BR112012024550B1

BR112012024550B1 - processo de produção de uma proteína dependente de vitamina k livre de príons em uma sequência de purificação que emprega cromatografia

Info

Publication number: BR112012024550B1
Application number: BR112012024550-3A
Authority: BR
Inventors: Gustav Gilljam; Stefan Winge
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2020-12-08
Also published as: AU2011234521A1; KR20130010474A; JP2013523689A; CN102858971A; RU2016122883A; IL221609A; RU2590726C2; JP5876868B2; RU2012146084A; WO2011121020A1; US20130079498A1; EP2553095A1; CN102858971B; DK3133157T3; KR101829860B1; ZA201207227B; IL248549A0; BR112012024550A2; TR201911082T4; DK2553095T3

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DEPENDENTES DE VITAMINA K TAL COMO O FATOR DE COAGULAÇÃO IX. Processo de produção de uma proteína dependente de vitamina K livre de príons em uma sequência de purificação que emprega cromatografia caracterizado pelo fato de que - pelo menos uma etapa de cromatografia é realizada utilizando uma resina multimodal - fornecimento de uma fração que contém proteína dependente de vitamina K em uma solução aquosa; - contato da fração que contém a proteína dependente de vitamina K com uma resina multimodal em um pH entre 6-9; - opcionalmente lavagem da resina multimodal que possui a proteína dependente de vitamina K adsorvida com um tampão de lavagem aquoso para lavar contaminantes e reter a proteína dependente de vitamina K, antes da proteína dependente de vitamina K ser eluída; - a proteína dependente de vitamina K é eluída da resina multi-modal em um pH entre 6 até 9 em um tampão que compreende arginina; e - opcionalmente coleta de frações que contêm proteína dependente de vitamina K na forma purificada ou enriquecida.

Description

A presente invenção refere-se a um processo de purificação de proteínas dependentes de vitamina K tal como o fator de coagulação IX (abreviado como FIX) e uma fração que contém uma proteína dependente de vitamina K tal como FIX que pode ser obtido através do processo da invenção.

A hemofilia é um grupo de distúrbios genéticos hereditários que prejudicam a capacidade do corpo de controlar a coagulação sanguínea ou a coagulação. Em uma de suas formas, Hemofilia B, o fator de coagulação IX (FIX) é deficiente, a Hemofilia B ocorre em aproximadamente 1 em 25.000 nascimentos do sexo masculino. O fator IX (ou fator Christmas) é uma das serina proteases do sistema de coagulação. É uma proteína do plasma dependente de vitamina K que participa da via intrínseca de coagulação sanguínea através da conversão do fator X em sua forma ativa na presença de íons Ca2+, fosfolipídeos e fator VIIIa. A proteína FIX é um fator essencial na coagulação sanguínea com propriedades multifuncionais.

O Fator IX (FIX) é uma glicoproteína de cadeia simples que contém 461 aminoácidos. É sintetizado primariamente no fígado e secretado no plasma. A molécula do fator IX consiste de vários domínios funcionais distintos, incluindo um peptídeo sinal, um pró-peptídeo, um domínio Gla, dois domínios similares ao fator de crescimento epidérmico (EGF), um peptídeo de ativação e um domínio similar à tripsina catalítico (domínio de serina protease) (O pró-peptídeo é clivado antes da secreção para criar a molécula de FIX de 415 aa madura). A proteína é adicionalmente processada em uma forma ativa, em um heterodímero que consiste de uma cadeia leve e uma cadeia pesada ligadas por uma ligação dissulfeto.

A deficiência de FIX pode ser tratada com concentrados derivados do plasma de FIX ou com FIX produzido de forma recombinante. O tratamento com concentrados de FIX levou a uma vida normalizada dos pacientes com hemofilia. Historicamente, a Hemofilia B foi tratada com FIX origi

nado do plasma sanguíneo humano. No plasma sanguíneo, sob condições normais, a molécula de FIX fica circulante em sua forma nativa, enquanto é ativada através de um processo complicado iniciado na cascata sanguínea de enzimas de coagulação.

Os produtos de FIX derivados do plasma ocorrem no mercado com purezas diferentes dependendo de qual método de purificação é aplica-do. Os métodos utilizados para purificar FIX eram normalmente uma combi-nação de etapas de cromatografia diferentes (principalmente etapas de troca iônica e de afinidade, para a(s) etapa(s) de purificação e ultrafiltração para concentração / dessalinização do produto.

Harrison e outros (S. Harrison e outros Sem Hematol 35 (Supl 2): 4-10 (1998) descrevem o processo de produção de um FIX recombinante (Benefix®) produzido em células CHO. As células são coletadas por microfil- tração e subsequentemente concentradas em uma etapa de ultrafiltra- ção/diafiltração onde o tampão é trocado por um tampão Tris para fornecer um tampão coerente para carregamento sobre a primeira coluna de croma-tografia.Quatro etapas de cromatografia independentes são utilizadas para a purificação de rFIX, a primeira é uma etapa de troca aniônica (Q Sepharose FF), que é realizada em um modo de pseudoafinidade. A coluna é eluída com cloreto de cálcio a 10 mM em pH 8,0. O cloreto de cálcio induz uma alteração na conformação na molécula de FIX que faz com esta se solte da coluna.

A etapa de Q Sepharose é seguida pela purificação dentro de uma coluna de sulfato de celufina Matrex, que é um análogo de heparina utilizado para purificação por afinidade de proteínas com domínios que se ligam à heparina. Esta também se comporta como uma resina de troca cati- ônica devido aos grupos sulfatos carregados negativamente. A etapa de pu-rificação com celufina remove baixos níveis de HCPs.

O eluato de celufina é carregado sobre uma coluna de Cerâmi- ca-Hidroxiapatita, que é uma forma sintética de fosfato de cálcio. Esta é utili-zada para separar proteínas de cargas variáveis e fornece a possibilidade de remover formas de atividade específica inferiores de rFIX. Esta coluna é elu- ida com uma eluição em etapas através do aumento da concentração de fosfato até uma concentração final de 0,5 M.

A etapa de purificação final no processo de produção de Bene- fix® é Chelate-EMD-Cu(ll). As proteínas interagem com os metais imobiliza-dos retidos pela resina. O rFIX ligado é eluído com imidazol como um deslo-cador e os contaminantes traços são removidos nesta etapa de purificação, que é seguida por uma etapa de filtração de vírus (Viresolve-70) e finalmente através de uma etapa de ultrafiltração/diafiltração em que o rFIX é concen-trado e o tampão é trocado pelo tampão de formulação.

O processo de produção de rFIX descrito anteriormente é coe-rente, 65 bateladas foram analisadas e foi observado que a atividade especí-fica era de 276 ± 23 IU/mg. O conteúdo de Gla era 11,4±0,1 moles Gla/mol de rFIX e as impurezas totais foram observadas como sendo de 0,01 ±0,01 % e 0,03±0,01 % determinado por RP-HPLC e HCP-ELISA, respectivamente.

Lindsay e outros (J Chrom A 1026: 149-157 (2004)) descrevem um método para purificar rFIX partindo de leite suíno transgênico. Heparina Sepharose FF foi utilizada como a primeira etapa no esquema de purificação, seguida por uma etapa de troca aniônica.

O domínio de ligação com a heparina do fator IX fica localizado na extremidade C-terminal da molécula. Esta região não possui PTMs e assim a etapa de cromatografia com heparina permite que a população inteira de rFIX seja isolada. A atividade específica do eluato era de 30-35 IU/mg, que indica que uma fração grande é inativa. As subpopulações de rFIX ativas foram separadas das subpopulações inativas durante uma eluição em gradiente da coluna de AIEX.

