BRPI0914695B1 - Processo de purificação ou enriquecimento de fator fviii de coagulação - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE FATOR VIII DE COAGULAÇÃO E COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA OBTENÍVEL DO MESMO. A presente invenção refere-se a um processo de purificação ou enriquecimento de FVIII de coagulação empregando cromatografia compreendendo as etapas de provimento de uma fração contendo FVIII em uma solução aquosa tendo uma alta resistência iônica; contato de fração contendo FVIII com uma resina multimodal; opcionalmente lavando a resina multimodal tendo FVIII adsorvido com um tampão de lavagem aquoso; eluição de frações contendo FVIII através de um tampão de eluição aquoso compreendendo pelo menos um aminoácido que está carregado positivamente em pH 6 a 8; e opcionalmente coletando frações contendo FVIII em forma purificada ou enriquecida.

Description

[001]A presente invenção refere-se a um processo de purificação de fator VIII de coagulação (abreviado como FVIII) e uma fração contendo FVIII obtenível através do processo da invenção.

Antecedentes da Invenção

[002]Hemofilia é um grupo de distúrbios genéticos hereditários que prejudica a habilidade do corpo para controlar formação de coágulo ou coagulação. Em sua forma mais comum, Hemofilia A, FVIII de formação de coágulo é deficiente. Hemofilia A ocorre em cerca de 1 em 5000-10 000 nascimento de machos. A proteína FVIII é um cofator essencial em coagulação de sangue com propriedades multifuncionais. A deficiência de FVIII pode ser tratada com concentrados de FVIII derivados de plasma ou com FVIII produzido recombinantemente. O tratamento com concentrados de FVIII conduziu a uma vida normalizada dos pacientes de hemofilia. Historicamente, Hemofilia A tem sido tratada com FVIII originando-se de plasma de sangue humano. Em plasma de sangue, sob condições normais, a molécula FVIII está sempre associada com seu cofator; fator von Willebrandt (vWf), que estabiliza a molécula FVIII de diferentes formas de degeneração.

[003]Produtos de FVIII derivados de plasma ocorrem no mercado com diferentes purezas e com mais ou menos quantidades de vWf presente. Comumente, produtos com baixa quantidade de vWf contêm albumina humana e/ou outros estabilizantes incluindo aumentada concentração de sal para estabilizar a molécula FVIII). Os processos usados para purificar FVIII foram normalmente uma combinação de diferentes processos de precipitação tais como crioprecipitação, precipitação com hidróxido de alumínio, etc., e etapas de cromatografia, principalmente etapas de troca de íons, afinidade e filtração em gel.

[004]De modo a aperfeiçoar produtos de FVIII foi empregada cromatografia de afinidade, que removeu efetivamente contaminantes para um alto grau de pureza de FVIII incluindo a possibilidade para reduzir também vWf (Farrugia et al., Biotechnology and plasma fractionation industry; The impacto f advances in the production of coagulation FVIII. Biotechnology, Vol. 3, No 1, Fevereiro de 1993). A desvantagem com cromatografia de afinidade imuno foi que ela é relativamente cara e que os anticorpos monoclonais usados como ligantes de afinidade, foram de origem animal.

[005]No meio dos anos 80 houve algumas transmissões de vírus associadas com produtos FVIII derivados de plasma. Mesmo se este problema foi resolvido através de implementação de etapas de redução de vírus específicas, este foi o ponto de partida para o desenvolvimento de produtos FVIII recombinantes (rFVIII). Nos anos 90, o primeiro produto rFVIII foi comercializado e atualmente existem três diferentes produtos rFVIII (duas moléculas de inteiro comprimento e uma molécula com domínio-B suprimido onde uma parte inativa da molécula FVIII foi removida para aumentar a produtividade da célula hospedeira (Eriksson et al., The manufacturing process for B- domain deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology, Vol 38, N° 2, Suppl. 4 (Abril), 2001:pp24-31)) com um alto grau de pureza (sem vWf).

[006]Os processos de purificação usados para purificar o rFVIII foram todos uma combinação de diferentes técnicas de cromatografia (ref. Bhattacharyya et al., Review article; Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies". CRIPS Vol.4, N°3, July-September 2003). Um foi a conhecida técnica de afinidade imuno (mesmo se existem produtos resolvendo isto, por exemplo, com afinidade de peptídeo (Kelly et al., Development and validation of an affinity chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of FVIII.) ou um fragmento de anticorpo derivado de levedura (VIIISelect FVIII affinity resin - GE Health care, Cat. N° 17-5450 presentemente estão entrando no mercado) como usado para o FVIII de plasma.

[007]Como vWf está ausente em todos os produtos rFVIII, certas medidas têm de ser tomadas para estabilizar a molécula de FVIII contra perda de atividade (agregação, proteases, adsorção de superfície, etc.). Em um dos produtos, um agente quelante (EDTA, etc.) é adicionado para proteger FVIII contra degeneração de metalo proteases (US-A- N°5 831 026). Para adicionar albumina, aprotinina, insulina ou mesmo para coexpressar rFVIII com vWf (e remover o mesmo a jusante no ciclo de purificação) são estratégias que têm sido realizadas para aumentar a estabilidade da molécula rFVIII (ref. Bhattacharyya et al., Review article; Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies". CRIPS Vol.4, N°3, Julho-Setembro 2003).

[008]Uma outra estratégia (para manter um processo livre de aditivos mamíferos e agentes quelantes) é descrito em EP- A- N°1 707 634, onde uma combinação de aumentadas quantidades de sais, contribui para a estabilidade e alta recuperação do produto rFVIII (Wang et al., Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003), 1-15). Entretanto, esta técnica tem uma certa desvantagem. Por exemplo, o teor de sal relativamente alto a torna imprópria para processar diretamente para um trocador de íons sem diluição (e possível desestabilização Parti et al., In vitro stability of recombinant FVIII. Haemophilia (2000), 6, 513-522. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87, N° 3, 5 de agosto de 2004.).

[009]WO-A- N°2009/007451 mostra um processo de purificação de FVIII usando uma resina multimodal ou modo - misto. O processo de purificação é baseado no contato de proteína FVIII com uma resina de modo - misto ou multimodal contendo ligantes que compreendem uma parte hidrofóbica e uma parte carregada negativamente e eluindo a dita proteína FVIII com um tampão de eluição contendo pelo menos sal a 1,5 M e pelo menos 40% (peso/volume) de etileno glicol, propileno glicol ou uma mistura dos mesmos, e íons cálcio.

[010]EP-A- 1707634 mostra um processo para isolamento de proteínas produzidas recombinantemente, isto é, através de vários processos tais como cromatografia de afinidade imuno, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, trocas de tampão, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, meios de cromatografia de troca de íons/hidrofóbico de modo misto, cromatografia quelante, cromatografia de afinidade como cromatografia de afinidade de lectina ou heparina, cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese, diálise, diferentes agentes de precipitação como polietileno glicol, sulfato de amônio, etanol, adsorção com hidróxi apatita, adsorção em membrana de filtro, ligantes acoplados a partículas magnéticas, etc. Entretanto, está identificando particulares etapas de purificação cromatográfica.

[011]WO-A-2005-082483 mostra um processo para a purificação de anticorpos de uma ou mais impurezas em um líquido, cujo processo compreende contato do dito líquido com uma primeira resina de cromatografia compreendida por um suporte ao qual ligantes multimodais foram imobilizados para adsorção de anticorpos para a resina, onde cada ligante multimodal compreende pelo menos um grupo de troca de cátions e pelo menos um sistema de anel heteroaromático ou aromático. Um eluente é adicionado para liberar os anticorpos da resina e o eluato é contatado com uma segunda resina de cromatografia.

[012]WO-A-2005/121163 mostra um processo para o isolamento de uma ou mais proteínas de uma solução de proteínas. O processo compreende as etapas de provimento de uma solução de proteínas compreendendo uma ou mais proteínas específicas e tendo um pH pré-fixado e uma resistência iônica ou condutividade pré-fixada, aplicação de ...

Descrição da Invenção

[013]Um objetivo da invenção foi evitar as desvantagens dos processos de purificação de técnica anterior através de provimento de um novo processo. Um outro objeto da invenção foi prover um processo de purificação de FVIII em particular a partir de fontes tendo alto teor de sal, em particular quando são usadas na fabricação de FVIII recombinante.

[014]Isto é realizado através de um processo de purificação de FVIII de coagulação em uma sequência de purificação empregando cromatografia onde pelo menos uma cromatografia é realizada usando uma resina multimodal. O termo "resina multimodal" como aqui usado significa um material cromatográfico tendo um suporte e metades ligadas ao suporte cujas metades interagem com grupos químicos das substâncias a serem separadas. Em uma particular modalidade da invenção a resina multimodal compreende metades ligadas a uma matriz e as metades são capazes de interagir com FVIII em uma mistura através de interações iônicas e outros tipos de interações como ligação de hidrogênio e/ou interação hidrofóbica.

