BR112020010760A2

BR112020010760A2 - purificação de proteína e inativação de vírus com alquilglicosídeos

Info

Publication number: BR112020010760A2
Application number: BR112020010760-3A
Authority: BR
Inventors: Tobias BRANDT; Hubert Metzner; Carsten Horn; Thomas Nowak
Original assignee: CSL Behring Lengnau AG
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-11-17
Also published as: WO2019121846A1; CN111511756B; AU2018390797A1; SG11202004725PA; US20200317727A1; CA3085885A1; KR20200100771A; CN111511756A; EP3728287B1; JP7458980B2; EP3728287A1; US11479578B2; EP4368210A2; JP2021506875A; DK3728287T3

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para purificar uma proteína recombinante, o qual compreende as etapas de: i) proporcionar uma solução que compreende a proteína recombinante; ii) adicionar um alquilglicosídeo à solução; e iii) purificar a proteína recombinante. A adição do alquilglicosídeo proporciona uma melhor depuração das impurezas relacionadas com o processo. A proteína recombinante purificada da invenção possui baixos níveis de DNA da célula hospedeira, proteína da célula hospedeira e contaminação viral.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PURIFI- CAÇÃO DE PROTEÍNA E INATIVAÇÃO DE VÍRUS COM ALQUILGLI- COSÍDEOS".

CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta invenção situa-se no campo de polipeptídeos expressos de forma recombinante, particularmente na purificação desses polipep- tídeos para uso farmacêutico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A purificação econômica em grande escala de polipeptídeos expressos de forma recombinante é cada vez mais um problema impor- tante para a indústria de biotecnologia. Esses polipeptídeos são produ- zidos por cultura de células, geralmente usando linhagens celulares de mamíferos, leveduras ou bactérias geneticamente modificadas para produzir o polipeptídeo de interesse por inserção de um plasmídeo re- combinante contendo o gene para esse polipeptídeo. Separação do po- lipeptídeo desejado dos componentes celulares, por exemplo, DNA e proteína da célula hospedeira, com uma pureza suficiente para uso como terapêutica humana, representa um desafio formidável. As técni- cas de purificação utilizadas serão idealmente escalonáveis, eficientes, econômicas, confiáveis e atenderão a quaisquer requisitos de pureza do produto final. As técnicas de purificação atuais geralmente envolvem múltiplas separações cromatográficas.

[0003] Um polipeptídeo fabricado usando técnicas recombinantes, particularmente com linhagens celulares de mamíferos, também pode estar contaminado com vírus, incluindo vírus patogênicos que são pre- judiciais à saúde. É importante eliminar qualquer atividade viral conta- minante se o polipeptídeo deve ser administrado a um indivíduo. Atual- mente, existem muitos métodos diferentes para inativar vírus patogêni- cos, incluindo, por exemplo, inativação por calor úmido ou seco, inativa-

ção por solvente/detergente (S/D), inativação por pH, inativação quí- mica e/ou inativação por irradiação gama/ultravioleta. Desses, inativa- ção S/D é talvez o método virucida mais amplamente utilizado, porque quase todos os patógenos humanos significativos são vírus envelopa- dos suscetíveis à ruptura da membrana por solventes e detergentes. No método de inativação S/D, um solvente orgânico e um detergente são misturados com um fluido que inclui o polipeptídeo que é purificado e incubados. O solvente cria um ambiente que promove agregação entre o detergente e a membrana lipídica que encapsula o vírus, e o deter- gente interrompe as interações entre moléculas nessa membrana lipí- dica. Uma vez interrompido, um vírus envelopado não pode mais se li- gar e infectar uma célula e é incapaz de se reproduzir porque uma mem- brana lipídica intacta é essencial para essas atividades. As condições típicas usadas de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) são 0,3% de tri(n-butil)fosfato (TNBP) e 1% de polissor- bato 80 (PS 80, também conhecido como mono-oleato de polioxietileno (80) sorbitano ou TWEEN® 80) incubados a 24°C por um período mí- nimo de 6 horas, ou 0,3% de TNBP e 1% de éter polioxietileno-octil- fenílico (TRITON® X-100) incubados a 24°C por um período mínimo de 4 horas (consulte a ref. 1).

[0004] Embora o tratamento com S/D tenha se tornado a técnica padrão para a inativação de vírus envelopados, seu uso tem algumas desvantagens. As misturas S/D adicionadas durante a fabricação de- vem ser essencialmente removidas antes da geração do produto fi- nal. Por exemplo, o TNBP representa um risco para a saúde nas con- centrações utilizadas e, portanto, é um problema de saúde e segurança em processos de fabricação e produtos acabados. Além disso, deter- gentes usados convencionalmente como o TRITON® X-100 represen- tam uma séria ameaça ambiental e precisam ser descontinuados. A in- corporação dessa etapa de inativação do vírus também aumenta o tempo de processamento e pode diminuir o rendimento do produto em até 10% (ver ref. 2), e requer um aparelho para agitar a mistura durante a incubação. Para minimizar ou eliminar esses problemas, foram pro- postos procedimentos mais simples e mais eficientes de inativação de vírus. Uma opção comum envolve o uso do ácido caprílico de ácidos graxos (octanoato), como proposto, por exemplo, nas referências 2, 3 e

4. Outras opções são descritas nas refs. 5 e 6. Em particular, a ref. 6 testa vários detergentes que são sugeridos como sendo mais compatí- veis com o meio ambiente. Os efeitos do uso de detergentes diferentes na inativação viral são variáveis. Além disso, embora um detergente es- pecífico possa ser capaz de inativação viral, sua influência no processo de purificação adicional não pode ser prevista, por exemplo, em termos de redução de DNA ou proteína da célula hospedeira.

[0005] Existe, portanto, a necessidade de processos adicionais e aprimorados para a purificação de polipeptídeos expressos de forma re- combinante, e particularmente processos que atinjam menor contami- nação por DNA e proteínas e inativem vírus patogênicos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção baseia-se em um processo de purificação no qual um alquilglicosídeo é adicionado ao polipeptídeo recombinante. Os in- ventores verificaram que alquilglicosídeos, e em particular o n-octil-beta- D-glicopiranosídeo, podem proporcionar uma melhor depuração das im- purezas relacionadas ao processo durante as etapas de purificação, por exemplo, quando adicionadas ao material de alimentação antes da etapa de purificação. Por exemplo, os inventores verificaram que a pre- sença de um alquilglicosídeo na corrente de alimentação de uma etapa de purificação por cromatografia pode resultar em níveis significativa- mente mais baixos de DNA da célula hospedeira e proteína da célula hospedeira no estágio de eluato em comparação com o uso de agentes alternativos, como TNBP/PS 80 ou soluções tampão de controle. Além disso, o alquilglicosídeo é capaz de inativar o vírus com eficiência, mesmo quando presente por apenas um curto período sem agitação, reduzindo assim o tempo e os custos do processo. O processo pode ser realizado sob uma ampla variedade de parâmetros, mantendo a inativa- ção eficiente do vírus. Além do n-octil-beta-D-glicopiranosídeo, os in- ventores verificaram que n-decil-beta-D-glicopiranosídeo, n-octil-beta- D-maltosídeo, n-dodecil-beta-D-maltosídeo, n-dodecil-beta-D-glicopira- nosídeo e n-decil-beta-D-maltosídeo são alquilglicosídeos particular- mente eficazes para uso na invenção.

[0007] Por conseguinte, a invenção proporciona um processo para purificar um polipeptídeo recombinante compreendendo as etapas de: i) proporcionar uma solução que compreende o polipeptídeo recombi- nante; ii) adicionar um alquilglicosídeo à solução; e iii) purificar o poli- peptídeo recombinante.

[0008] O polipeptídeo recombinante será tipicamente incluído em uma solução que compreende ainda quantidades mensuráveis de DNA da célula hospedeira e/ou proteína da célula hospedeira. Nessas moda- lidades de realização, a invenção proporciona um processo para sepa- rar o polipeptídeo recombinante do DNA da célula hospedeira e/ou da proteína da célula hospedeira, em que a etapa (iii) resulta nessa sepa- ração. A adição do alquilglicosídeo à solução pode melhorar essa sepa- ração em comparação com o mesmo processo sem o alquilglicosídeo, por exemplo, melhorar a separação em pelo menos 10% (particular- mente pelo menos 20%). Os inventores verificaram que é possível obter uma separação particularmente eficaz quando a etapa (iii) é realizado mediante realização de uma etapa de cromatografia na solução. A cro- matografia pode ser selecionada a partir de qualquer cromatografia ade- quada, por exemplo, de imunoafinidade, afinidade, interação hidrofó- bica, troca iônica, multimodal, cromatografia por exclusão de tamanho ou de afinidade por quelato metálico. Nas modalidades de realização da invenção abaixo, os inventores utilizam em particular uma etapa da cro- matografia de imunoafinidade. A cromatografia de interação hidrofóbica e/ou cromatografia de troca iônica também são particularmente úteis.

[0009] O alquilglicosídeo adicionado à solução que compreende o polipeptídeo recombinante pode ter uma concentração nessa solução de preferência entre 0,1 e 1.000 mM (por exemplo, entre 1 e 500 mM, 3 e 400 mM, 5 e 200 mM, 10 e 100 mM, 20 e 90 mM) e geralmente é de cerca de 25 a 80 mM.

[00010] Quando a etapa (iii) é realizada por meio da realização de uma etapa de cromatografia na solução, o alquil glicosídeo pode ser adicionalmente incluído no tampão de lavagem da etapa de cromato- grafia. Em outras modalidades de realização da presente invenção, a inclusão do alquil glicosídeo no tampão de lavagem da etapa de croma- tografia pode ser usada como uma alternativa à realização da etapa (ii) como uma etapa separada. Nessas modalidades de realização, a inven- ção proporciona, portanto, um processo para purificar um polipeptídeo recombinante compreendendo as etapas de: i) proporcionar uma solu- ção que compreende o polipeptídeo recombinante; e iii) purificar o poli- peptídeo recombinante executando uma etapa de cromatografia na so- lução, em que um alquil glicosídeo é incluído no tampão de lavagem da etapa de cromatografia. Incluindo o alquil glicosídeo no tampão de lava- gem da cromatografia, os níveis de DNA das células hospedeiras e/ou os níveis da proteína da célula hospedeira (HCP) e/ou outras impurezas de proteínas poderiam ainda ser reduzidos em comparação ao processo de referência utilizando um tampão de lavagem correspondente sem al- quil glicosídeo.

[00011] Outras etapas de purificação podem ser incluídas no pro- cesso, antes da etapa de adição do alquil glicosídeo à solução ou após a etapa (iii). A etapa de purificação é tipicamente uma etapa de croma-

tografia. A cromatografia pode ser selecionada de qualquer cromatogra- fia adequada, por exemplo, cromatografia de imunoafinidade, afinidade, interação hidrofóbica, troca iônica, multimodal, por exclusão de tamanho ou de afinidade por quelato metálico.

[00012] Por exemplo, uma ou mais etapas de cromatografia de inte- ração hidrofóbica podem ser incluídas no processo. Tipicamente, uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica é realizada na solução após a etapa (iii), particularmente quando a etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de imunoafinidade. Da mesma forma, uma ou mais eta- pas de cromatografia de troca iônica podem ser incluídas no pro- cesso. Tipicamente, é realizada uma etapa de cromatografia de troca iônica na solução antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solu- ção. Uma etapa de cromatografia de troca iônica também pode ser rea- lizada na solução após a etapa (iii), particularmente quando a etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de imunoafinidade. Nessa modalidade de realização da presente invenção, a etapa de cromatografia de imunoa- finidade é tipicamente seguida por uma etapa de cromatografia de inte- ração hidrofóbica (como descrito acima), que é então seguida pela etapa de cromatografia de troca iônica.

[00013] Por exemplo, os inventores verificaram que um processo particularmente eficaz para separar o polipeptídeo recombinante do DNA da célula hospedeira e/ou proteína da célula hospedeira compre- ende as etapas de: a) proporcionar uma solução que compreende o po- lipeptídeo recombinante; b) purificar o polipeptídeo recombinante reali- zando uma etapa de cromatografia de troca iônica na solução; c) adici- onar um alquilglicosídeo à solução; d) purificar o polipeptídeo recombi- nante realizando uma etapa de cromatografia de imunoafinidade na so- lução; e) purificar o polipeptídeo recombinante executando uma etapa de interação hidrofóbica ou cromatografia multimodal na solução; e f) purificar o polipeptídeo recombinante realizando uma etapa adicional de cromatografia de troca iônica na solução.

[00014] Consequentemente, a invenção proporciona, em um pro- cesso para purificar um polipeptídeo recombinante em uma solução, o melhoramento que consiste na adição de um alquilglicosídeo à solu- ção. A adição pode resultar em reduzida contaminação por DNA e/ou proteína da célula hospedeira após o processo. Adicional ou alternati- vamente, a adição pode proporcionar inativação eficiente do vírus. Além disso, o rendimento do polipeptídeo recombinante obtido pelo processo pode ser melhorado.

[00015] A invenção também proporciona o uso de um alquilglicosí- deo como aditivo a uma solução que compreende um polipeptídeo re- combinante. O uso pode resultar em contaminação reduzida por DNA e/ou proteína da célula hospedeira após purificação subsequente do po- lipeptídeo recombinante. Adicional ou alternativamente, o uso pode pro- porcionar uma inativação eficiente do vírus.

[00016] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante compreendendo um nível de contaminação por DNA da célula hospedeira que é inferior a 5.000 pg/ml (por exemplo, ≤4.000 pg/ml, ≤3.000 pg/ml, ≤2.500 pg/ml, ≤2.000 pg/ml, ≤1.500 pg/ml, ≤1.000 pg/ml, ≤500 pg/ml, ≤200 pg/ml, ≤100 pg/ml, ≤50 pg/ml etc.). Ti- picamente, o nível de contaminação por DNA da célula hospedeira é menor que 500 pg/ml, particularmente menor que 200 pg/ml.

[00017] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante que compreende um nível de contaminação por DNA da célula hospedeira que é reduzido por um fator de pelo me- nos 1,5, preferencialmente de pelo menos 2, de pelo menos 5, de pelo menos 10, de pelo menos 20, de pelo menos 50, de pelo menos 100, de pelo menos 150 ou de pelo menos 200, quando comparado com um processo de referência que é idêntico ao processo da invenção, com exceção de que não é usado nenhum alquilglicosídeo ou com exceção de que é usado um tratamento S/D convencional como TNBP/PS 80.

[00018] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante, preferencialmente após a purificação do po- lipeptídeo recombinante de acordo com a etapa iii), compreendendo um nível de contaminação por DNA da célula hospedeira que é reduzido por um fator de pelo menos 10, preferencialmente de pelo menos 100, de pelo menos 1.000, de pelo menos 10.000, de pelo menos 15.000, de pelo menos 20.000 ou de pelo menos 25.000, quando comparado com o nível de contaminação por DNA da célula hospedeira antes da purifi- cação do polipeptídeo recombinante, de preferência de acordo com a etapa iii). Tais reduções são observadas quando a etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de imunoafinidade, por exemplo.

