CN102066417B - 提纯凝固因子viii的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用色谱法的提纯或浓缩凝固FVIII的方法，包括以下步骤：在具有高离子强度的水性溶液中提供含有FVIII的级分；使所述含有FVIII的级分与多模态树脂接触；任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了FVIII的多模态树脂；用水性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述洗脱缓冲液包含至少一种在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸；以及任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有FVIII的级分。

Description

提纯凝固因子VIII的方法
本发明涉及提纯凝固因子VIII(简称FVIII)的方法和通过本发明的方法获得的含有FVIII的级分。
背景技术
血友病是一种遗传性疾病，其降低人体控制血液凝结或凝固的能力。在其最普通的形式，血友病A中，凝固FVIII是缺失的，血友病A在5,000-10,000名男婴中约出现1例。FVIII蛋白质是血液凝固中具有多功能性质的重要协同因子。可以用FVIII的血浆源性浓缩液或用重组产生的FVIII来治疗FVIII的缺失。使用FVIII浓缩液的治疗已经使血友病患者过上了正常的生活。在历史上，已经使用源自人类血浆的FVIII来治疗血友病A。在血浆中，在正常条件下，FVIII分子通常与其协同因子、血管假性血友病因子(vonWillebrandtfactor)(vWf)有关，所述血管假性血友病因子使不同退化形式的FVIII分子稳定。
血浆源性FVIII产品以不同的纯度出现在市场上，并且存在或多或少量的vWf。通常，具有低含量vWf的产品含有附加的人血白蛋白和/或其他稳定剂(包括增加的盐浓度以使FVIII分子稳定)。提纯FVIII的方法通常是不同沉淀法与色谱法步骤的组合，所述沉淀法例如冷沉淀法、氢氧化铝沉淀法等，所述色谱法主要例如离子交换步骤、亲和过滤步骤和凝胶过滤步骤。
为了改善FVIII产品，使用亲合色谱法，亲合色谱法有效地去除污染物达到高度的FVIII纯度，包括同时降低vWf的可能性(Farrugia等，Biotechnologyandplasmafractionationindustry；TheimpactofadvancesintheproductionofcoagulationFVIII.Biotechnology，Vol.3，No.1，1993年2月)。免疫亲和色谱法的缺点在于其比较昂贵以及用作亲和配体的单克隆抗体源自动物。
在20世纪80年代中期，发生了与血浆源性FVIII产品有关的一些病毒传染。即使通过进行特定的病毒降低步骤解决了这一问题，这依然是开发重组FVIII产品(rFVIII)的出发点。在20世纪90年代，第一个rFVIII产品上市，到现在有三种不同的具有高纯度的(全部不含有vWf)rFVIII产品(两种全长分子和一种B-结构域剔除分子，在所述B-结构域剔除分子中FVIII分子的非活性部分被去除，从而增加宿主细胞的生产力(Eriksson等，ThemanufacturingprocessforB-domaindeletedrecombinantFVIII.SeminarsinHematology，Vol38，No2，Suppl.4(April)，20001：24-31页))。
用于提纯rFVIII的提纯方法都是不同色谱技术的组合(参见Bhattacharyya等，Reviewarticle；RecombinantFVIIIforHaemophilia“Anoverviewofproductiontechnologies”.CRIPSVol.4，No.3，2003年6月-9月)。一种方法是已知的免疫亲和技术(虽然有解决这一问题的产品，例如使用肽亲合力(Kelly等，DevelopmentandvalidationofanaffinitychromatographystepusingapeptideligandforcGMPproductionofFVIII)或像用于血浆FVIII一样使用的酵母源性抗体片段(VIIISelectFVIII亲和树脂-GEHealthcare公司，商品目录号17-5450正在进入市场)。
由于在所有rFVIII产品中都不含有vWf，因此必须采取特定的措施以使FVIII分子稳定而不丧失活性(聚集、蛋白酶、表面吸附等)。在这些产品中的一个中，加入了螯合剂(EDTA等)从而保护FVIII防止金属蛋白酶的退化(US-A-5,831,026)。为了增加rFVIII分子的稳定性，已经采取的方法有加入白蛋白、抑肽酶、胰岛素或甚至使rFVIII与vWf共表达(并在提纯周期后阶段将其去除)(参见Bhattacharyya等，Reviewarticle；RecombinantFVIIIforHaemophilia“Anoverviewofproductiontechnologies”.CRIPSVol.4，No.3，2003年7月-9月)。
在EP-A-1707634中描述了另一种方法(保持没有哺乳动物添加剂和螯合剂的方法)，其中增加的盐量的组合对rFVIII产品的稳定性和高回收率做出贡献(Wang等，CoagulationFVIII，structureandstability.InternationalJournalofPharmaceuticals，259(2003)，1-15.)。然而，这一技术具有特定的缺点。例如，较高的盐含量使得其不适于在不稀释的情况下直接用离子交换器处理(并可能不稳定化，Parti等，InvitrostabilityofrecombinantFVIII.Haemophilia(2000)，6，513-522.BiotechnologyandBioengineering，Vol.87，No.3，2004年8月5日.)。
WO-A-2009/007451公开了一种使用混合模态或多模态树脂的FVIII提纯方法。该提纯方法基于使FVIII蛋白质与含有配体的多模态或混合模态树脂接触，并用洗脱缓冲液洗脱所述FVIII蛋白质，所述配体包含疏水部分和带负电部分，所述洗脱缓冲液含有至少1.5M盐和至少40％(W/V)的乙二醇、丙二醇或其混合物以及钙离子。
EP-A-1707634公开了一种重组制备的蛋白质的分离方法，即通过各种方法，例如免疫亲和色谱法、亲和色谱法、蛋白质沉淀法、缓冲液交换法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法、混合模态疏水/离子交换色谱介质、螯合色谱法、糖亲和类凝集素或肝素亲和色谱法、尺寸排除色谱法、电泳、渗析，不同的沉淀剂，例如乙聚二醇、硫酸铵、乙醇，羟基磷灰石吸附、过滤膜吸附、与磁性颗粒结合的配体等。然而，其确定特殊的色谱提纯步骤。
WO-A-2005-082483公开了一种从液体中的一种或多种杂质中提纯抗体的方法，所述方法包括使所述液体与由支撑物构成的第一色谱树脂接触，在所述支撑物上固定有多模态配体从而使抗体吸附在树脂上，其中每种多模态配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳族环体系。加入洗脱液以使抗体从树脂中释放出来，并使洗出液与第二色谱树脂接触。
WO-A-2005/121163公开了一种从蛋白质溶液中分离一种或多种蛋白质的方法。所述方法包括提供蛋白质溶液的步骤，所述蛋白质溶液含有一种或多种特定蛋白质，并且具有预定的pH值和预定的离子强度或电导率，将蛋白质溶液应用到包含吸附剂的填充床或膨胀床色谱柱，和从色谱柱获得一种或多种蛋白质；其中所述蛋白质溶液用醇补充。
发明内容
本发明的一个目的在于通过提供新方法来避免现有技术中提纯方法的缺点。本发明的另一目的在于提供一种具体从具有高盐含量的原料中提纯FVIII的方法，特别是在重组FVIII的制造中使用它们时。
这通过采用色谱法的在提纯顺序中提纯凝固FVIII的方法来实现，其中至少一个色谱法使用多模态树脂来进行。本文所用术语“多模态树脂”是指具有支撑体和与支撑体结合的配体(moiety)的色谱材料，其中所述配体与待分离的物质的化学基团相互作用。在本发明的具体实施方案中，多模态树脂包含与基体结合的配体并且所述配体能够通过离子相互作用或诸如氢键和/或疏水作用的其他类型的相互作用来与混合物中的FVIII相互作用。
根据本发明，提供一种采用色谱法的提纯或浓缩凝固FVIII的方法，所述方法包括以下步骤：在具有高离子强度的水性溶液中提供含有FVIII的级分；使含有FVIII的级分与多模态树脂接触；任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附有FVIII的多模态树脂；通过水性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述洗脱缓冲液含有至少一种在pH值为6-8的条件下带正电的氨基酸；以及任选地收集提纯形式或浓缩形式的含有FVIII的级分。