[015]De acordo com a invenção, é provido um processo de purificação ou enriquecimento de FVIII de coagulação empregando cromatografia compreendendo as etapas de provimento de uma fração contendo FVIII em uma solução aquosa tendo uma alta resistência iônica; contato de fração contendo FVIII com uma resina multimodal; opcionalmente lavagem de resina multimodal tendo FVIII adsorvido com um tampão de lavagem aquoso; eluição de frações contendo FVIII através de um tampão de eluição aquoso compreendendo pelo menos um aminoácido que é carregado positivamente em pH 6 a 8; e opcionalmente coleta de frações contendo FVIII em forma purificada ou enriquecida.

[016]Cromatografia multimodal (ou modo misto) é uma ferramenta para purificação de proteínas. Descrita em, por exemplo, Manufacturer data sheet GE Health Care (11-0035-45AA) Capto Adhere, Manufacturer data sheet GE Health Care (28-9078- 88AA) Capto MMC e Pedido de Patente EP 07114856.3 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins".

[017]As técnicas têm certas vantagens e desvantagens. Uma vantagem sendo a possibilidade de ligar proteínas dentro de uma maior concentração de sal, comparado a mais frequentemente usada cromatografia de troca de íons. Uma desvantagem é que a eluição frequentemente inclui condições relativamente ásperas como, por exemplo, pH abaixo ou acima de pH neutro, sozinho ou em combinação com outros parâmetros de eluição. FVIII é uma proteína relativamente instável, por exemplo, em relação a valores de pH fora de valor neutro; pH 6-8 (Wang et.al, Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003), 1-15.). A invenção resolve este problema através de condições de eluição suaves em uma faixa de pH de cerca de neutra que retém a atividade da molécula de FVIII e facilita o uso de cromatografia multimodal em combinação com os efeitos de estabilização da aumentada concentração de sal, descridos em, por exemplo, EP-A-1 707 634.

[018]De acordo com uma modalidade da invenção, a cromatografia multimodal pode ser realizada em uma coluna cromatográfica. Esta pode ser vista como uma primeira etapa de captura. O processo da invenção também pode ser realizado no modo batelada. A presente invenção também facilita um processo de purificação sem adição de aditivos estabilizantes derivados de humanos ou animais e o uso de um processo inteiro sem os mesmos (resinas de afinidade imuno baseadas em anticorpo monoclonal). O uso da resina multimodal, em particular como etapa de captura, facilita também uma maior capacidade de ligação em comparação com trocadores de íons convencionais, o que resulta em um eluato produto mais concentrado a partir da etapa, o que é vantajoso para a estabilidade de produto.

[019]O processo da invenção é tipicamente relacionado com a purificação de FVIII recombinante (FVIII), em particular FVIII recombinante de domínio-B suprimido.

[020]A solução de FVIII tipicamente compreende FVIII em uma solução de alta concentração de sal correspondendo a uma condutividade de cerca de 25 a cerca de 200 mS/cm a 25oC.

[021]Em uma outra modalidade da invenção, FVIII é aplicado à resina multimodal e após ligação à resina multimodal subsequentemente eluído com um tampão apropriado.

[022]Após aplicação da mistura compreendendo FVIII e ligação de FVIII à resina multimodal, a molécula de FVIII é eluída da resina multimodal usando um tampão de eluição compreendendo pelo menos um aminoácido que está carregado positivamente em um pH de 6 a 8, em particular o aminoácido que está carregado positivamente em um pH de 6 a 8 é lisina, arginina e/ou histidina.

[023]Adicionalmente, o tampão pode estar compreendendo pelo menos um composto orgânico contendo grupo hidroxila tal como um álcool, ou pelo menos um composto orgânico contendo grupo amino tal como um aminoácido, uma fonte provendo íons Ca2+, pelo menos um composto para regulação de resistência iônica do tampão tais como sais inorgânicos, por exemplo, NaCl, em particular em concentrações < 1 M, um detergente não-iônico e uma substância tamponante para regular o pH de cerca de 6 a cerca de 8 em particular para cerca de um valor neutro.

[024]Ainda em uma modalidade do processo da invenção o álcool pode ser selecionado do grupo de metanol, propanol e etileno glicol; o aminoácido pode ser selecionado do grupo de arginina, lisina e histidina; a fonte provendo Ca2+ pode ser CaCl2; os sais inorgânicos podem ser selecionados do grupo de KCl e NaCl; o detergente não-iônico pode ser selecionado do grupo de Tween 20, Tween 80 e Pluronic F68; a substância tamponante pode ser selecionada do grupo de citrato de sódio, histidina, HEPES, MES e acetato de sódio em um pH entre 6-8.

[025]Particularmente, a concentração do aminoácido que é carregado positivamente em um pH de 6 a 8 está presente em uma quantidade de pelo menos >0,4 M, em particular > 0,5M. Se concentrações maiores que 1 M do particular aminoácido são usadas, isto não conduz a ainda vantagens. Tipicamente, a quantidade de arginina está em uma faixa de cerca de 0,4 M a cerca de 1,0 M, em particular em uma faixa de cerca de 0,7 M a cerca de 0,9 M. O composto orgânico contendo grupo hidroxila tal como um álcool, por exemplo, etileno glicol está em particular presente em quantidades de 0% (v/v) a 30% (v/v), em particular de cerca de 5% a 15%. A concentração de íon cálcio deve estar na faixa de 0,0001 M a cerca de 0,1 M, em particular de cerca de 0,001 M a cerca de 0,03 M. A concentração do composto para regulagem de resistência iônica do tampão deve estar na faixa para prover uma condutividade de cerca de 15 a cerca de 200 mS/cm a 25oC. A quantidade de detergente não iônico está tipicamente na faixa de cerca de 0,001% a 1%.

[026]Em uma modalidade do processo da invenção um tampão de lavagem é aplicado à resina multimodal. Este pode ser usado para lavar contaminantes e reter FVIII, antes de FVIII ser liberado.

[027]Ainda em uma modalidade do processo da invenção a resina de cromatografia "multimodal" contém, pelo menos, uma das seguintes metades: i) um ligante N-benzil-N-metil etanolamina carregado positivamente ii) um ligante ácido 2-(benzoil amino) butanoico carregado negativamente, iii) um ligante fenil propila, iv) um ligante N-hexila, v) um ligante 4-mercapto etil piridina, vi) um ligante ácido 3-((3-metil-5-((tetra-hidro furan-2-il metil) amino) fenil) amino) benzoico ou combinações dos mesmos.

[028]Em particular, no processo da invenção a resina de cromatografia "multimodal" é selecionada das seguintes resinas comercialmente disponíveis HEP Hypercel; PPA Hypercel; Capto Adhere; Capto MMC; MEP Hypercel.

[029]Em uma outra modalidade do processo da invenção, a etapa de cromatografia multimodal é combinada com uma etapa de cromatografia de afinidade de FVIII onde a afinidade é provida por um ligante proteína tal como um fragmento de anticorpo que é expresso em levedura.

[030]De acordo com o processo da invenção, a sequência de purificação ainda compreende etapas de remoção/inativação de patógeno compreendendo uma etapa de inativação baseada quimicamente, uma etapa de remoção baseada em tamanho, etapas de cromatografia ou suas combinações cujas etapas são baseadas em diferentes propriedades fisiológicas direcionadas ao patógeno a ser removido.

[031]Em uma modalidade particular do processo da invenção a sequência de purificação ainda compreende as seguintes etapas: i. o uso de uma membrana aniônica tal como Sartobind Q, em particular para redução de DNA; ii. uma resina multimodal de cátion tal como Capto MMC; iii. uma resina de troca de cátions tal como SP Sepharose FF; iv. o uso de uma membrana aniônica secundária tal como Sartobind Q em particular para ainda redução de DNA; v. uma etapa de inativação quimicamente baseada para vírus envelopados em lipídeo em particular a inativação - detergente/solvente empregando fosfato de tri-n-butila e vi. uma resina de afinidade baseada em um ligante proteína expresso em levedura; tal como VIIISelect ou uma resina de cromatografia multimodal tal como Capto Adhere; vii. uma etapa de remoção de filtração de patógeno com um tamanho de poro médio de cerca de 20 nm, tal como Planova 20N; viii. uma resina trocadora de anions como Q Sepharose FF; ix. uma resina de cromatografia de exclusão de tamanho tal como Superdex 200pg.

[032]Em particular, no processo da invenção as condições de eluição da etapa de troca de cátions são baseadas em íons Ca2+, concentração variando de 0,15-0,25 M e a condutividade total do tampão de eluição não maior que 25 mS/cm a 25oC.

[033]Se o processo da invenção é empregado, a pureza do produto obtenível é > 4000 IU/mg, após a última etapa de purificação preferivelmente >9000 IU/mg e mais preferivelmente > 10 000/mg de proteína e < 1000 pg/1000 IU FVIII, preferivelmente <100 pg/1000 IU FVIII e mais preferivelmente < 10 pg/1000 IU FVIII em relação a contaminação de DNA.

