BRPI0814220B1

BRPI0814220B1 - Purificação de fator viii usando uma resina multimodal ou de modo misto

Info

Publication number: BRPI0814220B1
Application number: BRPI0814220-3A
Authority: BR
Inventors: Susanne Bang; Lars Thim; Johan Karlsson
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2019-09-17
Also published as: EP2167526B1; CN101730707B; JP5323072B2; AU2008274195A1; CN101730707A; KR20100051620A; ES2364118T3; CA2692814A1; RU2493163C2; JP2010533150A; US8399620B2; WO2009007451A1; ES2364118T9; BRPI0814220B8; US20100204452A1; PL2167526T3; DE602008005885D1; RU2010103528A; NL300663I2; BRPI0814220A2

Abstract

purificação de fator viii usando uma resina multimodal ou de modo misto a presente invenção refere-se a um método para purificação de uma proteína recombinante usando uma resina multimodal ou de modo misto contendo ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada é descrito. a invenção é vantajosa por ser um processo cromatográfico de etapa única que não requer ajuste de ph ou de condutividade durante a etapa de carregamento e resulta em um alto rendimento e potência. o processo é usado para a purificação de composições recombinantes de fator de coagulação, particularmente fator viii recombinante .

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PURIFICAÇÃO DE FATOR VIII USANDO UMA RESINA MULTIMODAL OU DE MODO MISTO.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método para purificar uma proteína recombinante usando uma resina multimodal ou de modo misto contendo ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada. A proteína de interesse é um fator de coagulação, particularmente relevante para a purificação de composições de fator VIII recombinante.

Antecedentes da Invenção

Fator humano VIII, também conhecido como fator anti-hemofilia ou FVIII.C é uma proteína plasmática humana consistindo em dois polipeptídeos com peso de cadeia molecular leve de 80,000 Dáltons e peso molecular de cadeia pesada variando entre 90 000 220 000. É considerado como um dos cofatores-chaves na rota de coagulação necessária para a conversão do Fator X em sua forma ativa Fator Xa. O Fator VIII circula no plasma como um complexo não covalente com o fator von Willebrand (também conhecido como FVIILRP). Hemofilia, um distúrbio de sangramento, é causada por níveis anormais de Fator VIII. Níveis de Fator VIII 20% abaixo do normal podem resultar em condição hemofílica em seres humanos. Uma queda nos níveis de Fator VIII de menos de 1% leva a distúrbio de sangramento severo, com sangramento espontâneo de juntas sendo o sintoma mais comum.

A estrutura e bioquímica de fator recombinante VIII foram descritos previamente.

Tradicionalmente, isolamento e purificação de Fator VIII são realizados a partir de uma fonte derivada de plasma (crioprecipitado). Procedimentos de purificação de fontes derivadas de plasma incluem aquelas que exploram o uso de purificação por imunoafinidade usando anticorpos policlonais e monoclonais para a purificação de FVIII. No entanto, pode haver casos onde o efluente de Fator VIII contém algum anticorpo residual devido a lixiviamento da matriz suporte, que pode resultar em antigenicidade durante o uso final, isto é, quando introduzido no sistema humano ou animal.

Procedimentos de purificação que exploram o uso de cromatografia de troca iônica sobre, por exemplo, contas de agarose também foram usadas para purificação de fator VIII a partir de plasma. Estes métodos, no entanto, frequentemente sofrem de certos níveis de contaminação do FVIII:C resultante.

No entanto, purificação de Fator VIII de fonte recombinante geneticamente engenheirada ganhou importância na década passada. Recuperação de proteína e concentração do produto final é de máxima importância na separação de proteínas recombinantes. Os contaminantes da proteína recombinantemente produzida pode incluir proteínas secretadas no meio de cultura, componentes de meios, lisados de células, proteínas indesejadas. produzidas pelas células e os ácidos nucléicos.

Quando da purificação de proteína recombinante, os materiais de fonte aquosa nos quais os polipeptídeos de interesse são encontrados frequentemente se mostram, adicionalmente, contaminados com um ou mais vírus. Técnicas para inativação de vírus em misturas polipeptídicas são conhecidas na técnica, como, por exemplo, métodos químicos usando soluções de solvente/detergente, métodos de irradiação, ou métodos térmicos, mas tentativas para combinar essas técnicas com processos conhecidos de purificação de polipeptídeos produziram métodos com uma multiplicidade de etapas inadequadas para produção de grandes volumes. É também importante tomar cuidado para que os agentes de inativação viral usados não desnaturem a proteína ou sejam difíceis de separar da proteína de interesse. Estes agentes, entretanto, têm sido desnaturantes ou difíceis de separar dos polipeptídeos de interesse, e têm exigido um tratamento ou etapa de separação especial. Outros métodos convencionais para tratamento de preparações contendo polipeptídeos quanto à contaminação viral potencial, como calor ou irradiação, resultaram em desnaturação significativa do polipeptídeo de interesse e/ou inativação insuficiente de vírus. Muitos dos produtos de Fator VIII recombinante comercialmente disponíveis (Advate®, Helixate®, Kogenate FS®, ReFacto®) são preparados usando cromatografia de imunoa3 finidade incluindo um detergente para purificação e inativação viral.

Na purificação de proteínas terapêuticas produzidas por uma técnica de DNA recombinante, é bem conhecido que problemas consideráveis são encontrados quando se tenta reduzir o teor de DNA e proteína da célula hospedeira (Host Cell Protein (HCP) ao nível muito baixo desejado).

Nordfang et al. (Thrombosis e Haemostasis (Trombose e hemostase) 58(4), 1043-1048 (1987) descreve uma separação usando uma resina anticorpo e um tampão contendo 50% de etileno glicol e alto teor de sal.

