CN105326859A - 一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC）的方法,包括以下步骤：（1）Cohn血浆组分III溶解；（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白；（3）S/D病毒灭活；（4）强阴离子交换柱层析；（5）超滤透析并浓缩；（6）加稳定剂及调节；（7）纳米膜除病毒过滤；（8）除菌过滤并分装；（9）冻干；（10）干热病毒灭活。本发明采用高效强阴离子交换柱层析，代替了传统的批处理凝胶吸附，大大减少了操作的劳动强度，并避免了批处理方法产生的交叉污染问题，同时在整个生产流程中，对制品采用三步病毒灭活及去除措施，具有流程简洁，生产周期短，操作容易，制品使用安全可靠的优点。

Description

一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及血液制品的制备，具体讲是涉及一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC）的方法。

背景技术

人凝血酶原复合物（PCC）是一种供静脉输注、促进血液凝固的止血制剂。PCC制品中包括凝血因子II、VII、IX、X四种凝血因子，是四种凝血因子的混合物。PCC的四种因子均属糖蛋白，分子中均含有特殊的氨基酸残基-γ羧基谷氨酸（Gla），Gla是可以与钙离子结合的氨基酸，它的存在使PCC具有与金属离子结合的性质。PCC与钙离子结合后会发生构象改变，从而显露出与磷脂膜结合的特性，并进而参与血液凝固过程。

PCC包括的四种因子都是丝氨酸蛋白酶（原），它们的催化区在结构和氨基酸顺序上与糜蛋白和胰蛋白酶同源。这些因子有相似的理化性质，具有相似的分子量、等电点、电泳迁移率。在临床上，PCC被广泛用于治疗乙型血友病和由肝疾患、维生素K缺乏而继发的凝血因子II、VII、IX、X低下所造成的出血，以及具有VIII因子抗体的甲型血友病的出血，疗效确切。随着我国肝炎发病率的增加，PCC制剂被大量应用于临床肝脏出血的患者，需求量逐年增加。

现有的PCC制备方法，按原料来源分为两种，一种是直接从去冷胶血浆中用凝胶吸附，一种是从预处理后的组分III中凝胶吸附；其中，前者大都采用经典的批式吸附法，即，将溶胀的凝胶按一定比例加入去冷胶血浆中去，一边搅拌一边吸附，吸附结束后对血浆进行过滤，收集吸附了PCC的凝胶，进行后续处理；该方法不可避免的会有部分碎胶残留在血浆中，对后续的蛋白分离产生不可预知的影响，另外，该工艺生产的PCC,其所含的凝血因子VII明显偏少，一般只有凝血因子IX的四分之一至三分之一。后一种方法所用的组分III沉淀，目前尚未被利用，属于废料，从此沉淀中分离制备PCC，则是变废为宝，充分利用血浆资源，而且不存在污染血浆的问题，在整个血制品的生产工艺安排上，有独特的优势，另外该法生产的PCC,四种因子的含量几乎相同，凝血因子VII甚至会高于凝血因子IX。

本发明开发了一种从血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC）的新工艺,该方法用高效强阴离子交换填料连续柱层析，代替传统的批处理凝胶吸附，大大减少了操作的劳动强度，并避免了批处理方法产生的交叉污染问题，同时在整个生产流程中，对制品采用三步病毒灭活及去除工序，具有流程简洁，生产周期短，操作容易，制品使用安全可靠的优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺先进、产品质量可靠、得率高及产品使用安全的人凝血酶原复合物（PCC）的制备方法。

1．一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）血浆组分III溶解

按一定的稀释比，将冰冻的血浆组分III沉淀悬浮于溶解缓冲液中，在10-25℃下，均匀搅拌2-4小时，使沉淀充分溶解，得到均匀的悬浮液；

（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白

在步骤（1）所述的悬浮液中加入50%PEG溶液，搅拌0.5-1.5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0um滤芯，过滤前用步骤（1）所述的溶解缓冲液预洗滤板及滤芯，收集澄清滤液；

（3）S/D病毒灭活

在步骤（2）所述的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时；

（4）强阴离子交换柱层析

将步骤（3）所述的S/D后的溶液降温至5-20℃，然后上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液即为凝血酶原复合物，用0.45μm或0.22μm滤芯过滤以上洗脱液,收集澄清滤液；