多模态(或混合模态)色谱是一种提纯蛋白质的工具。例如，在GEHealthCare公司的制造商数据清单(11-0035-45AA)CaptoAdhere、GEHealthCare公司的制造商数据清单(28-9078-88AA)CaptoMMC和专利申请EP07114856.3“Aprocessfortheisolationandpurificationofatargetprotein，freeofprionproteins”中进行了描述。
这些技术具有某些的优点和缺点。与更常用的离子交换色谱相比，一个优点是在高盐浓度的条件下结合蛋白质的可能性。缺点在于洗脱通常包括比较苛刻的条件，例如低于或高于中性的pH值，单独或与其他洗脱参数组合。例如就中性值pH值6-8以外的pH值而言，而言，FVIII是相对不稳定的蛋白质(Wang等，CoagulationFVIII，structureandstability.InternationalJournalofPharmaceuticals，259(2003)，1-15)。本发明通过在中性附近pH范围的温和洗脱条件来解决这一问题，所述条件保持FVIII分子的活性并且使例如在EP-A-1707634中描述的与增加的盐浓度的稳定化作用组合的多模态色谱法的使用更容易。
根据本发明的一个实施方案，可以在色谱柱中进行所述多模态色谱法。这可以称为第一捕获步骤。本发明的方法还可以在分批模式下进行。本发明还使得在不加入人体或动物源性稳定剂的提纯方法变得容易，并使得没有其(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂)存在的整个方法的使用变得容易。特别是对于捕获步骤，与常规离子交换器相比，多模态树脂的使用还使高结合能力变得容易，这导致从该步骤中得到更加浓缩的产物洗出液，这有利于产物的稳定性。
本发明的方法通常涉及重组FVIII(FVIII)的提纯，所述重组FVIII特别是B-结构域剔除的重组FVIII。
通常FVIII溶液含有在高盐浓度溶液中的FVIII，所述高盐浓度溶液在25℃下电导率为约25至200mS/cm。
在本发明的另一个实施方案中，将FVIII应用于多模态树脂，并且在与多模态树脂结合之后，用合适的缓冲液洗脱。
在将含有FVIII和结合FVIII的混合物应用于多模态树脂之后，使用洗脱缓冲液将FVIII分子从多模态树脂洗脱，所述洗脱缓冲液含有至少一种在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸，所述在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸具体是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸。
另外，所述缓冲液可以含有至少一种含羟基的有机化合物，如醇；至少一种含氨基的有机化合物，如氨基酸；Ca2+离子源；至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐，例如特别是浓度≤1M的NaCl；非离子洗涤剂以及缓冲物质，所述缓冲物质将pH值调节为约6至约8，特别是调节至大约中性的值。
在本发明方法的另一实施方案中，所述醇可以选自甲醇、丙醇和乙二醇；所述氨基酸可以选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸；所述Ca2+离子源可以是CaCl2；所述无机盐可以选自KCl和NaCl；所述非离子洗涤剂可以选自Tween20、Tween80和PluronicF68；所述缓冲物质可以选自pH值在6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、HEPES、MES和乙酸钠。
具体而言，在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸的浓度为至少＞0.4M，特别是＞0.5M。如果使用浓度大于1M的特殊的氨基酸，则不会导致其他优点。典型地，精氨酸的量在约0.4M至约1.0M的范围内，特别是在约0.7M至0.9M的范围内。所述诸如醇的含羟基的有机化合物，例如乙二醇的量具体为0％(v/v)至30％(v/v)，特别是约5％至15％。钙离子浓度应当在0.0001M至约0.1M的范围内，特别是约0.001M至约0.03M。调节缓冲液的离子强度的化合物浓度应在提供25℃下约15至约200mS/cm电导率的范围内。非离子洗涤剂的量典型地在约0.001％至1％的范围内。
在本发明方法的实施方案中，对多模态树脂使用清洗缓冲液。其可以用于在释放FVIII之前将污染物洗去并保留FVIII。
在本发明方法的另一实施方案中，所述“多模态”色谱树脂含有以下基团中的至少一种：
i)带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体
ii)带负电的2-(苯甲酰胺基)丁酸配体，
iii)苯基丙基配体，
iv)正己基配体，
v)4-巯基-乙基-吡啶配体，
vi)3-((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配体或其组合。
具体而言，在本发明的方法中，所述“多模态”色谱树脂选自以下市售的树脂：HEPHypercelTM；PPAHypercelTM；CaptoAdhereTM；CaptoMMCTM；MEPHypercelTM。
在本发明方法的另一实施方案中，将所述多模态色谱法步骤与FVIII亲和色谱法步骤组合，其中亲和由蛋白质配体提供，所述蛋白质配体是例如在酵母中表达的抗体片段。
根据本发明的方法，提纯顺序还包括病原体移除/失活步骤，所述病原体移除/失活步骤包括基于化学方法的失活步骤、基于尺寸的移除步骤、色谱法步骤或其组合，这些步骤基于待移除病原体的不同生理性质。
在本发明方法的一个具体实施方案中，提纯顺序还包括以下步骤：
i.阴离子膜的使用，如SartobindQ，所述阴离子膜具体用于DNA削减；
ii.阳离子多模态树脂，如CaptoMMC；
iii.阳离子交换树脂，如SPSepharoseFF；
iv.第二阴离子膜的使用，如SartobindQ，所述第二阴离子膜具体用于进一步的DNA削减；
v.脂质包膜病毒的基于化学方法的失活步骤，特别是如EP-A-131740中描述的使用磷酸三正丁酯和TritonX-100的溶剂/洗涤剂失活；
vi.基于在酵母中表达的蛋白质配体的亲和树脂；如VIIISelect或阴离子多模态色谱树脂，如CaptoAdhere；
vii.使用约20nm的平均孔径的病原体过滤移除步骤，例如使用Planova20N；
viii.阴离子交换树脂，如QSepharoseFF；
ix.尺寸排除色谱树脂，如Superdex200pg。
具体而言，在本发明的方法中，阳离子交换步骤的洗脱条件基于Ca2+-离子，浓度在0.15-0.25M的范围内并且25℃下洗脱缓冲液的总电导率不增加25mS/cm。
如果采用本发明的方法，则在最终提纯步骤之后获得的产品的纯度＞4000IU/mg蛋白质，优选＞9000IU/mg蛋白质，并且更优选＞10000IU/mg蛋白质，并且DNA污染物＜1000pg/1000IUFVIII，优选＜100pg/1000IUFVIII，更优选＜10pg/1000IUFVIII。
因此，本发明还涉及组合物，所述组合物包含可通过本发明的方法获得的提纯的重组FVIII(不添加或使用任何人类或动物添加剂，例如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫亲和配体)。
附录1表示本发明方法的流程图，其中在多模态树脂上进行捕获步骤。通过加入盐来处理细胞悬液，分离细胞然后优选在Q膜上进行DNA削减步骤。所述Q膜(例如Sartorious公司的SartobindQ)是强碱性阴离子交换器，其具有作为阴离子交换基团的季铵基团。在特定的pH值和电导率范围内，所述Q膜与特定的DNA结合，而产物(和宿主细胞蛋白质)保留在通过的液流中。与常规离子交换柱色谱法相反，带电配体与膜支撑体结合，这提高了生产率并且易于使用。捕获步骤包括使用多模态树脂的本发明的方法。在捕获步骤之后用阳离子交换器SPSepharoseFFTM(GEHealtCare公司)进行分离，然后在Q膜上进行进一步DNA削减。进行例如在EP-A-131740中公开的通过溶剂洗涤剂法(S/D法)进行的病毒失活处理，并用例如VIIISelectTM亲和树脂进行进一步提纯。在阴离子交换柱上，例如在QSepharoseFFTM(GEHealtCare公司)上进行进一步浓缩/精制步骤。然后在凝胶过滤柱(例如Superdex200p.g.TM(GEHealtCare公司))上处理浓缩的产品，从而交换缓冲液并移除潜在的聚集体和片段。收集所得产物，所得产物为GF洗出液。在实施例中更详细地对各步骤进行解释。
