KR101293504B1 - 혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ｖⅰⅰⅰ의 정제 - Google Patents

혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ｖⅰⅰⅰ의 정제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지를 사용하는 재조합 단백질의 정제 방법을 설명한다. 본 발명은 로딩 단계 동안 pH 또는 전도성의 조정을 요하지 않고 높은 수율 및 효율을 가져오는 단일 단계 크로마토그래피 공정이라는 점에서 유리하다. 이 공정은 응고 인자, 특히 재조합 인자 VIII의 재조합 조성물의 정제에 사용된다.

Description

혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ＶⅠⅠⅠ의 정제{PURIFICATION OF FACTOR VIII USING A MIXED-MODE OR MULTIMODAL RESIN}
본 발명은 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지를 사용하는 재조합 단백질의 정제방법에 관한 것이다. 해당 단백질은 특히 재조합 인자 VIII의 조성물의 정제에 관련된 응고 인자이다.
항혈우병 인자 또는 FVIII:C로서도 알려진 사람 인자 VIII는, 80,000 달톤의 경쇄 분자량 및 90,000 내지 220,000으로 다양한 중쇄 분자량을 갖는 두개의 폴리펩티드로 구성된 인간 혈장 단백질이다. 이것은 인자 X를 그것의 활성 형태 인자 Xa로 전환하는데 필요한 응고 경로에서 핵심 보조인자 중 하나로서 간주된다. 인자 VIII는 폰 빌레브란트 인자(FVIII:RP로서도 알려짐)와의 비공유 복합체로서 혈장에서 순환한다. 혈우병, 출혈성 장애는 비정상적 수준의 인자 VIII로 인해 초래된다. 정상 20% 미만의 인자 VIII 수준은 사람에게서 혈우병 상태를 초래할 수 있다. 인자 VIII의 1% 미만의 수준 저하는 심각한 출혈성 장애를 유발하며, 자발성 관절 출혈이 가장 흔한 증상이다.
재조합 인자 VIII의 구조 및 생화학은 이미 설명되어 있다.
전통적으로, 인자 VIII의 분리 및 정제는 혈장 유래의 공급원(동결침전물)으로부터이다. 혈장 유래의 공급원으로부터의 정제 과정은 FVIII의 정제를 위해 다클론 및 단클론 항체를 사용하는 면역친화성 정제의 사용을 모색하는 것을 포함한다. 그러나, 인자 VIII 유출물이 지지 매트릭스로부터의 누출로 인한 일부 잔류 항체를 함유하는 경우가 있을 수 있으며, 이것은 최종적으로 사용하는 동안, 즉 사람 또는 동물 계통으로 도입할 때 항원성을 초래할 수 있다. 또한, 예컨대 아가로스 비드 상에서 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것을 모색하는 정제 과정이 혈장으로부터 인자 VIII의 정제에 사용되어 왔다. 그러나 이들 방법은 때로는 얻어진 FVIII:C의 특정 오염 수준을 경험한다.
그러나, 유전자 조작된 재조합 공급원으로부터 인자 VIII를 정제하는 것은 지난 십년 동안 중요성을 얻어 왔다. 단백질 회수 및 최종 산물의 농도는 재조합 단백질의 분리에 있어 가장 중요한 것 중 하나이다. 재조합 생성된 단백질 내의 오염물질은 배양 배지 중의 분비 단백질, 배지 성분, 세포 용해물, 세포에 의해 생성된 원하지 않는 단백질 및 핵산을 포함할 수 있다.
재조합 단백질을 정제할 때, 해당 폴리펩티드가 발견된 수성 공급원 물질은 때로는 하나 이상의 바이러스로 오염된 것으로 보인다. 예컨대 용매/세척제 용액을 사용하는 화학적 방법, 방사선조사 방법 또는 열적 방법과 같이 폴리펩티드 혼합물 중의 바이러스를 불활성화시키는 기술은 기술분야에 알려져 있지만, 이러한 기술을 알려진 폴리펩티드 정제 공정과 조합하려는 시도는 대량 생산에 부적합한 단계의 중복성을 갖는 방법을 만들었다. 또한 사용되는 바이러스-불활성화 제제는 단백질을 변성시키지 않거나 해당 단백질로부터 분리하는 것이 어렵다는 점에서 주의를 기울이는 것이 중요하다. 그러나 이들 제제는 변성되거나 해당 폴리펩티드로부터 분리하는 것이 어려웠고, 특수 처리 또는 분리 단계가 요망되었다. 열 또는 방사선조사와 같은 잠재적인 바이러스 오염에 대한 폴리펩티드-함유 제조물의 종래의 처리 방법은, 해당 폴리펩티드의 중대한 변성 및/또는 불충분한 바이러스의 불활성화를 야기하였다. 시중에서 이용가능한 많은 재조합 인자 VIII 제품(Advate®, Helixate®, Kogenate FS®, ReFacto®)은 정제 및 바이러스 불활성화를 위한 세척제를 포함하는 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 이루어진다.
재조합 DNA 기술에 의해 생성된 치료적 단백질의 정제에서, DNA 및 숙주 세포 단백질(HCP)의 함량을 원하는 매우 낮은 수준까지 감소시키려고 할 때 상당한 문제들에 직면한다는 것이 잘 알려져 있다.
Nordfang et al.(Thrombosis and Haemostasis 58(4), 1043-1048 (1987)은 항체 수지 및 50% 에틸렌 글리콜과 고염을 함유하는 완충액을 사용하는 분리를 설명한다.
포유동물 세포 계통에서 발현된 재조합 단백질의 정제는 통상적으로 여러 단계로 행해진다. 상이한 단계는 보통 포획단계, 중간단계 및 연마단계로 분리된다. 포획 단계의 목적은 a) 안정한 용액 형태로 표적 단백질을 얻는 것 및 b) 부피를 감소시키는 것(즉 컬럼으로 로딩된 용액("로딩")에 비하여 단백질 함량에 대하여 농축된 용액을 얻는 것)의 두 부분이다.
