KR20070091098A - 단백질 분리 방법 - Google Patents
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Abstract
제 1 목적에서 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에서 단백질을 분리하는 방법에 대한 것이고, 상기 용액은 조혈장, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 상기 방법은 상기 M은 매트릭스 백본이고, S는 선택적인 스페이서 암이며, L은 메르캅톤이코틴산인 리간드인 식 M-S-L을 갖는 고체 분리 매질을 제공하는 단계, 적어도 하나의 단백질이 가역적으로 상기 고체 분리 매질에 결합하도록 상기 단백질에 상기 고체 분리 매질을 접촉시키는 단계에 관여된다. 적어도 하나의 용출 단계가 상기 고체 분리 매질로부터 적어도 하나의 단백질 단편을 선택적으로 용리하도록 수행된다. 다른 목적에서, 본 발명은 인자 VIII 및/또는 인자 IX을 분리하는 방법에 대한 것이다.
단백질, 용리
Description
본 발명은 생물학적 소스에서 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다. 더 자세하게는, 본 발명은 혈액으로부터 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
혈장(Plasma)은 자연이 주는 가장 존귀한 원료중 하나이며, 혈장에서 정제된 단백질은 전세계 수백만 인구의 삶과 건강에 필수적인 물질이다. 상기 단백질의 대부분은 코헨(Cohn)식 저온 에탄올 분할법(cold-ethanol fractionation)으로 생산된다. 이 방식은 1940년 초 하바드 대학의 에드윈 코헨 박사(Dr Edwin Cohn)에 의해 개발되었다. 코헨박사는 각기 다른 조건(즉, pH값, 이온강도(ionic strength), 단백질 농도(protein concentration), 온도, 및 에탄올 농도(ethanol concentration))하에서 침강특성(precipitation characteristics)에 따라 혈청으로부터의 단백질 분리가 가능하다는 것을 발견했다. 이들 파라미터(parameter)를 변경함에 따라, 각기 다른 단백질의 프리시피테이트(precipitate)가 단계별로 발생한다. 코헨 기술은 수세기동안 혈청산업계에서 사용되었으나, 절차상 그 정제도와 효율성에 한계가 있다. 즉, 이 절차는 고품질의 결과물을 제공하지만, 절차의 융통성에 한계가 있고 생산되는 결과물의 순도에도 한계가 있다. 여전히 이와 같은 방법론들을 사용하여 상업화되는 단백질로는 알부민, 면역글로불린(immunoglobulin), 안티트롬빈 III(anti-thrombin III), 트롬빈(thrombin) 및 피브리노겐(fibrinogen)등이 있다.
플라즈마 생성물 생산의 기술적 발전에 따라, 용액(이동상(mobile phase))이 고정상(stationary phase)을 포함한 밀폐 컬럼(column)을 따라 퍼콜레이트(percolates)할 때, 단백 분자들의 선택적 흡착에 기준하여 혈청내의 단백질을 분리하는 크로마토그래피(chromatography) 방식을 고정상을 가진 고정 고체면(고체상(solid phase))에 접목하게 되었다. 흡착 또는 상호작용의 효율에 따라, 다양한 단백질들의 이동이 각각 다른 정도로 지연되며, 결과적으로 단백질들이 각기 분리되어 컬럼의 하부에 모이게 된다.
일반적으로 크로마토그래피 방식은 코헨식 저온 에탄올 분할법에 비해 좀 더 순한 단백질 분리를 사용하는데, 코헨식 저온 에탄올 분해법은 고농도 에탄올에 대한 단백질 노출 시간이 길다. 이는 단백질의 변질이나 불필요한 응집체를 발생시킬 수 있고, 결과적으로 이들 생성물을 수용하는 단백질들에게 의도에 반대되는 치료효과를 주게 된다. 반대로, 크로마토그래피를 사용한 분할법은 단백질들의 원래 구조에 영향을 미치지 않으면서, 효과적으로 불순물들을 제거할 수 있다. 코헨식 저온 에탄올 분할법에 동반되는 반복적인 대규모 프리시피테이션(precipitations)에 비해, 크로마토그래피 방식은 좀 더 직접적인 분리를 사용하고, 이로 인해 혈청로부터 생성되는 리터당 단백질량이 증가한다.
그러나, 현재 사용되는 크로마토그래피 방식의 분할법들은 여전히 원하는 순도를 유지 또는 향상시키면서도 생성량은 최적화 해야 한다는 과제를 안고 있다. 즉, 현존하는 방식들에서 더 나아가서, 높은 순도와 생산량의 혈청성분의 선택적 용리(elute)를 가능케 할 수 있는 효과적이고도 비용 효율적인 크로마토그래피 방식이 여전히 요구되고 있는 것이다.
1960년 초, 저온 배양시 프리시피테이트가 형성되는 것이 관찰되었다. 이러한 프리시피테이트는 인자 VIII(Factor VIII), 폰빌레브랜드 인자(Von Willebrands Factor), 및 기타 여러 개의 다른 플라즈마 단백질들을 포함하는 것으로 확인되었다. 초기에는 이러한 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate)를 A형 혈우병 환자 치료에 사용하였으나, 생성물에 대한 환자의 내성 강화 요구에 따라, 좀 더 정제된 순도의 인자 VIII가 제시되었다. 이러한 크리오프리시피테이트 절차는 오늘날 업계에서 여전히 사용되고 있는 인자 VIII의 제1 기본이 된다. 불행히도 크리오프리시피테이트 절차는 그리 효율적이지 않을 뿐더러, 크리오프리시피테이트를 사용하는 대신에 혈청을 직접적으로 이용해 인자 VIII의 회수를 개선하고자 하는 많은 노력에도 불구하고, 상업적으로 성공한 예가 거의 없다.
인자 IX는 B형 혈우병 환자의 치료에 사용되며, 잘 알려진 코헨 플라즈마 분할로 얻어지는 부수적 단편물(side fraction)인 수퍼네이턴트 I(supernatant I)에서 분리된다. 일반적으로 수퍼네이턴트 I내의 인자 IX는 본질적으로 현재의 모든 생산 절차에서 헤파린 세파로우즈(Heparin Sepharose)를 사용해 유사 크로마토그라피 단계를 사용하여 추가적으로 정제된다. 그러나, 모든 절차가 코헨 분할법에 기준하고 있기 때문에, 생산효율의 한계는 여전히 현저히 남아 있다.
이와 같은 경우에서도, 인자 VIII및/또는 인자 IX를 포함하는 복합물에서 인 자 VIII 및/또는 IX인자를 분리할 수 있는 좀 더 효율적인 절차가 요구된다.
발명의 요약
제１ 목적에 따르면， 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에서 단백질을 분리하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 용액은 조혈장, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 상기 방법은,
단백질을 포함하는 용액으로부터 단백질을 분리하는 방법에서, 상기 용액은 조혈장, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 상기 방법은,
(1) M-S-L을 갖는 고체 분리 매질(medium)을 제공하는 단계;
상기 M은 매트릭스 백본(matrix backbone)이고, S는 선택적인 스페이서 암(spacer arm) 및 L은 메르캅톤이코틴산(mercaptonicotinic acid)인 리간드이고,
(2) 상기 단백질의 적어도 하나가 상기 고체 분리 매질과 가역적으로 결합하도록 상기 용액을 상기 고체 분리 매질과 접촉시키는 단계;
(3) 상기 고체 분리 매질로부터 적어도 하나의 단백질 단편(fraction)을 선택적으로 용리하는 적어도 하나의 용리(elution) 단계를 수행하는 단계;를 포함하는 단백질을 포함하는 용액에서 단백질을 분리하는 방법.
다음은 본 발명의 제 1 목적과 관련하여 설명한다.
본 실시예에서, 상기 단백질은 포유류 또는 인간 기원으로 되어 있다.
상기 스페이서 암 S는 에폭시기를 포함하는 화합물 (예를 들면, 부탄 디올디글리시딜에테르 또는 에피그로로히드린) 또는 다른 적당한, 리간드의 공유 결합에 잘 알려진 커플링 시약으로부터 유도될 수 있다.
상기 매트릭스 백본 M은 상기 고체 분리 매질이 리간드와 기능을 수행하는 수지인 수지일 수 있다. 또한, 상기 수지로는 리간드가 결합할 수 있는 수지라면 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 게다가, 상기 수지는 유동층 흡착 및 6%에서 4%의 아가로오스를 기초로 한 교차 결합된 구슬 모양의 아가로오스 유도체, 아가로오스-텅스텐 카바이드 응집체 (conglomerate), 아가로오스 스테인레스 스틸의 응집체, 아가로오스-석영 응집체, 다공성 세라믹 비드, 다공성 지르코니아 비드, 및 구멍내에 유기 폴리머를 포함하고 있는 다공성의 무기 물질의 조절된 구멍이 있는 유리 및 혼합 비드로 구성된 비드 같은 확장층 흡착같은 비충전층 흡착에 적합한 고농도 수지일 수 있다.
본 실시예에서, 상기 리간드는 2-메르캅톤이코틴산일 수 있다.
상기 단백질과 상기 리간드의 결합은 가역가능하기 때문에, 상기 단백질은 추후 설명될 적당한 용리 조건하에서 상기 고체 분리 매질로 부터 분리될 수 있다.