A purificação de uma proteína recombinante expressa no sistema celular de um mamífero é tipicamente realizada em várias etapas. As diferentes etapas são usualmente separadas em captura, intermediária e polimento. O objetivo da etapa de captura é desdobrado em : a) obterá proteína alvo em uma forma de solução estável e b) reduzir o volume (isto é, 15 obter uma solução concentrada com referência ao teor de proteína em comparação com a solução carregada na coluna (“a carga”).

A última etapa (redução de volume) é crítica para facilitar as etapas subsequentes de purificação. A etapa de captura é comumente obtida usando cromatografia com uma resina de troca iônica. A desvantagem de 20 usar uma resina de troca iônica é que a condutividade e/ou pH da carga tem de ser ajustada(o). Quando a condutividade é ajustada, na maior parte dos casos reduzida, esta é realizada por adição de água que aumenta o volume do material de partida, tornando-o não prático para etapas subsequentes e, sobretudo, complicado para fins de produção. Além disso, ajuste de pH fre25 quentemente resulta na formação de agregados que poderíam interferir com o desempenho das etapas de purificação.

Após a etapa de captura, pode-se seguir uma purificação intermediária, que remove a maior parte das impurezas significativas incluindo DNA, vírus e endotoxinas. Estas impurezas podem também ser removi30 das/reduzidas na captura. A etapa de polimento refere-se à etapa de purificação final, em que os contaminantes e impurezas traço são removidos e o produto é um produto biológico ativo. Contaminantes removidos durante a etapa de polimento são frequentemente conformadores da molécula alvo ou produtos suspeitos de vazamento.

Existe ainda uma necessidade na técnica de métodos melhorados de purificação, métodos que sejam rápidos e eficientes e em que a atividade do Fator VIII seja essencialmente conservada.

O método da presente invenção é vantajoso por proporcionar numa única etapa uma redução de volume e um aumento considerável na atividade específica. Assim, o método, em uma única etapa, combina uma etapa de captura com uma etapa de purificação.

A presente invenção também provê um processo eficiente para produzir uma solução muito pura e altamente concentrada de Fator VIII recombinante em que a proteína Fator VIII é estabilizada contra degradação. Com a presente invenção, é possível combinar uma etapa de captura e purificação sem arriscar severa desestabilização das moléculas de FVIII e, em uma única etapa, obter uma purificação inicial da amostra bruta, obter uma redução substancial de volume (facilitando assim outras etapas de purificação), bem como obter um fator de purificação substancial (aumento na atividade específica de FVIII) e uma solução resultante (“reservatório de captura”) em que a proteína é estabilizada contra degradação.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se à nova e eficiente purificação de proteínas recombinantes, especialmente fator VIII de coagulação. Os inventores da presente invenção descobriram que o uso de colunas multimodais para a captura de moléculas de fator VIII do fluido de cultura de células de mamíferos é um método de purificação surpreendentemente rápido e eficiente para remoção de contaminantes de proteína FVIII cultivadas a partir de cultura sem perda na atividade da proteína.

Em um aspecto, a invenção provê um método de purificação de uma proteína fator VIII de coagulação contendo um ou mais contaminantes, o método compreendendo as etapas de:

(a) pôr a proteína Fator VI em contato II com uma resina multimodal ou de modo misto contendo ligantes que consiste em uma parte hidro5 fóbica e de uma parte negativamente carregada;

(b) eluir a referida proteína Fator VIII com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons de cálcio. Em diferen5 tes modalidades, o método inclui adicionalmente uma etapa (c) em que a solução contendo Fator VIII que resulta da etapa (b) é coletada; e/ou o método inclui adicionalmente uma etapa (a1) em que a coluna, após a etapa (a) e antes da etapa (b), é atravessada por um ou mais tampões de lavagem.

Em várias modalidades da mesma, um ou mais dos referidos 10 tampões de lavagem incluem sal mM a 1000 mM, e/ou o tampão de eluição da etapa (b) contém pelo menos sal 2M e pelo menos 45% (p/v) de etileno glicol, propileno . glicol, ou uma mistura dos mesmos, como, por exemplo, sal 2,3-2,6 M e 4852% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos;

e/ou o sal contido no tampão de eluição da etapa (b) é selecionado entre: NaCI, NH4CI, KCI, (NH₄)₂SO4, CH3CO2NH4, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de etapa única de purificação de proteína Fator VIII contendo um ou mais contaminantes, 20 incluindo as etapas de:

a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal contendo os ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada;

b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo 25 pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio;

sendo que o referido método obtém uma redução no volume da coluna de cerca de 250 vezes.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de etapa única de purificação da proteína Fator VIII contendo um ou mais contaminantes, compreendendo as etapas de:

a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal con6

-	tendo os ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada; b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo pelo menos um sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno
5	glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons de cálcio; em que o referido método obtém um “fator de purificação” de pelo menos 30 vezes. Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método para estabilização de proteína Fator VIII, compreendendo as etapas de:
10	a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal contendo os ligantes que compreendem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada; b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno gli-
15	col, ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio. Breve Descrição das Figuras A Figura 1A é um cromatograma mostrando a absorção de UV a 280 nm, condutividade e pH durante uma operação de purificação com equilibração, carga, lavagem e eluição.
20	A Figura 1B mostra uma ampliação da parte de lavagem e eluição do cromatograma da Figura 1. A Figura 2 mostra uma eletroforese em gel SDS com coloração com prata ilustrando a purificação obtida usando a coluna Capto MMC nas etapas de carga, escoamento (FT) e eluição. Banda (Lane) 1: MW padrão,
25	Banda 2: meio de cultura de células, Banda 3: Vazio, Banda 4: Atravessamento (material não ligado) a partir da coluna Capto MMC, Banda 5: Vazio, Banda 6: Pool de captura (material protéico ligado e eluído a partir da coluna Capto MMC. A Figura 3 é um histograma mostrando o rendimento percentual
30	de Fator VIII recombinante purificado usando resina Capto MMC com diferentes tampões de eluição contendo várias concentrações de NaCI ou NH4CI e etileno glicol.

