및 의사의 전반적 질환 변화, 통증, 신체 장애, 및 급성기 반응물, 예컨대 C-반응성 단백질 (CRP) 또는 신속 안전성 보고서 (ESR) 중 3개에서 20 퍼센트 개선이 존재하는 경우에 "ACR20" 기준을 충족한다 (Felson, D.T. et al., Arthritis Rheum., 36:729-740 (1993); Felson, D.T. et al., Arthritis Rheum., 38:1-9 (1995)). 유사하게, 대상체는 압통 및 종창 관절수에서 각각 50 또는 70 퍼센트 개선, 및 측정된 5개의 나머지 증상, 예컨대 환자 및 의사의 전반적 질환 변화, 통증, 신체 장애, 및 급성기 반응물, 예컨대 CRP 또는 ESR 중 3개에서 각각 50 또는 70 퍼센트 개선이 존재하는 경우에 "ACR50" 또는 "ACR70" 기준을 충족한다.

<표 1>

ACR 코어 데이터 세트 및 반응 정의

혈청 샘플은 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELlSA)에 의해 CTLA4Ig에 대해 분석될 수 있다.

CTLA4-Ig 단량체 및 다량체

CTLA4-Ig 분자는, 예를 들어 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 다른 다량체 형태의 CTLA4-Ig 단백질을 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 적어도 CTLA4의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역을 갖는 단백질 융합체를 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는, 예를 들어 CTLA4 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 관하여 야생형 또는 돌연변이체 서열을 가질 수 있다. 단독의 또는 이량체, 사량체 또는 다른 다량체 형태의 CTLA4-Ig 단량체는 글리코실화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 특정 백분율의 이량체 또는 다른 다량체 분자를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 초과의 CTLA4-Ig 이량체가 존재하는 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 95% 내지 약 99.5%의 CTLA4-Ig 이량체 및 약 0.5% 내지 약 5%의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 약 98%의 CTLA4-Ig 이량체, 약 1.5%의 CTLA4-Ig 사량체 및 약 0.5%의 CTLA4-Ig 단량체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 단량체 분자가 실질적으로 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. CTLA4-Ig 단량체 분자가 실질적으로 없다는 것은 단량체가 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체, 예컨대 사량체, 육량체 등이 실질적으로 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체 분자가 실질적으로 없다는 것은 이량체 형태보다 큰 CTLA4-Ig 다량체가 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.

한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는, 예를 들어 다음의 아미노산 서열을 가질 수 있다: (i) 서열식별번호: 2의 26-383, (ii) 서열식별번호: 2의 26-382, (iii) 서열식별번호: 2의 27-383, 또는 (iv) 서열식별번호: 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열식별번호: 2의 25-382, 또는 (vi) 서열식별번호: 2의 25-383. 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 CHO 세포에서 발현될 때, 발현된 우세한 단량체 형태는 야생형 인간 CTLA4의 N-말단 아미노산 잔기에 상응하는 메티오닌인 N-말단 아미노산 잔기 (서열식별번호: 2의 잔기 27)를 갖는다. 그러나, 서열식별번호: 1은 온코스타틴 M 신호 서열에 대한 코딩 서열 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 11-88)을 또한 포함하기 때문에, 서열식별번호: 1로부터 발현된 단백질은 온코스타틴 M 신호 서열을 함유한다. 신호 서열은 세포질로부터의 단백질 유출 또는 세포 밖으로의 분비 과정 동안 발현된 단백질로부터 절단된다. 그러나, 절단은 아미노산 잔기 26과 27 사이의 절단 (잔기 27의 N-말단을 생성함)에 반대로, 아미노산 잔기 25와 26 사이의 절단 (잔기 26의 N-말단, 즉 "Ala 변이체"를 생성함), 또는 아미노산 잔기 24와 25 사이의 절단 (잔기 2의 N-말단, 즉 "Met-Ala 변이체"를 생성함)과 같은 N-말단 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, Met-Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물에 약 1%로 존재할 수 있고, Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물에 약 8-10%로 존재할 수 있다. 추가로, 서열식별번호: 1로부터 발현된 단백질은 불완전 프로세싱으로 인해 C-말단 변이체를 가질 수 있다. 우세한 C-말단은 서열식별번호: 2의 잔기 382에서의 글리신이다. CTLA4-Ig 분자의 혼합물에, C-말단에서 리신 (서열식별번호: 2의 잔기 383)을 갖는 단량체는, 예를 들어 약 4-5%로 존재할 수 있다.

CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 27-151을 코딩하는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 89-463의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 인간 CTLA4의 돌연변이체 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 보존적 아미노산 변화가 이루어지도록 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 89-463에 대한 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 89-463에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 불변 영역은 불변 영역의 일부분일 수 있고; 상기 불변 영역은 야생형 또는 돌연변이체 서열을 가질 수 있다. 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로부터의 것일 수 있다. 불변 영역은 이뮤노글로불린의 경쇄 또는 중쇄로부터의 것일 수 있다. 불변 영역이 IgG, IgD 또는 IgA 분자로부터의 것인 경우에, 불변 영역은 하기 불변 영역 도메인 중 1개 이상을 포함할 수 있다: CL, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3. 불변 영역이 IgM 또는 IgE로부터의 것인 경우에, 불변 영역은 하기 불변 영역 도메인 중 1개 이상을 포함할 수 있다: CL, CH1, CH2, CH3 또는 CH4. 한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG, IgD, IgA, IgM 또는 IgE로부터의 1개 이상의 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 변형된 인간 IgG1 힌지 영역 (서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열식별번호: 2의 아미노산 152-166)을 포함하고, 여기서 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 156, 162 및 165에서의 세린은 야생형 서열에 존재하는 시스테인으로부터 조작되었다.

한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 변형된 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 CH3 영역을 포함한다 (변형된 인간 IgG1 CH2 도메인은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 509-838 및 서열식별번호: 2의 아미노산 167-276을 갖고; 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 839-1159 및 서열식별번호: 2의 아미노산 277-383을 갖는다).

한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,094,874 (2006년 8월 22일에 등록됨) 및 7,455,835 (2008년 11월 25일에 등록됨)의 도 7, 8 또는 9 중 어느 하나 이상에 제시된 서열을 갖는 단량체를 포함한다.

한 실시양태에서, CTLA4-Ig 사량체 분자는 CTLA4-Ig 폴리펩티드의 2개의 쌍 또는 2개의 이량체를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 1개를 갖는다: (i) 서열식별번호: 2의 26-383, (ii) 서열식별번호: 2의 26-382, (iii) 서열식별번호: 2의 27-383, 또는 (iv) 서열식별번호: 2의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열식별번호: 2의 25-382, 또는 (vi) 서열식별번호: 2의 25-383. 폴리펩티드의 쌍 또는 이량체의 각각의 구성원은 다른 구성원에 공유 연결되고, 폴리펩티드의 2개의 쌍은 서로 비-공유 회합되어 사량체를 형성한다. 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4-Ig 이량체 (그의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 1개를 가짐)의 결합력보다 적어도 2배 더 큰 결합력으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 야생형 CTLA4의 결합 친화도 또는 결합력보다 적어도 2배 더 큰 결합력으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 이러한 보다 큰 결합력은 면역 장애 및 하기 기재된 바와 같은 다른 질환을 치료하는데 있어서 보다 큰 효능에 기여할 수 있다. 추가로, 보다 크거나 개선된 결합력은 약물의 보다 큰 효력의 결과를 가져올 수 있다. 예를 들어, CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 치료 조성물은 CTLA4-Ig 단량체를 갖는 치료 조성물의 동일한 양보다 더 큰 결합력을 갖고 따라서 더 큰 효력을 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 (그의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 1개를 가짐)와 비교하여 T 세포 증식에 대해 적어도 2배 더 큰 억제를 나타낼 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 사량체 분자는 야생형 CTLA4 분자와 비교하여 T 세포 증식에 대해 적어도 2배 더 큰 억제를 나타낼 수 있다.

T 세포 증식은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식을 평가하기 위한 가장 흔한 방식 중 하나는 TCR에 대한 항원 또는 효능작용 항체를 통해 T 세포를 자극하고, 예를 들어 증식하는 T 세포 내의 삼중수소화 티미딘 (3H-TdR)의 혼입 또는 증식하는 T 세포에 의해 배양물 내로 방출된 시토카인의 양을 측정하는 것이다. 그에 의해 T 세포 활성화 또는 증식에 대한 CTLA4-Ig 분자의 억제 효과가 측정될 수 있다.

본 발명의 CTLA4Ig 분자를 생산하는 방법

CTLA4Ig 분자의 발현은 원핵 세포에서 이루어질 수 있다. 원핵생물은 가장 빈번하게 다양한 박테리아 균주에 의해 나타내어진다. 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성일 수 있다. 전형적으로, 그람-음성 박테리아, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)가 바람직하다. 다른 미생물 균주가 또한 사용될 수 있다.