[034]Por isto, também uma composição de matéria é objeto da invenção cuja composição de matéria está compreendendo um FVIII recombinante purificado obtenível através do processo de acordo com a invenção (sem a adição ou uso de quaisquer aditivos humanos ou animais como albumina ou ligantes de imunoafinidade baseados em anticorpo monoclonal).

[035]O apêndice 1 mostra um fluxograma de um processo de acordo com a invenção em que a etapa de captura é realizada sobre uma resina multimodal. Uma suspensão de células é processada através de adição de sal, separação das células seguida por uma etapa de redução de DNA, preferivelmente sobre uma membrana Q. A membrana Q (por exemplo, Sartobind Q de Sartorius) é um trocador de anions básicos forte com grupos amônio quaternários como metade de troca de anions. Dentro de específicas faixas de pH e condutividade a membrana Q liga especificamente DNA, enquanto o produto (e proteínas de células hospedeiras) permanece no fluxo através. Em oposição a convencional cromatografia de coluna de troca de íons, o ligante carregado é ligado a um suporte de membrana que facilita uma alta produtividade e facilidade de uso. A etapa de captura compreende o processo da invenção usando a resina multimodal. A etapa de captura é seguida por uma separação sobre um trocador de cátions, SP Sepharose FF (GE HealthCare) seguido por ainda uma redução de DNA sobre uma membrana Q. Um tratamento de inativação de vírus através do processo de detergente solvente (processo S/D) tal como, por exemplo, mostrado em EP-A-131740 é realizado e ainda uma etapa de purificação sobre, por exemplo, resina de afinidade VIII Select. Ainda uma etapa de concentração/polimento é realizada sobre uma coluna trocadora de anions, por exemplo, sobre Q Sepharose FF (GE HealthCare). O produto concentrado é a seguir processado sobre uma coluna de filtração de gel (por exemplo, Superdex 200 p.g. (GE HealthCare)) para trocar tampão e remover potenciais agregados e fragmentos. O resultante produto, eluato GF, é coletado. As respectivas etapas são explicadas em mais detalhes nos exemplos.

[036]Apêndices 2 e 3 mostram uma modalidade alternativa em que a etapa de afinidade específica (VIIISelect (GE HealthCare)) como descrita no Apêndice 1, é substituída por uma cromatografia multimodal; Capto Adhere (GE HealthCare). Surpreendentemente, a sequência de purificação, como descrita em Apêndice 2, exerceu a mesma pureza como a sequência de purificação descrita em Apêndice 1 (incluindo a etapa de afinidade baseada em anticorpo específico). Este resultado foi repetido com o mesmo material de partida, como descrito no Apêndice 3. Isto mostra o amplo potencial de uso de técnica de purificação multimodal mais de uma vez (Ambos, na etapa de captura; Capto MMC (GE HealthCare) e ainda em uma etapa de purificação a jusante com Capto Adhere (GE HealthCare) como descrito em Apêndices 2 e 3) usando as específicas condições de eluição para FVIII de acordo com a invenção.

[037]A invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos

[038]Em todos os exemplos o real valor de M (Molar) é mol/Kg (isto é, 10 gramas de sal são adicionados a 1000 gramas de água - não a 10 gramas de sal é adicionada água até 1000 mL).

Exemplo 1: Produção de suspensão de células contendo FVIII Células

[039]A linha de células usada é uma célula de rim embriônico humano 293 (HEK 293), que foi adaptada para crescimento livre de soro. Este hospedeiro, HEK 293F, foi transfectado estavelmente com um cassete de expressão carreando o gene para FVIII humano com domínio-B suprimido sob o controle de um promotor forte (EP-A-1 739 179).

Processo de Cultura

[040]As células foram cultivadas em meio livre de soro em equipamento genérico e de acordo com os processos genéricos bem conhecidos na técnica, por exemplo, culturas sacudidas ou agitadas em frascos-t, fracos agitadores e biorreatores (sistemas descartáveis e tanques convencionais agitados) corridas como culturas em batelada, batelada - alimentada, quimiostato contínuo ou de perfusão (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4° ed, Wiley- Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York; Enfors, S-O and Haggstrdm, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hdgskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, EUA). Tipicamente, perfusão de meio foi usada para aumentar números de células e títulos de produtos além de níveis padrões de cultura em batelada. O rendimento de produto e a quantidade de proteínas de célula hospedeira diferem dependendo do modo de cultura: - o título de produto tipicamente aumentará com números de células - o teor total de proteína e teor de DNA tipicamente aumentarão com números de células - o teor total de proteína e teor de DNA também podem aumentar com longevidade de cultura - culturas em batelada acumulam proteína e DNA; nada é adicionado externamente, nada é removido - processos de perfusão rinçam culturas de células de metabólitos, proteína, DNA e outras impurezas; filtros ou centrífugas de células foram tipicamente usados para retenção de célula.

[041]Uma vez que o produto recombinante está associado com as células, a suspensão de células é colhida. As propriedades do colhido (títulos de produtos e impurezas como mencionado acima) diferem dependendo do modo de cultura usado.

Exemplo 2: Produção de material de partida de FVIII livre de células

[042]O material de partida FVIII livre de células para a purificação cromatográfica, foi obtido como se segue. Uma solução estoque de cloreto de sódio e cloreto de cálcio foi adicionado à suspensão de células, produzida de acordo com o exemplo 1, para render concentrações finais de 0,3 M e 30 mM, respectivamente, e uma condutividade de 30-40 mS/cm a 25oC. A solução foi misturada por cerca de 30 minutos, onde após as células foram removidas por centrifugação e seguido por uma etapa de filtração para remoção de quaisquer fragmentos de células restantes (para inibir entupimento das seguintes etapas de coluna).

Exemplo 3: Condições de eluição para resina de cátions multimodal Capto MMC

[043]As seguintes séries de experimentos foram realizadas para comparar diferentes condições de eluição sobre a resina de cátion multimodal Capto MMC.

Exemplo 3a: avaliação de diferente concentração de sal e pH para eluição de FVIII de resina Capto MMC (exemplo referência). Coluna e Resina

[044]A resina Capto MMC foi empacotada para uma altura de leito de 10 cm em uma coluna C10/20 (1 volume de coluna (CV) = 8 mL). A resina Capto MMC foi obtida de GE HealthCare (Cat. N° 17-5317).

Material de Partida

[045]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2. Tampão de Equilíbrio 0,01 M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 7,0, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[046]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida com uma taxa de fluxo de 5 mL/minuto. FVIII ligou-se à resina durante estas condições tampões (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 1 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada com um processo FVIII: C e calculada em % em relação à quantidade aplicada de FVIII.

Tampões de eluição incluíram 0,01M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M e 0,02% peso/peso de Polisorbato 80 ** O tampão de eluição incluiu 0,05 M L-histidina, CaCl2 a 0,05 M e 0,02% peso/peso Polisorbato 80 Conclusão de Exemplo Referência 3a

[047]Como pode ser visto na tabela 1, a ligação de FVIII à coluna Capto MMC, não é uma interação iônica.

[048]Exemplo Referência 3b, avaliando condições de eluição para Capto MMC, diferente concentração de NaCl com 50% de etileno glicol constante. Coluna e Resina

[049]A resina Capto MMC foi empacotada para uma altura de leito de 2 cm em uma coluna XK16/20 (1 volume de coluna (CV) = 4 mL). A resina Capto MMC foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5317). Material de partida

[050]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2. Tampão de Equilíbrio

[051]0,01 M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 7,0, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[052]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida com uma taxa de fluxo de 1 mL/minuto. FVIII ligou-se à resina durante estas condições de tamponamento (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 2 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada com um processo FVIII: C e calculada como % em relação à quantidade aplicada de FVIII.

1 Todos os tampões de eluição incluíram 0,02 M L- histidina, CaCl2 a 0,02 M e 0,02% peso/peso Polisorbato 80 Conclusão de Exemplo Referência 3B

[053]Como pode ser visto na tabela 2, a ligação de FVIII à coluna Capto MMC pode ser inibida por uma combinação de etileno glicol e NaCl. 50% etileno glicol é comumente usado como um tampão de eluição para resinas de afinidade baseadas em proteína convencionais. A eluição de FVIII é aperfeiçoada se etileno glicol é combinado com uma concentração de cloreto de sódio aumentada até 1,5 M. Dois diferentes pHs testados (pH 6,5 e 7,5) não alteram a recuperação de FVIII, indicando que o pH não pode ser usado como um parâmetro de eluição para FVIII, dentro de limites de estabilidade para a proteína (aproximadamente 6-8). Uma elevação da concentração de NaCl a 2,5 M não aperfeiçoa a recuperação de FVIII: C no eluato. Exemplo 3c: Variação de arginina como um componente de eluição para Capto MMC Coluna e Resina

[054]A resina Capto MMC foi empacotada para uma altura de leito de 8 cm em uma coluna Tricorn 5/100 (1 volume de coluna (CV) = 1,6 mL). A resina Capto MMC foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5317-10).