（5）超滤透析并浓缩

用5k-10k分子量的超滤膜浓缩步骤（4）所收集的滤液，并用透析液透析4-6倍，后再次浓缩后移出超滤膜包；

（6）加稳定剂及调节

在步骤（5）所收集的浓缩液中加入稳定剂，并按照所需规格，调节人凝血因子IX的效价至所需值（一般为20-30IU/ml），后调PH值至6.50-7.50；

（7）纳米膜除病毒过滤

用15-20纳米滤芯对步骤（6）获得的PCC溶液进行除病毒过滤，收集滤液；

（8）除菌过滤并分装

用0.22μm除菌滤芯对步骤（7）获得的滤液进行除菌过滤并分装；

（9）冻干；

（10）干热病毒灭活

将步骤（9）获得的PCC冻干制剂置于100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。

2．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（1）所述的稀释比为1：5~15，即一份重量的组分III沉淀投入到5-15份重量的溶解缓冲液中；所述溶解缓冲液的组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.1-0.2M氯化钠,PH6.50-7.50。

3．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（2）所述的PEG分子量为3000-8000，最终浓度为3-8%（wt%）。

4．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（4）所述的强阴离子交换柱所用填料为Capto-Q，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。

5．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（4）所述的平衡缓冲液组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液的组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.5M-1.5M氯化钠，0.02-0.04M精氨酸盐酸盐PH6.50-7.50。

6．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（5）所述的透析液的组成为0.01M柠檬酸钠,0.075M-0.15M氯化钠溶液，PH6.50-7.50。

7．根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（6）所述的稳定剂为精氨酸盐酸盐、甘氨酸及组氨酸中的一种或几种组合；其中精氨酸盐酸盐的加入量为0.5-3%，甘氨酸的加入量为0.5-3%，组氨酸的加入量为0.5-3%。

8．根据权利要求1-7所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：凝血酶原复合物制品在整个生产过程中采用了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒过滤及干热病毒灭活三种病毒灭除方法。

本发明的优越性：

（1）从Cohn血浆组分III中制备PCC工艺，流程简洁，变废为宝，不影响其它血液制品的生产工艺，经济效益好；

（2）用一步柱层析工艺替代了传统的凝胶批处理工艺，劳动强度小，操作便捷，无交叉污染；

（3）在洗脱缓冲液中加入蛋白保护剂，防止生产过程中凝血酶的激活，大大提高产品的合格率；

（4）生产流程中采用三步病毒灭活及去除工序，极大降低了病毒污染的概率，产品更加安全可靠。

附图说明

图1为从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，不能认为本发明的实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。

实施例一

1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于10kg溶解缓冲液中，溶解缓冲液配方为0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠,PH6.50-6.60；搅拌4小时，使沉淀充分溶解；

2，PEG沉淀去杂蛋白：在以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为3%,搅拌1.5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0μm滤芯，滤板预先用步骤（1）所述的溶解缓冲液预洗，收集得澄清滤液；

3，S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时；

4，强阴离子交换柱层析：将上述S/D后的溶液降温至8℃，然后上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.50-6.60,0.01M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液(PH6.50-6.60,0.01M柠檬酸钠，1.0M氯化钠，0.02M精氨酸盐酸盐）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液,所收集澄清滤液；

5，超滤透析并浓缩：用10k分子量的超滤膜包（0.1M²）浓缩以上滤液，并用透析液（0.01M柠檬酸钠,0.1M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）透析5倍，后再次浓缩至九因子效价大于40IU/ml后移出超滤膜包并后洗；

6，加稳定剂及调节：调节人凝血FIX效价至33IU/ml，加入精氨酸盐酸盐至0.5%，甘氨酸至3%，组氨酸至0.5%，做为稳定剂；最后调PH值至6.90-7.10

7，纳米膜除病毒过滤：用0.1μm滤芯串联20纳米除病毒滤芯过滤对以上PCC溶液；

8，除菌过滤并分装：用0.22μm滤芯对以上PCC溶液进行除菌过滤并分装；得到390.1克，活力31.8IU/ml;

9，冻干得到PCC冻干粉；

10，将PCC冻干制品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。

实施例二

1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于20kg溶解缓冲液中，溶解缓冲液配方为0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠,PH7.40-7.50；搅拌2小时，使沉淀充分溶解；

2，PEG沉淀去杂蛋白：以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为7%,搅拌0.5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0μm滤芯，滤板预先用步骤1所述的溶解缓冲液预洗，收集得澄清滤液；

3，S/D病毒灭活：同实施例一；

4，强阴离子交换柱层析：将上述S/D后的溶液降温至20℃，然后上QSepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH7.40-7.50,0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠，）平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液(PH7.40-7.50,0.02M柠檬酸钠，1.5M氯化钠，0.02M精氨酸盐酸盐）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液,收集澄清滤液；