CTLA4Ig 분자를 코딩하는, 상기 기재된 서열은 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 외래 서열을 발현시키기 위해 설계된 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이들 벡터는 통상적으로 사용되는 원핵생물 제어 서열을 포함할 수 있으며, 상기 서열은 리보솜 결합 부위 서열과 함께, 임의로 오퍼레이터와, 전사 개시를 위한 프로모터를 포함하는 것으로 본원에서 정의되고, 상기 프로모터는 베타-락타마제 (페니실리나제) 및 락토스 (lac) 프로모터 시스템 (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)) 및 람다 유래 P_L 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위 (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981))와 같은 통상적으로 사용되는 프로모터를 포함한다.

이러한 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선택 마커, 예컨대 박테리아에서 벡터를 복제할 수 있고 항생제, 예컨대 암피실린 또는 카나마이신의 존재 하에 성장시킬 때 플라스미드를 보유하는 세포를 선택할 수 있도록 항생제에 대한 내성을 부여하는 베타-락타마제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함할 것이다.

발현 플라스미드는 CaCl₂-쇼크 (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972), 및 Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)) 및 전기천공을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 표준 방법을 통해 원핵 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 실시에 따르면, 진핵 세포도 또한 적합한 숙주 세포이다. 진핵 세포의 예는 1차 세포인지 불멸화 세포인지 무관한 임의의 동물 세포, 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 및 식물 세포를 포함한다. 골수종, COS 및 CHO 세포는 숙주로서 사용될 수 있는 동물 세포의 예이다. 특정한 CHO 세포는 DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet., 12:555-556 (1986); Kolkekar, Biochemistry, 36:10901-10909 (1997)), CHO-K1 (ATCC 번호 CCL-61), CHO-K1 Tet-On 세포주 (클론테크(Clontech)), CHO 지정 ECACC 85050302 (CAMR, 영국 윌트셔 살리스베리), CHO 클론 13 (GEIMG, 이탈리아 제노바), CHO 클론 B (GEIMG, 이탈리아 제노바), CHO-K1/SF 지정 ECACC 93061607 (CAMR, 영국 윌트셔 살리스베리), 및 RR-CHOK1 지정 ECACC 92052129 (CAMR, 영국 윌트셔 살리스베리)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 식물 세포는 담배 (전체 식물, 세포 배양물 또는 캘러스), 옥수수, 대두 및 벼 세포를 포함한다. 옥수수, 대두 및 벼 종자도 또한 허용된다.

상기 기재된 CTLA4Ig 분자를 코딩하는 핵산 서열은 또한 진핵 숙주에서 외래 서열을 발현시키기 위해 설계된 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터의 조절 요소는 특정한 진핵 숙주에 따라 달라질 수 있다.

발현 벡터에 사용하기 위한 통상적으로 사용되는 진핵 제어 서열은 포유동물 세포에 상용성인 프로모터 및 제어 서열, 예컨대, 예를 들어 CMV 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육종 바이러스 (ASV) (πLN 벡터)를 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 프로모터는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 초기 및 후기 프로모터 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1973)), 또는 다른 바이러스 프로모터, 예컨대 폴리오마, 아데노바이러스 2 및 소 유두종 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터, 예컨대 hMTII (Karin et al., Nature, 299:797-802 (1982))도 또한 사용될 수 있다.

진핵생물에서 CTLA4Ig 분자를 발현시키는 벡터는 또한 인핸서 영역으로 불리는 서열을 보유할 수 있다. 이들은 유전자 발현을 최적화하는데 중요하고, 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견된다.

진핵 숙주 세포를 위한 발현 벡터의 예는 포유동물 숙주 세포를 위한 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (마니아티스(Maniatis)); pIRES (클론테크); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (스트라타진(Stratagene)), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (스트라타진)), pCDNA-3 (인비트로젠(Invitrogen)) 또는 그의 변형된 형태, 아데노바이러스 벡터; 아데노-연관 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (스트라타진))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

CTLA4Ig 분자를 코딩하는 핵산 서열은 진핵 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈이 복제됨에 따라 복제될 수 있다. 대안적으로, CTLA4Ig 분자를 보유하는 벡터는 염색체외 복제를 가능하게 하는 복제 기점을 함유할 수 있다.

사카로미세스 세레비지아에에서 핵산 서열을 발현시키기 위해, 내인성 효모 플라스미드로부터의 복제 기점인 2μ 써클이 사용될 수 있다 (Broach, Meth. Enzymol., 101:307 (1983)). 대안적으로, 자율 복제를 촉진할 수 있는 효모 게놈으로부터의 서열이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980); 및 Clarke et al., Meth. Enzymol., 101:300 (1983)] 참조).

효모 벡터에 대한 전사 제어 서열은 당분해 효소의 합성을 위한 프로모터를 포함한다 (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968) 및 Holland et al., Biochemistry, 17:4900 (1978)). 관련 기술분야에 공지된 추가의 프로모터는 CDM8 벡터에 제공된 CMV 프로모터 (Toyama et al., FEBS, 268:217-221 (1990)); 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터 (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)), 및 다른 당분해 효소에 대한 프로모터를 포함한다.

다른 프로모터는 환경적 자극 또는 세포의 성장 배지에 의해 조절될 수 있기 때문에 유도성이다. 이들 유도성 프로모터는 열 쇼크 단백질, 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 이화작용과 연관된 효소, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.

조절 서열은 또한 코딩 서열의 3' 말단에 위치할 수 있다. 이들 서열은 메신저 RNA를 안정화시키는 작용을 할 수 있다. 이러한 종결인자는 여러 효모-유래 및 포유동물 유전자에서의 코딩 서열 이후의 3' 비번역 영역에서 발견된다.

식물 및 식물 세포에 대한 예시적인 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) T_i 플라스미드, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 및 토마토 골든 모자이크 바이러스 (TGMV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

포유동물 세포는 인산칼슘의 존재 하의 형질감염, 미세주사, 전기천공 또는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 형질전환될 수 있다.

외래 DNA 서열을 식물 및 효모 게놈 내로 도입하는 방법은 (1) 기계적 방법, 예컨대 단세포 또는 원형질체 내로의 DNA의 미세주사, DNA의 존재 하에 세포와 유리 비드와의 볼텍싱, 또는 세포 또는 원형질체 내로의 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 구체의 발사; (2) 폴리에틸렌 글리콜 처리 또는 고전압 전기 펄스 (전기천공)에의 적용을 통해 세포 막이 거대분자를 투과가능하도록 만드는 것에 의한 DNA의 도입; 또는 (3) 세포 막으로 융합되는 리포솜 (cDNA 함유)의 사용을 포함한다.

미국 특허 번호 7,332,303 및 7,541,164는 동물 또는 포유동물 세포 배양에 의해 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 산물을 생산하는 방법을 교시하고, 본원에 참조로 포함된다.

세포 배양 방법의 단백질 생산기 후에, CTLA4Ig 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 기술을 사용하여 세포 배양 배지로부터 회수된다. 특히, CTLA4Ig 분자는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다.

배양 배지는 세포 파편 및 미립자를 제거하기 위해 초기에 원심분리된다. 이후에 목적하는 단백질은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있는 하기 비제한적 정제 절차를 사용하여 오염 DNA, 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제된다: SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 에탄올 침전; 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별증류; 역상 HPLC; 실리카 또는 음이온-교환 수지, 예컨대 QAE 또는 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 예를 들어 세파덱스(SEPHADEX)® G-75 칼럼을 사용하는 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스(SEPHAROSE)® 칼럼. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF) 또는 프로테아제 억제제 칵테일 믹스의 첨가는 또한 정제 동안 단백질분해적 분해를 억제하는데 유용할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관심 단백질, 예를 들어 당단백질에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양물에서의 발현 시에 단백질의 특징 변화를 설명하는 변경을 요구할 수 있음을 인식할 것이다.

당단백질의 탄수화물 기를 선택하는 정제 기술 및 방법이 본 발명의 문맥 내에서 또한 유용하다. 예를 들어, 이러한 기술은 HPLC 또는 양이온- 또는 음이온-교환 수지를 사용하는 이온-교환 크로마토그래피를 포함하고, 여기서 어떤 탄수화물이 선택되는지에 따라 보다 염기성인 분획 또는 보다 산성인 분획이 수집된다. 또한, 이러한 기술을 사용하면 오염물을 동시 제거할 수 있다.

정제 방법은 포유동물 세포주의 세포 배양 배지에 잠재적으로 존재할 수 있는 바이러스 및/또는 레트로바이러스를 불활성화 및/또는 제거하는 추가의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 카오트로프제, 예컨대 우레아 또는 구아니딘, 세제, 추가의 한외여과/투석여과 단계, 통상적인 분리, 예컨대 이온-교환 또는 크기 배제 크로마토그래피, 극한 pH, 가열, 프로테아제, 유기 용매 또는 그의 임의의 조합을 사용한 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 유의한 수의 바이러스 클리어런스 단계가 이용가능하다.