A Figura 4 mostra o efeito de ciclos repetitivos de congelamento/descongelamento na estabilidade do Fator VIII no reservatório de captura.

Descrição da Invenção

O presente método de purificação do fator VIII de coagulação é realizado com o uso de cromatografia multimodal fazendo uso de resinas que são ao mesmo tempo hidrofóbicas e carregadas negativamente. A solução de proteína a ser purificada, por exemplo, o sobrenadante contendo proteína obtido da fermentação de células de mamíferos, é aplicado à resina multimodal passando a solução por uma coluna cromatográfica contendo a 10 referida resina. A solução (carga) é tipicamente filtrada (por exemplo, por filtração frontal ou filtração em fluxo cruzado) e/ou centrifugada para remover células e partículas antes de ser carregada na resina. A etapa de carregamento não exige ajuste de pH ou de condutividade. Após carregamento, a coluna é tipicamente lavada com um ou mais tampões de lavagem, um dos 15 quais contendo alta concentração de sal. Em uma modalidade, a coluna é lavada, após carregamento, com tampão de equilíbrio, opcionalmente seguida por lavagem com um segundo tampão com alta concentração de sal.

Para recuperar substâncias adsorvidas, é realizada eluição, passando um tampão de eluição contendo alta concentração de sal e um 20 solvente orgânico sobre a coluna.

A invenção provê uma redução do volume de coluna (CV) de cerca de 250 vezes, comparada a (e calculada a partir do volume da) amostra de carregamento, alcançando assim uma excelente redução de volume. Por “redução de volume” entende-se uma redução no volume de solução 25 eluída contendo proteína quando comparado ao volume de solução carregada contendo proteína (por exemplo, a amostra bruta clarificada proveniente do processo de fermentação).

O método de purificação da invenção provê adicionalmente um rendimento de proteína de 70-100% e o fator de purificação (aumento na atividade específica) é de até 100 vezes. A proteína purificada resultante é estável no tampão de eluição por pelo menos 2 meses a -70°C.

Além disso, o método da invenção provê uma solução de fator

VIII estável: o eluído de captura pode ser congelado e descongelado pelo menos 3 vezes sem perda significativa de atividade.

A invenção utiliza resinas cromatográficas multimodais para a separação da proteína de fator VIII de interesse dos contaminantes. Foi de5 terminado que a cromatografia multimodal, em que dois ou mais sítios diferentes, mas cooperativos interagem com um alvo, é um sistema apropriado para purificação de proteína de fator VIII. A resina cromatográfica usada para a purificação da proteína recombinante na presente invenção é comercialmente disponível, por exemplo: Capto MMC® (GE Healthcare) ou MBI Hy10 perCel® (Pall, anteriormente BioSepra).

Capto MMC contém um ligante com funcionalidade multimodal que fornece uma seletividade diferente comparada a trocadores iônicos tradicionais, além de prover a possibilidade de proteínas de ligação em concentrações salinas tão altas como 0,5M a 1,0 Μ. O ligante exibe aqui diversas 15 funcionalidades para interação com a molécula-alvo e oferece, assim, interação iônica, ligação com hidrogênio e interação hidrofóbica. Em uma modalidade da invenção, a resina multimodal é Capto MMC®.

MBI HyperCel® (Pall), ainda outra cromatografia multimodal, é eficiente em atacar problemas de estabilidade e vazamento de colunas de 20 afinidade baseadas em proteína. Mais especificamente, MBI Hypercel® (Pall), um adsorvente contendo ligantes mercapto-benzimidazol-ácido sulfônico, provê interações hidrofóbicas bem como iônicas com uma proteína dada. Assume-se que as interações hidrofóbicas sejam devidas ao sistema de anel aromático, enquanto as interações iônicas devem ser devidas ao substi25 tuinte SO3, que é conhecido como um trocador catiônico forte. Além disso, os átomos de nitrogênio do sistema aromático do ligante MBI são carregáveis em certas condições, e podem consequentemente prover interações iônicas com grupos negativamente carregados.

Em uma modalidade vantajosa, os contaminantes são adsorvi30 dos aos ligantes multimodais, e uma fração essencialmente pura de fatorVIII de coagulação é recuperada por uma eluição seletiva subsequente. A etapa de captura provê um fator de purificação (aumento na atividade específica) de pelo menos 80 vezes, como 80 a 100 vezes, 90 a 100 vezes ou 100-160 vezes.

O reservatório de captura resultante compreende a proteína Fator VIII que é pelo menos 10% pura, como pelo menos 20% ou cerca de 30% 5 a 60%, como 30% a 50%. A pureza é definida como a quantidade de proteína Fator VIII em % (p/p) (por exemplo, determinado por ELISA) da quantidade total de proteína. Em uma modalidade do presente método, a solução carregada à resina cromatográfica multimodal é uma coleta contendo fator VIII de uma fermentação de células de mamífero. Em uma de suas modali10 dades a referida coleta é filtrada e/ou centrifugada para remover células e partículas; em outra modalidade, a coleta é carregada à resina sem qualquer ajuste de pH ou de condutividade da solução de carga.

A presente invenção abrange especificamente um método em que a etapa de carregamento inclui carregar a solução de carga contendo 15 proteína na resina em um pH e condutividade similar ao pH e condutividade de uma coleta contendo fator VIII de fermentação de células de mamífero, opcionalmente uma coleta filtrada.

Isto provê vantagem maior na etapa inicial de captura com restrição do volume que, de outra forma seria necessário para ajustar (reduzir) 20 a condutividade da solução de carga.

Em uma modalidade, a coleta contendo fator VIII é estabilizada pela adição de imidazol (como, por exemplo, 1-10 mmols de imidazol por L de coleta). Devido à quantidade e volume pequenos de imidazol adicionado em comparação com o volume de coleta, qualquer alteração no pH e/ou na condutividade da coleta é desprezível. Em uma outra modalidade, a coleta é, então (i) filtrada e/ou centrifugada para remover células e partículas e (ii) carregada à resina sem mais adição de químicos.

