MXPA06014318A - Proceso para aislamiento de proteinas. - Google Patents

Proceso para aislamiento de proteinas.

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Abstract

En un aspecto, la presente invencion se relaciona con un proceso para el aislamiento de proteinas a partir de una solucion que las contiene, en donde la solucion se selecciona a partir del grupo formado por: plasma sanguineo crudo, suero sanguineo, criosobrenadante derivado de plasma, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma y soluciones recombinantes. El proceso consiste en: proporcionar un medio de separacion solido que tiene la formula M-S-L, en donde M es una cadena matriz, S es una rama espaciadora opcional y L es un ligando constituido por acido mercaptonicotinico; poner el medio de separacion solido en contacto con la solucion que contiene las proteinas, de tal manera que al menos una de las proteinas forme una union reversible con el medio de separacion solido. Despues, se lleva a cabo al menos una etapa de elusion para eluir selectivamente al menos una fraccion proteica del medio de separacion solido. En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un proceso para aislar el Factor VIII y/o el Factor IX.

Description

PROCESO PARA AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un proceso para aislamiento de proteínas a partir de fuentes biológicas. En forma más precisa, la invención se relaciona con un proceso para aislamiento de proteínas a partir de la sangre.
ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN El plasma es una de las materias primas naturales más valiosas y por otra parte las proteínas purificadas a partir del plasma son esenciales para la vida y el bienestar de millones de personas alrededor del mundo. La mayoría de estas proteínas se producen por fraccionación Cohn en etanol frió. Este proceso fue desarrollado por el Dr. Edwin Cohn en la Universidad de Harvard a principios de la década que inicia en 1940. Cohn descubrió que era posible separar proteínas del plasma con base en sus características de precipitación en diferentes condiciones (pH, fuerza iónica, concentración de la proteina, temperatura y concentración de etanol) . Al variar estos parámetros se precipitan en forma gradual diferentes proteínas. La tecnología de Cohn se ha usado por décadas en la industria pero el proceso presenta algunas limitaciones 52-406-06 en cuanto a pureza y eficiencia. Aun cuando este proceso puede producir un producto de calidad, existen limitaciones respecto a la flexibilidad del procedimiento y la pureza del producto obtenido. Las proteínas más comunes producidas a nivel comercial con esta metodología incluyen albúmina, inmunoglobulina, antitrombina III, trombina y fibrinógeno. Un tipo de avance técnico en la fabricación de productos derivados del plasma, incorpora el uso de cromatografía para separar las proteínas del plasma con base en la adsorción selectiva de las moléculas de proteina en una superficie sólida estacionaria (fase sólida) a medida que el liquido (fase móvil) se desplaza y desciende en una columna que contiene la fase estacionaria. Dependiendo de la eficiencia de adsorción o interacción, el movimiento de varias proteínas se retarda diferencialmente permitiendo su separación y recolección en el fondo de la columna . La cromatografía es un medio más amigable para separar proteínas que el tradicional proceso de Cohn en etanol frió, el cual implica una prolongada exposición de las proteínas a elevadas concentraciones de etanol. Esto puede desnaturalizar las proteínas y producir agregados no deseados que a su vez tienen consecuencias terapéuticas adversas en los pacientes a los que se administran estos productos. Por el contrario, la fraccionación 52-406-06 cromatográfica elimina en forma eficiente las impurezas sin afectar la estructura nativa de las proteínas. Comparada con las repetidas precipitaciones a gran escala implicadas en la fraccionación en etanol frió del proceso de Cohn, la cromatografía es un método más directo de separación que permite producir mayores cantidades de proteína por litro de plasma. Los métodos cromatográficos adoptados a la fecha todavía ofrecen retos en términos de optimizar rendimientos y al mismo tiempo mantener o aumentar los niveles de pureza necesarios. Existe la necesidad de una técnica cromatográfica redituable que eluya selectivamente los componentes del plasma con pureza y rendimiento superiores a los de los métodos existentes. A principios de los años sesenta se descubrió que cuando el plasma se incubaba a bajas temperaturas se formaba un precipitado. Se determinó que este precipitado contenia el Factor VIII, el Factor Von Willebrands y otras proteínas plasmáticas. Al principio, este crioprecipitado se usó para tratar pacientes con hemofilia A, pero la necesidad de mejorar la tolerancia del paciente al producto se produjeron formas más puras del Factor VIII. El proceso de crioprecipitación sigue siendo actualmente la base de la producción industrial del Factor VIII. Desafortunadamente, el proceso no es muy eficiente y aun cuando se han hecho 52-406-06 varios intentos para mejorar la recuperación del Factor VIII mediante el uso directo del plasma en lugar del crioprecipitado, pocos han tenido éxito desde el punto de vista comercial. El Factor IX se usa para el tratamiento de pacientes con hemofilia B y se aisla del sobrenadante I, una fracción secundaria del muy conocido proceso de Cohn de fraccionación de plasma. En casi todos los procesos actuales de fabricación, el Factor IX en el sobrenadante I por lo general se purifica adicionalmente en una etapa de cromatografía por afinidad en la que se utiliza heparina Sepharose, sin embargo, puesto que el proceso completo se basa en la fraccionación de Cohn, persisten aún importantes limitaciones en la eficiencia de fabricación. En este caso, existe la necesidad de un proceso más eficiente para el aislamiento del Factor VIII y/o el Factor IX de mezclas que contengan el Factor VIII y/o el Factor IX.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para el aislamiento de proteínas a partir de una solución que las contiene, la solución se selecciona a partir del grupo formado por plasma sanguíneo crudo, suero sanguíneo, criosobrenadante derivado de 52-406-06 plasma, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma y caldos recombinantes, el proceso consiste en: (i) proporcionar un medio de separación sólido que tiene la fórmula: -S-L en donde M es una estructura matriz, S es una rama espadadora opcional y L es un ligando constituido por ácido mercaptonicotínico; (ii) poner en contacto el medio de separación sólido con la solución, de tal manera que al menos una de las proteínas forme una unión reversible con el medio de separación sólido; (iii) llevar a cabo al menos una etapa de elución para eluir selectivamente del medio de separación sólido al menos una fracción proteica. Las siguientes particularidades se relacionan con el primer aspecto de la invención. En una modalidad, las proteínas son humanas o de mamíferos . El grupo espaciador S se puede derivar de un compuesto que tenga un grupo epoxi (por ejemplo, butanodioldiglicidil éter o epiclorhidrina) u otro reactivo de acoplamiento que sea adecuado de los conocidos en la técnica para la unión covalente de ligandos . La estructura matriz M puede ser una resina, de 52-406-06 manera que el medio de separación sólido es una resina modificada con los grupos funcionales del ligando. La resina puede ser cualquier resina a la cual se pueda unir el ligando. Por otra parte, la resina puede ser una resina de alta densidad adecuada para adsorción en lecho no empacado, por ejemplo, adsorción en lecho fluidizado y adsorción en lecho expandido, por ejemplo, derivado de agarosa perlada de alto grado de reticulación y con una base de 6% ó 4% de agarosa, conglomerado agarosa-carburo de tungsteno, conglomerado de agarosa y acero inoxidable, conglomerado agarosa-cuarzo, microesferas de cerámica porosa, microesferas de zirconia porosa, microesferas de vidrio de poro controlado y microesferas compuestas de materiales inorgánicos porosos que contienen polímeros orgánicos dentro de los poros. En una modalidad el ligando puede ser ácido 2-mercaptonicotínico . Puesto que la unión de la proteína con el ligando es reversible, la proteína se puede aislar del medio de separación sólido en las condiciones de elución apropiadas que se describen más adelante. El medio de separación sólido puede estar constituido por una resina de alta densidad con un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 10 a 150 mieras y una densidad de la microesfera en el intervalo 52-406-06 aproximado de 1.5 g/ml a 15 g/ml o como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 10 a 120 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 2 g/ml a 15 g/ml o como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 15 a 100 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 2.3 g/ml a 15 g/ml o como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 15 a 80 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 3 g/ml a 15 g/ml. Las proteínas aisladas por el proceso según el primer aspecto se pueden seleccionar del grupo formado por: inmunoglobulinas como IgG, IgA, IgM, IgD o IgE, transferrina (Tf) , fibrinógeno o un derivado del mismo, inhibidor de proteasa plasmática como antitrombina, por ejemplo, antitrombina III, proteina promotora de coagulación sanguínea, proteína anticoagulación sanguínea, citocina, factor de crecimiento, albúmina o un derivado de la misma, agente trombolítico, proteína antiangiogénica, insulina o un derivado de la misma, inhibidor de a-1-proteinasa o un derivado de la misma como a-1-antitripsina, a-2-antiplasmina o un derivado de la misma, inhibidor de C-1 esterasa, apolipoproteína, HDL, fibronectina o un derivado de la misma, beta-2-glicoproteína I, plasminógeno, plasmina, activador de plasminógeno, inhibidor de 52-406-06 plasminógeno, urocinasa o un derivado de la misma, estreptocinasa o un derivado de la misma, inhibidor de inter-a-tripsina, a-2-macroglobulina, proteina amilodea, orosomucoide, ferritina, prealbúmina, GC-globulina, hemopexina y complemento C3. Las fracciones proteicas pueden contener una sola proteina o como alternativa pueden contener varias proteínas . El proceso puede incluir de 1 a 50, de 1 a 30, de l a 20, de 1 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3 etapas de elución o una sola etapa de elución. En una modalidad, los respectivos eluyentes pueden tener un pH en el intervalo aproximado de 4.0 a 9.0. Como alternativa, los respectivos eluyentes pueden tener un pH en el intervalo aproximado de 4.0 a 8.5 o de 4.0 a 8.0. También, los respectivos eluyentes pueden tener un pH en el intervalo aproximado 5.0 a 8.0, de 4.5 a 8.0 o de 5.5 a 8.0 y también, los respectivos eluyentes pueden tener un pH en el intervalo aproximado de 6.0 a 8.0. Los respectivos eluyentes pueden tener una fuerza iónica en el intervalo aproximado de 0.00005 Siemens/centímetro (S/cm) a 10.0 S/cm. Como alternativa los respectivos eluyentes pueden tener una fuerza iónica en el intervalo aproximado de 0.0005 S/cm a 10.0 S/cm o de 0.0001 S/cm a 6.0 S/cm. También los respectivos eluyentes pueden 52-406-06 tener una fuerza iónica en el intervalo aproximado de 0.001 S/cm a 5.5 S/cm, de 0.001 S/cm a 5.0 S/cm, de 0.005 S/cm a 5.0 S/cm o de 0.01 S/cm a 4.0 S/cm. Los respectivos eluyentes pueden tener cualquier combinación de valores de pH y fuerza iónica dentro de los intervalos arriba especificados. El primero, segundo o tercer eluyente pueden tener un pH aproximado entre 4.0 y 9.