정제된 CTLA4Ig 분자는 저장 또는 추가의 프로세싱 전에 농축 및 완충제 교환을 요구한다. 폴 필트론(Pall Filtron) TFF 시스템이 이전의 정제 칼럼으로부터의 용리 완충제를 약물 물질에 요구되는 최종 완충제로 농축 및 교환시키는데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 농축되어 투석여과 단계에 적용된 정제된 CTLA4Ig 분자는 2-L 바이오테이너(BIOTAINER)® 병, 50-L 생물공정 백 또는 임의의 다른 적합한 용기 내로 충전될 수 있다. 이러한 용기 내의 CTLA4Ig 분자는 동결 전에 2℃ 내지 8℃에서 약 60일 동안 저장될 수 있다. 2℃ 내지 8℃에서 정제된 CTLA4Ig 분자의 저장을 연장시키는 것은 HMW 종의 비율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 장기간 저장을 위해, CTLA4Ig 분자는 저장 전에 약 -70℃에서 동결되고 약 -40℃의 온도에서 저장될 수 있다. 동결 온도는 약 -50℃ 내지 약 -90℃로 달라질 수 있다. 동결 시간은 달라질 수 있고, CTLA4Ig 분자를 함유하는 용기의 부피 및 동결기에 로딩되는 용기의 수에 주로 좌우된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CTLA4Ig 분자는 2-L 바이오테이너® 병에 존재한다. 동결기 내 4개 미만의 2-L 바이오테이너® 병의 로딩에는 약 14 내지 적어도 18시간의 동결 시간이 요구될 수 있다. 적어도 4개의 병의 로딩에는 약 18 내지 적어도 24시간의 동결 시간이 요구될 수 있다. 동결된 CTLA4Ig 분자가 존재하는 용기는 약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서 저장된다. 약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서의 저장 시간은 달라질 수 있고, 18시간만큼 짧을 수 있다. 동결된 약물 물질은 약물 제품의 제제화를 위해 제어 방식으로 해동될 수 있다.

미국 공개 번호 2009/0252749는 동물 또는 포유동물 세포 배양에 의해 본 발명의 단백질, 구체적으로 재조합 당단백질 산물을 생산하는 방법을 교시하고, 본원에 참조로 포함된다.

제약 조성물

본 발명의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 허용되는 담체 또는 아주반트와 혼합된 CTLA4Ig 분자를 포함하는 제약 조성물을 이용한다. 제약 조성물은 바람직하게는 CTLA4Ig 분자와 조합될 때 분자의 활성을 유지하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함하는 적합한 담체 및 아주반트를 포함한다. 이들 담체 및 아주반트는 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 에멀젼), 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 다른 담체는 멸균 용액; 정제, 예를 들어 코팅 정제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 담체는 부형제, 예컨대 전분, 우유, 당 (예를 들어, 수크로스, 글루코스, 말토스), 특정 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜, 또는 다른 공지된 부형제를 함유한다. 또한, 이러한 담체는 향미 및 색상 첨가제 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다. 또한, 이러한 조성물은 다양한 지질 조성물, 예컨대, 예를 들어 리포솜 내에서 뿐만 아니라 다양한 중합체 조성물, 예컨대 중합체 마이크로구체 내에서 제제화될 수 있다.

가용성 CTLA4 분자를 포함하는 제제는 미국 특허 번호 8,476,239에 기재되어 있으며, 이는 본 출원에 참조로 포함된다. 미국 특허 번호 8,476,239에 기재된 바와 같이, 가용성 CTLA4 분자는 IV 및 피하 적용을 위해 제제화될 수 있다. 간략하게, 적합한 피하 (SC) 제제는 적어도 100 mg/ml의 단백질 농도의 CTLA4Ig 분자를 수성 담체 내의 안정화 수준의 당과 조합하여 포함한다.

실시예 III에 기재된 본 발명의 방법에서 이용된 미리 충전된 시린지를 통해 전달되는 CTLA4Ig SC 약물 제품의 예가 하기 표 2에 제공되어 있다.

<표 2>

CTLA4Ig SC 약물 제품의 조성, 125 mg/ml (125 mg/시린지)

본 명세서의 실시예 I 및 II는 본 발명의 방법에 유용한 CTLA4Ig의 정맥내 (IV) 및 피하 제제의 제조를 기재한다.

<표 3>

동결건조된 CTLA4Ig (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성

^a 바이알, 바늘, 시린지 손실에 대비해 5% 과다충전을 포함함.

^b 이들 성분은 CTLA4Ig 약물 물질 용액 중에 존재함.

동결건조된 약물 제품은 수성 담체로 구성될 수 있다. 본원에서 관심 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임) 동결건조 후에 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 전형적으로, 동결건조된 약물 제품은 10 ml의 멸균 주사용수, USP (SWFI) 또는 0.9% 염화나트륨 주사액, USP를 사용하여 약 25 mg/ml로 구성된다. 구성된 용액은 0.9% 염화나트륨 주사액, USP를 사용하여 1 내지 10 mg/ml의 약물 제품 농도로 추가로 희석된다. 주사를 위한 희석 약물 제품은 등장성이고 정맥내 주입에 의한 투여에 적합하다.

사용 방법

본 발명은 무약물 완화의 달성을 필요로 하는 초기 RA를 갖는 대상체에게 유효량의 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 또한 초기 RA를 갖는 대상체에서 손목 및 손의 미란 및 골수 부종 점수화 및/또는 활막염 점수화에 의해 평가된 바와 같은 관절의 구조적 손상을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 증상 완화의 양은 임상 세팅에서 증상 완화를 측정하고 기록하기 위해 확립된 임의의 허용되는 기준을 사용하여 측정될 수 있다. 증상 완화를 측정하기 위한 허용되는 기준은 미국 류마티스 학회에 의해 확립된 기준 (예를 들어, ACR 20), 증상 완화의 4가지 척도 (문헌 ["CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988"] 내), 및 건강 평가 설문지 (HAQ) (Fries, J.F. et al., J. Rheumatol., 9:789-793 (1982))에 기초한 점수를 포함할 수 있다. 이들 기준의 일반적 설명에 해서는, 문헌 [Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA) (Feb. 1999)]을 참조한다.

본 발명은 CTLA4Ig 분자를 단독으로 또는 다른 치료 약물과 함께 투여하기 위한 다양한 국부 또는 전신 방법을 제공한다. 방법은 정맥내, 근육내, 복강내, 경구, 흡입 및 피하 방법, 뿐만 아니라 이식형 펌프, 연속 주입, 유전자 요법, 리포솜, 좌제, 국소 접촉, 소포, 캡슐 및 주사 방법을 포함한다.

담체와 배합된 CTLA4Ig는 저장을 위해 통상적으로 동결건조되고, 투여 전에 물 또는 완충 용액으로 재구성된다 (실시예 I 참조). 관련 기술분야의 표준 관례와 같이, 본 발명의 조성물은 대상체에게 임의의 제약상 허용되는 형태로 투여될 수 있다.

담체와 배합된 CTLA4Ig는 투여를 위해 준비되는 피하 제제로서 제공될 수 있다 (실시예 II 참조). 피하 제제는 바이알 또는 미리 충전된 시린지에 제공될 수 있다.

본 발명의 제제의 가장 효과적인 투여 방식 및 투여 요법은 환자의 건강 및 치료에 대한 반응 및 치료하는 의사의 판단에 좌우된다. 본 발명의 실시에 따르면, 대상체를 치료하기 위한 유효량은 약 0.1 내지 100 mg/kg 대상체 체중의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 약 0.1 내지 20 mg/kg 대상체 체중, 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg 대상체 체중의 양이다. 구체적 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 약 2 mg/kg 대상체 체중이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 약 10 mg/kg 대상체 체중이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 60 kg 미만의 대상체 체중에 대해 500 mg, 60-100 kg의 대상체 체중에 대해 750 mg, 및 100 kg 초과의 대상체 체중에 대해 1000 mg이다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4Ig의 유효량은 매주 기준으로 피하로 투여되는 125 mg이다.

본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제는 대상체에서 내인성 B7 (예를 들어, CD80 및/또는 CD86) 분자가 그의 각각의 리간드에 결합하는 것을 차단하기에 충분한 양으로 충분한 시간 동안 (예를 들어, 장시간 및/또는 다수회) 대상체에게 투여될 수 있다. 내인성 B7/리간드 결합의 차단은 그에 의해 B7-양성 세포 (예를 들어, CD80- 및/또는 CD86-양성 세포)와 CD28- 및/또는 CTLA4-양성 세포 사이의 상호작용을 억제한다. 따라서, 작용제의 투여량은 대상체 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.

CTLA4Ig 분자의 유효량은 필요에 따라 시간/일/주/개월/년마다 단일회 또는 다수회로 매일, 매주, 매월 및/또는 매년 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CTLA4Ig 분자의 유효량은 초기에 1개월 동안 2주마다 1회에 이어서 그 이후 매월 1회, 또는 제1일, 제15일, 제29일 및 그 이후 매월 투여될 수 있다. +/- 3일 범위는 보다 이른 용량 (즉, 제15일 및 제29일)에 대해 허용된다. +/- 7일 범위는 그 이후의 매월 용량에 대해 허용된다.

대안적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자 위험 상태에 대한 반응 및/또는 요법에 대한 반응에 따라 투여 요법을 변형할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 기재된 요법은 제5일 투여를 요법에 추가함으로써 변형될 수 있다.

본원에 사용된 "4주", "개월", "개월들" 또는 "매월"은 28 ± 7일의 기간을 지칭한다.