상기 고체 분리 매질은 고농도 수지일 수 있는데, 상기 고농도 수지는 약 10 미크론(micron) 에서 약 150 미크론 범위의 평균입자크기 및 약 1.5 g/ml 에서 15 g/ml의 범위의 비드 밀도를 가지거나, 약 10 미크론 에서 약 120 미크론 범위의 평균입자크기 및 약 2.0 g/ml 에서 15 g/ml의 범위의 비드 밀도를 가지거나, 또는 약 15 미크론 에서 약 100 미크론 범위의 평균입자크기 및 약 2.3 g/ml 에서 15 g/ml의 범위의 비드 밀도를 가지거나, 약 15 미크론 에서 약 80 미크론 범위의 평균입자크기 및 약 3 g/ml 에서 15 g/ml의 범위의 비드 밀도를 가질 수 있다.
상기 목적에 따르는 방법에 의해 분리된 단백질은 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE, 트랜스페린(Tf), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 이들의 유도체와 같은 면역 글로불린, 예를 들면, 안티트롬빈 III(antithrombin III), 프로 혈액 응고 단백질(blood pro-coagulation protein), 항 혈액 응고 단백질(blood anti-coagulation protein), 시토킨(cytokine), 성장 인자(growth factor), 알부민(albumin) 또는 이들의 유도체와 같은 안티트롬빈(antitrombin)과 같은 플라즈마 프로테아제 억제제(plasma protease inhibitor), 혈전 용해제(thrombolytic agent), 항 신생 혈관 형성 단백질(anti-angiogenic protein), 인슐린(insulin) 또는 이들의 유도체, α-1-안티트립신(α-1-antitrypsin), α-2-안티플라스민(α-2-antiplasmin) 또는 이들의 유도체와 같은 α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor) 또는 이들의 유도체, C-1 분해효소 억제제 (C-1 esterase inhibitor), 아포지단백질(apolipoprotein), 고밀도지단백(HDL), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 유도체, 베타-2-글리코프로테인 I(beta-2-glycoprotein I), 플라스미노겐(plasminogen), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator), 플라스미노겐 억제제(plasminogen inhibitor), 유로키나아제(urokinase) 또는 이들의 유도체, 스트렙토키나아제(streptokinase) 또는 이들의 유도체, 내적-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-매크로글로불린(α-2-macroglobulin), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 오로소뮤코이드(orosomucoid), 페리틴(ferritin), 프리-알부민(pre-albumin), GC-글로불린(GC-globulin), 해모펙신(haemopexin) 및 C3-보체(C3 -complement)로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다.
상기 단백질 단편들은 하나의 단백질을 포함 할 수도 있다. 또는, 상기 단백질 단편들은 다양한 단백질을 포함 할 수도 있다.
상기 방법은 1에서 50, 1에서 30, 1에서 20, 1에서 10, 1에서 5, 1에서 3개의 용리 단계 또는 단 하나의 용리 단계를 포함 할 수도 있다.
본 실시예에서, 각 용리제는 약 4.0 에서 약 9.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 또는, 각 용리제는 약 4.0 에서 약 8.5 범위의 pH를 가질 수 있고, 각 용리제는 약 4.0 에서 약 8.0 범위의 pH를 가질 수 있으며, 각 용리제는 약 5.0 에서 약 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 또한, 각 용리제는 약 4.5 에서 약 8.0 범위의 pH를 가질 수 있고, 각 용리제는 약 5.5 에서 약 8.0 범위의 pH를 가질 수 있으며, 각 용리제는 약 6.0 에서 약 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다.
각 용리제는 약 0.00005 S/cm 내지 약 10.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 또는, 각 용리제는 약 0.0005 S/cm 내지 약 10.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있고, 각 용리제는 약 0.0001 S/cm 내지 약 6.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있으며, 각 용리제는 약 0.001 S/cm 내지 약 5.5 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 또한, 각 용리제는 약 0.001 S/cm 내지 약 5.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있고, 각 용리제는 약 0.005 S/cm 내지 약 5.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있으며, 각 용리제는 약 0.01 S/cm 내지 약 4.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
각 용리제는 상기 특정 범위내에서 pH 및 이온 강도 값의 어떠한 조합을 포함할 수 있다.
제 1, 제 2, 및 제 3 용리제는 약 4.0 내지 약 9.0 사이의 pH, 및 약 0.00005 S/cm 내지 약 10.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 제 1 용리제는 약 4.0 내지 약 8.0 사이의 pH, 및 약 0.00005 S/cm 내지 약 0.1 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있고, 약 4.5 내지 약 6.5 사이의 pH, 및 약 0.00005 S/cm 내지 약 0.075 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있으며, 약 5.0 내지 약 6.0 사이의 pH, 및 약 0.001 S/cm 내지 약 0.05 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
제 2 용리제는 약 5.0 내지 약 7.0 사이의 pH, 및 약 0.0001 S/cm 내지 약 0.1 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있고, 약 5.5 내지 약 6.5 사이의 pH, 및 약 0.0001 S/cm 내지 약 0.075 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있으며, 약 5.5 내지 약 6.5 사이의 pH, 및 약 0.001 S/cm 내지 약 0.05 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
제 3 용리제는 약 5.0 내지 약 9.0 사이의 pH, 및 약 0.0001 S/cm 내지 약 4.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있고, 약 6.0 내지 약 8.0 사이의 pH, 및 약 0.01 S/cm 내지 약 3.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있으며, 약 6.0 내지 약 8.0 사이의 pH, 및 약 0.05 S/cm 내지 약 2.0 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
제 1 용리제는 상기 단백질의 생물학적 기능에 있어서의 손실이 없는 용리제일 수 있는데, 예를 들면, 탈염수; 또는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 및 황산암모늄과 같은 염산, 황산 및 질산의 염 같은 강한 무기산 (mineral acids)의 적어도 하나의 무기염의 수용액일 수 있다. 또한, 제 1용리제는 상기 단백질의 생물학적 기능에 있어서의 손실을 일으키지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충수용액일 수 있는데, 예를 들면, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충액(buffer)일 수 있다.
제 2 용리제는 상기 단백질의 생물학적 기능에 있어서의 손실을 일으키지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충수용액일 수 있는데, 예를 들면, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충액(buffer)일 수 있다. 본 실시예에서, 제 2 용리제는 장쇄 알킬 카르복시산의 염, 알킬 술폰산의 염 또는 도데실 황산 나트륨 및 디옥시콜산나트륨같은 부대전성으로 대전된 세제(detergent)과 같은 방향성, 비-방향성 또는 헤테로방향성 소수성 부분을 갖는 부대전성 분자를 포함한다. 예를 들면, 제 2용리제는 카프로산, 헵탄산, 카프릴산, 펄라고닌산 (perlagonic acid) 및 카프르산, 운데칸산, 라우린산, 트리데칸산, 미리스틴산 및 펜타데칸산, 및 이들의 불포화 알킬치환 유도체로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 산의 염을 포함 할 수 있다. 또는, 제 2 용리제는 헥산 술폰산, 옥탄 술폰산, 데칸 술폰산, 도데칸 술폰산, 헥산 황산염, 옥탄 황산염, 데칸 황산염, 및 도데칸 황산염으로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 산의 염을 포함 할 수 있다.
제 3 용리제는 상기 단백질의 생물학적 기능에 있어서의 손실을 일으키지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충수용액일 수 있는데, 예를 들면, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충액(buffer)일 수 있다. 또한, 제 3 용리제는 황산암모늄, 황산 나트륨, 황산칼륨, 인산암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨, 구연산암모늄, 구연산나트륨, 및 구연산칼륨같이 비교적 높은 리토포비시티(lyｏtophobicity)의 무기염 또는 유기염을 포함 할 수 있다.
본 발명의 목적에 따른 방법은 상기 고체 분리 매질을 제 4 용리제로 용리 하여 제 4 단백질 단편을 선택적으로 용리할 수 있다. 제 4 용리제는 약 5.0에서 약 9.0사이의 pH 및 약 0.01 S/cm 내지 약 2 S/cm의 이온 강도를 가질 수 있고, 약 6.0에서 약 8.0사이의 pH 및 약 0.01 S/cm 내지 약 1.0 S/cm의 이온 강도를 가질 수 있으며, 약 6.0에서 약 8.0사이의 pH 및 약 0.05 S/cm 내지 약 1.0 S/cm의 이온 강도를 가질 수 있다. 상기 제 4 용리제는 분리될 단백질과 호환성을 가지는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충수용액일 수 있는데, 예를 들면, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충액(buffer)일 수 있다.
상기 제 4 용리제는 또한 상기 단백질의 생물학적 기능에 있어서의 손실이 없는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 및 황산암모늄과 같은 염산, 황산 및 질산의 염 같은 무기산 (mineral acids), 특히 강한 무기산,의 적어도 하나의 무기염의 수용액일 수 있다.
상기 제 1 단백질 단편은 알부민, 오로소뮤코이드(orosomucoid), 프리-알부민(pre-albumin), α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor,α-1-PI), 트랜스페린(transferrin), 및 피브리노겐(fibrinogen)으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함할 수 있다.