Kaufman e outros (JBC 261:9622-9628 (1986)) descrevem a ex-pressão de rFIX nas células CHO e a purificação da proteína. O meio de cul-tura de células que contém rFIX foi concentrado por ultrafiltração e submetido à diálise contra um tampão contendo CaCI2 a 3 mM, Tris-HCI a0,05 M e NaCI a 0,5 M antes da aplicação dentro de uma coluna de imunoafinidade com anticorpos específicos para a conformação (anticorpos anti-FIX:Ca(ll)).

A coluna foi subsequentemente eluída com EDTA a 10 mM, Tris-HCI a 0,05 M e NaCI a 0,15 M.

A presença de CaCI2 a 3 mM no material de partida antes da a- plicação na coluna resultou em uma separação entre espécies ativas e inati-vas de FIX. As espécies inativas falharam em se ligar à coluna e o FIX ativo podia ser eluído da coluna com EDTA. A WO-A-2009/007451 divulga um método de purificação de FVIII utilizando uma resina de modo misto ou multimodal. O método de purificação é baseado no contato da proteína FVIII com uma resina multimodal ou de modo misto contendo ligantes que compreendem uma parte hidrofóbica e uma parte carregada negativamente e na eluição da dita proteína FVIII pro-teína com um tampão de eluição que contém pelo menos sal a 1,5 M e pelo menos 40% (p/v) de etileno glicol, propileno glicol ou uma mistura dos mes-mos e íons cálcio. A EP-A-1 707 634 divulga um método para o isolamento de pro-teínas produzidas de forma recombinante, i.a., através de vários métodos tal como cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de afinidade, preci-pitação de proteínas, trocas de tampão, cromatografia de troca iônica, cro-matografia de interação hidrofóbica, meios de cromatografia hidrofóbicos de modo misto/troca iônica, cromatografia quelante, cromatografia de afinidade com lectina ou heparina similar à afinidade com carboidratos, cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese, diálise, agentes de precipitação dife-rentes tais como polietileno glicol, sulfato de amónio, etanol, adsorção à hi- droxiapatita, adsorção à membrana de filtro, ligantes acoplados a partículas magnéticas etc. Entretanto, não identifica etapas de purificação cromatográ- ficas particulares. A WO-A-2005-082483 divulga um processo para a purificação de anticorpos de uma ou mais impurezas em um líquido, cujo processo compreende o contato do dito líquido com uma primeira coluna de cromato-grafia compreendida de um suporte ao qual ligantes multimodais foram imo-bilizados para adsorver os anticorpos para a resina, em que cada ligante multimodal compreende pelo menos um grupo de troca catiônica e pelo me- nos um sistema de anéis aromáticos ou heteroaromáticos. Um eluente é adi-cionado para liberar os anticorpos da resina e o eluato é colocado em contato com uma segunda resina de cromatografia. A WO-A-2005/121163 divulga um processo para o isolamento de uma ou mais proteínas de uma solução de proteína. O processo compreende as etapas de fornecimento de uma solução de proteína que compreende uma ou mais proteínas específicas e que possui um pH pré-ajustado e uma força iônica ou uma condutividade pré-ajustada, aplicando a solução de proteína a uma coluna de adsorção que compreende uma partícula com pelo menos um núcleo não poroso de alta densidade circundado por um material poroso, o adsorvente compreende uma densidade de partícula de pelo menos 1,5 g/mL e um diâmetro de partícula de volume médio de no máximo 150 pm. A coluna é opcionalmente lavada antes da eluição da(s) proteína (s) do adsorvente. A WO-A-2009/156430A1 divulga um método de purificação de FVIII utilizando uma resina de modo misto ou multimodal. O método de puri-ficação se baseia no contato da proteína FVIII em uma solução que possui uma força iônica alta com uma resina multimodal ou de modo misto que con-tém ligantes que compreendem uma parte hidrofóbica e uma parte carregada negativamente e na eluição da dita proteína FVIII com um tampão de eluição que compreende pelo menos um aminoácido que é carregado positivamente em pH 6-8.

Com a finalidade de aprimorar os produtos que contêm FIX, foi empregada a cromatografia por afinidade específica direcionada contra a molécula de FIX molécula, que removia eficientemente os contaminantes até um alto grau de pureza de FIX. A desvantagem da cromatografia por imuno- afinidade utilizada frequentemente era que esta é relativamente cara e que os anticorpos monoclonais utilizados como ligantes de afinidade, eram de origem animal.

Na metade dos anos 80 havia algumas transmissões virais as-sociadas com os produtos de FIX derivados do plasma. Mesmo se este pro-blema fosse resolvido através da implementação de etapas de redução virai específicas, este era o ponto de partida do desenvolvimento de produtos de FIX recombinantes (rFIX). Nos anos 90, o primeiro produto de rFIX foi co-mercializado e até agora é o único.

Um objetivo da invenção era fornecer um processo através do qual os inconvenientes dos processos de purificação de proteínas depen-dentes de vitamina K, em particular FIX na arte anterior poderiam ser evita-dos. É sabido partindo da arte anterior que uma desvantagem de resinas para cromatografia de troca iônica tradicionais (como, por exemplo, resinas para cromatografia de troca iônica SP-, CM-, Q- ou DEAE Sepharose FF) é que a ligação da proteína à resina só pode ser realizada dentro de concentração de sal (condutividade) e pH relativamente baixos, tipicamente na faixa de 0,01-0,15M de concentração de sal (NaCI etc.). A faixa de pH ótima é dependente do fato de um trocador catiônico ou de um trocador aniônico ser utilizado e do ponto isoelétrico do produto alvo que será ligado na resina. Em geral a faixa de pH em que uma proteína se liga a uma resina de troca iônica é tipicamente aproximadamente uma unidade de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico do produto alvo.

Em certas aplicações seria uma demanda ser capaz de utilizar as condições de purificação relativamente suaves que uma etapa de croma-tografia de troca iônica exerce sobre as proteínas, ainda diretamente (sem diluição adicional) a uma resina de cromatografia em uma força iônica de alguma maneira maior e em um pH fora da faixa normal que não pode ser utilizado para cromatografia de troca iônica convencional.

A cromatografia multimodal (ou de modo misto) é uma ferramenta para a purificação de proteínas. Descrito, por exemplo, na folha de dados do Fabricante da GE Healthcare (11-0035-45AA) Capto Adhere, folha de dados do Fabricante da GE Healthcare (28-9078-88AA) Capto MMC e WO- A-2009/024620 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins". Uma desvantagem é que a eluição inclui frequen-temente condições relativamente rigorosas como, por exemplo, pH abaixo ou acima do pH neutro, isoladamente ou em combinação com outros parâmetros de eluição tal como, por exemplo, etileno glicol e como, por exemplo, descritos na WO-A-2009/007451.

Uma força iônica maior pode ser uma vantagem significativa para a estabilidade da proteína em uma solução de proteína, especialmente em uma preparação de proteína bruta como na coleta de proteínas recombi- nantes ou em produtos derivados do plasma onde proteases potenciais estão presentes na solução que podem afetar a proteína alvo negativamente.