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.00005 S/cm y 10.0 S/cm. El primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 4.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.00005 S/cm y 0.1 S/cm. Como alternativa, el primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 4.5 y 6.5 y una fuerza iónica aproximada entre 0.00005 S/cm y 0.075 S/cm. También el primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.0 y 6.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 0.05 S/cm. El segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.0 y 7.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.1 S/cm. Como alternativa, el segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.5 y 6.5 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.075 S/cm. También el segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.5 y 6.5 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 0.05 S/cm. El tercer eluyente puede tener un pH aproximado 52-406-06 entre 5.0 y 9.0 y una fuerza iónica aproximada O.OOQl S/cm y 4.0 S/cm. Como alternativa, el tercer eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.01 S/cm y 3.0 S/cm. También, el tercer eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.05 S/cm y 2.0 S/cm. El primer eluyente puede ser un eluyente con el que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, como agua desmineralizada o una solución acuosa de una o más sales inorgánicas de ácidos minerales, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. Como alternativa, el primer eluyente puede ser una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico con el que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, fosfato o borato. El segundo eluyente puede ser una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico con el que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, 52-406-06 formato, propionato, fosfato o borato. En una modalidad, el segundo eluyente tiene una molécula con carga negativa que tiene una entidad hidrofóbica aromática, no aromática o heteroaromática, por ejemplo, sales de ácidos alquilcarboxílicos o alquilsulfónicos de cadena mediana a larga y detergentes con carga negativa, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio y desoxicolato de sodio. Por ejemplo, el segundo eluyente puede contener una sal de uno o más ácidos seleccionados del grupo formado por: ácido caproico, ácido heptanoico, ácido caprílico, ácido pelargónico y ácido cáprico, ácido undecanoico, ácido láurico, ácido tridecanoico, ácido mirístico y ácido pentadecanoico y también sus derivados alquil sustituidos saturados en insaturados. Como alternativa, el segundo eluyente puede contener una sal de uno o más ácidos seleccionados del grupo formado por: ácido hexansulfónico, ácido octansulfónico, ácido decansulfónico, ácido dodecansulfónico, sulfato de hexilo, sulfato de octilo, sulfato de decilo y sulfato de dodecilo. El tercer eluyente puede ser una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico con el que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, fosfato o borato. Como alternativa, el 52-406-06 tercer eluyente puede contener una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico con liotrofobicidad relativamente alta, por ejemplo, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fosfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de amonio, citrato de sodio, citrato de potasio. El proceso según el primer aspecto, puede comprender la elución del medio de separación sólido con un cuarto eluyente para eluir selectivamente una cuarta fracción proteica. El cuarto eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.0 y 9.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.01 S/cm y 2 S/cm. Como alternativa el cuarto eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.01 S/cm y 1.0 S/cm. También, el cuarto eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.05 S/cm y 1.0 S/cm. El cuarto eluyente puede ser una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico compatible con las proteínas que se van a aislar, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, fosfato o borato. El cuarto eluyente también puede estar constituido por una solución de una o más sales inorgánicas de ácidos minerales, en particular ácidos minerales fuertes 52-406-06 con los que no haya pérdida de la función biológica, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de amonio. La primera fracción proteica puede comprender una o más de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo formado por: albúmina, orosmucoide, prealbúmina, inhibidor de a-1-proteinasa (a-l-Pl) , transferrina y fibrinógeno. La segunda fracción proteica puede comprender una o más de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo formado por: antitrombina, por ejemplo, antitrombina III, albúmina, inmunoglobulinas, transferrina y fibrinógeno. La tercera fracción proteica puede comprender una o más de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo formado por: inmunoglobulinas, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG y/o IgM, transferrina y fibrinógeno. La cuarta fracción proteica puede comprender una o más de las siguientes proteínas seleccionadas del grupo formado por: transferrina, a-2-macroglobulina, inmunoglobulinas como Ig y fibrinógeno. Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un proceso para aislar el factor VIII y/o el factor IX a partir de una solución que los contenga, la solución se selecciona del grupo formado por: plasma 52-406-06 sanguíneo crudo, suero sanguíneo, criosobrenadante derivado de plasma, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma y caldos recombinantes, el proceso consiste en: (i) proporcionar un medio de separación sólido que tiene la fórmula: M-S-L en donde M es una estructura matriz, S es una rama espadadora opcional y L es un ligando constituido por ácido mercaptonicotinico; (ii) poner en contacto el medio de separación sólido con la solución, de tal manera que al menos el factor VIII y/o el factor IX formen una unión reversible con el medio de separación sólido; (iii) llevar a cabo al menos una primera etapa de elución- para eluir del medio de separación sólido las proteínas que no se unieron; (iv) llevar a cabo una segunda etapa de elución para eluir el factor VIII y/o el factor IX del medio de separación sólido. M puede ser una resina de alta densidad adecuada para adsorción en lecho no empacado, por ejemplo, adsorción en lecho fluidizado y adsorción en lecho expandido, por ejemplo, un derivado de agarosa perlada de alto grado de reticulación y con una base de 6% ó 4% de agarosa, un 52-406-06 conglomerado agarosa-carburo de tungsteno, conglomerado de agarosa y acero inoxidable, conglomerado agarosa-cuarzo, microesferas de cerámica porosa, microesferas de zirconia porosa, microesferas de vidrio de poro controlado y microesferas compuestas de materiales inorgánicos porosos que contienen polímeros orgánicos dentro de los poros. La resina de alta densidad puede tener un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 10 a 300 mieras o aproximadamente de 15 a 150 mieras y una densidad de la microesfera en el intervalo aproximado de 1.1 g/ml a 15 g/ml o aproximadamente de 1.5 g/ml a 15 g/ml como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 10 a 120 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 2.0 g/ml a 15 g/ml o como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 15 a 100 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 2.3 g/ml a 15 g/ml o como alternativa un tamaño de partícula medio en el intervalo aproximado de 15 a 80 mieras y una densidad de la microesfera de aproximadamente 3 g/ml a 15 g/ml. El grupo espaciador S se puede derivar de un compuesto que tenga un grupo epoxi (por ejemplo, butanodioldiglicidil éter o epiclorhidrina) u otro reactivo de acoplamiento que sea adecuado de los conocidos en la técnica para la unión covalente de ligandos. 52-406-06 En una modalidad, L puede ser .m-xililendiamina. Como alternativa, L puede ser p-xililendiamina y también puede ser o-xililendiamina . Las proteínas no unidas se pueden seleccionar, en forma no exclusiva, del grupo formado por: IgG, IgA, IgM, IgD o IgE, transferrina (Tf) , fibrinógeno o un derivado del mismo, inhibidor de proteasa plasmática como antitrombina, por ejemplo, antitrombina III, proteina promotora de coagulación sanguínea, proteína anticoagulación sanguínea, citocina, factor de crecimiento, albúmina o un derivado de la misma, agente trombolítico, proteína antiangiogénica, insulina o un derivado de la misma, inhibidor de a-1-proteinasa o un derivado de la misma como a-1-antitripsina, a-2-antiplasmina o un derivado de la misma, inhibidor de C-1 esterasa, apolipoproteína, HDL, fibronectina o un derivado de la misma, beta-2-glicoproteína I, plasminógeno, plasmina, activador de plasminógeno, inhibidor de plasminógeno, urocinasa o un derivado de la misma, estreptocinasa o un derivado de la misma, inhibidor de inter- a-tripsina, a-2-macroglobulina, proteína amilodea, orosomucoide, ferritina, prealbúmina, GC-globulina, hemopexina y complemento C3. Los eluyentes utilizados en las etapas de elución pueden tener un pH aproximado entre 5.0 y 9.0. Los eluyentes pueden tener una conductividad aproximada en el 52-406-06 intervalo entre 0.0001 S/cm y 10.0 S/cm. Los eluyente pueden tener un pH aproximado entre 6.0 y 9.0 y una conductividad aproximada en el intervalo entre 0.03 S/cm y 0.2 S/cm. Los eluyentes pueden tener aproximadamente el mismo pH pero ser diferentes en fuerza iónica. Por ejemplo, los respectivos eluyentes pueden tener diferentes sistemas tampón y/u opcionalmente contener sales adicionales, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. Los respectivos eluyentes pueden tener cualquier combinación de valores de pH y fuerza iónica dentro de los intervalos arriba especificados. El eluyente estar constituido por una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico u orgánico con el que no haya pérdida de la función biológica del factor VIII y/o el factor IX, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, borato o fosfato. El eluyente también puede estar constituido por una solución acuosa de una o más sales inorgánicas de ácidos minerales fuertes con los que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y 52-406-06 ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. El primero y el segundo eluyentes pueden tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 1.0 S/cm. Como alternativa, el primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.5 y 6.