후자 단계(부피의 감소)는 후속 정제 단계를 용이하게 하는데 결정적이다. 포획 단계는 흔히 이온 교환 수지와 함께 크로마토그래피를 사용하여 달성된다. 이온-교환 수지를 사용하는 것의 단점은 로딩의 전도성 및/또는 pH가 조정되어야 한다는 점이다. 전도성을 조정할 때, 대부분의 경우 감소되는데, 출발 물질의 부피를 증가시키는 물의 첨가에 의해 행하며, 이것은 후속 단계를 비실행적으로 그리고 제조 목적을 전체적으로 복잡하게 만든다. 또한, pH의 조정은 때로는 정제 단계의 수행을 방해할 수 있는 응집체의 형성을 야기한다.
포획 단계 후, 중간 정제가 이어지며, 이것은 DNA, 바이러스 및 내독소를 포함하는 중대한 불순물의 대부분을 제거한다. 이들 불순물은 또한 포획 단계에서 제거/감소될 수 있다. 연마 단계는 최종 정제 단계를 말하며, 여기서 미량의 오염물질 및 불순물이 제거되고 산출물은 활성 생물학적 산물이다. 연마 단계 동안 제거되는 오염물질은 때로는 표적 분자의 이형태체 또는 의심되는 유출 산물이다.
여전히 기술분야에는 빠르고 효과적이며, 인자 VIII 활성이 필수적으로 유지되는, 개선된 정제 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 방법은 단일 단계에서 부피 감소 및 상당한 비활성(specific activity)의 증가를 제공한다는 점에서 유리하다. 따라서, 이 방법은 단일 단계로 포획 및 정제 단계를 조합한다.
본 발명은 또한 고농축되고 매우 순수한 재조합 인자 VIII의 용액을 제조하는데 효과적이고, 인자 VIII 단백질이 분해에 대하여 안정화된 공정을 제공한다. 본 발명을 사용하여, FVIII 분자의 심각한 불안정화의 위험 없이 포획 및 정제 단계를 단일 단계로 조합하고, 미정제 시료의 초기 정제를 달성하고, 실질적인 부피 감소를 달성하며(이로써 다음 정제 단계를 용이하게 함), 또한 실질적인 정제 인자(FVIII 비활성 증가) 및 결과 용액("포획 풀(capture pool)")을 달성하는 것이 가능하고, 이때 단백질은 분해에 대하여 안정화된다.
본 발명은 재조합 단백질, 특히 응고 인자 VIII의 신규하고 효과적인 정제에 관한 것이다. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 포유동물 세포 배양액으로부터 인자 VIII 분자의 포획을 위한 다중형 컬럼의 사용이, 단백질의 활성의 손실 없이 배양물로부터 수확된 FVIII 단백질로부터의 오염물질 제거를 위한 빠르고 효과적인 정제 방법이라는 것을 발견하였다.
한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 오염물질을 함유하는 응고 인자 VIII 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 인자 VIII 단백질을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 인자 VIII 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 방법은 단계 (b)로부터 얻어진 인자 VIII-함유 용액을 수집하는 단계 (c)를 더 포함하며; 및/또는 이 방법은 단계 (a) 후 단계 (b) 전에 컬럼에 하나 이상의 세정 완충액(들)을 통과시키는 단계 (a1)을 더 포함한다.
이들의 다양한 실시형태에서, 상기 세정 완충액(들) 중 하나 이상은 1OmM 내지 100OmM 염을 포함하고, 및/또는 단계 (b)의 용출 완충액은 적어도 2M 염 및 적어도 45%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 예컨대 2.3-2.6M 염 및 48-52%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물을 함유하고; 및/또는 단계 (b)의 용출 완충액에 함유된 염은 NaCl, NH4Cl, KCl, (NH4)2SO4, CH3CO2NH4 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 오염물질을 함유하는 인자 VIII 단백질을 정제하는 단일 단계 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 단백질을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 함유하는 다중형 수지와 접촉시키는 단계;
b) 상기 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하는 단계를 포함하며;
이때 상기 방법은 약 250배 컬럼 부피 감소를 달성한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 오염물질을 함유하는 인자 VIII 단백질을 정제하는 단일 단계 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 단백질을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 함유하는 다중형 수지와 접촉시키는 단계;
b) 상기 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하는 단계를 포함하며;
이때 상기 방법은 적어도 30배의 "정제 인자"를 달성한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 VIII 단백질을 안정화하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 단백질을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 함유하는 다중형 수지와 접촉시키는 단계;
b) 상기 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하는 단계를 포함한다.
도 1a는 평형화, 로딩, 세정 및 용출과 함께 정제를 행하는 동안 280nm에서의 UV 흡광도, 전도성 및 pH를 나타내는 크로마토그램이다.
도 1b는 도 1의 크로마토그램의 세정 및 용출 부분의 확대를 나타낸다.
도 2는 로딩, (FT)를 통한 유동 및 용출의 정제 단계에서 Capto MMC 컬럼을 사용하여 얻어진 정제를 나타내는 은-착색 SDS 겔 전기영동을 나타낸다. 레인 1: MW 기준, 레인 2: 세포 배양 배지, 레인 3: 빈 공간, 레인 4: Capto MMC 컬럼으로부터 누출된 (미결합 물질), 레인 5: 빈 공간, 레인 6: 포획 풀(Capto MMC 컬럼으로부터 결합 및 용출된 단백질 물질)
도 3은 다양한 농도의 NaCl 또는 NH4Cl 및 에틸렌 글리콜을 함유하는 상이한 용출 완충액와 함께 Capto MMC 수지를 사용하여 정제된 재조합 인자 VIII의 수율 퍼센트를 나타내는 히스토그램이다.
도 4는 포획 풀에서 인자 VIII의 안정성에 대한 반복된 냉동/해동 사이클의 효과를 나타낸다.