As proteases funcionam frequentemente melhor em condições de pH fisiológico (como é o caso na maioria dos sistemas celulares), isto é, aproximadamente pH 7 e uma concentração de sal de aproximadamente 0,15M, isto pode ser vantajoso para alterar estas condições para minimizar os efeitos de proteases. Tais alterações podem ser tipicamente realizadas através da adição de sal e/ou da alteração do pH. Ambos estes parâmetros são críticos para o desempenho de uma etapa de cromatografia de troca iônica convencional e assim frequentemente impossível de atingir. Assim outro objetivo da invenção era fornecer um processo em que este problema foi resolvido e tornar possível adicionar sal e/ou alterar o pH em amostras de proteína brutas que compreendem fatores potencialmente proteolíticos tais como proteases que poderiam degradar a proteína alvo. O processo deve ainda ser capaz de processar a solução de proteína com menos medidas adicionais possíveis e de ligar a proteína alvo a uma resina para cromatogra-fia. Isto forneceria uma etapa otimizada de concentração e purificação da proteína alvo partindo de uma amostra bruta ou purificação adicional a jusante utilizando, por exemplo, outras etapas de cromatografia tal como cro-matografia por afinidade.

A necessidade tem importância específica, porque a degradação da proteína alvo durante a purificação seria prevenida ou pelo menos dimi-nuída.

Isto torna possível remover proteases e outros contaminantes, que poderiam estar presentes em uma coleta bruta, antes da eluição da pro-teína alvo.

Outro objetivo da invenção era fornecer um processo de purifi-cação de uma proteína dependente de vitamina K tal como FIX, em particu- lar partindo de uma coleta de cultura de células de FIX recombinante.

De acordo com a invenção o objetivo é realizado através de um processo de purificação de uma proteína dependente de vitamina K tal como FIX em uma sequência de purificação que emprega cromatografia em que -pelo menos uma cromatografia é realizada utilizando uma resina multimodal -proteína dependente de vitamina K tal como FIX se liga à resina multimodal e -proteína dependente de vitamina K tal como FIX é eluída da resina multimodal em um pH entre 6 até 9 em um tampão que compreende arginina.

Sete glicoproteínas do plasma são conhecidas como sendo de-pendentes da vitamina K para sua biossíntese. Estas são protrombina (fator II), fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S e proteína Z. O domínio Gla é uma característica estrutural comum em todas estas proteínas depen-dentes de vitamina K e imediatamente após o domínio Gal, cada uma das proteínas (exceto protrombina) possui um ou mais domínios similares ao EGF. As proteínas dependentes de vitamina K requerem íons Ca2+ para expressarem sua função fisiológica e os sítios de ligação ao cálcio envolvem pelo menos o domínio Gla e os domínios similares ao EGF. A ligação ao cál-cio possibilita que estas proteínas se liguem aos fosfolipídeos/membranas celulares e assim expressem suas atividades biológicas completas.

A presente invenção utilizando uma resina multimodal como uma etapa de purificação de captura fornece a possibilidade de ajustar a concen-tração de sal e o pH em valores que minimizam o risco de proteases ativas na solução de proteína durante a ligação da proteína alvo a etapa de croma-tografia multimodal.

Uma vantagem do processo da invenção é a possibilidade de a- plicar adicionalmente uma etapa de lavagem antes da eluição da proteína alvo após a ligação da proteína alvo à resina multimodal, por exemplo, utili-zada como uma etapa de captura em um processo recombinante. Isto é conseguido através da utilização da resina multimodal para lavar a resinaatravés da seleção de um tampão de lavagem adequado para remover pro-teases e outros contaminantes que se aderem na resina multimodal, antes da eluição da proteína alvo. O tampão de lavagem adequado é preferencialmente um que contém um sal ou um aminoácido ou um componente tam- ponante ou misturas dos mesmos em um pH adequado para ainda inibir a atividade de protease durante a etapa de remoção por lavagem.

O processo da invenção torna possível eluir a proteína alvo, li-gada à resina multimodal, em um ambiente de eluição suave com proprieda-des de eluição distintas (isto é, em um volume menor possível). Isto foi atin-gido através da utilização de um maior pH ou uma maior concentração de sal ou da adição de um aminoácido ou combinação dos mesmos. O processo da invenção fornece vantagens tal como a inibição de agregados, preservando a estrutura da molécula ativa e fornecendo um baixo volume para o processamento a jusante adicional.

A presente invenção facilita ainda um processo de purificação sem a adição de aditivos estabilizantes derivados de humanos ou animais e o uso de um processo inteiro que está ausente dos mesmos (resinas de i- munoafinidade baseadas em anticorpos monoclonais). O uso da resina mul-timodal, em particular, como a etapa de captura, facilita ainda uma capaci-dade de ligação maior em comparação com trocadores iônicos convencio-nais, que resulta em um eluato de produto mais concentrado partindo da co-luna, que pode ser vantajoso para a estabilidade do produto.

De acordo com uma modalidade da invenção a cromatografia multimodal pode ser realizada dentro de uma coluna cromatográfica. Isto pode ser considerado como uma primeira etapa de captura. O processo da invenção também pode ser realizado em um modo de batelada.

Em uma modalidade da invenção a cromatografia em resinas multimodais é combinada com uma cromatografia em uma resina que possui um ligante de afinidade derivado de levedura, empregando uma pureza de >90% após a eluição da proteína dependente de vitamina K tal como a Pro-teína FIX.

Em outra modalidade adicional da invenção a etapa da resina

multimodal e a etapa de cromatografina com ligante de afinidade derivado de levedura são combinadas com outra etapa de purificação por cromatografia para exercer uma pureza de mais de 99% no produto final dependente de vitamina K tal como a Proteína FIX.

Portanto, ainda uma composição de importância é objetivo da invenção cuja composição de importância compreende uma proteína depen-dente de vitamina K purificada tal como FIX que pode ser obtida através do processo de acordo com a invenção (sem a adição ou o uso de quaisquer aditivos humanos ou de animais como albumina ou ligantes de imunoafini- dade baseados em anticorpos monoclonais).

Em outra modalidade da invenção a resina multimodal compre-ende grupamentos ligados a uma matriz e os grupamentos são capazes de interagir com a proteína dependente de vitamina K tal como FIX em uma mistura através de interações iônicas e outros tipos de interações tais como ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e tiofílicas.

Em uma modalidade adicional da invenção o ligante de afinidade é um fragmento de Fab derivado de levedura direcionada para proteína de-pendente de vitamina K tal como FIX.

Em uma modalidade adicional da invenção a etapa da resina multimodal é realizada para capturar a proteína dependente de vitamina K tal como FIX partindo de uma solução de proteína bruta em que após o proces-samento do eluato da resina de cromatografia multimodal resultante na etapa de cromatografia com ligante de afinidade derivado de levedura e após a eluição de proteína dependente de vitamina K tal como FIX da dita afinidade etapa de cromatografia, exercendo uma pureza de mais de 90% em relação às proteínas e ao DNA.

Em outra modalidade adicional da invenção que é caracterizada pelo fato de que a pureza do produto final é maior que 99%, se a etapa da resina multimodal realizada para capturar a proteína dependente de vitamina K tal como FIX partindo de uma solução de proteína bruta em que após o processamento do eluato da resina de cromatografia multimodal resultante é adicionalmente processada na(s) etapa(s) de cromatografia adicional(is) se- lecionada(s) de cromatografia por exclusão de tamanho, troca aniônica, troca catiônica, interação hidrofóbica e afinidade por metal imobilizado e um ligante de afinidade derivado de levedura.

Ainda em outra modalidade da invenção a mistura que compre-ende proteína dependente de vitamina K tal como FIX está presente em uma solução.

Ainda em outra modalidade da invenção a proteína dependente de vitamina K tal como FIX está em uma solução de proteína bruta que inclui potencialmente proteases que podem degradar o produto.

Pode ser vantajoso aplicar o tampão de lavagem à resina multi-modal, para lavar os contaminantes (proteases, DNA etc.) e manter a proteí-na dependente de vitamina K tal como FIX, antes desta ser liberada.

Em uma modalidade adicional da invenção, a resina multimodal é lavada com a tampão de lavagem em um pH entre 6-9, antes da eluição da proteína dependente de vitamina K tal como FIX.