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.01 S/cm. También, el primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 5.5 y 6.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.05 S/cm. Como alternativa, el primer eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 6.5 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 0.1 S/cm. El segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.1 S/cm. Como alternativa, el segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 6.0 y 8.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.5 S/cm. También, el segundo eluyente puede tener un pH aproximado entre 7.0 y 9.0 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 1 S/cm. Al controlar el pH y la conductividad de los eluyentes tal como se describe en los párrafos anteriores, el proceso se puede usar para aislar el factor VIII y el 52-406-06 factor IX como mezcla, a partir de una solución que contenga el factor VIII y el factor IX asi como otras substancias. Como alternativa, si la solución contiene solamente el factor VIII (por ejemplo, si la solución es un crioprecipitado derivado del plasma o una caldo recombinante en donde sólo se ha expresado el factor VIII) , al controlar el pH y la conductividad de los eluyentes tal como se describió en párrafos anteriores, el proceso se puede usar para aislar sólo el factor VIII. Si la solución contiene solamente el factor IX (por ejemplo, si la solución es un criosobrenadante derivado del plasma o una caldo recombinante en donde sólo se ha expresado el factor IX) , al controlar el pH y la conductividad de los eluyentes tal como se describió en párrafos anteriores, el proceso se puede usar para aislar sólo el factor IX.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un proceso según la invención y muestra la purificación adicional de las fracciones proteicas aisladas. La Figura 2 muestra la recuperación de producto utilizando un proceso según una modalidad de la invención. La Figura 3 muestra un análisis SDS-PAGE según una modalidad del primer aspecto de la invención. La Figura 4 muestra el análisis por 52-406-06 inmunodifusión radial simple en fracciones obtenidas con una modalidad del primer aspecto de la invención. La Figura 5 ilustra una modalidad de la invención en la que el primero y el segundo aspecto de la invención se usan en serie para aislar ciertas fracciones proteicas. La Figura 6 muestra el análisis SDS-PAGE de fracciones de adsorción del factor VIII. La banda 1 representa plasma crudo, la banda 2 representa la fracción run-through y la banda 3 representa la elución del factor VlII/factor IX. El eluato de factor VIH/factor IX se diluyó en proporción al volumen de elución para la comparación directa con el plasma aplicado, es decir, los rendimientos se pueden estimar en forma visual. La Figura 7 muestra el análisis SDS-PAGE de fracciones proteicas obtenidas en el proceso de aislamiento de proteínas correspondiente al primer aspecto en el que la material prima (solución que contiene las proteínas) utilizada es la fracción "pasada" (run-through) obtenida del proceso según el segundo aspecto. La banda 1 representa plasma humano, la banda 2 represente la fracción run-through (a-l-PI) , la banda 3 representa la elución 2 (albúmina) , la banda 4 representa la elución 3 (IgG) y la banda 5 representa la elución 4 (fibrinógeno) . La Figura 8 muestra un análisis de inmunodifusión radial simple de las fracciones obtenidas en el proceso de 52-406-06 aislamiento de proteínas correspondiente al primer aspecto en el que la material prima (solución que contiene las proteínas) utilizada es la fracción run-through obtenida del proceso según el segundo aspecto. Las fracciones 1 a 4 representan la fracción run-through, la elución 2, la elución 3 y la elución 4, respectivamente. La Figura 8A muestra la cuantificación de albúmina y la Figura 8B muestra la cuantificación de IgG. Las dos filas arriba de 8A y 8B representan una curva estándar de plasma crudo 100-20% (determinación por duplicado) . Las dos filas debajo de A y B representan lo siguiente: 1: fracción run-through; 2: elución 2; 3: elución 3; 4: elución 4.
Definiciones Las siguientes son algunas definiciones que pueden ayudar a entender la descripción de la presente invención. En el contexto de esta especificación, el término "que contiene, que comprende o constituida por" significa "que incluye principalmente, pero no necesariamente en forma exclusiva". Por otra parte, las variaciones de la expresión "que contiene, que comprende o constituida por" como "contiene, comprende o constituida por" tiene el mismo significado con su correspondiente variación. En el contexto de la presente invención, los 52-406-06 términos "etapa de elución", "elución" o "eluir" se pueden emplear indistintamente y se refieren a una etapa en la que se obtiene una fracción proteica que contiene una o más proteínas que pueden o no estar unidas y que posteriormente se liberan del medio de separación sólido. En el contexto de la presente especificación, el término "etapa de lavado" se refiere a una etapa en la que el medio de separación sólido se lava con un liquido que prácticamente no libera ninguna de las proteínas del medio de separación sólido. En el contexto de la presente especificación, el término "etapa de equilibrio" se refiere a una etapa en la que se permite que pase suficiente solución a través del medio de separación sólido para que la concentración de contraiones, la conductividad y el pH de la solución que sale sean aproximadamente los mismos que los de la solución que entra. En el contexto de la presente especificación, el término "caldo recombinante" se refiere a las proteínas solubles que se han expresado in vitro mediante células manipuladas genéticamente. Las proteínas que pueden expresarse en estas células manipuladas dentro del caldo recombinante pueden incluir: proteínas de la vía de coagulación, por ejemplo, factor VII, factor VIII, factor IX o factor XIII, inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG, IgA, 52-406-06 Ig , IgD o IgE, transferrina (Tf) , fibrinógeno o un derivado del mismo, inhibidor de proteasa plasmática como antitrombina, por ejemplo, antitrombina III, inhibidor de al-proteinasa, proteína promotora de coagulación sanguínea, proteina anticoagulación sanguínea, citocina, factor de crecimiento, albúmina o un derivado de la misma, agente trombolitico, proteína antiangiogénica, insulina o un derivado de la misma, inhibidor de a-1-proteinasa o un derivado de la misma como a-l-antitripsina, -2-antiplasmina o un derivado de la misma, inhibidor de C-l esterasa, apolipoproteína, HDL, fibronectina o un derivado de la misma, beta-2-glicoproteína I, plasminógeno, plas ina, activador de plasminógeno, inhibidor de plasminógeno, urocinasa o un derivado de la misma, estreptocinasa o un derivado de la misma, inhibidor de inter-a-tripsina, a-2-macroglobulina, proteina amilodea, orosomucoide, ferritina, prealbúmina, GC-globulina, hemopexina y complemento C3. En el contexto de la presente especificación, el término "plasma sanguíneo" se refiere a la porción líquida de la sangre y es una solución compleja que comprende más de 90 por ciento de agua. El soluto principal del plasma es un grupo heterogéneo de proteínas. Otros constituyentes del plasma incluyen substancias grasas (lípidos) , electrólitos inorgánicos, glucosa, aminoácidos, vitaminas, hormonas y 52-406-06 productos de desecho del metabolismo. En el contexto de la presente especificación, el término "suero sanguíneo" se refiere al plasma sanguíneo al que se le ha eliminado el fibrinógeno en el proceso de coagulación. En el contexto de la presente especificación, los términos "criosobrenadante" y "crioprecipitado" se refieren a lo siguiente: criosobrenadante es la solución producida a partir del plasma después de eliminar el crioprecipitado. El crioprecipitado está compuesto de las proteínas precipitadas del plasma al exponerlo a temperaturas entre 1°C y 10°C. En el contexto de la presente especificación, el término "plasma humano fraccionado" se refiere a cualquier componente o mezcla de componentes del plasma obtenidos cuando el plasma se somete a un proceso de separación, por ejemplo, precipitación, filtración, cromatografía, etc. En el contexto de la presente especificación, el término "run-through" ("pasado por") se refiere a una fracción de proteína obtenida según el segundo aspecto de la invención que comprende el eluato obtenido cuando la solución de plasma se deposita en la columna y que se ha mezclado con el eluato obtenido en la primera etapa de elución. 52-406-06 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aislamiento de la proteina El primer aspecto de la invención se relaciona con el proceso para el aislamiento de proteínas a partir de soluciones biológicas. De manera más particular, la invención se relaciona con un proceso para aislar proteínas humanas a partir de plasma sanguíneo humano, criosobrenadante derivado de plasma humano, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma humano, de suero sanguíneo o de caldos recombinantes . La solución que contiene las proteínas se puede diluir con otro liquido adecuado antes de ponerlo en contacto con el medio de separación sólido. Por ejemplo, el plasma se puede diluir con agua desmineralizada o una solución acuosa de una o más sales inorgánicas de ácidos minerales fuertes compatibles con las proteínas que se van a aislar, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. La solución que contiene las proteínas se puede diluir con otro liquido adecuado en una proporción aproximada de 1000:1 a 1:1000. Por ejemplo, la relación de dilución aproximada puede ser de: 1000:1, 750:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 7.5:1, 5:1, 3:1, 2.5:1, 52-406-06 2:1, 1:1, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:5, 1:7.5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 ó 1:1000. El pH de la solución que contiene las proteínas se puede ajusfar antes de ponerlo en contacto con el medio de separación sólido. Como alternativa, el pH se puede ajusfar después de que la solución que contiene las proteínas se haya puesto en contacto con el medio de separación sólido. El pH se puede aumentar o disminuir. Como alternativa el pH puede mantenerse sin cambio. El pH se puede ajusfar en el intervalo aproximado entre 3.0 y 6.0 o como alternativa en el intervalo aproximado entre 4.5 y 6.0. Por ejemplo, el pH se puede ajusfar a un valor aproximado de 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 ó 6.0. Se puede ajusfar mediante un ácido adecuado, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido acético, etc. El pH se puede ajusfar mediante una base adecuada, por ejemplo, carbonato, bicarbonato, hidróxido de amonio, hidróxido, etc. También se puede ajusfar con un sistema tampón adecuado. Estos sistemas son muy conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato, acetato, fosfato, formato, succinato, MES, ADA, bis-Tris-propano, PIPES, ACES, imidazol, MOPS, TES, HEPES, HEPPS, TRICINE, clorhidrato de glicinamida, TRIS, BICINE, 52-406-06 glicilglicina, ácido bórico, CHES, CAPS. Muchos sistemas tampón se encuentran disponibles en el comercio, por ejemplo, los de Sigma Chemical Company. Los expertos en la técnica podrán identificar los sistemas adecuados en términos del pH deseado. Los eluyentes pueden tener pH diferentes. Las etapas de elución pueden consistir en tratar el medio de separación sólido con eluyentes con pH creciente o con pH decreciente. Los eluyentes pueden tener aproximadamente el mismo pH pero tener diferente fuerza iónica. Por ejemplo, los respectivos eluyentes pueden contener diferentes sistemas tampón y/u opcionalmente contener sales adicionales, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. El rendimiento mínimo de cada una de las proteínas eluídas es de 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con respecto a la cantidad de proteina presente en el material fuente . La etapa de elución se puede llevar a cabo a una temperatura en el intervalo aproximado de 0°C a 40°C. Por ejemplo, la temperatura puede ser de 5°C, 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25°C, 30°C, 35°C ó 40°C. 52-406-06 El proceso según el primer aspecto, opcionalmente puede incluir una o más etapas de lavado. Una etapa de lavado se puede realizar en cualquier fase del proceso según el primer aspecto, por ejemplo, antes de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que comprende las proteínas, después de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que comprende las proteínas o entre cada etapa de elución. La etapa de lavado se puede llevar a cabo utilizando cualquier solución con la que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, agua, solución salina o una solución tampón, por ejemplo, una solución tampón de citrato. Una etapa de lavado se puede llevar a cabo después de eluir el medio de separación sólido con el segundo eluyente. La solución tampón de lavado puede contener una sal inorgánica u orgánica con liotrofobicidad relativamente alta, por ejemplo, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fosfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de amonio, citrato de sodio, citrato de potasio. La fuerza iónica mínima de la solución tampón de lavado puede ser de 0.001 S/cm o como alternativa de al menos 0.01 S/cm ó como alternativa al menos 0.1 S/cm o también al menos 1.0 S/cm. El proceso según el primer aspecto de la 52-406-06 invención también puede incluir una o más etapas de equilibrio. Una etapa de equilibrio se puede llevar a cabo antes de poner el contacto el medio de separación sólido con la solución que contiene las proteínas. La etapa de equilibrio puede consistir en tratar el medio de separación sólido con agua o una solución tampón adecuada para ajusfar el pH y la fuerza iónica del medio de separación sólido. La solución usada en la etapa de equilibrio puede ser agua desmineralizada o una solución acuosa de una o más sales de ácidos minerales fuertes compatibles con las proteínas que se van a aislar, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. Como alternativa, la solución tampón de equilibrio puede ser una solución acuosa tampón que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico compatible con las proteínas que se van a aislar, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, fosfato o borato. La etapa de equilibrio se puede llevar a cabo a una temperatura en el intervalo aproximado de 10 °C a 40 °C. Por ejemplo, la temperatura puede ser de 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C ó 40°C. El pH de la solución que comprende las proteínas 52-406-06 puede ser el mismo que el pH de la solución tampón utilizada para equilibrar el medio de separación sólido antes de ponerlo en contacto con la solución que comprende las proteínas. El pH de la solución que comprende las proteínas puede ser diferente que el pH de la solución tampón utilizada para equilibrar el medio de separación sólido antes de ponerlo en contacto con la solución que comprende las proteínas. El proceso según el primer aspecto también puede incluir una o más etapas de regeneración. Una etapa de regeneración consiste en tratar el medio de separación sólido con un reactivo adecuado capaz de eliminar el material residual del medio de separación sólido. Una etapa de regeneración se puede llevar a cabo en cualquier momento después de que se haya realizado la etapa de elución. Los reactivos de regeneración adecuados incluyen bases, por ejemplo, soluciones de hidróxidos como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, soluciones de perecidos o peróxido de hidrógeno, soluciones que contienen cloro activo como soluciones de hipoclorito, desnaturalizantes como clorhidrato de guanidinio, disolventes orgánicos como etanol . De conformidad con el proceso según el primer aspecto, el medio de separación sólido se puede cargar en un aparato adecuado con columna de cromatografía. El 52-406-06 proceso se puede llevar a cabo en una columna de lecho empacado. Como alternativa, el proceso se puede llevar a cabo en una columna de adsorción de lecho expandido (EBA) . En el contexto según el primer aspecto, prácticamente todas las proteínas del plasma humano se adsorber en el medio de separación sólido en una sola columna. Las etapas sucesivas de elución aquí descritas se pueden utilizar para eluir selectivamente las fracciones proteicas enriquecidas en proteínas específicas. Las columnas EBA son muy conocidas en la técnica y el aparato con la columna y su instalación, incluidos los métodos para introducir líquidos en columna de lecho expandido, se encuentran disponibles comercialmente y son de GE Healthcare, Suecia, también se han descrito en los documentos WO 99/65586, WO 01/85329 y WO 92/00799, cuyos contenidos Íntegros se incorporan en la presente, como referencia. Una modalidad según el primer aspecto consiste en seleccionar una columna EBA y colocar en ella una cantidad adecuada del medio de separación sólido. La cantidad de medio de separación sólido que se utilice dependerá de la cantidad que se va aplicar de la solución que contiene las proteínas. Cuando la solución de proteina es plasma humano o plasma crioprecipitado, por lo general, se utiliza 1 litro de medio de separación sólido por cada 0.5 a 1.5 52-406-06 litros de plasma. Si la solución de proteína es un caldo de fermentación recombinante, se puede usar un litro de medio de separación sólido por 1 litro de caldo de fermentación y hasta 1000 litros de caldo de fermentación. Se establece un flujo lineal en el fondo de la columna hasta que el medio de separación sólido se fluidifica. Las velocidades de flujo lineal adecuadas en la columna incluyen velocidades de flujo en el intervalo de 0.5 a 20 cm/min. o como alternativa de aproximadamente 5 cm/min. a 15 cm/min. Luego, el medio de separación sólido se puede equilibrar con una solución apropiada (por ejemplo, agua, una solución acuosa de electrólito o una solución tampón) , después, se puede introducir en el fondo de la columna una solución de plasma sanguíneo, suero sanguíneo, criosobrenadante, crioprecipitado solubilizado o caldo recombinante. Opcionalmente, se puede realizar otra etapa de lavado una vez que la solución se ha incorporado al medio de separación sólido. Después, se llevan a cabo las etapas de elución para eluir en forma selectiva las fracciones proteicas enriquecidas en proteínas específicas. Cada etapa de elución respectiva, se realiza en condiciones adecuadas para eluir en forma selectiva la fracción proteica que contiene una o más proteínas . Por ejemplo, al variar el pH y/ o la fuerza iónica del eluyente utilizado en las respectivas etapas de elución, s posible 52-406-06 eluir diferentes proteínas. El eluyente se puede ajusfar a un pH y fuerza iónica adecuados mediante una solución tampón adecuada. La fuerza iónica también se puede ajusfar mediante una sal. Las sucesivas etapas de elución pueden consistir en tratar el medio de separación sólido con un eluyente con pH creciente. Como alternativa, las sucesivas etapas de elución pueden consistir en tratar el medio de separación sólido con un eluyente con pH decreciente. Otra modalidad según el primer aspecto implica disponer de una columna EBA que contiene microesferas de conglomerado de agarosa-carburo de tungsteno modificado con ácido 2-mercaptonicotinico. Las microesferas de agarosa-carburo de tungsteno tienen una distribución de tamaño de partícula entre 40 y 120 mieras y un diámetro medio de 70 mieras. La densidad de las microesferas es de 2.9 g/ml. Se lleva a cabo una etapa de equilibrio utilizando un tampón de citrato a un pH aproximado de 4.5 y enseguida se realiza otra etapa de equilibrio con tampón de citrato a un pH aproximado de 5.0. El plasma humano que se ha diluido con 2 partes de agua y cuyo pH se ha ajustado a 5.0 con HC1 se introduce a la columna en una proporción de 1.5 litros de plasma diluido por litro de medio de separación sólido. Después, la columna se eluye con las siguientes soluciones tampón: Elución 1. Citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. 52-406-06 Elución 2. 5 g/1 de caprilato de sodio y HC1 a pH 6.0. Elución 3. Citrato de sodio 1M a pH 8.0 Elución 4. Citrato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0 El medio de separación sólido se regenera después con NaOH 1M. La velocidad de flujo en todas las operaciones es de 7.5 cm/min. y las cantidades de cada solución utilizada se presentan en el Cuadro 2. El volumen de eluyente utilizado dependerá normalmente de varios factores interrelacionados, por ejemplo: (i) La velocidad de flujo usada durante la aplicación de la muestra, lavado, elución, regeneración y equilibrio. (ii) El número de fracciones de producto eluidas. (iii)La selección de eluyentes utilizados en cada etapa, ya que la selección de eluyentes afecta el rendimiento y la pureza de las fracciones individuales. (iv) La separación óptima entre las fracciones individuales, lo cual también influye en el rendimiento y la pureza de los productos obtenidos. (v) La altura del lecho del medio de separación sólido, ya que por lo general los volúmenes de lavado y elución consumidos disminuyen cuando disminuye la altura 52-406-06 del lecho del medio de separación sólido. El Cuadro 2 muestra el volumen óptimo de solución para cada etapa en la modalidad descrita anteriormente. Con referencia a la Figura 3, en la modalidad anterior se puede observar que las proteínas inhibidor de -1-proteinasa, albúmina, IgG y fibrinógeno se pueden aislar en forma eficaz.