전형적으로, 본 발명의 CTLA4Ig 분자 제제의 용량은 체중에 기초하고, 투여 요법은 표적 혈청 최저 프로파일에 의해 좌우될 수 있다. 전형적으로, 약 3 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 바람직하게는 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 보다 바람직하게는 약 10 μg/mL 내지 약 30 μg/mL의 본 발명의 CTLA4Ig 분자의 표적 최저 혈청 농도가 RA를 갖는 대상체에서 RA를 치료하거나 완화를 달성하기에 충분할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 목적하는 혈청 최저 농도를 달성하기 위해 CTLA4Ig의 투여량 및/또는 투여 스케줄을 조정할 수 있을 것이다.

본 발명의 분자 또는 제약 조성물의 투여는 30분 내지 1시간 이상의 정맥내 주입을 통해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 단일 내지 다중 피하 주사가 요구되는 투여량을 전달할 수 있다.

본 발명의 CTLA4Ig 분자는 다른 면역억제/면역조절 요법과 함께 병용으로 또는 순차적으로 투여될 수 있고, 예를 들어 본원에 명시된 바와 같이 공-투여되는 면역억제제 또는 면역조절 화합물의 투여량은 사용되는 공-투여 약물의 유형에 따라 물론 달라질 것이다.

비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)은 본 발명의 CTLA4Ig 분자와 함께 병용으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. NSAID는 대상체에서 염증 반응을 감소시킨다. NSAID는 아세틸 살리실산, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트, 살살레이트, 살리실산나트륨, 디클로페낙, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 나프록센, 나부메톤, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 아세트아미노펜, 이부프로펜, Cox-2 억제제, 멜록시캄 및 트라마돌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

코르티코스테로이드가 본 발명의 CTLA4Ig 분자와 함께 병용으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 안정한 저용량 경구 코르티코스테로이드 (매일 ≤10 mg 프레드니손에 등가임), 또는 경구 경로로 6개월마다 투여되는 고용량 코르티코스테로이드 (최대 2주 동안 매일 20 mg/일 프레드니손에 등가임), 또는 단일 IM (근육내) 용량 또는 단일 IA (관절내) 용량이 있다.

코르티코스테로이드의 예는 베타메타손, 부데소니드, 코르티솔, 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 및 트리암시놀론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

전형적으로, 상기 기재된 공-투여되는 약물의 표준 투여량 및 투여 요법은 본 발명의 CTLA4Ig 분자를 치료 요법에 추가하는 것에 의해 영향받지 않는다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 보다 낮은 독성의 본 발명의 CTLA4Ig 분자를 치료 요법 내로 포함시켰기 때문에 보다 낮은 용량의 공-투여되는 약물을 처방할 수 있다. 각각의 공-투여되는 약물에 대한 처방 정보는 패키지 삽입물에 기초할 수 있다.

초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하는 방법

이전에 논의된 바와 같이, 관절 파괴는 RA에서 초기에 발생한다. 이러한 통찰은 염증 과정을 단순히 억제하는 것이 아니라 근본적으로 변경시켜 RA의 과정에 있어서 초기에 증상 및 구조적 손상의 약화를 야기할 수 있는 요법에 대한 필요성을 강조하였다. 결과적으로, 이는 RA의 보다 이른 진단 및 치료를 점점 더 강조하였다.

추가로, RA에서 염증 및 관절 파괴를 유도하는 기저 메카니즘을 목표로 하는 표적화 요법에 대한 이상적인 후보가 될 불량한 예후를 갖는 초기 RA 대상체를 확인하는 것이 무약물 완화를 달성하는데 핵심적이다. 이러한 접근법은 불행하게도 RA의 자연 병력을 특징화하는 관절 손상의 발생, 기능적 장애 및 후속 삶의 질 손상을 방지할 것이다.

본 발명의 한 실시양태는 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 대상체를 확인하는 방법이다. 지속적 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 초기 RA를 갖는 대상체는 고도 활성 질환 및 불량한 예후 마커를 갖는다. 예를 들어, 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 초기 RA 대상체는 ≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절의 활성 임상 활막염, DAS28 (CRP) ≥ 3.2 및 항-시트룰린화 펩티드 (CCP)-2 항체 양성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 고도 활성 질환 및 불량한 예후 마커를 갖는 초기 RA 대상체에게 유효량의 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, CTLA4Ig는 125 mg/주 피하로 또는 10 mg/kg 대상체 체중으로 격주, 매월 또는 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL의 표적 최저 혈청 농도를 충족하기에 충분한 스케줄로 투여될 수 있다.

CTLA4 분자는 고도 활성 질환 및 불량한 예후 마커를 갖는 초기 RA 대상체에게 상기 언급된 용량으로 완화가 달성될 때까지 투여된다. 본 발명의 방법에서, 완화는 DAS-규정 완화 (류마티스 관절염에 대한 질환 활성 점수 계산표 (C-반응성 단백질) [DAS28(CRP)]) < 2.6이다. DAS-규정 완화는 전형적으로 12개월의 CTLA4 투여에 의해 달성된다.

본 발명의 방법은 DAS-규정 완화가 달성되면 모든 면역억제/면역조절 요법의 철회를 추가로 포함한다. RA 의약 중 1종 이상은 일정 기간, 예컨대 1개월, 2개월 또는 3개월에 걸쳐 급속히 철회될 수 있거나 점감될 수 있다. 예를 들어, 일정 기간, 예컨대 1개월, 2개월 또는 3개월에 걸쳐 CTLA4 분자는 급속히 철회되고 다른 RA 의약은 점감된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 초기 RA를 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성함으로써 구조적 손상을 억제하는 방법이다. 본 발명의 방법에서 구조적 손상은 손목 및 손의 미란, 골염 및/또는 활막염 점수화에 의해 평가된다.

실시예 III은 각각의 치료군에서 MRI에 의해 측정된 방사선촬영 변화가 임상 효능 결과와 일치하였다는 것을 제시한다. 아바타셉트 + MTX 및 아바타셉트 단독요법은 활막염 및 골염 점수에 있어서 기준선으로부터 수치적으로 보다 큰 감소를 가져왔고, 아바타셉트 + MTX는 제12개월에서 MTX보다 미란 점수의 더 적은 진행을 가져왔다 (도 7A-C 참조).

실시예 III은 아바타셉트 (즉, CTLA4-Ig)를 받은 초기 RA를 갖는 환자에서 모든 요법 (csDMARD, 생물학적 DMARD 및 코르티코스테로이드 포함)의 급속한 철회 후에 완화가 유지될 수 있다는 것을 입증하는 제1 임상 연구 (AVERT)를 기재한다. 아바타셉트를 사용하여 치료된 환자는 MTX 치료 중보다 유의하게 더 높은 DAS-규정 완화율을 달성하였고, 적지만 유의하게 더 높은 수의 환자는 모든 RA 치료의 철회 후에 지속적 절대, 무약물, DAS-규정 완화를 달성하였다. 이들 결과는 염증성 캐스케이드에서 고도로 작용하는 T-세포 면역조절제를 사용한 조기 치료가 무약물 완화를 증가시킬 수 있다는 가설을 지지한다.

AVERT에서, 환자는 관절 손상 및 질환 진행의 가능성 증진과 연관된 조합인 고도 활성 질환 및 불량한 예후 마커를 가졌다. 아바타셉트 + MTX는 완화 및 HAQ-DI의 다중 측정에 의해 입증된 바와 같이 MTX에 비해 강건한 효능 및 일치하는 구조적 이익을 달성하였다.

AVERT는 많은 환자가 MTX를 용인할 수 없기 때문에 관심을 갖게 된 아바타셉트 단독요법을 평가하는 대규모 데이터세트를 제공한다. 아바타셉트를 받은 유사한 수의 환자가 제12개월에서 MTX에 비해 DAS-규정 완화를 달성하였으나, 전체 데이터는 아바타셉트 단독요법이 MTX와 비교하여 수치적으로 더 높은 이익을 가졌다는 것을 제시하였다. 아바타셉트 단독요법에 대한 MRI 소견은 또한 제12개월에서 MTX 단독과 비교하여 골염 및 활막염에 대한 수치적으로 더 큰 이익을 입증하였다.

모든 요법의 철회 후에, 적지만 유의한 수의 환자가 MTX 단독과 비교하여 아바타셉트 + MTX를 사용한 선행 치료 후에 무약물 완화를 지속하였다. 데이터는, 아바타셉트 + MTX 치료를 사용한 경우에, 4명의 환자 중 1명이 6개월 내내 무약물 완화를 유지할 수 있었다는 것을 나타낸다. 이러한 효과는 평가가 모든 치료의 철회 후 6개월까지 (> 5회 반감기) 수행되었기 때문에 아바타셉트의 반감기 (14.3일)의 결과는 아니다. 더욱이, 무약물 완화를 지속한 환자의 사후 분석은 보다 짧은 증상 지속기간 및 기준선에서의 보다 낮은 질환 활성 또는 치료 철회 전 보다 긴 지속적 DAS-규정 완화를 갖는 환자가 무약물 완화를 유지할 가능성이 보다 많다는 것을 나타낸다. 이들 연관성은 구체적으로 두 아바타셉트 부문에서 관찰되었으며, 이는 생물학적 효과에 원인이 있다는 것을 시사한다.