응고 인자 VIII를 정제하는 본 방법은 소수성이며 음으로 하전된 수지를 사용하는 다중형 크로마토그래피를 사용하여 행해진다. 정제될 단백질의 용액, 예컨대 포유동물 세포 발효로부터 얻어진 단백질-함유 상청액은 상기 수지를 함유하는 크로마토그래피 컬럼을 통해 용액을 통과시킴으로써 다중형 수지에 적용된다. 용액(로딩)은 통상적으로 수지로 로딩되기 전에 여과(예컨대 전량 여과(dead-end filtration) 또는 십자 흐름 여과에 의함) 및/또는 원심분리되어 세포 및 입자가 제거된다. 로딩 단계는 pH 또는 전도성의 조정을 요하지 않는다. 로딩 후, 통상적으로 컬럼을 하나 이상의 세정 완충액로 세정하는데, 이들 중 하나는 고농도의 염을 함유한다. 한 실시형태에서, 컬럼은 로딩 후 평형화 완충액으로 세정되며, 선택적으로 그 후 고농도의 염을 갖는 제2 완충액으로 세정된다.
흡착된 물질을 회수하기 위해서, 컬럼을 통해 고농도의 염 및 유기 용매를 포함하는 용출 완충액을 통과시킴으로써 용출을 행한다.
본 발명은 로딩 시료의 부피에 비하여(그리고 이것으로부터 계산하여) 약 250배의 컬럼 부피(CV) 감소를 제공하며, 우수한 부피 감소를 달성한다. "부피 감소"는 단백질-함유 로딩 용액(예컨대 발효 공정으로부터의 정화된 미정제 시료)의 부피와 비교했을 때 단백질-함유 용출물 용액의 부피 감소를 의미한다.
본 발명의 정제 방법은 70-100%의 단백질 수율을 또한 제공하며, 정제 인자 (비활성 증가)는 최대 100배이다. 얻어진 정제된 단백질은 적어도 2달 동안 -70℃에서 용출 완충액에서 안정하다.
또한, 본 발명의 방법은 안정한 인자 VIII 용액을 제공한다: 포획 용출물은 상당한 활성 손실 없이 적어도 3회 냉동 및 해동될 수 있다.
본 발명은 오염물질로부터 해당 인자 VIII 단백질의 분리를 위한 다중형 크로마토그래피 수지를 사용한다. 둘 이상의 상이하지만 함께 작동하는 부위가 표적과 상호작용하는 다중형 크로마토그래피가 인자 VIII 단백질의 정제를 위한 적절한 시스템이 된다는 것을 결정한다. 본 발명에서 재조합 단백질의 정제를 위해 사용되는 크로마토그래피 수지는 시중에서 입수가능하며, 예를 들어: Capto MMC™(GE Healthcare) 또는 MBI HyperCel™(Pall, formerly BioSepra)이 있다.
Capto MMC는 종래의 이온 교환제에 비하여 상이한 선택성을 부여하는 다중형 기능성을 갖는 리간드를 함유하며, 또한 0.5M 내지 1.0M 정도로 높은 염 농도에서 단백질 결합의 가능성을 제공한다. 본원에서 리간드는 표적 분자와 상호작용하기 위한 다양한 기능성을 나타내며, 따라서 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 제공한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 다중형 수지는 Capto MMC™이다.
또 다른 다중형 크로마토그래피, MBI HyperCel™(Pall)는 안정성 문제 및 단백질-기반 친화성 컬럼으로부터의 유출을 해결하는데 효과적이다. 보다 구체적으로, MBI Hypercel™(Pall), 머르캅토-벤즈이미다졸-술폰산 리간드를 포함하는 흡착제는 주어진 단백질과의 소수성 및 이온성 상호작용을 제공한다. 소수성 상호작용은 방향족 고리계에 기인한 것으로 생각되는 한편, 이온성 상호작용은 SO3-치환체에 기인한 것이며, 이것은 강한 양이온 교환제로서 알려져 있다. 또한, MBI 리간드의 방향족계의 질소 원자는 특정 조건하에서 하전가능하고, 결과적으로 음으로 하전된 기와의 이온성 상호작용을 제공할 수 있다.
유리한 실시형태에서, 오염물질은 다중형 리간드에 흡착되며, 기본적으로 응고 인자 VIII의 순수한 분획은 후속의 선택적 용출에 의해 회수된다. 포획 단계는 적어도 80배, 예컨대 80 내지 100배, 90 내지 100배 또는 100-160배의 정제 인자(비활성 증가)를 제공한다.
얻어진 포획 풀은 적어도 10% 순수, 예컨대 적어도 20% 또는 약 30% 내지 60%, 예컨대 30% 내지 50% 순수한 인자 VIII 단백질을 포함한다. 순도는 단백질의 총량 중 인자 VIII 단백질의 양 %(w/w)(예컨대 ELISA에 의해 측정됨)으로 정의된다.
본 방법의 실시형태에서, 다중형 크로마토그래피 수지에 로딩되는 용액은 포유동물 세포 발효로부터의 인자 VIII-함유 수확물이다. 그것의 한 실시형태에서, 상기 수확물은 여과 및/또는 원심분리되어 세포 및 입자가 제거되고; 다른 실시형태에서 수확물은 로딩 용액의 pH 또는 전도성의 조정 없이 수지로 로딩된다.
본 발명은 구체적으로 로딩 단계가 포유동물 세포 발효로부터의 인자 VIII-함유 수확물, 선택적으로 여과된 수확물의 pH 및 전도성과 유사한 pH 및 전도성으로 단백질-함유 로딩 용액을 수지로 로딩하는 것을 포함하는 방법을 포괄한다.
이것은 로딩 용액의 전도성을 조정(감소)하는데 필요한 부피를 제한함으로써 초기 포획 단계에서 매우 큰 이점을 제공한다.
한 실시형태에서, 인자 VIII-함유 수확물은 이미다졸(예컨대 수확물 L 당 1-10mmol 이미다졸)의 첨가에 의해 안정화된다. 수확물의 부피에 비하여 적은 양 및 부피의 이미다졸 첨가로 인하여, 수확물의 pH 및/또는 전도성의 변화는 미미하다. 다른 실시형태에서, 그 다음 수확물은 (i) 여과 및/또는 원심분리되어 세포 및 입자가 제거되고 (ii) 다른 화학물질의 첨가 없이 수지로 로딩된다.