CUADRO 2 *CV es el volumen total de la columna El Cuadro 3 muestra los rendimientos de proteínas con respecto al plasma crudo utilizado, según se determina por SRI (inmunodifusión radial simple) .
CUADRO 3 52-406-06 La inmunodifusión radial simple (SRI) se realizó para determinar el rendimiento relativo de las proteínas individuales en las fracciones de eluyentes 1 a 4. La Figura 4 muestra el análisis SRI para albúmina, IgG, inhibidor de a-1-proteinasa y fibrinógeno. Se observó que el proceso descrito se desarrolla en forma uniforme, reproducible y sin complicaciones. Todos los eluatos finales son líquidos transparentes sin señales de desnaturalización y/o precipitación considerable de ninguna de las proteínas. Los análisis por SDS-PAGE y SRI posteriores al desplazamiento en la columna no mostraron señales de fragmentación, aglomeración o cambios en la in unorreactividad de los productos eluídos . Los expertos en la técnica se percatarán que el proceso según el primer aspecto y por supuesto el segundo aspecto, se puede vigilar haciendo mediciones de la absorbancia en ultravioleta del líquido que sale de la columna. La presencia de proteínas y otro material que absorba en el UV se pueden detectar y cuantificar durante los procesos de la invención y asi hacer una correcta recolección de las diferentes fracciones proteicas. También, determinar continuamente pH, la conductividad y el índice de refracción puede ser de utilidad para documentar y controlar los procesos de la invención. 52-406-06 Aislamiento del factor VIII y/o el factor IX La solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX es por lo general plasma crudo sin diluir que puede ponerse en contacto directo con el medio de separación sólido. Como alternativa, el plasma crudo se puede diluir con otro líquido adecuado antes de ponerlo en contacto con el medio de separación sólido. Por ejemplo, el plasma se puede diluir con agua desmineralizada o una solución acuosa de una o más sales de ácidos orgánicos minerales fuertes compatibles con el factor VIII y/o el factor IX, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. La solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX se puede diluir con otro líquido adecuado en una proporción aproximada de 1000:1 a 1:1000. Por ejemplo, la relación de dilución aproximada puede ser de: 1000:1, 750:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 7.5:1, 5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:5, 1:7.5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 ó 1:1000. El pH de la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX se puede ajusfar antes de ponerla en contacto con el medio de separación sólido. Como alternativa, el pH se puede ajusfar después que la solución 52-406-06 que contiene el factor VIII y/o el factor IX se haya puesto en contacto con el medio de separación sólido. El pH se puede aumentar o disminuir y como alternativa puede mantenerse sin cambio. El pH se puede ajusfar a un valor en el intervalo aproximado de 5.0 a 9.0. Por ejemplo, el pH se puede ajusfar a un valor aproximado de 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 ó 9.0. El pH se puede ajusfar con un ácido adecuado, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido acético, etc. El pH se puede ajusfar mediante una base adecuada, por ejemplo, carbonato, bicarbonato, hidróxido de amonio, hidróxido, etc. También, se puede ajusfar con un sistema tampón adecuado. Estos sistemas son muy conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato, acetato, fosfato, formato, succinato, MES, ADA, bis-Tris-propano, PIPES, ACES, imidazol, MOPS, TES, HEPES, HEPPS, TRICINE, clorhidrato de glicinamida, TRIS, BICINE, glicilglicina, ácido bórico, CHES, CAPS. Muchos sistemas tampón se encuentran disponibles en el comercio, por ejemplo, los de Sigma Chemical Company. Los expertos en la técnica podrán identificar los sistemas adecuados en términos del pH deseado. Opcionalmente, el proceso puede incluir una o más etapas de lavado. Una etapa de lavado se puede llevar a 52-406-06 cabo antes de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX o como alternativa después de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX. La etapa de lavado se puede realizar utilizando cualquier solución con la que no haya pérdida de la función biológica del factor VIII y/o el factor IX, por ejemplo, agua, solución salina o una solución tampón, por ejemplo, solución tampón de citrato. Como alternativa, la solución tampón de lavado puede contener una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico con liotrofobicidad relativamente alta, por ejemplo, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fosfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de amonio, citrato de sodio, citrato de potasio. La solución tampón de lavado puede tener un pH en el intervalo aproximado de 5.0 a 9.0. El pH de la solución de lavado puede ser 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8 ó 9.0. La solución tampón de lavado puede tener una conductividad en el intervalo aproximado de 0.1 S/cm a 100 S/cm. Como alternativa, la solución tampón de lavado puede tener una conductividad aproximada de 0.1 mS/cm a 40 mS/cm. La solución tampón de lavado también puede estar constituida por una solución acuosa de una o más sales 52-406-06 inorgánicas de ácidos minerales con la que no haya pérdida de la función biológica de las proteínas, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio . El proceso también puede incluir una o más etapas de equilibrio. Una etapa de equilibrio se puede llevar a cabo antes de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX. La etapa de equilibrio puede consistir en tratar el medio de separación sólido con agua o una solución tampón adecuada para ajusfar el pH y la fuerza iónica del medio de separación sólido. La solución utilizada en la etapa de equilibrio puede ser agua desmineralizada o una solución acuosa de una o más sales inorgánicas de ácidos minerales fuertes compatible con el factor VIII y/o el factor IX, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y sulfato de amonio. Como alternativa, la solución tampón de equilibrio puede ser una solución tampón acuosa que contenga una sal de un ácido inorgánico y/u orgánico compatible con el factor VIII y/o el factor IX, por ejemplo, una solución tampón que contenga citrato, acetato, 52-406-06 succinato, lactato, tartrato, formato, propionato, fosfato o borato. Las etapas de equilibrio se pueden llevar a cabo a una temperatura en el intervalo aproximado de 2°C a 28°C. Por ejemplo, la temperatura aproximada pude ser de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 28°C. El pH de la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX puede ser igual al pH de la solución tampón utilizada para equilibrar el medio de separación sólido antes de poner en contacto el medio de separación sólido con la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX. El pH de la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX puede ser diferente del pH de la solución tampón utilizada para equilibrar el medio de separación sólido antes de ponerlo en contacto con la solución que contiene el factor VIII y/o el factor IX. El proceso puede incluir también una o más etapas de regeneración. Una etapa de regeneración consiste en tratar el medio de separación sólido con un reactivo capaz de eliminar el material residual del medio de separación sólido. Una etapa de regeneración se puede llevar a cabo después de eluir el medio de separación sólido con un eluyente que eluya el factor VIII y/o el factor IX. Los reactivos de regeneración adecuados incluyen bases, por ejemplo, soluciones de hidróxidos como hidróxido de sodio o 52-406-06 hidróxido de potasio, soluciones de perecidos o peróxido de hidrógeno, soluciones que contienen cloro activo como soluciones de hipoclorito, desnaturalizantes como clorhidrato de guanidinio, disolventes orgánicos como etanol. El proceso se puede llevar a cabo en una columna de lecho empacado. Como alternativa, el proceso se puede llevar a cabo en una columna EBA de lecho expandido. En una modalidad, tal como se mencionó antes, el proceso se puede usar para aislar el factor VIII y el factor IX como una mezcla a partir de una solución que contenga el factor VIII y el factor IX así como otras substancias. En esta modalidad se selecciona una columna EBA y en ella se introduce una cantidad adecuada de medio de separación sólido. La cantidad de medio de separación sólido utilizado dependerá de la cantidad que se aplicará de solución que contiene el factor VIII y el factor IX, asi como de la concentración de los factores VIII y IX en la solución. Cuando la solución proteica es plasma humano o plasma crioprecipitado, se usa por lo general 1 litro de medio de separación sólido por cada 5 a 30 litros de plasma. Si la solución de proteína es un caldo de fermentación recombinante, se puede usar un litro de medio de separación sólido por 1 litro de caldo de fermentación y hasta 1000 litros de caldo de fermentación. Se establece un 52-406-06 flujo lineal en el fondo de la columna hasta que el medio de separación sólido se fluidifica. Las velocidades de flujo lineal adecuadas en la columna incluyen velocidades de flujo en el intervalo de 0.5 a 40 cm/min. o como alternativa de aproximadamente 3 cm/min. a 15 cm/min. Luego, se puede llevar a cabo una etapa de equilibrio con una solución apropiada (por ejemplo, agua, una solución acuosa de electrólito o una solución tampón) , después, se puede introducir en el fondo de la columna una solución que contenga el factor VIII y el factor IX, por ejemplo, plasma sanguíneo crudo, mediante lo cual el factor VIII y el factor IX entran en contacto con el medio de separación sólido. Luego se realiza una primera etapa de elución para eluir de la columna las proteínas que no se han fijado. Opcionalmente, se puede realizar una etapa de lavado después de la primera etapa de elución. Luego, se lleva a cabo una segunda etapa de elución para eluír el factor VIII y el factor IX del medio de separación sólido. El primero y el segundo aspecto de la invención se pueden aplicar en serie en un proceso de dos etapas, en donde la primera etapa implica el segundo aspecto de la invención para aislar el factor VIII o su complejo con el factor Von Willebrand y/o el factor IX a partir de una solución que contiene cualquiera de las proteínas enunciadas en la página 4 de la especificación, con un 52-406-06 enriquecimiento mínimo de 10 en cuanto al factor; la segunda etapa implica el primer aspecto de la invención para separar las proteínas que no se fijaron, obtenidas en la primera etapa según el segundo aspecto, en fracciones que contienen proteínas como el inhibidor de a-1-proteinasa, albúmina, IgG, antitrombina III y fibrinógeno, todas con alto rendimiento. El proceso según el segundo aspecto se puede desarrollar en serie con otros procesos de aislamiento de proteínas. Por ejemplo, el proceso según el segundo aspecto se puede usar para aislar el factor VIII y/o el factor IX a partir de una solución de plasma sanguíneo y utilizar las proteínas restantes presentes en la fracción run-through como materia prima a partir de la cual se puedan aislar otras proteínas, por ejemplo, albúmina, fibrinógeno, inmunoglobulinas, inhibidor de a -1-proteinasa, mediante otros procesos de fraccionación, por ejemplo, precipitación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, etc. Las proteínas aisladas según el primero y segundo aspectos de la invención se pueden incorporar en formulaciones adecuadas, por ejemplo, polvos, soluciones, líquidos, etc. En el Cuadro 4 se presentan ejemplos de algunas formulaciones de productos. 52-406-06 Cuadro 4 También se puede emplear una etapa más de purificación de las fracciones proteicas aisladas en el proceso de la invención, según se requiera o se considere conveniente. Uno de estos métodos comprende la inclusión en serie de etapas con intercambio aniónico o cromatografía de interacción hidrofóbica. Con este tipo de métodos se concentran y purifican más las fracciones proteicas obtenidas en los procesos de la invención. Seleccionando el medio estacionario óptimo y las condiciones de elución óptimas para la etapa o etapas de cromatografía, se pueden fijar a una columna todas las proteínas obtenidas de los procesos de la invención. Las proteínas fijas podrían entonces eluirse de manera selectiva desde la columna secundaria conforme a diferentes grupos de condiciones químicas que darían lugar a una alta concentración y posiblemente a una mayor purificación de las proteínas. Otras técnicas cromatográficas, como la cromatografía por afinidad, la cromatografía con quelatos metálicos y la 52-406-06 filtración en gel, también se pueden empleara de manera individual o combinadas . La Figura 1 muestra algunas etapas de purificación adicionales que son viables para emplearse después de realizar los procesos de la invención. Opcionalmente, los procesos de la invención pueden incluir etapas de inactivación viral. Por ejemplo, en el Cuadro 5, se ilustran etapas de inactivación/eliminación viral, para cada producto que se ha aislado a través de un proceso de la invención.
Cuadro 5 Ahora la invención se describirá con más detalle y sólo a manera de ilustración mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos están destinados a ilustrar la invención y no deben interpretarse como limitativos del 52-406-06 alcance de la exposición de la descripción en la especificación .
Ejemplos Ejemplo 1 - Aislamiento de inhibidor de « -1-proteinasa, antitrombina III, fibrinógeno, inmunoglobulinas y albúmina Etapa 1. Medio de separación sólido: microesferas de agarosa-carburo de tungsteno modificada con ácido 2-mercaptonicotinico . Las microesferas de agarosa-carburo de tungsteno tienen una distribución de tamaño de partícula entre 40 y 120 mieras y un diámetro medio de 70 mieras. La densidad de las microesferas es de 2.9 g/ml (FastLine UFC NNSDW Núm. de catálogo CS48, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) . Las microesferas se colocan en una columna EBA (FastLine 100, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (10 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 50 cm; volumen del lecho sedimentado = 3.926 1) . El equilibrio se realiza a una temperatura de 25 °C con 2.5 volúmenes de columna (9.8 1) de citrato de sodio 40 M con un pH de 4.5 y enseguida otros 2.5 volúmenes de columna (9.8 1) de citrato de sodio 40 mM con un pH de 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 7.5 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron 6 1 de una solución de plasma diluido que contenia 2 1 de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una 52-406-06 proporción de 1:2 con 4 1 de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con solución tampón de elución 1 constituida por 4.2 volúmenes de columna (16.49 1) de una solución tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen más de 95% del inhibidor de -1-proteinasa presente en la solución de plasma diluido depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 2.9 volúmenes de columna (11.39 1) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina de la columna con un rendimiento mayor a 95% de la cantidad de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio lugar a la elución de 60% de la antitrombina III presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 5. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se eluyó con 4.4 volúmenes de columna (17.27 1) de solución tampón de elución 3 constituida por citrato de sodio 1M, pH 8.0. Esta 52-406-06 etapa dio lugar a la elución de más de 95% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 2.1 volúmenes de columna (8.24 1) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de más de 95% de fibrinógeno presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (3.926 1) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.5 volúmenes de columna (9.8 1) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5 y enseguida otros 2.5 volúmenes de columna (9.8 1) de citrato de sodio 40 mM y pH 5.0.
Ejemplo 2 - Aislamiento de inhibidor de a-1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas y fibrinógeno en donde se incluye una etapa de lavado adicional El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de 52-406-06 diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 4.5 a una velocidad de flujo lineal de 5.0 cm/min . Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenia 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se habla diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con 3.3 volúmenes de columna (259.2 mi) de una solución tampón de elución 1, constituida por citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen el inhibidor de a-1-proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 2.6 volúmenes de columna (204.2 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina presente en la solución de plasma diluida 52-406-06 depositada en la columna. Etapa 4a. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se lavó con 1.0 volúmenes de columna (78.5 mi) de citrato de sodio 1M a pH 8.0. Etapa 5. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 4a, la columna se eluyó con 4.9 volúmenes de columna (384.8 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 2.6 volúmenes de columna (204.2 mi) de citrato de sodio 20mM que comprende cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución del fibrinógeno presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5. 52-406-06 Ejemplo 3 - Aislamiento de inhibidor de ce -1-proteinasa, albúmina, transferrina, inmunoglobulinas y fibrinógeno El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 15.0 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenia 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con solución tampón de elución 1 constituida por 9.4 volúmenes de columna (738.3 mi) de agua desmineralizada. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen 100% del inhibidor de -1-proteinasa, 10% de la albúmina, 5% de transferrina y 10% 52-406-06 del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluido depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 8.9 volúmenes de columna (699 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina con un rendimiento de 90% respecto a la cantidad de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 5% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 5. Después de eluir la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se eluyó con 9.0 volúmenes de columna (706.8 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0.
Esta etapa dio lugar a la elución de más del 85% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 95% de la transferrina y 30% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 5.0 volúmenes 52-406-06 de columna (392.7 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de 60% del fibrinógeno y 10% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 5.0.
Ejemplo 4 - Aislamiento de inhibidor de ct -1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas , transferrina y fibrinógeno El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 5.0 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una 52-406-06 proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con solución tampón de elución 1 constituida por 6.8 volúmenes de columna (533.8 mi) de agua desmineralizada. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen 100% del inhibidor de -1-proteinasa, 10% de la albúmina, 5% de transferrina y 10% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluido depositada en la columna. Etapa 4. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 3, la columna se eluyó con 5.5 volúmenes de columna (431.75 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina con un rendimiento de 90% respecto a la cantidad de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 5% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 5. Después de la etapa 4, la columna se 52-406-06 eluyó con 5.0 volúmenes de columna (392.5 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de más del 85% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 95% de la transferrina y 30% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 3.1 volúmenes de columna (243.35 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de 60% del fibrinógeno y 10% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 5.0.
Ejemplo 5 - Aislamiento de inhibidor de ct -1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas, fibrinógeno y transferrina El medio de separación sólido utilizado en este 52-406-06 ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21 °C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 10.0 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con solución tampón de elución 1 constituida por 9.5 volúmenes de columna (745.75 mi) de agua desmineralizada. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lipidos y otras substancias que incluyen 100% del inhibidor de a-1-proteinasa, 10% de la albúmina, 5% de transferrina y 10% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluido depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se 52-406-06 eluyó con 7.1 volúmenes de columna (557.35 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina con un rendimiento de 90% respecto a la cantidad de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 5% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 5. Después de la etapa 4, la columna se eluyó con 5.9 volúmenes de columna (463.15 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de más del 85% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 95% de la transferrina y 30% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 3.1 volúmenes de columna (243.35 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de 60% del fibrinógeno y 10% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida 52-406-06 depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 5.0.
Ejemplo 6 - Aislamiento de inhibidor de ct -1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas, transferrina y fibrinógeno El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 20.0 cm/min . Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. 52-406-06 Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con solución tampón de elución 1 constituida por 12.6 volúmenes de columna (989.1 mi) de agua desmineralizada. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lipidos y otras substancias que incluyen 100% del inhibidor de -1-proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Se observa que en esta etapa también se eluye una cantidad significativa de albúmina a una velocidad de flujo de 20 cm/min. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 10.6 volúmenes de columna (832.1 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina con un rendimiento de 90% respecto a la cantidad de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 5% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 5. Después de la etapa 4, la columna se eluyó con 6.9 volúmenes de columna (541.65 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de más del 85% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma 52-406-06 diluida depositada en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 95% de la transferrina y 30% del fibrinógeno presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 6.8 volúmenes de columna (533.8 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de 60% del fibrinógeno y 10% de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 5.0.