Em uma modalidade adicional da invenção a eluição é realizada com arginina como o agente de eluição. De acordo com a invenção, o agente de eluição pode ser combinado com uma maior concentração de sal em que o sal é selecionado da série de Hofmeister. De acordo com a invenção a eluição pode ocorrer parte com a arginina isoladamente ou em combinação com uma maior concentração de sal ou apenas com maior concentração de sal, da qual toda está dentro da faixa de pH entre 6-9, preferencialmente em pH 7,0.

De acordo com a invenção NaCI e KCI são preferidos em relação ao sal compreendido na série de Hofmeister que, por exemplo, são sódio, potássio, amónio, magnésio, cálcio, bário, acetato, fosfato e sulfato.

De acordo com a invenção a concentração de arginina fica, em particular, na faixa de aproximadamente 0,1 M até aproximadamente 2M e 0,1 M até 4M para o sal de acordo com a série de Hofmeister; em particular na faixa de aproximadamente 0,4M até aproximadamente 1,5M para arginina e 0,6 M até 2M para o sal de acordo com a série de Hofmeister ou na faixa de aproximadamente 0,3M até aproximadamente 0,7M para arginina e 0,8 M até 1,2 M para o sal de acordo com a série de Hofmeister.

De acordo com outra modalidade da invenção a proteína depen-dente de vitamina K tal como FIX se liga à resina multimodal em um pH entre 6-9, preferencialmente em pH 7,0.

Em uma modalidade adicional da invenção é utilizada uma subs-tância tamponante que compreende preferencialmente pelo menos uma das substâncias selecionadas do grupo que consiste em citrato de sódio, histidi- na, ácido 2-(4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil)-etano sulfônico (HEPES), ácido 2- (N-Morfolino)etano sulfônico (MES), base Tris e acetato de sódio, em parti-cular, em uma faixa de aproximadamente pH 6 até aproximadamente pH 9.

No processo da invenção um detergente não iônico pode estar presente em qualquer um dos tampões utilizados, cujo detergente não iônico é, em particular, selecionado do grupo que consiste em Polissorbatos (Polis- sorbato 20, 40, 60, 80) e Pluronic F68.

No tampão de eluição com um pH 6-9, preferencialmente em pH 7,0, a quantidade de arginina fica tipicamente na faixa de 0,1 até 2M, em particular 0,5M.

No tampão de eluição com um pH 6-9, preferencialmente pH 7,0, o cloreto de sódio é incluído em uma faixa de 0,1-4M, em particular, em uma faixa de 0,05 até 0,3M.

No tampão de eluição com um pH 6-9, preferencialmente em pH 7,0, a arginina e o cloreto de sódio são incluídos em uma faixa de 0,1-0,5M, em particular, em uma faixa de 0,3 até 0,7M.

No tampão de lavagem com um pH 6-9, preferencialmente pH 7,0, o cloreto de sódio é incluído em uma faixa de 0,01-0,3M, em particular, em uma faixa de 0,05 até 0,15M.

A quantidade de detergente não iônico fica tipicamente na faixa de 0,001 até 1%, em particular, nos tampões para cromatografia multimodal 0,02%.

A resina para cromatografia multimodal que pode ser empregada de acordo com a invenção pode conter pelo menos um dos grupamentos a seguir: a.um ligante de N-Benzil-N-metil etanolamina carregado positi-vamente, b.um ligante de ácido 2-(benzoilamino) butanoico carregado ne-gativamente, c.um ligante de fenilpropila, d.um ligante de N-hexila, e.um ligante de 4-Mercapto-Etil-Piridina, f.um ligante do ácido 3-((3-metil-5-((tetra-hidrofuran-2-ilmetil)- amino)-fenil)-amino)-benzoico ou combinações dos mesmos.

Em particular, uma resina para cromatografia multimodal para uso de acordo com a presente invenção é selecionada das resinas disponíveis comercialmente a seguir HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto A- dhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™.

Em outra modalidade do processo da invenção, a etapa de cro-matografia multimodal é combinada com uma proteína dependente de vita-mina K tal como a etapa cromatográfica por afinidade a FIX em que a afini-dade é fornecida por uma proteína ligante tal como um fragmento de anti-corpo que é expresso, por exemplo, em levedura.

Em outra modalidade da presente invenção a sequência de puri-ficação pode compreender ainda etapas de remoção/inativação de agentes patogênicos que compreendem uma etapa de inativação com base química, uma etapa de remoção com base no tamanho, etapas de cromatografia ou combinações das mesmas cujas etapas são baseadas em propriedades fisi-ológicas diferentes direcionadas para o agente patogênico que será removi-do. Um exemplo de uma etapa de inativação de agentes patogênicos bem descritos na literatura é o método de detergente solvente com base química, por exemplo, com base em fosfato de tri-n-butila e Triton X-100, que rompe todos os vírus com envelope lipídico, divulgado na EP-A-131 740. Um e- xemplo de uma etapa de remoção de agentes patogênicos baseada no ta-manho,é, por exemplo, um nanofiltro com um tamanho de poro médio de aproximadamente 20nm, tal como um filtro Planova 20. Outro exemplo de remoção de agentes patogênicos se baseia em cromatografia. Por exemplo, a cromatografia por afinidade é conhecida por exercer propriedades de re-moção de agentes patogênicos em geral, por exemplo, uma proteína depen-dente de vitamina K derivada de levedura tal como resina de cromatografia por afinidade com ligante FIX.

Em uma modalidade particular do processo da invenção a se-quência de purificação compreende ainda as etapas a seguir: 1.uma resina multimodal catiônica tal como Capto MMC; 2.uma etapa de inativação com base química para vírus envoltos por lipídeos, em particular, a inativação com solvente/detergente empregando fosfato de tri-n-butila e Triton X-100 como divulgado na EP-A- 131 740; 3.uma resina de afinidade baseada em um ligante expresso em levedura; 4.um trocador catiônico tal como SP Sepharose ou Resource S; 5.uma etapa de remoção por filtração de agentes patogênicos com um tamanho de poro médio de aproximadamente 20nm tal como Plano- va 20N; 6.uma etapa de troca e/ou de concentração de tampão tal como ultra filtração com uma faixa aproximada de 10kDa; 7.uma resina de cromatografia por exclusão de tamanho tal como Superdex 200.

Em uma modalidade particular o processo da invenção poderia compreender as etapas a seguir; -Uma resina multimodal Capto MMC™ foi empacotada dentro de uma coluna e equilibrada com um tampão que compreende citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1 M, 0,02% de Polissorbato 80 em pH 7,0. -Foi aplicada a amostra contendo proteína dependente de vita-mina K bruta tal como FIX que compreende aproximadamente as mesmas condições que no tampão de equilíbrio anterior e a proteína alvo e parte de proteínas com impurezas adicionais se ligaram à coluna. -Uma etapa de lavagem, de acordo com a invenção, utilizando o tampão de equilíbrio, foi aplicada à coluna para inibir a atividade proteolítica e para remover proteases, DNA e outros contaminantes, enquanto que a proteína dependente de vitamina K tal como FIX ainda estava ligada à coluna. -a proteína dependente de vitamina K tal como FIX foi eluída, de acordo com a invenção, utilizando o tampão de equilíbrio em que arginina a 0,5M foi adicionada e ajustada em pH 7,0, para atingir uma fração solúvel não agregada de proteína dependente de vitamina K tal como FIX em um volume baixo.

A cromatografia multimodal (ou de modo misto) é uma ferramenta para a purificação de proteínas. Descrita, por exemplo, na folha de dados do Fabricante da GE Health Care (11-0035-45AA) Capto Adhere, folha de dados do Fabricante da GE Health Care (28-9078-88AA) Capto MMC e pedido de patente WO-A-2009/024620 "A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins".

