ES2342539T3 - Proceso para la purificacion de proteinas en una fraccion de flujo-directo de cromatografia de interaccion hidrofobica. - Google Patents

Abstract

Un proceso para separar una proteína diana a partir de una mezcla que contiene la proteína diana y los contaminantes, que comprende: a) el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal a un pH de al menos 5.5, en condiciones que permiten que los contaminantes se unan al adsorbente y que la proteína diana pase a través del adsorbente en una fracción flujo directo sin unirse al adsorbente hidrofóbico; y b) la recolección de la fracción flujo directo de la mezcla que contiene la proteína diana que no se une al adsorbente hidrofóbico.

Description

Proceso para la purificación de proteínas en una fracción de flujo-directo de cromatografía de interacción hidrofóbica.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con la purificación de proteínas utilizando la cromatografía de interacción hidrofóbica.

Antecedentes

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), es un método de separación de proteínas basado en la fuerza de sus interacciones hidrofóbicas relativas con un adsorbente hidrofóbico. La hidrofobicidad generalmente se define como la repulsión entre un compuesto no-polar y un ambiente polar, tal como el agua.

Las "interacciones" hidrofóbicas son esencialmente la tendencia de un ambiente polar a excluir los compuestos no-polares (i.e., hidrofóbicos) del ambiente polar y la fuerza de agregación del hidrófobo entre ellos mismos. El fenómeno de las interacciones hidrofóbicas se aplica a la separación de proteínas, mediante el uso de una solución acuosa de sal, para forzar una proteína hidrofóbica en una muestra a agregarse con o unirse adsortivamente a los grupos funcionales hidrofóbicos (el adsorbente) fijados a un soporte sólido. Las proteínas adsorbidas se liberan del adsorbente mediante la elución con menores concentraciones de sal, invirtiendo el ambiente que promueve las interacciones hidrofóbicas, lo que conduce a la pérdida de interacciones hidrofóbicas entre las proteínas y el soporte y la liberación de la proteína del soporte con el fin de aumentar la hidrofobicidad (con las proteínas hidrofóbicas menos considerables siendo liberadas primero).

Las proteínas recombinantes, por lo general contienen una variedad de impurezas que necesitan que se eliminen antes de que el producto sea farmacéuticamente aceptable. Algunas de estas impurezas pueden incluir proteínas de células huésped (HCPs) a partir del sistema de célula huésped en el cual se expresan. Para un sistema CHO, estas impurezas se denominan como Proteínas de Células Huésped CHO (CHOP). Además a estas impurezas, la proteína según se expresa durante el cultivo celular, también puede contener formas variantes de la proteína del producto, por ejemplo, una forma plegada incorrectamente de la proteína diana. Otras impurezas se pueden adicionar al flujo del producto o generar como un resultado del proceso de purificación, tal como agregados de peso molecular más alto de la proteína o la Proteína A lixiviada. Estas impurezas tienen un amplio rango de retenciones en diferentes tipos de cromatografía y la eliminación de dicho amplio espectro de impurezas es difícil, por lo general se necesitan múltiples etapas que involucran diferentes tipos de cromatografía.

La HIC se puede utilizar para separar proteínas empleando dos diferentes metodologías. En la primera metodología de HIC, denominada como el modo de "enlace y eluido", la mezcla que contiene la proteína diana se pone en contacto con el adsorbente hidrofóbico bajo condiciones donde la proteína diana se une al adsorbente, mientras que los contaminantes (o la mayor cantidad de contaminantes como sea posible) no se unen y fluyen completamente. En el modo "enlace y eluido", la proteína se puede recuperar aplicando al complejo proteína/adsorbente una concentración de sal aplicada en un gradiente gradual o reducido de manera escalonada, para liberar selectivamente las diferentes proteínas unidas y los contaminantes y recolectando las fracciones discretas hasta que se obtiene la fracción que contiene la proteína más purificada. En un proceso donde una proteína diana se une a la columna (mientras se permite que los contaminantes fluyan completamente), los adsorbentes que tienen mayor hidrofobicidad se utilizan generalmente para unir un amplio rango de proteínas que serán recolectadas en una fracción específica, se liberan a una concentración de sal en el curso de la aplicación del gradiente de sal. En la segunda metodología de HIC, se denomina como el modo "flujo directo", la mezcla que contiene la proteína diana se pone en contacto con el adsorbente hidrofóbico donde los contaminantes (o la mayor cantidad de contaminantes como sea posible) se unen al adsorbente, mientras que la proteína diana (y tan pocos contaminantes como sea posible) no se unen y fluyen completamente. En este modo, el uso de adsorbentes menos hidrofóbicos, tales como aquellos que tienen grupos alquilo de menor peso molecular, se prefieren, dado que una menor capacidad de enlace se necesita para las condiciones bajo las cuales la proteína diana no se une. Como se debería esperar, sin embargo, el uso de HIC en el modo flujo directo, ha sido de utilidad limitada debido a que las condiciones necesarias para permitir que la proteína diana fluya completamente, intrínsecamente resultan en una menor capacidad de enlace, lo que conduce a una eliminación temprana de la proteína diana, o a la eliminación de la proteína diana junto con los contaminantes.

Mientras que diferentes modalidades de cromatografía se pueden emplear para eliminar una clase particular de impurezas, muy pocas etapas cromatográficas son capaces de eliminar todas estas impurezas a partir de un producto. De esta manera, existe la necesidad de un proceso de purificación que se pueda emplear genéricamente para la eliminación de estas impurezas de una proteína recombinante.

Divulgación de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que la cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados, tales como grupos alquilo ramificados, es altamente selectiva en el enlace de los contaminantes de proteína, mientras que la proteína diana no se une, permitiendo así que la proteína diana se recupere en la fracción flujo directo. El uso de HIC en flujo directo se ha encontrado que es sorprendentemente eficiente, dando lugar a una significantemente mayor recuperación de la proteína diana en una única etapa, de esta manera, simplificando y mejorando la eficiencia y el costo del proceso de purificación de proteínas.

La presente invención incluye un proceso para separar una proteína diana (tal como una proteína recombinante producida en un cultivo celular) a partir de una mezcla que contiene la proteína diana y los contaminantes que comprenden: el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales de hidrocarburos ramificados en una solución acuosa de sal, y la recolección de la porción de la mezcla que no se une al adsorbente hidrofóbico, que contiene la proteína diana.

Una modalidad de la presente invención incluye un proceso para separar una proteína diana de una mezcla que contiene la proteína diana y los contaminantes, que comprende:

a) el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal a un pH de al menos 5.5, bajo condiciones que permiten que los contaminantes se unan al adsorbente y la proteína diana pase a través del adsorbente en una fracción flujo directo sin unirse al adsorbente hidrofóbico; y

b) la recolección de la fracción flujo directo de la mezcla que contiene la proteína diana que no se une al adsorbente hidrofóbico.

En otra modalidad, la presente invención incluye un proceso para la separación de una proteína recombinante, producida como un producto de la expresión de cultivo celular en una célula huésped, a partir de una mezcla que contiene la proteína y los contaminantes del cultivo celular que comprende: el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal, y la recolección de la porción de la mezcla que no se une al adsorbente hidrofóbico, la cual contiene la proteína diana.

En otra modalidad, la presente invención incluye un proceso para separar una proteína de fusión F_{C} recombinante, producida como un producto de la expresión del cultivo celular en una célula huésped, a partir de una mezcla que contiene la proteína y los contaminantes del cultivo celular, que comprende: el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal, y la recolección de la porción de la mezcla que no se une al adsorbente hidrofóbico, la cual contiene la proteína diana.

En incluso otra modalidad, la presente invención incluye un proceso de separación de una proteína diana recombinante, producida como un producto de la expresión de cultivo celular en una célula huésped, a partir de una mezcla que contiene la proteína y los contaminantes, que comprende: la preparación de una columna de cromatografía que tiene un soporte que comprende grupos funcionales alquilo ramificados hidrofóbicos, en donde los grupos funcionales alquilo ramificados tienen de 4 a 8 átomos de carbono, al menos uno de los cuales es un átomo de carbono terciario, la preparación de la mezcla en una solución acuosa que tiene una concentración de sal tal que los contaminantes se unen a la columna mientras que la proteína diana en la mezcla no se une a la columna; el contacto de la mezcla con la columna; y la recolección a partir de la columna de la porción de la mezcla que no se une a la columna, la cual contiene la proteína diana recombinante.