Material de Partida

[055]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2. Tampão de Equilíbrio

[056]0,01 M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 7,0, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[057]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida com uma taxa de fluxo de 0,6 mL/minuto. FVIII ligou-se à resina durante estas condições de tamponamento (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição sequencial (aproximadamente 10 volumes de coluna (CV) cada) como descrito na tabela 3 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada com um processo FVIII: C e calculada como % em relação à quantidade aplicada de FVIII.

* Todos os tampões de eluição incluíram 0,02 M L- histidina, CaCl2 a 0,02 M e 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 6,5 Conclusão de Exemplo 3c (de acordo com a invenção)

[058]Como pode ser visto na tabela 3, a ligação de FVIII à coluna Capto MMC pode ser surpreendentemente inibida através de uma combinação de etileno glicol e arginina. Eluição de FVIII é observada em eluatos contendo até 0,9 M arginina junto com 20% (peso/peso) de etileno glicol. Exemplo 3d (de acordo com a invenção), comparação de arginina e lisina como um componente de eluição para Capto MMC Coluna e Resina

[059]A resina Capto MMC foi empacotada para uma altura de leito de 4 - 8 cm em uma coluna Tricorn 5/100 ou C10/20 (1 volume de coluna (CV) = 1,6 - 3 mL). A resina Capto MMC foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5317).

Material de Partida

[060]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2.

Tampão de Equilíbrio

[061]0,01 M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 7,0, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[062]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida com uma taxa de fluxo representando um tempo de contato de 1-2 minutos. FVIII ligou- se à resina durante estas condições de tamponamento (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 4 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada com um processo FVIII: C e calculada como % em relação à quantidade aplicada de FVIII.

* Todos os tampões de eluição incluíram 0,02 M L- histidina, CaCl2 a 0,02 M e 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 6,5 Conclusão de Exemplo 3d (de acordo com a invenção)

[063]Como pode ser visto na tabela 4, a ligação de FVIII à coluna Capto MMC foi estudada com etileno glicol 20% em combinação com lisina e arginina de diferentes concentrações. Arginina elui FVIII melhor que lisina, uma concentração de 0,75 M parece render aproximadamente 90% de recuperação. Parece ser possível usar menores quantidades de qualquer aminoácido em combinação com etileno glicol, como uma etapa de lavagem para remoção de impurezas da molécula de FVIII, antes de eluição de FVIII com, por exemplo, arginina a 0,75M. Exemplo 3e, avaliação de pureza e recuperação usando diferentes condições de eluição e lavagem para a resina Capto MMC.

Coluna e Resina

[064]A resina Capto MMC foi empacotada em diferentes tamanhos de coluna (2-9 cm de altura de leito, volume 1,6-48 mL). A resina capto MMC foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5317)

Material de Partida

[065]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2, com uma pureza típica de aprox. 100 IU FVIII/mg de proteína (como pode ser visto no exemplo 9, tabela 18). Tampão de Equilíbrio

[066]0,01 M L-histidina, 0,01 M CaCl2, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 7,0, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[067]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida com apropriadas taxas de fluxo (dependendo de tamanho de coluna, aproximadamente 13300 cm/h). FVIII ligou-se à resina durante estas condições de tamponamento (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 5 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada com um processo FVIII: C e calculada como % em relação à quantidade aplicada de FVIII.

* Todos os tampões de eluição incluíram 0,02 M L- histidina, 0,02 M CaCl2 e 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 6,5 2 * Medida com Bradford

Conclusão de Exemplo 3e

[068]Como pode ser visto na tabela 5, a combinação de etileno glicol 20% e arginina 0,4 M em uma etapa de lavagem antes de aplicação de maior concentração de arginina no tampão de eluição rende maior rendimento e produto puro, a concentração de arginina no tampão de lavagem não deve exceder 0,4 M devido à resultante recuperação de FVIII relativamente baixa.

Conclusão de exemplo 3

[069]Torna-se claro que a resina multimodal de cátion (Capto MMC) não pode ser eluída usando convencionais condições de eluição de troca de íons (alto sal) ou resinas de interação hidrofóbica (baixo sal). Uma aumentada quantidade de aminoácido carregado sozinho ou em combinação com etileno glicol pode surpreendentemente liberar a molécula de FVIII ligada da resina Capto MMC. Em adição, concentrações de NaCl, arginina, lisina e etileno glicol podem ser variadas durante lavagem e eluição da resina, para otimizar recuperação e pureza do eluato de Capto MMC.

Exemplo 4: Condições de eluição para resina de anion multimodal Capto Adhere (comparativa)

[070]As seguintes séries de experimentos foram realizadas para avaliar diferentes condições de eluição sobre a resina de anion multimodal Capto Adhere.

Coluna e Resina

[071]A resina Capto Adhere foi empacotada para uma altura de leito de 13,5 cm em uma coluna C10/20. A resina Capto Adhere foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5444).

Material de Partida

[072]Os materiais de partida usados foram uma solução de proteína contendo rFVIII, obtido como descrito no Exemplo 6C. Tampão de Equilíbrio

[073]0,01 M L-histidina, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 6,6, condutividade 31 ± 3 mS/cm a 25oC.

[074]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida. A resina a seguir foi submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 6 e a resultante quantidade de FVIII saindo da coluna foi analisada.

Condição de Eluição A

[075]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,3M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 30 +/ 3 mS/cm a 25oC. Condição de Eluição B (alto sal)

[076]L-histidina a 0,05M, CaCl2 a 0,05M, NaCl a 2,0 M, 0,02% em peso de Polisorbato 80, pH 6,5, condutividade 140 ± 5 mS/cm a 25oC.

Condição de Eluição C (baixo sal)

[077]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,1M, 0,02% peso/peso Polisorbato 80, pH 6,5, condutividade 13 ± 3 mS/cm a 25oC.

Condição de Eluição D (baixo aminoácido + baixo etileno glicol)

[078]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,3M, cloridrato de arginina 0,3M, etileno glicol 20% peso/peso, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 28 ± 3 mS/cm a 25oC.

Condição de Eluição E (aminoácido)

[079]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,3 M, cloridrato de arginina a 0,8M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 53 +/- 2 mS/cm a 25oC.

Conclusão de Exemplo 4

[080]Torna-se claro que a resina multimodal de anions (Capto Adhere) não pode ser eluída usando condições convencionais de eluição de trocador de íons (alto sal) ou resinas de interação hidrofóbica (baixo sal). Uma quantidade aumentada de um aminoácido carregado sozinho ou em combinação com etileno glicol pode surpreendentemente liberar a molécula de FVIII ligada. Exemplo 5Comparação de uma etapa convencional de troca de cátions (SP Sepharose FF) com uma resina multimodal de cátions (Capto MMC) como uma etapa de purificação (etapa de captura) Coluna e Resina

[081]A resina Capto MMC foi empacotada para uma altura de leito de 11 cm em uma coluna C10/20 (1 volume de coluna (CV) = 8,5 mL). A resina Capto MMC foi obtida de GE Helathcare (Cat. N° 17-5317).

[082]A resina SP Sepharose FF foi empacotada para uma altura de leito de 18 cm em uma coluna XK26/20 (1 volume de coluna (CV) = 100 mL). A resina SP Sepharose FF foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-0729).

Material de Partida

[083]O material de partida usado foi uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2 (idêntico material de partida foi usado para ambos experimentos). Para a resina SP Sepharose FF, o material de partida foi diluído com tampão de diluição para uma condutividade de 12 mS antes de aplicação à resina, para FVIII ser capaz de se ligar.

Tampão de Diluição SP

[084] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,07M, Polisorbato 80 0,02%, pH 6,5.

Tampão de Equilíbrio MMC

[085] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,3M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 7,0, condutividade 31 +/3 mS/cm a 25oC.

Tampão de Equilíbrio SP

[086]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,1M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 12 +/2 mS/cm a 25oC.

[087]As colunas foram equilibradas com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida em uma taxa de fluxo de 5 mL/minuto respectivamente 40 mL/minuto. FVIII se liga às resinas durante estas condições tampões (nenhum FVIII pode ser detectado no fluxo através). A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de lavagem e eluição, o princípio descrito no exemplo 3d (lavagem 0,75 M lisina + 20% etileno glicol) e exemplo 3b (eluição NaCl a 1,5M + 50% etileno glicol) para a etapa de Capto MMC e em exemplo 6b para a etapa de SP Sepharose FF (lavagem NaCl a 0,15M e eluição NaCl a 0,36M). Na tabela 7 as diferenças entre as duas etapas de purificação pode ser estudada.

* Calculada de material de partida não diluído **Medida com Bradford

Conclusões de exemplo 5 (comparativo)

[088]O resultado de tabela 7 mostra que o uso da etapa Capto MMC como uma etapa de captura/purificação para FVIII exerce várias vantagens incluindo: . melhor recuperação de FVIII . maior pureza em relação a proteínas de células hospedeiras . maior pureza com relação a DNA . maior capacidade de ligação de FVIII/mL de resina . menor tempo de processo devido a menos diluição (a resina MMC pode ser processada com uma maior condutividade) Exemplo 6: Eluição específica (Ca) e componentes de lavagem para FVIII e sua purificação sobre uma resina de troca de cátions (SP Sepharose FF) (comparativo).