따라서 이들 데이터는 매우 짧은 증상 지속기간 및 보다 경도의 질환 활성을 갖는 초기 RA를 갖는 환자가 아바타셉트를 사용한 치료 후에 지속적이고 완전한 무약물 완화를 달성할 수 있다는 것을 나타낸다.

DAS-규정 완화 컷오프 < 2.6은, RA의 임상 완화에 대한 미국 류마티스 학회 정의에 상응하지만 (Fransen, J. et al., "Remission in rheumatoid arthritis: agreement of the disease activity score (DAS28) with the ARA preliminary remission criteria", Rheumatology (Oxford), 43:1252-1255 (2004)), 현재 다른 완화 척도 (Felson, D.T. et al., "American College of Rheumatology/European League against Rheumatism provisional definition of remission in rheumatoid arthritis for clinical trials", Ann. Rheum. Dis., 70:404-413 (2011)); 예컨대 여기에 또한 보고된 SDAI 및 불린에 의해 대체되었다. 컷오프는 적혈구 침강 속도 (ESR)에 기초하고, CRP 컷오프는 아직 정의되지 않았다. AVERT에서, CRP는 연구 기관에 걸친 급성기 반응물 및 보조 표준화의 변동성을 감소시키기 위해 ESR과 상호교환되었다. 데이터는 활성 질환 및 불량한 예후 인자를 갖는 초기 RA를 갖는 환자로부터 획득되며, 이는 전체 RA 집단으로의 일반화가능성을 제한한다. 철회 분석은 철회 기간에 남아있는 소수의 환자에 의해 제한되었다. RA 의약의 점진적 점감은 AVERT에 적용된 모든 RA 요법의 급속한 철회보다 더 높은 완화율을 가져왔으며 다른 시험에서 평가될 것이다.

AVERT는 초기 RA 집단에서 MTX와 조합된 아바타셉트 치료의 이익을 확립하고, 추가로 초기 RA에서 무약물 완화가 아바타셉트를 사용한 치료 후에 가능하다는 것을 나타낸다. 모든 RA 요법의 철회 후에 신규 지속적 완화 달성은 자가면역 과정에 대한 아바타셉트의 메카니즘의 기저 효과를 시사한다. 철회 치료 전략은 RA의 장기간 치료에 있어서 환자 및 의사에게 매우 바람직한 목표이다. 완화로의 치료는 현재 RA 요법의 널리 허용되는 목표이다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 모든 인용문헌은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

실시예 I

CTLA4Ig의 동결건조된 (250 mg/바이알) 약물 제품은 정맥내 (IV) 투여에 적합한 멸균 비-발열성 동결건조물이다. 각각의 일회용 바이알은 250 mg의 CTLA4Ig를 함유하고, 이는 사용 시에 멸균 주사용수, USP로 구성되고 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 추가로 희석된다.

115 리터 배치 크기에 대한 배치 조성이 하기 표 4에 기재되어 있다.

<표 4>

배치 조성

^a CTLA4Ig 약물 물질: 단백질 농도 50 mg/ml, 25 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨, pH 7.5, < 5% HMW 종.

^b 제제화된 벌크 용액 밀도 = 대략 1.04 g/ml.

요구되는 양의 CTLA4Ig 약물 물질을 혼합기가 구비된 세정 및 멸균된 스테인레스 스틸 배합 용기에 첨가한다. 용액 온도를 5℃ - 25℃로 유지하면서, 약물 물질 용액을 250±50 rpm으로 혼합한다.

요구되는 양의 말토스 1수화물 분말을 배합 용기에 첨가한다. 용액을 15℃ - 25℃에서 최소 10분 동안 혼합한다.

용액 pH를 필요한 경우에 미리 제조한 1N 수산화나트륨 용액 또는 1N 염산 용액을 사용하여 7.3-7.7로 조정한다. 배치를 주사용수, USP를 사용하여 최종 배치 중량 (최종 충분량)으로 만들고, 최소 8분 동안 혼합한다. 제제화된 벌크 용액을 pH를 위해 샘플링한다.

제제화된 벌크 용액을 한 0.45-㎛ 필터로 예비-여과한다. 0.45-㎛ 필터 후 제제화된 벌크 용액을 바이오버든 및 박테리아 내독소 (BET)를 위해 샘플링한다.

예비-여과된 제제화된 벌크 용액을 충전 전에 2개의 0.22-㎛ 필터로 연속으로 멸균 여과한다.

멸균 여과된 제제화된 벌크 용액을 완전 자동 충전/마개막기 기기에 의해 충전하고 20 nm-다이쿄(Daikyo) 회색 부틸 마개로 부분적으로 막는다. 15-cc 타입 I 플린트 튜빙 유리 바이알을 세척하고, 멸균/발열원 제거를 수행한다.

충전되고 부분적으로 마개로 막은 약물 제품 바이알을 동결건조시킨다. CTLA4Ig 약물 제품의 동결건조 동안 사용된 동결 건조 주기의 요약이 하기 표 5에 제공되어 있다.

<표 5>

CTLA4Ig 동결건조된 약물 제품에 대한 동결 건조 주기

동결건조 주기의 종료 시에, 챔버 압력을 멸균 여과된 질소를 사용하여 500 마이크로미터로 상승시키고, 바이알을 마개로 막는 것은 진공 하에 수행한다. 마개로 막은 바이알을 동결건조기 내부에서 적어도 4시간 동안 유지시킨다. 동결건조되고 마개로 막은 바이알을 캡핑 기계에 의해 HEPA 여과된 공기 하에 20-mm 알루미늄 백색 플립-오프 밀봉제로 밀봉한다. 밀봉된 바이알을 외부 바이알 세척기에 의해 탈이온수로 헹군다. 세척된 약물 제품 바이알을 2℃ 내지 8℃에서 저장한다.

동결건조된 CTLA4Ig (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성이 하기 표 6에 열거되어 있다.

<표 6>

동결건조된 CTLA4Ig (250 mg/바이알) 약물 제품의 조성

^b 이들 성분은 CTLA4Ig 약물 물질 용액 중에 존재함.

실시예 II

CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품은 피하 투여에 적합한 멸균 비-발열성 즉시 사용 용액으로서 제제화한다. CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 배치는 5-L 규모 (3,500 바이알)로 제조한다. 배치 조성이 하기 표 7에 기재되어 있다.

<표 7>

배치 조성

상기 실시예 I에 기재된 바와 같이, CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 제조 방법은 25 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨 (pH 7.5)으로부터 10 mM 인산나트륨 (pH 7.8) 완충제로의 벌크 약물 물질의 완충제 교환에 이어서, 완충제의 제거에 의한 ~50 mg/ml에서 ~150 mg/ml로의 단백질 농축을 수반한다. 이어서, 수크로스 및 폴록사머 188을 농축된 단백질 용액 중에 용해시키고, 최종 배치 중량을 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.8)로 조정한다. 벌크 용액을 0.22 마이크로미터 멸균 필터를 통해 여과하고, 멸균 및 발열원 제거한 5-cc 타입 I 플린트 유리 바이알 내로 충전하고, 20 mm 고무 마개로 막고, 20 mm 알루미늄 플립-오프 밀봉제로 밀봉한다.

CTLA4Ig SC 약물 제품, 125 mg/ml (125 mg/바이알)의 조성이 하기 표 8에 제공되어 있다.

<표 8>

CTLA4Ig SC, 125 mg/ml (125 mg/바이알) 약물 제품의 조성

^c 바이알, 바늘, 시린지 손실에 대비해 40% 과다충전을 포함함.

실시예 III

극초기 류마티스 관절염 치료 평가 (AVERT)는 3b상, 무작위화, 활성-대조 24개월 시험이었으며, 12-개월은 이중-맹검 치료 기간이었다.

연구 설계

연구 설계는 도 2에 그래프로 기재되어 있다.

포함 기준

연구에 참여할 의향이 있고, 서명한 사전 동의를 제공하였음

스크리닝에서 ≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절 (≥ 1개 작은 관절을 포함하고 원위지골간 관절을 포함하지 않음)의 활성 임상 활막염

스크리닝 ≤ 2년 전에 지속성 증상의 발병

스크리닝에서 질환 활성 점수 28 (DAS28) C-반응성 단백질 (CRP) ≥ 3.2

항-시클릭 시트룰린화 펩티드-2 양성

스크리닝 전 메토트렉세이트 (MTX) 나이브 또는 ≤ 4주 동안 MTX ≤ 10 mg/kg 및 1개월 동안 용량 부재

생물제제 나이브

≥ 28일 동안 클로로퀸, 히드록시클로로퀸 및 술파살라진 중지 (받은 경우에)

안정한 용량 경구 코르티코스테로이드 (≥ 4주 동안 ≤ 10 mg 프레드니손 등가) 또는 무작위화 ≥ 4주 전 근육내, 정맥내 또는 관절내 코르티코스테로이드 (받은 경우에)