附录2和附录3表示备选的实施方案，其中用多模态色谱，CaptoAdhereTM(GEHealtCare公司)代替如在附录1中描述的具体亲和步骤(VIIISelectTM(GEHealtCare公司))。出乎意料地，如在附录2中所描述的提纯顺序达到与在附录1中描述的提纯顺序(包括基于特定抗体的亲和步骤)相同的纯度。如附录3中所述，使用相同的起始物重复了这一结果。这表明，根据本发明，使用多模态提纯技术一次以上(在捕获步骤，CaptoMMCTM(GEHealtCare公司)中和在附录2和附录3中所描述的用CaptoAdhereTM(GEHealtCare公司)的其他后阶段提纯中)潜力巨大，所述多模态提纯技术使用特定的FVIII洗脱条件。
通过以下非限定性实施例进一步描述本发明。
实施例
在全部实施例中，M(摩尔)的实际值是mol/Kg(即，将10克盐加入到1000克水中，而不是向10克盐加水至1000mL)
实施例1：含有FVIII的细胞悬液的制备。
细胞
所使用的细胞系是人类胚胎肾细胞293(HEK293)的衍生物，所述细胞系适于无血清生长。在强启动子的控制下，用携带B-结构域剔除的人类FVIII基因的表达盒稳定地转染该宿主，HEK293F(EP-A-1739179)。
培养方法
在常用仪器中根据本领域熟知的常用方法将细胞在无血清基质中培养，例如以分批形式、间歇形式、灌注形式或连续恒化器培养形式在烧瓶、震荡瓶和生物反应器(一次性系统和常规搅拌罐)中的进行震荡或搅拌培养(Freshney，RI(2000)，Cultureofanimalcells：amanualofbasictechnique，4thed，Wiley-Liss；Spier，REed(2000)，Encyclopediaofcelltechnology，Wiley，NewYork；Enfors，S-OandL(2000)，Bioprocesstechnology：fundamentalsandapplications，RoyalInstituteofTechnology，Stockholm；Vinci，VAandParekh，SR(2003)，Handbookofindustrialcellculture：mammalian，microbial，andplantcells，HumanaPress，USA)。典型地，使用基质的灌注来提高细胞数量和产物效价，产物效价超过标准批次培养水平。产物收率和宿主细胞蛋白质的量随培养模式变化：
-产物浓度通常随着细胞数量的增加而增加
-总蛋白质含量和DNA含量通常随着细胞数量的增加而增加
-总蛋白质含量和DNA含量也可以随着培养时间的增加而增加
-分批培养积累蛋白质和DNA；不从外部加入任何物质，也不移除任何物质
-灌注过程将代谢物、蛋白质、DNA和其他杂质从细胞培养物中洗掉；
通常使用过滤器或细胞离心机来保留细胞。
由于重组产物与细胞有关，因此细胞悬液就是收取物。所述收取物的性质(上述的产物效价和杂质)根据采用的培养模式而变化。
实施例2：制备无细胞FVIII起始物
用于色谱提纯的无细胞FVIII起始物获得如下。向根据实施例1制备的细胞悬液中加入氯化钠和氯化钙的原液，使最终浓度分别为0.3M和30mM，使25℃下电导率为30-40mS/cm。将溶液混合约30分钟，通过离心将细胞移除之后进行过滤步骤，以除去任何残留的细胞碎片(以防止以下色谱柱步骤的堵塞)。
实施例3：多模态阳离子树脂CaptoMMC的洗脱条件
进行下面一系列试验来比较多模态阳离子树脂CaptoMMC的不同洗脱条件。
实施例3a，对从CaptoMMC树脂中洗脱FVIII的不同盐浓度和pH值的评价(参考例)。
色谱柱和树脂
在C10/20色谱柱(1色谱柱的体积(CV)＝8mL)中将CaptoMMC树脂填充至10cm的滤层高度。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317)。
起始物
使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以5mL/min的流量填充起始物。在这些缓冲条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表1中描述的不同洗脱条件并用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使用量的％。
表1
*包含0.01M的L-组氨酸、0.01M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80的洗脱缓冲液
**包含0.05M的L-组氨酸、0.05M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80的洗脱缓冲液
参考例3a的结论
在表1中可以看出，FVIII与CaptoMMC色谱柱的结合不是离子相互作用。
参考例3b，对CaptoMMC的洗脱条件的评价，不同的NaCl浓度，保持50％乙二醇恒定。
色谱柱和树脂
在XK16/20色谱柱(1色谱柱的体积(CV)＝4mL)中将CaptoMMC树脂填充至2cm的滤层高度。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317)。
起始物
使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以1mL/min的流量填充起始物。在这些缓冲条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表2中描述的不同洗脱条件并且用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使用量的％。
表2
*全部洗脱缓冲液都包含0.02M的L-组氨酸、0.02M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80
参考例3b的结论
在表2中可以看出，可以用乙二醇和NaCl的组合抑制FVIII与CaptoMMC色谱柱的结合。对于常规基于蛋白质的亲和树脂通常使用50％的乙二醇作为洗脱缓冲液。如果乙二醇与最高1.5M的提高的氯化钠浓度组合，则促进FVIII的洗脱。测试的两种不同的pH值(pH6.5和7.5)不改变FVIII的回收率，这表明在蛋白质的稳定性限度内(约6-8)，pH值不能用作FVIII的洗脱参数。将NaCl浓度提高至2.5M并没有提高在洗脱液中FVIII:C的回收率。
实施例3c，精氨酸作为CaptoMMC洗脱组分的变化
色谱柱和树脂
在Tricorn5/100色谱柱(1色谱柱的体积(CV)＝1.6mL)中将CaptoMMC树脂填充至8cm的滤层高度。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317-10)。
起始物
使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以0.6mL/min的流量填充起始物。在这些缓冲条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表3中描述的不同的连续洗脱条件(每个约10色谱柱体积)并用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使用量的％。
表3
洗脱条件* 在洗出液中检测到FVIII(％)
20％乙二醇 0
0.1M精氨酸+20％乙二醇 0
0.2M精氨酸+20％乙二醇 0
0.3M精氨酸+20％乙二醇 0
0.4M精氨酸+20％乙二醇 1
0.5M精氨酸+20％乙二醇 10
0.6M精氨酸+20％乙二醇 37
0.7M精氨酸+20％乙二醇 32
0.8M精氨酸+20％乙二醇 8
0.9M精氨酸+20％乙二醇 1
1.0M精氨酸+20％乙二醇 0
*全部洗脱缓冲液都包含0.01M的L-组氨酸、0.3M的NaCl、0.01M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
实施例3c的结论(根据本发明)
在表3中可以看出，FVIII与CaptoMMC色谱柱的结合出乎意料地可以被乙二醇和精氨酸的组合抑制。在含有最多0.9M精氨酸与20％(w/w)乙二醇的洗出液中观察到FVIII的洗脱。
实施例3d(根据本发明)，作为CaptoMMC的洗脱组分的精氨酸和赖氨酸的比较
色谱柱和树脂
在Tricorn50/100或C10/20色谱柱(1色谱柱的体积(CV)＝1.6-3mL)中将CaptoMMC树脂填充至4-8cm的滤层高度。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317)。