[089]A seguinte série de experimentos foi realizada para avaliar diferentes condições de eluição sobre a resina SP Sepharose FF. Exemplo 6a: Cloreto de sódio e arginina como eluição específica e componente de lavagem usado sobre uma resina de troca de cátions (SP Sepharose FF).

Coluna e Resina

[090]A resina SP Sepharose FF foi empacotada para uma altura de leito de 15 cm em uma coluna XK16. A resina SP Sepharose FF foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-0729).

Material de Partida

[091]O material de partida usado foi uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2, e ainda processada sobre uma resina Capto MMC, como descrito no exemplo 9. O eluato da coluna de Capto MMC foi diluído 12x com um tampão de diluição para diminuir a condutividade para aproximadamente 12 mS/cm, o que permite a ligação da proteína alvo à resina SP Sepharose FF.

Tampão de Diluição

[092] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,07M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5.

Tampão de Equilíbrio

[093]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01 M, NaCl a 0,1M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade de 12 +/- 2 mS/cm a 25oC.

[094]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida. A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 8 e a resultante quantidade de FVIII deixando a coluna foi analisada.

na = não analisado ** medida com Bradford

Lavagem A

[095]L-histidina a 0,01 M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,15 M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 16,5 - 18,0 mS/cm a 25oC.

Tampão de Eluição

[096]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,035M, NaCl a 0,34M, D-sorbitol 0,2 M, cloridrato de arginina 0,045 M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 36 +/- 2 mS/cm a 25oC.

Conclusão de exemplo 6a (comparativo)

[097]O FVIII ligado foi efetivamente eluído da coluna de SP Sepharose FF quando um tampão de eluição com uma condutividade de 36 mS/cm foi usado. Esta condutividade foi um efeito da concentração de NaCl e parcialmente das concentrações de CaCl2 e arginina. O sorbitol e arginina foram incluídos no tampão para estabilização de molécula de FVIII durante processamento, congelamento e descongelamento. Exemplo 6b: Cloreto de sódio como uma eluição específica e componente de lavagem usado sobre uma resina de troca de cátions (SP Sepharose FF).

Coluna e Resina

[098]A resina SP Sepharose foi empacotada para uma altura de leito de 15 cm em uma coluna C10/20. A resina SP sepharose FF foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-0729).

Material de Partida

[099]O material de partida usado foi uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2 e exemplo 9. O eluato da coluna Capto MMC foi diluído 12x com um tampão de diluição para diminuir a condutividade, o que permite a ligação da proteína alvo à resina SP Sepharose FF.

Tampão de diluição

[0100]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,01M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5.

Tampão de equilíbrio

[0101]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,1M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 12 +/ 2 mS/cm a 25oC.

[0102]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida. A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 9 e a resultante quantidade de FVIII deixando a coluna foi analisada.

** medida com Bradford Lavagem B

[0103] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,15M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 16,5 18,0 mS/cm a 25oC.

Tampão de eluição

[0104] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,035M, NaCl a 0,36M, D-sorbitol 0,2 M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade de 36 +/- 2 mS/cm a 25oC.

Conclusão de exemplo 6b

[0105] Um tampão de eluição com uma condutividade de 36 mS/cm foi usado. Comparado ao usado em experimento 5a a arginina foi excluída e a condutividade foi ajustada para 36 mS/cm através de adição de uma concentração de NaCl levemente maior. A porcentagem eluída de FVIII foi levemente menor que no experimento 5a indicando que arginina tem uma função positiva durante o processo. Exemplo 6c: cloreto de cálcio como uma eluição específica e componente de lavagem usado sobre uma resina de troca de cátions

Coluna e Resina

[0106] A resina SP Sepharose FF foi empacotada para uma altura de leito de 15,5 cm em uma coluna XK26. A resina SP sepharose FF foi obtida de GE Healthcare (Cat. N 17-0729).

Material de Partida

[0107] O material de partida usado foi uma solução de proteína contendo rFVIII, obtida como descrito no exemplo 2 e exemplo 9. O eluato da coluna Capto MMC foi diluído 12x com um tampão de diluição para diminuir a condutividade, o que permite a ligação da proteína alvo à resina SP Sepharose FF.

Tampão de diluição

[0108] L-histidina a 0,0z M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,05M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5.

Tampão de equilíbrio

[0109]L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,1M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 12 +/2 mS/cm a 25oC.

[0110]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido por carga do material de partida. A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de eluição como descrito na tabela 10 e a resultante quantidade de FVIII deixando a coluna foi analisada.

** medida com Bradford

Lavagem B

[0111] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,15M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 16,5 - 18,0 mS/cm a 25oC.

Lavagem C (sorbitol)

[0112] L-histidina a 0,01M, CaCl2 a 0,01M, NaCl a 0,2M, D-sorbitol a 0,2 M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 12 +/- 2 mS/cm a 25oC.

Tampão de Eluição (cloreto de cálcio)

[0113] L-histidina a 0,02 M, CaCl2 a 0,2M, NaCl a 0,1M, D-sorbitol a 0,2M, Polisorbato 80 0,02% peso/peso, pH 6,5, condutividade 18,7 (18,0-19,0) mS/cm a 25oC.

Conclusão de exemplo 6c (6a, 6b)

[0114] Neste experimento (6c) a concentração de NaCl foi diminuída e uma maior concentração de CaCl2 foi usada, no tampão de eluição. Esta mudança resultou em uma condutividade de 18,7 mS/cm. A capacidade de eluição do FVIII a partir da SP Sepharose FF foi igualmente boa como no experimento 5a onde a condutividade no tampão de eluição foi de 36 mS/cm. Foi uma verificação inesperada que a recuperação de FVIII foi igual ou melhor com um tampão de eluição com quase metade da condutividade. Em cromatografia de troca de íons, normalmente, a eluição de proteínas é fortemente dependente da condutividade (resistência iônica) e/ou o pH. Neste exemplo parece que os íons Ca2+ exercem efeitos específicos, outros que não somente a partir da resistência iônica, sobre a molécula de FVIII. Isto também é verificado pela pureza, que é maior (2811 comparado com 362 e 948 respectivamente em 6a e 6b) quando usando a eluição baseada em Ca com menor condutividade.

Exemplo 7: Purificação com um ligante de afinidade de FVIII derivado de levedura

[0115] O seguinte experimento foi realizado para avaliar as condições de eluição sobre a resina de afinidade VIIISelect.

Coluna e Resina

[0116] Uma coluna C10/20 foi empacotada a resina VIIISelect para uma altura de leito de sete cm. A resina VIIISelect foi obtida de GE Healthcare (Cat. N° 17-5450).

Material de Partida

[0117] O material de partida usado foi um eluato de SP Sepharose contendo rFVIII, obtido como descrito no exemplo 6b para a etapa de SP Sepharose FF (lavagem NaCl a 0,15M e eluição NaCl a 0,36M).

Composições Tampões:

[0118] Tampão A (tampão de equilíbrio com compostos químicos S/D adicionados)

[0119] NaCl 0,3 mol/kg, CaCl2 0,02 mol/kg (2xH2O), L- histidina 0,02 mol/kg, Triton X-100 1% peso/peso, TNBP 0,3% peso/peso, pH: 6,5 +/- 0,1, condutividade: 31 +/- 3 mS/cm a +25oC Lavagem B (tampão de equilíbrio sem compostos químicos S/D)

[0120] NaCl 0,3 mol/kg, CaCl2 0,02 mol/kg, L-histidina 0,02 mol/kg, Polisorbato 80 0,02% (peso/peso), pH: 6,5 +/- 0,1, condutividade: 31 +/- 3 mS/cm a +25oC. Lavagem C (tampão de lavagem de alta concentração de sal)

[0121] NaCl 1,0 mol/kg, CaCl2 0,02 mol/kg, L-histidina 0,02 mol/kg, Polisorbato 80 0,02% (peso/peso), pH: 6,5 +/- 0,1, condutividade: 85 +/- 3 mS/cm a +25oC.

Tampão D (Tampão de eluição)

[0122]NaCl 1,5 mols/kg, CaCl2 0,02 mol/kg, L-histidina 0,02 mol/kg, Polisorbato 80 0,02% (peso/peso), etileno glicol (EG) 50% (peso/peso), pH: 6,5 +/- 0,1, condutividade: 39 +/- 3 mS/cm a +25oC.

[0123]Os tampões de equilíbrio, lavagem e eluição não são limitados ao pH estabelecido, concentrações, e tipo de tampão, sais ou detergente.

[0124]A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio A seguido por carga do material de partida. A resina foi a seguir submetida a diferentes condições de lavagem e eluição como descrito na tabela 11 e a resultante quantidade de FVIII deixando a coluna foi analisada. Tabela 11. Resultados de experimento com VIIISelect

* medida com Bradford

[0125]Figura 1 SDS-PAGE manchada com prata mostrando perfil de pureza para material de partida (faixa 1)e eluato de VIIISelec (faixa 2) após a etapa de cromatografia de afinidade.