상기 제 2 단백질 단편은 안티트롬빈 III(antithrombin III), 알부민, 면역 글로불린, 트랜스페린(transferrin) 및 피브리노겐(fibrinogen)과 같은 안티트롬빈(antithrombin)으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함할 수 있다.
상기 제 3 단백질 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE, 트랜스페린(transferrin) 및 피브리노겐(fibrinogen)과 같은 면역 글로불린으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함할 수 있다.
제4 단백질 단편은 트랜스페린, α-2 매크로글로불린, IgM과 같은 면역글로불린 및 피브리노겐으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 목적에 따르면, 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함하는 용액으로부터 인자 VIII 및/또는 인자 IX을 분리하는 방법에서, 상기 용액은 조혈장, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 상기 방법은, (1) M-S-L을 갖는 고체 분리 매질(medium)을 제공하는 단계; 상기 M은 매트릭스 백본(matrix backbone)이고, S는 선택적인 스페이서 암(spacer arm) 및 L은 자일리엔디아민(xylylenediamine)인 리간드이고, (2) 적어도 인자 VIII 및/또는 인자 IX이 상기 용액 분리 매질과 가역적으로 결합하도록 상기 용액을 상기 고체 분리 매질과 접촉시키는 단계; (3) 상기 고체분리 매질로부터 비결합 단백질을 용리하는 제1 용리 단계를 수행하는 단계; (4) 상기 고체 분리 매질로부터 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 용리하는 제2 용리 단계를 수행하는 단계를 포함한다.
M은 비충전층 흡착에 적합한 고밀도의 수지, 예를 들어 유체화된 층 흡착 및 확장층 흡착, 예를 들어 6% 또는 4% 아가로스(agarose)에 기초하여 고도로 교차결합(cross-link)된 비드형 아가로즈 유도체(beaded agarose derivative), 아가로즈-텅스텐 카바이드 응집체(agarose-tungsten carbide conglomerate), 아가로즈 스텐인레스 스틸 응집체(agarose stainless steel conglomerate), 아가로즈-쿼츠 응집체(agarose-quartz conglomerate), 다공성 세라믹 비드, 다공성 지르코니아 비드, 조절된 다공 유리로 된 비드 및 기공 안에 유기 중합체를 포함하는 다공성 무기 물질의 복합 비드가 적합한 고밀도의 수지일 수 있다.
이 고밀도 수지는 약 10 미크론 내지 약 300 미크론, 또는 약 15 미크론 내지 150 미크론 범위의 평균 입자 크기, 및 약 1.1g/ml 내지 15g/ml 또는 약 1.5g/ml 내지 15g/ml 범위의 비드 밀도, 또는 택일적으로 약 10 미크론 내지 120 미크론 범위의 평균 입자 크기 및 약 2.0g/ml 내지 15g/ml의 비드 밀도, 또는 택일적으로 약 15 미크론 내지 100 미크론 범위의 평균 입자 크기 및 약 2.3g/ml 내지 15g/ml 범위의 비드 밀도 또는 약 15 미크론 내지 80 미크론 범위의 평균 입자 크기 및 약 3g/ml 내지 15g/ml 범위의 비드 밀도를 가질 수 있다.
스페이서 암 S는 에폭시 그룹(예를 들어, 부탄 디올디클리시딜에테르（butane dioldiglycidylether） 또는 에피클로로히드린（epichlorohydrin）) 또는 리간드의 공유결합 부착을 위해 본 기술분야에서 알려진 다른 적당한 결합 시약을 포함하는 화합물로부터 추출될 수 있다.
일 실시예에 있어서, L은 m-자일리엔디아민일 수 있다. 택일적으로 L은 p-자일리엔디아민일 수 있다. L은 또한 o-자일리엔디안일 수 있다.
비결합 단백질은 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE, 트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 이들의 유도체, 예를 들면, 안티트롬빈 III(antithrombin III), 프로 혈액 응고 단백질(blood pro-coagulation protein), 항 혈액 응고 단백질(blood anti-coagulation protein), 시토킨(cytokine), 성장 인자(growth factor), 알부민(albumin) 또는 이들의 유도체, 혈전 용해제(thrombolytic agent), 항 신생 혈관 형성 단백질(anti-angiogenic protein), 인슐린(insulin) 또는 이들의 유도체, α-1-안티트립신(α-1-antitrypsin), α-2-안티플라스민(α-2-antiplasmin) 또는 이들의 유도체와 같은 α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor) 또는 이들의 유도체, C-1 분해효소 억제제 (C-1 esterase inhibitor), 아포지단백질(apolipoprotein), 고밀도지단백(HDL), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 유도체, 베타-2-글리코프로테인 I(beta-2-glycoprotein I), 플라스미노겐(plasminogen), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator), 플라스미노겐 억제제(plasminogen inhibitor), 유로키나아제(urokinase) 또는 이들의 유도체, 스트렙토키나아제(streptokinase) 또는 이들의 유도체, 내적-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-매크로글로불린(α-2-macroglobulin), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 오로소뮤코이드(orosomucoid), 페리틴(ferritin), 프리-알부민(pre-albumin), GC-글로불린(GC-globulin), 해모펙신(haemopexin) 및 C3-보체(C3 -complement)로 구성되는 그룹으로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않는다.
용리 단계에서 사용된 용리제(eluant)는 약 5.0 내지 약 9.0 범위 내의 pH를 가질 수 있다. 이 용리제는 약 0.0001S/cm 내지 약 10.0S/cm 범위의 전도성을 가질 수 있다. 이 용리제는 약 6.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 가질 수 있으며, 약 0.03S/cm 내지 약 0.2S/cm 범위의 전도성을 가질 수 있다.
이 용리제는 대략 동일한 pH를 가질 수 있으나 이온 강도에 있어 다를 수 있다. 예를 들어, 각 용리제는 다른 완충(buffer) 시스템 및/또는 선택적으로 추가적인 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄과 같은 염화수소산, 황산, 질산을 포함할 수 있다.
각 용리제는 상기에서 제시된 범위 내에서 pH와 이온 강도의 결합을 가질 수 있다. 용리제는 인자 VIII 및/또는 인자 IX의 생물학적 기능에 어떠한 손실도 초래하지 않는 무기 또는 유기산의 염을 포함하는 완충 수용액(aqueous buffer solution), 예를 들어, 시트레이트(citrate), 아세테이트, 숙신산염（succinate）, 유산염（lactate）, 타르타르산염（tartrate）, 포름산염（formate）, 프로피온산염（propionate）, 붕산염 또는 인산염을 포함하는 완충액이다. 이 용리제는 또한 단백질의 생물학적 기능에 어떠한 손실도 초래하지 않는 강력한 무기산의 하나 이상의 무기염, 예를 들어,염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄과 같은 염화수소산, 황산, 질산의 수용액을 포함할 수 있다.
제1 및 제2 용리제는 약 6.0 내지 8.0 사이의 pH와 0.0001S/cm 내지 약 1.0S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 택일적으로 제1 용리제는 약 5.5 및 약 6.0 사이의 pH를 가질 수 있으며 약 0.0001S/cm 및 약 0.01S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
나아가 제1 용리제는 약 5.5 내지 6.0 사이의 pH와 0.0001S/cm 및 약 0.05S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 나아가 제1 용리제는 약 6.0 내지 6.5 사이의 pH와 0.001S/cm 및 약 0.1S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
제2 용리제는 약 6.0 내지 8.0 사이의 pH와 0.0001S/cm 및 약 0.1S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 택일적으로 제2 용리제는 약 6.0 내지 8.0 사이의 pH와 0.0001S/cm 및 약 0.5S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다. 나아가 제2 용리제는 약 7.0 내지 9.0 사이의 pH와 0.001S/cm 및 약 1 S/cm 사이의 이온 강도를 가질 수 있다.
상기한 문단에서 설명한 용리제의 pH 및 전도성을 조절함으로써, 본 방법은 다른 물질뿐만 아니라 혼합물로서의 인자 VIII 및 인자 IX를 인자 VIII 및 인자 IX를 포함하는 용액으로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다. 택일적으로 이 용액이 인자 VIII를 포함하는 경우(예를 들어 이 용액이 혈장 또는 인자 VIII만이 발현되는 재결합형 배양액으로부터 추출된 크리오프리시피테이트인 경우), 상기한 문단에서 설명한 용리제의 pH 및 전도성을 조절함으로써 본 방법이 인자 VIII만을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 이 용액이 인자 IX만을 포함하는 경우(예를 들어 이 용액이 혈장 또는 인자 IX만이 발현되는 재결합형 배양액으로부터 추출된 크리오수퍼네이턴트인 경우), 상기한 문단에서 설명한 용리제의 pH 및 전도성을 조절함으로써 본 방법이 인자 IX만을 분리하기 위해 이용될 수 있다.
정의
다음은 본 발명의 내용을 이해하는데 도움이 될 수 있는 몇 가지 정의들이다.