起始物
使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以表现为1-2分钟接触时间的流量填充起始物。在这些缓冲条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表4中描述的不同洗脱条件并用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使用量的％。
表4
*全部洗脱缓冲液都包含0.01M的L-组氨酸、0.3M的NaCl、0.01M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
实施例3d的结论(根据本发明)
在表4中可以看出，用与不同浓度的赖氨酸和精氨酸组合的20％的乙二醇研究了FVIII与CaptoMMC色谱柱的结合。精氨酸洗脱FVIII比赖氨酸更好，0.75M的浓度产生约90％的回收率。在用例如0.75M的精氨酸洗脱FVIII之前，似乎可以使用较低量的两种氨基酸中的一种与乙二醇组合，作为清洗步骤来将杂质从FVIII分子中移除。
实施例3e，对CaptoMMC树脂使用不同清洗和洗脱条件得到的纯度和回收率的评价。
色谱柱和树脂
以不同的色谱柱尺寸(2-9cm的滤层高度，1.6-48mL的体积)填充CaptoMMC树脂。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317)。
起始物
使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液，其典型的纯度为约100IUFVIII/mg蛋白质(如实施例9中表18所示)。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以合适的流量(根据色谱柱尺寸，约13-300cm/小时)填充起始物。在这些缓冲条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表5中描述的不同的连续清洗和洗脱条件并用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使用量的％。
表5
*全部洗脱缓冲液都包含0.01M的L-组氨酸、0.3M的NaCl、0.01M的CaCl2和0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
**用Bradford法检测
实施例3e的结论
在表5中可以看出，在洗脱缓冲液中使用更高浓度的精氨酸之前，在清洗步骤中的20％乙二醇和0.4M精氨酸的组合产生高收率和纯净产物，由于所得FVIII回收率较低的原因，在清洗缓冲液中精氨酸的浓度不应超过0.4M。
实施例3的结论
显然，不能使用常规离子交换器洗脱条件(高盐)或疏水作用树脂(低盐)来洗脱阳离子多模态树脂(CaptoMMC)。增加量的带电氨基酸单独使用，或者与乙二醇组合可以出乎意料惊讶地从CaptorMMC树脂中释放结合的FVIII分子。另外，可以在树脂的清洗和洗脱期间变化NaCl、精氨酸、赖氨酸和乙二醇浓度来优化CaptorMMC洗出液的回收率和纯度。
实施例4：多模态阴离子树脂CaptoAdhere的洗脱条件(对比)
进行下面一系列实验来对多模态阴离子树脂CaptoAdhere的不同洗脱条件进行评价。
色谱柱和树脂
在C10/20色谱柱中将CaptoAdhere树脂填充至13.5cm的滤层高度。所述CaptoAdhere树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5444)。
起始物
所使用的起始物是含有按照实施例6C中的描述获得的rFVIII的蛋白质溶液。
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率30±3mS/cm。
用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后填充起始物。然后使树脂经历如表6所示的不同洗脱条件并分析从色谱柱中洗出的FVIII的量。
表6
洗脱条件A
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率30±3mS/cm。
洗脱条件B(高盐)
0.05M的L-组氨酸，0.05M的CaCl2，2.0M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率140±5mS/cm。
洗脱条件C(低盐)
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率13±3mS/cm。
洗脱条件D(低氨基酸+低乙二醇)
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.3M的精氨酸盐酸盐、20％(w/w)的乙二醇、0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率28±3mS/cm。
洗脱条件E(氨基酸)
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.8M的精氨酸盐酸盐、0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率53±2mS/cm。
实施例4的结论
显然，不能使用常规离子交换器洗脱条件(高盐)或疏水作用树脂(低盐)来洗脱阴离子多模态树脂(CaptoAdhere)。增加量的带电氨基酸单独使用或与乙二醇组合可以出乎意料地释放FVIII分子。
实施例5，常规阳离子交换步骤(SPSepharoseFF)与作为提纯步骤(捕获步骤)的阳离子多模态树脂(CaptoMMC)的比较
色谱柱和树脂
在C10/20色谱柱(1色谱柱体积(CV)＝8.5mL)中将CaptoMMC树脂填充至11cm的滤层高度。所述CaptoMMC树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5317)。
在XK26/20色谱柱(1色谱柱体积(CV)＝100mL)中将SPSepharoseFF树脂填充至18cm的滤层高度。所述SPSepharoseFF树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-0729)。
起始物
所使用的起始物是含有按照实施例2中的描述获得的rFVIII的蛋白质溶液(在两个实验中使用相同的起始物)。对于SPSepharoseFF树脂，为了使FVIII能够结合，在对树脂应用之前，用稀释缓冲液将起始物稀释至12mS的电导率。
稀释缓冲液SP
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.07M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
平衡缓冲液MMC
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.3M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值7.0，25℃下电导率31±3mS/cm。
平衡缓冲液SP
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率12±2mS/cm。
用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后分别以5mL/min和40mL/min的流量填充起始物。在这些缓冲液条件下FVIII与树脂结合(在通过液流中未检测到FVIII)。然后使树脂经历不同的清洗和洗脱条件，对于CaptoMMC步骤，原则如实施例3d(清洗，0.75M的赖氨酸+20％的乙二醇)和实施例3b(洗脱，1.5M的NaCl+50％的乙二醇)中所述，对于SPSepharoseFF步骤，原则如实施例6b所述(清洗，0.15M的NaCl，洗脱，0.36M的NaCl)。在表7中可以研究两种提纯步骤之间的区别。
表7
*由未稀释的起始物计算
**用Bradford法检测
实施例5的结论(比较)
表7的结果表明，使用CaptoMMC步骤作为FVIII的捕获/提纯步骤具有若干优点，包括：
·更好的FVIII回收率
·就宿主细胞蛋白质而言，更高的纯度
·就DNA而言，更高的纯度
·更高的FVIII/mL树脂的结合能力
·更短的处理时间，因为较少的稀释(可以用更高的电导率处理MMC树脂)
实施例6，FVIII的特殊的洗脱(Ca)和清洗组分，以及用阳离子交换树脂(SPSepharoseFF)的FVIII提纯(对比)
进行下面一系列实验来评价SPSepharoseFF树脂的不同洗脱条件。