본 발명의 방법은 통상적으로 다수 단계: 컬럼의 평형화, 로딩 및 용출로 행해진다. 로딩 후 용출 전에 하나 이상의 세정 단계를 포함할 수 있다. 세정 단계(들)는 통상적으로 고농도의 염을 함유하는 적어도 하나의 완충액을 사용하여 행한다. 한 실시형태에서, 10mM 내지 1000mM 염, 예컨대 100-1000mM, 또는 250-1000mM, 또는 500-1000mM, 또는 500-800mM 염을 포함하는 완충액을 사용하는 세정 단계를 사용한다. 또 다른 실시형태에서, 이 방법은 로딩 후 컬럼을 먼저 평형화 완충액으로 세정한 다음 고염을 함유하는 두번째 세정 완충액으로 세정하는 세정 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 평형화 완충액은 완충제(예컨대 5mM 내지 100mM 범위 내의 이미다졸, 예컨대 2OmM 이미다졸), Ca-염(1mM 내지 100mM, 예컨대 10mM CaCl2), 세척제(예컨대 0.001% 내지 0.1% 범위 내의 Tween™ 80, 예컨대 0.02%(w/v) Tween™ 80) 및 염(10mM 내지 1000 mM, 예컨대 50mM NaCl)를 포함한다. 평형화 완충액은 pH 6.0 내지 8.0로 유지되며; 바람직하게는 pH 조건은 7.3 내지 7.5에서 유지된다. 본원에 예시된 인자 VIII 단백질은 pH 약 6.0 내지 8.0에서 안정하며 따라서 평형화 완충액은 pH 7.3-7.5, 보다 바람직하게는 7.5이라는 것이 당업자들에게 자명할 것이다.
한 실시형태에서, 세정 완충액은 완충제(예컨대 5mM 내지 100mM 범위 내의 이미다졸, 예컨대 2OmM 이미다졸), Ca-염(1mM 내지 100mM, 예컨대 10mM CaCl2,), 세척제(예컨대 0.001% 내지 0.1% 범위 내의 Tween™ 80, 예컨대 0.02%(w/v) Tween 80) 및 염(예컨대 50mM 내지 1000mM 범위 내의 NaCl)을 포함한다.
용출 단계는 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온(1mM 내지 100mM, 예컨대 10mM CaCl2)을 포함하는 용출 완충액으로 행한다. 용출 완충액은 pH 6.0 내지 8.0이고; 바람직하게는 pH 조건이 7.3 내지 7.5로 유지된다. 소망하는 pH 조건을 유지하기 위해서, 용출 완충액은 또한 완충제를 함유한다.
용어 "완충제"는 원하는 범위 내로 - 본 발명의 내용에서는 6.0 내지 8.0, 예컨대 7.3 내지 7.5 범위 내로 용액의 pH를 유지할 수 있는 제제를 포함한다. 완충액 농도 범위는 용액의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 완충제는 또한 적어도 두개의 완충제의 혼합물일 수 있으며, 이때 혼합물은 특정 범위 내의 pH값을 제공할 수 있다. 완충제는 시트레이트(나트륨 또는 칼륨), 아세테이트(암모늄, 나트륨 또는 칼슘), 히스티딘(L-히스티딘), 포스페이트(나트륨 또는 칼륨), 타르타르산, 숙신산, MES, HEPES, 이미다졸, TRIS, 에탄올아민, 및 이들 중 둘 이상의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 사용되는 완충제는 5mM 내지 10OmM 범위 내의 이미다졸이다.
바람직한 염은 NaCl, NH4Cl, KCl, (NH4)2SO4, CH3CO2NH4(암모늄 아세테이트, NH4Ac), 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물이다. 한 실시형태에서, 용출 완충액은 약 2.5M 염 및 적어도 40% 글리콜을 포함하며; 또 다른 실시형태에서, 용출 완충액은 약 2.5M 염 및 약 50% 글리콜을 포함한다. 한 실시형태에서, 염은 NaCl이고; 다른 실시형태에서, 염은 NH4Cl이다. 한 실시형태에서, 글리콜은 에틸렌 글리콜이며; 또 다른 실시형태에서, 글리콜은 프로필렌 글리콜이다. 또 다른 실시형태에서, 용출 완충액은 NaCl 및 에틸렌 글리콜을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, NH4Cl이 또한 2.5M 농도로 에틸렌 글리콜과 함께 단백질의 용출을 위해 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 용출 완충제는 세척제를 더 포함한다. 이 방법의 특정 실시형태에서, 용출물은 pH 7.5의 2OmM 이미다졸, 1OmM CaCl2, 0.02%(v/v) Tween 80, 2.5M NaCl 및 8M 에틸렌 글리콜이다.
또 다른 실시형태에서, MBI HyperCel™ 수지가 인자 VIII의 정제를 위한 방법에 사용된다. 한 실시형태에서, MBI HyperCel™ 컬럼을 사용한 재조합 인자 VIII의 결합은 10OmM Na2SO4의 첨가 후 수확물에 대하여 행하며, 용출은 1M NaCl 및 5M 글리세롤로 달성된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 이 방법은 a) 인자 VIII을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지와 접촉시키는 단계; b) 컬럼에 2OmM 이미다졸, 10mM CaCl2, 0.02%(w/v) Tween 80 및 50mM NaCl을 포함하는 평형 완충액 및 2OmM 이미다졸, 10mM CaCl2, 0.02%(w/v) Tween 80 및 1.5M NaCl을 포함하는 세정 완충액을 통과시키는 단계; c) 상기 단백질을 2OmM 이미다졸, 10mM CaCl2, 0.02%(v/v) Tween 80, 2.5M NaCl, 및 8M 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액으로 용출하는 단계를 포함한다.