Conclusão de exemplo 7

[0126]A etapa de VIIISelect é uma poderosa etapa de purificação que rende um eluato puro. Exemplo 8: Comparação de uma sequência de purificação com resina de afinidade VIIISelect ou ao invés uma resina multimodal (Capto Adhere) (Apêndice 3).

[0127]Os dois diferentes esquemas de purificação foram realizados em pequena escala de acordo com o exemplo 7 (VIIISelect) e exemplo 10 (Capto Adhere). Tabela 12. Comparação de recuperação e pureza de FVIII através de uso de uma etapa de purificação com FVIII Select ou Capto Adhere

n.a. = não analisada 1 medida com Bradford 2 * medida com análises de aminoácidos

[0128]A figura 2 mostra manchamento com prata de SDS Page de amostras descritas na tabela 12; comparação de esquema de purificação com VIIISelect e esquema de purificação com Capto Adhere.

[0129]A faixa 1 mostra a pureza do material de partida (filtrado-SP) antes de carregado na coluna de VIIISelect em uma concentração de FVIII de 483 IU/mL.

[0130]A faixa 2 mostra a pureza do eluato de VIIISelect carregado em uma concentração de FVIII de 500 IU/mL.

[0131]A faixa 3 mostra a pureza após a sequência de purificação de SP-VIIISelect-Q Seph, carregada em uma concentração de FVIII de 500 IU/mL.

[0132]A faixa 4 mostra a pureza após a sequência de purificação SP-VIIISelect-Q Seph - filtração em gel, carregada em uma concentração de FVIII de 385 IU/mL.

[0133]A faixa 5 mostra a pureza do material de partida (filtrado-SP) antes de coluna Capto Adhere carregada em uma concentração de FVIII de 493 IU/mL.

[0134]A faixa 6 mostra a pureza do eluato de Capto Adhere carregado em uma concentração de FVIII de 500 IU/mL.

[0135]A faixa 7 mostra a pureza após a sequência de diluição de SP-Capto Adhere - Q Seph, carregada em uma concentração de 500 IU/mL.

[0136]A faixa 8 mostra a pureza após a sequência de purificação SP-Capto Adhere - Q Seph - filtração em gel, carregada em uma concentração de FVIII de 493 IU/mL.

[0137]A faixa 9 mostra um marcador molecular.

Conclusão de Exemplo 8

[0138]A mesma pureza pode ser obtida tanto através do uso de etapa de afinidade VIIISelect como a etapa de cromatografia Capto Adhere, se a pureza é comparada no produto final (GF- eluato). A pureza após a etapa VIIISelect é maior comparada a após a etapa de Capto Adhere, mas após as restantes etapas de purificação (Q e GF) nenhuma diferença em pureza pode ser notada com processos analíticos usados. A recuperação usando a etapa Capto Adhere é levemente maior comparada à sequência usando VIIISelect.

Exemplo 9: Sequência de purificação em escala industrial, incluindo resina de afinidade VlIISelect

[0139]Para estudar a capacidade de reprodução de recuperação e pureza, etapas de purificação 1-9 descritas abaixo, foram realizadas sobre 3-4 bateladas em escala piloto. Cada batelada originando de 40-100 L de suspensão de células, como descrito nos exemplos 1-2.

Etapa de 1Etapa N° 1 de redução de DNA (Cromatografia de ânions)

[0140]Redução primária de DNA é feita com filtração através de uma membrana - Q (Sartobind Q, Sartorius). A membrana -Q é equilibrada com tampão antes de filtração (Tabela 13). Tabela 13 Tampão usado para membrana-Q

[0141]O filtrado de células (do exemplo 2) é processado através de membrana -Q e o fluxo através contendo produto é coletado. A membrana é lavada com tampão de equilíbrio para recuperar qualquer FVIII restante na membrana.

Etapa 2 Etapa de captura (cromatografia multimodal, Capto MMC)

[0142]A purificação e concentração (captura) de produto primário são realizadas em 500-10 000 IU de FVIII/mL de gel de cromatografia de troca de cátions multimodal (Capto MMC). O gel é equilibrado antes de aplicação de produto com tampão de equilíbrio Capto MMC. O filtrado da etapa 1 é carregado para a coluna Capto MMC que a seguir é rinçada com tampão de equilíbrio Capto MMC e a seguir lavada sequencialmente com tampão de lavagem 1-3 seguido por eluição de FVIII, como descrito na Tabela 14

Etapa 3: Cromatografia de troca de cátions, SP

Sepharose FF

[0143]A solução contendo FVIII (eluato de Capto MMC) de etapa 2 é ainda purificada usando um gel de SP-Sepharose FF (GE Healthcare Cat. N° 17-0729). Antes de aplicação de produto, a coluna é equilibrada com tampão de equilíbrio SP-Sepharose e a solução de proteína é diluída para satisfazer a resistência iônica e pH do tampão de equilíbrio, para ser capaz de ligar FVIII ao gel. A solução de proteína diluída é aplicada à coluna de sepharose, que a seguir é rinçada com tampão de equilíbrio e a seguir lavada com tampão de lavagem seguido por eluição de FVIII, como descrito na tabela 15. Tabela 15: Tampões usados para cromatografia de troca de cátions

Etapa 4: Etapa N° 2 de redução de DNA (cromatografia de ânions)

[0144]Redução secundária de DNA é feita com filtração através de uma membrana Q (Sartobind Q, Sartorius). A membrana Q é equilibrada com tampão antes de filtração (tabela 16). Tabela 16: Tampão usado para membrana Q

[0145]O eluato -SP de etapa 3 é filtrado através de membrana Q, o fluxo através contendo produto é coletado para ainda processamento. A membrana é lavada com tampão de equilíbrio para recuperar qualquer FVIII restante na membrana. Etapa 5: Inativação de vírus (tratamento de solvente/detergente (S/D))

[0146]O filtrado da etapa 4 é inativado de vírus através de tratamento com S/D (solvente/detergente) com Triton X-100 1% e fosfato de tri-(n-butila) (TNBP) 0,3%. Inativação de vírus é realizada sob agitação em temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora.

Etapa 6: Purificação com uma resina de cromatografia de afinidade derivada de levedura

[0147]A solução de FVIII inativada de vírus da etapa 5 é processada através de uma coluna de afinidade VIIISelect de acordo com a descrição no exemplo 7. Aproximadamente 5-20 000 IU de FVIII são carregadas por mL de resina.

Etapa 7: Nanofiltração

[0148]O eluato de VIIISelect da etapa 6 é nanofiltrado para remoção de potenciais agentes adventícios como vírus não envelopados, usando um nanofiltro Planova 20N (Asahi Kasei Medical). O fluxo através contendo produto é coletado.

Etapa 8: Etapa de cromatografia de troca de anions (Q-Sepharose FF)

[0149]A resina Q Sepharose FF foi obtida de GE Healthcare (Cat. No. 17-0510). O material de partida usado é um nanofiltrado obtido da etapa 7, onde o sal e pH foram ajustados para serem comparáveis ao tampão de equilíbrio na Tabela 17. A solução de proteína diluída é aplicada à coluna de Q Sepharose FF com uma carga de 5000 - 25 000 IU/mL, que a seguir é 6rinçada com tampão de equilíbrio e a seguir lavada com tampão de lavagem seguido por eluição de FVIII, como descrito na tabela 17. Tabela 17: Tampão usado para etapa de troca de anions (Q-Sepharose)

Etapa 9: Etapa de cromatografia de filtração com gel

[0150]Uma resina de filtração com gel (Superdex 200 pg, GE Healthcare Cat. N° 17-1043) foi empacotada para uma altura de leito de 60-75 cm. O material de partida usado é a eluato-Q obtido da etapa 8. A coluna é equilibrada com uma composição fisiológica aceitável que protege o produto de adsorção de superfície e estabiliza o mesmo durante congelamento, estocagem, secagem por congelamento, etc. O eluato-Q é aplicado à coluna de filtração com gel com um volume de 2-8% do volume total de coluna. O eluato contendo FVIII formulado, destituído de fragmentos e agregados, é coletado após a coluna (eluato- GF).

[0151]A tabela 18 resume os resultados das etapas de purificação descritas em etapas 1-4, de quatro bateladas de purificação de escala piloto (originando-se de aproximadamente 50 L ((BPP077-078) e 100 L (BPP080-081) de material de suspensão de células (descrito no exemplo 1).

* Medida com Brad ford

[0152]Bateladas colhidas por captura BPP077 e BPP078 foram reunidas a batelada de purificação a jusante BPP079, enquanto batelada BPP080 foi representada BPP083 e BPP081 representada BPP084. A tabela 19 resume os resultados sobre as etapas de cromatografia descritas em etapas 5-9, na parte a jusante de três bateladas de purificação em escala piloto.

Rendimento calculado sobre a etapa Q, ** Rendimento calculado sobre a etapa GF, *** Medida com Bradford, **** Medida com análise de aminoácidos

[0153]A figura 3 mostra padrão de manchamento com prata de SDS-PAGE do produto final antes (faixa 3 - BPP083, faixa 7 - BPP084) e após (faixa 6 - C810A139, Faixa 8 - C811A139) formulação, purificado de acordo com exemplo 9 (tabelas 18-19). A faixa 2 mostra um marcador molecular, faixa 3 mostra uma amostra controle de FVIII e faixa 4 mostra um produto FVIII comercialmente disponível (ReFacto - Lote C66202).