实施例6a，氯化钠和精氨酸作为对阳离子交换树脂(SPSepharoseFF)使用的特殊洗脱和清洗组分。
色谱柱和树脂
在XK16色谱柱中将SPSepharoseFF树脂填充至15cm的滤层高度。所述SPSepharoseFF树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-0729)。
起始物
所使用的起始物是按照实施例2中的描述获得的并且按照实施例9中的描述用CaptoMMC树脂进一步处理的含有rFVIII的蛋白质溶液。使用稀释缓冲液将得自CaptoMMC色谱柱的洗出液稀释12倍来将电导率降低至约12mS/cm，这使得目标蛋白质可以与SPSepharoseFF树脂结合。
稀释缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.07M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率12±2mS/cm。
用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后填充起始物。然后使树脂经历如表8所述的不同洗脱条件并分析从色谱柱中脱离的FVIII所得量。
表8
na-未分析
**用Bradford法检测
清洗A
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.15M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率16.5-18.0mS/cm。
洗脱缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.035M的CaCl2，0.34M的NaCl，0.2M的D-山梨醇、0.045M的精氨酸盐酸盐、0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率36±2mS/cm。
实施例6a的结论(比较)
当使用具有36mS/cm的电导率的洗脱缓冲液时，可以将结合的FVIII有效地从SPSepharoseFF色谱柱上洗脱。这一导电率是NaCl浓度的作用和CaCl2与精氨酸浓度的部分作用。在缓冲液中包含山梨醇和精氨酸是为了在处理、冷冻和解冻期间使FVIII分子稳定。
实施例6b，氯化钠作为对阳离子交换树脂(SPSepharoseFF)使用的特殊洗脱和清洗组分。
色谱柱和树脂
在C10/20色谱柱中将SPSepharoseFF树脂填充至15cm的滤层高度。所述SPSepharoseFF树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-0729)。
起始物
所使用的起始物是按照实施例2和实施例9中的描述获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。使用稀释缓冲液将得自CaptoMMC色谱柱的洗出液稀释12倍来降低电导率，这使得目标蛋白质可以与SPSepharoseFF树脂结合。
稀释缓冲液
0.01M-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.01M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
平衡缓冲液
0.01M-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率12±2mS/cm。
用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后填充起始物。然后使树脂经历如表9所述的不同洗脱条件并分析从色谱柱中脱离的FVIII所得量。
表9
**用Bradford法检测
清洗B
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.15M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率16.5-18.0mS/cm。
洗脱缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.035M的CaCl2，0.36M的NaCl，0.2M的D-山梨醇、0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率36±2mS/cm。
实施例6b的结论
使用具有36mS/cm的电导率的洗脱缓冲液。与实验5a中使用的洗脱缓冲液相比，未加入精氨酸，并且通过加入稍微高一些的NaCl浓度来将电导率调节到36mS/cm。洗脱FVIII的百分比比实验5a中的稍微低一些，这表明精氨酸在该方法中具有积极的作用。
实施例6c，氯化钙作为对阳离子交换树脂(SPSepharoseFF)使用的特殊洗脱和清洗组分。
色谱柱和树脂
在XK26色谱柱中将SPSepharoseFF树脂填充至15.5cm的滤层高度。所述SPSepharoseFF树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-0729)。
起始物
所使用的起始物是按照实施例2和实施例9中的描述获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。使用稀释缓冲液将得自CaptoMMC色谱柱的洗出液稀释12倍来降低电导率，这使得目标蛋白质可以与SPSepharoseFF树脂结合。
稀释缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.05M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5
平衡缓冲液
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率12±2mS/cm。
用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后填充起始物。然后使树脂经历如表10所述的不同洗脱条件并分析从色谱柱中脱离的FVIII所得量。
表10
**用Bradford法检测
清洗B
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.15M的NaCl，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率16.5-18.0mS/cm。
清洗C(山梨醇)
0.01M的L-组氨酸，0.01M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.2M的D-山梨醇，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率12±2mS/cm。
洗脱缓冲液(氯化钙)
0.02M的L-组氨酸，0.2M的CaCl2，0.1M的NaCl，0.2M的D-山梨醇、0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值6.5，25℃下电导率18.7(18.0-19.0)mS/cm。
实施例6c(6a，6b)的结论
在该实验(6c)中，降低了洗脱缓冲液中NaCl浓度并使用了更高的CaCl2浓度。这一变化导致了18.7mS/cm的电导率。从SPSepharoseFF上洗脱FVIII的能力与在实验5a中一样好，在实验5a中洗脱缓冲液的电导率为36mS/cm。未预料到的发现是使用具有几乎一半导电性的洗脱缓冲液，FVIII回收率相同或更好。在离子交换色谱法中，通常，蛋白质的洗脱强烈依赖于电导率(离子强度)或/和pH值。在本实施例中，似乎Ca2+对FVIII分子具有特殊的作用，而不是仅仅对离子强度起作用。这还被纯度证实了，当使用具有低电导率的基于Ca的洗脱时纯度更高(2811，分别与6a和6b中的362和948相比)。
实施例7，使用酵母源性FVIII亲和配体提纯。
进行以下实验来评价亲和树脂VIIISelect的洗脱条件。
色谱柱和树脂
用FVIIISelect树脂将C10/20色谱柱填充至7cm的滤层高度。所述FVIIISelect树脂购自GEHealthcare公司(商品目录号17-5450)。
起始物
所使用的起始物是对于SPSepharoseFF步骤(清洗，0.15M的NaCl，洗脱，0.36M的NaCl)按照实施例6b中描述的原则获得的含有rFVIII的SPSepharose洗出液。
缓冲液组成：
缓冲液A(加入S/D化合物的平衡缓冲液)
0.3mol/kg的NaCl，0.02mol/kg的CaCl2(2xH2O)，0.02mol/kg的L-组氨酸，1％(w/w)的TritonX-100，0.3％(w/w)TNBP，pH值：6.5±0.1，电导率：+25℃下31±3mS/cm