Un proceso para eliminar una variante plegada incorrectamente de una proteína diana recombinante a partir de una mezcla que contiene variantes plegadas correctamente y variantes plegadas incorrectamente de la proteína diana, que comprende el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal; y la recolección de la porción de la mezcla que no se une al adsorbente hidrofóbico, que contiene la variante plegada correctamente de la proteína diana.

Un proceso para eliminar la proteína A de una mezcla que contiene una proteína diana y la proteína A, que comprende; el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal; y la recolección de la porción de la mezcla que no se une al adsorbente, la cual contiene la proteína diana.

En otras modalidades de la presente invención, el adsorbente hidrofóbico comprende un grupo funcional alquilo ramificado. En otra modalidad, el grupo funcional alquilo ramificado tiene de 3 a 8 átomos de carbono, y más preferiblemente de 4 a 6 átomos de carbono. En otra modalidad, el grupo funcional alquilo ramificado contiene un átomo sec-carbono, un ter-carbono o un neo-carbono. En otra modalidad, el grupo funcional alquilo se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de sec-butilo, ter-butilo, ter-pentilo, y neopentilo. En otra modalidad, el grupo funcional alquilo ramificado es el ter-butilo.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un cromatograma que muestra la purificación de IL1R-II en la etapa de flujo directo en una resina HIC t-butilo Macroprep.

Figura 2 es un gel de SDS-PAGE, que muestra las fracciones de carga y flujo directo de la figura 1. La senda 1 muestra los estándares de peso molecular, la senda 2 muestra la carga de HIC, y la senda 3 muestra el flujo directo de HIC.

Figura 3 es un cromatograma que muestra la purificación de RANK:F_{C} en la etapa de flujo directo en la resina de HIC t-butilo Macroprep.

Figura 4 es una serie de gráficas que compara la carga de HIC con la mezcla de flujo directo, mediante varios métodos analíticos incluyendo cromatografía de permeación sobre gel (SEC) (Figura 4a), ELISA Proteína A lixiviada (Figura 4b), HIC (Figura 4c) y ELISA de fCHOP (Figura 4d).

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Mejor modo(s) para llevar a cabo la invención Definiciones

Adsorbente: Un adsorbente tiene al menos una molécula fijada a un soporte sólido, o al menos una molécula que es, por si misma, un sólido, que se utiliza para realizar una cromatografía, tal como cromatografía de interacción hidrofóbica. En el contexto de la cromatografía de interacción hidrofóbica, el adsorbente es un grupo funcional hidrofóbico.

Cromatografía de interacción hidrofóbica o HIC: La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), es la cromatografía que utiliza interacciones hidrofóbicas reversibles específicas entre las biomoléculas en una solución acuosa de sal como una base para la separación de proteínas. En la práctica, HIC involucra el uso de un adsorbente, tal como un grupo funcional de hidrocarburo aromático o alifático hidrofóbico fijado a un soporte sólido, para separar cromatográficamente, moléculas que se unen al adsorbente, de aquellas proteínas que no se unen.

Anticuerpo: Un anticuerpo es una proteína o complejo de proteínas, cada uno de los cuales comprende al menos un dominio de inmunoglobulina del anticuerpo variable y al menos un dominio de inmunoglobulina del anticuerpo constante. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos diméricos, o algún complejo de orden superior de proteínas que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos heterodiméricos.

Cromatografía: La cromatografía es la separación de moléculas diferentes químicamente en una mezcla de la una con la otra, mediante el contacto de la mezcla con un adsorbente, en donde una clase de moléculas se une reversiblemente o se adsorbe en el adsorbente. Las moléculas que están menos fuertemente adsorbidas o retenidas por el adsorbente se liberan del adsorbente bajo condiciones donde aquellas más fuertemente adsorbidas o retenidas no lo están.

Dominio de inmunoglobulina del anticuerpo constante: Un dominio de inmunoglobulina del anticuerpo constante es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a o sustancialmente similar a un dominio C_{L}, C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, o C_{H}4 de origen humano o animal. Ver por ejemplo, Charles A Hasemann and J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, 209,210-218 (1989).

Contaminante: Un contaminante es cualquier molécula extraña u objetable, particularmente una macromolécula biológica tal como un ADN, un ARN, o una proteína, diferente de la proteína que se va a purificar, que está presente en una muestra de una proteína que se va a purificar. Los contaminantes incluyen, por ejemplo, otras proteínas de la célula huésped de las células empleadas para expresar recombinantemente la proteína que se va a purificar, las proteínas que son parte de un absorbente utilizado en una etapa de cromatografía de afinidad que se puede filtrar en una muestra durante una etapa previa de cromatografía de afinidad, tal como proteína A, y las variantes plegadas incorrectamente de la proteína diana por sí misma.

F_{C}: F_{C} se refiere a la porción F_{C} de un anticuerpo, e incluye dominios de inmunoglobulina animal o humana C_{H}2 y C_{H}3 o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de una porción F_{C} de un anticuerpo con el propósito de determinar la sustancial similitud, es la capacidad de ser unido por una segunda proteína que se une a las porciones F_{C} que ocurren naturalmente de anticuerpos, tales como Proteína A o Proteína G. Para una discusión, ver Hasemann and Capra, supra, en 212-213.

Proteínas de célula huésped: Las proteínas de célula huésped son proteínas codificadas por el genoma que ocurre naturalmente de una célula huésped en la cual el ADN que codifica una proteína que se va a purificar se introduce. Las proteínas de célula huésped pueden tener contaminantes de la proteína que se va a purificar, los niveles de estos pueden ser reducidos por purificación. Las proteínas de la célula huésped se pueden analizar mediante cualquier método apropiado, incluyendo electroforesis en gel y tinción y/o ensayo de ELISA, entre otros. Las proteínas de célula huésped incluyen, por ejemplo, proteínas de ovario de Hámster Chino (CHO) (CHOP), producidas como un producto de expresión de las proteínas recombinantes.

IL1RII: IL1R.II se refiere al receptor de la Interleucina-I (Célula B) del Tipo II, descrito en U.S. Patent Nos. 6,521,740; 5,464,937; y 5,350,683.

Polipéptido: Para los propósitos de la invención, "polipéptido" se utiliza intercambiablemente con "proteína".

Proteína: Una proteína es cualquier cadena de al menos cinco aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

Proteína A: Una proteína A es una proteína descubierta originalmente en la pared celular del Stapphylococcus que se une específicamente a una porción F_{C} del anticuerpo de IgG. Para propósitos de la invención, "Proteína A" es cualquier proteína idéntica o sustancialmente similar a la Proteína A de Stapphylococcal, incluyendo las disponibles comercialmente y/o las formas recombinantes de la Proteína A. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de la proteína A, con el fin de determinar la similitud sustancial, es la capacidad de unirse a una porción F_{C} del anticuerpo de IgG.

Purificación: Purificar una proteína significa reducir las cantidades de elementos extraños u objetables, especialmente macromoléculas biológicas tales como proteínas o ADN, que pueden estar presentes en una muestra de la proteína. La presencia de proteínas extrañas se puede analizar, mediante cualquier método apropiado incluyendo electroforesis en gel y ensayos de tinción y/o de ELISA. La presencia de ADN se puede analizar, mediante cualquier método apropiado incluyendo electroforesis en gel y tinción y/o ensayos que emplean la reacción de la cadena de la polimerasa.

Proteína de fusión recombinante: Una proteína de fusión recombinante es cualquier proteína que comprende parte o toda de dos o más proteínas que no se fusionan en su estado natural. Ejemplos de dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a, activador del receptor humano de NF-KappaB fusionado a una porción F_{C} de un anticuerpo (huRANK:F_{C}), quinasa-delta célula endotelial de tunica interna fusionada a una porción F_{C} de un anticuerpo (TEKdelta:F_{C}), y el receptor del factor de necrosis tumoral fusionado a una porción F_{C} de un anticuerpo (TNFR:F_{C}).