O método da invenção é tipicamente realizado em várias etapas: equilibração da coluna, carga e eluição. Uma ou mais etapas de lava30 gem podem ser incluídas após a carga e antes da eluição. A(s) etapa(s) de lavagem é/são tipicamente realizadas usando pelo menos um tampão contendo uma alta concentração de sal. Em uma modalidade, uma etapa de lavagem é empregada usando um tampão contendo 10 mM a 1000 mM de sal, como, por exemplo, 100-1000 mM, ou 250-1000 mM, ou 500-1000 mM, ou 500-800 mM de sal. Em outra modalidade, o método inclui uma etapa de lavagem em que, após a carga, a coluna é primeiramente lavada com tam5 pão de equilíbrio e, então lavada com um segundo tampão de lavagem contendo alto teor de sal.

Em uma modalidade, o tampão de equilíbrio compreende um agente de tamponamento (como, por exemplo, imidazol na faixa de 5 mM a 100 mM, por exemplo, 20mM de Imidazol), um sal de Ca (1 mM a 100 mM, 10 por exemplo 10 mM CaCI₂,) um detergente (como, por exemplo. Tween® 80 na faixa de 0,001% a 0,1%, por exemplo, 0,02% (p/v) Tween® 80) e um sal (10 mM a 1000 mM, por exemplo 50 mM NaCI). O tampão de equilíbrio é, mantido em um pH de 6,0 a 8,0; preferivelmente as condições de pH são mantidas em 7,3 a 7,5. Será apreciado por uma pessoa com habilidade na 15 técnica que a proteína Fator VIII aqui exemplificada é estável em um pH de cerca de 6,0 a 8,0 e assim, o tampão de equilíbrio está em um pH de 7,3 7,5, mais preferivelmente a 7,5.

Em uma modalidade, o tampão de lavagem compreende um agente de tamponamento (como, por exemplo, imidazol na faixa de 5 mM a 20 100 mM, por exemplo 20 mM de Imidazol), um sal Ca (1 mM a 100 mM, por exemplo 10 mM CaCh,) um detergente (como, por exemplo. Tween® 80 na faixa de 0,001% a 0,1%, por exemplo, 0,02% (p/v) Tween 80) e um sal (por exemplo, NaCI na faixa de 50 mM a 1000 mM).

A etapa de eluição é realizada com um tampão de eluição con25 tendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol ou uma mistura dos mesmos, e íons de cálcio (1 mM a 100 mM, por exemplo, 10 mM CaCl2). O tampão de eluição tem um pH de 6,0 a 8,0; preferivelmente as condições de pH são mantidas em 7,3 a 7,5. Para manter as condições desejadas de pH, o tampão de eluição também contém um 30 agente de tamponamento.

O termo “agente de tamponamento” abrange aqueles agentes que são capazes de manter o pH da solução dentro de uma faixa desejada 11 no contexto da presente invenção na faixa de 6,0 a 8,0, como 7,3 a 7,5. A faixa de concentração do tampão é escolhida para manter o pH preferido da solução. O agente de tamponamento pode também ser uma mistura de pelo menos dois agentes de tamponamento em que a mistura é capaz de prover um valor de pH na faixa especificada.

Agentes de tamponamento podem incluir, mas não são limitados a, citrato (sódio ou potássio), acetato (amônio, sódio ou cálcio), histidina (Lhistidina), fosfato (sódio ou potássio), ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES, imidazol, TRIS, etanolamina, e misturas de dois ou mais dos mes10 mos. Em uma modalidade, o agente de tamponamento empregado é imidazol na faixa de 5 mM a 100 mM.

Sais preferidos são NaCI, NH₄CI, KCI, (NH₄)2SO₄, CH₃CO₂NH₄(acetato de amônio, NH₄Ac), ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos. Em uma modalidade, o tampão de eluição inclui sal de cerca 2,5 M e pelo 15 menos 40% glicol; em outra modalidade, o tampão de eluição inclui sal de cerca de 2,5M e cerca de 50% glicol. Em uma modalidade, o sal é NaCI; em outra, o sal é NH₄CI. Em uma modalidade, o glicol é etileno glicol; em outra, o glicol é propileno glicol. Em ainda outra modalidade, o tampão de eluição inclui NaCI e etileno glicol.

Em outra modalidade, NH₄CI em uma concentração de 2,5M com etileno glicol é também usado para eluição da proteína. Em ainda outra modalidade, o tampão de eluição inclui adicionalmente um detergente. Em uma modalidade particular do método, o eluente é 20mM Imidazol, 10mM CaCh, 0,02% (v/v) Tween 80, 2,5M NaCI e 8 M etileno glicol em um pH de 25 7,5.

Em outra modalidade, resina MBI HyperCel® é usada no método para purificação do Fator VIII. Em uma modalidade, ligação do fator VIII recombinante usando a coluna de MBI HyperCel® é realizada após adição de 100mM Na2SO₄ à coleta e eluição é obtida com NaC11M e glicerol 5M.

Em uma modalidade particular da invenção, o método compreende as etapas de:

a) por o Fator VIII em contato com uma resina multimodal ou de modo misto contendo os ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada;

b) passar pela coluna tampão de equilíbrio contendo 20mM Imidazol, 10 mM CaCh, 0,02% (p/v) Tween 80 e 50 mM NaCI e tampão de la- vagem contendo 20mM de Imidazol, 10 mM CaCI₂, 0,02% (p/v) Tween 80 e 1,5MNaCI;

c) eluir a referida proteína com tampão de eluição contendo 20mM Imidazol, 10 mM CaCh, 0,02% (v/v) Tween 80, 2,5M NaCI, e 8M etileno glicol.