[0154]A figura 4 mostra Western blot de FVIII usando anticorpos FVIII anti-humanos policlonais. Faixas 1 e 10 são vazias, faixa 2 mostra um padrão de massa molecular (Precision Plus Protein Western C de Bio-rad), faixa 3 mostra um produto FVIII comercialmente disponível ReFacto lote C66202, faixas 46 mostram amostras controles de FVIII, faixas 7-9 mostram produtos formulados finais de bateladas BPP079, BPP083 e BPP084 purificadas de acordo com o exemplo 9 (tabelas 17-18). Amostras forram diluídas para uma concentração de FVIII correspondendo a 5 IU FVOOO: C/mL antes de aplicação ao western blot.

[0155]A figura 5 mostra 2-D-PAGE seguindo manchamento com prata e western blotting de produtos formulados finais de bateladas BPP079 e BPP083, produto final (eluato-GF) de bateladas BPP079 eluato GF e BPP083 eluato GF, purificados de acordo com o exemplo 9(tabelas 17-18). Um produto FVIII comercialmente disponível (ReFacto, Lote 70591) foi usado como referência. Painel esquerdo: imagens manchadas com prata de géis com eluatos -GF BPP079 e BPP083 e ReFacto. Painel direito: Imagens de Western blot com eluatos -GF de BPP083 e ReFacto. Conclusão de exemplo 9

[0156]O processo de purificação descrito pode ser realizado em escala industrial em uma maneira que é reproduzível com relação à recuperação, pureza e qualidade de produto. Adicionalmente ele satisfaz a alta demanda de pureza para ser capaz de usar o produto para tratamento de humanos.

Exemplo 10: Escala industrial de sequência de purificação sem ligante de afinidade específica (resina multimodal de anions; ao invés Capto Adhere)

[0157]Para estudar a reproduzibilidade de recuperação e pureza, etapas de purificação 2-3 (capto MMC e SP Sepharose FF) e etapa 5 (inativação de vírus), como descrito no exemplo 9 foram realizadas para duas bateladas (BPP068-069) em escala piloto. A seguir as duas bateladas foram reunidas para uma batelada a jusante (BPP071) e processada de acordo com as etapas 6-9 no exemplo 9, com a exceção de que a etapa 6 (o gel VIIISelect) foi trocada por uma etapa de cromatografia multimodal de troca de anions (Capto Adhere). A etapa de purificação inteira pode ser estudada em Apêndice 2. Cada batelada (BPP068-069) originando-se de aproximadamente 50 L de suspensão de células, como descrito nos exemplos 1-2. A etapa Capto Adhere

[0158]A coluna multimodal de troca de anions (Capto Adhere, GE Healthcare, cat. N° 17-5444) foi carregada na faixa de 5 000 - 10 000 IU FVIII/mL de resina. O gel é equilibrado com tampão de equilíbrio antes de aplicação de produto. A solução de vírus inativado (como descrito no exemplo 9, etapa 5) é carregada para a coluna Capto Adhere que a seguir é rinçada com tampão de equilíbrio e lavada sequencialmente com tampões de lavagem 1-3 seguido por eluição de FVIII, como descrito na tabela 20.

Tabela 21: Resumo de resultados das duas primeiras etapas de cromatografia (de acordo com exemplo 9, etapas 2-3) de duas bateladas de purificação em escala piloto

1) Rendimento calculado sobre a etapa SP * Medida com Bradford Tabela 22: Resumo de resultados sobre as etapas de cromatografia (etapa 5 - exemplo 9, Capto Adhere, etapas 8-9 de exemplo 9) na parte a jusante de uma batelada de purificação em escala piloto.

2) Rendimento calculado sobre a etapa Capto Adhere 3) Rendimento calculado sobre a etapa Q Sepharose 4) Rendimento calculado sobre a etapa de filtração com gel * Medida com Bradford

[0159]A figura 6 mostra um gel de manchamento com prata de SDS-PAGE de amostras de batelada piloto BPP071 purificada de acordo com o exemplo 10. A faixa 1 mostra um produto FVIII comercialmente disponível (ReFacto). A faixa 2 mostra o material de partida (filtrado-SP) antes de etapa de Capto Adhere. A faixa 3 mostra o perfil de pureza do eluato de Capto Adherte. A faixa 4 mostra a pureza após a sequência de purificação filtrado SP - Capto adhere - Q Seph. A faixa 5 mostra a pureza após a sequência de purificação filtrado SP - Capto Adhere - Q Seph - filtração com gel.

[0160]A figura 7 mostra um gel de Western blot de amostras de batelada piloto BPP071 purificada de acordo com exemplo 10. A faixa 1 mostra um produto FVIII comercialmente disponível (ReFacto). A faixa 2 mostra o eluato de Capto Adhere. A faixa 3 mostra o resultado da sequência de purificação filtrado SP - Capto Adhere - Q Seph. A faixa 4 mostra os resultados após a sequência de purificação de filtrado SP - Capto Adhere - Q Seph - filtração com gel.

Conclusão de Exemplo 10

[0161]O processo de purificação em escala piloto, incluindo uma etapa de cromatografia multimodal (Capto Adhere) ao invés do ligante de afinidade VIIISelect, revela a mesma recuperação, pureza e qualidade de produto no eluato-GF final. Descrição de Análises FVIII: C, Processo de separação baseado em Coatest

[0162]O processo é baseado em um princípio de dois estágios, e foi realizado usando técnica de microplaca. Em estágio um, fator x ativado (Xa) é gerado via o caminho intrínseco onde FVIII: C atua como um cofator. Em estágio dois, Fator Xa é então determinado através de uso de um substrato cromogênico sintético, S-2222 na presença de um inibidor de trombina I 2581 para prevenir hidrólise do substrato por trombina. A reação é interrompida com ácido, e a atividade VIII: C, que é proporcional à liberação de pNA (para-nitroanilina), é determinada fotometricamente em 405 nm contra um branco de reagente.

[0163]O processo aquiesce com os requisitos na farmacopeia Europeia. A unidade de FVIII: C é expressa em unidades internacionais (IU) como definidas no atual International Concentrate Standard (IS) estabelecido pela World Health Organization (WHO). A rotina usando tampão contendo BSA 1% ao invés de plasma hemofílico severo para pré-diluições foi validada. Vide também referências de literatura (European Pharmacopoeia Supplement 2000, general Methods, 2.7.4. Assay of Blood Coagulation FVIII; Rosén S (1984) Assay of FVIII: C with a Chromogenic Substrate. J, Haematol, Suppl 40, vol 33, 139-145, 1984; Carlebjork G, Oswaldsson U, Rosén S (1987) A simple and accurate micro plate assay for the determination of FVIII activity. Thrombosis Research 47; 5-14, 1987; Mire-Sluis AR, Gerrard T, Gaines das R, Padilla A and Thorpe R. Biological assays: Their Role in the development and quality Control of Recombinant Biological Medicinal Products. Biological, 24, 351-362 (1996)). Determinação de proteína total de acordo com Bradford

[0164]Determinação de proteína de acordo com Bradford é baseada na observação de que o máximo de absorbância para uma solução ácida de Azul Brilhante Coomassie G-250 desvia de 465 nm para 595 nm quando ocorre ligação a proteína. Ambas interações, hidrofóbicas e iônicas estabilizam a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de cor. O ensaio é útil uma vez que o coeficiente de extinção de uma solução de complexo de corante - albumina é constante sobre uma faixa de concentração de 10 vezes. Vide também a referência Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976, para ainda informação.

Determinação de proteína total de acordo com análises de aminoácidos (AAA)

[0165]Antes de AAA todas as proteínas são hidrolisadas por HCl a 6M por 24 h a 110oC. Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca de cátions sobre resinas poliestireno sulfonadas e continuamente detectadas no eluente. A detecção é baseada em derivação com ninidrina após-coluna usando um fotômetro dual para medição simultânea em 440 nm para prolina e hidroxiprolina e 570 nm para todos os outros aminoácidos. Os aminoácidos asparagina, e glutamina são ambos desaminados durante AAA e são determinados como ácido aspártico e ácido glutâmico, respectivamente. Assim, os resultados de ácido aspártico e ácido glutâmico representam a soma de ácido aspártico/asparagina (Asx) e ácido glutâmico/glutamina (Glx), respectivamente, na amostra original. Triptofano não está gerando uma resposta distinta usando este processo, e, assim, não é quantificado pela AAA. Cisteína é destruída durante a hidrólise e não é quantificada. A AAA é ainda descrita em referência: Total protein AAA analytical method. Spackman, D. H., Stein, W. H., and Moore, S. (1958) Anal. Biochem. 30: 11901206.