RANK: "RANK" se refiere a un activador del receptor de las proteínas Kappa \beta NF, que comprende las secuencias de aminoácidos que son idénticas o sustancialmente similares a la secuencia de un RANK nativo. La actividad biológica para los propósitos de determinación de la similitud sustancial significa la capacidad de unir un ligando Rank (RANK-L), para transducir una señal biológica iniciada por el enlace de RANK-L a una célula, o reaccionar en cruz con los anticuerpos anti-RANK creados contra RANK a partir de fuentes naturales (i.e., no-recombinante). Una proteína RANK puede ser de cualquier RANK de mamífero, incluyendo proteínas murina o RANK humana, Tales proteínas RANK se describen en U.S. Patent Nos. 6,017,729; 6,562,948; y 6,271,349.

RANK:F_{C}: RANK:F_{C} es una proteína de fusión recombinante que comprende todo o parte de un dominio extracelular de un RANK fusionado a una región F_{C} de un anticuerpo, como se describe en U.S. Patent Nos. 6,017,729; 6,562,948; y 6,271,349.

Separar o Eliminar: una proteína se separa (o elimina) de una mezcla que comprende la proteína y otros contaminantes cuando la mezcla se somete a un proceso, de tal manera que la concentración de la proteína diana es mayor en el producto resultante que en el producto inicial.

TNFR: "TNRF" se refiere a las proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas o similares sustancialmente a la secuencia de un receptor del factor de necrosis tumoral nativo (TNFR). La actividad biológica con el fin de determinar la sustancial similitud significa, la capacidad de unir el factor de necrosis tumoral (TNF), para transducir una señal biológica iniciada por el enlace de TNF a una célula, o reaccionar en cruz con anticuerpos anti-TNFR creados contra TNFR a partir de fuentes naturales (i.e, no-recombinante). Un TNFR puede ser cualquier TNFR de mamífero, incluyendo TNFRs murina o humano. Dichos TNFRs se describen en U.S. Patent No. 5,395,760 y en U.S. Patent No. 5,610.279. Un TNFR particularmente preferido es aquel descrito en U.S. Patent No. 5,395,760, el cual tiene un peso molecular aparente por SDS-PAGE de aproximadamente 80 kilodaltons en su forma glicosilada.

TNRF: F_{C}: TNFR: F_{C} es una proteína de fusión recombinante que comprende todo o parte de un dominio extracelular de un TNFR fusionado a una región F_{C} de un anticuerpo. Dicho dominio extracelular incluye, pero no se limita a, las secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a los aminoácidos 1-163, 1-185, o 1-235 de la Figura 2A de U.S. Patent No-5,395,760.

Dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable: Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o sustancialmente similar a un dominio VL o VH de origen humano o animal. Para los propósitos de la invención, la actividad biológica de un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable con el fin de determinar la sustancial similitud es un enlace de antígeno.

Descripción del Proceso

El proceso de purificación de una proteína frecuentemente requiere de numerosas etapas, con cada etapa resultando en una mayor reducción en la producción. La cromatografía de interacción hidrofóbica es una de las técnicas más comúnmente utilizadas. La purificación de la proteína por HIC se puede realizar en una columna que contiene un medio hidrofóbico (por lo general una columna empacada con un soporte del copolímero de metacrilato o perlas de agarosa, al cual se fija un adsorbente que consiste de grupos funcionales levemente hidrofóbicos, tales como grupos hidrocarburo arilo, o alquilo pequeños). La columna se equilibra con una solución reguladora a una concentración alta de sal y una muestra que contiene una mezcla de proteínas (la proteína diana, más proteínas contaminantes) en una solución de sal alta no-desnaturalizante compatible, se carga en la columna. Como la mezcla pasa a través de la columna, la proteína diana se une al adsorbente dentro de la columna, mientras que los contaminantes no unidos fluyen completamente. A continuación, la proteína unida se eluye de la columna con una menor concentración de sal. Por lo general, la proteína diana se puede recuperar mediante la elución de la columna con una concentración de sal aplicada en un gradiente reducido escalonado o gradual, para liberar selectivamente las diferentes proteínas unidas a la particular concentración de sal, propicia para su liberación, y la recolección de fracciones discretas hasta que la fracción que contiene la proteína más purificada se obtiene. Mediante la recolección de las fracciones flujo directo durante periodos de tiempo discretos, las fracciones que contienen proteínas específicas se pueden aislar. En un proceso donde una proteína diana se une a la columna (mientras que se deja que los contaminantes fluyan a través), los adsorbentes que tienen mayor hidrofobicidad se utilizan generalmente para unir un amplio rango de proteínas que será recolecto en una fracción específica propicia para la liberación de la proteína. Los adsorbentes menos hidrofóbicos, tales como aquellos que tienen grupos alquilo de menor peso molecular, han sido de eficacia limitada porque la resina generalmente muestra menores capacidades de enlace que conducen a la eliminación temprana en selecciones de resinas para HIC.

La presente invención se relaciona con un proceso de separación de una proteína diana a partir de una mezcla que comprende la proteína diana y los contaminantes, utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), En contraste a la metodología de unión y elución descrita anteriormente, no obstante, la presente invención aplica HIC en un modo flujo directo, para separar la proteína diana, mediante el enlace de las proteínas contaminantes (diferentes de la proteína diana) al soporte cromatográfico, y la recolección de la proteína diana purificada en la fracción flujo directo sin unir. De esta manera, la presente invención contempla que las condiciones de HIC serán tales que las proteínas contaminantes se unen al soporte cromatográfico, mientras que la proteína diana no se une. La separación de la proteína diana en la fracción flujo directo simplifica en gran medida el proceso de separación. En el modo flujo directo, HIC puede ser operada bajo mayores capacidades de carga, ya que solamente las impurezas se unen en la resina y el producto fluye a través. Adicionalmente, el modo flujo directo de HIC permite el uso de menores concentraciones de sal, dado que las proteínas de interés, de baja o moderadamente hidrofobicidad eluyen preferencialmente a las citadas menores concentraciones de sal.

El proceso de la invención puede, por supuesto, ser utilizado en combinación con otras metodologías de purificación de proteínas, tales como precipitación de sal, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía líquida de alta presión, cromatografía de intercambio iónico, o cualquier otra técnica de purificación de proteínas de uso común. Se contempla, sin embargo, que el proceso de la presente invención eliminará o reducirá significantemente la necesidad de otras etapas de purificación.

Cualquiera o todas las etapas de cromatografía de la presente invención se llevaran a cabo mediante cualquier medio mecánico. La cromatografía se puede realizar, por ejemplo, en una columna. La columna se puede correr con o sin presión y de la parte superior a la base o de la base a la parte superior. La dirección del flujo del fluido en la columna puede ser reversa durante el proceso de cromatografía. La cromatografía también se puede llevar a cabo utilizando un proceso interrumpido en el cual el medio sólido se separa del líquido utilizado para la carga, lavado, y eluir la muestra por cualquier medio apropiado, incluyendo gravedad, centrifugación, o filtración. La cromatografía también se puede llevar a cabo mediante el contacto de la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moléculas en la muestra más fuertemente que las otras. En la siguiente descripción, las diferentes modalidades de la presente invención se describen en el contexto de cromatografía llevada a cabo en una columna. Se entiende, sin embargo, que el uso de una columna es solamente una de las diversas modalidades cromatográficas que pueden ser utilizadas, y la ilustración de la presente invención utilizando una columna no limita la aplicación de la presente invención a cromatografía de columna, como alguien de habilidad en el oficio, puede fácilmente aplicar las instrucciones a otras modalidades así como aquellas que utilizan un proceso interrumpido o filtro.

La presente invención se relaciona con un proceso de separación de proteínas basándose en su capacidad para unirse selectivamente a un medio de cromatografía hidrofóbico. El medio de cromatografía hidrofóbico está compuesto de un soporte sólido al cual se fija un adsorbente hidrofóbico que comprende un grupo funcional hidrocarburo ramificado. Una muestra que contiene la proteína diana que va a ser purificada, se pone en contacto con el adsorbente hidrofóbico bajo condiciones que causan que los contaminantes se unan selectivamente al adsorbente, mientras que la proteína diana no se une. La porción de la mezcla que no se une (y que contiene la proteína diana) luego se separa del adsorbente bajo condiciones que no interfieren con el enlace de los contaminantes al adsorbente.