清洗B(不含有S/D化合物的平衡缓冲液)
0.3mol/kg的NaCl，0.02mol/kg的CaCl2，0.02mol/kg的L-组氨酸，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值：6.5±0.1，电导率：+25℃下31±3mS/cm。
清洗C(高盐浓度清洗缓冲液)
1.0mol/kg的NaCl，0.02mol/kg的CaCl2，0.02mol/kg的L-组氨酸，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，pH值：6.5±0.1，电导率：+25℃下85±3mS/cm。
缓冲液D(洗脱缓冲液)
1.5mol/kg的NaCl，0.02mol/kg的CaCl2，0.02mol/kg的L-组氨酸，0.02％(w/w)的聚山梨酯80，50％(w/w)的乙二醇(EG)，pH值：6.5±0.1，电导率：+25℃下39±3mS/cm。
平衡缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液不限于所述的pH值、浓度以及缓冲液类型、盐的类型或洗涤剂的类型。
使用平衡缓冲液A平衡色谱柱，然后填充起始物。然后使树脂经历如表11中描述的不同清洗和洗脱条件并分析脱离色谱柱的FVIII的所得量。
表11VIIISelect实验中得到的结果
*用Bradford法检测
图1是银染色的SDS-PAGE，其表示起始物的纯度信息(泳道1)和亲和色谱法步骤之后的VIIIselect洗出液的纯度信息(泳道2)。
实施例7的结论
VIIISelect步骤是产生纯净洗出液的强大提纯步骤。
实施例8，使用VIIISelect亲和树脂的提纯顺序或使用多模态树脂(CaptoAdhere)的提纯顺序的比较(附录3)。
根据实施例7(VIIISelect)和实施例10(CaptoAdhere)以小比例进行两种不同的提纯方案
表12通过使用FVIIISelect或CaptoAdhere提纯步骤进行FVIII回收率和纯度的比较
n.a.＝未分析
*用Bradford法检测
**用氨基酸分析法检测
图2表示表12中描述的样品的SDSPage银染色；VIIISelect提纯方案与CaptoAdhere提纯方案的比较。
泳道1表示在以483IU/ml的FVIII浓度填充VIIISelect色谱柱之前的起始物(SP-滤液)的纯度。
泳道2表示以500IU/ml的FVIII浓度填充的VIIISelect洗出液的纯度，。
泳道3表示在提纯顺序SP-VIIISelect-QSeph之后的纯度，以500IU/ml的FVIII浓度填充。
泳道4表示在提纯顺序SP-VIIISelect-QSeph-凝胶过滤之后的纯度，以385IU/ml的FVIII浓度填充。
泳道5表示在以493IU/ml的FVIII浓度填充的CaptoAdhere色谱柱之前的起始物(SP-滤液)纯度。
泳道6表示CaptoAdhere的洗出液的纯度，以500IU/ml的FVIII浓度填充。
泳道7表示在提纯顺序SP-CaptoAdhere-QSeph之后的纯度，以500IU/ml的FVIII浓度填充。
泳道8表示在提纯顺序SP-CaptoAdhere-QSeph-凝胶过滤之后的纯度，以493IU/ml的FVIII浓度填充。
泳道9表示分子标记
实施例8的结论
如果比较最终产物(GF洗出液)的纯度，则可以通过使用VIIISelect亲和步骤或通过CaptoAdhere色谱法步骤来获得相同的纯度。在VIIISelect步骤之后的纯度比CaptoAdhere步骤之后的纯度更高，但是在剩余的提纯步骤(Q和GF)中，通过使用的分析方法检测不到纯度的差别。使用CaptoAdhere步骤的回收率比使用VIIISelect的提纯顺序稍微高一些。
实施例9：包括VIIISelect亲和树脂的工业规模提纯顺序
为了研究回收率和纯度的可再现性，将以下描述的提纯步骤1-9以中试规模进行3-4批次。每批次由40-100L实施例1-2中描述的细胞悬液开始。
步骤1DNA削减步骤No.1(阴离子色谱法)
通过Q-膜(SartobindQ，Sartorious公司)过滤完成DNA的初级削减。在过滤之前用缓冲液平衡Q-膜(表13)。
表13用于Q-膜的缓冲液
通过Q-膜处理细胞滤液(得自实施例2)并收集含有产物的通过液流。用平衡缓冲液清洗膜来回收残留在膜上的FVIII。
步骤2捕获步骤(多模态色谱法，CaptoMMC)
以500-10,000IU的FVIII/ml的多模态阳离子交换色谱(CaptoMMC)凝胶进行初级产物提纯和浓缩(捕获)。在产物应用之前用CaptoMMC平衡缓冲液平衡凝胶。将得自步骤1的滤液加入到CaptoMMC色谱柱中，然后用CaptoMMC平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后依次用清洗缓冲液1-3清洗色谱柱，之后进行FVIII的洗脱，如表14中所述。
表14
步骤3阳离子交换色谱法，SPSepharoseFF
使用SP-SepharoseFF凝胶(GEHealthcare公司，商品目录号17-0729)将得自步骤2的含有FVIII的溶液(CaptoMMC洗出液)进一步提纯。在产物应用之前，使用SP-Sepharose平衡缓冲液平衡色谱柱，并稀释蛋白质溶液以满足平衡缓冲液的离子强度和pH值，从而使FVIII能与凝胶结合。将稀释的蛋白质溶液应用于SPSepharose色谱柱，之后用平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用清洗缓冲液清洗色谱柱，之后进行FVIII的洗脱，如表15中所述。
表15用于阳离子交换色谱法的缓冲液
步骤4DNA削减步骤No.2(阴离子色谱法)
通过Q-膜(SartobindQ，Sartorious公司)过滤来完成DNA的第二削减。在过滤之前用缓冲液平衡Q-膜(表16)。
表16用于Q膜的缓冲液
通过Q-膜过滤得自步骤3的SP-洗出液，收集含有产物的通过液流以进行进一步的处理。用平衡缓冲液清洗所述膜来回收残留在膜中的FVIII。
步骤5病毒失活(溶剂/洗涤剂(S/D)处理)
通过使用1％的TrionX-100和0.3％的磷酸三正丁酯(TNBP)的S/D(溶剂/洗涤剂)处理对得自步骤4的滤液进行病毒失活。病毒失活在室温搅拌下进行约1小时。
步骤6使用酵母源性亲和色谱树脂的提纯
根据实施例7中的描述通过VIIISelect亲和色谱柱处理得自步骤5的病毒失活的FVIII溶液。每mL树脂填充约5-20,000IUFVIII。
步骤7纳米过滤
为了去除潜在的外源因子，如无包膜病毒，使用Planova20N纳米过滤器(AsahiKaseiMedical公司)对得自步骤6的VIIISelect洗出液进行纳米过滤。收集含有产物的通过液流。
步骤8阴离子交换色谱法步骤(Q-SepharoseFF)
QSepharoseFF树脂购自GEHealthcare公司(产品目录号17-0510)。使用的起始物是得自步骤7的纳米过滤液，但是将盐和pH调节至与表17中的平衡缓冲液相当。以5,000-25,000IU/mL凝胶的填充量对QSepharoseFF色谱柱应用稀释的蛋白质溶液，然后用平衡缓冲液冲洗色谱柱，之后用清洗缓冲液清洗色谱柱，然后进行FVIII的洗脱，如表17中所述。
表17用于阴离子交换步骤的缓冲液(Q-SepharoseFF)
步骤9凝胶过滤色谱法步骤
将凝胶过滤树脂(Superdex200pg，GEHealthcare公司，商品目录号17-1043)填充至60-75cm的滤层高度。使用的起始物是得自步骤8的Q-洗出液。用生理可接受组合物平衡色谱柱，所述组合物保护产物防止表面吸附，并使其在冷冻、存储、冷冻干燥等期间稳定。将Q-洗出液以总色谱柱体积的2-8％的体积应用于凝胶过滤色谱柱。在色谱柱之后收集所调制的含有FVIII的洗出液(GF-洗出液)，所述FVIII不含有碎片和聚集体。
表18，在步骤1-4中描述的提纯步骤中的结果总结，4个中试规模提纯批次(源自约50L(BPP077-078)和100L(BPP080-081)细胞悬浮物(描述于实施例1))的总结。
*用Bradford法检测
捕获收集批次BPP077和BPP078汇集在后阶段提纯批次BPP079，而批次BPP080用BPP083表示，批次BPP081用BPP084表示。
表19，在3个中试规模的提纯批次的后阶段部分中的步骤5-9中描述的色谱法步骤的结果总结。
*在Q步骤期间计算的收率，**在GF步骤期间计算的收率，***用Bradford检测，****用氨基酸分析法检测
图3表示根据实施例9进行提纯(表18-表19)的在配制之前(泳道3-BPP083，泳道7-BPP084)和之后(泳道6-C810A139，泳道8-C811A139)的最终产物的SDS-PAGE银染色图案。泳道2表示分子标记，泳道3表示FVIII对比样，泳道4表示市售的FVIII产品(ReFacto-LotC66202)。