본 명세서에 있어서, "포함하는"이라는 용어는 "주로 포함하지만, 반드시 단독적이지는 않음"을 의미한다. 나아가 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 단어 변형예들은 대응하는 변형된 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서, "용리 단계(elution step)" "용리(elution)" 또는 "용리하는(eluting)"이라는 용어는 교환적으로 사용될 수 있으며, 결합 또는 결합되지 않을 수 있으며, 이에 따라 고체 분리 매질로부터 방출되거나 방출되지 않을 수도 있는 하나 이상의 단백질을 포함하는 단백질 단편을 획득하는 단계에 관련되도록 의도된다.
본 명세서에 있어서, "세척 단계(washing step)"란 용어는 고체 분리 매질로부터 단백질을 실질적으로 방출하지 않는 유체를 고체 분리 매질에 제공하는(flushing) 단계에 관련되도록 의도된다.
본 명세서에 있어서, "평형 단계(equilibration step)"는 유출(outgoing) 용액의 반대-이온(counter-ion) 농도, 전도성 및 pH가 대략 유입(incoming) 용액의 그것들과 같도록 충분한 용액이 고체 분리 매질을 통과하도록 허용되는 단계에 관련되도록 의도된다.
본 명세서에 있어서, "재조합형 배양액(recombinant broth)"은 유전학적으로 조작된 세포들에 의해 체외에서(in vitro)로 표현된 가용성 단백질에 관련된다. 재조합형 배양액 내에서 이러한 조작된 세포들로 발현될 수 있는 단백질들은 예를 들어, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 또는 인자 XIII과 같은 혈액응고기전(coagulation pathway) 단백질, 예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE와 같은 면역 글로불린 항체, 트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 이들의 유도체, 예를 들면, 안티트롬빈 III(antithrombin III), α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor), 프로 혈액 응고 단백질(blood pro-coagulation protein), 항 혈액 응고 단백질(blood anti-coagulation protein), 시토킨(cytokine), 성장 인자(growth factor), 알부민(albumin) 또는 이들의 유도체와 같은 안티트롬빈(antitrombin)과 같은 플라즈마 프로테아제 억제제(plasma protease inhibitor), 혈전 용해제(thrombolytic agent), 항 신생 혈관 형성 단백질(anti-angiogenic protein), 인슐린(insulin) 또는 이들의 유도체, α-1-안티트립신(α-1-antitrypsin), α-2-안티플라스민(α-2-antiplasmin) 또는 이들의 유도체와 같은 α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor) 또는 이들의 유도체, C-1 분해효소 억제제 (C-1 esterase inhibitor), 아포지단백질(apolipoprotein), 고밀도지단백(HDL), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 유도체, 베타-2-글리코프로테인 I(beta-2-glycoprotein I), 플라스미노겐(plasminogen), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator), 플라스미노겐 억제제(plasminogen inhibitor), 유로키나아제(urokinase) 또는 이들의 유도체, 스트렙토키나아제(streptokinase) 또는 이들의 유도체, 내적-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-매크로글로불린(α-2-macroglobulin), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 오로소뮤코이드(orosomucoid), 페리틴(ferritin), 프리-알부민(pre-albumin), GC-글로불린(GC-globulin), 해모펙신(haemopexin) 및 C3-보체(C3 -complement)를 포함한다.
본 명세서에 있어서, "혈장(blood plasma)"란 용어는 혈액의 액체 부분에 관련되며, 90 퍼센트 이상의 물을 포함하는 혼합 용액이다. 혈장의 주요 용질은 이종의 단백질 그룹이다. 다른 혈장 성분은 지방 물질(지질), 무기 전해물(inorganic electrolytes), 글루코스, 아미노산, 비타민, 호르몬 및 물질대사의 폐기물을 포함한다.
본 명세서에 있어서, "혈청(blood serum)"이란 용어는 응고 과정에서 피브리노겐이 제거되는 혈장(blood plasma)에 관련된다.
본 명세서에 있어서, "크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant)" 및 "크리오프리시피테이트(동결침전제제, cryoprecipitate)"란 용어는 다음에 의하여 이해되어야 한다: 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant)는 크리오프리시피테이트(동결침전제제, cryoprecipitate)의 제거에 따라 혈장으로부터 생성되는 용액이다. 크리오프리시피테이트(동결침전제제, cryoprecipitate)"는 1℃ 및 10℃ 사이 온도로 혈장을 노출시켜 혈장으로부터 침전된 단백질로 구성된다.
본 명세서에 있어서, "분할혈장(fractionated human plasma)"이란 용어는 예를 들어, 침전, 여과, 크로마토그래피 등의 분리 과정이 수행되는 혈장으로부터 추출된 혈장의 구성요소 또는 구성요소들의 혼합물에 관련된 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 있어서, "런-쓰루(run-through)"란 용어는 제1 용리 단계에서 획들된 용리제와 혼합된 혈장 용액이 칼럼 상에 로드될 때 획득된 용리제를 포함하는 본 발명의 제2 목적으로부터 획득된 단백질 단편에 관련된 것으로 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명
단백질 분리
본 발명의 제1 목적은 생물학적 용액으로부터 단백질을 분리하는 방법에 관련된다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인간의 혈장, 인간의 혈장으로부터 추출된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장, 인간의 혈장으로부터 추출된 동결침전제제(cryoprecipitate), 혈청 또는 재결합형 배양액으로부터 인간의 단백질을 분리하는 방법에 관련된다.
단백질을 포함하는 용액은 상기한 고체 분리 매질과 접촉하기 전에 다른 적절한 유체와 희석될 수 있다. 예를 들어, 혈장은 탈염된(dimineralised) 물, 분리된 단백질과 양립가능한 강력한 무기산(mineral acid)의 하나 이상의 무기염, 예를 들면 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄과 같은 염화수소산, 황산 및 질산이다.
단백질을 포함하는 상기의 용액은 약 1000:1 내지 1:1000의 비율로 다른 적당한 유체와 희석될 수 있다. 예를 들면, 희석 비율은 약 1000:1, 약 750:1, 약 500:1, 약 250:1, 약 100:1, 약 50:1, 약 25:1, 약 10:1, 약 7.5:1, 약 5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:2.5, 약 1:3, 약 1:5, 약 1:7.5, 약 1:10, 약 1:25, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:250, 약 1:500, 약 1:750, 약 1:1000이 될 수 있다.
단백질을 포함하는 상기한 용액의 pH는 유체를 고체 분리 매질에 접촉하기 전에 조절될 수 있다. 택일적으로, pH는 단백질을 포함하는 상기한 용액이 고체 분리 매질과 접촉된 이후에 조절될 수도 있다. pH는 올라가거나 또는 내려갈 수 있다. 택일적으로, pH는 변화되지 않을 수 있다. pH는 약 3.0 내지 약 6.0 범위의 pH로 조절될 수 있으며, 택일적으로, pH는 약 4.5 내지 약 6.0 범위의 pH로 조절될 수 있다.
예를 들면, pH 는 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0의 pH로 조절할 수 있다. 이 pH는 적절한 산, 예컨대, 염산, 황산, 인산，시트르산, 숙신산, 아세트산 등을 이용하여 조절할 수 있다.
이 pH는 적절한 염(base), 예컨대, 탄산염, 중탄산염, 암모니아, 수산화물 등을 이용하여 조절할 수 있다. 이 pH는 적절한 완충 계(buffer system)로 조절할 수 있다. 완충 계들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면, 구연산염(citrate), 아세트산염, 인산염, 포름산염, 숙신산염(succinate), MES, ADA, 2-3 프로판(bis-tris propane), PIPES, ACES, 이미다졸(Imidazole), MOPS, TES, HEPES, HEPPS, TRICINE, 글리신 아미드(Glycine Amide), 염화수소산염(hydrochloride), TRIS, BICINE, 글리실글리신(Glycylglycine), 붕산, CHES, CAPS를 포함한다. 많은 완충 계들이 상용화되어 있고 예컨대 Sigma Chemical Compnay로부터 입수할 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 자라면 원하는 pH에 대한 적절한 완충 계들을 알 수 있을 것이다.
용리제(eluant)들은 pH가 다양하다. 용리 단계들은 증가된 pH 또는 감소된 pH의 용리제들로 고체 분리 매질(soild separation medium)을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
용리제들은 거의 동일한 pH를 가질 수 있지만 이온 강도에서 다를 수 있다. 예를 들면, 각각의 용리제들은 다른 완충 계들을 포함하고/또는 선택적으로 부가적인 염들(salts), 예컨대, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 암모늄, 황산 나트륨(sodium sulpate), 황산 칼륨, 황산 암모늄과 같은 염산, 유황산(sulphuric acid), 질산의 염들을 포함할 수 있다.
용리된 단백질들 각각의 수율은 시작 물질에 존재하는 단백질의 양에 대하여 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 될 수 있다.
용리 단계들은 0℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다. 예컨대, 온도는 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 또는 약 40℃일 수 있다.
제 1 목적(aspect)의 방법는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 세정(washing) 단계를 포함할 수 있다. 세정 단계는 제 1 특징의 방법 중 임의의 단계, 예컨대, 고체 분리 매질을 단백질들을 포함한 용액에 접촉시키기 전, 고체 분리 매질을 단백질들을 포함한 용액에 접촉시킨 후, 또는 각 용리 단계 사이에서 수행할 수 있다. 세정 단계는 단백질들의 생물학적 기능을 손상시키지 않은 임의의 용액, 예컨대, 물, 염수(saline), 또는 완충 용액, 예를 들면, 구연산염(citrate) 완충액를 이용하여 수행할 수 있다.