El medio de cromatografía hidrofóbica se puede representar por la fórmula S-X-R, donde S es el soporte, los grupos -X-R se adhieren covalentemente al soporte, R es uno o más del grupo funcional hidrocarburo ramificado, y X es un heteroátomo o grupo de átomos que sirve para unir covalentemente R al soporte. El soporte utilizado en la presente invención comprende una matriz de resina preparada por cualquier medio apropiado, ampliamente conocido por alguien de habilidad en el oficio. En general, el soporte puede ser de cualquier material que sea compatible con las separaciones de proteínas, sea insoluble en agua, y pueda ser modificado por la unión covalente para formar el enlace -X-R con el grupo funcional R. Los soportes apropiados pueden ser cualquier material disponible o desarrollado posteriormente que tenga las características necesarias para practicar el método reivindicado, y se puede basar en cualquier polímero sintético, orgánico, o natural. Por ejemplo, las sustancias soporte utilizadas comúnmente incluyen materiales orgánicos tales como celulosa, poliestireno, agarosa, sefarosa, poliacrilamida polimetacrilato, dextran y almidón, y materiales inorgánicos, tales con carbón vegetal, silica (perlas de vidrio o arena) y materiales cerámicos. Los soportes sólidos apropiados se revelan, por ejemplo, en Zaborsky "Immobilized Enzymes" CRC Press, 1973, Table IV on pages 28-46.

Los materiales de soporte de HIC específicos, que pueden ser utilizados incluyen polímero de metacrilato y agarosa activada (ver, Porath, Nature 215, 1491 (1967) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245,3059, (1970)). En ciertos casos puede ser necesario activar el soporte, de tal manera que este reaccione con un grupo funcional R para producir la fracción -X-R. Por consiguiente, se debe entender que el material fuente para el soporte, por ejemplo agarosa, no es por sí mismo sensible a la reacción con un grupo funcional particular, se puede acondicionar o activar de tal manera que sea sensible a dichas reacciones. Un ejemplo es la activación de la agarosa mediante el tratamiento con haluro de cianógeno como se describe, por ejemplo, por Porath et al. in Nature, 215, 1491 (1967) y por Cuatrecasas in J. Biol. Chem. 245,3059 (1970). El material soporte de HIC, también puede ser las resinas de perlas del copolímero de metacrilato (tales como, las resinas soporte para HIC de t-butilo Macro-Prep, proporcionadas por Bio-Rad Laboratories, Inc) a las cuales se les ha unido covalentemente grupos hidrocarburo ramificados. Las características apropiadas incluyen tamaño medio de las perlas de 30 a 100 micrones, densidades del grupo funcional de 5 a 50 micromoles por mL del gel, y las perlas que contienen de 4-6% de agarosa. Otros tipos de materiales incluyen partículas de matriz de poliestireno/divinilbenceno, que se pueden acoplar a los grupos R funcionales apropiados, descritos anteriormente. La selección y el uso de dichos materiales soporte es bien conocido por alguien de habilidad en el oficio.

Como se utiliza en la presente invención, R puede ser grupos aromáticos, alifáticos o una mezcla de aromáticos/alifáticos, que tengan hidrofobicidad suficientemente moderada o baja, que se unan selectivamente a los contaminantes de la proteína, mientras que no se unan con una proteína diana. En una modalidad de la presente invención, R tiene de baja a moderada hidrofobicidad. En otra modalidad, el grupo R hidrocarburo ramificado es un grupo alquilo ramificado. Los grupos funcionales alquilo ramificados pueden tener en las diferentes modalidades, respectivamente, de 3 a aproximadamente 8 átomos de carbono, de 4 a 7, de 4 a 6, de 4 a 5, o 4 átomos de carbono. A modo de ejemplo, el grupo R funcional alquilo ramificado se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de isopropilo, isobutilo, sec-butilo, y ter-butilo isopentilo, sec-pentilo, ter-pentilo, neopentilo, isohexilo, sec-hexilo, ter-hexilo, y otros grupos alquilo ramificados superiores que tienen hasta alrededor de 8 átomos de carbono. En otras modalidades, estos grupos alquilo ramificados pueden ser aquellos que tienen fracciones ter-carbono (carbono unido a otros tres carbonos) o neo-carbono (carbono unido a otros cuatro carbonos), tales con ter-butilo, ter-pentilo, y neopentilo.

En otra modalidad, R tiene un átomo ter-carbono, tal como ter-butilo, ter-pentilo y ter-hexilo. En otra modalidad, R es un ter-butilo. Como se indica en los ejemplos a continuación, como entre los dos grupos R que tienen el mismo número de átomos de carbono, los grupos funcionales más efectivos son aquellos que están más altamente ramificados. Por ejemplo, el ter-butilo, (que tiene 4 átomos de carbono, uno de los cuales es un carbono terciario) es sorprendentemente más efectivo que el butilo lineal (que también tiene 4 átomos de carbono, pero que sin ramificar).

X puede ser cualquier heteroátomo, tal como O o S, o grupo de átomos, tal como NH, el cual también puede tener una carga eléctrica en la forma de un ion. Una variedad de resinas para cromatografía de interacción hidrofóbica disponibles comercialmente, se pueden utilizar, y la presente invención no se limita a ninguna resina en particular. Un ejemplo de una columna de HIC que tiene un grupo funcional alquilo ramificado es t-butilo Macroprep (Bio-Rad Laboratories, Inc).

Antes del equilibrio y la cromatografía, los medios de la cromatografía HIC (el soporte y el adsorbente fijado en el soporte), se pueden pre-equilibrar en una solución preferida, por ejemplo una solución reguladora y/o solución de sal. El pre-equilibrio tiene la función de desplazar una solución utilizada para regenerar y/o almacenar el medio cromatográfico. Alguien de habilidad en el oficio se dará cuenta que la composición de la solución de pre-equilibrio depende de la composición de la solución de almacenamiento y de la solución que será utilizada para la posterior cromatografía. De este modo, las soluciones de pre-equilibrio apropiadas pueden incluir la misma solución reguladora o de sal utilizada para llevar a cabo la cromatografía, opcionalmente, a una concentración más alta que la que se usa para realizar la cromatografía. Las soluciones reguladoras y las sales que pueden ser utilizadas para cromatografía se discuten abajo. Por ejemplo, cuando la solución utilizada para realizar la cromatografía comprende fosfato de sodio a una concentración dada, el pre-equilibrio puede tener lugar en una solución que contiene fosfato de sodio a una concentración alta. Como una ilustración de esto, si la solución utilizada para realizar la cromatografía contiene fosfato de sodio entre alrededor de 0.5 milimolar y cerca de 50 milimolar, el pre-equilibrio se puede producir en una solución que contenga fosfato de sodio entre aproximadamente 0.2 molar y aproximadamente 0.5 molar, más preferiblemente en concentraciones de fosfato de sodio entre aproximadamente 0.3 molar y aproximadamente 0.4 molar, inclusive.

Antes de que la muestra se aplique a la columna, la columna puede ser equilibrada en la solución reguladora o la sal que será utilizada para realizar la cromatografía de la proteína. Como se discute a continuación, la cromatografía (y la carga de la proteína que será purificada) puede ocurrir en una variedad de soluciones reguladoras o sales que incluyen sales de sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro, fluoruro, acetato, fosfato, y/o citrato y/o solución reguladora Tris. Las soluciones reguladoras de citrato y las sales se prefieren por aquellos de habilidad en el oficio por su facilidad de eliminación. Dichas soluciones reguladoras o sales tienen un pH de al menos aproximadamente 5.5. En algunas modalidades, el equilibrio puede tomar lugar en una solución que comprende un Tris o una solución reguladora de fosfato de sodio. Opcionalmente, la solución reguladora de fosfato de sodio está a una concentración entre aproximadamente 0.5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar, más preferiblemente a una concentración entre aproximadamente 15 milimolar y 35 milimolar. El equilibrio tiene lugar a un pH de al menos aproximadamente 5.5. El equilibrio puede tener lugar a pHs entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 8.6, preferiblemente a pHs entre aproximadamente 6.5 y 7.5. Más preferiblemente, la solución comprende una solución reguladora de fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 25 milimolar y a un pH de aproximadamente 6.8.