A desvantagem mencionada anteriormente da cromatografia multimodal é evitada por condições de eluição suaves em uma faixa de pH aproximadamente neutra que mantém a atividade da molécula de proteína dependente de vitamina K tal como FIX e facilita o uso de cromatografia mul-timodal em combinação com os efeitos de estabilização da maior concentra-ção de sal, descrita, por exemplo, na EP-A-1 707 634.

De acordo com uma modalidade da invenção a cromatografia multimodal pode ser realizada dentro de uma coluna cromatográfica. Isto pode ser considerado como uma primeira etapa de captura. O processo da invenção também pode ser realizado em um modo de batelada. A presente invenção facilita ainda um processo de purificação sem adição de aditivos estabilizantes derivados de humanos ou animais e o uso de um processo inteiro que está livre dos mesmos (resinas de imunoafinidade baseadas em anticorpos monoclonais). O uso da resina multimodal, em particular, como a etapa de captura, facilita ainda uma capacidade de ligação maior em compa-ração com trocadores iônicos convencionais, que resulta em um eluato do produto mais concentrado, que é vantajoso para a estabilidade do produto.

O processo da invenção é tipicamente relacionado com a purifi- cação de proteína dependente de vitamina K recombinante tal como FIX (rFIX).

Em outra modalidade do processo da invenção, a etapa de cro-matografia multimodal é combinada com uma etapa de cromatografia por afinidade da proteína dependente de vitamina K tal como FIX em que a afi-nidade é fornecida por um ligante de proteína tal como um fragmento de an-ticorpo que é expresso em levedura.

Portanto, ainda uma composição de importância é objetivo da invenção cuja composição de importância compreende a proteína dependente de vitamina K tal como FIX recombinante purificada que pode ser obtida através do processo de acordo com a invenção (sem a adição ou o uso de quaisquer aditivos humanos ou de animais como ligantes de imuno afinidade baseados em albumina ou anticorpo monoclonal).

A invenção é adicionalmente descrita pelos exemplos não limi- tantes a seguir.

Exemplos DESCRIÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS Análise da atividade biológica - Fator IX (o ensaio de coagulação em um úni-co estágio)

A atividade biológica do fator IX foi medida com um ensaio de coagulação em um único estágio e a unidade de fator IX foi expressa em Unidades Internacionais (IU) que são definidas para o padrão concentrado de fator IX da WHO atual.

O ensaio de coagulação em um único estágio é o método pres-crito na Farmacopeia Europeia. O princípio do ensaio se baseia na capaci-dade de uma amostra que contém fator IX de corrigir o tempo de coagulação de um plasma deficiente em relação ao fator IX na presença de fosfolipí- deos, ativador de contato e íons cálcio. O tempo de aparecimento de um coágulo de fibrina é medido em uma etapa. A atividade do fator IX é inver-samente proporcional ao tempo de coagulação. O método foi realizado no instrumento Siemens BCS XP.

SDS Page (Distribuição do peso molecular)

A eletroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) envolve a separação de proteínas com base em seu tamanho. Este método descreve a SDS-PAGE de proteínas, que é rodada sob condições reduzidas. Através do aquecimento da amostra sob condições desnaturantes e redutoras, as proteínas se tornam desdobradas e revestidas com o detergente ani- ônico dodecil sulfato de sódio (SDS), adquirindo uma carga negativa líquida que é proporcional ao comprimento da cadeia polipeptídica. Quando carregadas em uma matriz de gel de poliacrilamida e colocadas em um campo elétrico, as moléculas de proteína carregadas negativamente migram em direção ao eletrodo carregado positivamente e são separadas através de um efeito de peneiração molecular, isto é, por seu peso molecular.Os géis de poliacrilamida impedem que moléculas maiores migrem tão rápido quanto moléculas menores. Devido ao fato da proporção de carga em relação à massa ser quase a mesma entre os polipeptídeos desnaturados com SDS, a separação final de proteínas é dependente quase totalmente das diferenças na massa molecular relativa de polipeptídeos. Em um gel de densidade uni-forme a distância de migração relativa de uma proteína (Rf) é negativamente proporcional ao log de sua massa. Se as proteínas de massa conhecida fo-rem corridas simultaneamente com as desconhecidas, a relação entre Rf e a massa pode ser representada graficamente e as massas de proteínas des-conhecidas podem ser estimadas. As bandas de proteína separadas por ele-troforese são visualizadas por coloração com prata.A avaliação é feita atra-vés do julgamento visual das aparências dos padrões, das amostras de refe-rência (amostra de controle) e das amostras analisadas.

Fator IX derivado do plasma

O material utilizado nestes experimentos se origina do produto disponível comercialmente Nanotiv®, que é um concentrado de Fator IX alta pureza tratado com SD e nanofiltrado.

Fator IX recombinante

Produção de suspensão celular contendo FIX.

Células

A linhagem de células utilizada é um derivado da célula renal embrionária humana 293 (HEK 293), que foi adaptada para crescimento livre de soro. Este hospedeiro, HEK 293F, foi transfectado de forma estável com um cassete de expressão que carrega a sequência que codifica o cDNA para FIX humano e furina humana (PACE). O mesmo promotor forte foi utilizado para ambos os cassetes. O processo geral é também descrito na EP-A- 1 739 179 (Schroder e outros).

Método de cultivo

As células foram cultivadas em meio isento de soro em equipa-mento geral e de acordo com métodos gerais bem conhecidos na técnica, por exemplo, culturas agitadas ou misturadas em frascos t, frascos de agitação e biorreatores (sistemas descartáveis e tanques agitados convencionais) corridas na forma de culturas em batelada, batelada alimentada, perfusão ou quimiostáticas contínuas (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4â ed, Wiley- Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclo-pedia of cell technology, Wiley, New York; Enfors, S-0 e Hãggstrõm, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hõgskoletryckeriet, Royal Institute de Technology, Stockholm; Vinci, V A e Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial and plant cells, Humana Press, USA). Tipicamente, a perfusão do meio foi utilizada para aumentar o número de células e produzir títulos além dos níveis de cultura em batelada padronizada. O rendimento do produto e a quantidade de proteínas da célula hospedeira diferem dependendo do modo de cultivo: •o título de produto irá tipicamente aumentar com os números de células •o conteúdo de proteína total e o conteúdo de DNA irão tipicamente au-mentar com os números de células •o conteúdo de proteína total e o conteúdo de DNA também aumentarão com a longevidade da cultura •as culturas em batelada acumulam proteína e DNA; nada é adicionado externamente, nada é removido •os processos de perfusão lavam as culturas de células dos metabólitos, proteína, DNA e outra impurezas; filtros ou centrífugas de células foramtipicamente utilizados para retenção celular.

O produto recombinante é liberado das células e a suspensão de células ou o sobrenadante da suspensão de células é o coletado. As propri-edades da coleta (títulos do produto e impurezas que são mencionadas an-teriormente) diferem dependendo do modo de cultivo utilizado.

A suspensão de células foi utilizada em alguns dos exemplos de FIX descritos a seguir.

Purificação de FIX utilizando resina Capto MMC como a etapa de captura.

Exemplo 1 Material de partida

O FIX derivado do plasma (pdFIX, Nanotiv®) foi utilizado. Nano- tiv seco por congelamento foi dissolvido e diluído em um tampão de equilíbrio antes de ser carregado dentro de uma coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como a etapa de captura para a molécula de FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbicas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. Uma coluna Tricorn 5/150 foi empacotada com resina Capto MMC até uma altura de leito de 15,7cm. O volume da co-luna (CV) era de 3,1 mL.

Tampões

Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 7,0 Tampão de lavagem com baixo teor de sal: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,2M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 6,5 Tampão de lavagem com alto teor de sal: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,7M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 6,5 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,2M, mono cloridrato de arginina a 0,5M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 6,5 Configuração experimental

A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 1 mL/min. O pdFIX foi ligado à resina Capto MMC durante estas condições de tampão. Como observado na Tabela 1 não foi observado pdFIX no fluxo. A resina foi, depois disso, submetida a condições de lavagem diferentes que são descritas na Tabela 1 e nenhum pdFIX foi detectado em qualquer um dos tampões de lavagem testados. Através da adição de arginina a 0,5M ao tampão o FIX foi eluído da resina e um rendimento de 85% foi obtido.Tabela 1

Conclusão

O FIX derivado do plasma (pdFIX, Nanotiv) se liga a Capto MMC em pH 7 e pode ser lavado com tampão NaCI a pelo menos 0,7M sem ser eluído da resina.

Através da adição de monocloridrato de arginina a 0,5M ao tam-pão, o pdFIX é eluído da coluna.

Exemplo 2 Material de partida

FIX humano recombinante (rhFIX) produzido em células HEK 293. As células foram removidas e o sobrenadante livre de células era o material de partida carregado dentro da coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como a etapa de captura para a molécula de FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbicas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. Uma coluna XK 26 foi empacotada com a resina Capto MMC até uma altura de leito de 15 cm. O volume da coluna (CV) era de 80 ml_.

Tampões

Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1 M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 7,0 Tampão de lavagem com alto teor de sal: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,7M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 6,5 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,2M, mo- nocloridrato de arginina a 0,5M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 6,5 Configuração experimental

A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 26 mL/min. O rhFIX foi ligado à resina Capto MMC durante estas condições de tampão. Como observado na Tabela 2 não foi observado rhFIX no fluxo. A lavagem com alto teor de sal não eluía qualquer rhFIX da coluna.Através da adição de arginina a 0,5M ao tampão o rhFIX foi eluído da resina e um rendimento de 92% foi obtido. Tabela 2

Conclusão

O FIX recombinante (rhFIX) se liga ao Capto MMC em pH 7 e pode ser lavado com tampão NaCI a pelo menos 0,7M sem ser eluído da resina.

Através da adição de monocloridrato de arginina a 0,5M ao tam-pão, o rhFIX é eluído da coluna.

Os tampões utilizados continham 0,02% de Polissorbato 80 (um detergente não iônico) que não resultavam em quaisquer efeitos negativos.

Possivelmente era uma vantagem o uso de Polissorbato 80 nos tampões; comparar com os resultados obtidos no experimento a seguir (Exemplo 3) em que não foi adicionado Polissorbato 80 aos tampões utilizados.

Exemplo 3 Material de partida

O FIX humano recombinante (rhFIX) foi produzido em células HEK 293.As células foram removidas e o sobrenadante livre de células era o material de partida carregado dentro da coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como a etapa de captura para a molécula de FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbicas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. Uma coluna XK 26 foi empacotada com resina Capto MMC até uma altura de leito de 15 cm. O volume da coluna (CV) era de 80 mL.

Tampões

Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, pH 7,0 Tampão de lavagem com alto teor de sal: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,7M, pH 6,5 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,2M, mo- nocloridrato de arginina a 0,8M, pH 6,5

Configuração experimental e resultados

A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 26mL/min. O rhFIX foi ligado à resina Capto MMC durante estas condições de tampão. Como observado na Tabela 3 uma pequena quantidade do rhFIX carregado dentro da coluna foi observada no fluxo. A resina foi, depois disso, lavada com um tampão com uma concentração de NaCI razoavelmente alta, 0,7M. Como descrito na Tabela 3 menos de 1% de rhFIX foi detectado nesta lavagem. Através da adição de 0,8M arginina ao tampão o rhFIX foi eluído da resina e um rendimento de 84% foi obtido. O tampão utilizado neste experimento não continha qualquer Polissorbato 80 comparado com o Experimento 2 e o Ex-perimento 5.Tabela 3

AmostraVolume mLFIX:C IU/mLTotal FIX:C IURendimento %

Conclusão

O FIX humano recombinante (rhFIX) se liga a Capto MMC em pH 7 e pode ser lavado com tampão NaCI a pelo menos 0,7M sem ser eluído da resina.

Através da adição de monocloridrato de arginina a 0,8M ao tam-pão, o rhFIX é eluído da coluna.

Não foi adicionado detergente aos tampões, o que pode indicar uma recuperação de alguma maneira inferior de rhFIX na fração de eluição. Exemplo 4 (Exemplo 4A e Exemplo 4B)

Material de partida

O FIX derivado do plasma (pdFIX, Nanotiv®) foi utilizado. O Na- notiv seco por congelamento foi dissolvido e diluído em um tampão de equi-líbrio antes de ser carregado dentro de uma coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como a etapa de captura para a molécula de FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbicas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. A coluna Tricorn 5/150 foi empacotada com resina Capto MMC até uma altura de leito de 15 cm. O volume da coluna (CV) era de 3 mL.

Tampões

Para o experimento do Exemplo 4A: Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, pH 7,0 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1 M, mo- nocloridrato de arginina a 0,5M, pH 7,0 Para o experimento do Exemplo 4B: Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 7,0 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1 M, mo- nocloridrato de arginina a 0,5M, 0,02% de Polissorbato 80, pH 7,0 Configuração experimental

Uma comparação da purificação de pdFIX em uma coluna de Capto MMC com tampões com ou sem Polissorbato 80 e um pH ajustado em 7,0. A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo car-regamento do material de partida em uma vazão de ImL/min. O pdFIX foi ligado à resina Capto MMC durante estas condições de tampão. Como ob-servado na Tabela 4 não foi observado pdFIX no fluxo e na fração de lavagem de equilíbrio.Tabela 4

Conclusão

Um aumento de 5% do FIX derivado do plasma foi eluído quando o Polissorbato 80 foi incluído nos tampões comparado a quando não havia Polissorbato 80 nos tampões. A diferença era baixa, mas os resultados apontam em direção a um benefício de utilizar Polissorbato 80 nos tampões. O rendimento de pdFIX era alto em ambos os experimentos. Isto também mostra que o pH 7,0 nos tampões utilizados resultava em bons dados em relação tanto à ligação quanto à eluição do pdFIX da resina Capto MMC.

Exemplo 5 (Exemplo 5A e Exemplo 5B) Material de partida

O FIX derivado do plasma (Nanotiv) foi utilizado. O Nanotiv seco por congelamento foi dissolvido e diluído em um tampão de equilíbrio antes de ser carregado dentro de uma coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Tampões

Para o experimento do Exemplo 5A: Tampão de equilíbrio: HEPES a 20 mM, NaCI a 0,1M, pH 8,0 Tampão de eluição: HEPES a 20 mM, NaCI a 0,1 M, monoclori- drato de arginina a 0,5M, pH 8,0 Para o experimento do Exemplo 5B: Tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, pH 6,0 Tampão de eluição: citrato de sódio a 20mM, NaCI a 0,1M, mo- nocloridrato de arginina a 0,5M, pH 6,0 Configuração experimental

Uma comparação de purificação de pdFIX em uma coluna de Capto MMC com tampões com dois pH, 8,0 e 6,0 diferentes, utilizada em tampões tanto de ligação quanto de eluição. A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 1mL/min. O pdFIX foi ligado à resina Capto MMC durante es- tas condições de tampão. Como observado na Tabela 5 não foi observado pdFIX no fluxo. O rendimento de pdFIX era igualmente alto na fração de eluição para ambos os pHs testados.Tabela 5

Conclusão

Estes experimentos mostram que o FIX derivado do plasma pode se ligar à resina Capto MMC em tampões com pH de 8,0 e 6,0 e que ambos estes pHs também podem ser utilizados no tampão de eluição.