세정 단계는 제 2 용리제로 고체 분리 매질을 용리한 후에 수행할 수 있다. 세정 완충액는 황산 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 인산 암모늄, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 구연산 암모늄(ammonium citrate), 구연산 나트륨, 구연산 칼륨과 같은 비교적 높은 립트로포비시티(lyotrophobicity)의 무기 또는 유기 염을 포함할 수 있다. 세정 완충액의 이온 강도는 적어도 0.001 S/cm, 또는 대안으로 적어도 0.01 S/cm, 또는 대안으로 적어도 0.1 S/cm, 또는 적어도 1.0 S/cm 일 수 있다.
제 1 목적의 방법는 하나 또는 그 이상의 평형 단계들(equilibaration steps)을 포함할 수 있다, 평형 단계는 고체 분리 매질을 단백질들을 포함한 용액에 접촉시키기 전에 수행할 수 있다. 평형 단계는 고체 분리 매질의 pH와 이온 강도를 조절하기 위하여 물 또는 적절한 완충 용액으로 상기 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 평형 단계에 사용된 용액은 탈염된 물(demineralised water) 또는 분리되는 단백질들과 호환 가능한 강한 미네럴 산의 하나 또는 그 이상의 무기 염들의 수용액, 예를 들면, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄과 같은 염산, 황산 및 질산의 염들의 수용액이 될 수 있다. 대안적으로, 평형 완충액는 분리되는 단백질들과 호환 가능한 무기 및/또는 유기 산의 염을 포함하는 완충 수용액(aqueous buffer solution), 예컨대, 구연산염, 아세트산염, 숙신산염(succinate), 유산염(lactate), 타르타르산염(tartrate), 포름산염, 프로피온 에스테르(propionate), 인산염, 또는 붕산염을 포함한 완충일 수 있다
평형 단계들은 약 10℃ 내지 약 40℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다. 예컨대, 온도는 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃ 또는 약 40℃일 수 있다.
단백질들을 포함한 용액의 pH는 단백질들을 포함한 상기 용액으로 상기 고체 분리 매질을 접촉시키기 전에 고체 분리 매질을 평형화하는 데 이용된 완충 용액의 pH와 같을 수 있다. 단백질들을 포함한 용액의 pH는 단백질들을 포함한 상기 용액으로 상기 고체 분리 매질을 접촉시키기 전에 고체 분리 매질을 평형화하는 데 이용된 완충 용액의 pH와 다를 수 있다.
제 1 목적의 방법는 하나 또는 그 이상의 재생(regeneration) 단계들을 더 포함할 수 있다. 재생 단계는 고체 분리 매질로부터 잔유 물질을 제거할 수 있는 적절한 시약(reagent)으로 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함한다. 재생 단계는 제 1 용리 단계를 수행한 후 임의 시점에서 수행할 수 있다. 적절한 재생 시약들은 염기들(bases), 예컨대, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨과 같은 수산화 용액들, 과산들(peracids) 또는 과산화 수소의 용액들, 예컨대, 에탄올과 같은 유기 용매들, 구아니디니움(guanidinium) 염산염과 같은 변성제들(denaturants), 차아염소산염(hypochlorite)과 같은 활성 염소를 포함한 용액을 포함한다.
제 1 목적의 방법에 따라서 고체 분리 매질은 적절한 크로마토그라피 컬럼 장치(chromatography column apparatus)에 적재될 수 있다. 이 방법는 확장층 모드(expanded bed mode)로 EBA(확장층 흡착， expanded bed absorption)칼럼에서 수행할 수 있다. 제 1 특징의 면에서 사실상 모든 혈장 단백질들은 단일 컬럼내의 고체 분리 매질에 흡수될 수 있다. 여기에 기술된 연속적인 용리 단계들은 특정 단백질들에서 엔리치된(enriched) 단백질 단편들(protein fractions)을 선택적으로 용리하는 데 이용될 수 있다.
EBA 컬럼들은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 적절한 컬럼 장치와 액체들을 확장층 컬럼에 도입하는 방법을 포함한, 셋업은 GE Healthcare, Sweden으로부터 상용 가능하고, 또는 전체 내용이 본 명세서에 교차 참조로 포함되는 WO99/65586, WO01/85329 및 WO92/00799 에 기술되어 있다.
제 1 목적의 한 실시예는 EBA 컬럼을 선택하고, 적절한 양의 고체 분리 매질을 컬럼 내에 배치하는 것을 포함한다. 사용되는 고체 분리 매질의 양은 적용될 단백질들을 포함한 용액의 양과 단백질 용액의 단백질 농도에 의존한다. 단백질 용액이 혈장 또는 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 플라즈마인 경우 통상 1.0 리터의 고체 분리 매질이 0.5 내지 1.5 리터의 플라즈마 마다 사용된다. 단백질 용액이 재조합 발효 배양액(recombinant fermentation broth)인 경우 1 리터의 고체 분리 매질이 1 리터의 발효 배양액 및 1000 l까지의 발효 배양액에 대해 사용될 수 있다. 고체 분리 매질이 유체화(fluidsed)될 때까지 플로우 쓰루(flow through)가 컬럼의 바닥부터 형성된다. 적절한 선형 플로우 레이트들은 0.5-20 cm/min 또는 대안으로 5 cm/min 내지 15 cm/min 범위의 플로우 레이트들을 포함한다. 그 후 고체 분리 매질은 적절한 용액(예컨대, 물, 전해질 수용액 또는 완충 용액)을 이용하여 평형화되고, 그 다음에, 혈장(blood plasma), 혈청(blood serum), 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 가용화된 크리오프리시피테이트(solubilised cryprecipitate) 또는 재결합 배양액이 컬럼의 바닥에 도입될 수 있다. 용액이 고체 분리 매질에 도입되면 추가 세정 단계가 선택적으로 수행될 수 있다. 그 후 용리 단계들이 특정 단백질들에서 엔리치된(enriched) 단백질 단편들(protein fractions)을 선택적으로 용리하기 위하여 수행된다.
각각의 용리 단계는 하나 또는 그 이상의 단백질들을 포함한 단백질 단편을 선택적으로 용리하기에 적합한 조건들 하에서 수행된다. 예를 들면, 각각의 용리 단계들에서 이용되는 용리제의 pH 및/또는 이온 강도를 변경함으로써 다른 단백질들이 용리될 수 있다. 용리제는 적절한 완충를 사용하여 적합한 pH와 이온 강도로 조절될 수 있다. 또한 이온 강도는 염을 사용하여 조절될 수 있다. 연속적인 용리 단계들은 증가된 pH의 용리제로 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 연속하는 용리 단계들은 감소된 pH의 용리제로 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
제 1 목적에 따른 다른 실시예는 2-메르캅톤이코틴 산(2-mercaptonicotinic acid)로 기능화된 아가로스-텅스텐 카바이드 비드들(functionalised agarose-tungsten carbide beads)을 포함한 EBA 컬럼을 설정하는 것을 포함한다. 아가로스-텅스텐 카바이드 비드들(agarose-tungsten carbide beads)은 70 마이크론의 평균 지름을 가진 40-120 마이크론 사이의 크기 분포를 갖는다. 비드들의 밀도는 2.9 g/ml다. 평형 단계는 약 4.5 pH에서 시트르산염 완충를 이용하여 수행되고, 약 5.0 pH에서 시트르산염으로 추가의 평형 단계가 바로 이어진다. 2 파트들(parts)의 물로 희석되고 HCI로 5.0의 pH로 조절된 휴먼 플라즈마가 고체 분리 매질의 리터당 1.5 리터의 희석된 플라즈마의 비율로 칼럼 내로 가해졌다. 그 후 컬럼은 다음의 완충 용액들로 용리되었다.
용리 1. pH 5.0에서 10mM 구연산염 나트륨(sodium citrate)
용리 2. pH 6.0에서 HCI와 카프릴산 나트륨(sodium caprylate) 의 리터당 5g
용리 3. pH 8.0에서 1M 구연산염 나트륨(sodium citrate)
용리 4. pH 8.0에서 20mM 구연산염 나트륨 및 0.1 M 염화 나트륨
그 다음 고체 분리 매질은 1 M NaOH로 재생되었다.
모든 동작에 대한 유속은 7.7 cm/분 이었고, 사용된 각 용액의 양들은 아래 테이블 2에 주어진다.
사용된 용리제의 부피는 통상 다수의 상호관련된 요소들에 의존할 것이다, 예를 들면:
(i) 샘플 적용, 세정, 용리, 재생 및 평형 동안 이용된 유속
(ii) 용리된 물질 단편들(product fractions)
(iii) 용리제들의 선택이 각 단편들의 순도와 수율에 영향을 미치므로 각 단계에서 사용된 용리제들의 선택
(iv) 얻어진 물질(product)의 순도와 수율에 역시 영향을 미치는 개별 단편들(fractions) 사이의 최적 갭
(v) 고체 분리 매질의 층(bed) 높이가 감소될 때 일반적으로 소모된 세정 및 용리 부피가 감소하므로 고체 분리 매질의 층 높이(bed height)
테이블 3은 위에 기술한 실시예에서 각 단계에 대한 최적 용액 부피를 나타낸다.