La proteína diana que se va a purificar se puede producir por células huésped vivas que han sido producidas mediante ingeniería genética para producir la proteína. Los métodos de células de ingeniería genética para producir proteínas son bien conocidos en el oficio. Ver por ejemplo, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Tales métodos incluyen la introducción de ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en las células huésped vivas. Estas células huésped pueden ser células bacterianas, células de hongos, o, preferiblemente, células animales producidas en cultivos. Las células huésped bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de Escherichia coli. Ejemplos de cepas de E. coli apropiadas incluyen: HB101, DH5\alpha, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, y cualquier cepa de E. coli que fracasa para cortar el ADN foráneo. Las células huésped que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, células de Saccaromyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Unos pocos ejemplos de líneas celulares animales que pueden ser utilizadas son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, y WI38. Nuevas líneas celulares animales se pueden establecer utilizando métodos bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio (por ejemplo, por transformación, infección viral, y/o selección). Opcionalmente, la proteína puede ser segregada por las células huésped en el medio.

La concentración de la proteína de una muestra, en cualquier etapa de purificación se puede determinar por cualquier método apropiado. Tales métodos son bien conocidos en el oficio e incluyen: 1) métodos colorimétricos tales como el ensayo de Lowry, el ensayo de Bradford, el ensayo de Smith, y el ensayo de oro coloidal; 2) métodos que utilizan las propiedades de absorción UV de proteínas; y 3) estimación visual basado en bandas de proteínas teñidas en geles apoyándose en la comparación con estándares de proteína de cantidad conocida en el mismo gel. Ver por ejemplo Stoschek (1990). Quantitation of protein, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzimol. 182: 50-68.

El proceso de purificación de proteínas de la presente invención es aplicable a cualquier proteína. El proceso es particularmente útil en la purificación de proteínas que son menos hidrofóbicas que los contaminantes de los cuales ellas están siendo separadas. El proceso es particularmente útil, por ejemplo, en la purificación de proteínas de baja a moderada hidrofobicidad, tal como proteínas producidas recombinantemente, o proteínas que comprenden una región F_{C} de un anticuerpo, ambas de las cuales tienden a tener bajas a relativamente moderadas hidrofobicidades. Las proteínas que comprenden uno o más dominio(s) de inmunoglobulina de anticuerpos constantes pueden, pero no necesitan, comprender un dominio(s) de inmunoglobulina de anticuerpo variable múltiple o único. Las proteínas de fusión F_{C}pueden ser una proteína que ocurre naturalmente o una proteína de fusión recombinante. Puede comprender una porción F_{C} de un anticuerpo. También pueden comprender una proteína no-anticuerpo.

Algunas proteínas contempladas específicamente para utilizar con la invención incluyen proteínas de fusión recombinantes que comprenden uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente una porción F_{C} de un anticuerpo, y una proteína idéntica a o sustancialmente similar a una de las siguientes proteínas: un ligando flt3 (como se describe en la international application no WO 94/28391), un ligando CD40 (como se describe en U.S. Patent No. 6,087,329, eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, ligando Fas, ligando para el activador receptor de NF-kappa B (RANKL), ligando que induce la apoptosis relacionada (TRAIL) del factor de necrosis tumoral (TNF), como se describe en international application no. WO 97/01633, linfopoyetina derivada del estroma timico, factor de estimulación de la colonia granulocito-macrófago (GM-CSF) como se describe en Australian Patent No. 588819, factor de crecimiento de células mastoides, factor de crecimiento de células madre, factor de crecimiento epidérmico, RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento de tipo insulina, hormona paratiroide, interferones, factores de crecimiento nervioso, glucagón, interleucinas 1 a 18, factores estimuladores de colonias, linfotoxina-\beta, factor de necrosis tumoral (TNF), factor inhibidor de la leucemia, oncostatina-M, y varios ligandos para las moléculas de la superficie celular ELK y Hek (tal como los ligandos para las quinasas relacionadas con eph o LERKS). Las descripciones de las proteínas que pueden ser purificadas de acuerdo con los métodos inventivos se pueden encontrar en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol. II Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (Mckay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook (A.W. Thompson, ed., AcademicPress, San Diego, CA, 1991).

Las proteínas contempladas por la invención también incluyen proteínas de fusión recombinantes que comprenden uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente una porción F_{C} de un anticuerpo, más un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o proteínas sustancialmente similares a dichos receptores. Estos receptores incluyen: ambas formas de TNFR (conocidas como p55 y p75), receptores de la Interleucina-1 tipos I y II (como se describe en EP Patent No. 0 460 846, US Patent No. 4,968,607, y US Patent No. 5,767,064, receptor de la interleucina-2, receptor de la interleucina-4 (como se describe en EP Patent No. 0 367 566 y US Patent No. 5, 856,296, receptor de la Interleucina-15, receptor de la interleucina-17, receptor de la interleucina-18, receptor del factor estimulador de la colonia granulocito-macrófago, receptor del factor estimulador de la colonia de granulositos, receptores para el factor inhibidor de la leucemia y la oncostatina-M, activador del receptor de NF-Kappa B (RANK, como se describe en US Patent No. 6,271,349, receptores para TRAIL (incluyendo los receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4), y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o el Receptor que induce la Apoptosis (AIR).

Otras proteínas que se pueden purificar utilizando el proceso de la invención incluyen antígenos de diferenciación (denominados como proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a cualquiera de estas, que se fusionan a al menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente una porción F_{C} de un anticuerpo. Tales antígenos se revelan en Leukocyte Typing VI (proceedings of the VIth International Workshop and Conference. Kishimoto. Kikutani et al., eds., Kobe Japan, 1996). Las proteínas CD similares incluyen CD27, CD30, CD39, CD40, y los ligandos de estas (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antígenos de CD son miembros de la familia del receptor TNF, que también incluye el ligando 41BB y el ligando OX40. Los ligandos generalmente son miembros de la familia TNF, como lo son el ligando 41BB y el ligando OX40. Por consiguiente, los miembros de las familias de TNF y TNFR, también se pueden purificar utilizando la presente invención.

Las proteínas activas enzimáticamente o sus ligandos, también se pueden purificar de acuerdo con la invención. Ejemplos incluyen proteínas de fusión recombinantes que comprenden al menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante más toda o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una proteína sustancialmente similar a una de estas: miembros de la familia metaloproteinasa-disintegrina, varias quinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1 antititripsina, Enzima Convertidora TNF-alfa, los ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente, y numerosas otras enzimas y sus ligandos.

El método de la invención, también se puede utilizar para purificar anticuerpos o porciones de estos y anticuerpos quiméricos, i.e. anticuerpos que tienen dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante humanos acoplados a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable murina, o fragmentos de estos. El método de la invención también se puede utilizar para purificar conjugados que comprenden un anticuerpo y una sustancia citotóxica o luminiscente. Tales sustancias incluyen: derivados de la maitansina (tales como DM1); enterotoxinas (tales como una enterotoxina Staphylococcal); isotopos de yodo (tales como yodo-125); isotopos de tecnecio (tal como Tc-99m); cianina fluorocromos (tal como Cy5.5.18) y proteínas inactivadoras de ribosomas (tales como bouganina, gelonina, o saporina-S6). Ejemplos de anticuerpos o conjugados de anticuerpo/citotoxina o anticuerpo/luminóforo contemplados por la invención incluyen aquellos que reconocen cualquiera o la combinación de las proteínas descritas anteriormente y/o los siguientes antígenos: subunidades de CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-18, PDGF-\beta, VEGF, TGF, TGF-\beta2, TGF-\beta1, receptor de EGF, receptor de VEGF, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón) HER-2, una glicoproteína asociada con el tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epitopes asociados con un tumor que están presentes en niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epitopes asociados con el cáncer o proteínas expresadas en células de cáncer de mama, colon, célula escamosa, próstata, pancreático, pulmón, y/o riñón y/o en células de melanoma, glioma, o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores 1, 2, 3, y 4 TRAIL, RANK, ligando RANK, TNF-\alpha, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de célula epitelial (EpCAM), molécula de adhesión intracelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, la glicoproteína de plaqueta gp IIb/IIIa, cadena pesada de la miosina cardíaca, hormona paratiroide, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor tisular del factor VIIa), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado con el linfocito T citotóxico), receptor de F_{C}-\gamma-1, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, L-selectina, IFN-\gamma, Virus Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la hepatitis B (HBV), Streptococcus mutans, y Staphylococcus aureus.