연령 ≥ 18세

연구 의약의 마지막 용량 후 최대 10주 (유럽 연합에서는 14주) 동안 임신을 피하기 위해 허용되는 피임 방법을 사용하는 가임 남성 및 여성

임상시험용 제품의 개시 전 48시간 이내에 음성 혈청 또는 소변 임신 검사를 갖는 여성

여성은 모유수유이지 않아야 함

연구자는 MTX에 대한 제조업체의 권고를 따라야 함

자기 공명 영상화 (MRI)를 받을 수 있음

배제 기준

또 다른 류마티스성 질환에 대한 진단 기준을 충족함

연구-관련 평가를 완료하는데 장애가 있거나, 무력화되거나 또는 불가능함

중증, 진행성 또는 비제어성 신장, 간, 혈액, 위장, 폐, 심장, 신경계 또는 뇌 질환의 현재 증상

연구자의 의견에서 환자를 본 연구에의 참여에 대해 허용되지 않는 위험에 놓이게 할 수 있는 동반 의학적 상태

유방암 스크리닝 연구에서 악성종양이 의심되고 악성종양의 가능성이 추가의 임상, 실험실 또는 다른 진단 평가 후에 합리적으로 배제될 수 없는 여성

지난 5년 이내에 (국부 절제에 의해 치유된 비-흑색종 피부 세포 암 이외의) 암의 병력. 기존 비-흑색종 피부 세포 암은 투여 전에 제거되어야 함. 연구 진입 전에 확정적인 외과적 개입으로 치료된 상피내 암종을 갖는 환자는 허용되었음

임상적으로 유의한 약물 또는 알콜 남용

임의의 심각한 급성 박테리아 감염 (항생제로 치료되고 완전히 해소되지 않은 경우)

중증 만성 또는 재발성 박테리아 감염

TB에 대한 위험: 결핵 (TB)에 대한 현재 임상, 방사선촬영 또는 실험실 증거; 활성 TB의 병력 ≤ 3년 전; 선행 항-TB 치료의 적절한 지속기간 및 유형을 지지하는 보고가 없는 경우에 활성 TB의 병력 > 3년 전; 성공적으로 치료되지 않은 잠재성 TB (활성 TB 감염이 배제되지 않은 경우 및 연구 약물의 투여 전 ≥ 4주 동안 이소니아지드를 사용한 잠재성 TB에 대한 치료 및 등록 시에 음성 흉부 방사선사진)

대상 포진이 등록 < 2개월 전에 해소됨

잠재적 등록 시에 활성 또는 잠재성 박테리아 또는 바이러스 감염의 증거

B형 간염 표면 항원-양성

C형 간염 항체-양성 및 재조합 이뮤노블롯 검정 양성 (RIBA-양성) 또는 폴리메라아제 연쇄 반응 양성 (PCR 양성)

헤모글로빈 < 8.5 g/dL

백혈구 < 3000/mm³

혈소판 < 100,000/mm³

혈청 크레아티닌, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) > 정상 상한치 2배

연구자의 의견에서 환자를 연구에의 참여에 대해 허용되지 않는 위험에 놓이게 할 수 있는 임의의 다른 실험실 시험 결과

아바타셉트에 대한 선행 노출

임의의 임상시험용 약물에 대한 4주 이내 또는 5회 반감기 중 보다 긴 기간에 대한 노출

아자티오프린, 금, 레플루노미드, 면역흡착 칼럼, 미코페놀레이트 모페틸, 시클로스포린, 다른 칼시뉴린 억제제 또는 D-페니실라민을 현재 받고있음 (또는 지난 3개월에 받았음)

무작위화 ≤ 4주 전 근육내, 정맥내 또는 관절내 코르티코스테로이드

파트너가 가임 여성인 경우에 효과적인 산아 제한을 사용하지 않는 성적 활성 가임 남성

비자발적으로 감금된 죄수 또는 환자

정신 질환 또는 신체 질환의 치료를 위해 강제 구금됨

문맹자

연구 집단은 ≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절의 활성 임상 활막염과 ≤ 2년 동안의 지속성 증상; 질환 활성 점수 (DAS)28 (C-반응성 단백질 [CRP]) ≥ 3.2 및 항-시트룰린화 펩티드 (CCP)-2 항체 양성을 갖는 성인 (≥ 18세)을 포함하였다. 환자는 MTX 나이브이거나 또는 ≤ 4주 동안 MTX (≤ 10 mg/주)를 받고 등록 전 1개월 동안에는 MTX를 받지 않았다. 경구 코르티코스테로이드를 받은 환자는 개시 시에 안정한 용량 (≥ 4주 동안 ≤ 10 mg/일) 중이도록 요구되었고, 12개월까지 그 용량을 유지하도록 요구되었다.

12-개월 치료 기간에, 환자를 중앙 무작위화 시스템을 사용하여 기준선에서의 코르티코스테로이드 사용 (예/아니오)에 의해 계층화된 아바타셉트 (즉, CTLA4-Ig) + MTX, 아바타셉트 단독요법 또는 MTX로 무작위화 (1:1:1)하였다. SC 아바타셉트를 125 mg/주로 투여하였다. MTX를 7.5 mg/주로 개시하고, 6-8주 이내에 15-20 mg/주로 적정하였다 (불내성을 갖는 환자에서는 ≤ 10 mg/주가 허용됨). 모든 환자는 병용 폴산 요법을 받았다.

제12개월에 DAS28 (CRP) < 2.6을 갖는 환자는 모든 치료가 중지되는 12-개월 철회 기간에 진입할 수 있다: 직후 아바타셉트 및 1개월에 걸쳐 MTX 및 스테로이드 점감. DAS28 (CRP) ≥ 3.2를 갖는 환자는 중단되었다.

제15개월 후에, 하기: 제12개월에 비해 압통 및 종창 관철수의 배가, 제12개월로부터 DAS28 (CRP) ≥ 1.2의 증가, 또는 RA 급성악화라는 연구자의 판단 중 2가지로 정의되는 RA의 급성악화를 경험한 철회 기간에서의 환자는 개방 표지 SC 아바타셉트 125 mg + MTX를 사용하는 재-노출 기간에 진입하는데 적격이었다.

모든 환자는 기준선 및 6개월, 12개월, 18개월 및 24개월에 주요 이환 상지의 손목 및 손의 조영 자기 공명 영상화 (MRI)를 겪었다.

결과 측정

본 연구의 목적상, DAS-규정 완화는 DAS28 (CRP) < 2.6이었다. 공동-1차 종점은 다음과 같았다: 아바타셉트 + MTX 대 MTX에 대한 (i) 제12개월 및 (ii) 제12 및 제18개월에서의 DAS-규정 완화 상태에 있는 무작위화된 환자 및 치료된 환자의 비율.

2차 종점은 다음을 포함하였다: 아바타셉트 단독요법 대 MTX에 대한 (i) 제12개월 및 (ii) 제12 및 제18개월 둘 다에서의 DAS-규정 완화; 건강 평가 설문지-장애 지수 (HAQ-DI) 반응 (기준선으로부터의 ≥ 0.3점 감소); MRI에 의한 골염, 활막염 및 미란 점수; 안전성 및 내약성.

탐색적 종점은 다음을 포함하였다: 각각의 부문에서 다른 완화율 (단순 질환 활성 지수 [SDAI; ≤ 3.3], 임상 질환 활성 지수 [CDAI; ≤ 2.8] 및 불린 완화 [28개-관절 압통 관절수 ≤ 1 및 28개-관절 종창 관절수 ≤ 1 및 질환 활성에 대한 환자의 전반적 평가 [0-10 cm] ≤ 1 및 높은 감수성 CRP ≤ 1 mg/dL]), 미국 류마티스 학회 (ACR) 반응 및 주요 임상 반응 (임의의 기간에서 6개월 동안의 ACR 70 반응).

통계적 분석

부문당 116명 환자의 샘플 크기로, 제1 공동-1차 종점에 대해 22%의 예상 차이를 검출하기 위한 90% 검정력이 생성되었다. 이러한 검정력 추정치에 의해, 아바타셉트 + MTX 부문에서의 환자 중 60% 및 MTX 부문에서의 환자 중 38%가 제12개월에서 DAS-규정 완화 (DAS28 [CRP] < 2.6)를 달성할 것으로 가정되었다. 제1 공동-1차 종점을 달성하는데 조건부로, 부문당 116명 환자의 샘플 크기로, 제2 공동-1차 종점에 대해 22%의 예상 차이를 검출하기 위한 98% 검정력이 생성되었다. 이러한 검정력 추정치에 의해, 아바타셉트 + MTX 부문에서의 환자 중 30% 및 MTX 부문에서의 환자 중 8%가 제12 및 제18개월 둘 다에서 DAS-규정 완화 (DAS28 [CRP] < 2.6)를 달성할 것으로 가정되었다.

공동-1차 종점을 계층적 방식으로 시험하였다. 치료군, 기준선에서의 코르티코스테로이드 사용 (예/아니오) 및 기준선 DAS28 (CRP)에 대해 조정된 로지스틱 회귀를 사용하여 아바타셉트 + MTX 대 MTX에 대한 오즈비 (95% 신뢰 구간 [CI]을 가짐)를 계산하였고; 누락 기준선 DAS28 (CRP)을 갖는 환자는 포함시키지 않았다. 치료 또는 철회 기간를 완료하기 전에 중단된 모든 환자는 제12 또는 제18개월 분석을 위한 비-반응자로서 귀속시켰다.

종적 반복 측정 모델을 사용하여 모든 부문에 대한 기준선으로부터의 보정된 평균 MRI 변화 및 표준 오차를 계산하였다. 안전성 평가는 치료-의도 집단 (연구 의약의 ≥ 1회 용량을 받은 환자)에 기초하였다. 다른 2차 종점의 분석은 보충 정보에 기재되어 있다.