도 3을 참조하면, 위 실시예에서 α-1 단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor), 알부민(albumin), IgG 및 피브리노겐(fibrinogen)이 효과적으로 분리될 수 있다는 것을 알 수 있다.
테이블 2
| 단계 | 용액의 부피* |
| 평형 | 5.0 CV |
| 용리 1 | 4.2 CV |
| 용리 2 | 2.9 CV |
| 용리 3 | 4.4 CV |
| 용리 4 | 2.1 CV |
| 재생 | 1.0 CV |
| 전체 | 19.6 CV |
* CV는 컬럼 부피
아래의 테이블 3은 SRI에 의해 결정된 적용 비가공 플라즈마(applied raw plasma)에 대한 단백질들의 수율들을 나타낸다.
테이블 3
| 용리 1 | 용리 2 | 용리 3 | 용리 4 | |
| 알부민 | <5 % | 95+% | ||
| 면역 글로불린 항체 (immunoglobulin) | 95+% | <5% | ||
| α-1 단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor) | 95+% | |||
| 피브리노겐(fibrinogen) | <5% | 95+% |
단일 방사 면역확산법(single radial immunodiffusion)(SRI)이 용리제 부분들 1 내지 4 에서 개별 단백질들의 상대적 수율을 결정하기 위하여 수행되었다. 도 4는 알부민, IgG, α-1 단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor) 및 피브리노겐(fibrinogen)에 대한 SRI 분석을 도시한다.
전술한 방법은 매끄럽고 재생가능하고 복잡하지 않은 방식으로 수행된다는 것이 확인되었다. 모든 최종 용리제들은 어떤 단백질의 현저한 변성/침전(denaturation/precioitation)의 징후 없이 맑은 액체들인 것으로 확인되었다. 전술한 SDS-PAGE 및 SRI에 의한 포스트 컬럼 테스트는 용리된 물질들(eluted products)의 면역 반응성(immunoreactivity)의 변화, 장애(break-down), 또는 응집(agglomeration)의 징후를 나타내지 않았다.
본 기술 분야에서 숙련된 자는 제 1 목적 및 제 2 목적의 방법가 컬럼에서 나오는 액체의 자외선 흡수도를 측정함으로써 모니터될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 단백질 및 다른 UV-흡수 물질의 존재는 본 발명의 방법들 동안 검출되고 정량화될 수 있고 다른 단백질 단편들(fractions)의 정확한 수집이 수행될 수 있다. 또한, pH, 전도도, 및 굴절율의 연속적인 모니터링이 본 발명의 방법들을 기록하고(documenting) 제어하는 데 유용할 것이다.
인자 VIII 및/또는 인자 IX의 분리(Isolation of Factor VIII and/or Factor IX)
상기 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액은 통상적으로 희석되지 않은 비가공 플라즈마(raw undiluted plasma)로 이 플라즈마는 고체 분리 매질에 직접 접촉할 수 있다. 대안적으로, 비가공 플라즈마(raw plasma)는 상기 고체 분리 매질에 접촉하기 전에 다른 적절한 유체로 희석될 수 있다. 예를 들면, 플라즈마는 탈염(demineralised)수 또는 인자 VIII 및/또는 인자 IX와 호환 가능한 강한 미네럴 산들의 하나 또는 그 이상의 무기 염들의 수용액, 예컨대, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄과 같은 염산, 황산, 및 질산의 염들의 수용액으로 희석될 수 있다.
인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액은 약 1000:1 내지 약 1:1000의 비율로 다른 적절한 유체로 희석될 수 있다. 예를 들면, 희석 비율은 약 1000:1, 약 750:1, 약 500:1, 약 250:1, 약 100:1, 약 50:1, 약 25:1, 약 10:1, 약 7.5:1, 약 5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:2.5, 약 1:3, 약 1:5, 약 1:7.5, 약 1:10, 약 1:25, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:250, 약 1:500, 약 1:750, 또는 약 1:1000 일 수 있다.
인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액의 pH는 고체 분리 매질에 접촉하기 전에 조절될 수 있다. 대안으로, pH는 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액이 고체 분리 매질에 접촉된 후에 조절될 수 있다. pH는 상승하거나 pH는 감소할 수 있다. 또는 pH는 변화되지 않고 유지될 수 있다. pH는 약 5.0 내지 약 9.0의 범위의 pH로 조절될 수 있다. 예컨대, pH는 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0의 pH로 조절될 수 있다. pH는 예컨대, 염산, 황산, 인산, 시트르산, 숙신산, 아세트산 등의 적절한 산을 이용하여 조절될 수 있다.
이 pH는 적절한 염, 예컨대, 탄산염, 중탄산염, 암모니아, 수산화물 등을 이용하여 조절할 수 있다. 이 pH는 적절한 완충 계(buffer system)로 조절할 수 있다. 완충 계들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면, 구연산염, 아세트산염, 인산염, 포름산염, 숙신산염(succinate), MES, ADA, 2-3 프로판(bis-tris propane), PIPES, ACES, 이미다졸(Imidazole), MOPS, TES, HEPES, HEPPS, TRICINE, 글리신 아미드(Glycine Amide), 염화수소산염, TRIS, BICINE, 글리실글리신(Glycylglycine), 붕산, CHES, CAPS를 포함한다. 많은 완충 계들이 상용화되어 있고 예컨대 시그마 케미컬 컴퍼니（Sigma Chemical Compnay）로부터 입수할 수 있다. 본 기술 분야에서 숙련된 자라면 원하는 pH에 대한 적절한 완충 계들을 알 수 있을 것이다.
이 방법은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 세정 단계를 포함할 수 있다. 세정 단계는 고체 분리 매질을 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액에 접촉시키기 전, 또는 대안으로 고체 분리 매질을 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액에 접촉시킨 후 수행될 수 있다. 세정 단계는 인자 VIII 및/또는 인자 IX의 생물학적 기능을 손상시키지 않은 임의의 용액, 예컨대, 물, 염수(saline), 또는 완충 용액, 예컨대, 구연산염 완충액를 이용하여 수행할 수 있다.
또는 세정 완충액는 황산 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 인산 암모늄, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 구연산염 암모늄(ammonium citrate), 구연산염 나트륨, 구연산염 칼륨과 같은 비교적 높은 립트로포비시티(lyptrophobicity)의 무기 또는 유기 염을 포함할 수 있다. 세정 완충액는 약 5.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 세정 완충의 pH는 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8 또는 9.0 일 수 있다. 세정 완충액는 약 0.1 mS/cm 내지 약 100 mS/cm 범위의 전도도를 가질 수 있다. 또는, 세정 완충액는 약 0.1 mS/cm 내지 약 40 mS/의 전도도를 가질 수 있다.
세정 완충액는 또한 단백질들의 생물학적 기능을 손상시키지 않는 강한 미네럴 산의 하나 또는 그 이상의 무기 염들의 수용액, 예컨대, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄과 같은 염산, 황산, 및 질산의 염들의 수용액을 포함할 수 있다.
이 방법은 하나 또는 그 이상의 평형 단계들(equilibration steps)을 더 포함할 수 있다．평형 단계는 고체 분리 매질을 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액에 접촉시키기 전에 수행할 수 있다. 평형 단계는 고체 분리 매질의 pH와 이온 강도를 조절하기 위하여 물 또는 적절한 완충 용액으로 상기 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 평형 단계에 사용된 용액은 탈염수(demineralised water)의 하나 또는 그 이상의 무기 염들의 수용액, 예를 들면, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 암모늄, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄과 같은 염산, 황산 및 질산의 염들의 수용액이 될 수 있다. 대안적으로, 평형 완충액는 인자 VIII 및/또는 인자 IX와 호환 가능한 무기 및/또는 유기 산의 염을 포함하는 완충 수용액(aqueous buffer solution), 예컨대, 구연산염, 아세트산염, 숙신산염(succinate), 유산염(lactate), 타르타르산염(tartrate), 포름산염, 프로피온산염(propionate), 인산염, 또는 붕산염을 포함한 완충액일 수 있다
평형 단계들은 약 2 ℃ 내지 약 28℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다. 예컨대, 온도는 약 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28℃일 수 있다.
인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액의 pH는 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 상기 용액으로 상기 고체 분리 매질을 접촉시키기 전에 고체 분리 매질을 평형화하는 데 이용된 완충 용액의 pH와 같을 수 있다. 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액의 pH는 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 상기 용액으로 상기 고체 분리 매질을 접촉시키기 전에 고체 분리 매질을 평형화하는 데 이용된 완충 용액의 pH와 다를 수 있다.
이 방법은 하나 또는 그 이상의 재생(regeneration) 단계들을 더 포함할 수 있다. 재생 단계는 고체 분리 매질로부터 잔유 물질을 제거할 수 있는 적절한 시약(reagent)으로 고체 분리 매질을 처리하는 것을 포함한다. 재생 단계는 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 용리시키기 위하여 용리제로 상기 고체 분리 매질을 용리한 후 수행할 수 있다. 적절한 재생 시약들은 염기들(bases), 예컨대, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨과 같은 수산화 용액들, 과산들(peracids) 또는 과산화 수소의 용액들, 예컨대, 에탄올과 같은 유기 용매들, 구아니디니움(guanidinium) 염산염과 같은 변성제들(denaturants), 차아염소산염(hypochlorite)과 같은 활성 염소를 포함한 용액들을 포함한다.