La invención también se puede utilizar para purificar anticuerpos anti-idiotípicos, o proteínas sustancialmente similares, incluyendo pero no limitando a anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliósido GD3; o un anticuerpo contra el gangliósido GD2.

En el proceso de purificación de proteínas de la presente invención, la muestra que contiene la proteína diana y los contaminantes se pueden cargar en el soporte adsorbente bajo condiciones en las cuales los contaminantes del cultivo celular se unen a la columna de fase estacionaria, mientras que permiten que la proteína de elección pase a través en la fracción flujo directo. HIC se realiza generalmente mediante la carga de la muestra de la proteína dentro de la columna cromatográfica en una solución acuosa que comprende una solución reguladora y/o una sal. La disminución de la fuerza iónica de la solución (i.e, disminución de la concentración de la sal) reduce la tendencia de los materiales hidrofóbicos a ser retenidos por la columna. Las soluciones reguladoras apropiadas incluyen, pero no se limitan a soluciones reguladoras de fosfato, soluciones reguladoras Tris, soluciones reguladoras de acetato, y/o soluciones reguladoras de citrato. Las sales aceptables pueden incluir, pero no se limitan a cloruro de sodio, cloruro de amonio, cloruro de potasio, acetato de sodio, acetato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, tiocianato de amonio, citrato de sodio, fosfato de sodio, y sus sales de potasio, magnesio, y calcio, y las combinaciones de estas sales. En otras modalidades, las sales incluyen citrato de sodio y cloruro de sodio. Los rangos aceptables de concentraciones de sales utilizados para los sistemas de HIC están por lo general en el rango entre 0 a aproximadamente 2M de citrato de sodio, 0 a aproximadamente 4M de cloruro de sodio, 0 a aproximadamente 3M de sulfato de amonio, 0 a aproximadamente 1M de sulfato de sodio y 0 a aproximadamente 2M de fosfato de sodio. Los rangos de la concentración de sal pueden incluir 0 a aproximadamente 1M de citrato de sodio, 0 a aproximadamente 2M de cloruro de sodio, 0 a aproximadamente 1.5M de sulfato de amonio, 0 a aproximadamente 1M de sulfato de sodio y 0 a aproximadamente 1.5M de fosfato de sodio. Otras soluciones reguladoras y sales también pueden ser utilizadas. Después de la carga, el adsorbente se puede lavar con más de la misma solución para lograr que la proteína diana (sin que se una al adsorbente) fluya a través del adsorbente. La proteína, luego se recolecta en la fracción flujo directo. Las condiciones para unir los contaminantes, mientras que la proteína diana no se une, se pueden optimizar fácilmente por aquellos de habilidad en el oficio. Las concentraciones de sal discutidas en este documento son ejemplares, y otras sales y concentraciones de sal se pueden utilizar variando las velocidades de flujo, temperaturas, y tiempos de elución, según se conoce en el oficio.

Las condiciones bajo las cuales estas columnas se utilizan varían con las columnas específicas como se conoce en el oficio. Para la mayoría de las proteínas de interés, el rango de pH puede estar entre aproximadamente 6.0 y alrededor de 8.6, o alternativamente entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 7.5. Sin embargo, se conoce que ciertas proteínas son resistentes a pHs extremos, y un rango más amplio puede ser posible. Las condiciones típicas incluyen un rango de pH entre 5-7 y un rango de concentración de citrato de sodio de 0 a aproximadamente 0.8M (por ejemplo citrato de sodio 0.5M, pH 6.0).

Alguien de habilidad en el oficio será guiado por el conocimiento en el oficio para determinar qué solución reguladora o sal es apropiada para la proteína particular que será purificada. Por otra parte, un experto puede determinar fácilmente la concentración óptima de la solución reguladora o de la sal seleccionada para utilizar, por ejemplo, mediante la estabilización particular de las condiciones de la solución reguladora o de la sal bajo las cuales los contaminantes se unen a una columna de HIC mientras que la proteína de interés fluye a través en la fracción flujo directo. Las fracciones del efluente de la columna pueden ser recolectadas y analizadas para determinar la concentración de la solución reguladora o de la sal en la cual la proteína diana y los contaminantes eluyen. Los análisis apropiados incluyen, por ejemplo, una medida de la conductancia eléctrica con un medidor de conductividad (para determinar la concentración de la sal en la muestra) más electroforesis en gel o ensayo de ELISA (para determinar la identidad de las proteínas en la muestra). Opcionalmente, la columna se puede lavar con más de la misma solución en la cual la muestra de la proteína fue cargada, y esta solución de lavado también se puede recolectar y combinar con el líquido flujo directo.

Después de la recolección del flujo directo y, opcionalmente, el lavado, que comprende la proteína que se está purificando, las proteínas que pueden permanecer unidas a la columna se pueden liberar por agotamiento del medio de cromatografía utilizando una solución que comprende la solución reguladora o de la sal utilizada para cromatografía, pero a una fuerza iónica para liberar las proteínas contaminantes. A continuación, la columna se puede regenerar utilizando una solución que tendrá el efecto de liberar la mayoría o todas las proteínas del medio cromatográfico y reducir o eliminar cualquier contaminación microbiana que pueda estar presente en el medio cromatográfico. En una modalidad, dicha solución puede comprender hidróxido de sodio. Otros reactivos, también se pueden utilizar. Posteriormente, la columna se puede aclarar y almacenar en una solución que puede desmotivar el crecimiento microbiano. Dicha solución puede comprender hidróxido de sodio, pero otros reactivos también pueden ser apropiados.

La proteína diana, así como las proteínas contaminantes que pueden estar presentes en una muestra, pueden ser monitoreadas por cualquier medio apropiado. Preferiblemente, la técnica debería ser lo suficientemente sensible para detectar los contaminantes en el rango entre aproximadamente 2 partes por millón (ppm) (calculados como nanogramos por miligramo de la proteína que se purifica) y 500 ppm. Por ejemplo, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un método bien conocido en el oficio, se puede utilizar para detectar la contaminación de la proteína de la segunda proteína. Ver, por ejemplo Reen (1994), Enzime-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32: 461-466. En un aspecto, la contaminación de la proteína por las citadas otras proteínas, se puede reducir después de HIC, preferiblemente por al menos cerca de dos-veces, más preferiblemente por al menos cerca de tres veces, más preferiblemente por al menos cerca de cinco veces, más preferiblemente por al menos cerca de diez veces, más preferiblemente por al menos cerca de veinte veces, más preferiblemente por al menos cerca de treinta veces, más preferiblemente por al menos cerca de cuarenta veces, más preferiblemente por al menos cerca de cincuenta veces, más preferiblemente por al menos cerca de sesenta veces, más preferiblemente por al menos cerca de setenta veces, más preferiblemente por al menos cerca de 80-veces, más preferiblemente por al menos cerca de 90 veces, más preferiblemente por al menos cerca de 100 veces. En otro aspecto, la contaminación de la proteína por las otras citadas proteínas después de HIC no es más de aproximadamente 10,000 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 2500 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 400 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 360 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 320 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 280 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 240 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 200 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 160 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 140 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 120 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 100 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 80 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 60 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 40 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 30 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 20 ppm, más preferiblemente no más de aproximadamente 10 ppm, y más preferiblemente no más de aproximadamente 5 ppm. Tal contaminación puede oscilar de niveles no detectables a aproximadamente 10 ppm o de aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 10,000 ppm. Si la proteína que se purifica es para uso farmacológico, alguien de habilidad en el oficio se dará cuenta que el nivel preferido de la segunda proteína puede depender de la dosis semanal de la proteína que será administrada por paciente, con el fin de que el paciente no reciba más de una cierta cantidad de una proteína contaminante por semana. De esta manera, si la dosis semanal necesaria de la proteína se disminuye, el nivel de contaminación por una segunda proteína puede aumentar posiblemente.