A primeira etapa da purificação de uma proteína recombinante expressa em células de mamífero, nas circunstâncias mais normais, lida com altos volumes de carga. Para purificação de proteína comercial, é importante reduzir o volume ao ponto de ser facilmente manuseado. Além disso, a etapa de purificação tem de ter um rendimento significativo para obter economia de processo para fins comerciais ou outros. Cerca de 20 a 100 vezes de redução em volume na primeira etapa é normalmente objetivada na primeira etapa da purificação da proteína, sendo a última considerada como um bom volume de redução.

Em uma modalidade, o volume de carga contendo a proteína a ser purificada fica acima de 500 volumes de coluna (CV). A proteína eluída provê uma redução no volume final de mais de 100 vezes. A presente invenção abrange um volume de carga de 50-600 CV. A redução de volume é preferivelmente de cerca de 100-300 vezes. Em uma modalidade, o volume de carga é de cerca de 500 CV, ou de cerca de 450-600 CV, e a proteína

Fator VIII é eluída em cerca de 2CV atingindo uma redução de volume de cerca de 250 vezes.

Em outra modalidade, a etapa de captura pode ser combinada com um ou mais agentes inativadores de vírus como, por exemplo, Triton X100 (por exemplo, em uma concentração de cerca de 1% (p/v). O agente 30 inativador de vírus pode, ser, por exemplo, adicionado a um ou mais, dos tampões usados.

Vazões são manipuladas para ficarem entre 300-950 cm/h para todas as etapas do processo de purificação exceto para as etapas de eluição e limpeza no local (CIP) em que as vazões são de 30-350 cm/h. Em uma modalidade a vazão de carga é de 450cm/h; durante eluição e CIP, a vazão é reduzida para 30cm/h. Em uma modalidade da invenção, a vazão de carga é de cerca de 450-600cm/h.

Em um aspecto, a invenção também se refere a uma preparação compreendendo:

(i) uma proteína Fator VIII; e (ii) um tampão contendo pelo menos 1,5 M sal e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou 10 uma mistura dos mesmos, e íons cálcio;

em que o Fator VIII é 30% a 60% puro.

Definições

Na presente invenção, “proteína Fator VIII” significa incluir fator

VIII de comprimento completo, FVIILC, e derivados por deleção de fator VIII 15 de comprimento completo tendo atividade coagulante. Por derivado por deleção entende-se o fator VIII em que o total ou parte do domínio B está faltando enquanto a atividade de coagulação é mantida. Estas formas de fator VIII com domínio B deletado são, por exemplo, descritas no WO 91/09122. A estrutura e bioquímica do Fator VIII em geral foram descritos por Kaufman (Trends in Biotechnology, 9, pp.353-359 (1991) e Hematology, 63, pp.155165 (1991)). Estão incluídos também variantes de sequência e derivados de fator VIII, incluindo formas peguiladas, aciladas, e polissialiladas de fator VIII, tendo mantido a atividade biológica característica do fator VIII. O fator VIII pode ser obtido por meios recombinantes. Em uma modalidade, o fator VII é fator VIII recombinantemente produzido. Em uma modalidade, o Fator VIII é Fator VIII de comprimento completo; em outra modalidade, a proteína Fator VIII é um Fator VIII com domínio B deletado. Em ainda outra modalidade, o fator VIII é um Fator VIII peguilado, acilado, ou polissialilado.

Concentrados de Fator VIII derivados de plasma humano con30 têm várias formas de Fator VIII totalmente ativo fragmentado como descrito por Andersson et al (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pp.2979-2983 (1986)). A menor forma ativa tem uma massa molecular de 170 kDa e consiste de duas

-	cadeias de 90 kDa e 80 kDa ligadas por íon(s) metálico(s) (ver, por exemplo, EP197901). Esses fragmentos de Fator VIII são também incluídos - purificação desses fragmentos constitui uma modalidade da presente invenção. Atividade biológica de fator VIII é aranjada, por exemplo, como
5	descrito na seção Experimental (ver abaixo). O termo “eluente” significa em seu significado convencional, identificado na técnica, um tampão ou tampões de pH e/ou força iônica adequados para liberar uma ou mais proteínas ou compostos de uma matriz de separação.
10	Neste contexto, o “sal” na etapa de eluição refere-se a um sal de metal alcalino, sal de metal alcalino-terroso ou sal de amônio, isto é, um sal tendo um cátion de elementos de metal alcalino ou alcalino-terroso ou um. cátion de amônio e tendo um ânion inorgânico ou orgânico (baseado em hidrocarboneto). Exemplos desses sais incluem cloreto de sódio, cloreto de
15	amônio, citrato de sódio, citrato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato de amônio, fosfato de magnésio, fosfato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de amônio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de cálcio, etc. Sais preferidos neste contexto são cloretos ou sulfatos. O sal mais preferido é
20	cloreto de sódio.

O termo ligante cromatográfico multimodal refere-se a um ligante que é capaz de prover pelo menos dois sítios diferentes, mas cooperativos, que interagem com a proteína a ser ligada. Um destes sítios fornece um tipo atrativo de interação carga-carga entre o ligante e a substância de 25 interesse. O outro sítio tipicamente proporciona interação aceptor-doador de elétrons e/ou interações hidrofóbicas e/ou hidrofílicas. A presente invenção refere-se, particularmente a interações hidrofóbicas. Interações doadorasaceptoras de elétrons incluem interações como ligação de hidrogênio, .pi..pi., cátion-.pi., transferência de carga, dipolo-dipolo, dipolo induzido etc. Li30 gantes cromatográficos multimodais neste contexto ou em outro são também conhecidos como ligantes cromatográficos de “modo misto”.