이 방법은 충전층 모드(packed bed mode)로 충전층 컬럼에서 수행될 수 있다. 또는, 이 방법는 확장층 모드로 EBA 컬럼에서 수행될 수 있다.
위에서 제시한 바와 같이 한 실시예에서 이 방법은 다른 물질들만이 아니라 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액으로부터 혼합물로서 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 분리하는 데 사용될 수 있다. 이 실시예에서는 EBA 컬럼이 선택되고 그 안에 적절한 양의 고체 분리 매질이 놓인다. 사용되는 고체 분리 매질의 양은 적용될 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함한 용액의 양과 용액 내의 인자 VIII 및/또는 인자 IX 농도에 의존한다. 단백질 용액이 휴먼 플라즈마 또는 크리오프리시피테이트(cryoprecipitated) 플라즈마인 경우 통상 1.0 리터의 고체 분리 매질이 5 내지 30 리터의 플라즈마 마다 사용된다. 단백질 용액이 재조합 발효 배양액(recombinant fermentation broth)인 경우 1 리터의 고체 분리 매질이 1 리터의 발효 배양액 및 1000 l까지의 발효 배양액에 대해 사용될 수 있다. 고체 분리 매질이 유체화(fluidsed)될 때까지 플로우 쓰루(flow through)가 컬럼의 바닥부터 형성된다. 적절한 선형 유속은 0.5 cm/min 내지 40 cm/min 또는 대안으로 3 cm/min 내지 15 cm/min 범위의 유속들을 포함한다.
평형단계(an equilibration step)는 적당한 용액{예를 들면, 물, 수성 전해질용액(an aqueous electrolyte solution )}을 사용하여 수행될 수 있고, 그 후 용액은 인자 Ⅷ과 인자 Ⅸ를 포함한다. 예를 들어, 조혈장(a crude blood plasma)은 컬럼의 하부(the bottom of the column)에 유입될 수 있다. 여기서, 인자 Ⅷ과 인자 Ⅸ를 포함한 용액은 고체 분리 매질(a solid separation medium)와 접촉된다. 제 1 용리 단계(a first elution step)는 컬럼으로부터 비결합 단백질(non-bound protein)을 용리하기 위해 수행된다. 세척단계(a washing step)는 제 1 용리단계 후에 선택적으로 수행될 수 있다. 그런 다음,제 2 용리단계(a second elution step)는 고체분리매질로부터 인자 Ⅷ과 인자 Ⅸ를 용리시키기 위해 수행된다.
본 발명의 제 1 및 제 2 목적(aspect)은 연속적인 두 단계에서 사용될 수 있다. 여기서 제 1 단계는 인자 Ⅷ, 또는 폰 빌레프란트 인자(von Willebrand factor)와의 복합물, 또는/및 적어도 10개의 첨가물을 포함하여 상세한 설명의 4 페이지에 기재된 단백질 중 어떤 것을 포함하는 용액(solution)으로부터의 인자 Ⅸ의 격리(isolation)를 위해 본 발명의 제 2 목적을 이용하는 것을 포함하고, 제 2 단계는 제 2 목적의 제 1 단계로부터 얻어진 비 결합 단백질들을, 높은 수율로(all in high yield), α-1-단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor), 알부민(albumin), 면역글로빈항체G(IgG), 안티트롬빈(anti-thrombin) Ⅲ 및 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 단편들(fractions)로 분리(separation)시키기 위해, 본 발명의 제 1 목적을 이용하는 것을 포함한다.
제 2 목적의 방법들은, 연속적으로 다른 단백질 격리 방법들(other protein isolation processes)에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 제 2 목적의 방법들은 혈장 용액(solution)으로부터, 전 과정(the run-through)에서 얻어지는 단편 상의 잔존하는 단백질들과 인자 Ⅷ 및/또는 인자 Ⅸ를 격리시키는데 사용될 수 있다. 여기서 잔존하는 단백질들은 원료(raw material)로 사용되어 진다. 이 원료들로부터, 예를 들면 알부민(albumin), 피브리노겐(fibrinogen), 면역 글로불린항체, α-1-단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor)과 같은 추가적인 단백질들이,예를 들면 침전(precipitation), 여과법(filtration), 이온 교환 크로마토그라피(ion exchange chromatography) 등의, 다른 다양한 부분적인 방법들(various other fractionation processes)을 이용하여 격리(isolated)될 수 있다.
본 발명의 제 1 및 제 2 목적의 격리된 단백질들은, 파우터, 용액, 액체등과 같은 적당한 제제(formulation)로 합쳐질 수 있다. 약간의 생산물(product) 제제의 예가 표 4에 기재되어 있다.
표 ４
| 생산물 | 제제 |
| 인자 Ⅷ | 드라이드 파우더(dried powder):250IU, 50OIU, 1000IU |
| α-1-PI | 드라이드 파우더, 1g |
| 알부민(albumin) | 5%, 25% 용액 |
| 안티트롬빈(antitｈrombin) Ⅲ | 드라이드 파우더:1000IU |
| IVIG | 10% 액체, pH 4.25 |
| 피브리노겐(Figrinogen) | 드라이드 파우더 1.5g |
또한, 격리된 단백질 단편(fraction)의 추가적인 정제(purification)는 본 발명의 방법에서 필요한 만큼 또는 적절하게 도입될 수 있다.
하나의 방법은 음이온 교환(anion exchange) 또는 소수성 인터액션 크로마토그라피(hydrophobic interaction chromatography) 단계들을 연속적으로 포함할 수 있다. 이러한 방법들은, 본 발명의 방법들로부터 얻어진 단백질 단편(protein fraction)을 더 정제시키고 집중시킨다. 연속적인 크로마토그라피 단계 또는 단계들을 위한 용리 조건들과 옵티멀 스테이션어리 메디아 (optimal stationary media)를 선택함으로써, 본 발명의 방법들로부터 얻어진 모든 단백질들은 컬럼과 결합될 수 있다. 그런 다음 결합된 단백질들은 다른 화학적 조건들 하에서 두번째 컬럼(secondary column)으로부터 선택적으로 용리(溶離)되어, 단백질의 현저한 농축(concentration) 및 추가적이고 잠재적인 정제를 가져올 수 있다. 머피니티 크로마토그라피(affinity chromatography), 메탈 첼레이트 크로마토그라피(metal chelate chromatography) 및 겔 필트레이션(gel filtration)과 같은 다른 크로마트그라피 기술들은 또한 각각 개별적으로 또는 복합적으로 도입될 수 있다.
도 1은, 아래에 기술된 본 발명의 방법들에 적절히 도입될 수 있는 추가적인 정제단계들(purification steps)의 일부를 도시한다.
본 발명의 방법들은 바이러스의 비활성 단계들(viral inaction steps)을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 바이러스의 비활성/제거 단계들(viral inactivation/elimination)은 각각의 생산물들에 따라 표 5에 개시되어 있다. 여기서 각각의 생산물들은 본 발명의 방법들을 통해 격리되어진 것들이다.
표 ５
| 생성물 | １단계 | ２단계 |
| 인자 Ⅷ | 세제 용매(solvent detergent) | 건조가열(dry heat), 80℃, 72시간 |
| α-1 단백질 가수분해 효소 억제제(proteinase inhibitor) | 세제 용매(solvent detergent) | 바이러스 여과법(viral filtration) |
| 안티트롬빈(antithrombin) Ⅲ | 저온살균,60℃,1h | 바이러스 여과법(viral filtration) |
| 알부민(albumin) | S-20０ 크로마토그라피 (chromatography) | 저온살균,60℃,1시간 |
| IVIG | 세제 용매(solvent detergent) | 바이러스 여과법(viral filtration) |
| 피브리노겐(Fibrinogen) | 세제 용매(solvent detergent) | 습식 가열(wet heat), 62℃,10시간 |
본 발명은 후술되는 실시 예들에 의해서, 오직 예시적인 방법으로 보다 자세하게 지금부터 설명되어 진다. 이러한 예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 상세한 설명 전체를 걸쳐 개시된 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 본 발명에 따라 분리된 단백질 단편에 대한 추가적인 정제(purification)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법을 사용하는 생성물 회수를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 제1 목적의 실시예에 따라 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 4는 본 발명의 제1 목적의 실시예에 따라 단일 방사 면역확산(Single Radial Immunodiffusion) 분석을 도시한다.
도 5는 본 발명의 제1 및 제2 목적이 단백질 단편들을 분리하기 위해 연달아 이용되는 본 발명의 일 실시예를 도시한다.
도 6은 인자 VIII 흡착으로부터 단편들에 대한 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 레인 1은 비가공 혈장을 나타내며, 레인 2는 런-쓰루(run-through) 단편을 나타내며, 레인 3은 인자 VIII/인자 IX의 용리(elution)를 나타낸다. 인자 VIII/인자 IX 용출액(eluate)은 적용된 혈장과의 직접 비교를 위해 용리 양(elution volume)에 대하여 희석되었다. 즉 수율(yield)이 시각적으로 추정될 수 있다.
도 7은 사용된 원료(단백질을 포함하는 용액)가 제2 목적의 방법으로부터 획득된 런-쓰루 단편인 제1 목적의 단백질 분리 방법으로부터 획득된 단백질 단편에 대한 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 레인 1은 인간의 혈장을 나타내며, 레인 2는 런-쓰루 단편(α-1-PI)을 나타내며, 레인 3은 용리 2(알부민)를 나타내며, 레인 4는 용리 3(IgG)을 나타내며, 레인 5는 용리 4(피브리노겐)를 나타낸다.
도 8은 사용된 원료(상기 단백질을 포함하는 용액)가 제2 목적의 방법으로부터 획득된 런-쓰루 단편인 제1 목적의 단백질 분리 방법으로부터 획득된 단편들에 대한 단일 방사 면역확산 분석을 도시한다. 단편 1 내지 4는 런-쓰루 단편, 용리 2, 용리 3, 용리 4 각각을 나타낸다. 도 8a는 알부민의 양(quantitation)을 나타내며, 도 8b는 IgG의 양을 나타낸다. 도 8a 및 8b의 상부 ２개의 열은 비가공 혈장 100-20%(이중 결정 double determinations)의 표준 곡선을 나타낸다. A 및 B의 하부 2개의 열은 다음을 나타낸다. 1: 런-쓰루 단편, 2: 용리 2, 3: 용리 3, 4: 용리 4
Claims (29)
- 단백질을 포함하는 용액으로부터 단백질을 분리하는 방법에서, 상기 용액은 조혈장（ｃｒｕｄｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 상기 방법은,(1) M-S-L을 갖는 고체 분리 매질(medium)을 제공하는 단계;상기 M은 매트릭스 백본(matrix backbone)이고, S는 선택적인 스페이서 암(spacer arm) 및 L은 메르캅톤이코틴산(mercaptonicotinic acid)인 리간드이고,(2) 상기 단백질의 적어도 하나가 상기 고체 분리 매질과 가역적으로 결합하도록 상기 용액을 상기 고체 분리 매질과 접촉시키는 단계;(3) 상기 고체 분리 매질로부터 적어도 하나의 단백질 단편(fraction)을 선택적으로 용리하는 적어도 하나의 용리(elution) 단계를 수행하는 단계;를 포함하는 단백질을 포함하는 용액에서 단백질을 분리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 용액은 조혈장인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 M은 고농도 수지인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L은 2-메르캅톤이코틴산인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S는 에폭시기를 포함하는 화합물인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,상기 적어도 하나의 단백질 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE, 트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen) 또는 이들의 유도체와 같은 면역 글로불린, 예를 들면, 안티트롬빈 III(antithrombin III), 프로 혈액 응고 단백질(blood pro-coagulation protein), 항 혈액 응고 단백질(blood anti-coagulation protein), 시토킨(cytokine), 성장 인자(growth factor), 알부민(albumin) 또는 이들의 유도체와 같은 안티트롬빈(antitrombin)과 같은 플라즈마 프로테아제 억제제(plasma protease inhibitor), 혈전 용해제(thrombolytic agent), 항 신생 혈관 형성 단백질(anti-angiogenic protein), 인슐린(insulin) 또는 이들의 유도체, α-1-안티트립신(α-1-antitrypsin), α-2-안티플라스민(α-2-antiplasmin) 또는 이들의 유도체와 같은 α-1-단백질 가수분해효소 억제제(α-1 -proteinase inhibitor) 또는 이들의 유도체, C-1 분해효소 억제제 (C-1 esterase inhibitor), 아포지단백질(apolipoprotein), 고밀도지단백(HDL), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 유 도체, 베타-2-글리코프로테인 I(beta-2-glycoprotein I), 플라스미노겐(plasminogen), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator), 플라스미노겐 억제제(plasminogen inhibitor), 유로키나아제(urokinase) 또는 이들의 유도체, 스트렙토키나아제(streptokinase) 또는 이들의 유도체, 내적-α-트립신 억제제(inter-α-trypsin inhibitor), α-2-매크로글로불린(α-2-macroglobulin), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 오로소뮤코이드(orosomucoid), 페리틴(ferritin), 프리-알부민(pre-albumin), GC-글로불린(GC-globulin), 해모펙신(haemopexin) 및 C3-보체(C3 -complement)로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제 6항에 있어서,상기 적어도 하나의 단백질 단편은 면역 글로불린, 트랜스페린, 피브리노겐 또는 이들의 유도체, α-1-단백질 가수분해효소 억제제 및 알부민, 또는 이들의 유도체로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,상기 용액은 상기 단백질의 pH가 약 3.0와 약 6.0의 사이인 것을 포함하는 방법.
- 제 8항에 있어서,상기 용액은 상기 단백질의 pH가 약 4.5와 약 6.0의 사이인 것을 포함하는 방법.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,제1 용리 단계는 pH가 약 4와 약 8의 사이인 용액으로, 약 0.00005 S/cm 내지 약 0.1 S/cm 사이의 이온 강도로 제1 단백질 단편을 용리하는, 상기 고체 분리 매질을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 10항에 있어서,상기 제1 단백질 단편은 α-1-단백질 가수분해효소 억제제, 알부민, 오로소뮤코이드, 및 프리-알부민으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제 10항 또는 제 11항에 있어서,제2 용리 단계는 pH가 약 5와 약 7의 사이인 용액으로, 약 0.0001 S/cm 내지 약 0.1 S/cm 사이의 이온 강도로 제2 단백질 단편을 용리하는, 상기 고체 분리 매질을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서,상기 용액은 방향성, 비-방향성 또는 헤테로방향성 소수성 화합물을 더 포함 하는 방법.
- 제13항에 있어서,상기 비-방향성 소수성 화합물은 알킬 카르복시산의 염, 술폰산의 염 또는 부대전성으로 대전된 세제(detergent)인 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,상기 제2 단백질 단편은 알부민 및 면역 글로불린으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,제3 용리 단계는 pH가 약 5와 약 9의 사이인 용액으로, 약 0.001 S/cm 내지 약 4 S/cm 사이의 이온 강도로 제3 단백질 단편을 용리하는, 상기 고체 분리 매질을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서,상기 제3 단백질 단편은 면역 글로불린, 트랜스페린 및 피브리노겐으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서,제4 용리 단계는 pH가 약 5와 약 9의 사이인 용액으로, 약 0.01 S/cm 내지 약 2 S/cm 사이의 이온 강도로 제4 단백질 단편을 용리하는, 상기 고체 분리 매질을 용리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서,상기 용액은 무기산(mineral acid)의 염을 더 포함하는 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서,상기 제4 단백질 단편은 트랜스페린, 면역 글로불린, 피브리노겐 및 α-2-매크로글로불린으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,상기 방법은 확장층 모드(expanded bed mode)에서 확장층 흡착 칼럼(expanded bed adsorption column)으로 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,상기 방법은 충전층 모드(packed bed mode)에서 충전층 칼럼(packed bed column)으로 수행되는 방법.
- 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 포함하는 용액으로부터 인자 VIII 및/또는 인자 IX을 분리하는 방법에서, 상기 용액은 조혈장（ｃｒｕｄｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）, 혈청, 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오수퍼네이턴트(cryosupernatant), 분할혈장(fractionated human plasma), 혈장(plasma)으로부터 유도된 크리오프리시피테이트(cryoprecipitate) 및 재조합형 배양액(recombinant broths)로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 상기 방법은,(1) M-S-L을 갖는 고체 분리 매질(medium)을 제공하는 단계;상기 M은 매트릭스 백본(matrix backbone)이고, S는 선택적인 스페이서 암(spacer arm) 및 L은 자일리엔디아민(xylylenediamine)인 리간드이고,(2) 적어도 인자 VIII 및/또는 인자 IX이 상기 용액 분리 매질과 가역적으로 결합하도록 상기 용액을 상기 고체 분리 매질과 접촉시키는 단계;(3) 상기 고체분리 매질로부터 비결합 단백질을 용리하는 제1 용리 단계를 수행하는 단계;(4) 상기 고체 분리 매질로부터 인자 VIII 및/또는 인자 IX를 용리하는 제2 용리 단계를 수행하는 단계;를 포함하는 인자 VIII 및/또는 인자IX를 포함하는 용액에서 인자 VIII 및/또는 인자 IX을 분리하는 방법.
- 제23항에 있어서,상기 인자 VIII 및 인자 IX을 포함하는 용액은 조혈장인 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서,상기 M은 고밀도 수지인 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,상기 S는 에폭시기를 포함하는 화합물인 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,상기 제1 용리 단계는 pH가 약 5.5와 약 6.5의 사이인 용액으로, 약 0.001 S/cm 내지 약 0.02 S/cm 사이의 이온 강도로 제1 단백질 단편을 용리하는 방법.
- 제27항에 있어서,제2 용리 단계는 pH가 약 7와 약 9의 사이인 용액으로, 약 0.03 S/cm 내지 약 0.2 S/cm 사이의 이온 강도로 제2 단백질 단편을 용리하는 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서,상기 용액은 무기산의 염을 더 포함하는 방법.
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