Exemplo 6 (Exemplo 6A-6K) Objetivo

O objetivo destes experimentos era estudar a captura e a eluição do FIX humano recombinante (rhFIX) em uma resina Capto MMC em três pHs diferentes; 6,0, 7,0 e 8,0. O benefício de 0,02% de Polissorbato 80 nestes tampões utilizados em relação à ligação e à eluição de rhFIX também foi investigado.

Material de partida

FIX humano recombinante produzido em células HEK 293. As células foram removidas e o sobrenadante livre de células era o material de partida carregado dentro da coluna de Capto MMC.

Resina e coluna cromatográficas

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como a etapa de captura para a molécula de

FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbicas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. Uma coluna XK 16 foi empacotada com resina Capto MMC até uma altura de leito de 13,5 cm. O volume da coluna (CV) era de 27 mL.

Tampões

Exemplo 6A

WFI: Água para injeção Exemplo 6B

Exemplo 6C

Exemplo 6D

Exemplo 6E

Exemplo 6F

Configuração experimental e resultados

A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 9mL/min. A coluna foi então lavada com tampão de equilíbrio seguido pela eluição do rhFIX ligado da coluna de Capto MMC. Os resultados são apresentados na Tabela 6.Tabela 6

Os dados apresentados na tabela 6 mostram que rhFIX se liga a Capto MMC em pH 6, pH 7 e pH 8. Não foi observado rhFIX no fluxo. O rhFIX ligado também pode ser eluído da resina Capto MMC nestes pHs com uma recuperação de >75%. A melhor recuperação foi obtida com um tampão de eluição com pH 7.A adição de Polissorbato 80 no tampão de equilíbrio e de eluição resultou em um aumento de pelo menos 5% quando pH 7 ou 6 foi utilizado. Não foi obtido benefício para Polissorbato 80 quando tampões com pH 8 foram utilizados.

Estes dados e os dados obtidos no experimento 5 indicam um efeito positivo do Polissorbato 80 para a recuperação de rhFIX e pdFIX em uma resina Capto MMC.

Conclusão

O FIX humano recombinante pode se ligar a Capto MMC em uma faixa de pH de pelo menos 6-8. As moléculas rhFIX são eluídas da resina Capto MMC através da adição de monocloridrato de arginina a 0,5M aos tampões independente do fato dos três pHs testados que foram utilizados.

Porém, os resultados obtidos mostram que o pH 7 resulta em um rendimento maior de rhFIX.

A adição do detergente Polissorbato 80 indica um aumento da recuperação de rhFIX quando pH 7 ou 6 foi utilizado.

Exemplo 7 Objetivo

O objetivo deste trabalho era purificar o FIX humano recombi- nante dos meios de cultura em um produto puro. Isto incluía três etapas; uma etapa de captura, uma etapa de afinidade e uma etapa de concentração e troca de tampão. Uma resina Capto MMC foi utilizada como uma etapa de captura e uma etapa de ligante de afinidade ao FIX não derivado de animal foi utilizada como a etapa de purificação principal. Como a etapa final, foi utilizado um sistema de ultra filtração com uma faixa de 10kDa, primeiramen-te para concentrar a molécula e então para alterar o tampão para um ambi-ente de tampão fisiológico.

Material de partida para a etapa de captura

Etapa de captura (Exemplo 7A-C)

Capto MMC, uma resina de modo misto da GE Healthcare (no. de cat. 17-5317), foi utilizada como uma etapa de captura para a molécula de FIX. Capto MMC é uma resina catiônica fraca com interações hidrofóbi- cas e tiofílicas e ligações de hidrogênio. Uma coluna XK 50 foi empacotada com a resina Capto MMC até uma altura de leito de 16,5 cm. O volume da coluna (CV) era de 324 mL.

Configuração experimental e resultados

A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 75ml_/min. A coluna foi então lavada com tampão de equilíbrio seguido pela eluição do rhFIX ligado da coluna Capto MMC. Os resultados são apresentados na Tabela 7. A purificação de rhFIX foi realizada em três corridas separadas, utilizando o mesmo ajuste experimental e o mesmo tipo de tampões. Estas purificações de captura foram realizadas em pH 7,0. Tabela 7

Os dados apresentados na tabela 7 mostram que o rhFIX se liga a Capto MMC em pH 7. Nenhum ou muito pouco rhFIX foi encontrado no fluxo. O rhFIX ligado poderia também ser eluído da resina Capto MMC em pH 7,0 através da adição de arginina-HCI a uma concentração final de 0,5M. A recuperação média destas três capturas de rhFIX era de 92%.

Etapa de afinidade ao FIX (Exemplo 7D-E)

Como uma etapa de afinidade um ligante de afinidade de FIX não derivado de animal (fragmento Fab) produzido em levedura foi utilizado (desenvolvido em cooperação com BAC BV, the Bio Affinity Company). Este ligante foi acoplado a uma resina Capto MP (GE Healthcare) de acordo com técnicas de acoplamento padronizadas e é referido como "a resina de afini-dade de FIX".Uma coluna XK 26 foi empacotada com a resina de afinidade deFIX até uma altura de leito de 7,5 cm. O volume da coluna (CV) era de 40 mL.

Configuração experimental e resultados

Os eluatos das três etapas de captura foram agrupados e utili-zados como o material de partida na coluna de afinidade. A coluna foi equili-brada com tampão de equilíbrio seguido pelo carregamento do material de partida em uma vazão de 10 mL/min. A coluna foi então lavada com tampão de equilíbrio seguido pela eluição do rhFIX ligado da coluna de afinidade. Os resultados são apresentados na Tabela 8. A purificação de rhFIX foi realizada em duas corridas separadas, utilizando o mesmo ajuste experimental e o mesmo tipo de tampões.Tabela 8

Os dados apresentados na tabela 8 mostram que o rhFIX se ligaà resina de afinidade de FIX em pH 7. O fluxo obtido era um efeito da capa-cidade de ligação da quantidade de resina utilizada. Aproximadamente 100% do rhFIX utilizado em ambos os experimentos são detectáveis. O rhFIX ligado poderia ser eluído da resina de afinidade de FIX através da utilização de um tampão que contém MgCI2 a 2M.

Concentração e etapa de troca de tampão (Exemplo 7F)

Através da utilização de um sistema de UF o rhFIX no eluato da coluna de afinidade foi concentrado e então o tampão foi trocado através de uma diafiltração utilizando o mesmo filtro de UF.

Filtro de UF

Um filtro Pellicon 3 com uma faixa de 10kDa montado em um sistema Pellicon 2 foi utilizado.

Configuração experimental e resultados

Através do bombeamento da amostra em um fluxo tangencial e permitindo que uma pequena parte do volume passasse continuamente a- través do filtro Pellicon 3, o volume foi diminuído. Devido ao tamanho de poro utilizado no filtro, a molécula de rhFIX ficava contida na fração de recircu- lação. O peso molecular de rhFIX é de aproximadamente 55kDa e fica retido quando um filtro com um tamanho de poro de 10kDa é utilizado.

Um volume de 310 mL de eluato de afinidade foi concentrado até aproximadamente 60mL. Este volume era o diafiltrado através da adição contínua do tampão de diafiltração na mesma velocidade que é filtrado atra-vés do filtro Pellicon 3. O tampão neste concentrado de 60 mL foi trocado aproximadamente 18 vezes. A condutividade deste concentrado foi alterada de 123mS/cm para 18,6mS/cm a 25 °C.