La cantidad de ADN que puede estar presente en una muestra de la proteína que se purifica, se puede determinar mediante cualquier método apropiado. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo que utiliza reacción en cadena de la polimerasa. Opcionalmente, la técnica puede detectar la contaminación de ADN en niveles de 10 picogramos por miligramo de proteína y más, los niveles de ADN se pueden reducir por HIC, opcionalmente por aproximadamente dos veces, preferiblemente por aproximadamente cinco veces, más preferiblemente por aproximadamente diez veces, más preferiblemente por aproximadamente quince veces, más preferiblemente por aproximadamente 20 veces. Opcionalmente, los niveles de ADN después de la cromatografía de hidroxiapatita son menos de aproximadamente 20 picogramos por miligramo de proteína, preferiblemente menos de 15 picogramos por miligramo de la proteína, más preferiblemente menos de 10 picogramos por miligramo de proteína, más preferiblemente menos de 5 picogramos por miligramo de proteína.

Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar las modalidades particulares, y no limitar el alcance, de la invención. Aquellos de habilidad en el oficio reconocerán fácilmente que modalidades adicionales se abarcan por la invención.

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Ejemplo 1

Purificación de IL1R-II

Una etapa flujo directo de HIC en t-butilo Macroprep (BioRad Laboratories, Inc.) se empleó en la purificación de un dominio extracelular de IL1R-II. Una muestra que contiene IL-1R-II, en primer lugar se sometió a la purificación en una columna de intercambio aniónico TMAE Fractogel utilizando Tris 25 mM, pH 8 como la solución reguladora de equilibrio y de lavado y Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 8 como la solución reguladora de elución. La etapa de HIC se realizó a pH 7.0 citrato 600 mM en la solución reguladora de carga. La figura 1 muestra un cromatograma representativo de la etapa flujo directo en la resina t-butilo. Como se puede ver en la figura, una mayoría (-90% por un ensayo cuantitativo) de la proteína cargada fluye a través bajo estas condiciones. Un pico de resolución se observa durante un lavado con fosfato 25 mM, pH 7.0 y un pico pequeño se observó en la banda de NaOH 0.5N.

La tabla 1 muestra los niveles de la proteína de célula huésped CHO (CHOP) en la carga de HIC, flujo directo de HIC, y fracciones de elución de HIC a partir de la purificación flujo directo de IL1R-II mostrada en la figura 1. Como se observa en la tabla, esta etapa es acertada para reducir los niveles de la proteína de la célula huésped en varios órdenes de magnitud. La mayoría de estos contaminantes tienden a unirse fuertemente a la columna y desprenderse en el pico de elución.

TABLA 1

1

La carga y las fracciones flujo directo también fueron analizadas por SDS-PAGE. Como se muestra en la figura 2, la etapa flujo directo en t-butilo Macroprep elimina exitosamente un rango de contaminantes vistos por SDS-PAGE. La senda 1 muestra los estándares de peso molecular, la senda dos muestra una distribución amplia de varias proteínas en la carga de muestra inicial, y la senda 3 muestra que la fracción flujo directo eliminó una mayoría de contaminantes para producir una forma más altamente purificada de IL1R-II (las dos bandas representando IL1R-II en la forma de un monómero y un dímero).

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Ejemplo 2

Purificación de RANK:F_{C}

La etapa de HIC se empleó después de la etapa de purificación durante el tratamiento adicional de RANK:F_{C}, una proteína de fusión F_{C}. En esta fase en el proceso, las impurezas predominantes en el producto incluyen CHOP (\sim 5-10000 ppm), proteína A lixiviada (50-200 ppm), agregado de alto peso molecular (2-5%) y la forma del pico C de la proteína (5-10%). La forma del pico C de la proteína es potencialmente RANK:F_{C} plegada incorrectamente, que se ha encontrado que tienen una menor actividad de enlace que la forma del pico B (pico principal).

RANK:F_{C} fue purificada en una etapa flujo directo de HIC utilizando una resina de t-butilo Macroprep, preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La columna se preparó para una capacidad de 15 mg/ml a una velocidad de flujo de operación de 2 cm/min y fue sanitizado con NaOH 0.5. Después de la inactivación viral de la mezcla eluida de la Proteína A, el eluato se diluyó con solución citrato 0.6M (pH 6.0, relación proteína:sal 1:1.75) para lograr la concentración de sal final de la carga de alimentación para citrato 0.4M antes de la carga en la columna. Se demostró que este nivel de concentraciones de citrato era óptimo para separar el producto de las impurezas enumeradas anteriormente. Después del equilibrio de la columna (citrato 0.4M, pH 6.0), la carga de alimentación que contiene la proteína RANK:F_{C} se cargó en la columna en una solución reguladora que consiste de Citrato 400 mM, pH 6.0. El producto fluye a través, mientras que las impurezas permanecieron detrás en la columna y se retiraron mediante un lavado con agua y una etapa de regeneración de NaOH 0.5N, seguido por la esterilización con NaOH 0.1M.

El cromatograma mostrado en la Figura 3, muestra la purificación de RANK:F_{C} en una t-butilo Macroprep operada en el modo flujo directo. Específicamente, el cromatograma muestra que la fracción flujo directo contenía esencialmente solo el Pico B (RANK:F_{C}), mientras que las siguientes fracciones de la elución contenían predominantemente las impurezas, incluyendo CHOP, una proteína A lixiviada, los agregados de alto peso molecular y el Pico C (la forma plegada incorrectamente de RANK:F_{C}).

La Figura 4 compara gráficamente la carga de HIC con la mezcla flujo directo, mediante varios métodos analíticos incluyendo SEC (Figura 4a), ELISA de la Proteína A lixiviada (Figura 4b), HIC (Figura 4c) y ELISA de fCHOP (Figura 4d). Cada una de estas figuras indica que la etapa flujo directo de HIC en t-butilo Macroprep es exitosa para eliminar los agregados, la Proteína A lixiviada, la forma del pico C de la proteína (plegada incorrectamente) y los contaminantes de la proteína de la célula huésped, todos en una etapa única. El alcance de la liquidación de estas impurezas se encontró que era mucho mayor que el logrado con una sola etapa en cualquier otro modo de cromatografía sin-afinidad para esta proteína (HIC de intercambio iónico, metal-quelato etc.).

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Ejemplo 3

Selectividad de Grupos Funcionales Hidrocarburo Ramificados para Formas Alternas de RANK:F_{C}

Un rango de medios soporte de HIC se compararon independientemente para su selectividad entre las formas del pico B y C de RANK:F_{C} según se define por un ensayo de HIC que consiste de elución con gradiente lineal (1 a 0M de sulfato de amonio) en una columna TSK Butilo NPR. Específicamente, los medios de cromatografía que fueron probados incluyeron (a) t-butilo Macroprep, (b) TosoHaas Butilo 650M, (c) Butilo Sefarosa FF, (d) TosoHaas Phenyl 650M, y (e) TosoHaas Ether 650M. Inyecciones analíticas (0.5 mL a un rango de concentración de 0.5-2 mg/mL de los picos B y C (obtenidos a partir de un experimento de gradiente lineal preparativo en la columna analítica TSK Butilo NPR) se cargaron en varias columnas de HIC, y las columnas se eluyeron con un gradiente de citrato 400 mM a citrato 0 mM en 15 CV, seguido por lavados 5 CV con agua, seguido por NaOH 0.5N.