O termo etapa de captura refere-se, no contexto de cromato15 grafia líquida, à etapa inicial de um procedimento de separação. Mais comumente, uma etapa de captura inclui clarificação, concentração, estabilização e uma purificação significativa de contaminantes solúveis. Após a etapa de captura, pode-se seguir uma purificação intermediária, que remove a maior parte das impurezas significativas incluindo DNA, vírus e endotoxinas.

Estas impurezas podem também ser removidas/reduzidas na captura.

O termo etapa de polimento refere-se a uma etapa final de purificação, em que contaminantes e impurezas traço são removidos e o produto é um produto biológico ativo. Contaminantes removidos durante a etapa

de polimento são frequentemente conformadores das moléculas-alvos ou produtos suspeitos de vazamento.

O termo “Volume de Coluna” conhecido na técnica da cromatografia refere-se ao volume geométrico da parte do tubo que contém o recheio. Na presente invenção, o volume de carga é superior a 50 volumes de coluna (CV) ou mais ou menos cerca de 300-600 CV ou 450-600 CV. A proteína eluída na etapa final de purificação é de cerca de 2-5 CV alcançando um volume de redução de cerca de 100 vezes a 350 vezes, como, por exemplo, 250 vezes.

O “fator de purificação” é definido como aumento na atividade 20 específica: isto é, U/mg de proteína antes da etapa de purificação comparada a U/mg de proteína após a etapa de purificação.

A atividade específica do fator VIII de coagulação pode ser testada por testes de atividade comercialmente disponíveis, como, por exemplo, usando CoaTest® Chromogenix® (Instrumentation Laboratory, Bélgica) de acordo com o protocolo do fabricante ou como descrito na seção de Experiências, abaixo.

O termo “método de etapa única” refere-se a um método de purificação da proteína Fator VIII contendo um ou mais contaminantes, em que o método alcança tanto uma redução no volume quanto um aumento na ati30 vidade específica (fator de purificação >1).

Em uma modalidade da presente invenção, o método provê (i) uma redução no volume de coluna de cerca de 250 vezes, e (ii) um “fator de purificação” de pelo menos 30 vezes.

A invenção é mais completamente entendida por referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos não devem, entretanto, ser considerados como restringindo o escopo da invenção.

Exemplos

A estrutura e bioquímica do fator VIII recombinante foram descritas anteriormente, (ver, por exemplo, Trends in Biotechnol. 1991, 9:353-359,

Transfus. Med. Rev. 1992, 6:235-246).

Além disso, isolamento do fator VIII, bem como produção de fa10 tor VIII (comprimento completo e variantes/formas truncadas) são descritos na técnica:

tecnologia de DNA recombinante permitiu construção de pias-,, mídeos que direcionam a expressão de produtos de fusão de proteína de Fator VIII em células transfectadas de mamífero. Produção recombinante de 15 Fator VIII em cultura de células é reportada por Wood et al (Ver Nature, 1984, 312:330-337). Variantes e análogos ativos de proteína Fator VIII e sequências de DNA que os codificam também foram reportados (US 4 868 112, EP 0 786 474, WO 86/06101, e WO 87/07144). Várias manipulações das sequências genéticas mostraram que o domínio B do Fator VIII não é 20 crítico para a atividade procoagulante e a proteína procoagulante ativa pode ser expressa expressando o Fator VIII- codificando a região de nucleotídeo em que falta o domínio B. Modificações importantes nessas variantes e análogos incluem aquela parte ou todo em que está faltando o domínio B e/ou em que as posições específicas de aminoácidos estão modificadas, por 25 exemplo, de modo que sítios normalmente labeis em protease são resistentes a proteólise, por exemplo, por trombina ou proteína C ativada. Outros análogos incluem modificações em um ou mais resíduos de lisina e/ou tirosina. A forma truncada da proteína é uma glicoproteína de 170 kDa consistindo em 1438 aminoácidos. Esta proteína com domínio B deletado é 30 uma modificação pós-translacional do fator VIII derivado de plasma e é comparável em sua atividade anti-hemofílica àquela do pai.

Ensaio de atividade do Fator VIII

Ensaios para estimativa da atividade biológica do fator VIII são bem conhecidos do especialista e esses ensaios são comercialmente disponíveis de vários fornecedores.

A atividade de Fator VIII purificado pode ser, por exemplo, testada usando CoaTest® Chromogenix® (Instrumentation Laboratory, Bélgica) de acordo com o protocolo do fabricante.

Exemplo 1

Produção recombinante de Fator VIII é bem conhecida na técni10 ca; referência pode, por exemplo, ser feita a US 5 633 150 (Genentech) e US 7 138 505 (Novo Nordisk/Novartis).

O Fator VIII recombinante foi expresso em células de CHO em, um meio isento de soro comercialmente disponível. A coleta de proteína da fermentação foi adicionalmente usada para a purificação.

Exemplo 2

Purificação de Fator VIII Recombinante

Resina Capto MMC (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi usada para a purificação da proteína recombinante. A coluna foi empacotada com uma altura de leito de 12cm e 24 ml de volume de leito.

Como uma primeira etapa, o processo de purificação envolveu carregamento em que a coleta da fermentação foi aplicada à coluna. O volume de coluna (CV) de carregamento foi de 450CV (Tabela 1). Seguiu-se passagem pela coluna de tampão de equilíbrio consistindo de 20mM imidazol, 10mM CaCh, 0,02% (v/v) Tween 80 e 50 mM NaCI. O pH do tampão de equilíbrio é ajustado a 7,5. A coluna é adicionalmente lavada com tampão de lavagem (20mM imidazol, 10mM CaCL, 0,02% (v/v) Tween 80 e 1,5M NaCI) em um pH equivalente ao do tampão de equilíbrio, i.e. 7,5. Os volumes de coluna das etapas de equilíbrio e lavagem foram de 3CV (Tabela 1).