[00019] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante compreendendo um nível de contaminação por proteína da célula hospedeira (HCP) inferior a 5.000 ng/ml (por exemplo, ≤4.000 ng/ml, ≤3.500 ng/ml, ≤3.000 ng/ml, ≤2.500 ng/ml, ≤2.000 ng/ml, ≤1.800 ng/ml, ≤1.500 ng/ml, ≤1.000 ng/ml etc.). Tipica- mente, o nível de contaminação por proteína da célula hospedeira é in- ferior a 5.000 ng/ml, particularmente inferior a 3.000 ng/ml.

[00020] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante compreendendo um nível de contaminação por proteína da célula hospedeira (HCP) que é reduzido por um fator de pelo menos 1,5, preferencialmente de pelo menos 2, de pelo menos 2,5, de pelo menos 3 ou de pelo menos 3,5, quando comparado com um processo de referência que é idêntico ao processo da invenção, com exceção de que não é nenhum alquilglicosídeo ou com exceção de que é usado um tratamento S/D convencional como TNBP/PS 80.

[00021] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante, preferencialmente após a purificação do po- lipeptídeo recombinante de acordo com a etapa iii), compreendendo um nível de contaminação por proteína da célula hospedeira (HCP) que é reduzido por um fator de pelo menos 10, de preferência de pelo menos 100, de pelo menos 200, de pelo menos 300, de pelo menos 400, de pelo menos 500, de pelo menos 700, de pelo menos 800, de pelo menos 900 ou de pelo menos 1.000, quando comparado com o nível de conta- minação por proteína da célula hospedeira antes da purificação do poli- peptídeo recombinante, de preferência de acordo com a etapa iii). Tais reduções são observadas quando a etapa (iii) é uma etapa de cromato- grafia de imunoafinidade, por exemplo.

[00022] Em particular, o processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante em que: (a) o nível de con- taminação por DNA da célula hospedeira é inferior a 5.000 pg/ml (como descrito acima); e (b) o nível de contaminação por proteína da célula hospedeira (HCP) é inferior a 5.000 ng/ml (como descrito acima).

[00023] O processo da invenção pode proporcionar uma solução do polipeptídeo recombinante em que o rendimento do polipeptídeo recom- binante obtido é melhorado por um fator de pelo menos 1,05; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9 ou 1,9 ou pelo menos 2, quando compa- rado com o rendimento do polipeptídeo recombinante obtido por um pro- cesso de referência que é idêntico ao processo da invenção, com exce- ção de que não é usado nenhum alquilglicosídeo ou com exceção de que é usado um tratamento S/D convencional como TNBP/PS 80.

[00024] A solução do polipeptídeo recombinante de acordo com um ou mais dos processos aqui mencionados é preferencialmente propor- cionada como resultado de uma purificação do polipeptídeo recombi- nante como aqui descrito, particularmente como resultado da purifica- ção de acordo com a etapa iii). Alternativa ou adicionalmente, o alquil- glicosídeo pode ser incluído no tampão de lavagem de uma etapa de cromatografia.

[00025] A invenção também proporciona uma solução que compre- ende um polipeptídeo recombinante e um alquilglicosídeo, em particular uma solução obtida ou obtenível a partir da etapa (ii) do processo da invenção.

[00026] A invenção também proporciona uma solução que compre- ende um polipeptídeo recombinante purificado, em particular uma solu- ção obtida ou obtenível a partir do processo da invenção. A solução pode conter uma quantidade residual de alquilglicosídeo. A quantidade de alquilglicosídeo pode estar abaixo do limite de detecção, por exem- plo, ao usar espectroscopia de massa. Por exemplo, a quantidade de alquilglicosídeo pode ser menor que 1,5 pg/ml (ou menor que 40 ng/mg de polipeptídeo recombinante purificado). A quantidade de alquilglicosí- deo pode, em particular, ser inferior a 10 ng/mg de polipeptídeo recom- binante purificado.

[00027] A invenção também proporciona uma solução que compre- ende um polipeptídeo recombinante em que a solução compreende um nível de contaminação por DNA da célula hospedeira que é inferior a

5.000 pg/ml (por exemplo, ≤4.000 pg/ml, ≤3.000 pg/ml, ≤2.500 pg/ml, ≤2.000 pg/ml, ≤1.500 pg/ml, ≤1.000 pg/ml, ≤500 pg/ml, ≤200 pg/ml, ≤100 pg/ml, ≤50 pg/ml etc.). Tipicamente, o nível de contaminação por DNA da célula hospedeira é menor que 500 pg/ml, particularmente menor que 200 pg/ml.

[00028] A invenção também proporciona uma solução que compre- ende um polipeptídeo recombinante em que a solução compreende um nível de contaminação por proteínas da célula hospedeira que é inferior a 5.000 ng/ml (por exemplo, ≤4.000 ng/ml, ≤3.500 ng/ml, ≤3.000 ng/ml, ≤2.500 ng/ml, ≤2.000 ng/ml, ≤1.800 ng/ml, ≤1.500 ng/ml, ≤1.000 ng/ml etc.). Tipicamente, o nível de contaminação por proteína da célula hos- pedeira é inferior a 5.000 ng/ml, particularmente inferior a 3.000 ng/ml.

[00029] A invenção também proporciona uma solução que compre- ende um polipeptídeo recombinante em que: (a) o nível de contamina- ção por DNA da célula hospedeira é inferior a 5.000 pg/ml (como des- crito acima); e (b) o nível de contaminação por proteína da célula hos- pedeira for inferior a 5.000 ng/ml (como descrito acima).

[00030] A invenção também proporciona o uso de um alquilglicosí- deo como aditivo para uma solução que compreende um polipeptídeo recombinante em que o alquilglicosídeo é adicionado sem qualquer sol- vente orgânico, tal como TNBP. Os solventes orgânicos neste contexto podem, por exemplo, ser quaisquer solventes à base de carbono. De acordo com a invenção, o alquilglicosídeo pode ser fornecido sem mis- tura prévia com um solvente que não seja água ou que não sejam solu- ções tampão aquosas ou similares.

[00031] A invenção também proporciona o uso de um alquilglicosí- deo como aditivo para um tampão de lavagem para uma etapa de cro- matografia como aqui descrito.

[00032] A invenção também proporciona um tampão de lavagem para uso em uma etapa de cromatografia, em que o tampão compre- ende um alquilglicosídeo como aditivo. O tampão de lavagem é de pre- ferência configurado para ser aplicável em um processo de purificação de um polipeptídeo recombinante de acordo com a invenção.

[00033] O alquilglicosídeo pode ter uma concentração nesse tampão de lavagem entre 0,1 e 1.000 mM (por exemplo, entre 0,2 e 500 mM, 0,5 e 300 mM, 1 e 200 mM, 1,5 e 100 mM, 2 e 80 mM) e geralmente é de cerca de 10 a 100 mM.

[00034] Assim, de acordo com uma modalidade de realização prefe- rida da invenção, é proporcionada uma solução que compreende o po- lipeptídeo recombinante e pode ser incubada, se necessário; a solução é usada para carregar uma coluna de cromatografia e antes da eluição a coluna é lavada com um tampão de lavagem contendo um alquilglico- sídeo. A concentração final de alquilglicosídeo no tampão de lavagem situa-se tipicamente entre 0,1 e 1.000 mM (por exemplo, entre 0,2 e 500 mM, 0,5 e 300 mM, 1 e 200 mM, 1,5 e 100 mM, 2 e 80 mM) e geralmente é de cerca de 10 a 100 mM. Os inventores verificaram que neste caso a concentração também pode estar abaixo da concentração crítica de micelas (CMC) do alquilglicosídeo. Usando esse procedimento de lava- gem, o DNA da célula hospedeira e/ou o HCP e/ou outras impurezas proteicas podem ser reduzidos em mais de 5 vezes, mais de 10 vezes, mais de 25 vezes, mais de 50 vezes ou até mais de 100 vezes em com- paração com um processo de referência que usa um tampão de lava- gem correspondente sem alquilglicosídeo. Uma redução de mais de 100 vezes dessa impureza proteica é demonstrada no exemplo 3 abaixo. Uma impureza proteica pode ser, por exemplo, um ou mais fragmentos do polipeptídeo recombinante de interesse, um pró-peptídeo do polipep- tídeo recombinante de interesse, qualquer proteína coexpressa, etc.

[00035] Em outro aspecto da invenção, os inventores verificaram que os alquilglicosídeos têm efeitos particularmente vantajosos quando em- pregados para inativação viral. Os vírus envelopados são sensíveis aos alquilglicosídeos e em comparação com agentes alternativos como TNBP/PS 80, os alquilglicosídeos sofrem pouca ou nenhuma perda da capacidade de inativação quando usados em baixas temperaturas. Eles podem até ser usados sem agitação, por exemplo, sem agitação. Exem- plos de alquilglicosídeos para esse fim são n-octil-beta-D-glicopiranosí- deo, n-decil-beta-D-glicopiranosídeo, n-octil-beta-D-maltosídeo, n-do- decil-beta-D-maltosídeo, n-dodecil-beta-D-glicopiranosídeo e n-decil- beta-D-maltosídeo, com n-octil-beta-D-glicopiranosídeo sendo particu- larmente eficaz.

[00036] Esse outro aspecto da invenção pode ser aplicado com o processo da invenção para purificar um polipeptídeo recombinante. Por exemplo, a etapa ii) desse processo (isto é, adicionar um alquilglicosí- deo à solução que compreende o polipeptídeo recombinante) pode ainda compreender incubar a solução. A incubação resulta na inativa- ção de um ou mais vírus que podem estar na solução. A incubação pode ser realizada como descrito abaixo. Os vírus normalmente contaminam vírus que entram na solução a partir do ambiente ou estavam presentes no material do qual a solução foi feita. A presença ou ausência dos vírus na solução pode não ser conhecida e, portanto, a invenção pode ser usada para reduzir o risco de contaminação viral ao desativar um ou mais vírus que possam estar presentes na solução. Quando vírus estão presentes na solução, a incubação resulta em inativação de um ou mais desses vírus.

[00037] Alternativamente, esse aspecto da invenção pode ser apli- cado como um processo independente. Desse modo, a invenção pro- porciona um processo para inativar um ou mais vírus que podem estar em uma solução que inclui um polipeptídeo recombinante que compre- ende uma etapa de adição de um alquilglicosídeo à solução e incubação da solução. Os referidos um ou mais vírus geralmente são vírus enve- lopados. A incubação pode ser realizada por qualquer período de tempo adequado, tipicamente pelo tempo necessário para alcançar uma redu- ção viral eficaz. O fator de redução de vírus alcançado em log10 pode, por exemplo, ser de pelo menos 4. Em modalidades de realização típi- cas da presente invenção, a incubação é realizada entre 1 minuto e 24 horas, entre 2 minutos e 12 horas, preferencialmente entre 10 minutos e 5 horas, e geralmente durante cerca de 30 minutos ou mais. A incu- bação é convenientemente realizada a temperatura ambiente, embora bons resultados também possam ser alcançados em temperaturas mais baixas, por exemplo, ≤20°C, e até mesmo entre 4 e 10°C. Essas tem- peraturas mais baixas são particularmente vantajosas se a proteína é sensível a temperatura. A concentração final de alquilglicosídeo antes da incubação situa-se tipicamente entre 0,1 e 1.000 mM (por exemplo, entre 1 e 500 mM, 3 e 400 mM, 5 e 200 mM, 10 e 100 mM, 20 e 90 mM) e geralmente é de cerca de 25 a 80 mM.

Os inventores verificaram que uma concentração acima da concentração crítica de micelas (CMC) do alquilglicosídeo é útil, particularmente para inativação viral.

Normal- mente, a concentração será 1,5; 2, 3 ou 4 vezes superior a esse CMC.

Esse processo para inativar um ou mais vírus foi descrito acima em re- lação a uma solução compreendendo um polipeptídeo recombinan- te.

No entanto, aquele versado no estado da técnica compreenderá que o processo pode ser aplicado a qualquer material de alimentação ade- quado, em particular material derivado de plasma (humano) ou simi- lar.

O material derivado do plasma é particularmente suscetível a con- taminação viral.

Por conseguinte, em um aspecto mais geral, a invenção proporciona um processo para inativar um ou mais vírus que podem es- tar em uma solução que compreende uma etapa de adição de um alqui- lglicosídeo à solução e incubação da solução.

A solução pode em parti- cular ser derivada de uma composição biológica, como sangue total, concentrados de glóbulos vermelhos, concentrados de plaquetas, con- centrados de leucócitos, proteínas de células sanguíneas, plasma san- guíneo, plasma rico em plaquetas, um concentrado plasmático, um pre- cipitado de qualquer fracionamento do plasma, um sobrenadante de qualquer fracionamento do plasma, frações proteicas do plasma sanguí- neo, proteínas ou outros componentes sanguíneos purificados ou parci- almente purificados, soro, sêmen, colostro de mamífero, leite, saliva, ex- tratos placentários, um crioprecipitado, um criossobrenadante, um li- sado celular, meio de cultura ou cultura de células de mamíferos, pro- dutos de fermentação, líquido ascítico, proteínas presentes nas células sanguíneas e produtos produzidos em cultura de células por células nor- mais ou transformadas (por exemplo, via tecnologia de DNA recombi- nante ou anticorpo monoclonal).

[00038] De acordo com uma modalidade de realização preferida da presente invenção, o alquilglicosídeo é usado para inativar um ou mais vírus envelopados, em particular em um ou mais dos processos aqui descritos, em que os referidos um ou mais vírus são preferencialmente selecionados do grupo que consiste em MuLV (vírus da leucemia mu- rina), BVDV (vírus da diarreia viral bovina), PRV (vírus da pseudorraiva), VSV (vírus da estomatite vesicular) e VACV (vírus Vaccinia). O polipeptídeo recombinante

[00039] O termo "polipeptídeo" é aqui empregado para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. O termo também abrange um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, sulfatação ou qualquer outra manipu- lação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação ou de prolongamento de meia-vida. Também estão incluídos no termo, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais etc.), bem como outras modificações conhecidas no estado da técnica. O po- lipeptídeo pode estar na forma de um multímero de polipeptídeos indivi- duais.

[00040] O polipeptídeo da invenção pode ser qualquer polipeptídeo de interesse, particularmente aquele em que seja desejada a eliminação de qualquer atividade viral contaminante. O polipeptídeo da invenção pode preferencialmente ser um polipeptídeo solúvel em água, particu- larmente não um polipeptídeo inserido em membrana.