보통의 환경하에서 포유동물 세포에서 발현되는 재조합 단백질의 정제의 제1 단계는 큰 로딩 부피를 취급한다. 시중의 단백질 정제에 대하여, 용이하게 취급할 수 있도록 부피를 감소시키는 것이 중요하다. 또한, 정제 단계는 상업적 공정 경제성 및 다른 목적을 달성하는데 중대한 수율을 가져야 한다. 제1 단계에서 약 20 내지 100배 부피 감소가 보통 단백질 정제의 제1 단계에서 목적이 되며, 후자는 충분한 부피 감소로서 간주된다.
한 실시형태에서, 정제될 단백질을 함유하는 로딩 부피는 500 컬럼 부피(CV)를 초과한다. 용출된 단백질은 100배를 초과하는 최종 부피 감소를 제공한다. 본 발명은 50-600CV의 로딩 부피를 포함한다. 부피 감소는 약 100-300배가 바람직하다. 한 실시형태에서, 로딩 부피는 약 500CV, 또는 약 450-600CV이며, 인자 VIII 단백질은 약 2CV로 용출되며 이는 약 250배 부피 감소를 달성한다.
또 다른 실시형태에서, 포획 단계는 하나 이상의 바이러스 불활성화제, 예컨대 Triton X-100(예를 들어 약 1% (w/v)의 농도)와 조합할 수 있다. 바이러스 불활성화제는 예컨대 사용하는 완충액 중 하나 이상에 첨가될 수 있다.
유속이 30-350cm/h인 용출 및 클린-인-플레이스(clean-in-place(CIP)) 단계를 제외한 모든 정제 공정 단계 동안 유속은 300-950cm/hr으로 조작된다. 한 실시형태에서, 로딩시 유속은 450cm/h이고; 용출 및 CIP 동안, 유속은 30cm/h으로 감소된다. 본 발명의 한 실시형태에서, 로딩시 유속은 약 450-600cm/h이다.
한 양태에서, 본 발명은 또한
(i) 인자 VIII 단백질; 및 (ii) 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘이온을 함유하는 완충액을 포함하고, 인자 VIII는 30% 내지 60% 순수한 제조물에 관한 것이다.
정의
본 발명에서, "인자 VIII 단백질"은 전장 VIII, FVIII:C, 및 응고 활성을 갖는 전장 인자 VIII의 결실 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 유도체의 결실에 의해, 이것은 B-도메인의 전체 또는 일부가 소실되었지만 응고 활성이 유지된 인자 VIII를 의미한다. 이러한 인자 VIII의 B-도메인 결실 형태는, 예컨대 WO91/09122에 설명된다. 인자 VIII의 일반적인 구조 및 생화학은 Kaufman(Trends in Biotechnology, 9, p.353-359 (1991) 및 Hematology, 63, p.155-165 (1991))에 의해 설명되었다. 또한 특징적인 인자 VIII 생물학적 활성을 유지하는, 인자 VIII의 페길화, 아실화 및 폴리시알릴화 형태를 포함하는 인자 VIII 서열 변이체 및 유도체가 포함한다. 인자 VIII는 재조합 수단에 의해 얻을 수 있다. 한 실시형태에서, 인자 VII는 인자 VIII를 재조합 생성한다. 한 실시형태에서, 인자 VIII는 전장 인자 VIII이고; 또 다른 실시형태에서, 인자 VIII 단백질은 B-도메인 결실 인자 VIII이다. 또 다른 실시형태에서, 인자 VIII는 페길화, 아실화, 또는 폴리시알릴화 인자 VIII이다.
사람 혈장으로부터 유래한 인자 VIII 농축물은 Andersson et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.2979- 2983 (1986))에 의해 설명된 바와 같이 여러 단편화된 완전 활성 인자 VIII 형태를 함유한다. 최소 활성 형태는 170kDa의 분자 질량을 가지며, 금속 이온(들)에 의해 함께 고정된 90kDa 및 80kDa의 두개의 쇄로 구성된다(예컨대 EP197901 참조). 이러한 인자 VIII 단편도 포함되는데 - 이러한 단편의 정제는 본 발명의 한 실시형태를 구성한다. 인자 VIII의 생물학적 활성은, 예컨대 실험 부분(이하 참조)에 설명된 바와 같이 분석된다.
용어 "용출물"은 기술분야에서 확인되는 바와 같은 그 종래의 의미를 의미하며, 이것은 분리 매트릭스로부터 하나 이상의 단백질 또는 화합물을 방출하는데 적합한 pH 및/또는 이온 강도의 완충액 또는 완충액들이다.
본원에 사용된 용출 단계에서의 "염"은 알칼리 토금속, 알칼리 금속 또는 암모늄염, 즉 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속 원소로부터의 양이온 또는 암모늄 양이온을 갖고 무기 또는 유기(탄화수소계) 음이온을 갖는 염이다. 이러한 염의 예는 염화나트륨, 염화암모늄, 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 인산암모늄, 인산마그네슘, 인산칼륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산칼륨, 황산마그네슘, 황산칼슘 등을 포함한다. 본원에서 바람직한 염은 염화물 또는 황산염이다. 본원에서 가장 바람직한 염은 염화나트륨이다.
용어 "다중형 크로마토그래피 리간드"는 결합될 단백질과 상호작용하는 적어도 두개의 상이하지만 함께 작용하는 부위를 제공할 수 있는 리간드를 말한다. 이들 부위 중 하나는 리간드와 해당 물질 간의 인력 형태의 전하-전하 상호작용을 제공한다. 다른 부위는 통상적으로 전자 수용체-공여체 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 제공한다. 본 발명은 특히 소수성 상호작용에 관한 것이다. 전자 공여체-수용체 상호작용은 수소-결합, .pi. -.pi., 양이온-. pi., 전하 이동, 쌍극자-쌍극자, 유도된 쌍극자 등과 같은 상호작용을 포함한다. 본원에서 또는 다른 곳에서 사용되는 다중형 크로마토그래피 리간드는 또한 "혼합형" 크로마토그래피 리간드로서 알려져 있다.