2차 및 탐색적 종점의 통계적 분석

시간 경과에 따른 질환 활성 점수 (DAS)-규정 완화, SDAI 완화, CDAI 완화, 불린 완화, ACR 20/50/70 반응 및 주요 임상 반응의 종점을 기술 통계학 (각각의 시점에서 95% 신뢰 구간을 가짐)을 사용하여 요약하였다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 완화 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 완화 사이에 발생한 경우에 완화로서 귀속시켰다. 조기 중단으로 인한 것이 아닌 및 치료 기간의 제1일 또는 철회 기간의 제169일에서의 것이 아닌 누락 ACR 반응 데이터는, 누락 값이 2개의 관찰된 ACR 반응 사이에 발생한 경우에 ACR 반응으로서 귀속시켰다.

사후 분석

각각의 치료 부문에 대해, 제12개월에서만 및 제12 및 제18개월 둘 다에서 DAS-규정 완화를 달성한 환자에 대한 평균 기준선 특징, 및 이들 특징에 기초하여 DAS-규정 완화를 달성한 환자의 비율에 관하여 사후 분석을 수행하였다. DAS28 (CRP)의 기준선으로부터의 평균 변화에 있어서 전체 치료 효과의 분석 (치료 기간의 제12개월까지의 데이터 포함)을 각각의 치료 부문에 대해 수행하였다. 전체 치료 효과 및 3개 부문 사이의 치료 차이를 치료의 고정 범주형 효과, 개월수 및 선행 코르티코스테로이드 사용, 뿐만 아니라 기준선 값의 연속 고정 공변량을 포함하는 종적 반복 측정 모델을 사용하여 획득하였다. 비구조화 공분산 매트릭스를 각각의 대상체 내에서의 반복 측정의 상관관계를 나타내는데 사용하였다.

결과

인구통계 및 기준선 특징

총 511명의 환자를 등록시키고, 전세계 72곳의 장소에서 351명의 환자를 치료에 무작위로 배정하였다 (아바타셉트 + MTX, n=119; 아바타셉트 단독요법, n=116; MTX, n=116) (도 3 참조).

하기 표 9에 기재된 바와 같이, 환자는 고도 염증성 질환 (평균 압통 관절수 23.3개, 종창 관절수 16.5개 및 CRP 17 mg/dL), 중증 질환 활성 (평균 DAS28 [CRP] 5.44 및 HAQ-DI 1.42) 및 불량한 예후 인자 (95.2% 류마티스 인자 및 항-CCP-2 이중 양성)를 갖는 초기 RA (평균 증상 지속기간 0.56년)를 가졌다.

<표 9>

인구통계 및 기준선 특징

플러스-마이너스 값은 평균 ± SD임. CRP = C-반응성 단백질, DAS = 질환 활성 점수, HAQ-DI = 건강 평가 설문지-장애 지수, MTX = 메토트렉세이트, RA = 류마티스 관절염, RF = 류마티스 인자, ROW = 나머지 세계, SD = 표준 편차, VAS = 시각 상사 척도

철회 기간에 진입하는 환자의 수는 아바타셉트 + MTX, 아바타셉트 단독요법 및 MTX 부문에서 각각 84명/119명 (70.6%), 66명/116명 (56.9%) 및 73명/116명 (62.9%)이었다.

징후 및 증상

치료 기간 동안 아바타셉트 + MTX 대 MTX

아바타셉트 + MTX는 제12개월에서 MTX에 비해 통계적으로 유의하게 더 높은 DAS-규정 완화율을 달성하였다 (70명/115명 [60.9%] 환자 대 52명/115명 [45.2%] 환자; 오즈비 [OR; 95% CI]:2.01 [1.18, 3.43], P=0.010). 제57일로부터 MTX에 비해 아바타셉트 + MTX 군에서 수치적으로 더 높은 DAS-규정 완화율이 관찰되었으며, 이는 치료 기간의 나머지 동안 시간 경과에 따라 유지되었다 (도 4A 참조). DAS28 (CRP)의 기준선으로부터의 변화에 있어서 12개월의 치료 기간에 걸친 전체 치료 효과에 관한 사후 분석은 아바타셉트 + MTX 대 MTX에 대한 추정된 치료 차이 (95% CI) -0.52 (-0.74, -0.30)를 입증하였다.

다른 완화 종점 (단순 질환 활성 지수 [SDAI], 임상 질환 활성 지수 [CDAI] 및 불린 완화 포함), 미국 류마티스 학회 (ACR) 반응 및 주요 임상 반응 (MCR)을 달성하는 환자의 비율은 시간 경과에 따라 MTX에 비해 아바타셉트 + MTX에서 수치적으로 더 컸다 (도 4A-D 및 도 5A-E 참조). 하기 표 10에 제시된 바와 같이, 제12개월에서의 HAQ-DI 반응률은 각각 65.5% 대 44.0%였다.

<표 10>

제12 및 제18개월에서 건강 평가 설문지-장애 지수 (HAQ-DI) 상의 반응을 갖는 환자의 비율.^*

^* 값은 명 (%) (95% CI)임.

CI = 신뢰 구간; MTX = 메토트렉세이트.

치료 기간 동안 아바타셉트 단독요법 대 MTX

아바타셉트 단독요법은 제12개월에서 MTX와 비교하여 DAS-규정 완화를 달성하는 환자의 비율이 보다 작았다 (48명/113명 [42.5%] 대 52명/115명 [45.2%]). 그러나, 시간 경과에 따라, DAS-규정 완화율은 대부분의 다른 시점에서 아바타셉트 단독요법에 대해 수치적으로 더 높았다 (도 4A 참조). 실제로, 사후 분석에 의해 결정된 바와 같이, DAS28 (CRP)의 기준선으로부터의 변화에 있어서 아바타셉트 단독요법 대 MTX 사이의 전체 추정 치료 차이 (95% CI)는 -0.26 (-0.11, -0.48)이었다. 추가로, 아바타셉트 단독요법은 시간 경과에 따라 MTX에 비해 수치적으로 더 높은 비율의 CDAI, SDAI, 불린 완화 및 ACR20/50/70 및 MCR 비율 (도 4A-D 및 도 5A-E) 및 HAQ-DI (상기 표 10)를 입증하였다.

철회 기간 동안 아바타셉트 + MTX 및 아바타셉트 단독요법 대 MTX

아바타셉트 + MTX는 제12 및 제18개월 둘 다에서 MTX에 비해 통계적으로 유의하게 더 높은 DAS-규정 완화율을 달성하였다 (17명/115명 [14.8%] 환자 대 9명/115명 [7.8%] 환자; OR [95% CI]: 2.51 [1.02, 6.18], P=0.045). 제12 및 제18개월 둘 다에서 DAS-규정 완화를 달성하는 환자의 비율은 아바타셉트 단독요법 및 MTX 군에 대해 각각 14명/113명 (12.4%) 대 9명/115명 (7.8%)이었다 (기준선에서 이용가능한 DAS28 (CRP)을 갖는 환자만을 분석에 포함시켰음).

철회 기간에 진입한 환자 중에서, 각각의 치료군 내 73명, 50명 및 53명 환자가 제12개월에서 DAS-규정 완화 상태에 있었다. 이들 중에서, 18명/73명 (24.7%), 14명/50명 (28%) 및 9명/53명 (16.9%)은 제18개월에서 DAS-규정 완화 상태로 남아있었다 (도 6 참조).

하기 표 11에 제시된 사후 분석은, 아바타셉트 치료 부문 둘 다에서, 치료 철회 후 지속적 DAS-규정 완화를 갖는 환자의 비율이 보다 낮은 기준선 DAS28 (CRP), HAQ-DI 및 보다 짧은 증상 지속기간을 갖는 환자에서 수치적으로 보다 높다는 것을 나타냈으며; 이것은 MTX 부문에서는 그렇지 않았다.

<표 11>

기준선 특징 하위군에 의한 제12 및 제18개월 둘 다에서의 DAS-규정 완화 (DAS28 [CRP] < 2.6)를 갖는 환자의 비율 (사후 분석)

CRP = C-반응성 단백질, DAS = 질환 활성 점수, HAQ-DI = 건강 평가 설문지-장애 지수, MTX = 메토트렉세이트, Q = 사분위수, VAS = 시각 상사 척도

유사하게, 하기 표 12에 제시된 바와 같이, 상기 제12 및 제18개월에서의 DAS-규정 완화와 연관된 기준선 인자는 또한 아바타셉트 부문에서도 제12개월에서의 DAS-규정 완화와 연관된 기준선 인자로서 확인되었다.

<표 12>

제12개월에서의 완화의 달성 후 제18개월에서의 무약물 DAS-규정 완화 (DAS28 [CRP] < 2.6)를 갖거나 갖지 않는 환자의 기준선 특징 (사후 분석)

CRP = C-반응성 단백질, DAS = 질환 활성 점수, HAQ-DI = 건강 평가 설문지-장애 지수, MRI = 자기 공명 영상화, MTX = 메토트렉세이트, VAS = 시각 상사 척도

아바타셉트를 받은 환자는 또한 치료 기간 동안 MTX를 받은 환자보다 DAS28 (CRP) < 2.6을 갖는 시간이 보다 많았다 (아바타셉트 + MTX의 경우 10.2개월 대 8.1개월; 아바타셉트 단독요법의 경우 8.9개월 대 6.6개월; MTX의 경우 5.8개월 대 5.7개월).