Ejemplo 7 - Aislamiento de inhibidor de oc -1-proteinasa, albúmina e IgG El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del 52-406-06 lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (196.3 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 4.5 a una velocidad de flujo lineal de 5.0 cm/min . Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con 3.3 volúmenes de columna (259.2 mi) de solución tampón de elución 1 constituida por citrato de sodio 10 mM y pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen el inhibidor de c-1-proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 4. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 3, la columna se eluyó con 2.7 volúmenes de columna (211.95 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de la albúmina presente en la solución de plasma diluida 52-406-06 depositada en la columna. Etapa 5. Cancelada. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 3.8 volúmenes de columna (298.3 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de la IgG presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (78.5 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (157 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5.
Ejemplo 8 - Aislamiento de inhibidor de oc -1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas y fibrinógeno en donde se incluye una etapa de lavado adicional El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21 °C con 2.5 volúmenes de columna (392.5 mi) de citrato 52-406-06 de sodio 40 mM y pH 4.5 a una velocidad de flujo lineal de 5.0 cm/min . Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con 2.9 volúmenes de columna (455.3 mi) de una solución tampón de elución 1, constituida por citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen el inhibidor de a~l-proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 2.8 volúmenes de columna (439.6 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4a. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se lavó con 1.0 52-406-06 volumen de columna (157 mi) de citrato de sodio 1M a pH 8.0. Etapa 5. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 4a, la columna se eluyó con 4.5 volúmenes de columna (706.5 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 1.9 volúmenes de columna (298.3 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución del fibrinógeno presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (157 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 1.9 volúmenes de columna (298.3 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5. 52-406-06 Ejemplo 9 - Aislamiento de inhibidor de a -1-proteinasa, albúmina, inmunoglobulinas y fibrinógeno en donde se incluye una etapa de lavado adicional El medio de separación sólido utilizado en este ejemplo es igual al que se utilizó en el Ejemplo 1. Etapa 1. Una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 78.5 mi) se equilibró a una temperatura de 21°C con 2.5 volúmenes de columna (392.5 mi) de citrato de sodio 40 mM y pH 4.5 a una velocidad de flujo lineal de 10.0 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron 117.8 mi de una solución de plasma diluido que contenía 39.3 mi de plasma humano descongelado el cual se había diluido en una proporción de 1:2 con 78.5 mi de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con 3.7 volúmenes de columna (580.9 mi) de una solución tampón de elución 1, constituida por citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lípidos y otras substancias que incluyen el inhibidor de a-1- 52-406-06 proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 3.6 volúmenes de columna (565.2 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4a. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se lavó con 1.0 volumen de columna (157 mi) de citrato de sodio 1M a pH 8.0. Etapa 5. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 4a, la columna se eluyó con 5.4 volúmenes de columna (847.8 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 8.0.
Esta etapa dio lugar a la elución de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 1.7 volúmenes de columna (266.9 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 8.0. Esta etapa dio lugar a la elución del fibrinógeno presente en la solución 52-406-06 de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (157 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.6 volúmenes de columna (408.2 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5. Determinaciones analíticas Todos los rendimientos de los ejemplos anteriores se determinaron por inmunodifusión radial simple (Agnete Ingild en: Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, ed. Nils H., Axelsen, Scandinavian Journal of Immunology, Suppl. Núm. 10, Vol . 17, págs . 41-57, 1983.
Ejemplo 10 - Aislamiento de factor VIII y factor IX a partir de plasma crudo Etapa 1. Medio de separación sólido: La estructura matriz es una resina de agarosa-carburo de tungsteno, el espaciador se deriva de un grupo epoxi y el ligando es p-xililendiamína o m-xililendiamina. Las microesferas se depositan en una columna EBA (FastLine 10, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (1 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 25 cm; volumen del lecho sedimentado = 20 mi) . El equilibrio se realizó a una temperatura de 25 °C con citrato de sodio 20 mM y pH 6.0 a una velocidad de flujo lineal de 5.0 cm/min. 52-406-06 Etapa 2 (etapa de carga) . La columna se cargó con 300 mi de plasma crudo sin diluir. El pH del plasma se ajustó a 6.0 con HCl 1M antes de depositarlo en la columna y la proporción de carga fue de 15 1 de plasma por litro de resina. Etapa 3 (elución 1) . Después de cargar el plasma, la columna se eluyó con 9 volúmenes de columna (180 mi) de solución tampón de elución 1, constituida por citrato de sodio 20 mM y pH 6.0. Esto dio como resultado la eliminación de las proteínas sin fijar. Etapa 4. La columna se lavó con 6.4 volúmenes de columna (128 mi) de solución tampón de lavado constituida por citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 0.2 M y pH 6.0. Etapa 5. (elución 2) . Después de la etapa 4, la columna se eluyó con 6.0 volúmenes de columna (120 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 1.0 M y pH 8.0. Esta etapa dio como resultado la elución de más de 45% de actividad de factor VIII presente en el plasma depositado en la columna. Esta etapa también dio como resultado la elución de 85% de la actividad de factor IX presente en el plasma depositado en la columna. Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se regeneró con 52-406-06 1 volumen de columna (20 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (40 mi) de citrato de sodio 20 mM y pH 6.0. Determinación de actividad de factor VIII Las actividades relativas del factor VIII se determinaron en el plasma crudo y en las fracciones proteicas procedentes de la columna EBA, mediante un estuche de Coamatic (núm. de catálogo 822585-63) para la determinación de actividad del factor VIII. Se trazó una curva estándar utilizando plasma crudo sin diluir (100% de actividad) y diluido a 80%, 60%, 40%, 20% y 0% (blanco) de la actividad inicial (no se muestran) . Se analizaron las fracciones run-through, el lavado y el eluato (elución 2) procedentes de la columna y el rendimiento de actividad en el eluato se determinó con referencia a la curva estándar (véase el Cuadro 7) . En el Cuadro 7 se puede observar que el medio de separación sólido fija y eluye el equilibrio a 45% de actividad del factor VIII en las condiciones aplicadas . 52-406-06 CUADRO 7 : Factor VIII , volúmenes de la fracción y rendimiento en actividad Volumen Actividad Rendimiento relativa de en factor VIII actividad Plasma crudo 300 mi 100% 100% Fracción run-through 480 mi 13% 21% Lavado 128 mi 0% 0% Eluato (elución 2) 120 mi 113% 45% Determinación de antígeno de factor IX: Las concentraciones relativas de antígeno de factor IX se determinaron en el plasma crudo y en las fracciones proteicas provenientes de la columna EBA mediante una prueba ELISA combinada con factor IX utilizando anticuerpos comerciales. Se trazó una curva estándar con plasma sin diluir (100%) y diluido a 80%, 60%, 40%, 20% y 0% (blanco) de la concentración inicial (no se muestran) . Las fracciones run-through, las de lavado y el eluato (elución 2) se analizaron y se determinó el rendimiento del antígeno en el eluato (elución 2) con referencia a la curva estándar (véase el Cuadro 8) . En el Cuadro 8 se puede observar que el medio de separación sólido fija y eluye 85% del antígeno del factor IX en las condiciones aplicadas. 52-406-06 CUADRO 8: Factor IX, volúmenes de la fracción y rendimiento del antigeno Volumen Concentración Rendimiento relativa de antigeno de factor IX Plasma crudo 300 mi 100% 100% Fracción run-through 480 mi 0% 0% Lavado 128 mi 0% 0% Eluato (elución 2) 120 mi 213% 85% Selectividad La Figura 8 ilustra por medio de SDS-PAGE que el eluato (elución 2) contiene una muy pequeña proporción de la proteína aplicada. Cuando se diluye para comparación directa con el plasma crudo sólo son visibles bandas muy tenues de IgG, albúmina y otras proteínas lo que indica que la pérdida de estas proteínas en la fracción proteica de factor VIII y/o factor IX será insignificante. También la Fracción run-through se diluye para comparación directa con el plasma crudo y no se observa pérdida significativa de proteína. El RDI mostró también recuperación total de a-1-Pl y fibrinógeno en las fracciones run-through (no se muestran) . 52-406-06 Ejemplo 11 - Compatibilidad entre el proceso según el segundo aspecto y el proceso según el primer aspecto La fracción run-through del Ejemplo 10 se utilizó como materia prima en el proceso según el primer aspecto para determinar si la previa eliminación del factor VIII y el factor IX ejerció alguna influencia negativa en el proceso de aislamiento según el primer aspecto. Etapa 1. Medio de separación sólido: microesferas de agarosa-carburo de tungsteno modificada con ácido 2-mercaptonicotínico. Las mícroesferas de agarosa-carburo de tungsteno tienen una distribución de tamaño de partícula entre 40 y 120 mieras y un diámetro medio de 70 mieras. La densidad de las microesferas era de 2.9 g/ml (FastLine UFC NNSDW Núm. de catálogo CS48, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) . Las microesferas se colocan en una columna EBA (FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhague, Dinamarca) (2 cm de diámetro; altura de lecho sedimentado, 50 cm; volumen del lecho sedimentado = 157 mi) . El equilibrio se realiza a una temperatura de 25 °C con 2.5 volúmenes de columna (392.5 mi) de citrato de sodio 40 mM con un pH de 4.5 y enseguida otros 2.5 volúmenes de columna (392.5 mi) de citrato de sodio 40 mM con un pH de 5.0 a una velocidad de flujo lineal de 7.5 cm/min. Etapa 2. En la columna se cargaron la fracción run-through de la columna tal como se describe en el 52-406-06 Ejemplo 10 y se ajustó a 1 parte plasma crudo + 2 partes de agua. El pH de la solución de plasma diluido se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 1M antes de introducirlo en la columna y la proporción de carga fue de 1.5 de solución de plasma diluido por litro de resina. Etapa 3. Después de cargar la solución de plasma diluido, la columna se eluyó con 3.3 volúmenes de columna (518 mi) de solución tampón de elución 1 constituida por citrato de sodio 10 mM a pH 5.0. Esto dio como resultado la eliminación de proteínas sin fijar, lipidos y otras substancias que incluyen el inhibidor de a-1-proteinasa presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 4. Después de la etapa 3, la columna se eluyó con 2.6 volúmenes de columna (408 mi) de solución tampón de elución 2, constituida por 5 g/1 de caprilato de sodio/HCl, pH 6.0. La etapa 4 dio como resultado la elución de albúmina presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 4a. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 4, la columna se lavó con 1.0 volumen de columna (157 mi) de citrato de sodio 1M a pH 8.0. Etapa 5. Después de lavar la columna tal como se describió en la etapa 4a, la columna se eluyó con 4.9 52-406-06 volúmenes de columna (769 mi) de solución tampón de elución 3, constituida por citrato de sodio 0.3M, pH 7.4. Esta etapa dio lugar a la elución de las inmunoglobulinas presentes en la solución de plasma diluida depositada en la columna . Etapa 6. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 5, la columna se eluyó con solución tampón de elución 4, constituida por 2.6 volúmenes de columna (408 mi) de citrato de sodio 20 mM que contenía cloruro de sodio 0.1M a pH 7.4. Esta etapa dio lugar a la elución del fibrinógeno presente en la solución de plasma diluida depositada en la columna. Etapa 7. Después de la elución de la columna tal como se describió en la etapa 6, la columna se regeneró con 1 volumen de columna (157 mi) de hidróxido de sodio 1M y se volvió a equilibrar con 2.0 volúmenes de columna (314 mi) de citrato de sodio 40 mM, pH 4.5. Como se puede observar en la Figura 7, el patrón cualitativo obtenido con el plasma ya sin factor VIII y/o factor IX, es idéntico al patrón obtenido en el Ejemplo 4. Los volúmenes de cada fracción obtenidos de los procesos también fueron iguales a los que se describen en el Ejemplo 4. La Figura 8A-B ilustra el análisis cuantitativo de albúmina e IgG en las diferentes fracciones proteicas y 52-406-06 como se puede observar prácticamente toda la albúmina se recupera en la elución 2 y prácticamente toda la IgG se recupera en la elución 3. La albúmina y la IgG son apenas detectables en las otras fracciones. Se observó que tiene el inhibidor de a-1-proteinasa y el fibrinógeno se comportan de la misma manera que se describe en el proceso según el primer aspecto. Los resultados demuestran que la p-xililendiamina y la jp-xililendiamina tienen la capacidad de extraer de manera selectiva y eficiente el factor VIII y el factor IX da partir del plasma sin diluir sin reducir significativamente los niveles de otras proteínas plasmáticas que pudieran aislarse en proceso posteriores, por ejemplo, el proceso según el primer aspecto. El proceso de aislamiento del factor VIII y/o el factor IX es compatible con el proceso de aislamiento de albúmina, IgG, fibrinógeno e inhibidor de -1-proteinasa, según el primer aspecto. 52-406-06

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES : 1. Un proceso para el aislamiento de proteínas a partir de una solución que las contiene, la solución se selecciona a partir del grupo formado por: plasma sanguíneo crudo, suero sanguíneo, criosobrenadante derivado de plasma, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma y caldos recombinantes, el proceso consiste en: (i) proporcionar un medio de separación sólido que tiene la fórmula: M-S-L en donde M es una estructura matriz, S es una rama espadadora opcional y L es un ligando constituido por ácido mercaptonicotínico; (ii) poner en contacto el medio de separación sólido con la solución, de tal manera que al menos una de las proteínas forme una unión reversible con el medio de separación sólido; (iii) llevar a cabo al menos una etapa de elución para eluir selectivamente del medio de separación sólido al menos una fracción proteica. 2. El proceso según la reivindicación 1, en donde la solución es plasma crudo. 3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde M es una resina de alta densidad. 52-406-06 4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde L es ácido 2-mercaptonicotínico . 5. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde S es un compuesto que tiene un grupo epoxi . 6. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos una fracción proteica contiene al menos una proteína seleccionada a partir del grupo formado por: inmunoglobulinas como IgG, IgA, IgM, IgD o IgE, transferrina, fibrinógeno o un derivado del mismo, inhibidor de proteasa plasmática como antitrombina, por ejemplo, antitrombina III, proteina promotora de coagulación sanguínea, proteína anticoagulación sanguínea, citocina, factor de crecimiento, albúmina o un derivado de la misma, agente trombolítico, proteína antiangiogénica, insulina o un derivado de la misma, inhibidor de a-1-proteinasa o un derivado de la misma como a-1-antitripsina, a-2-antiplasmina o un derivado de la misma, inhibidor de Cl esterasa, apolipoproteina, HDL, fibronectina o un derivado de la misma, beta-2-glicoproteína I, plasminógeno, plasmina, activador de plasminógeno, inhibidor de plasminógeno, urocinasa o un derivado de la misma, estreptocinasa o un derivado de la misma, inhibidor de inter-a-tripsina, a-2-macroglobulina, 52-406-06 proteina amilodea, orosomucoide, ferritina, prealbúmina, GC-globulina, hemopexina y complemento C3. 7. El proceso según la reivindicación 6, en donde al menos una fracción proteica contiene al menos una proteína seleccionada a partir del grupo formado por: inmunoglobulinas, transferrina, fibrinógeno o un derivado del mismo, inhibidor de -1-proteinasa y albúmina o un derivado del mismo. 8. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la solución que contiene las proteínas tiene un pH aproximado entre 3.0 y 6.0. 9. El proceso según la reivindicación 8, en donde la solución que contiene las proteínas tiene un pH aproximado entre 4.5 y 6.0. 10. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde una primera etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 4 y 8 y una fuerza iónica aproximada entre 0.00005 S/cm y 0.1 S/cm y se eluye una primera fracción proteica. 11. El proceso según la reivindicación 10, en donde la primera fracción proteica contiene al menos una proteina seleccionada a partir del grupo formado por: inhibidor de -1-proteinasa, albúmina, orosomucoide y prealbúmina. 52-406-06 12. El proceso según las reivindicaciones 10 u 11, en donde una segunda etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 5 y 7 y una fuerza iónica aproximada entre 0.0001 S/cm y 0.1 S/cm y se eluye una segunda fracción proteica. 13. El proceso según la reivindicación 12, en donde la solución también contiene un compuesto hidrofóbico aromático, no aromático o heteroaro ático. 14. El proceso según la reivindicación 13, en donde el compuesto hidrofóbico no aromático es una sal de una ácido alquil carboxílico, una sal de un ácido sulfónico o un detergente con carga negativa. 15. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la segunda fracción proteica contiene al menos una proteína seleccionada a partir del grupo formado por: albúmina e inmunoglobulinas. 16. El proceso según cualquiera las reivindicaciones 12 a 15, en donde una tercera etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 5 y 9 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 4 S/cm y se eluye una tercera fracción proteica. 17. El proceso según la reivindicación 16, en donde la tercera fracción proteica contiene al menos una 52-406-06 proteina seleccionada a partir del grupo formado por: inmunoglobulinas, transferrina y fibrinógeno. 18. El proceso según las reivindicaciones 16 ó 17, en donde una cuarta etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 5 y 9 y una fuerza iónica aproximada entre 0.01 S/cm y 2 S/cm y se eluye una cuarta fracción proteica. 19. El proceso según la reivindicación 18, en donde la solución también contiene una sal de un ácido mineral . 20. El proceso según las reivindicaciones 18 ó 19, en donde la cuarta fracción proteica contiene al menos una proteína seleccionada a partir del grupo formado por: transferrina. inmunoglobulinas, fibrinógeno y OÍ-2-macroglobulina . 21. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el proceso se lleva a cabo en una columna de lecho expandido. 22. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el proceso se lleva a cabo en una columna de lecho empacado. 23. Un proceso para aislar el factor VIII y/o el factor IX a partir de una solución que los contenga, la solución se selecciona del grupo formado por: plasma 52-406-06 sanguíneo crudo, suero sanguíneo, criosobrenadante derivado de plasma, plasma humano fraccionado, crioprecipitado derivado de plasma y caldos recombinantes, el proceso consiste en: (i) proporcionar un medio de separación sólido que tiene la fórmula: M-S-L en donde M es una estructura matriz, S es una rama espadadora opcional y L es un ligando constituido por xililendia ina; (ii) poner en contacto el medio de separación sólido con la solución, de tal manera que al menos el factor VIII y/o el factor IX formen una unión reversible con el medio de separación sólido; (iii) llevar a cabo al menos una primera etapa de elución para eluir del medio de separación sólido las proteínas que no se unieron; (iv) llevar a cabo una segunda etapa de elución para eluir el factor VIII y/o el factor IX del medio de separación sólido. 24. El proceso según la reivindicación 23, en donde la solución que contiene el factor VIII y el factor IX es plasma sanguíneo crudo. 25. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, en donde M es una resina de alta 52-406-06 densidad. 26. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde S es un compuesto que contiene un grupo epoxi . 27. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en donde una primera etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 5.5 y 6.5 y una fuerza iónica aproximada entre 0.001 S/cm y 0.02 S/cm y se eluye una primera fracción proteica. 28. El proceso según la reivindicación 27, en donde una segunda etapa de elución consiste en eluir el medio de separación sólido con una solución que tiene un pH aproximado entre 7 y 9 y una fuerza iónica aproximada entre 0.03 S/cm y 0.2 S/cm y se eluye una segunda fracción proteica. 29. El proceso según las reivindicaciones 27 ó 28, en donde la solución también contiene una sal de ácido mineral . 52-406-06
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