용어 "포획 단계"는 액체 크로마토그래피의 내용에서 분리 과정의 초기 단계를 의미한다. 가장 일반적으로 포획 단계는 정화, 농축, 안정화 및 가용성 오염물질로부터의 중대한 정제를 포함한다. 포획 단계 후, 중간 정제가 이어지며, 이것은 DNA, 바이러스 및 내독소를 포함하는 중대한 불순물을 대부분 제거한다. 이들 불순물은 또한 포획시 제거/감소될 수 있다.
용어 "연마 단계"는 최종 정제 단계를 말하며, 이때 미량의 오염물질 및 불순물이 제거되고 산출물은 활성 생물학적 산물이다. 연마 단계 동안 제거된 오염물질은 때때로 표적 분자의 이형태체 또는 의심되는 유출 산물이다.
크로마토그래피의 기술분야에서 알려진 용어 "컬럼 부피"는 패킹을 함유하는 튜브 부분의 기하학적 부피를 말한다. 본 발명에 따라, 로딩 부피는 50 컬럼 부피(CV)를 초과하거나 또는 약 300-600CV 또는 450-600CV 보다 크거나 작다. 최종 정제 단계에서 용출된 단백질은 약 2-5CV이며, 이것은 약 100배 내지 350배, 예컨대 250배의 부피 감소를 달성한다.
"정제 인자"는 비활성의 증가로서 정의되며 이것은 정제 단계 후 U/mg 단백질에 비한 정제 단계 전 U/mg 단백질이다. 응고 인자 VIII의 비활성은 시중에서 이용가능한 활성 분석에 의해, 예컨대 CoaTest® Chromogenix™ (Instrumentation Laboratory, Belgium)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라, 또는 하기 실험 부분에서 설명한 바와 같이 분석될 수 있다.
용어 "단일 단계 방법"은 하나 이상의 오염물질을 함유하는 인자 VIII 단백질의 정제 방법을 말하며, 여기서 이 방법은 부피 감소 및 비활성 증가(정제 인자 > 1)를 모두 달성한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 이 방법은 (i) 약 250배의 컬럼 부피 감소 및 (ii) 적어도 30배의 "정제 인자"를 제공한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해된다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하도록 구성되어서는 안된다.
실시예
재조합 인자 VIII의 구조 및 생화학은 이미 설명되어 있다(예컨대 Trends in Biotechnol. 1991, 9:353-359, Transfus. Med. Rev. 1992, 6:235-246 참조).
또한 인자 VIII의 분리 및 인자 VIII의 재조합 생성(전장 및 변이체/절단 형태)는 기술분야에 설명되어 있다:
재조합 DNA 기술은 트랜스펙션된 포유동물 세포에서 인자 VIII 단백질의 융합 산물의 발현을 지시하는 플라스미드의 구성을 가능하게 한다.
세포 배양에서 인자 VIII의 재조합 생성은 Wood et al에 의해 보고되었다(예컨대 Nature, 1984, 312: 330-337 참조). 또한 인자 VIII 단백질의 활성 변이체 및 유사체 및 이들을 암호화하는 DNA 서열이 보고되었다(US4868112, EP0786474, WO 86/06101, 및 WO 87/07144). 유전자 서열의 다양한 조작은 인자 VIII의 B 도메인이 응고촉진 활성에 결정적이지 않고, B 도메인이 결여된 뉴클레오티드 영역을 암호화하는 인자 VIII를 발현함으로써 활성 응고촉진 단백질을 발현할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 변이체 및 유사체에서의 중요한 변형은 B 도메인의 일부 또는 전부를 소실하고 및/또는 특정 아미노산 위치가 예를 들어 정상 프로테아제-불안정 부위가 예컨대 트롬빈 또는 활성화 단백질 C에 의한 단백질분해에 내성이 있도록 변형되는 것을 포함한다. 다른 유사체는 하나 이상의 리신 및/또는 티로신 잔기에서의 변형을 포함한다. 단백질의 절단 형태는 1438개 아미노산으로 구성된 170kDa 당단백질이다. 이 B-도메인 결실 단백질은 혈장-유래 인자 VIII의 변역 후 변형이며, 그것의 혈액응고 활성이 모체의 것과 필적한다.
인자 VIII 활성 분석
인자 VIII의 생물학적 활성의 추정을 위한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이러한 분석은 많은 제공자로부터 시중에서 이용가능하다.
정제된 인자 VIII의 활성은, 예컨대 CoaTest® Chromogenix™ (Instrumentation Laboratory, Belgium)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 분석할 수 있다.
실시예 1
인자 VIII의 재조합 생성은 기술분야에 잘 알려져 있으며; 예를 들어 US 5633150(Genentech) 및 US 7138505(Novo Nordisk/Novartis)을 참조할 수 있다.
재조합 인자 VIII를 시중에서 이용가능한 무혈청 배지에서 CHO-세포에서 발현하였다. 발효로부터의 단백질 수확물을 또한 정제에 사용하였다.
실시예 2
재조합 인자 VIII의 정제
재조합 단백질의 정제에 Capto MMC(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 수지를 사용하였다. 컬럼은 베드 높이 12cm 및 베드 부피 24ml로 패키징되었다.
제1 단계로서, 정제 공정은 로딩을 수반하였으며, 이때 발효로부터의 수확물을 컬럼에 적용하였다. 로딩의 컬럼 부피(CV)는 450CV이었다(표 1). 그 다음 컬럼에 2OmM 이미다졸, 1OmM CaCl2, 0.02%(v/v) Tween 80 및 5OmM NaCl로 구성된 평형화 완충액을 통과시켰다. 평형화 완충액의 pH는 7.5로 조정한다. 컬럼을 세정 완충액(2OmM 이미다졸, 1OmM CaCl2, 0.02%(v/v) Tween 80 및 1.5M NaCl)으로 평형화 완충액과 동등한 pH, 즉 7.5에서 더 세정한다. 평형화 및 세정 단계의 컬럼 부피는 3CV(표 1)이었다.