5，超滤透析并浓缩：同实施例一；

6，加稳定剂及调节：调节人凝血FIX效价至33IU/ml，加入精氨酸盐酸盐至1.5%，甘氨酸至2%，组氨酸至1.5%，做为稳定剂；最后调PH值至6.90-7.10

7，纳米膜除病毒过滤：同实施例一；

8，除菌过滤并分装：用0.22μm滤芯对以上PCC溶液进行除菌过滤并分装；得到410.5克，活力29.4IU/ml;

9-10，同实施例一。

实施例三

1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于20kg溶解缓冲液中，溶解缓冲液组成为0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠,PH6.90-7.10；搅拌3小时，使沉淀充分溶解；

2，PEG沉淀去杂蛋白：在以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为5%,搅拌1小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0μm滤芯，滤板预先用步骤1所述的溶解缓冲液预洗，收集得澄清滤液；

3，S/D病毒灭活:同实施例一；

4，强阴离子交换柱层析:将上述S/D后的溶液降温至15℃，然后上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.12M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液(PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.8M氯化钠，0.04M精氨酸盐酸盐）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液,收集澄清滤液；

5，超滤透析并浓缩:同实施例一；

6，加稳定剂及调节:调节人凝血FIX效价至33IU/ml，加入精氨酸盐酸盐至1.0%，甘氨酸至1.5%，组氨酸至1.0%，做为稳定剂；最后调PH值至6.90-7.10；

7，纳米膜除病毒过滤:同实施例一；

8，除菌过滤并分装:用0.22μm滤芯对以上PCC溶液进行除菌过滤并分装；得到381.5克，活力32.7IU/ml;

9-10，同实施例一。

PCC试制品FII、FVII、FIX、及FX技术数据统计一览表

*每吨血浆可得到约30kg组分III沉淀（不含硅藻土）。

Claims (8)

1.一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）Cohn血浆组分III溶解

按一定的稀释比，将冰冻的Cohn血浆组分III沉淀悬浮于溶解缓冲液中，在10-25℃下，均匀搅拌2-4小时，使沉淀充分溶解，得到均匀悬浮液；

（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白

在步骤（1）所述的悬浮液中加入50%PEG溶液，搅拌0.5-1.5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0um滤芯，用步骤（1）所述的溶解缓冲液预洗滤板及滤芯，收集澄清滤液；

（3）S/D病毒灭活

在步骤（2）所述的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时；

（4）强阴离子交换柱层析

将步骤（3）所述的S/D后的溶液降温至5-20℃，然后上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液即为凝血酶原复合物，用0.45μm或0.22μm滤芯过滤以上洗脱液,收集澄清滤液；

（5）超滤透析并浓缩

用5k-10k分子量的超滤膜浓缩步骤（4）所收集的滤液，并用透析液透析4-6倍，后再次浓缩后移出超滤膜包；

（6）加稳定剂及调节

在步骤（5）所收集的浓缩液中加入稳定剂，并按照所需规格，调节人凝血因子IX的效价至所需值（一般为20-30IU/ml），后调PH值至6.50-7.50；

（7）纳米膜除病毒过滤

用15-20纳米的滤芯对步骤（6）获得的PCC溶液进行除病毒过滤，收集滤液；

（8）除菌过滤并分装

用0.22μm除菌滤芯对步骤（7）获得的滤液进行除菌过滤并分装；

（9）冻干；

（10）干热病毒灭活

将步骤（9）获得的PCC冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。

2.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（1）所述的稀释比为1：5~15，即一份重量的组分III沉淀投入到5-15份重量的溶解缓冲液中；所述溶解缓冲液的组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.1-0.2M氯化钠,PH6.50-7.50。

3.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（2）所述的PEG分子量为3000-8000，最终浓度为3-8%（wt%）。

4.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（4）所述的强阴离子交换柱所用填料为Capto-Q，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（4）所述的平衡缓冲液组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液的组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.5M-1.5M氯化钠，0.02-0.04M精氨酸盐酸盐PH6.50-7.50。

6.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（5）所述的透析液的组成为0.01M柠檬酸钠,0.075M-0.15M氯化钠溶液，PH6.50-7.50。

7.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：步骤（6）所述的稳定剂为精氨酸盐酸盐、甘氨酸及组氨酸中的一种或几种组合；其中精氨酸盐酸盐的加入量为0.5-3%，甘氨酸的加入量为0.5-3%，组氨酸的加入量为0.5-3%。

8.根据权利要求1-7所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：凝血酶原复合物制品在整个生产过程中采用了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒过滤及干热病毒灭活三种病毒灭除方法。