A recuperação de rhFIX ao longo desta etapa de concentração e troca de tampão era de 86%. Uma etapa de lavagem do filtro de UF com o tampão de diálise foi realizada para recuperar o máximo de rhFIX possível.

A figura 1 mostra o padrão de pureza por SDS Page após a puri-ficação com a resina de afinidade de FIX. A Faixa 1 é um marcador molecular disponível comercialmente, a Faixa 2 é um produto de FIX do derivado plasma de alta pureza disponível comercialmente, a Faixa 3 é um produto de FIX recombinante de alta pureza disponível comercialmente, as Faixas 4 e 5 são amostras após a purificação por afinidade de FIX que é descrita nos E- xemplos 7D e 7E, as Faixas 6 e 7 são amostras após a purificação por afini-dade e a concentração por ultrafiltração / dessalinização que são descritas no Exemplo 7F. Como pode ser observado partindo das Faixas 4-7 a pureza de FIX do produto obtido de acordo com a invenção não exibe impurezas de peso molecular menor ou maior quando comparadas com as Faixas 2 ou 3.

Claims

1.PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DEPENDENTE DE VITAMINA K LIVRE DE PRÍONS EM UMA SEQUÊNCIA DE PURIFICAÇÃO QUE EMPREGA CROMATOGRAFIA, caracterizado por: -pelo menos uma etapa de cromatografia ser realizada utilizando uma resina multimodal; -fornecimento de uma fração que contém proteína dependente de vitamina K em uma solução aquosa; -contato da fração que contém a proteína dependente de vitamina K com uma resina multimodal em um pH entre 6-9; -opcionalmente, lavagem da resina multimodal que possui a proteína dependente de vitamina K adsorvida com um tampão de lavagem aquoso para lavar contaminantes e manter a proteína dependente de vitamina K, antes da proteína dependente de vitamina K ser eluída; e -a proteína dependente de vitamina K é eluída da resina multimodal em um pH entre 6 a 9 em um tampão que compreende arginina; e -opcionalmente, coleta de frações que contêm proteína dependente de vitamina K na forma purificada ou enriquecida, em que a proteína dependente de vitamina K é FVII ou FIX derivado do plasma ou FVII ou FIX produzido de forma recombinante.

2.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela resina multimodal compreender grupamentos ligados a uma matriz e os grupamentos são capazes de interagir com a proteína dependente de vitamina K em um ambiente aquoso através de interações iônicas e outros tipos de interações tais como ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e tiofílicas.

3.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela solução aquosa compreender a proteína dependente de vitamina K em uma solução de sal que corresponde a uma condutividade de 5 até 200 mS/cm a 25°C e/ou o tampão de eluição que corresponde a uma condutividade de 5 até 200 mS/cm a 25°C.

4.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela arginina estar presente em concentrações de 0,1 - 0,3 M e 0,7 - 1 M.

5.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela arginina estar presente em uma concentração de 0,3-0,7 M.

6.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pela proteína dependente de vitamina K ser eluída com um tampão que possui um pH de 6 até 9.

7.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela proteína dependente de vitamina K ser eluída com o tampão que possui um pH de 6 até 8 ou com o tampão que possui um pH de 7.

8.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo tampão de eluição compreender, adicionalmente, agentes selecionados do grupo que consiste em pelo menos um composto orgânico que contém grupo hidroxila, pelo menos um composto orgânico que contém grupo amino, pelo menos um composto para a regulação da força iônica do tampão, pelo menos um detergente não iônico, pelo menos uma substância tamponante para regular o pH de 6 a 9 ou combinações dos mesmos.

9.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por -o composto orgânico contendo o grupo hidroxila ser selecionado do grupo que consiste em metanol, propanol, etileno glicol e propilenoglicol; -o composto para regular a força iônica do tampão ser selecionado do grupo que consiste em KCl e NaCl; -o detergente não iônico ser selecionado do grupo que consiste em Tween 20, Tween 80 e Pluronic F68; -a substância tamponante ser selecionada do grupo que consiste em citrato de sódio, histidina, HEPES, MES, base Tris e acetato de sódio em um pH entre 6-9, citrato de sódio para o ajuste de pH 6-7,5 e base Tris para o ajuste de pH 7,59.

10.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela proteína dependente de vitamina K ser eluída com uma combinação de NaCl/etilenoglicol ou combinação de arginina/NaCl ou combinação de arginina/etilenoglicol.

11.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela resina de cromatografia "multimodal" conter pelo menos um dos grupamentos a seguir: a.um ligante de N-Benzil-N-metil etanolamina carregado positivamente, b.um ligante de ácido 2-(benzoilamino) butanóico carregado negativamente, c.um ligante de fenilpropila, d.um ligante de N-hexila, e.um ligante de 4-Mercapto-Etil-Piridina, f.um ligante do ácido 3-((3-metil-5-((tetra- hidrofuran-2-ilmetil)-amino)-fenil)-amino)-benzóico ou combinações dos mesmos.

12.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela resina de cromatografia "multimodal" ser selecionada das resinas disponíveis comercialmente a seguir HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™.

13.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela etapa de cromatografia multimodal ser combinada com a etapa de cromatografia por afinidade à proteína dependente de vitamina K em que a afinidade é fornecida por um ligante que se baseia em uma proteína expressa em levedura e a pureza do eluato resultante é maior que 90%.

14.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela sequência de purificação compreender ainda etapas de remoção/inativação de agentes patogênicos que compreende a etapa de inativação com base química, ultrafiltração, etapas de cromatografia ou combinações das mesmas cujas etapas são baseadas nas propriedades fisiológicas diferentes direcionadas para o agente patogênico que será removido.

15.PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela sequência de purificação compreender ainda as etapas a seguir: i.uma resina multimodal catiônica; ii.uma etapa de inativação química para vírus envelopados com lipídeos, em particular, a inativação com solvente/detergente; iii.uma resina de afinidade baseada em um ligante de proteína, tal como, um ligante que consiste em um fragmento de anticorpo para proteína dependente de vitamina K expresso em levedura; iv.uma etapa de remoção por filtração de agentes patogênicos com um tamanho médio de poros de 20 nm; v.uma resina de trocador aniônico; vi.uma etapa de ultrafiltração com uma faixa de 10kDa.

16.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por -a resina multimodal catiônica usada na etapa de cromatografia de resina multimodal de cátions ser Capto MMCTM; -a inativação química ser a inativação solvente/detergente empregando tri-n-butil fosfato e TritonTM X-100; -a etapa de cromatografia em resina de afinidade baseiar-se num ligante de proteína consistindo num fragmento de anticorpo de proteína dependente de vitamina K expresso em levedura; -a etapa de remoção do patógeno ser realizada usando o PlanovaTM 20N; -a resina de trocador aniônico utilizada na etapa de cromatografia em resina de trocador aniônico ser Q Sepharose® FF ou Capto QTM; -a etapa de ultrafiltração ser realizada usando o Pellicon® 3.

17.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela etapa de cromatografia multimodal ser combinada com uma etapa de cromatografia por afinidade em que a afinidade é fornecida por um ligante que se baseia em uma 5 proteína expressa em levedura e que a pureza do produto resultante da resina de cromatografia por afinidade é maior que 95%.

18.PROCESSO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela(s) etapa(s) de cromatografia adicional(is) 10 ser/serem realizada(s), selecionada(s) de cromatografia de exclusão de tamanho, troca aniônica, troca catiônica, interação hidrofóbica e afinidade por metal imobilizado, e em que a pureza do produto final é maior que 99%.