Las formas del Pico B y C de la proteína se separaron mediante un gradiente de sal lineal (de citrato 400 mM a citrato 0 mM a pH 6.0 durante 15 volúmenes de columna) antes de la purificación por HIC utilizando los diferentes medios de cromatografía descritos anteriormente. El gradiente de sal se continuo por etapas de bandas con agua seguido por NaOH 0.5N. La HIC utilizando una columna t-butilo Macroprep fue selectivamente alta, con el pico B que se forma eluyendo durante el gradiente de sal (de aproximadamente 30-50 min) mientras que la forma del pico C de la proteína fue muy fuertemente retenida y eluyendo solo durante la etapa de la banda NaOH 0.5N (a aproximadamente 80 min). En contraste HIC utilizando una columna TosoHaas Butilo 650M fue mucho menos selectiva, con ambos picos eluyendo a intervalos muy cercanos o superpuestos durante el gradiente de sal. Se observaron similares no-selectividades utilizando medios Butilo Sefarosa 4FF, TosoHaas Phenyl 650M y TosoHaas Ether 650M. Estos datos indican que la resina t-butilo Macroprep posee una selectividad única para estas dos variantes similares de la misma proteína. Tomado junto con los datos en la eliminación de otras impurezas, incluyendo las proteínas de células huésped, la Proteína A lixiviada y los agregados de peso molecular alto, este dato indica la utilidad de la resina alquilo ramificada de HIC como una etapa de acabado genérica para un rango de proteínas producidas mediante cultivo celular.

Mientras que no se una por cualquier teoría particular de acción mecanística, debería parecer que estos resultados son debidos a la funcionalidad butilo terciaria única, presente en esta resina que es distinta de las funcionalidades en las otras resinas (grupos éter, fenilo o butilo lineal). Adicionalmente, no parece que sea una contribución del esqueleto de la fase estacionaria, ya que todas las resinas t-butilo Macroprep, Toso Haas Butilo, Phenyl y Ether comparten un esqueleto de polimetacrilato.

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Ejemplo 4

Comparación de las resinas ter-Butilo y Butilo lineal que tienen la misma hidrofobicidad

Las resinas de HIC se prepararon con funcionalidades de t-butilo y butilo lineal que tienen hidrofobicidades similares con el fin de determinar si la especificidad de la resina t-butilo fue atribuible a su gran hidrofobicidad (relativa a la resina butilo lineal) o a alguna selectividad específica asociada con la estructura física ramificada de la fracción t-butilo.

Los grupos funcionales ter-butilo y butilo lineal se inmovilizaron por unión covalente de sus grupos amino primarios a un soporte de agarosa disponible comercialmente (NHS-activated Shepharose 4 Fast Flow; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) vía la fracción funcional NHS (N-hidroxisuccinimida), utilizando la química estándar de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Este enlace forma una amida muy estable, especialmente a pH alto. La densidad de los grupos funcionales t-butilo y butilo lineal se ajustó empíricamente de tal manera que la hidrofobicidad neta de las dos resinas fue igual, como se determina por la retención igual de RANK:F_{C} en un gradiente de citrato de sodio.

Se obtuvieron las formas del Pico B y C de la proteína separadas (por gradiente lineal de sal de citrato 400 mM a citrato 0mM a pH 6.0 durante 15 volúmenes de la columna en una columna analítica TSK Butilo NPR) antes de la purificación por HIC. Las inyecciones analíticas de las formas del Pico B y C (0.5 mL a un rango de concentración de 0.5-2 mg/mL) se cargaron en las columnas t-butilo y butilo lineal, preparadas como se describe anteriormente, y las columnas fueron eluidas con un gradiente de citrato 400 mM a citrato 0mM en 15 volúmenes de la columna, seguido por 5 lavados de volúmenes de la columna con agua, seguido por NaOH 0.5N.

El gradiente de sal se siguió por etapas de bandas con agua, seguido por NaOH 0.5N. La HIC utilizando la columna t-butilo balanceada hidrofóbicamente fue altamente selectiva, con la forma del pico B, el cual eluyó durante el gradiente de sal mientras que la forma del pico C de la proteína fue retenida muy fuertemente y eluyó solo durante la etapa de banda de NaOH 0.5N.

Estos datos indican que la selectividad del grupo funcional t-butilo no es debida a una diferencia en la hidrofobicidad, sino más bien debida a alguna otra propiedad inherente en la estructura alquilo ramificada.

El dato en esta resina de dos proteínas diferentes (IL1R-II y RANK:F_{C}) indica la naturaleza genérica de esta etapa flujo directo para la purificación de las proteínas, tales como proteínas expresadas recombinantemente y proteínas de fusión F_{C} expresadas recombinantemente, y para la eliminación de los contaminantes, tales como las proteínas CHOP, los agregados de proteína recombinante, la Proteína A y las formas plegadas incorrectamente de una proteína particular.

Claims (12)

1. Un proceso para separar una proteína diana a partir de una mezcla que contiene la proteína diana y los contaminantes, que comprende:

a) el contacto de la mezcla con un adsorbente hidrofóbico que comprende grupos funcionales hidrocarburo ramificados en una solución acuosa de sal a un pH de al menos 5.5, en condiciones que permiten que los contaminantes se unan al adsorbente y que la proteína diana pase a través del adsorbente en una fracción flujo directo sin unirse al adsorbente hidrofóbico; y

b) la recolección de la fracción flujo directo de la mezcla que contiene la proteína diana que no se une al adsorbente hidrofóbico.

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína diana es una proteína diana recombinante, producida como un producto de la expresión del cultivo celular en una célula huésped.

3. El proceso de la reivindicación 2, en donde la proteína diana recombinante es una proteína diana de fusión F_{C} recombinante.

4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína diana es una proteína diana recombinante, y en donde dichos contaminantes comprenden contaminantes del cultivo celular producidos por la expresión del cultivo celular de la proteína recombinante en una célula huésped de Ovario de Hámster Chino.

5. El proceso de la reivindicación 1, para la separación de una proteína diana recombinante, producida como un producto de la expresión del cultivo celular en una célula huésped, a partir de una mezcla que contiene una proteína diana y los contaminantes, que además comprende, antes de la etapa (a) las etapas:

i) preparación de una columna de cromatografía que tiene un soporte que comprende los grupos funcionales alquilo ramificados hidrofóbicos, en donde los grupos funcionales alquilo ramificados tienen de 4 a 8 átomos de carbono, uno de los cuales al menos es un átomo de carbono terciario.

ii) preparación de la mezcla en una solución acuosa a un pH de al menso 5.5 que tiene a una concentración de sal tal que los contaminantes se unan a la columna mientras que la proteína diana en la mezcla no se une a la columna;

en donde la etapa (a) comprende el contacto de la mezcla con la columna bajo dichas condiciones; y

en donde la etapa (b) comprende la recolección de la columna de la fracción flujo directo de la mezcla que contiene la proteína diana que no se une a la columna.

6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para eliminar la proteína A, a partir de una mezcla que contiene la proteína diana y la Proteína A, en donde dichos contaminantes comprenden dicha Proteína A.

7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para eliminar una variante plegada incorrectamente de una proteína diana recombinante a partir de una mezcla que contiene una combinación de variantes plegadas correctamente y variantes plegadas incorrectamente de la proteína diana, en donde dichos contaminantes comprenden la citada variante plegada incorrectamente de la proteína diana, y en donde en la etapa (b) del proceso de la fracción flujo directo de la mezcla contiene una variante plegada correctamente de la proteína diana que no se une al adsorbente hidrofóbico.

8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para eliminar las formas agregadas de una proteína diana recombinante a partir de una mezcla que contiene formas individuales y formas de agregados de la proteína diana, en donde dichos contaminantes comprenden las citadas formas de agregados de la proteína diana, y en donde en la etapa (b) del proceso la fracción flujo directo de la mezcla contiene una forma individual de la proteína diana que no se une al adsorbente hidrofóbico.

9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-8, en donde el adsorbente hidrofóbico comprende un grupo funcional alquilo ramificado.

10. El proceso de la reivindicación 9, en donde el grupo funcional alquilo ramificado tiene de 3 a 8 átomos de carbono.

11. El proceso de la reivindicación 10, en donde el grupo funcional alquilo ramificado comprende un átomo de carbono terciario.

12. El proceso de las reivindicaciones 5 u 11, en donde el grupo funcional alquilo ramificado es el ter-butilo.