Pureza ou atividade específica (FVIII: C/proteína total)

[0166]A pureza (ou também chamada atividade específica) para uma amostra, é calculada tomando o valor obtido das análises FVIII: C e dividindo o mesmo com o valor obtido das análises de proteína total.

SDS-PAGE (distribuição de peso molecular)

[0167]Eletroforese de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) envolve a separação de proteínas baseado no seu tamanho. Este processo descreve a SDS-PAGE de proteínas, que é corrida sob condições reduzidas. Através de aquecimento de amostra sob condições desnaturantes e redutoras, proteínas tornam-se desdobradas e revestidas com detergente aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS), adquirindo uma alta carga negativa líquida que é proporcional ao comprimento da cadeia de polipeptídeo. Quando carregadas sobre uma matriz de gel de poliacrilamida e colocadas em um campo elétrico, as moléculas de proteína carregadas negativamente migram na direção de eletrodo carregado positivamente e são separadas por um efeito de peneiramento molecular, isto é, através de seu peso molecular. Géis de poliacrilamida restringem que maiores moléculas migrem tão rápido quanto menores moléculas. Devido a razão de carga-para-massa ser aproximadamente a mesma entre SDS-polipeptídeos desnaturados, a separação final de proteínas é quase inteiramente dependente das diferenças em massa molecular relativa de polipeptídeos. Em um gel de densidade uniforme a distância de migração relativa de uma proteína (Rf) é negativamente proporcional ao log de sua massa. Se proteínas de massa conhecida são corridas simultaneamente com as desconhecidas, a relação entre Rf e massa pode ser feita um gráfico, e as massas de proteínas desconhecidas estimadas. As bandas de proteína separadas por eletroforese são visualizadas através de manchamento com prata. Avaliação é feita visualmente através de julgamento de aparências dos padrões, amostras de referência (amostra controle) e analisadas. Processo analítico DNA (reação de cadeia polimerase quantitativa, qPCR)

[0168]O ensaio é um ensaio PCR quantitativo em tempo real (qPCR) baseado em química SYBR Green 1. Ele é baseado em uma publicação de Umetani et al. com alguns aperfeiçoamentos adicionados (Umetani N, Kim J, Hiramatzu S, Reber HA, Hines OJ, Bilchik AJ and Hoon DSB. Increased Integrity of Free Circulating DNA in Sera of Patients with Colorectal or Periampullary Cancer: Direct Quantitative PCR for ALU Repeats. Clin Chem 2006;52: 1062-1069). Durante cada ciclo de PCR um fragmento de 115 pares de bases das famílias de sequências ALU é amplificado pelos iniciadores, ALU115-F e ALU115-R. A família de sequências ALU altamente abundante é limitada para genoma da família Hominidae (Chimpanzé, Gorila, Humano e Orangotango), mas o ensaio somente amplifica DNA de origem humana. O procedimento permite análise de alta produtividade de DNA de HEK293F residual em meios de cultura de tecido livres de células e seus processos de purificação a jusante. Western Blot, distribuição de massa molecular de FVIII

[0169]Proteínas e peptídeos em preparações de FVIII são separados de acordo com massa molecular através de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) dodecil sulfato de sódio (SDS) sob condições redutoras. A seguir, as proteínas são transferidas eletroforeticamente da matriz de gel para uma membrana de nitrocelulose que é subsequentemente incubada com um agente de bloqueio. Anticorpos ovelha policlonais direcionados para a molécula de FVIII inteira são então adicionados seguidos por um anticorpo secundário que é específico para a parte Fc de anticorpos cabra/ovelha. Como uma terceira etapa complexos solúveis de anticorpo cabra para peroxidase de raiz forte (HRP) e HRP são adicionados. Polipeptídeos FVIII são então detectados através de ocorrência de bandas azuis após incubação com o substrato 4-cloro-1-naftol.

Eletroforese de gel de poliacrilamida bidimensional (2-D PAGE)

[0170]2-D-PAGE foi realizada de modo a estudar o padrão de banda eletroforética das cadeias de proteína de rhFVIII humano- cl. Foco isoelétrico foi realizado como a corrida de primeira dimensão usando um gradiente de pH linear de 3 a 10. A SDS- PAGE de segunda dimensão foi corrida usando géis de gradiente de poliacrilamida (3-8%). Os géis foram manchados com uma mancha de prata seguindo a corrida de segunda dimensão ou foram submetidos a Western blotting (O’Farrell PH (1975) High resolution two-dimensional elestrophoresis of proteins. J Biol Chem 250: 4007-4021).

Claims (13)

1. PROCESSO DE PURIFICAÇÃO OU ENRIQUECIMENTO DE FATOR FVIII DE COAGULAÇÃO empregando cromatografia, caracterizado por compreender as etapas de: - provimento de uma fração contendo FVIII em uma solução aquosa tendo uma alta resistência iônica; - contato da fração contendo FVIII com uma resina multimodal; - lavagem de resina multimodal tendo FVIII adsorvido com um tampão de lavagem aquoso; - eluição das frações contendo FVIII com um tampão de eluição aquoso compreendendo pelo menos um aminoácido que é carregado positivamente em pH 6 a 8; em que o dito pelo menos um aminoácido é selecionado a partir de lisina ou arginina ou uma combinação das mesmas em uma concentração entre 0,4 M e 1 M; e - coleta das frações contendo FVIII em forma enriquecida ou purificada.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela resina multimodal compreender porções ligadas a uma matriz e as porções são capazes de interagir com FVIII em um ambiente aquoso através de interações iônicas e ligação de hidrogênio ou interações hidrofóbicas.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo FVIII ser FVIII com domínio-B suprimido.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela solução aquosa compreender FVIII em uma solução de alta concentração de sal correspondendo a uma condutividade de Coleta 25 a 200 mS/cm a 25oC.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tampão de eluição adicionalmente compreender pelo menos um composto orgânico contendo grupo hidroxila, pelo menos um composto orgânico contendo grupo amino, pelo menos uma fonte provendo íons Ca2+, pelo menos um composto para regular a resistência iônica do tampão, pelo menos um detergente não-iônico e pelo menos uma substância tamponante para regular o pH de 6 a 8.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo composto orgânico contendo grupo hidroxila ser selecionado a partir do grupo consistindo em metanol, propanol, etileno glicol e propileno glicol; a fonte provendo Ca2+ ser CaCl2; o composto para regular a resistência iônica do tampão ser selecionado a partir do grupo consistindo em KCl e NaCl; o detergente não iônico ser selecionado do grupo consistindo em Tween 20, Tween 80 e Pluronic F68; a substância tamponante ser selecionada a partir do grupo consistindo em citrato de sódio, histidina, HEPES, MES e acetato de sódio em um pH entre 6-8.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo tampão de lavagem ser aplicado à resina multimodal, para lavagem de quaisquer contaminantes e reter FVIII antes de FVIII ser liberado.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela resina de cromatografia "multimodal" conter pelo menos uma das seguintes porções: a. um ligante N-benzil-N-metil etanol amina carregado positivamente, b. um ligante ácido 2-(benzoilamino) butanoico carregado negativamente, c. um ligante fenil propila, d. um ligante N-hexila, e. um ligante 4-mercapto etil piridina, f. um ligante ácido 3-((3-metil-5-((tetra- hidrotetra-hidrofuran-2-il metil) amino) fenil) amino) benzoico ou suas combinações.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela resina de cromatografia "multimodal" ser selecionada das seguintes resinas comercialmente disponíveis HEP Hypercel; PPA Hypercel; Capto Adhere; Capto MMC; MEP Hypercel.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela etapa de cromatografia multimodal ser combinada com uma etapa de cromatografia de afinidade de FVIII, onde a afinidade é provida por um ligante que é baseado em uma proteína expressa em levedura.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela sequência de purificação ainda compreender etapas de remoção/inativação de patógenos compreendendo uma etapa de inativação baseada em química, uma etapa de remoção baseada em tamanho, etapas de cromatografia ou suas combinações cujas etapas são baseadas em diferentes propriedades fisiológicas direcionadas para o patógeno a ser removido.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela sequência de purificação compreender as seguintes etapas: i. uma membrana aniônica Sartobind Q, para redução de DNA; ii. uma resina multimodal de cátions Capto MMC; iii. uma resina trocadora de cátions SP Sepharose FF; iv. uma membrana aniônica Sartobind, Q para redução adicional de DNA; v. uma etapa de inativação por solvente/detergente para vírus envelopados em lipídeo empregando fosfato de tri- n-butila e Triton X-100; vi. uma resina de afinidade baseada em um ligante de proteína consistindo em um fragmento de anticorpo expresso em levedura ou uma resina de cromatografia multimodal de ânions Capto Adhere; vii. uma etapa de remoção de filtração de patógeno com um tamanho médio de poro de 20 nm utilizando Planova 20N; viii. uma resina trocadora de ânions Q Sepharose FF; ix. uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho Superdex 200pg.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelas condições de eluição para FVIII da etapa de troca de cátions serem baseadas em Ca, a concentração variando de 0,15-0,25 M e a condutividade total do tampão de eluição não aumentando de 25 mS/cm a 25oC.

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