图4表示使用多克隆抗人FVIII抗体的FVIII的蛋白质印迹法。泳道1和泳道10是空的，泳道2表示分子质量标样(Bio-rad公司的PrecisionPlusProteinWesternC)，泳道3表示市售的FVIII产品ReFactolotC66202，泳道4-6表示FVIII对比样，泳道7-9表示根据实施例9提纯的(表17-18)批次BPP079、BPP083和BPP084的最终配制的产物。在应用于蛋白质印迹法之前将样品稀释至5IUFVIII:C/ml的FVIII浓度。
图5表示根据实施例9提纯的(表17-18)批次BPP079和BPP083的最终配制产物以及批次BPP079GF洗出液和BPP083GF洗出液的最终产物(GF洗出液)的银染色和蛋白质印迹法后的2-D-PAGE。使用市售的FVIII产品(ReFacto，Lot70591)作为参照。左窗口：使用BPP079和BPP083GF-洗出液以及ReFacto的凝胶的银染色图像。右窗口：使用BPP083GF-洗出液和ReFacto的蛋白质印迹法图像。
实施例9的结论
在某种程度上，所述提纯方法可以以工业规模进行，所述方法就回收率、纯度和产物质量而言是可再现的。另外，所述方法满足了能使用该产品治疗人体的高纯度要求。
实施例10：不使用特殊亲和配体的(而是使用阴离子多模态树脂，CaptoAdhere)工业规模提纯顺序
为了研究回收率和纯度的可再现性，以中试规模对两个批次(BPP068-069)进行实施例9中描述的提纯步骤2-3(CaptoMMC和SPSepharoseFF)和步骤5(病毒失活)。然后将这两个批次汇集为一个后阶段批次(BPP071)，并根据实施例9中的步骤6-9进行处理，其中用阴离子交换多模态色谱法步骤(CaptoAdhere)代替步骤6(VIIISelect凝胶)。可以研究在附录2中的整个提纯顺序。每个批次(BPP068-069)源自约50L如实施例1-2中描述的细胞悬液。
CaptoAdhere步骤
在5,000-10,000IUFVIII/mL树脂的范围填充阴离子交换多模态色谱柱(CaptoAdhere，GEHealthcare公司，产品目录号17-5444)。在应用产物之前，用平衡缓冲液平衡凝胶。向CaptoAdhere色谱柱填充病毒失活的溶液(如实施例9中所述，步骤5)，然后用平衡缓冲液冲洗色谱柱并依次用清洗缓冲液1-3清洗色谱柱，然后进行FVIII的洗脱，如表20中所述
表20
表21，两个中试规模提纯批次中的两个第一色谱法步骤(根据实施例9，步骤2-3)的结果总结
1)SP步骤期间计算的收率
*用Bradford法检测
表22，在一个中试规模提纯批次的后阶段部分中的色谱法步骤(步骤5-实施例9，CaptoAdhere，步骤8-9-实施例9)的结果总结。
2)在CaptoAdhere步骤期间计算的收率
3)在QSepharose步骤期间计算的收率
4)在凝胶过滤步骤期间计算的收率
*用Bradford法检测
图6表示得自根据实施例10提纯的中试规模批次BPP071的样品的SDS-PAGE银染色凝胶。泳道1表示市售的FVIII产品(ReFacto)。泳道2表示在步骤之前的起始物(SP过滤液)。泳道3表示CaptoAdhere洗出液的纯度信息。泳道4表示在提纯顺序SP过滤液-CaptoAdhere-QSeph之后的纯度。泳道5表示在提纯顺序SP过滤液-CaptoAdhere-QSeph-凝胶过滤之后的纯度。
图7表示得自根据实施例10提纯的中试规模批次BPP071的样品的蛋白质印迹法凝胶。泳道1表示市售的FVIII产品(ReFacto)。泳道2表示CaptoAdhere洗出液。泳道3表示提纯顺序SP过滤液-CaptoAdhere-QSeph的结果。泳道4表示在提纯顺序SP过滤液-CaptoAdhere-QSeph-凝胶过滤之后的结果。
实施例10的结论
包括代替VIIISelect亲和配体的多模态色谱步骤(CaptoAdhere)的中试规模的提纯方法在最终GF洗出液中显示出相同的回收率、纯度和产物质量。
分析方法的描述
FVIII:C，基于Coatest的筛选法
该方法基于两阶段原则，使用微平板技术进行。在阶段1中，通过内源性途径产生活化因子X(Xa)，其中FVIII:C起协同因子的作用。在阶段2中，通过在凝血酶抑制剂I-2581的存在下使用合成显色底物S-2222来检测因子Xa，凝血酶抑制剂是为了防止底物被凝血酶水解。使用酸终止反应，相对于空白试剂在405nm下光度测定VIII:C活性，VIII:C活性与pNA(对硝基苯胺)的释放成正比。
该方法符合欧洲药典的要求。FVIII:C的单位用如在世界卫生组织(WHO)建立的现行国际浓缩物标准(IS)中所定义的国际单位(IU)表示。已经证明使用含有1％BSA的缓冲液代替严重血友病患者血浆的预稀释方案是有效的。另外参见参考文献(EuropeanPharmacopoeiaSupplement2000，generalMethods，2.7.4.AssayofBloodCoagulationFVIII；RosénS(1984)AssayofFVIII:CwithaChromogenicSubstrate.J，Haematol，Suppl40，vol33，139-145，1984；G，OswaldssonU，RosénS(1987)AsimpleandaccuratemicroplateassayforthedeterminationofFVIIIactivity.ThrombosisResearch47；5-14，1987；Mire-SluisAR，GerrardT，GainesdasR，PadillaAandThorpeR.Biologicalassays：TheirRoleinthedevelopmentandqualityControlofRecombinantBiologicalMedicinalProducts.Biological，24，351-362(1996))。
根据Bradford法的总蛋白质测定
根据Bradford法的蛋白质测定建立在观察到当发生与蛋白质结合时考马斯亮蓝G-250酸性溶液的最大吸光度从465nm移动到595nm的基础上。疏水和离子作用都使染料的阴离子形式稳定，这导致可见的颜色变化。该测定法是有用的，因为在10倍的浓度范围内染料-白蛋白配合物溶液的消光系数是恒定的。其他信息请另外参见文献Bradford，MM.Arapidandsensitivemethodforthequantisationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry72：248-254.1976。
根据氨基酸分析法的总蛋白质的测定(AAA法)
在AAA法之前，用6MHCl在110℃下将全部蛋白质水解24h。通过基于磺化聚苯乙烯树脂的阳离子交换色谱法分离氨基酸，并在洗脱液中连续地检测氨基酸。所述检测基于后柱茚三酮衍生法，所述后柱茚三酮衍生法使用双光度计同时在440nm检测脯氨酸盐与羟基脯氨酸盐和在570nm下检测所有其他氨基酸。在AAA期间将氨基酸天冬氨酸盐和谷氨酸盐都脱酰胺化，并且分别测定为天冬氨酸和谷氨酸。因此，在初始样品中，天冬氨酸和谷氨酸的结果分别代表天冬氨酸/天冬氨酸盐(Asx)和谷氨酸/谷氨酸盐(Glx)的总量。使用该方法，色氨酸不产生明显的反应，因此，不通过AAA定量色氨酸。半胱氨酸在水解期间被破坏，不定量半胱氨酸。在参考文献中进一步描述了AAA：TotalproteinAAAanalyticalmethod.Spackman，D.H.，Stein，W.H.，和Moore，S.(1958)Anal.Biochem.30：1190-1206。
纯度或比活性(FVIII:C/总蛋白质)
例如，通过用得自FVIII:C分析的值除以得自总蛋白质分析的值计算纯度(或也称为比活性)。
SDS-PAGE(分子量分布)
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)涉及根据蛋白质的尺寸将蛋白质分离。本方法描述了蛋白质的SDS-PAGE，所述SDS-PAGE在还原条件下运行。通过在变性和还原条件下加热样品，蛋白质变成伸直的并且覆盖着阴离子洗涤剂十二烷基磺酸钠(SDS)，获得与多肽链的长度成正比的高净负电荷。当被填充到聚丙烯酰胺凝胶基体中并且置于电场中时，带负电的蛋白质分子向带正电的电极移动并通过分子筛分作用分开，即通过它们的分子质量分开。聚丙烯酰胺凝胶限制较大分子使其不能和较小分子运动的一样快。因为在SDS变性的多肽中电荷与质量的比值几乎是相同的，蛋白质的最终分离几乎全部取决于多肽的相对分子质量的差别。在密度均匀的凝胶中蛋白质的相对运动距离(Rf)与蛋白质的质量的对数(log)值成反比。如果已知质量的蛋白质与未知的蛋白质同时运动，则可以测定Rf与质量之间的关系，并且可以估算未知蛋白质的质量。用银染色来使通过电泳分离的蛋白质带显影。通过判断标样、参照(对照样)和分析样的外观来直观地进行评价。