[00041] O polipeptídeo pode ser qualquer polipeptídeo de interesse terapêutico. O polipeptídeo pode ser, em particular, selecionado do grupo que compreende um anticorpo, uma proteína do sangue, uma en- zima, um receptor, um hormônio, um fator regulador, um antígeno, uma citocina e outros polipeptídeos de interesse. Por exemplo, pode ser um anticorpo monoclonal, seus domínios, dímeros ou oligômeros desses anticorpos ou seus domínios, um anticorpo biespecífico, um domínio de ligação com antígeno de cadeia única (ScFv) ou um polipeptídeo qui- mérico.

[00042] O polipeptídeo pode em particular também ser uma proteína do sangue, por exemplo, uma proteína de coagulação, albumina ou uma imunoglobulina. Exemplos não limitativos de uma proteína do sangue incluem ADAMTS-13, α1-antiplasmina, α2-antiplasmina, antitrombina III, pró-coagulante de câncer, eritropoietina, Fator II, Fator V, Fator VII, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator XII, Fator XIII, fibronectina, fibrinogênio, cofator II da heparina, cininogênio de alto peso molecular, imunoglobulina, plasminogênio, inibidor do ativador do plasminogênio- 1, inibidor do ativador do plasminogênio-2, pré-calicreína, proteína C, proteína S, proteína Z, inibidor da protease relacionada com proteína Z, fator tecidual, ativador do plasminogênio tecidual, uroquinase ou Fator de Von Willebrand. O polipeptídeo pode ser uma proteína de fusão do mesmo.

[00043] O polipeptídeo também pode ser uma variante de polipeptí- deo de ocorrência natural, por exemplo, uma variante de um dos poli- peptídeos descritos acima. Uma variante pode compreender fragmen- tos do referido polipeptídeo de ocorrência natural. Os inventores desen- volveram originalmente o processo da invenção para purificar variantes recombinantes de proteínas de fusão do Fator de Von Willebrand. A classe geral de variantes é descrita na ref. 7, e a variante "D’D3-FP" desse documento (onde é designada SEQ ID NO: 2) é o polipeptídeo representativo que os inventores usaram nas modalidades de realiza- ção da invenção abaixo.

[00044] O polipeptídeo pode ser fundido com uma sequência de ami- noácidos heteróloga. A referida sequência de aminoácidos heteróloga compreende ou consiste em um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em regiões constantes de imunoglobulina e suas partes, por exemplo, o fragmento Fc, transferrina e seus fragmentos, o peptídeo com término C da gonadotropina coriônica humana, cadeias aleatórias solvatadas com grande volume hidrodinâmico conhecidas como XTEN, repetições de homoaminoácidos (HAP), repetições de prolina-alanina- serina (PAS), albumina, afamina, alfa-fetoproteína, proteína de ligação à vitamina D, polipeptídeos capazes de se ligar em condições fisiológi- cas a regiões constantes da albumina ou imunoglobulina e combinações dos mesmos. De acordo com uma modalidade de realização preferida da presente invenção, o polipeptídeo é fundido à albumina ou a um fra- gmento Fc, em particular à albumina.

[00045] O polipeptídeo pode alternativa ou adicionalmente ser conju- gado com outra porção. Essa fração é selecionada do grupo que con- siste em hidroxietilamido (HES), polietilenoglicol (PEG), ácidos polissiá- licos (PSAs), polipeptídeos do tipo elastina, polímeros de heparosana, ligantes de ligação com ácido hialurônico e com albumina, por exemplo, cadeias de ácidos graxos ou peptídeos de ligação com albumina e com- binações dos mesmos.

[00046] O termo "polipeptídeo recombinante" é aqui empregado para se referir a um polipeptídeo que foi expresso de forma recombi- nante. Em particular, o polipeptídeo foi obtido a partir de um organismo transgênico geneticamente modificado para expressar o polipeptídeo, ou a partir de uma linhagem celular que produz de forma recombinante o polipeptídeo. Exemplos não limitativos de um organismo incluem pás- saros e mamíferos, como, por exemplo, camundongos, ratos, cabras, ovelhas, cavalos, burros, vacas, primatas e humanos. Exemplos não li- mitativos de um organismo transgênico incluem organismos que foram geneticamente modificados para expressar o polipeptídeo. Um polipep- tídeo de um organismo transgênico pode ser obtido a partir de um ex- trato de fluido, tecido ou órgão biológico ou outra fonte de um organismo mediante uso de métodos de rotina conhecidos no estado da téc- nica. Mais tipicamente, no entanto, um sistema de expressão procari- onte e/ou eucariótico é usado para expressar de forma recombinante o polipeptídeo. Os sistemas de expressão podem incluir qualquer uma de várias características, incluindo, sem limitação, expressão induzível, ex- pressão não induzível, expressão constitutiva, expressão específica de tecido, expressão específica de célula, expressão mediada por vírus, expressão estavelmente integrada e expressão transitória. Como pro- duzir e usar esses sistemas de expressão é conhecido no estado da técnica.

[00047] Geralmente, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse é clonado em um vetor de expressão. Os vetores de ex- pressão de procariontes compreendem tipicamente uma origem de re- plicação, um promotor adequado e/ou elementos potenciadores, e tam- bém sítios necessários para ligação ao ribossomo, poliadenilação, ter- minação de transcrição, bem como sequências não transcritas de flan- queio 5' e outros elementos genéticos não transcritos. Exemplos de ve- tores procarióticos incluem pET e pRSET que usam promotores como, por exemplo, um promotor de bacteriófago T7. Os vetores de expressão eucarióticos compreendem tipicamente uma origem de replicação, um promotor adequado e/ou elementos melhoradores, e também sítios ne- cessários para ligação ao ribossomo, poliadenilação, splicing, termina- ção de transcrição, bem como sequências não transcritas de flanqueio 5' e outros elementos genéticos não transcritos. Exemplos de vetores de levedura incluem pAO, pMET, pPIC, pPICZ e pYES usando promo- tores tais como, por exemplo, AOX1, AUG1, GAP e GALL. Exemplos de vetores de insetos incluem pAc5, pBAC, pIB, pMIB, pMT, usando pro- motores tais como, por exemplo, PH, p10, MT, Ac5, OplE2, gp64 e polh. Exemplos de vetores de mamíferos incluem pBPV, pCMV, pCMVTNT, pDNA, pDisplay, pMSG, pOG44, PQBI25, pRc/RSV, pSEC- Tag, pSECTag2, pSG, pSV2cat, pSVK3, pSVL, pUCIG-MET, pVAX1, pWLneo e pXT1, usando promotores tais como, por exemplo, beta-ca- seína, beta-lactoglobulina, promotor de ácido do soro do leite, HSV timi- dina cinase, vírus símio precoce e tardio 40 (SV40), LTRs de retrovírus e metalotioneína-1 de camundongo. Marcadores selecionáveis incluem ampicilina, cloranfenicol transferase, canamicina, neomicina e tetraci- clina. Vetores de expressão adequados são conhecidos no estado da técnica e estão disponíveis comercialmente.

[00048] Células capazes de expressar um vetor compatível incluem células procarióticas, células eucarióticas e linhagens celulares deriva- das de células procarióticas e eucarióticas. Exemplos não limitativos de cepas procarióticas incluem aquelas derivadas de, por exemplo, Esche- richia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficle, Caulobacter crescentus, Lacto- coccus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirullonas, Neisseria meningirullonas, Pseudomonas fluorescens e Salmonella typhimurium. Exemplos não limitativos de cepas de leveduras incluem aquelas derivadas de, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevi- siae e Yarrowia lipolytica. Células vegetais e linhagens celulares deriva- das de plantas incluem células de, por exemplo, espécies de monocoti- ledôneas, tal como, por exemplo, Zea mays, e espécies de dicotiledô- neas, tais como Arabidopsis thaliana, Triticum aestivum, Lemna gibba e Lemna minor. Células de insetos e linhagens celulares derivadas de in- setos incluem células de, por exemplo, Spodoptera frugiperda, Tricho-

plusia ni, Drosophila melanogaster e Manduca sexta. Exemplos não li- mitativos de linhagens celulares de insetos incluem linhagens celulares High-Five, Kc, linhagem Drosophila 2 (S2), SF9 e SF21 de Schnei- der. Linhagens celulares de mamíferos e linhagens de células derivadas de células de mamíferos incluem células de, por exemplo, camundongo, rato, hamster, porcinas, bovinas, equinas, de primatas e huma- nas. Exemplos não limitativos de linhagens celulares de mamíferos in- cluem linhagens de células 1A3, 3T3, 6E6, 10T1/2, APRT, BALB/3T3, BE(2)-C, BHK, BT, C6, C127, CHO, CHP3, COS-1, COS- 7, CPAE, ESK-4, FB2, GH1, GH3, HeLa, HEK-293, HepG2, HL-60, IMR-32, L2, LLC-PK1, LM, MCF-7, NB4, NBL-6, NCTC, Neuro 2A, NIE-115, NG108- 15, NIH3T3, PC12, PK15, SBAC, SH-SY5Y, SK-Hep, SK-N-DZ, SK-N- F1, SK-N-SH, ST, SW-13 e W-1. As linhagens celulares podem ser ob- tidas da American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures e/ou a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.

[00049] O polipeptídeo recombinante será tipicamente incluído em uma solução que compreende DNA da célula hospedeira e/ou proteína da célula hospedeira (mais tipicamente as duas). A solução é tipica- mente uma solução aquosa, porque os polipeptídeos ocorrem em um ambiente aquoso na natureza. O DNA da célula hospedeira e/ou a pro- teína da célula hospedeira estão presentes na solução do organismo transgênico ou linhagem celular que expressou de forma recombinante o polipeptídeo. Quando o polipeptídeo foi expresso por uma linhagem celular, a solução pode compreender meio de cultura da cultura da li- nhagem celular. O polipeptídeo recombinante pode ter sido transferido para um meio específico para purificação subsequente.

[00050] Tipicamente, a quantidade de DNA da célula hospedeira na solução que compreende o polipeptídeo recombinante na etapa (i) situa- se entre 0,01 μg/ml e 100 μg/ml, por exemplo, entre 0,1 μg/ml e 50 μg/ml. Similarmente, a quantidade de proteína da célula hospedeira na etapa (i) situa-se tipicamente entre 5 μg/ml e 5 mg/ml, por exemplo, en- tre 50 μg/ml e 1.000 μg/ml. Como discutido acima, é comum que ambas as espécies contaminantes estejam presentes, de modo que a solução tenha entre 0,01 e 100 μg/ml de DNA da célula hospedeira (como des- crito acima, por exemplo, pelo menos 100 μg/ml) e entre 5 μg/ml e 5 mg/ml de proteína da célula hospedeira (como descrito acima, por exemplo, pelo menos 100 ng/ml). Etapas de purificação antes da adição do alquilglicosídeo

[00051] Como discutido acima, outras etapas de purificação podem ser incluídas no processo, antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solução ou após a etapa (iii). Cada etapa de purificação adicional é tipicamente uma etapa de cromatografia. A cromatografia pode ser se- lecionada a partir de qualquer cromatografia adequada, por exemplo, cromatografia de imunoafinidade, afinidade, interação hidrofóbica, troca iônica, multimodal, por exclusão de tamanho ou de afinidade por quelato metálico.

[00052] Por exemplo, uma etapa de cromatografia de troca iônica pode ser realizada na solução antes da etapa de adição do alquilglico- sídeo à solução. Um exemplo dessa abordagem é fornecido nas moda- lidades de realização da invenção abaixo. Os inventores verificaram que cromatografia de troca aniônica (como descrita abaixo) é particular- mente adequada para essa etapa, por exemplo, com uma matriz de cro- matografia Poros™ XQ.

[00053] A invenção utiliza tipicamente cromatografia de troca aniô- nica como cromatografia de troca iônica. Na cromatografia de troca aniônica, moléculas carregadas negativamente são atraídas para um suporte sólido carregado positivamente. Um suporte sólido carregado positivamente pode ser preparado por qualquer meio conhecido daque- les versados no estado da técnica e normalmente envolverá a ligação covalente de um ligante funcional carregado positivamente com um su- porte sólido. Os ligantes funcionais carregados positivamente adequa- dos dependerão invariavelmente do polipeptídeo a ser separado da so- lução. Exemplos de resinas de troca aniônica adequadas são aqueles que compreendem um grupo amina quaternária funcional (Q) e/ou um grupo amina terciária (DEAE) ou um grupo dietilaminopropila (ANX). Matrizes de cromatografia de troca aniônica comercialmente dis- poníveis incluem, mas sem limitação, DEAE celulose, Poros™ PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50, XQ da ThermoFisher, MonoQ™, Mi- niQ™, Source™ 15Q e 30Q, Q, DEAE e ANX Sepharose Fast Flow™, Q Sepharose High Performance™, QAE SEPHADEX™ e FAST Q SEPHAROSE™ da GE Healthcare, WP PEI™, WP DEAM™, WP QUAT™ da J.T. Baker, Hydrocell™ DEAE e Hydrocell™ QA da Bio- chrom Labs Inc., UNOsphere™ Q, Macro-Prep™ DEAE e Macro-Prep™ High Q da Biorad, Ceramic HyperD™ Q, Ceramic HyperD™ DEAE, Q HyperZ™, Trisacryl™ M e LS™ DEAE, Spherodex™ LS DEAE, QMA Spherosil™ LS, QMA Spherosil™ M da Pall Technologies, DOWEX™ malha fina base forte Tipo I e Tipo II matriz de ânions e DOWEX™ MO- NOSPHER E 77, base fraca ânion da Dow Liquid Separations, Matrex Cellufme™ A200, A500, Q500 e Q800, da Millipore, Fractogel™ EMD TMAE3 Fractogel™ EMD DEAE e Fractogel™ EMD DMAE da EMD, tro- cadores de ânions fracos e fortes tipos I e II Amberlite™, trocadores de ânions fracos e fortes tipos I e II DOWEX™, trocadores de ânions fracos e fortes tipos I e II Diaion™, Duolite™ da Sigma-Aldrich, TSK™ gel Q e DEAE 5P e 5PW-HR, Toyopearl™ SuperQ-650S, 650M e 650C3 QAE- 26-550C e 650S, DEAE-650M e 650C da Tosoh, e QA52™, DE23™, DE32™, DE51™, DE52™, DE53™, Express-Ion™ D e Express-Ion™ Q da Whatman.

[00054] Se desejável, pode ser utilizada uma membrana de croma- tografia de troca aniônica em vez de uma matriz de cromatografia de troca aniônica. Membranas de troca aniônica disponíveis comercial- mente incluem, mas sem limitação, membrana Sartobind™ Q da Sarto- rius, Mustang™ Q da Pall Technologies e Intercept™ Q da Millipore.