Tabela 1. Volumes de Coluna (CV) usados em várias etapas da purificação de Fator VIII

Etapa	Tampão	Volume de coluna
Equilibração	Tampão de equilíbrio	3
Carregamento	Tampão de carga	450
Lavagem 1	Tampão de equilíbrio	3
Lavagem 2	Tampão de lavagem	3
Eluição	Tampão de eluição	5
CIP	CIP	3

Eluição foi realizada passando tampão de eluição pela coluna.

Tampão de eluição consiste de 20 mM imidazol, 10 mM CaCfe, 0,02% (v/v) 5 Tween 80 e 2,5M NaCl e 8M etileno glicol.

Vazão foi mantida a 450 cm/h em toda etapa de purificação exceto na de eluição e CIP durante as quais a vazão foi de 30cm/h.

Um cromatograma mostrando a absorção de UV a 280 nm em uma operação de purificação com equilibração, carregamento, lavagem e 10 eluição é fornecida na Figura 1.

Exemplo 3

Ensaio de atividade

A atividade de Fator VIII purificado foi medida usando uma modificação do ensaio de CoaTest® SP:

reagentes e solução tampão de estoque do kit CoaTest® SP foram utilizados. Todos os reagentes foram deixados atingir a temperatura ambiente antes do início do experimento. Amostras foram diluídas em tampão de ensaio CoaTest (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7,3, com conservante) a aproximadamente 2 mU/ml. O plasma de referência foi diluí20 do em tampão de ensaio a 5 - 0,5 mU/ml. As amostras foram diluídas em tampão de ensaio a 12 e 9 U/ml, e então 10 vezes em plasma deficiente em FVIII com VWF (Dade Behring), e finalmente 10 e 20 vezes em tampão de ensaio CoaTest® (resultando em 4 diluições por amostra). Cinquenta pl de amostras, padrões, e controle negativo de tampão foram adicionados a pla25 cas de microtítulo com 96 poços (Nunc) em duplicatas. O reagente fator I19

Xa/fator X, o reagente fosfolipídio e CaCh do kit CoaTest® SP foram misturados 5:1:3 (vol:vol:vol) e 75 pl desta mistura adicionados aos poços. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, 50 μΙ da mistura de substrato de fator Xa S-2765/inibidor de trombina 1-2581 foram adicionados e as rea5 ções incubadas durante 10 min à temperatura ambiente antes que 25 μΙ de ácido cítrico a 2% fosse adicionado. A absorbância a 415 nm foi medida em um leitor de placa de microtitulação Spectramax® (Molecular Devices) com absorbância a 620 nm usada como comprimento de onda de referência. O valor do controle negativo foi subtraído de toras as amostras e uma curva de 10 calibração preparada por regressão linear dos valores de absorbância plotada vs. concentração de FVIII em mU/ml.

Ensaio ELISA

Antígeno de Fator VIII foi determinado usando o kit comercial

ELISA da Affinity Biologicals (VisuLize Fator VIII Antigen Kit, Lot AG8-0006) 15 essencialmente como descrito pelo fabricante.

Fator VIII recombinante foi purificado da coleta de fermentação como descrito no Exemplo 2, acima. Fator de purificação e rendimento de proteína Fator VIII foram determinados por CoA e ELISA como descrito acima:

fator de purificação e rendimento (determinados por teste CoA)

(Tabela 2):

Rendimento total [%]	o o o	1,5	49,7
Fator de Purificação [X]	V		96
Atividade específica [U/mg]	55		5300
Proteína total [mg]	23221	23100	120,6
Proteína [mg/ml]	c\T	2,10	2,68
Atividade total [U]	1287000	19800	639180
Atividade [U/ml]	r-	00	14204
Volume [ml]	11000	11000	45
Etapa	Meio	Escoamento de captura	reservatório de Captura

Como pode ser visto dos resultados acima é possível concentrar meio contendo FVIII de 11000 ml para 45 ml (244 vezes) e ao mesmo tempo obter um aumento na atividade específica de 55 U/mg a 5300 U/mg, por exemplo, obter um fator de purificação de 96 vezes determinado por medição 5 de atividade.

Fator de purificação fator e rendimento (determinado por ELISA) (Tabela 3):

Rendimento [%]	100,0	OI CO	72,0
Fator de Purificação [X]			130
“Atividade específica [mg Fator VIIl/mg proteína total]	0,0046	00 OI O O o o“	0,6
Proteína total [mg]	23221	23100 i	120,6
Proteína [mg/ml]	OÍ	2,10	2,68
Proteína total de Fator VIII [mg]	106,7	6,6	76,8
Proteína Fator VIII [pg/ml]	9,7	0,6	1706
Vol. [ml]	o o o v	11000	45
Etapa	Meio	Escoamento de captura	reservatório de Captura

Como pode ser visto dos resultados acima é possível concentrar meio contendo FVIII de 11000 ml para 45 ml (244 vezes) e ao mesmo tempo obter um aumento na atividade específica de 0,0046 mg Fator Vlll/mg proteína total para 0,6 mg Fator Vlll/mg proteína total, por exemplo, obter um fator de purificação de 130 vezes determinado por ELISA.

Exemplo 4

Eletroforese em Gel de Proteína

Eletroforese em gel SDS foi realizada usando 7% NuPage® tris acetato gel com tris acetato como tampão contínuo essencialmente como 10 descrito pelo fabricante (Invitrogen). Em suma, a eletroforese em gel foi realizada por 50 min a 150 volts e as amostras foram coloridas com kit de coloração SilverQuest® (Invitrogen) como descrito nas instruções do fabricante.,. Os padrões de peso molecular (MW) usados foram Mark 12 da Invitrogen.

Os resultados mostrados na Figura 2 revelam um enriquecimen15 to muito alto do Fator VIII recombinante no reservatório de captura ilustrado pela presença de alta quantidade de bandas de cadeia pesada (HC) e de cadeia leve (LC) (indicadas pelas setas Figura 2).