DNA分析方法(定量聚合酶链反应，qPCR)
该测定法是基于SYBRGreen1化学法的实时定量PCR(qpCR)测定法。其基于Umetani等的出版物，并增加了一些改进(UmetaniN，KimJ，HiramatzuS，ReberHA，HinesOJ，BilchikAJ和HoonDSB.IncreasedIntegrityofFreeCirculatingDNAinSeraofPatientswithColorectalorPeriampullaryCancer：DirectQuantitativePCRforALURepeats.ClinChem2006；52：1062-1069)。在每个PCR循环期间，ALU序列族的115碱基对片段被引物放大，所述引物是ALU115-F和ALU115-R。高度富ALU序列族被限制在人科(Hominidae)(黑猩猩、大猩猩、人类和猩猩)的基因组上，但是该测定法仅放大源自人类的DNA。该过程允许无细胞组织培养基中残余HEK293FDNA的高通过量分析及其后阶段提纯方法。
蛋白质印迹法，FVIII分子质量分布
根据分子质量通过还原条件下的十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来分离在FVIII制备中的蛋白质和肽。然后蛋白质从凝胶基体被电泳转移至硝化纤维素膜，然后用封闭剂培养。加入针对整个FVIII分子的多克隆绵羊抗体，然后加入针对山羊/绵羊抗体的Fc部分的第二抗体。作为第三步，加入山羊抗体与辣根过氧化物酶(HRP)的可溶性配合物和HRP。然后通过在用底物4-氯-1-萘酚培养之后蓝带的出现来检测FVIII多肽。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DPAGE)
为了研究人类-clrhFVIII的蛋白质链的电泳带图案，进行2-DPAGE。进行等电位聚焦作为使用pH值3至10的线性pH值梯度的第一维度运行。使用聚丙烯酰胺梯度(1-8％)凝胶运行第二维度SDS-PAGE。在第二维度运行之后使用银染色法将凝胶染色或者使凝胶经历蛋白质印迹法(O′FarrellPH(1975)Highresolutiontwo-dimensionalelectrophoresisofproteins.JBiolChem250：4007-4021)。

Claims (15)

1.一种使用色谱法提纯或浓缩凝固FVIII的方法，包括以下步骤：
-在具有高离子强度的水溶液中提供含有FVIII的级分；
-使所述含有FVIII的级分与多模态树脂接触；
-任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了FVIII的多模态树脂；
-用水性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述水性洗脱缓冲液包含至少一种在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸，在pH值6至8的条件下带正电的所述氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸及其组合，所述氨基酸的浓度为＞0.4M，所述水性洗脱缓冲液还包含至少一种含有羟基的有机化合物；至少一种含有氨基的有机化合物；至少一种Ca2+离子源；至少一种调节缓冲液离子强度的化合物；至少一种非离子洗涤剂；以及至少一种将pH值调节为6至8的缓冲物质；所述含有羟基的有机化合物为醇；所述含有氨基的有机化合物为氨基酸；所述调节缓冲液离子强度的化合物为无机盐；所述醇选自甲醇、丙醇、乙二醇和丙二醇；所述Ca2+离子源是CaCl2；所述无机盐选自KCl和NaCl；所述非离子洗涤剂选自Tween20、Tween80和PluronicF68；所述缓冲物质选自pH值在6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、HEPES、MES和乙酸钠；以及
-任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有FVIII的级分，
其中所述多模态树脂包含与基体结合的基团，并且所述基团可以在水性环境中通过离子相互作用、氢键和疏水作用来与FVIII相互作用，“多模态”色谱树脂选自：
a.CaptoAdhere，
b.CaptoMMC，及其组合；
其中将所述清洗缓冲液应用于所述多模态树脂，来在FVIII被释放之前清洗掉污染物并保留FVIII。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FVIII是重组FVIII。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述水性溶液包含在高盐溶液中的FVIII，所述高盐溶液在25℃下的电导率为25至200mS/cm。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的浓度为＞0.5M。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，多模态色谱法步骤与FVIII亲和色谱法步骤组合，其中通过基于在酵母中表达的蛋白质的配体提供亲和力。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，提纯顺序还包括病原体移除/失活步骤，所述病原体移除/失活步骤包括基于化学法的失活步骤、基于尺寸的移除步骤、色谱法步骤或其结合，这些步骤基于待移除的病原体的生理性质。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，提纯顺序还包括以下步骤：
i.阴离子膜；
ii.阳离子多模态树脂；
iii.阳离子交换树脂；
iv.阴离子膜；
v.基于化学方法的脂质包膜病毒失活步骤；
vi.基于蛋白质配体的亲和树脂；
vii.使用20nm的平均孔径的病原体过滤移除步骤；
viii.阳离子交换树脂；
ix.尺寸排除色谱树脂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，阴离子膜为SartobindQ，用于DNA削减；阳离子多模态树脂为CaptoMMC；阳离子交换树脂为SPSepharoseFF；阴离子膜为SartobindQ，用于进一步DNA削减；所述脂质包膜病毒失活步骤是使用磷酸三正丁酯和TritonX-100的溶剂/洗涤剂失活；所述蛋白质配体为VIIISelect，所述VIIISelect配体由在酵母中表达的抗体片段或阴离子多模态色谱树脂组成；所述阴离子多模态色谱树脂为CaptoAdhere；所述病原体过滤移除步骤使用Planova20N；所述阳离子交换树脂为QSepharoseFF；所述尺寸排除色谱树脂为Superdex200pg。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换步骤中FVIII的洗脱条件基于Ca，所述Ca浓度在0.15M-0.25M的范围内，25℃下洗脱缓冲液的总电导率不超过25mS/cm。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在最后提纯步骤之后的纯度＞4000IU/mg蛋白质，并且DNA含量＜1000pg/1000IUFVIII。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在最后提纯步骤之后的纯度＞9000IU/mg蛋白质，并且DNA含量＜100pg/1000IUFVIII。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在最后提纯步骤之后的纯度＞10000IU/mg蛋白质，并且DNA含量＜100pg/1000IUFVIII。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在最后提纯步骤之后的纯度＞10000IU/mg蛋白质，并且DNA含量＜10pg/1000IUFVIII。
14.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述FVIII是B-结构域剔除FVIII。
15.一种包含提纯的重组FVIII的组合物，所述重组FVIII可通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法来获得，在最终提纯步骤之后的纯度＞9000IU/mg蛋白质，并且DNA含量＜100pg/1000IUFVIII。
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