[00055] Como alternativa à cromatografia de troca aniônica, pode ser possível, em algumas modalidades de realização da presente invenção, usar cromatografia de troca catiônica. Na cromatografia de troca catiô- nica, moléculas carregadas positivamente são atraídas para um suporte sólido carregado negativamente. Qualquer ligante carregado negativa- mente ligado à fase sólida adequado para formar a matriz de troca ca- tiônica pode ser usado, por exemplo, um carboxilato, sulfonato e outros, como descrito abaixo. Matrizes de troca catiônica disponíveis comerci- almente incluem, mas sem limitação, por exemplo, aquelas que pos- suem um grupo baseado em sulfonato (por exemplo, MonoS®, MiniS, Source™ 15S e 30S, SP Sepharose® Fast Flow™, SP Sepharose® High Performance da GE Healthcare, Toyopearl® SP-650S e SP-650M da Tosoh, Macro-Prep® High S da BioRad, Ceramic HyperD® S, Trisa- cryl® M e LS SP e Spherodex® LS SP da Pall Technologies); um grupo à base de sulfoetila (por exemplo, Fractogel® SE da EMD Millipore, PO- ROS® (S-10 e S-20 da ThermoFisher)); um grupo à base de sulfopropila (por exemplo, TSK Gel® SP 5PW e SP-5PW-HR da Tosoh, POROS® HS-20 e HS 50 da ThermoFisher); um grupo à base de sulfoisobutila (por exemplo, Fractogel® EMD S03 da EMD Millipore); um grupo à base de sulfoxietila (por exemplo, SE52, SE53 e Express-Ion™ S da What- man), um grupo à base de carboximetila (por exemplo, CM Sepharose® Fast Flow da GE Healthcare, Hydrocell CM da Biochrom Labs Inc., Ma- cro-Prep® CM da BioRad, Ceramic HyperD® CM, Trisacryl M CM, Tri- sacryl LS CM, da Pall Technologies, Matrex Cellufine C500 e C200 da Millipore, CM52, CM32, CM23 e Express-Ion™ C da Whatman, Toyope- arl® CM-650S, CM-650M e CM -650C da Tosoh); grupos à base de ácido sulfônico e carboxílico (por exemplo, BAKERBOND® Carboxy-

Sulfon da J.T. Baker); um grupo à base de ácido carboxílico (por exem- plo, WP CBX da J.T. Baker, DOWEX® MAC-3 da Dow Liquid Separa- tions, trocadores de cátions fracos Amberlite™, trocador de cátions fra- cos DOWEX® e trocadores de cátions fracos Diaion da Sigma-Aldrich e Fractogel® EMD COO da EMD); um grupo à base de ácido sulfônico (por exemplo, Hydrocell SP da Biochrom Labs Inc., matriz de cátions de ácidos fortes malha fina DOWEX® da Dow Liquid Separations, UNOs- phere® S, WP Sulfônico da J.T. Baker, membrana Sartobind® S da Sar- torius, trocadores de cátions fortes Amberlite™, trocadores de cátions fortes DOWEX® e trocadores de cátions fortes Diaion da Sigma-Al- drich); e um grupo baseado em ortofosfato (por exemplo, PI 1 de What- man).

[00056] Se desejável, pode ser usada uma membrana de troca ca- tiônica em vez de uma matriz de troca catiônica, por exemplo, Sarto- bind® S (Sartorius; Edgewood, NI).

[00057] Alternativamente, uma etapa de cromatografia de imunoafi- nidade pode ser realizada na solução antes da etapa de adição do al- quilglicosídeo à solução.

[00058] A cromatografia de imunoafinidade utiliza a alta especifici- dade de uma interação antígeno-anticorpo para isolar e purificar poli- peptídeos. A etapa de cromatografia de imunoafinidade na presente in- venção envolve tipicamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos imobilizados em um suporte sólido sobre o qual a solução compreen- dendo o polipeptídeo recombinante é passada e o polipeptídeo especí- fico para o anticorpo imobilizado é capturado. Proteínas e peptídeos não específicos são lavados e o antígeno é então eluído. Em outras modali- dades de realização da presente invenção, por exemplo, quando o poli- peptídeo recombinante é ele próprio um anticorpo, o antígeno específico para esse anticorpo pode ser acoplado à coluna e a solução do anti- corpo é passada pela coluna.

[00059] O anticorpo (ou nas outras modalidades de realização da presente invenção, antígeno) pode ser imobilizado no suporte sólido por inúmeras técnicas, incluindo acoplamento químico do anticorpo ou antí- geno a um suporte sólido ativado por meio de resíduos de aminas ou sulfidrila. Existem várias agaroses ativadas comerciais que estão dispo- níveis comercialmente, usando várias químicas de acoplamento diferen- tes. Outra técnica utiliza um suporte sólido revestido com uma proteína de ligação a anticorpos, como a proteína A ou G, que captura e imobiliza o anticorpo. O anticorpo é então covalentemente ligado à resina com a ajuda de um reticulador químico.

[00060] Na presente invenção, uma etapa de cromatografia de imu- noafinidade pode ser usada para reduzir adicionalmente a proteína da célula hospedeira. Essa etapa geralmente mantém um bom rendimento de polipeptídeo, por exemplo, em torno de 60-90%. O processo normal- mente usa uma coluna de cromatografia de imunoafinidade. A carga da coluna pode ser calculada com base na concentração de polipeptídeo recombinante na solução, por exemplo, por absorção de UV. Em algu- mas modalidades de realização da presente invenção, a solução é con- dicionada antes da etapa de cromatografia de imunoafinidade, por exemplo, por adição de edetato dissódico (EDTA) ou citrato de sódio.

[00061] Alternativamente, uma etapa de cromatografia de afinidade pode ser realizada na solução antes da etapa de adição do alquilglico- sídeo à solução.

[00062] A cromatografia de afinidade é um método de separação ba- seado em uma interação de ligação específica entre um ligante imobili- zado e seu parceiro de ligação. Exemplos incluem interações anti- corpo/antígeno, enzima/substrato e enzima/inibidor. O grau de purifica- ção pode ser alto, dependendo da especificidade da interação e, conse- quentemente, cromatografia de afinidade pode às vezes ser a única etapa em uma estratégia de purificação.

[00063] A cromatografia de afinidade pode ser amplamente dividida em duas abordagens. A primeira abordagem utiliza uma estrutura ou sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente no polipeptídeo de interesse como sítio de ligação. Exemplos de materiais de cromatogra- fia de afinidade incluem materiais derivatizados da proteína A ou prote- ína G. Outras opções incluem ligantes especificamente desenvolvidos (peptídeos, peptídeos modificados, ácidos nucleicos, compostos sinté- ticos e similares) que permitem uma ligação suficientemente forte com o polipeptídeo e, portanto, podem atuar como ligantes em uma resina de afinidade. O segundo método envolve ligação com uma sequência de aminoácidos especial geneticamente modificada no polipeptídeo de interesse, comumente referida como "tag". Várias tags diferentes estão disponíveis. Duas das tags de proteína mais comumente usadas são a tag de poli-histidina, que se liga a certos complexos que contêm metal, tais como aquelas em resinas IMAC, e a sequência de glutationa-trans- ferase (GST), que se liga a glutationa, encontrada em meios GST.

[00064] Exemplos particulares de materiais de cromatografia de afi- nidade incluem Prosep-VA, Prosep-VA Ultra Plus (Merck), proteína A sepharose fluxo rápido, MAbSelect, MAbSelect SuRe, MAbSelect SuRe LX, VIII Select, Capto Blue, Capto Blue, Capto Heparin (GE Healthcare), Toyopearl Protein A (Tosoh), CaptureSelect Human Albumin ou outras resinas CaptureSelect (ThermoFisher Scientific), Mimetic Blue SA e Al- bupure (Prometic). Além disso, podem ser usadas resinas de afinidade personalizadas de empresas como ThermoFisher, Merck ou Avitide. O material de cromatografia de afinidade pode ser empregado na forma de uma coluna de cromatografia de afinidade. Em outras modalidades de realização da presente invenção, o material de cromatografia de afi- nidade é usado na forma de uma membrana de cromatografia de afini- dade. O alquilglicosídeo

[00065] O termo "alquilglicosídeo" é aqui utilizado para se referir ge- ralmente a qualquer açúcar unido por uma ligação a qualquer alquila hidrofóbica, como é conhecido no estado da técnica. A ligação entre a cadeia alquil hidrofóbica e o sacarídeo hidrofílico pode incluir, entre ou- tras possibilidades, uma união ou ligação glicosídica, éster, tioglicosí- dica, tioéster, éter, amida ou ureído. Opções típicas para o açúcar na presente invenção incluem glicose (como glicopiranosídeo) e mal- tose. Opções típicas para a alquila hidrofóbica incluem grupos n-octila, n-decila e n-dodecila. A ligação pode em particular ser uma ligação gli- cosídica, especialmente uma ligação beta glicosídica (por exemplo, uma ligação beta-D glicosídica). Os inventores usaram em particular um al- quilglicosídeo em que o açúcar é glicose, a alquila hidrofóbica é um grupo n-octila e a ligação é uma ligação beta-D glicosídica. Outras com- binações respectivas que os inventores usaram incluem: glicose, um grupo n-decila e uma ligação beta-D glicosídica; maltose, um grupo n- octila e uma ligação beta-D glicosídica; maltose, um grupo n-dodecila e uma ligação beta-D glicosídica; glicose, um grupo n-dodecila e uma li- gação beta-D glicosídica; e maltose, um grupo n-decila e uma ligação beta-D glicosídica.

[00066] Uma estrutura geral de alquilglicosídeos que podem ser usa- dos na presente invenção é R1-O-(CH2)x-R, na qual R pode ser, por exemplo, CH3, cicloexila (C6H11I) ou outra cadeia alquila, incluindo seus isômeros, x situa-se tipicamente entre 5 e 13, especialmente entre 7 e 11, e R1 é um açúcar, tipicamente glicose ou maltose. De preferência, o alquilglicosídeo utilizado na invenção é n-octil-β-D-glicopiranosídeo (ou seja, R1 representa glicose, R é CH3 e x é 7). Os inventores consideram isso como uma opção preferida porque n-octil-β-D-glicopiranosídeo é um detergente suave com propriedades físico-químicas e toxicológicas favoráveis. Outros alquilglicosídeos que os inventores usaram incluem n-decil-beta-D-glicopiranosídeo (isto é, R1 é glicose, R representa um grupo CH3 e x é 9), n-octil-beta-D-maltosídeo (isto é, R1 é maltose, R representa um grupo CH3 e x é 7), n-dodecil-beta-D-maltosídeo (isto é, R1 é maltose, R representa um grupo CH3 e x é 11), n-dodecil-beta-D- glicopiranosídeo (isto é, R1 é glicose, R representa um grupo CH3 e x é 11) e n-decil-beta-D-maltosídeo (isto é, R1 é maltose, R é CH3 e X é 9).

[00067] Alquilglicosídeos alternativos exemplificativos incluem aque- les em que R1 é glicose, R representa um grupo CH3 e x é: 5(n-hexil-β- D-glicopiranosídeo); 6(n-heptil-β-D-glicopiranosídeo); ou 8(n-nonil-β-D- glicopiranosídeo). Às vezes, os glicopiranosídeos são chamados glico- sídeos.

[00068] Alquilglicosídeos exemplares incluem adicionalmente aque- les em que R1 é maltose, R representa um grupo CH3 e x é: 5(n-hexil-β- D-maltosídeo); 8(n-nonil-β-D-maltosido); 10(n-undecil-β-D-maltosí- deo); 12(n-tridecil-β-D-maltosídeo); 13(n-tetradecil-β-D-maltosídeo) ou 15(n-hexadecil-β-D-maltosídeo). Às vezes os maltosídeos são chama- dos maltopiranosídeos.

[00069] Exemplos de alquilglicosídeos incluem ainda aqueles em que R1 é glicose, x é 3 e R é cicloexil(3-cicloexil-l-propil-β-D-glicosídeo) e em que R1 é maltose, x é 4 e R é cicloexil(4-cicloexil-l-butil-β-D-malto- sídeo).

[00070] Aquele versado no estado da técnica entenderá que a sín- tese química de alquilglicosídeos tais como estes pode resultar em uma mistura heterogênea de compostos, em vez de uma preparação com- pletamente homogênea. Como tal, as referências aqui a um alquilglico- sídeo particular utilizado significa que pelo menos o componente majo- ritário de qualquer mistura heterogênea é esse alquilglicosídeo. Adição do alquilglicosídeo à solução que compreende o polipeptí- deo recombinante

[00071] A solução que compreende o polipeptídeo recombinante é tratada com um alquilglicosídeo como descrito acima. Em modalidades de realização particulares da presente invenção, o alquilglicosídeo é n- octil-β-D-glicopiranosídeo. Esse tratamento pode ser obtido convenien- temente misturando a solução com uma solução de reserva do alquilgli- cosídeo, por exemplo, sob 10x a concentração final pretendida. Diferen- temente do tratamento com solvente/detergente, por exemplo, com TN BP/PS 80, o alquilglicosídeo pode ser fornecido em uma solução aquosa; não requer um solvente adicional, particularmente um solvente orgânico como TNBP. Quando o alquilglicosídeo é n-octil-β-D-glicopira- nosídeo, é conveniente usar uma solução de reserva com uma concen- tração entre 200 e 1.000 mM. Se a solução que compreende o polipep- tídeo recombinante é o eluato de uma etapa de cromatografia, então a solução pode ser diluída com tampão de eluição adicional antes da adi- ção do alquilglicosídeo, se desejado.

[00072] A concentração final de alquilglicosídeo situa-se tipicamente entre 0,1 e 1.000 mM (por exemplo, entre 1 e 500 mM, 3 e 400 mM, 5 e 200 mM, 10 e 100 mM, 20 e 90 mM). Para n-octil-β-D-glicopiranosídeo, a concentração final é geralmente de cerca de 25 a 80 mM. Aquele ver- sado no estado da técnica seria capaz de identificar concentrações ade- quadas para outros alquilglicosídeos. Concentrações ideais podem ser identificadas testando um intervalo dessas concentrações. Os invento- res verificaram que é útil uma concentração acima da concentração crí- tica de micelas (CMC) do alquilglicosídeo, particularmente para inativa- ção viral. Normalmente, a concentração será 1,5; 2; 3 ou 4 vezes supe- rior a essa CMC.

[00073] Após adição do alquilglicosídeo, a mistura é preferencial- mente homogeneizada para garantir uma boa mistura. Essa homoge- neização normalmente leva entre 2 e 10 minutos.

[00074] A mistura é tipicamente filtrada (por exemplo, usando um ta- manho de poro de filtro de 0,45/0,2 μm), o que é vantajoso porque ga- rante a remoção de partículas que potencialmente protegem os vírus do tratamento com alquilglicosídeo. Os inventores verificaram que essa etapa mantém um bom rendimento de polipeptídeo, por exemplo, cerca de 90-100%.

[00075] A mistura pode ser incubada para permitir inativação viral, como descrito acima. A incubação pode ser realizada por qualquer pe- ríodo de tempo adequado, tipicamente pelo tempo necessário para al- cançar uma redução viral eficaz. O fator de redução de vírus alcançado em log10 pode, por exemplo, ser de pelo menos 4. Em modalidades de realização típicas da presente invenção, a incubação é realizada entre 1 minuto e 24 horas, entre 2 minutos e 12 horas, preferencialmente entre 10 minutos e 5 horas e, geralmente, por cerca de 30 minutos ou mais. A incubação é convenientemente realizada em temperatura ambiente, embora bons resultados também possam ser alcançados em tempera- turas mais baixas, por exemplo, ≤20°C e até mesmo entre 4°C e 10°C. Essas temperaturas mais baixas são particularmente vantajosas se a proteína é sensível a temperatura. Deve-se tomar cuidado para não incubar a mistura a uma temperatura que possa desnaturar o polipeptí- deo recombinante (caso a atividade deva ser preservada). Durante a in- cubação, não é necessário mais agitação, embora isso possa ser reali- zado, se desejado.

[00076] Após a incubação, a solução pode opcionalmente ser conge- lada para armazenamento até uso posterior, por exemplo, abaixo de - 20°C ou mais preferivelmente abaixo de -65°C. Idealmente, o congela- mento é realizado o mais rápido possível e a duração do congelamento é o mais curta possível, para preservar o polipeptídeo recombinante. Purificando a proteína recombinante

[00077] Como discutido acima, a purificação do polipeptídeo recom- binante na etapa (iii) é tipicamente realizada por meio da realização de uma etapa de cromatografia na solução. A cromatografia pode ser sele-

cionada a partir de qualquer cromatografia adequada, por exemplo, cro- matografia de imunoafinidade, afinidade, interação hidrofóbica, troca iô- nica, multimodal, por exclusão de tamanho ou de afinidade por quelato metálico.

[00078] A etapa da cromatografia pode ser em particular uma etapa de cromatografia de imunoafinidade ou cromatografia de afinidade. Al- ternativamente, a etapa de cromatografia que pode ser realizada como etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica ou uma etapa de cromatografia de troca iônica. Além disso, outras etapas de purificação podem ser incluídas no processo após a etapa (iii). Por exemplo, uma ou mais etapas de cromatografia de interação hidrofóbica podem ser incluídas no processo. Em uma modalidade de realização da presente invenção, uma etapa de cromatografia de interação hidrofó- bica é realizada na solução após a etapa (iii), por exemplo, quando a etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de imunoafinidade. De forma similar, uma ou mais etapas de cromatografia de troca iônica podem ser incluídas no processo. Tipicamente, uma etapa de cromatografia de troca iônica é realizada na solução após a etapa (iii), particularmente quando a etapa (iii) é uma etapa de cromatografia de imunoafinidade ou afinidade. Em uma modalidade de realização preferida da presente in- venção, a etapa de cromatografia de imunoafinidade é tipicamente se- guida por uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica (como descrito acima), que é seguida pela etapa de cromatografia de troca iô- nica.

[00079] Outras sequências de etapas também são possíveis. Por exemplo, em uma primeira modalidade de realização da presente inven- ção, uma etapa de cromatografia de troca catiônica é realizada na solu- ção antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solução, a etapa (iii) é então uma etapa de cromatografia de imunoafinidade e essa etapa é seguida por uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica, que é por sua vez seguida por uma etapa de cromatografia de troca aniô- nica. Em uma segunda modalidade de realização da presente invenção, uma etapa de cromatografia de imunoafinidade é realizada na solução antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solução, a etapa (iii) é então uma etapa de cromatografia de troca aniônica e essa etapa é se- guida por uma etapa de cromatografia de troca catiônica. Em uma ter- ceira modalidade de realização da presente invenção, uma etapa de cromatografia de imunoafinidade é realizada na solução antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solução, a etapa (iii) é então uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica e essa etapa é seguida por uma etapa de cromatografia de troca aniônica. Em uma quarta modali- dade de realização da presente invenção, uma etapa de cromatografia de troca catiônica é realizada na solução antes da etapa de adição do alquilglicosídeo à solução, a etapa (iii) é então uma etapa de cromato- grafia de interação hidrofóbica e essa etapa é seguida por uma etapa de cromatografia de troca aniônica. Outras sequências serão evidentes àquele versado no estado da técnica e podem ser otimizadas depen- dendo do polipeptídeo recombinante de interesse. Métodos de croma- tografia de troca iônica foram descritos acima. A invenção utiliza tipica- mente cromatografia de troca aniônica (por exemplo, para a etapa (iii) e/ou quando cromatografia de troca iônica é usada após a etapa (iii)), embora cromatografia de troca catiônica possa ser adequada em algu- mas modalidades da presente invenção. Um exemplo de uso de croma- tografia de troca aniônica é fornecido nas modalidades de realização da invenção abaixo. Os inventores verificaram que cromatografia de troca aniônica após a etapa (iii) é particularmente útil.

[00080] Métodos de cromatografia de imunoafinidade e de cromato- grafia de afinidade foram descritos acima. Cromatografia multimodal, de tamanho, de afinidade por quelato metálico e de interação hidrofóbica é descrita abaixo.

[00081] A etapa iii) pode opcionalmente incluir modificação da solu- ção que compreende o polipeptídeo recombinante, por exemplo, antes da purificação do polipeptídeo recombinante. A modificação pode envol- ver alteração da condutividade da solução e/ou a inclusão de um ou mais aditivos. O aditivo pode por exemplo ser um agente quelante, por exemplo, EDTA. A modificação pode envolver diluição ou outro condici- onamento da solução. Cromatografia multimodal

[00082] Cromatografia multimodal ou de modo misto é baseada em suportes de meios que foram funcionalizados com ligantes capazes de vários modos de interação: troca iônica, hidroxiapatita, afinidade, por exclusão de tamanho e interações hidrofóbicas. A capacidade de com- binar esses métodos de separação pode aumentar a seletividade em um processo de purificação de polipeptídeo. Existem vários meios de modo misto disponíveis comercialmente que combinam diferentes ele- mentos cromatográficos, em particular baseados em hidroxiapatita (complexos de coordenação eletrostática e de cálcio) ou baseados em ligantes de troca iônica hidrofóbicos.

[00083] Exemplos particulares de materiais de cromatografia multi- modal incluem Capto MMC Imp Res, Capto MMC ImpAct e Capto ad- here (todos da GE Healthcare); Toyopearl NH2-750F, Toyopearl MX- Trp-650M (Tosoh); Nuvia cPrime (BioRad) e HEA HyperCel, MEP HyperCel, PPA HyperCel, CMM HyperCel (Pall). Cromatografia por exclusão de tamanho

[00084] A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) separa mo- léculas com base em seu tamanho por filtração através de um gel. O gel consiste em grânulos esféricos contendo poros de uma distribuição de tamanhos específica. A separação ocorre quando moléculas de tama- nhos diferentes são incluídas ou excluídas dos poros da matriz. Peque- nas moléculas difundem-se nos poros e seu fluxo através da coluna é retardado de acordo com seu tamanho, enquanto moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas no volume vazio da coluna. Conse- quentemente, as moléculas separam-se com base em seu tamanho à medida que passam pela coluna e são eluídas em ordem decrescente de peso molecular.

[00085] As condições operacionais e a seleção do gel dependem da aplicação e da definição desejada. Dois tipos comuns de separação re- alizados por SEC são fracionamento e dessalinização (ou troca de tam- pão). O fracionamento envolve a separação de moléculas de pesos mo- leculares variáveis dentro da matriz de gel. A faixa de fracionamento do gel é selecionada de modo a abranger as moléculas de interesse. A dessalinização envolve o uso de SEC para dessalinizar amostras. A mo- lécula de interesse é eluída no volume vazio, enquanto moléculas me- nores são retidas nos poros do gel. Para obter a separação desejada, o gel deve ter um limite de exclusão significativamente menor que a mo- lécula de interesse.

[00086] Exemplos particulares de materiais de cromatografia por ex- clusão de tamanho incluem meios de poliacrilamida Bio-Gel P. Cromatografia de afinidade por quelato metálico

[00087] A cromatografia de afinidade por quelato metálico é útil para a purificação de proteínas marcadas com histidina e também pode ser usada para purificar outras proteínas com resíduos de histidina, cisteína e triptofano expostos. As resinas de cromatografia de afinidade imobili- zada (IMAC) são usadas para purificar o polipeptídeo. Afinidades alta- mente seletivas podem ser alcançadas dependendo do íon metálico em- pregado, como Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+ ou Fe3+. A força de ligação do po- lipeptídeo-alvo à resina é afetada principalmente pelo íon metálico e pelo pH dos tampões utilizados. A proteína ligada pode ser eluída por eluição competitiva com imidazol ou diminuindo o pH. Cromatografia de interação hidrofóbica

[00088] A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é geralmente realizada para remover agregados de proteínas e outras impurezas re- lacionadas com o processo. Ao realizar a separação, a mistura da amostra é contatada com o material HIC, por exemplo, usando uma téc- nica de purificação em batelada ou uma coluna. Antes da purificação por HIC, pode ser desejável remover quaisquer agentes caotrópicos ou substâncias muito hidrofóbicas, por exemplo, passando a mistura atra- vés de uma pré-coluna.

[00089] Por exemplo, no contexto da purificação em batelada, o ma- terial de HIC é preparado ou equilibrado para o tampão de equilíbrio desejado. É obtida uma pasta do material de HIC. A solução que com- preende o polipeptídeo recombinante é colocada em contato com a pasta para adsorver o polipeptídeo a ser separado no material de HIC. A solução que compreende as impurezas que não se ligam ao material de HIC é separada da pasta, por exemplo, permitindo que a pasta sedi- mente e remova o sobrenadante. A pasta pode ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejado, a pasta pode ser contatada com uma solução de menor condutividade para dessorver o polipeptídeo que se ligou ao material de HIC. Para eluir o polipeptídeo ligado, a concen- tração de sal pode ser diminuída.

[00090] Uma vez que a cromatografia de troca iônica depende das cargas do polipeptídeo para isolá-lo, a cromatografia de interação hidro- fóbica utiliza as propriedades hidrofóbicas do polipeptídeo. Grupos hi- drofóbicos no polipeptídeo interagem com grupos hidrofóbicos na co- luna. Quanto mais hidrofóbico for um polipeptídeo, mais forte será a in- teração com a coluna. Assim, a etapa de HIC, por exemplo, remove im- purezas derivadas das células hospedeiras e às vezes impurezas rela- cionadas com o produto.

[00091] Adsorção do polipeptídeo em uma coluna de HIC é favore- cida por altas concentrações de sal, mas as concentrações reais podem variar em uma ampla faixa, dependendo da natureza do polipeptídeo e do ligante de HIC específico escolhido. As colunas de HIC normalmente compreendem uma matriz-base (por exemplo, agarose reticulada ou material de copolímero sintético) à qual ligantes hidrobóbicos (por exem- plo, grupos alquila ou arila) são acoplados. Uma coluna de HIC ade- quada compreende uma resina de agarose substituída por grupos fenila (por exemplo, uma coluna de Phenyl Sepharose™). Muitas colunas de HIC estão disponíveis comercialmente. Os exemplos incluem, mas sem limitação, coluna Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow com baixa ou alta substituição (GE Healthcare Life Sciences); coluna Phenyl Sepharose™ High Performance (GE Healthcare Life Sciences); coluna Octyl Sepha- rose™ High Performance ou coluna Butyl Sepharose Fast Flow or High Performance (GE Healthcare Life Sciences); colunas Fractogel™ EMD Propyl ou Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemanha); suportes Ma- cro-Prep™ Methyl ou Macro-Prep™ t-Butyl (Bio-Rad, Califórnia); coluna WP Hl-Propyl (C3)™ (J.T. Baker, Nova Jérsei); e colunas Toyopearl™ éter, fenila ou butila (TosoHaas, PA).

[00092] Um exemplo do uso de HIC é fornecido nas modalidades de realização da invenção abaixo. Os inventores verificaram que a croma- tografia HIC após a etapa (iii) é particularmente útil, por exemplo, com uma coluna Butyl Sepharose™ High Performance (GE Healthcare Life Sciences). Tratamento adicional da solução que compreende o polipeptídeo re- combinante

[00093] A solução pode sofrer tratamento adicional após a etapa (iii) e quaisquer etapas adicionais de purificação, como descrito acima.

[00094] Por exemplo, uma etapa de filtração viral pode ser reali- zada. Em certos aspectos da invenção, a solução que compreende o polipeptídeo recombinante da etapa anterior é submetida a filtração para remoção de partículas virais, incluindo vírus intactos, se presentes. Um exemplo não limitativo de um filtro adequado é o filtro Ultipor DV50™ da Pall Corporation ou o filtro Planova 20N da Asahi Kasei Medical Co., Ltd. Outros filtros virais podem ser usados nessa etapa de filtragem e são bem conhecidos daqueles versados no estado da técnica. Em certas modalidades de realização da presente invenção, após o processo de filtração, o filtro é lavado usando, por exemplo, o tampão de eluição em- pregado na etapa anterior, a fim de remover qualquer polipeptídeo re- combinante retido no alojamento do filtro.

[00095] Uma ou mais etapas de ultrafiltração e/ou diafiltração tam- bém podem ser usadas para purificar o polipeptídeo recombinante. Es- sas etapas podem concentrar o polipeptídeo recombinante e/ou trocar seu tampão. Tipicamente, os referidos um ou mais etapas de ultrafiltra- ção e/ou diafiltração são realizados após a etapa de filtração viral acima.

[00096] Ultrafiltração é descrita em detalhes nas refs. 8 e 9. Um pro- cesso de filtração é a Filtragem por Fluxo Tangencial como descrito na ref. 10. Ultrafiltração é geralmente considerada como filtração usando filtros com um tamanho de poros menor que 0,1 μm. Empregando filtros com tamanho de poros tão pequeno, o volume da amostra pode ser re- duzido por permeação do tampão de amostra através do filtro enquanto o polipeptídeo recombinante é retido atrás do filtro.

[00097] Diafiltração é um método de utilização de ultrafiltros para re- mover e trocar sais, açúcares e solventes não aquosos, separar espé- cies livres de espécies ligadas, remover material de baixo peso molecu- lar e/ou levar à rápida mudança de ambientes iônicos e/ou de pH. Mi- crossolutos são removidos com mais eficiência adicionando solvente à solução que é ultrafiltrada a uma taxa aproximadamente igual à taxa de ultrafiltração. Isso lava microespécies da solução a um volume cons- tante, purificando efetivamente o polipeptídeo retido. Em certas modali- dades de realização da presente invenção, é empregada uma etapa de diafiltração para trocar os vários tampões usados em conexão com o processo da invenção, opcionalmente antes de etapas de purificação adicionais, bem como para remover impurezas do polipeptídeo recom- binante. Composições farmacêuticas e métodos

[00098] As composições farmacêuticas da invenção podem ser pre- paradas para armazenamento como formulações liofilizadas ou solu- ções aquosas misturando um polipeptídeo recombinante purificado da invenção com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceutica- mente aceitáveis opcionais, tipicamente empregados no estado da téc- nica (todos aqui referidos como "veículos"), isto é, agentes de tampona- mento, estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes não iônicos, antioxidantes e outros aditivos diversos (ver ref. 11). Esses adi- tivos devem ser não tóxicos para os receptores nas dosagens e concen- trações empregadas.

[00099] Uma composição farmacêutica da invenção também pode conter um segundo agente terapêutico além do polipeptídeo recombi- nante purificado da invenção.

[000100] As composições podem ser preparadas de várias for- mas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetá- veis, como soluções líquidas ou suspensões. Também podem ser pre- paradas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veí- culos líquidos antes da injeção. A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pes- sário. A composição pode ser preparada para administração nasal, au- ditiva ou ocular, por exemplo, como gotas, como um spray ou como um pó [por exemplo, 12].

[000101] A composição farmacêutica é tipicamente estéril. Ela é pre- ferencialmente livre de pirogênio.

[000102] Em muitas modalidades de realização da presente invenção, a composição é tamponada, por exemplo, entre pH 6 e pH 8, geralmente em torno de pH 7. A composição pode ser aquosa ou liofilizada.

[000103] A invenção também proporciona um dispositivo de adminis- tração contendo uma composição farmacêutica da invenção. O disposi- tivo pode ser, por exemplo, uma seringa ou um inalador.

[000104] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente a um indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais; em particular, indivíduos humanos podem ser tratados. Geral

[000105] O termo "compreendendo" abrange "incluindo" e "consis- tindo de", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode con- sistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[000106] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x signi- fica, por exemplo, x ± 10%.

[000107] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancial- mente" pode ser omitida da definição da invenção.

[000108] Quando a invenção proporciona um processo que envolve várias etapas sequenciais, as etapas são realizadas na ordem indicada, isto é, em ordem numérica ou alfabética. No entanto, aquele versado no estado da técnica entenderá que a ordem das etapas pode ser alterada enquanto ainda se obtêm resultados úteis. A invenção também pode proporcionar um processo que envolve menos do número total de eta- pas. Por exemplo, se uma solução que compreende a proteína recom- binante já tiver sido purificada mediante realização de uma etapa de cromatografia de troca iônica na solução, essa etapa poderá ser omitida nos processos da invenção. Similarmente, uma etapa de adição de um alquilglicosídeo à solução que compreende o polipeptídeo recombinante pode ser realizada para fornecer o material pronto para a etapa (iii), mas a etapa (iii) não precisa ser realizada. A etapa (iii) não precisa ser reali- zada para se enquadrar no escopo da invenção, pois o material pré- tratado tem utilidade como intermediário para purificação subsequente e pode ser usado, armazenado, exportado etc. para uso posterior, por exemplo, para cromatografia de imunoafinidade ou cromatografia em geral. Essas etapas diferentes podem ser executadas em momentos di- ferentes por pessoas diferentes em lugares diferentes (por exemplo, em países diferentes).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[000109] A Figura 1 mostra a inativação do MuLV com OG/TNBP e com OG apenas: triângulo aberto mostra inativação do MuLV em 4,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 200 mM + TNBP a 0,3% a 21°C sob agita- ção, quadrado aberto mostra inativação do MuLV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 6°C sem agitação.

[000110] A Figura 2 mostra inativação do BVDV com OG/TNBP e com OG apenas: triângulo aberto mostra inativação do BVDV em 4,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 200 mM + TNBP a 0,3% a 21°C sob agitação, quadrado aberto mostra inativação de BVDV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 6°C sem agitação.

[000111] A Figura 3 mostra inativação do PRV com OG/TNBP e com OG apenas: triângulo aberto mostra inativação do PRV em 4,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 200 mM + TNBP a 0,3% a 21°C, com agitação, quadrado aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 6°C sem agitação.

[000112] A Figura 4 mostra inativação do PRV com OG a 6°C, com agitação ou sem agitação: triângulo aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml D’D3-FP com OG 20 mM a 6°C sob agitação, quadrado aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D'D3-FP com OG 20 mM a 6°C sem agitação, losango aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 6°C sem agitação.

[000113] A Figura 5 mostra inativação do PRV com diferentes concen- trações de OG a 5-6°C com agitação: quadrado aberto mostra inativa- ção do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 15 mM a 5-6°C sob agitação, losango aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 5-6°C sob agitação, triângulo aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 30 mM a 5-6°C sob agitação.

[000114] A Figura 6 mostra inativação do PRV com várias concentra- ções de OG a 18-19°C: triângulo aberto mostra inativação do PRV em 4,4 mg/ml de D'D3-FP com OG 10 mM a 21,5°C sob agitação, quadrado aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM a 18°C sob agitação, losango aberto mostra inativação de PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 30 mM a 18°C sob agitação, círculo aberto mostra inativação de PRV em 8,4 mg/ml de D'D3-FP com OG 40 mM a 18°C sob agitação, losango fechado mostra inativação de PRV em 13,5 mg/ml de D'D3-FP com OG 60 mM a 19°C sob agitação, triân- gulo fechado mostra inativação de PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 20 mM armazenado 7 dias no escuro a 18°C sob agitação, quadrado fechado mostra inativação de PRV em 8,4 mg/ml de D'D3-FP com OG 20 mM armazenado 7 dias sob luz a 18°C sob agitação, círculo fechado mostra inativação de PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 10 mM armazenado 7 dias no escuro a 18°C sob agitação.

[000115] A Figura 7 mostra inativação do PRV com concentrações iguais de MM de OG a 18 ou 5-6°C: triângulo aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 30 mM a 18°C sob agitação, quadrado aberto mostra inativação do PRV em 8,4 mg/ml de D’D3-FP com OG 30 mM a 5-6°C sob agitação.

[000116] A Figura 8 mostra a capacidade de inativação do PRV por uma variedade de alquilglicosídeos: quadrado aberto mostra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP a OG 60 mM, triângulo aberto mos- tra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D'D3-FP em n-decil-β-D-glico- piranosídeo 60 mM, losango aberto mostra inativação de PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP sob n-octil-β-D-maltosídeo 60 mM, quadrado fe- chado mostra inativação de PRV em 11,9 mg/ml de D'D3-FP sob n-do- decilβ-D-maltosídeo 60 mM. triângulo fechado mostra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP sob n-dodecil-β-D-glicopiranosídeo 60 mM, losango fechado mostra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP sob n-decil-β-D-maltosídeo.

[000117] A Figura 9 mostra a capacidade de inativação do PRV por n- decil-β-D-glicopiranosídeo, n-decil- β-D-maltosídeo e n-octil-β-D-malto- sídeo em concentrações mais baixas (cerca de duas vezes seus valores de CMC mais altos): triângulo aberto mostra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP sob 5 mM de n-decil-β-D-glicopiranosídeo, quadrado aberto mostra inativação do PRV em 11,9 mg/ml de D'D3-FP sob 40 mM de n-octil-β-D-maltosídeo, losango aberto mostra inativação de PRV em 11,9 mg/ml de D’D3-FP sob 5 mM de n-decil-β-maltosídeo.

[000118] A Figura 10 compara: a) a concentração residual de proteína da célula hospedeira em amostras de uma proteína de fusão albumina (rD'D3-FP) obtida por cromatografia de imunoafinidade após tratamento com n-octil-β-D-glicopiranosídeo (OG), n-decil-β-D-glicopiranosídeo (DG), polissorbato 80 e tri-n-butilfosfato (PS80/TNBP) ou controle com tampão; e b) o melhoramento relativo da depuração da proteína da cé- lula hospedeira (melhoramento em dobro da depuração do HCP)

quando OG ou DG são usados na etapa ii), em comparação com trata- mento com PS80/TNBP (barras transparentes) ou controle com tampão (barras hachuradas).

[000119] A Figura 11 compara: a) a concentração residual de DNA da célula hospedeira em amostras de uma proteína de fusão albumina (rD'D3-FP) obtida por cromatografia de imunoafinidade após tratamento com n-octil-β-D-glicopiranosídeo (OG), polissorbato 80 e tri-n-butilfos- fato (PS80/TNBP) ou controle com tampão; e b) o melhoramento rela- tivo da depuração de DNA da célula hospedeira (melhoramento em do- bro da depuração do DNA da célula hospedeira) quando OG é usado em comparação com tratamento com PS80/TNBP (barra transparente) ou controle com tampão (barra hachurada).

[000120] A Figura 12 mostra inativação do VSV por tratamento com SD em comparação com GO: triângulo fechado mostra inativação do VSV por OG 40 mM em 10,4 mg/ml de D’D3-FP a 24,5°C e quadrado aberto mostra inativação do VSV por PS80 a 1% + TNBP a 0,3% em 10,4 mg/ml de D'D3-FP a 26,5°C.

[000121] A Figura 13 mostra inativação do vírus Vaccinia por trata- mento com SD comparado com OG: triângulo fechado mostra inativação do vírus Vaccinia por OG 40 mM em 10,4 mg/ml de D’D3-FP a 24,5°C e quadrado aberto mostra inativação do vírus Vaccinia por PS80 a 1% + TNBP a 0,3% em 10,4 mg/ml de D'D3-FP a 26,5°C.

MODALIDADES DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Exemplo 1 Comparação de n-octil-beta-D-glicopiranosídeo com uma mistura solvente/detergente e tampão como controle Sumário

[000122] Tratamento de D’D3-FP recombinante (ref. 7) com uma mis- tura solvente/detergente típica de polissorbato 80 e tri-n-butilfosfato (PS80/TNBP) foi comparado com tratamento com o alquilglicosídeo n-

octil-β-D-glicopiranosídeo (OG). Experimentos iniciais mostraram que o rD'D3-FP permaneceu estável após tratamento com o alquilglicosí- deo. É importante ressaltar que inativação rápida de três vírus modelo foi observada com o alquilglicosídeo, mesmo na ausência do tri-n-butil- fosato (TNBP). A inativação do vírus foi concluída dentro de uma hora a temperaturas tão baixas quanto 5°C, com ou sem agitação. O procedi- mento eficiente tolerou o uso de uma gama inesperadamente ampla de parâmetros do processo, resultando em inativação eficiente do vírus (a faixa testada para OG foi de 4-25°C, por menos de ou igual a 30 minutos (normalmente foram acompanhados 120 minutos) em concentrações maiores ou iguais a 20 mM). Inesperadamente, a presença do alquilgli- cosídeo na corrente de alimentação de uma etapa subsequente de pu- rificação por cromatografia resultou em níveis significativamente mais baixos de DNA da célula hospedeira e proteína da célula hospedeira no estágio de eluato em comparação com o uso de PS80/TNBP ou das soluções tampão de controle. Métodos e resultados

[000123] rD'D3-FP contém o sítio de ligação FVIII da proteína Fator de von-Willebrand (vWF) gerado pela tecnologia de DNA recombinante. A sequência de cDNA de O rD'D3-FP foi transfectada em células de Ová- rio de Hamster Chinês (CHO) e o polipeptídeo foi expresso para realizar as investigações descritas. Estudos de laboratório foram realizados para avaliar a capacidade de inativação do vírus da etapa de alquilgli- cosídeo com uma variedade de modelos de vírus representativos. O uso do retrovírus MuLV (vírus da leucemia murina) como um vírus relevante é particularmente relevante para produtos derivados de células CHO, pois estes são sabidos conter partículas endógenas semelhantes a re- trovírus. O flavivírus BVDV (vírus da diarreia viral bovina) e o herpesví- rus PRV (vírus da pseudorraiva) que geralmente são mais estáveis ao tratamento S/D foram utilizados em estudos de avaliação de vírus para demonstrar a ampla capacidade de inativação do vírus no tratamento com alquilglicosídeo.

[000124] Os títulos de vírus de todas as amostras estudadas foram determinados usando ensaios de diluição de final imediatamente após geração das amostras e foram calculados de acordo com o método de Spearman-Karber, conforme indicado na referência 13.

[000125] Para esses estudos de OG, foram escolhidos dois parâme- tros de controle de processo para testar as condições de desafio relaci- onadas com inativação de vírus: 1) uma concentração de detergente OG de 20 mM; e 2) uma temperatura de 6°C ± 1°C. Amostras de um in- termediário rD'D3-FP (concentração de proteína de cerca de 14 mg/ml) foram diluídas adequadamente ou usadas não diluídas e adicionadas com vírus para serem estudadas, resultando na concentração de deter- gente desejada.

[000126] Amostras foram coletadas antes da adição de detergente (não tratado) e em diferentes pontos de tempo após a adição de deter- gente. As amostras foram ensaiadas imediatamente diluindo 1:100 em meio de cultura de células para parar a reação e tornar as amostras não tóxicas nos ensaios de vírus.

[000127] Foram obtidos os seguintes fatores de redução (que para to- dos os vírus foram limitados apenas pelo sistema de teste, em particular o limite de detecção, bem como a quantidade de vírus usada para adi- ção): Tabela 1 Vírus Estu- Condição estu- Após incubação Cinética Dados for- LRV [log10] dado dada por dada na necidos na MuLV  4,2 15 minutos Figura 1 Tabela 2 OG 20 mM BVDV  5,3 15 minutos Figura 2 Tabela 3 a 6°C PRV  6,3 60 minutos Figura 3 Tabela 4

[000128] Os resultados do controle de retenção de vírus nas Figuras 1-3 (Tabelas 2-4, respectivamente) indicaram que não houve redução significativa na amostra de estabilidade do vírus durante o período de incubação, o que confirma que a redução demonstrada foi devida à ação do tratamento com detergente alquilglicosídeo. Além disso, as figuras demonstram que a inativação do vírus foi muito rápida e em todos os casos foram observados mais de quatro registros de inativação do ví- rus. MuLV e BVDV foram completamente inativados a uma temperatura de 6°C ± 1°C por uma concentração de detergente OG de 20 mM no primeiro ponto de tempo de 15 minutos estudado, enquanto inativação completa do PRV levou 60 minutos. Tabela 2: Inativação do MuLV por, por exemplo, OG MuLV, 4,4 mg/ml de rD’D3-FP, MuLV, 8,4 mg/ml de controle tempo em minutos OG 200 mM + TNBP a 0,3% a controle mantido rD’D3-FP, OG 20 mM mantido 21°C, com agitação a 6°C, sem agitação antes da adição 6,2 6,2 5,4 5,4 de OG 15 n.d. n.d. ≤ 1,2 n.d. 30 ≤ 2,7 n.d. ≤ 1,2 n.d. 60 ≤ 1,7 n.d. ≤ 1,2 n.d. 120 ≤ 1,7 4,8 ≤ 1,2 5,2 Tabela 3: Inativação do BVDV por, por exemplo, OG BVDV, 4,4 mg/ml de rD’D3-FP, BVDV, 8,4 mg/ml de tempo em controle OG 200 mM + TNBP a 0,3% a controle mantido rD’D3-FP, OG 20 mM a minutos mantido 21°C, com agitação 6°C, sem agitação antes da adi- 6,5 6,5 6,5 6,5 ção de OG 15 n.d. n.d. ≤ 1,2 n.d. 30 ≤ 2,7 n.d. ≤ 1,2 n.d. 60 ≤ 1,7 n.d. ≤ 1,2 6,4 120 ≤ 1,7 6,4 n.d. n.d.

Tabela 4: Inativação do PRV sob, por exemplo, OG 20 mM a 6°C PRV, 8,4 mg/ml D'D3- controle tempo em mi- PRV, 4,4 mg/ml D'D3-FP, OG 200 controle man- FP, OG 20 mM a 6°C, mantido nutos mM + TNBP a 0,3% a 21°C, batido tido 16070521 sem agitação 16111422 antes da adi- 8,4 8,4 7,8 7,8 ção de OG 15 n.d. n.d. 1,5 n.d. 30 ≤ 2,7 n.d. 1,3 n.d. 60 ≤ 1,7 n.d. ≤ 1,2 7,6 120 ≤ 1,7 8,0 n.d. n.d.

[000129] Em estudos adicionais de robustez com PRV, um vírus en- velopado mais resistente, foram estudados os seguintes parâmetros: • Variação da concentração da proteína não influenciou a inativação do PRV (Figura 3, Tabela 4). • Agitação durante a incubação de OG 20 mM a 6°C resultou em inati- vação do PRV ligeiramente mais rápida (Figura 4, Tabela 5). No en- tanto, o PRV foi inativado de forma completa e confiável por tratamento com OG 20 mM sem qualquer agitação durante a incubação de OG. • Redução da concentração de OG para 15 mM (abaixo do CMC) a 6°C não resultou em inativação significativa do PRV (Figura 5, Tabela 6). • Uma observação semelhante foi feita sob OG 10 mM a 21°C (Figura 6, Tabela 7). Aumentar a concentração de OG para 30 mM ou mais re- sultou em rápida inativação do PRV. Além disso, armazenamento da solução de reserva de OG por sete dias (no escuro) não influenciou a capacidade de inativação. • Aumento da temperatura de incubação de 6°C para 18°C sob OG 30 mM não resultou em uma inativação mais rápida do PRV (Figura 7, Ta- bela 8). 60 mM de vários outros alquilglicosídeos inativam completa- mente o PRV muito rapidamente (Figura 8, Tabela 9). Especialmente, baixas quantidades de alquilglicosídeos (cerca do dobro da CMC) inati- vam completamente o PRV muito rapidamente (Figura 9, Tabela 10a). Tabela 5: Inativação do PRV sob OG 20 mM por agitação ou não a 6°C PRV, 8,4 PRV, 8,4 mg/ml de mg/ml de PRV, 8,4 mg/ml de rD’D3- tempo em rD’D3-FP, controle man- controle rD’D3-FP, controle FP, OG 20 mM a 6°C, sem minutos OG 20 mM tido mantido OG 20 mM a mantido agitação a 6°C, com 6°C, sem agitação agitação antes da adição de 7,6 7,6 7,8 7,8 7,6 7,6

OG 15 1,3 n.d. 1,5 n.d. n.d. n.d. 30 ≤ 1,0 n.d. 1,3 n.d. 1,3 n.d. 60 ≤ 1,0 7,3 ≤ 1,0 7,6 ≤ 1,2 7,7

Tabela 6: Inativação do PRV sob vários mM de OG a 6°C PRV, rD’D3- PRV, rD’D3-FP tempo FP 8,4 mg/ml, PRV, rD’D3-FP 8,4 controle man- controle 8,4 mg/ml, OG 30 controle em mi- OG 15 mM a mg/ml, OG 20 mM a tido mantido mM a 5-6°C, com mantido nutos 5-6°C, com 5-6°C, com agitação agitação agitação antes da adição 7,7 7,7 7,5 7,5 7,4 7,4 de OG 30 6,6 n.d. n.d. n.d. ≤ 0,9 n.d. 60 6,6 7,3 1,2 7,3 ≤ 0,9 7,4 Tabela 7: Carga de PRV em Iog10 sob vários mM de OG a 18-22°C PRV, rD’D3- PRV, rD’D3- PRV, rD’D3- con- PRV, rD’D3-FP 8,4 FP 8,4 con- tempo FP 4,4 mg/ml, FP 8,4 mg/ml, trole controle mg/ml, OG 30 mM controle mg/ml, OG trole em mi- OG 10 mM a OG 20 mM a manti- manti-do a 18°C, com agita- manti-do 40 mM a manti- nutos 21,5°C, com 18°C, com do ção 18°C, com do agitação agitação agitação antes da adi- 7,4 7,4 7,3 7,3 7,1 7,1 7,3 7,3 ção de

OG 15 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 30 6,8 n.d. ≤ 0,9 n.d. ≤ 0,9 n.d. ≤ 0,9 n.d. 60 7,0 n.d. ≤ 0,9 7,3 ≤ 0,9 7,2 ≤ 0,9 7,2 120 6,7 7,5 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

PRV, rD’D3- PRV, rD’D3- PRV, 13,5 FP 8,4 mg/ml, PRV, rD’D3-FP 8,4 FP 8,4 mg/ml, mg/ml de con- con- tempo OG 20 mM mg/ml, OG 20 mM OG 10 mM ar- rD’D3-FP, trole controle controle trole em mi- armazenado armazenado 7 dias mazenado 7 OG 60 mM manti- manti-do manti-do manti- nutos 7 dias no es- sob luz, a 18°C, dias no es- a 19°C, sem do do curo, a 18°C, com agitação curo, a 18°C, agitação com agitação com agitação antes da adi- 7,8 7,8 7,3 7,3 7,5 7,5 7,6 7,6 ção de

OG 15 ≤ 1,2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 30 ≤ 1,2 n.d. ≤ 0,9 n.d. 1,2 n.d. 7,2 n.d. 60 ≤ 1,2 7,5 ≤ 0,9 7,4 ≤ 0,9 7,4 7,0 7,4 120 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Tabela 8: Inativação do PRV sob OG OG 30 mM a 6°C ou 18°C antes da PRV, rD’D3-FP 8,4 PRV, rD’D3-FP 8,4 mg/ml, adição de mg/ml, OG 30 mM a controle mantido OG 30 mM a 5-6°C, com controle mantido OG 18°C, com agitação agitação 0 7,1 7,1 7,4 7,4 30 ≤ 0,9 n.d. ≤ 0,9 n.d. 60 ≤ 0,9 7,2 ≤ 0,9 7,4

Tabela 9: Capacidade de inativação do PRV por uma variedade de alquilglicosídeos PRV, n-Octil-ß- tempo em PRV, OG PRV, n-Decil-ß-D-glicopirano- controle controle controle mantido D-maltosídeo 60 minutos 60 mM sídeo 60 mM mantido mantido mM60 mM antes da 7,8 7,8 7,5 7,5 7,6 7,6 adição 30 ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. 2,5 n.d. 60 ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. 120 ≤ 2,2 7,6 ≤ 2,2 7,5 ≤ 2,2 7,6 PRV, n-Do- PRV, n-Decil- tempo em decil-ß-D- controle PRV, n-Dodecil-ß-D-glicopiranosí- controle man- ß-D-maltopi- controle minutos maltosídeo mantido deo 60 mM tido ranosídeo 60 mantido 60 mM mM antes da 7,8 7,8 7,7 7,7 7,6 7,6 adição 30 ≤ 4,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. 60 ≤ 4,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. 120 ≤ 4,2 7,5 ≤ 2,2 7,5 ≤ 2,2 7,5 Tabela 10a: Capacidade de inativação do PRV por n-decil-β-D-gli- copiranosídeo, n-decil-β-D-maltosídeo e n-octil-β-D-maltosídeo sob concentrações mais baixas (cerca de duas vezes seus valores de CMC mais altos) PRV, n-Decil- PRV, n-Decil- tempo em controle PRV, n-Octil-ß-D-mal- controle controle ß-D-glicopira- ß-D-maltosí- minutos mantido tosídeo 40 mM mantido mantido nosídeo 5 mM deo 5 mM antes da 7,5 7,5 7,3 7,3 7,5 7,5 adição 30 ≤ 2,2 n.d. 2,5 n.d. ≤ 2,2 n.d. 60 ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. ≤ 2,2 n.d. 120 ≤ 2,2 7,5 ≤ 2,2 7,3 ≤ 2,2 7,2

[000130] Sob todas as condições de robustez avaliadas, a cinética de inativação do vírus foi semelhante à das condições padrões. No geral, a etapa de tratamento com OG mostrou-se eficaz e robusta e com alta capacidade de inativar vírus envelopados, incluindo o retrovírus particu- larmente relevante MuLV. Também para outros alquilglicosídeos, sua capacidade de efetivamente inativar vírus relevantes pode ser demons- trada.

[000131] Além disso, foram realizados estudos de robustez com o ví- rus Vaccinia (VACV), o vírus envelopado mais resistente a inativação com SD [14] e o vírus da estomatite vesicular (VSV). Os resultados apresentados na Figura 12 (Tabela 10b) para VSV e na Figura 13 (Ta- bela 10c) para VACV demonstram uma inativação de vírus muito mais rápida por OG em comparação com SD (PS80 a 1% + TNBP a 0,3%). Especialmente, apenas OG inativa completamente VACV muito rápido, quando SD falhou em inativar VACV efetivamente por um perí- odo de 4 horas (Figura 13). Tabela 10b: Inativação do VSV (Vírus da Estomatite Vesicular) por SD em comparação com tratamento com GO tempo em mi- controle man- VSV, PS80 a 1% + TNBP a VSV,OG 40 mM controle mantido nutos tido 0,3% antes da adição 7,1 7,1 6,9 6,9 30 ≤ 1,5 n.d. 4,9 n.d. 60 ≤ 1,5 n.d. 4,7 n.d. 120 ≤ 1,5 n.d. 2,8 n.d. 180 ≤ 1,5 n.d. ≤ 1,5 n.d. 240 ≤ 1,5 6,6 ≤ 1,5 6,9 Tabela 10c: Inativação do VACV (Vaccinia) por SD em comparação com tratamento com OG VACV, OG 40 VACV, PS80 a 1% + tempo em minutos controle mantido controle mantido mM TNBP a 0,3% antes da adição 6,2 6,2 6,3 6,3 30 ≤ 1,5 n.d. 4,6 n.d. 60 ≤ 1,5 n.d. 4,0 n.d. 120 ≤ 1,5 n.d. 3,5 n.d. 180 ≤ 1,5 n.d. 3,3 n.d. 240 ≤ 1,5 6,2 3,3 6,1 Conclusão

[000132] A cinética de inativação rápida observada indica que OG e outros alquilglicosídeos inativam de maneira eficaz e confiável vírus en- velopados. Experimentos de cromatografia de imunoafinidade (IAC)

[000133] rD'D3-FP foi tratado com OG ou PS80/TNBP antes de carga em uma resina IAC. Para esse fim, a amostra de rD'D3-FP foi diluída com solução de reserva de OG (600 mM) para produzir uma solução de inativação de vírus incluindo 60 mM de OG. Em um experimento de con- trole, foi adicionada uma solução de reserva de PS80/TNBP (PS80 a3%/TNBP a 0,9%) para produzir uma concentração final de PS80 a 1%, TNBP a 0,3%. As soluções foram então filtradas e incubadas a tem- peratura ambiente durante duas horas. Subsequentemente, foram rea- lizados experimentos de IAC de acordo com a Tabela 11. Para croma- tografia, foi utilizada a resina de imunoafinidade CaptureSelect Human Albumin (ThermoFisher). A unidade de cromatografia usada foi um sis- tema ÄKTA Avant (GE Healthcare). Tabela 11: Condições experimentais para cromatografia de imuno- afinidade. Etapa Descrição 1 equilíbrio da coluna com Tris 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4 2 Carga de 11 mg de rD’D3-FP/mL resina para virus inativado, condicionada com solução de re- serva de EDTA até uma concentração final de EDTA 9 mM 3 lavagem pós-carga com Tris 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4 (volumes para 10 colunas (CV)) 4 etapa de lavagem 2 com NaCl400 mM, fosfato de sódio 20 mM, pH 6,3 (5 CV) 5 pré-eluição com MgCl2 375 mM, MES 100 mM, pH 6,0 (3 CV) 6 Eluição com MgCl2 1M, MES 100 mM, pH 6,0 (5 CV). Coleta de duas CV. 7 Limpeza da coluna

[000134] O tratamento com PS80/TNBP resultou em uma perda signi- ficativa de 60% de rD'D3-FP na fração de pré-eluição (etapa 5) e apenas 40% de rD'D3-FP foram encontrados na fração de eluato. Por outro lado, o tratamento com OG produziu rendimentos muito mais altos e 83% de rD'D3-FP estavam presentes na fração de eluato. A depuração do DNA da célula hospedeira na fração de eluato (180 pg/mL) foi de

1.700 vezes ao longo da etapa de purificação com OG. Em outros exem- plos, quando diferentes bateladas de matéria-prima rD'D3-FP com mai- ores concentrações de DNA da célula hospedeira foram incubados com OG, o teor de DNA da célula hospedeira no eluato da etapa de croma- tografia de imunoafinidade foi comparável, resultando em fatores de pu- rificação de cerca de 25.000. Comparado com tratamento com PS80/TNBP, tratamento com OG produziu 7,4 vezes melhor depuração do DNA da célula hospedeira. A depuração normal da proteína da célula hospedeira ao longo dessa etapa foi de 1.270 vezes para a amostra tratada com OG, resultando em 117 ppm no eluato (1,9 vez melhor em comparação com tratamento com PS80/TNBP). Para permitir uma me- lhor comparabilidade entre as frações do eluato nas mesmas concen- trações de rD'D3-FP após o tratamento com detergente ou solvente/de- tergente, a etapa 5 (Tabela 11) foi omitida do protocolo em um segundo conjunto de experimentos para evitar a divisão do rD'D3-FP no caso de material de alimentação tratado com PS80/TNBP em duas frações. Experimentos de cromatografia de imunoafinidade (IAC) (sem etapa 5 de pré-eluição)

[000135] O rD'D3-FP foi tratado com OG 60 mM ou outros alquilglico- sídeos conforme especificado na Tabela 12, PS 80 a 1%, TNBP a 0,3% ou um controle com tampão (NaCI 500 mM, Tris 20 mM, pH 7,4). As soluções foram então filtradas e incubadas a temperatura ambiente du- rante 2 horas. Tabela 12: Visão geral dos alquilglicosídeos usados para pré-puri- ficação por imunoafinidade com incubação. Concentração de reserva (em NaCl Concentração final Alquilglicosídeo 500 mM, Tris 20 mM, pH 7,4) após mistura n-octil-beta-D-glicopiranosídeo (OG) 600 mM 60 mM 600 mM 60 mM n-decil-beta-D-glicopiranosídeo (DG) 50 mM 5 mM n-dodecil-beta-D-glicopiranosídeo (DDG) 5 mM 0,5 mM n-octil-beta-D-maltosídeo (OM) 600 mM 60 mM 600 mM 60 mM n-decil-beta-D-maltosídeo (DM) 50 mM 5 mM 600 mM 60 mM n-dodecil-beta-D-maltosídeo (DDM) 5 mM 0,5 mM

[000136] Após duas horas de incubação, as amostras de vírus inati- vados foram carregadas em uma coluna de cromatografia recheada com resina CaptureSelect Human Albumin (ThermoFisher). A unidade de cromatografia utilizada foi um sistema ÄKTA Avant (GE Heal- thcare). O protocolo de cromatografia é descrito na Tabela 11, a etapa 5 foi omitida neste conjunto de experimentos a fim de evitar a perda de rendimento nas frações tratadas com PS80/TNBP.

[000137] Todas as opções de tratamento resultaram em rendimentos e concentrações proteicas de rD'D3-FP comparáveis nas frações de eluato, as quais foram analisadas quanto a DNA da célula hospedeira (DNA da HC) e proteína (HCP) (Tabela 13, Figuras 10ª e 11 a). Tabela 13: Visão geral dos dados analíticos obtidos com diferentes alquilglicosídeos e controle. Frações de DNA Etapa de redução HCP normali- Etapa de redu- DNA HC/ppm HCP ng/mL eluato HC/pg/mL de DNA HC zado (ppm) ção de HCP Controle 18419 2091 16 5792 657 226 com tampão OG 60 mM 146 17 1978 1649 187 794 OM 60 mM 18672 2425 15 2914 379 392 DG 60 mM 50030 7829 6 288 45 3300 DG 5 mM 28401 3235 10 6528 744 200 DM 60 mM 28417 3593 10 4283 541 274 DM 5 mM 29649 4001 10 4478 535 278

DDG 20149 2577 14 12119 1551 96 0,5 mM

DDM 37381 5065 8 5560 753 197 60 mM

DDM 24566 2863 12 9154 1068 139 0,5 mM PS80/TNBP 31293 3246 9 2381 247 601

[000138] Os resultados para o DNA da célula hospedeira foram com- paráveis ou levemente piores em comparação com o controle com tam- pão para todas as amostras, exceto quando foram usados 60 mM de OG. Isso levou a uma amostra de eluato com um teor de DNA da célula hospedeira particularmente baixo que foi 126 vezes menor que no con- trole com tampão e 214 vezes menor que no controle com PS80/TNBP (Figura 11b). O DNA da célula hospedeira foi depurado por um fator de cerca de 2.000 neste exemplo em particular (níveis de DNA normaliza- dos em relação ao teor de proteína).

[000139] Similarmente, em comparação com o tratamento com con- trole com tampão, o tratamento com OG levou a uma redução 3,5 vezes maior nos níveis de proteína da célula hospedeira. Normalizada em re- lação ao teor de rD'D3-FP, a redução de HCP ao longo da etapa de purificação foi de 725 vezes. Se PS80/TNBP fosse usado, a depuração de HCP diminuiria 32% em comparação com OG (Tabela 13, Figura 10b). Dos outros alquilglicosídeos testados, apenas DG e OM a 60 mM melhoraram a depuração de HCP em comparação com controle com tampão. Para OM, o efeito foi pequeno (1,7 vez), enquanto para DG ve- rificou-se um melhoramento de 14,6 vezes. Esse efeito foi fortemente dependente da concentração, uma vez que o teor de DGHCP de 5 mM no eluato foi comparável ao controle com tampão.

[000140] Em resumo, a incubação de rD'D3-FP com OG antes da etapa seguinte de cromatografia produz uma amostra de eluato que é significativamente mais pura em comparação com controle com tampão ou com PS80/TNBP em relação ao DNA da célula hospedeira e à pro- teína da célula hospedeira. O tratamento com OG também permitiu usar uma etapa de lavagem adicional (Tabela 1, etapa 5) que, no caso de tratamento com PS80/TNBP, produziu perdas significativas. Exemplo 2 Capacidade de inativação viral de uma variedade de alquilglicosí- deos Sumário

[000141] Estudos laboratoriais adicionais foram conduzidos de modo semelhante àqueles descritos no Exemplo 1 para avaliar a capacidade de inativação do vírus por alquilglicosídeos além de OG. n-Octil-beta-D- glicopiranosídeo, n-decil-beta-D-glicopiranosídeo, n-octil-beta-D-malto- sídeo, n-dodecil-beta-D-maltosídeo, n-dodecil-beta-D-glicopiranosídeo e n-decil-beta-D-maltosídeo verificaram-se todos ser eficazes (Figura 8), bem como em concentrações mais baixas (cerca de duas vezes seus valores de CMC mais altos, Figura 9).

[000142] Será entendido que a invenção foi descrita apenas a título de exemplo e modificações podem ser feitas enquanto permanecem dentro do escopo e espírito da invenção.

Exemplo 3 Reduzindo impurezas relacionados com o processo mediante uso de uma etapa de lavagem contendo OG Sumário

[000143] Estudos adicionais foram realizados para avaliar o uso de al- quilglicosídeos como agentes de lavagem em uma configuração de cro- matografia e estudar o efeito na impureza relacionada com o processo, em particular depuração de impureza proteica. Neste exemplo, material de colheita de rD'D3-FP livre de células derivado de um processo de biorreator foi carregado em uma coluna de troca aniônica (Poros XQ, Thermo Scientific). rD'D3-FP é expresso juntamente com o propeptídeo do fator de von Willebrand (VWF) que é clivado nas células, mas secre- tado juntamente com rD'D3-FP no sobrenadante celular e está, por- tanto, presente em níveis comparáveis com o produto. Portanto, redu- ção dos níveis dessa impureza proteica é importante. O protocolo de cromatografia foi modificado e OG foi adicionado a um dos tampões de lavagem. Método e resultados

[000144] Os detalhes de purificação da cromatografia de troca aniô- nica podem ser encontrados na Tabela 14. Foram realizados dois expe- rimentos. Na opção 1, a etapa 5 (etapa de lavagem 2) foi realizada sem OG, na opção 2 OG 60 mM foi adicionalmente incluído no tampão de lavagem. Tabela 14: Condições experimentais para cromatografia de imuno- afinidade. Etapa Descrição 1 Equilíbrio da coluna com Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5 2 Carga de aproximadamente 20 mg de rD’D3-FP/mL de resina 3 Lavagem pós-carga com Tris 20 mM, NaCl 50 mM pH, 7,5 (volumes para 5 colunas (CV)) 4 Etapa de lavagem 1 com MES 50 mM, citrato de sódio 10 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 (15 CV) Etapa de lavagem 2 com 5 Opção 1: Tris 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5 (15 CV) Opção 2: Tris 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, OG 60 mM, pH 7,5 (15 CV) 6 Eluição linear de NaCl 50 a 500 mM em Tris 60 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5 (5 CV). Coleta de três CV. 7 Limpeza da coluna

[000145] A adição de OG na etapa de lavagem reduziu significativa- mente o teor do propeptídeo VWF, uma das principais impurezas pro- teicas (ver Tabela 15). Tabela 15: Resultados analíticos para as principais frações de elui- ção de experimentos com e sem OG no tampão de lavagem. Redução de fator (em Etapa de lavagem 2 Quantidade de propeptídeo VWF na Quantidade de propeptídeo VWF no relação a material de tampão colheita (em relação a rD’D3-FP) eluato (em relação a rD’D3-FP) colheita) Sem OG 892.985 ppm 1.041.885 ppm Nenhuma OG 60 mM 919.508 ppm 6.228 ppm 148

[000146] Sem a adição de OG, o propeptídeo VWF não foi separado de todo o rD'D3-FP. Após adição de OG 60 mM à etapa de lavagem 2, a concentração de propeptídeo VWF no eluato foi reduzida quase 150 vezes. Como a presença de OG na etapa de lavagem 2 foi a única vari- ável nesses experimentos, a melhor depuração de impureza proteica pode ser atribuída a ele.

REFERÊNCIAS

[1] WHO Technical Report, Anexo 4, Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products, Nº de Série 924, pp. 151-224 (2004).

[2] Korneyeva et al. (2002) Biologicals. 30(2):153-62.

[3] Lebing et al. (2003) Vox Sang. 84(3):193-201.

[4] Johnston et al. (2003) Biologicals. 31(3):213-21.

[5] Bosley et al. (2008) Proteomics Clin Appl. 2(6):904-7.

[6] WO 2015/073633

[7] WO 2016/188907

[8] Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman e A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1996).

[9] Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN Nº 87762-456-9).

[10] Catálogo Millipore entitulado "Pharmaceutical Process Filtration Ca- talogue", pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96).

[11] Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição (Osol, ed. 1980).

[12] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.

[13] Gröner et al. (2012) Transfusion 52:2104-2112

[14] Roberts (2000) Biologicals 28: 29–32.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para purificar um polipeptídeo recombinante ca- racterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) proporcionar uma solução que compreende o polipeptídeo recombinante; ii) adicionar um alquil glicosídeo à solução; e iii) purificar o polipeptídeo recombi- nante realizando uma etapa de cromatografia na solução.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alquil glicosídeo é adicionalmente incluído no tampão de lavagem da etapa de cromatografia; ou alternativamente pelo fato de que o alquil glicosídeo não é adicionado à solução na etapa ii), mas apenas incluído no tampão de lavagem da etapa de cromatografia.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que a etapa (iii) resulta em separação do polipeptídeo recombinante do DNA da célula hospedeira e/ou da proteína da célula hospedeira na solução e/ou de outras impurezas proteicas na solução.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) resulta em separação melhorada do poli- peptídeo recombinante do DNA da célula hospedeira e/ou da proteína da célula hospedeira na solução, em comparação com o mesmo pro- cesso sem adicionar o alquil glicosídeo à solução.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cromatografia é cromato- grafia de imunoafinidade, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica, cromatografia mul- timodal, cromatografia por exclusão de tamanho ou cromatografia de afinidade por quelato metálico.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cromatografia é cromatografia de imunoafinidade.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma etapa de cromatografia de troca iônica é realizada na solução antes da etapa de adição do al- quilglicosídeo à solução.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica é realizada na solução após a etapa (iii).

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma etapa de cromatografia multimodal é realizada na solução após a etapa (iii).

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, carac- terizado pelo fato de que uma etapa de cromatografia de troca iônica é realizada na solução após a etapa de cromatografia de interação hidro- fóbica ou cromatografia multimodal.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que se destina a separar o poli- peptídeo recombinante do DNA da célula hospedeira e/ou da proteína da célula hospedeira e compreende as etapas de: a) proporcionar a so- lução que compreende o polipeptídeo recombinante; b) purificar o poli- peptídeo recombinante realizando uma etapa de cromatografia de troca iônica na solução; c) adicionar um alquil glicosídeo à solução; d) purifi- car o polipeptídeo recombinante realizando uma etapa de cromatografia de imunoafinidade na solução; e) purificar o polipeptídeo recombinante realizando uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica ou cro- matografia multimodal na solução; e f) purificar o polipeptídeo recombi- nante realizando uma etapa adicional de cromatografia de troca iônica na solução.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5, 7, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca iônica é cromatografia de troca aniônica.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que proporciona uma solução que compreende um nível de contaminação por DNA da célula hospe- deira que é inferior a 5.000 pg/ml; e/ou pelo fato de que proporciona uma solução do polipeptídeo recombinante que compreende um nível de contaminação por DNA da célula hospedeira que é reduzido por um fator de pelo menos 1,5, preferencialmente de pelo menos 2, de pelo menos 5, de pelo menos 10, de pelo menos 20, de pelo menos 50, de pelo menos 100, de pelo menos 150 ou de pelo menos 200, quando comparado com um processo de referência que é idêntico ao processo reivindicado, com exceção de que não é usado nenhum alquil glicosídeo ou com exceção de que é usado um tratamento com S/D convencional tal como TNBP/PS 80.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que proporciona uma solução que compreende um nível de contaminação por proteína da célula hos- pedeira que é inferior a 5.000 ng/ml; e/ou pelo fato de que proporciona uma solução do polipeptídeo recombinante que compreende um nível de contaminação por proteína da célula hospedeira (HCP) que é redu- zido por um fator de pelo menos 1,5, preferencialmente de pelo menos 2, de pelo menos 2,5, de pelo menos 3 ou de pelo menos 3,5, quando comparado com um processo de referência que é idêntico ao processo reivindicado, com exceção de que não é usado nenhum alquil glicosídeo ou com exceção de que é usado um tratamento com S/D convencional tal como TNBP/PS 80.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) compreende adi- cionalmente incubar a solução.

16. Processo para inativar um ou mais vírus que podem estar em uma solução caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de adição de um alquil glicosídeo à solução e incubação da solução.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que a solução é i) uma solução que compreende um polipeptídeo recombinante ou ii) material derivado de plasma.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada durante entre 20 minutos e 5 horas.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada à temperatura ambiente ou entre 4°C e 10°C.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 19, caracterizado pelo fato de que a concentração final do alquil glicosídeo antes da incubação está acima da concentração crítica de micelas (CMC) do alquil glicosídeo.

21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada sem agitação.

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é de uma linhagem celular que produz de forma recombinante o polipeptídeo.

23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma prote- ína de coagulação sanguínea, albumina, uma imunoglobulina ou uma proteína de fusão.

24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a solução na etapa (i) possui entre 0,1 μg/ml e 50 μg/ml de DNA da célula hospedeira e/ou entre 50 μg/ml e 1.000 μg/ml de proteína da célula hospedeira.

25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o alquilglicosídeo é n-octil- β-D-glicopiranosídeo ou é selecionado a partir do grupo que consiste em n-decil-beta-D-glicopiranosídeo, n-octil-beta-D-maltosídeo, n-dode- cil-beta-D-maltosídeo, n-dodecil-beta-D-glicopiranosídeo e n-decil-beta- D-maltosídeo.

26. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a solução é tratada posteri- ormente após a etapa (iii) e quaisquer etapas adicionais de purificação por uma etapa de filtração viral.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a solução é tratada posteri- ormente após a etapa (iii) e quaisquer etapas adicionais de purificação por uma ou mais etapas de ultrafiltração e/ou diafiltração.

28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante purificado é misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição farmacêutica.

29. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o alquil glicosídeo é adicio- nado sem qualquer solvente orgânico e/ou o alquil glicosídeo é adicio- nado sem qualquer mistura prévia com um solvente orgânico.

30. Solução que compreende um polipeptídeo recombinante e um alquil glicosídeo caracterizada pelo fato de que a solução é obtida da etapa (ii), como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

31. Solução que compreende um polipeptídeo recombinante purificado caracterizada pelo fato de que a solução é obtida pelo pro- cesso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29.