구조적 손상에 대한 효과

각각의 치료군에서 MRI에 의해 측정된 방사선촬영 변화는 임상 효능 결과와 일치하였다. 아바타셉트 + MTX 및 아바타셉트 단독요법은 활막염 및 골염 점수에 있어서 기준선으로부터 수치적으로 보다 큰 감소를 가져왔고, 아바타셉트 + MTX는 제12개월에서 MTX보다 미란 점수의 더 적은 진행을 가져왔다 (도 7A-C 참조).

논의

AVERT에서, 환자는 고도 활성 질환 및 불량한 예후 마커를 가졌고; 환자 중 95%는 관절 손상 및 질환 진행의 가능성 증진과 연관된 조합인 항-CCP-2 양성 및 류마티스 인자 양성이었다 (Goronzy, J.J. et al., "Prognostic markers of radiographic progression in early rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 50:43-54 (2004); Kroot, E.J. et al., "The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 43:1831-1835 (2000)). 아바타셉트 + MTX는 완화 및 HAQ-DI의 다중 측정에 의해 입증된 바와 같이 MTX에 비해 강건한 효능 및 일치하는 구조적 이익을 달성하였다. 관절수가 주관적일 수 있고 매월 변동성이 분명하였지만, MRI 결과는 임상 종점을 지지하면서 비교 효능의 객관적 척도를 제공한다.

AVERT는 많은 환자가 MTX를 용인할 수 없기 때문에 관심을 갖게 된 아바타셉트 단독요법을 평가하는 대규모 데이터세트를 제공한다: 환자 중 대략 30%가 단독요법으로서 생물제제를 받는다 (Emery, P. et al., "Biologic and oral disease-modifying antirheumatic drug monotherapy in rheumatoid arthritis", Ann. Rheum. Dis., 72:1897-1904 (2013)). 아바타셉트를 받은 유사한 수의 환자가 제12개월에서 MTX에 비해 DAS-규정 완화를 달성하였으나, 전체 데이터는 아바타셉트 단독요법이 MTX와 비교하여 수치적으로 더 높은 이익을 가졌다는 것을 제시하였다. 아바타셉트 단독요법에 대한 MRI 소견은 또한 제12개월에서 MTX 단독과 비교하여 골염 및 활막염에 대한 수치적으로 더 큰 이익을 입증하였다.

모든 요법의 철회 후에, 적지만 유의한 수의 환자가 MTX 단독과 비교하여 아바타셉트 + MTX를 사용한 선행 치료 후에 무약물 완화를 지속하였다. 데이터는, 아바타셉트 + MTX 치료를 사용한 경우에, 4명의 환자 중 1명이 6개월 내내 무약물 완화를 유지할 수 있었다는 것을 나타낸다. 이러한 효과는 평가가 모든 치료의 철회 후 6개월까지 (> 5회 반감기) 수행되었기 때문에 아바타셉트의 반감기 (14.3일)의 결과는 아니다. 더욱이, 무약물 완화를 지속한 환자의 사후 분석은 보다 짧은 증상 지속기간 및 기준선에서의 보다 낮은 질환 활성 또는 치료 철회 전 보다 긴 지속적 DAS-규정 완화를 갖는 환자가 무약물 완화를 유지할 가능성이 보다 많다는 것을 시사한다. 이들 연관성은 구체적으로 두 아바타셉트 부문에서 관찰되었으며, 이는 생물학적 효과에 원인이 있다는 것을 시사한다.

DAS-규정 완화 컷오프 < 2.6은, RA의 임상 완화에 대한 미국 류마티스 학회 정의에 상응하지만 (Fransen, J. et al., "Remission in rheumatoid arthritis: agreement of the disease activity score (DAS28) with the ARA preliminary remission criteria", Rheumatology (Oxford), 43:1252-1255 (2004)), 현재 다른 완화 척도 (Felson, D.T. et al., "American College of Rheumatology/European League against Rheumatism provisional definition of remission in rheumatoid arthritis for clinical trials", Ann. Rheum. Dis., 70:404-413 (2011)); 예컨대 여기에 또한 보고된 SDAI 및 불린에 의해 대체되었다. 컷오프는 적혈구 침강 속도 (ESR)에 기초하고, CRP 컷오프는 아직 정의되지 않았다.

AVERT에서, CRP는 연구 기관에 걸친 급성기 반응물 및 보조 표준화의 변동성을 감소시키기 위해 ESR과 상호교환되었다. 데이터는 활성 질환 및 불량한 예후 인자를 갖는 초기 RA를 갖는 환자로부터 획득되며, 이는 전체 RA 집단으로의 일반화가능성을 제한한다. 철회 분석은 철회 기간에 남아있는 소수의 환자에 의해 제한되었다. RA 의약의 점진적 점감은 AVERT에 적용된 모든 RA 요법의 급속한 철회보다 더 높은 완화율을 가져올 수 있으며 다른 시험에서 평가될 것이다.

결론적으로, AVERT는 초기 RA 집단에서 MTX와 조합된 아바타셉트 치료의 이익을 확립하고, 초기 RA에서 무약물 완화가 아바타셉트를 사용한 치료 후에 가능할 수 있다는 것을 시사한다. 모든 RA 요법의 철회 후에 신규 지속적 완화 달성은 자가면역 과정에 대한 아바타셉트의 메카니즘의 기저 효과를 시사한다. 철회 치료 전략은 RA의 장기간 치료에 있어서 환자 및 의사에게 매우 바람직한 목표이다. 완화로의 치료는 현재 RA 요법의 널리 허용되는 목표이다.

SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> METHOD OF ACHIEVING DRUG-FREE REMISSION IN SUBJECTS WITH EARLY RA <130> 12343-WO-PCT <150> US 61/984,287 <151> 2014-04-25 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1152 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PRIMER-CTLA4Ig <400> 1 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE-CTLA4Ig <400> 2 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

Claims

i) 초기 류마티스 관절염 (RA)을 갖는 대상체에게 류마티스 관절염에 대한 질환 활성 점수 계산표 (DAS)-규정 완화가 달성될 때까지 유효량의 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계, 및
ii) 모든 RA 요법을 철회하는 단계
를 포함하며, 여기서 CTLA4 분자는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 위치 26에서 알라닌 또는 위치 27에서 메티오닌으로 시작하고 위치 150에서 아스파르트산으로 종료되는 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 것인,
초기 류마티스 관절염 (RA)을 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하기 위한 방법.
제1항에 있어서, CTLA4 분자의 용해도 또는 친화도를 변경시키는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 용해도 또는 친화도를 변경시키는 아미노산 서열이 이뮤노글로불린을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 이뮤노글로불린이 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분인 방법.
제4항에 있어서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분이 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분이 인간 또는 원숭이 이뮤노글로불린 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그의 부분이 인간 또는 원숭이 이뮤노글로불린 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 방법.
i) 초기 류마티스 관절염을 갖는 대상체에게 DAS-규정 완화가 달성될 때까지 서열식별번호: 2의 위치 27에서 메티오닌 또는 위치 26에서 알라닌으로 시작하고 위치 383에서 리신으로 종료되는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계, 및
ii) 모든 RA 요법을 철회하는 단계
를 포함하는, 초기 류마티스 관절염을 갖는 대상체에서 무약물 완화를 달성하기 위한 방법.
제1항 또는 제8항에 있어서, DAS-규정 완화가 12개월의 치료 후에 DAS28 (C-반응성 단백질[CRP])이 2.6 미만인 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제1항 또는 제8항에 있어서, CTLA4 제약 조성물이 125 mg/주로 피하로 투여되는 피하 제제인 방법.
제1항 또는 제8항에 있어서, 초기 RA가 ≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절의 활성 임상 활막염, DAS28 (CRP) ≥ 3.2 및 항-시트룰린화 펩티드 (CCP)-2 항체 양성을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
≥ 8주 동안 ≥ 2개 관절의 활성 임상 활막염, DAS28 (CRP) ≥ 3.2 및 항-시트룰린화 펩티드 (CCP)-2 항체 양성을 갖는 대상체를 선택하는 것을 포함하는, CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 사용한 치료 후에 무약물 완화를 달성할 가능성이 있는 초기 RA를 갖는 대상체를 확인하는 방법.
i) 초기 RA를 갖는 대상체에게 DAS-규정 완화가 달성될 때까지 유효량의 CTLA4 분자 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계, 및
ii) 모든 RA 요법을 철회하는 단계
를 포함하며, 여기서 CTLA4 분자는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 위치 26에서 알라닌 또는 위치 27에서 메티오닌으로 시작하고 위치 150에서 아스파르트산으로 종료되는 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 것인,
초기 RA를 갖는 대상체에서 구조적 손상을 억제하는 방법.
제13항에 있어서, 구조적 손상이 손목 및 손의 미란, 골염 및/또는 활막염 점수화에 의해 평가되는 것인 방법.