인자 VIII 정제의 다양한 단계에 사용된 컬럼 부피(CV)
단계 완충액 컬럼 부피
평형화 평형화 완충액 3
로딩 로딩 450
세정 1 평형화 완충액 3
세정 2 세정 완충액 3
용출 용출 완충액 5
CIP CIP 3
용출 완충액을 컬럼에 통과시킴으로써 용출을 행하였다. 용출 완충액은 2OmM 이미다졸, 1OmM CaCl2, 0.02%(v/v) Tween 80 및 2.5M NaCl 및 8M 에틸렌 글리콜로 구성된다.
유속이 30cm/h인 용출 및 CIP를 제외하고 유속을 모든 정제 단계에서 450cm/h로 유지하였다.
평형화, 로딩, 세정 및 용출과 함께 정제를 행하는 동안 280nm에서의 UV 흡광도를 나타내는 크로마토그램을 도 1에 제공한다.
실시예 3
활성 분석
정제된 인자 VIII의 활성을 CoaTest® SP 분석의 변형을 사용하여 측정하였다:
CoaTest? SP 키트로부터의 시약 및 완충액 스톡 용액을 사용하였다. 모든 시약은 실험 시작 전에 실온에 도달하도록 하였다. 시료를 CoaTest 분석 완충액(50mM Tris, 150mM NaCl, 1% BSA, pH 7.3, 보존제 함유)에 약 2mU/ml으로 희석하였다. 기준 혈장을 분석 완충액에 5 - 0.5mU/ml으로 희석하였다. 시료를 분석 완충액에 12 및 9U/ml으로 희석한 다음, VWF을 갖는 FVIII-결함 혈장(Dade Behring)에 10배, 마지막으로 CoaTest® 분석 완충액에 10배 및 20배로 희석하였다(시료 당 4회 희석이 이루어짐). 시료 50μl, 표준 및 완충액 음성 대조군을 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 2회분 첨가하였다. CoaTest? SP 키트로부터의 인자 IXa/인자 X 시약, 인지질 시약 및 CaCl2을 5:1:3(부피:부피:부피)로 혼합하고 이것의 75μl를 웰에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션 후, 50μl의 인자 Xa 기질 S-2765/트롬빈 억제제 1-2581 혼합물을 첨가하고, 반응을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 25μl 2% 시트르산을 첨가하였다. 기준 파장으로서 사용되는 620nm에서의 흡광도를 갖는 Spectramax® 마이크로타이터 플레이트 리더(Molecular Devices)에서 415nm에서의 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군에 대한 값을 모든 시료로부터 감하고 플롯된 흡광도값 대 FVIII의 mU/ml 농도의 선형 회귀법에 의해 검정 곡선을 만들었다.
ELISA 분석
Affinity Biologicals로부터의 시중의 ELISA 키트(VisuLize Factor VIII Antigen Kit, Lot AG8-0006)를 사용하여 제조자에 의해 기본적으로 설명된 바와 같이 인자 VIII 항원을 결정하였다.
재조합 인자 VIII를 상기 실시예 2에 설명된 바와 같이 발효 수확물로부터 정제하였다. 정제 인자 및 인자 VIII 단백질의 수율을 상기 설명한 바와 같이 CoA 및 ELISA에 의해 결정하였다:
정제 인자 및 수율(CoA 테스트에 의해 결정)
단계 부피
[ml]		 활성
[U/ml]		 총 활성
[U]		 단백질
[mg/ml]		 총 단백질
[mg]		 비활성
[U/mg]		 정제 인자
[X]		 전체 수율
[%]
배지 11000 117 1287000 2.11 23221 55 1 100.0
포획-
통과		 11000 1.8 19800 2.10 23100 1.5
포획 풀 45 14204 639180 2.68 120.6 5300 96 49.7
상기 결과로부터 볼 수 있듯이, FVIII-함유 배지를 11000ml에서 45ml(244배)까지 농축함과 동시에 55U/mg에서 5300U/mg까지 비활성의 증가를 얻는 것이 가능하며, 예컨대 활성 측정에 의해 결정된 96배의 정제 인자를 얻을 수 있다.
정제 인자 및 수율(ELISA에 의해 결정)
단계 부피
[ml]		 인자 VIII 단백질
[μg/ml]		 총 인자 VIII 단백질
[mg]		 단백질
[mg/ml]		 총 단백질
[mg]		 "비활성"
[인자 VIII mg/총단백질 mg]		 정제 인자
[X]		 수율[%]
배지 11000 9.7 106.7 2.11 23221 0.0046 1 100.0
포획-통과 11000 0.6 6.6 2.10 23100 0.00028 6.2
포획 풀 45 1706 76.8 2.68 120.6 0.6 130 72.0
상기 결과로부터 볼 수 있듯이, FVIII-함유 배지를 11000ml에서 45ml(244배)까지 농축함과 동시에 0.0046 인자 VIIImg/총 단백질 mg에서 0.6 인자 VIII mg/총 단백질 mg까지의 비활성 증가를 얻는 것이 가능하며, 예컨대 ELISA에 의해 결정된 130배의 정제 인자를 얻을 수 있다.
실시예 4
단백질 겔 전기영동
제조자(Invitrogen)에 의해 설명된 바와 같이 기본적으로 러닝 버퍼로서 트리스 아세테이트와 함께 7% NuPage® 트리스 아세테이트 겔을 사용하여 SDS 겔 전기영동을 행하였다. 간단히 말해서, 50분 동안 150 볼트에서 겔 전기영동을 행하고, 시료를 SilverQuest® 착색 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조자의 설명서에 설명된 바와 같이 착색하였다. 사용된 분자량(MW) 표준은 Invitrogen으로부터의 Mark 12이었다.
도 2에 나타낸 결과는 많은 양의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 밴드(도 2에서 화살표로 표시됨)의 존재에 의해 설명되는, 포획 풀 중 재조합 인자 VIII의 매우 높은 풍부화를 나타낸다.