Exemplo 5

Purificação visualizada por eletroforese em gel SDS

Amostras de proteína para eletroforese foram desnaturadas e reduzidas a 70 °C por 10 min em tampão de amostra LDS (Invitrogen) contendo 50 mM DTT. Géis de separação foram 7% tris-acetato (TA) gel PreCast Novex poliacrilamida (Invitrogen) e eletroforese foi realizada por 60 min em uma voltagem limitante de 150 V e com tampão tris-acetato (Invitrogen) 25 como tampão de anodo e cátodo. Coloração com prata foi realizada usando SilverQuest® (Invitrogen) de acordo com a descrição do fabricante.

O gel ilustra a grande purificação obtida usando a coluna de captura MMC. O meio da célula contém uma série de proteínas. A grande maioria destas proteínas passa pela coluna enquanto o Fator VIII é altamen30 te concentrado no reservatório de captura proveniente da coluna.

Exemplo 6

Condições de eluição

Várias condições de eluição foram testadas parta a resina Capto MMC. À coleta contendo Fator VIII recombinante, foram adicionados glicerol a 5% de concentração final e CHAPS a 5mM d. Equilibração foi realizada com tampão de equilíbrio de 20mM Imidazol, 10mM CaCI₂, Tween 80 (0,2%v/v), 50mM NaCI, 5mM CHAPS e 5% glicerol a pH 7,5.

Tampão de eluição de 20mM etanolamina, 10mM CaCI₂, Tween 80 (0,2%v/v), em pH 8,3 com diferentes concentrações de sal e etileno glicol foram usados, o que inclui : a. nenhuma adição; b. 1M NH4CI; c. 2,5M NH4CI; d. 3M etileno glicol; e. 1M NH₄CI + 3M etileno glicol; f. 2,5M NH₄CI + 3M etileno glicol; g. 8M etileno glicol; h. 1M NH4CI + 8M etileno glicol; I. 2,5M NH4CI + 8M etileno glicol; 2,5M NaCI + 8M etileno glicol. As condições de eluição foram determinadas com base no rendimento percentual. A Figura 3 mostra que em concentrações de 2,5M NH₄CI ou 2,5M NaCI e 8M etileno glicol, o rendimento percentual de proteína foi máximo (Figura 3).

Exemplo 7

Estabilidade a congelamento/descongelamento do reservatório de captura

Alíquotas do reservatório de captura, eluídas da resina Capto MMC como descrito no Exemplo 2, foram submetidas a vários ciclos de congelamento/descongelamento, com congelamento de um dia para o outro a 80 °C seguido por descongelamento a 4 °C no dia seguinte. A atividade do Fator VIII foi medida simultaneamente para todas as amostras usando ensaio CoA (CoaTest® Chromogenix®, como descrito no Exemplo 3) no final do experimento.

Tabela 4. Atividade específica do Fator VIII no reservatório de captura depois de repetidos ciclos de congelamento/descongelamento.

	Ciclo de congelamento/descongelamento 0	Ciclo de congelameto/descongelamento 1	Ciclo de congelamento/ descongelamento 2	Ciclo de congelameto/descongelamento 3
Atividade de FVIII (mU/ml)	2	2,2	1,9	2,3

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método de purificação de uma proteína Fator VIII de coagulação contendo um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

5 (a) pôr a proteína Fator VIII em contato com uma resina multimodal ou de modo misto contendo ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada;

(b) eluir a referida proteína Fator VIII com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, 10 propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons de cálcio.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente uma etapa (c) em que a solução contendo Fator VIII resultante da etapa (b) é coletada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de que inclui adicionalmente uma etapa (a1) em que a coluna, após a etapa (a) e antes da etapa (b), é atravessada por um ou mais tampões de lavagem.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um ou mais tampões de lavagem inclui(em) sal 10mM a

20 1000mM.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tampão de lavagem contém sal 0,5-0,8 M.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição da etapa (b) contém pelo

25 menos sal 2M e pelo menos 45% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição da etapa (b) contém sal 2,3-2,6 M e 48-52% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos.

30 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que o sal contido no tampão de eluição da etapa (b) é selecionado entre: NaCI, NH₄CI, KCI, (NFUhSCU, CH3CO2NH4, ou uma

mistura de dois ou mais deles. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido tampão de eluição contém NaCI e etileno glicol. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 5 fato de que o tampão de eluição contém íons cálcio em uma concentração de 1 mM a 100 mM. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 10, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada: (i) em um pH equivalente ao pH da solução de carregamento, 10 e/ou • (ii) sem ajuste de condutividade. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 11, caracterizado pelo fato de que a proteína Fator VIII é selecionado no grupo que consiste em: fator VIII de comprimento completo, FVIIkC, versões 15 com domínio B deletado de Fator VIII, derivados peguilados de Fator VIII, derivados polissialilados de Fator VIII, e suas combinações, preferivelmente versões com domínio B deletado de Fator VIII. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 112, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição da etapa (b) é com- • 20 posto de 20mM Imidazol, 10 mM CaCh, 0,02% (p/v) Tween 80, e 2,5M NaCI e 8M etileno glicol em pH de cerca de 7,5. 14. Método de etapa única de purificação de proteína Fator VIII contendo um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que inclui as etapas de: 25 a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal contendo os ligantes eu incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada; b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno gli- 30 col, ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio; em que o referido método obtém uma redução no volume de coluna de cerca de 250 vezes.

15. Método de etapa única de purificação de proteína Fator VIII contendo um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que inclui as etapas de:

a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal con5 tendo os ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada;

b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio;

10 em que o referido método obtém um “fator de purificação” de pelo menos 30 vezes.

16. Método para estabilização de proteína Fator VIII, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) pôr a proteína em contato com uma resina multimodal con15 tendo os ligantes que incluem uma parte hidrofóbica e uma parte negativamente carregada;

b) eluir a referida proteína com um tampão de eluição contendo pelo menos sal 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio.