TW202012426A - 多肽之純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種可有效率的去除非目標多肽的多肽純化方法。 一種方法，其係藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法，其包含以含有還原劑之處理劑對非目標多肽進行處理之步驟。

Description

多肽之純化方法
本發明係有關於一種多肽之純化方法。更詳而言之，係有關於一種多肽之純化方法、及使用於該方法之處理劑。
抗體係對於多種動物，尤為人類的免疫系統而言屬重要的要素。近年來，隨著重組技術的進步，可針對癌細胞、細菌及病毒而產生抗體。例如，抗體係使用設計成可高程度地表現的細胞株來產生。此外，設計之細胞株係在包含抗體以外的多肽或蛋白質，以及糖類、胺基酸、生長因子之複合混合物等的培養物中培養。
為了將以抗體為首的目標多肽由細胞副產物或培養液成分中分離，而使用於研究用途或作為治療藥/診斷藥使用，則需充分提高純度。在如對人類投予抗體作為藥劑時，特別重要的是抗體分子的純度。 作為代表性抗體純化方法之一，有採用親和層析法之純化。此方法係使培養液等試料中的抗體結合於固定於固相上之配體，並使用洗淨液將非目標多肽由固相去除後，使抗體溶出之手法(例如專利文獻1～4)。 作為使用於由固相去除非目標多肽之處理的上述洗淨液，提案有包含氯化苄烷銨的液劑或包含精胺酸的液劑(專利文獻5、6)。 然而，在使用此等液劑的抗體純化中，並無法充分去除非目標多肽。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 美國專利第6870034號說明書 [專利文獻2] 日本專利第4031049號公報 [專利文獻3] 日本專利第4460302號公報 [專利文獻4] 日本專利第5150488號公報 [專利文獻5] 國際公開第2014/192877號小冊 [專利文獻6] 日本特開2017-160215號公報
[發明所解決之課題]
本發明所欲解決之課題在於提供一種可有效率的去除非目標多肽的多肽純化方法。 [解決課題之手段]
上述課題可藉由下述手段來解決。 ＜1＞一種方法，其係藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法，其包含以含有還原劑之處理劑對非目標多肽進行處理之步驟。 ＜2＞如＜1＞之方法，其中前述處理劑的氧化還原電位(ORP)為-500～50mV。 ＜3＞如＜1＞或＜2＞之方法，其中前述處理劑的氧化還原電位(ORP)為-500～-250mV。 ＜4＞如＜1＞～＜3＞中任一項之方法，其中前述還原劑為可切斷二硫鍵之還原劑。 ＜5＞如＜1＞～＜4＞中任一項之方法，其中前述還原劑為分子內具有選自氫硫基(sulfanyl group)及磷原子的1種或2種之還原劑。 ＜6＞如＜1＞～＜5＞中任一項之方法，其中前述還原劑為非胺基酸系還原劑。 ＜7＞如＜1＞～＜6＞中任一項之方法，其中前述非目標多肽為HCP。 ＜8＞如＜1＞～＜7＞中任一項之方法，其中前述目標多肽為抗體、抗體片段、Fc融合蛋白質或其片段。 ＜9＞如＜1＞～＜8＞中任一項之方法，其中前述處理步驟係由固定有結合有前述試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理前述非目標多肽之步驟。 ＜10＞如＜9＞之方法，其中在前述分離處理步驟前，包含使固定於固相上之配體與包含目標多肽及非目標多肽的試料接觸，而使前述目標多肽與前述配體結合之步驟。 ＜11＞如＜9＞或＜10＞之方法，其進一步包含使用溶出緩衝液由前述固相中回收目標多肽之步驟。 ＜12＞如＜9＞～＜11＞中任一項之方法，其中前述配體為免疫球蛋白結合性蛋白質。 ＜13＞如＜12＞之方法，其中前述免疫球蛋白結合性蛋白質為選自蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、VHH抗體、Fc結合蛋白及其功能性突變體的1種或2種以上。 ＜14＞一種處理劑，其係使用於藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法的處理劑，其係含有還原劑。 ＜15＞如＜14＞之處理劑，其中前述方法係由固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理前述非目標多肽，而純化出目標多肽之方法。 [發明之效果]
根據本發明之多肽純化方法，可有效率的去除非目標多肽，而能夠獲得非目標多肽之混入較少的目標多肽。
[實施發明之形態]
以下，就本發明詳細加以說明。此外，表示數值範圍等的「a～b」等之表記，除非特別排除，否則使a及b包含於其數值範圍，係與「a以上、b以下」同義。
[處理劑] 本發明中所使用之處理劑係使用於藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法的處理劑，其係含有還原劑。
(還原劑) 作為還原劑，為提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為可切斷二硫鍵之還原劑。 此外，上述「可切斷二硫鍵之還原劑」，只要是可在對非目標多肽進行處理的條件下切斷分子內具有二硫鍵之非目標多肽的二硫鍵者即可。
再者，還原劑可為水溶性或非水溶性，而為了防止有機溶劑所引起之目標多肽的凝聚或變性，較佳為水溶性還原劑。此外，於本說明書中，茲將在23℃下對純水100g可溶解1g以上的還原劑稱為水溶性還原劑。 此外，還原劑可為聚合物(如胜肽系還原劑之聚合型還原劑)或非聚合物(非聚合型還原劑)，而為了提高去除非目標多肽之效果，則較佳為非聚合物。又，還原劑亦可粗分為非胺基酸系還原劑、胺基酸系還原劑，而為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為非胺基酸系還原劑。此種還原劑當中，較佳為非胺基酸系非聚合型還原劑。
又，作為還原劑，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為分子內具有選自氫硫基(-SH)及磷原子的1種或2種之還原劑，更佳為分子內具有氫硫基之還原劑。 分子內具有氫硫基之還原劑，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，係於分子內具有較佳為1～5個，更佳為1或2個，特佳為2個氫硫基。 分子內具有磷原子之還原劑，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，係於分子內具有較佳為1～3個，更佳為1個磷原子。此外，此種分子內具有磷原子之還原劑較佳為有機磷化合物。 還原劑亦可於分子內具有上述以外的取代基或連結基。氫硫基以外的取代基可舉出羥基、胺基、羧基、氰基、磺酸基、硝基等；又，磷原子以外的連結基可舉出醚鍵、酯鍵、醯胺鍵等。此外，可僅具有此等取代基或連結基當中的1種或2種以上。 氫硫基以外的取代基的個數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為0～10個，更佳為1～5個，特佳為2～4個。氫硫基以外的取代基當中，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為羥基、胺基、羧基，更佳為羥基。又，磷原子以外的連結基的個數較佳為0～10個，更佳為0～5個，特佳為0～2個。
還原劑的分子內所含之總碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～50，更佳為1～30，再更佳為1～20，再更佳為2～10，再更佳為3～8，特佳為4～6。
又，作為還原劑，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為下述式(1)、(2)或者(3)所表示之化合物或彼等之衍生鹽，更佳為式(1)或者(2)所表示之化合物或彼等之衍生鹽，特佳為式(2)所表示之化合物。此外，式(1)所表示之化合物係於分子內具有1個氫硫基者。
Figure 02_image001
[式(1)中，R1 表示一價有機基(較佳為在經取代或者未取代之碳數1～30之烴基、或經取代或者未取代之碳數2～30之烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團，更佳為在由羥基取代或者未取代的碳數1～30之烴基、或由羥基取代或者未取代的碳數2～30之烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團)。]
Figure 02_image003
[式(2)中，R2 表示二價有機基(較佳為在經取代或者未取代之碳數1～30之二價烴基、或經取代或者未取代之碳數2～30之二價烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團，更佳為在由羥基取代或者未取代的碳數1～30之二價烴基、或由羥基取代或者未取代的碳數2～30之二價烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團)。]
Figure 02_image005
[式(3)中，R3 、R4 及R5 各自獨立表示一價有機基(較佳為在經取代或者未取代之碳數1～30之烴基、或經取代或者未取代之碳數2～30之烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團，更佳為在由羥基取代或者未取代的碳數1～30之烴基、或由羥基取代或者未取代的碳數2～30之烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團)。]
式(1)、(3)中之R1 、R3 、R4 及R5 所示之一價有機基的碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為1～10，特佳為1～8。
一價有機基可舉出在碳數1以上之烴基、碳數2以上之烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團。此連結基的個數較佳為0～10個，更佳為0～5個，特佳為0～2個。此外，作為在碳-碳原子間具有多個醚鍵之情形的一例，可舉出烷氧基聚氧伸烷基。 上述「碳數1以上之烴基」的碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為1～10，特佳為1～8。又，「碳數2以上之烴基」，除碳數為2以上以外係與「碳數1以上之烴基」相同，其碳數較佳為2～30，更佳為2～20，再更佳為2～10，特佳為2～8。
R1 、R3 、R4 及R5 之「烴基」可舉出烷基、烯基、環烷基、橋聯環烴基、芳基、芳烷基。 為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，烷基的碳數較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為1～10，再更佳為1～8，特佳為2～4。烷基可為直鏈狀或支鏈狀。烷基具體而言可舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、壬基、癸基、十一基、十二基等。 烯基的碳數較佳為2～30，更佳為2～20，再更佳為2～10，再更佳為2～8，特佳為2～4。烯基可為直鏈狀或支鏈狀。烯基具體而言可舉出乙烯基、丙烯基、丁烯基等。
環烷基、橋聯環烴基的碳數較佳為3～30，更佳為3～12。環烷基具體而言可舉出環丙基、環己基等。橋聯環烴基可舉出異莰基等。
芳基的碳數較佳為6～30，更佳為6～12。可舉出例如苯基等。芳烷基的碳數較佳為7～30，更佳為7～13。可舉出例如苯甲基、苯乙基等。
又，R1 、R3 、R4 及R5 之「烴基」亦可具有取代基。作為取代基，較佳為包含雜原子之取代基，可舉出例如羥基、胺基、羧基、氰基、磺酸基、硝基等。為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，取代基的個數較佳為0～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～4個，特佳為1或2個。此等取代基當中，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為羥基、胺基、羧基，更佳為羥基。
式(2)中之R2 所示之二價有機基的碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為2～10，再更佳為3～8，特佳為4～6。 二價有機基可舉出在碳數1以上之二價烴基、碳數2以上之二價烴基的碳-碳原子間具有選自醚鍵、酯鍵及醯胺鍵的1種以上之連結基的基團。此連結基的個數較佳為0～10個，更佳為0～5個，特佳為0～2個。此外，作為在碳-碳原子間具有多個醚鍵之情形的一例，可舉出聚氧伸烷基。 上述「碳數1以上之二價烴基」的碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為2～10，再更佳為3～8，特佳為4～6。又，「碳數2以上之二價烴基」，除碳數為2以上以外係與「碳數1以上之二價烴基」相同，其碳數較佳為2～30，更佳為2～20，再更佳為2～10，再更佳為3～8，特佳為4～6。
R2 之「二價烴基」，除烷二基外，尚可舉出伸乙烯基等烯二基；環己烷二基等環烷二基；二價橋聯環烴基；伸苯基等伸芳基。此外，烷二基、烯二基可為直鏈狀或支鏈狀。 此等當中，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為烷二基、烯二基，更佳為烷二基。 烷二基的碳數，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為1～30，更佳為1～20，再更佳為2～10，再更佳為3～8，特佳為4～6。烷二基具體而言可舉出甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基、丁烷-1,2-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-1,4-二基、戊烷-1,5-二基、己烷-1,6-二基等。
又，R2 之「二價烴基」亦可具有取代基。作為取代基，較佳為包含雜原子之取代基，可舉出例如羥基、胺基、羧基、氰基、磺酸基、硝基等。為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，取代基的個數較佳為0～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～4個，特佳為1或2個。此等取代基當中，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為羥基、胺基、羧基，更佳為羥基。 此外，式(1)、(2)或(3)所表示之化合物的衍生鹽可舉出例如鹽酸鹽。
還原劑的具體實例可舉出例如半胱胺酸(L-半胱胺酸、D-半胱胺酸)、半胱胺酸鹽酸鹽、半胱胺、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚醇、榖胱甘肽、1-硫甘油、2-巰基乙醇、2-巰基乙酸、3-巰基丙酸、2-巰基乙磺酸、2-巰基乙胺鹽酸鹽、參(2-氰乙基)膦、參(2-羧乙基)膦、參(3-羥丙基)膦、參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽、三丁基膦等。可單獨使用此等當中的1種，亦可組合2種以上使用。 此等當中，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為半胱胺酸、二硫蘇糖醇、1-硫甘油、參(3-羥丙基)膦，更佳為二硫蘇糖醇、1-硫甘油，特佳為二硫蘇糖醇。此外，就1-硫甘油而言，亦有安全性特別高之優點。
還原劑的濃度，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，在本發明所使用之處理劑中，較佳為0.1mM以上，更佳為0.5mM以上，再更佳為1mM以上，再更佳為5mM以上，再更佳為10mM以上，再更佳為50mM以上；而為了抑制純化時的壓力上升，在本發明所使用之處理劑中，較佳為10000mM以下，更佳為5000mM以下，再更佳為2500mM以下，再更佳為1500mM以下。尤其是為了有效率的改善去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為0.1～2500mM，更佳為0.5～1500mM，再更佳為1～1500mM，再更佳為5～1500mM，再更佳為10～1500mM，又更佳為50～1500mM。 尤其是使用如二硫蘇糖醇之分子內具有2個以上氫硫基之還原劑時，分子內具有2個以上氫硫基之還原劑的濃度，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，在本發明所使用之處理劑中，特佳為100mM以上；而且為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，在本發明所使用之處理劑中，特佳為500mM以下。亦即，使用分子內具有2個以上氫硫基之還原劑時，特佳為100～500mM。 另一方面，使用分子內具有1個氫硫基之還原劑時(尤為使用分子內具有1個氫硫基之非胺基酸系還原劑時)，分子內具有1個氫硫基之還原劑的濃度，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，在本發明所使用之處理劑中，特佳為500mM以上；而且為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，在本發明所使用之處理劑中，特佳為1000mM以下。亦即，使用分子內具有1個氫硫基之還原劑時(尤其是使用分子內具有1個氫硫基之非胺基酸系還原劑時)，特佳為500～1000mM。
(其他成分) 本發明之處理劑，除上述成分外，亦可包含水；磷酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉等無機鹽；界面活性劑；胺基酸；糖等。此外，此等其他成分可單獨使用1種或組合2種以上使用。
再者，就上述無機鹽的濃度，為了提高去除非目標多肽之效果，在本發明所使用之處理劑中，較佳為1～1500mM，更佳為5～1000mM，再更佳為10～750mM，特佳為200～750mM。 又，水的含量，在本發明所使用之處理劑中，較佳為70質量%以上，更佳為80質量%以上，特佳為90質量%以上。
(氧化還原電位等) 本發明所使用之處理劑的氧化還原電位(ORP)，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為-500 mV以上，更佳為-450mV以上，再更佳為-400mV以上，再更佳為-350mV以上，特佳為-300mV以上；而且為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為50mV以下，更佳為30mV以下，再更佳為0mV以下，再更佳為-25mV以下，再更佳為-100mV以下，再更佳為-150 mV以下，又更佳為-200mV以下，特佳為-250mV以下。尤其是將氧化還原電位(ORP)定為-250mV以下時，可大幅改善去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率。 為了有效率的改善去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為-500～50mV，更佳為-500～0mV，再更佳為-500～-25mV，再更佳為-500～-100mV，再更佳為-500～-150mV，又更佳為-500～-200mV，特佳為-500～-250 mV。 本說明書中，氧化還原電位(ORP)係指pH7.5時的氧化還原電位(ORP)，只要使用ORP電極來測定即可。具體而言，可依據實施例所記載之方法來測定。
本發明所使用之處理劑在23℃下的pH，為了提高目標多肽的回收率，較佳為5以上，更佳為6以上，特佳為7以上；又，較佳為9以下，更佳為8以下。 本發明所使用之處理劑較佳為液劑。又，就本發明中所使用之處理劑在23℃下的黏度，較佳為0.8～2.0mPa・s，更佳為0.8～1.6mPa・s。
本發明中的處理劑係使用於藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法。處理劑較佳為多肽處理劑，更佳為非目標多肽處理劑。 (試料) 包含目標多肽及非目標多肽的試料可舉出如細胞培養液、細胞勻漿之試料液。更具體而言，可舉出包含非目標多肽之CHO細胞(中國倉鼠卵巢蛋白質)的培養液、包含非目標多肽之融合瘤的培養液、基因重組大腸菌之細胞勻漿。此外，CHO細胞的培養液中，除非目標多肽外，一般包含IgG型抗體，其包含CHO細胞產生的Fc區。
(目標多肽) 目標多肽除抗體、抗體片段、Fc融合蛋白質或其片段外，尚可舉出彼等之突變體或修飾體。其中，較佳為抗體、抗體片段、Fc融合蛋白質或其片段，更佳為抗體，再更佳為包含Fc區(CH2/CH3區(CH2區及CH3區))的IgG型抗體。 於此，本說明書中的「抗體」可包含例如IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及此等之次型等任意類型之免疫球蛋白、其片段、彼等之突變體。又，本說明書中的「抗體」可為動物細胞所產生之抗體、擬人化抗體等嵌合抗體、抗體複合體、包含抗原辨識位置的其他免疫球蛋白修飾體等。 又，本說明書中的「抗體片段」可為包含抗原辨識位置的抗體之片段，亦可為不含抗原辨識位置的抗體之片段。不含抗原辨識位置的抗體片段可舉出例如僅由免疫球蛋白之Fc區所構成的蛋白質、Fc融合蛋白質及彼等之突變體或修飾體等。 (非目標多肽) 非目標多肽可舉出HCP(Host Cell Protein)、源自培養基之成分等。HCP包含源自CHO細胞等抗體產生細胞之細胞片的蛋白質。 本發明之處理劑特別適用於HCP的去除。
[多肽純化方法] 目標多肽的純化，除了以含有還原劑之處理劑對非目標多肽進行處理以外，只要以與周知之多肽純化同樣方式進行即可。 非目標多肽之處理可舉出分離非目標多肽之處理。例如，可藉由將本發明之處理劑預先添加於試料中，並將其通入親和管柱等手法而由試料中分離非目標多肽；又，亦可藉由使試料中的目標多肽結合於固定於固相上之配體，並對填充有此固相的親和管柱流通本發明之處理劑等手法，而由固相中分離非目標多肽。此外，亦可進行此兩者。 作為以本發明之處理劑對非目標多肽進行處理之步驟，為了提高去除非目標多肽之效果或目標多肽的回收率，較佳為由固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理非目標多肽之步驟。如此由固相分離非目標多肽之步驟，有時稱為中間洗淨；於本發明中，在進行此種中間洗淨時，特別適用於藉由使用蛋白質A等免疫球蛋白結合性蛋白質作為配體之親和層析法的抗體純化。中間洗淨只要例如依循常用方法作成固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相填充於管柱容器之狀態，並對其流通本發明之處理劑等來進行即可。
固相只要是使用於親和層析法者則不特別限定。固相的材質，例如除合成高分子、天然高分子外，尚可舉出二氧化矽、玻璃等，較佳為合成高分子、天然高分子。合成高分子可舉出聚苯乙烯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂；天然高分子可舉出以瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等多糖類所構成者。其中，較佳為瓊脂糖、甲基丙烯酸酯樹脂，由於容易填充於管柱容器或大規模化，更佳為甲基丙烯酸酯樹脂。 固相之形狀可舉出粒子、中空纖維、不織布、濾布、單塊，較佳為粒子。
配體只要考量與目標多肽的親和性來選擇即可，較佳為免疫球蛋白結合性蛋白質，更佳為選自蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、VHH抗體、Fc結合蛋白及其功能性突變體的1種或2種以上。此等當中，由於可在抗體醫藥的製造時使用，特佳為蛋白質A。本發明之處理劑，由於不易使抗體由蛋白質A解離，而特別適用於以蛋白質A作為配體的抗體純化。 此外，本說明書中所稱「免疫球蛋白結合性蛋白質」，係指具有對抗體或其片段之結合活性的蛋白質。 又，免疫球蛋白結合性蛋白質係包含蛋白質A之功能性突變體、蛋白質G之功能性突變體、蛋白質L之功能性突變體、VHH抗體之功能性突變體、此等以外的Fc結合蛋白之功能性突變體；此等「功能性突變體」係指蛋白質A之功能性突變體、蛋白質G之功能性突變體、蛋白質L之功能性突變體、VHH抗體之功能性突變體、此等以外的Fc結合蛋白之功能性突變體當中具有免疫球蛋白結合性的突變體。
於此，針對本發明中的目標多肽之純化方法的程序等，茲舉一例更具體地加以說明。 本發明之多肽純化方法較佳為包含使固定於固相上之配體與包含目標多肽及非目標多肽的試料接觸，而使目標多肽與配體結合之步驟(結合步驟)的方法。該結合步驟一般係在由固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理非目標多肽前，或者將本發明之處理劑添加於試料後進行。此外，亦可於結合步驟之前使管柱達平衡。 使配體與試料中的目標多肽結合之方法不特別限定，可舉出例如藉由將固定有配體的粒狀固相填充於管柱容器，並將試料添加於管柱中，使目標多肽與配體接觸而使其結合的方法。
就上述結合步驟後所進行之由固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理非目標多肽之步驟，係如上所述。 本發明之處理劑的用量，在使用管柱時，一般為1～10管柱容量，惟較佳為2～5管柱容量。進行上述處理之溫度(具體而言為進行分離處理之溫度)一般為0～50℃，較佳為5～35℃，更佳為常溫。此外，亦可於本步驟前後，使用對磷酸鈉或三鹽酸緩衝液等中性緩衝液視需求添加氯化鈉或硫酸鈉等無機鹽之洗淨液等，進一步將固相洗淨。
然後，透過使用溶出緩衝液，可由經去除非目標多肽的固相回收目標多肽。此種回收步驟可舉出例如以溶出緩衝液使目標多肽溶出，再使用層析系統之區分收集器回收目標多肽之方法。作為溶出緩衝液，當配體為蛋白質A等時可舉出酸性緩衝液等。 此外，若包含經純化之目標多肽的溶液中含有還原劑時，亦可於回收步驟後去除還原劑。 [實施例]
以下舉出實施例對本發明更詳細地加以說明，惟本發明非限定於此等實施例。
(實施例1～6、比較例1～4) 對管柱容器(GE Healthcare公司製Tricorn5/200 column)以填充高度約20cm填充Ampshere A3(JSR Life Sciences公司製)而製成管柱。將所得管柱連接至AKTAprime plus(GE Healthcare公司製)，以5管柱容量(管柱容積的5倍)、流速1mL/分通入20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)，使其達平衡。 其次，將含有單株抗體Trastuzumab之生物仿製藥的CHO細胞培養上清液以約40g抗體/mL載體的負荷量並以流速1mL/分通入管柱中。 其次，將作為洗淨液1之20mM磷酸鈉、500mM氯化鈉及包含表1所記載之添加劑的緩衝液(pH7.5)以3管柱容量、流速1mL/分通入管柱中。此外，洗淨液1的氧化還原電位(ORP)係使用堀場製作所公司製pH計D-51、ORP電極9300-10D及作為比較電極內部液的氯化鉀溶液(3.33mol/L)來測定。將結果示於表1。 接著，將作為洗淨液2之20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)以5管柱容量、流速1mL/分通入管柱中。 其後，將100mM乙酸鈉緩衝液(pH3.3)以5管柱容量、流速1mL/分通入管柱中，使捕捉於管柱內的單株抗體溶出，回收在波長280nm下按光徑長每1mm之吸光度為50mAu以上之區分。 然後，使用Cygnus Technologies公司製CHO HCP ELISA kit,3G測定回收之區分中所含有的Host Cell Protein(HCP)濃度。將結果示於表1。 又，使用分光光度計(Bio-Rad公司製SmartSpec Plus)測定回收之區分中所含有的抗體濃度，將其乘以回收液量而算出抗體回收量，再進一步除以添加之抗體量而求出抗體回收率。將結果示於表1。
Figure 02_image007
表1中之各記號的定義係如以下所示。 DTT：二硫蘇糖醇 TG：1-硫甘油 Cys：L-半胱胺酸 THPP：參(3-羥丙基)膦 GL：甘油 Arg：L-精胺酸 BAK：氯化苄烷銨
如表1所示，以含有作為還原劑之二硫蘇糖醇、1-硫甘油、L-半胱胺酸或參(3-羥丙基)膦的液劑進行處理時(實施例1～6)，可由固相有效率的去除HCP。

Claims (15)

  1. 一種方法，其係藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法，其包含以含有還原劑之處理劑對非目標多肽進行處理之步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中前述處理劑的氧化還原電位(ORP)為-500～50mV。
  3. 如請求項1之方法，其中前述處理劑的氧化還原電位(ORP)為-500～-250mV。
  4. 如請求項1之方法，其中前述還原劑為可切斷二硫鍵之還原劑。
  5. 如請求項1之方法，其中前述還原劑為分子內具有選自氫硫基及磷原子的1種或2種之還原劑。
  6. 如請求項1之方法，其中前述還原劑為非胺基酸系還原劑。
  7. 如請求項1之方法，其中前述非目標多肽為HCP。
  8. 如請求項1之方法，其中前述目標多肽為抗體、抗體片段、Fc融合蛋白質或其片段。
  9. 如請求項1之方法，其中前述處理步驟係由固定有結合有前述試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理前述非目標多肽之步驟。
  10. 如請求項9之方法，其中在前述分離處理步驟前，包含使固定於固相上之配體與包含目標多肽及非目標多肽的試料接觸，而使前述目標多肽與前述配體結合之步驟。
  11. 如請求項9之方法，其進一步包含使用溶出緩衝液由前述固相中回收目標多肽之步驟。
  12. 如請求項9～11中任一項之方法，其中前述配體為免疫球蛋白結合性蛋白質。
  13. 如請求項12之方法，其中前述免疫球蛋白結合性蛋白質為選自蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、VHH抗體、Fc結合蛋白及其功能性突變體的1種或2種以上。
  14. 一種處理劑，其係使用於藉由親和層析法而由包含目標多肽及非目標多肽的試料中純化出目標多肽之方法的處理劑，其係含有還原劑。
  15. 如請求項14之處理劑，其中前述方法係由固定有結合有試料中的目標多肽之配體的固相，分離處理前述非目標多肽，而純化出目標多肽之方法。
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