실시예 5
SDS-겔 전기영동에 의해 시각화된 정제
전기영동을 위한 단백질 시료를 변성시키고 50mM DTT을 함유하는 LDS 시료 완충액(Invitrogen)에서 70℃에서 10분 동안 환원시켰다. 분리 겔은 7% 트리스-아세테이트(TA) Pre-Cast Novex 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)이었고, 60분 동안 한계 전압 150V에서 음극 및 양극 완충액으로서 트리스-아세테이트 완충액(Invitrogen)을 가지고 전기영동을 행하였다. SilverQuest®(Invitrogen)을 사용하여 제조자의 설명에 따라 은 착색을 행하였다.
겔은 Capture MMC 컬럼을 사용하여 얻어진 큰 정제를 나타낸다. 세포 배지는 일련의 단백질을 함유한다. 이들 단백질의 대부분은 컬럼을 통과하는 반면 인자 VIII는 컬럼으로부터의 포획 풀에 고도로 농축된다.
실시예 6
용출 조건
다양한 용출 조건을 Capto MMC 수지에 대하여 테스트하였다. 재조합 인자 VIII를 함유하는 수확물에 대하여, 5% 최종 농도로 글리세롤 및 5mM로 CHAPS를 첨가하였다. 2OmM 이미다졸, 1OmM CaCl2, Tween 80(0.2%v/v), 5OmM NaCl, 5mM CHAPS 및 5% 글리세롤의 평형화 완충액을 가지고 pH 7.5에서 평형화를 행하였다.
상이한 염 및 에틸렌 글리콜 농도를 갖는 pH 8.3의 2OmM 에탄올아민, 1OmM CaCl2, Tween 80(0.2%v/v)의 용출 완충액을 사용하였으며 이것은 a. 무첨가물; b. 1M NH4Cl; c. 2.5M NH4Cl; d. 3M 에틸렌 글리콜; e. 1M NH4Cl + 3M 에틸렌 글리콜; f. 2.5M NH4Cl + 3M 에틸렌 글리콜; g. 8M 에틸렌 글리콜; h. 1M NH4Cl + 8M 에틸렌 글리콜; I. 2.5M NH4Cl + 8M 에틸렌 글리콜; 2.5M NaCl + 8M 에틸렌 글리콜을 포함한다. 용출 조건은 수율 퍼센트에 기초하여 결정하였다. 도 3은 2.5M NH4Cl 또는 2.5M NaCl 및 8M 에틸렌 글리콜의 농도에서 단백질의 수율 퍼센트가 최대였다는 것을 나타낸다(도 3).
실시예 7
포획 풀의 냉동/해동 안정성
실시예 2에 설명된 바와 같이 Capto MMC 수지로부터 용출된 포획 풀의 분액에 -80℃에서 밤새 냉동한 후 다음날 4℃에서 해동하는 다수의 냉동/해동 사이클을 실시하였다. 인자 VIII 활성을 CoA 분석(CoaTest® Chromogenix™, 실시예 3에 설명됨)을 사용하여 실험의 종료시 모든 시료에 대하여 동시에 측정하였다.
반복된 냉동/해동 사이클에 따른 포획 풀 중의 인자 VIII의 비활성
냉동/해동 사이클
0		 냉동/해동 사이클
1		 냉동/해동 사이클 2 냉동/해동 사이클 3
FVIII 활성
(mU/ml)		 2 2.2 1.9 2.3

Claims (16)

  1. 컬럼을 통해 인자 VIII 단백질의 1회 통과로 용액 중의 인자 VIII 단백질을 포획 및 정제하는 단일 단계 방법을 포함하는, 하나 이상의 오염물질을 함유하는 용액으로부터 응고 인자 VIII 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 단일 단계 방법은
    (a) 인자 VIII 단백질 용액을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지를 함유하는 컬럼과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 인자 VIII 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하여 정제된 인자 VIII 단백질을 얻는 단계를 포함하는, 하나 이상의 오염물질을 함유하는 용액으로부터 응고 인자 VIII 단백질의 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)로부터 얻어진 인자 VIII-함유 용액을 수집하는 단계 (c)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단계 (a) 후 단계 (b) 전에 컬럼에 하나 이상의 세정 완충액(들)을 통과시키는 단계 (a1)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 세정 완충제(들) 중 하나 이상은 1OmM 내지 100OmM 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 세정 완충제는 0.5-0.8M 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)의 용출 완충액은 적어도 2M 염 및 적어도 45%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 단계 (b)의 용출 완충액은 2.3-2.6M 염 및 48-52%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)의 용출 완충액에 함유된 염은 NaCl, NH4Cl, KCl, (NH4)2SO4, CH3CO2NH4, 또는 이들 염의 두가지 이상의 혼합물로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 용출 완충액은 NaCl 및 에틸렌 글리콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 용출 완충액은 1mM 내지 100mM 농도로 칼슘 이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)는
    (i) 로딩 용액의 pH와 동등한 pH에서, 및/또는
    (ii) 전도성의 조정 없이
    행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 인자 VIII 단백질은 전장 인자 VIII, FVIII:C, 인자 VIII의 B-도메인 결실 형태, 인자 VIII의 페길화 유도체, 인자 VIII의 폴리시알릴화 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)에서 용출 완충액은 약 7.5의 pH에서 2OmM 이미다졸, 10mM CaCl2, 0.02%(w/v) Tween 80, 및 2.5M NaCl 및 8M 에틸렌 글리콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 약 250배 컬럼 부피 감소를 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 방법은 적어도 30배의 인자 VIII 단백질의 정제 인자를 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 컬럼을 통해 인자 VIII 단백질의 1회 통과로 인자 VIII 단백질 용액을 포획 및 안정화하는 단일 단계 방법을 포함하는, 인자 VIII 단백질을 안정화하는 방법으로서, 상기 단일 단계 방법은
    (a) 인자 VIII 단백질을 소수성 부분 및 음으로 하전된 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 다중형 또는 혼합형 수지를 함유하는 컬럼과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 인자 VIII 단백질을 적어도 1.5M 염 및 적어도 40%(w/v) 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물, 및 칼슘 이온을 함유하는 용출 완충액으로 용출하여 안정화된 인자 VIII 단백질을 얻는 단계를 포함하는, 인자 VIII 단백질의 안정화 방법.
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