ES2596727T3 - Procedimiento de purificación de un factor proteico de crecimiento G-CSF - Google Patents

Procedimiento de purificación de un factor proteico de crecimiento G-CSF Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de purificación de G-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos) en una secuencia de purificación que emplea cromatografía, caracterizado porque - al menos una cromatografía se lleva a cabo utilizando una resina multimodal que contiene un ligando ácido 2- (benzoilamino) butanoico cargado negativamente - el G-CSF se une a la resina multimodal a un pH entre 4 y 6,2, y - el G-CSF se eluye a un pH > 6,3 y en el que la elución se lleva a cabo con un agente de elución que comprende arginina a una concentración en el intervalo de 0,1 M a 2,0 M, - opcionalmente en combinación con una etapa de cromatografía de afinidad con un ligando que emplea un fragmento Fab derivado de levaduras dirigido hacia el G-CSF.

Description

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G-CSF recombinante
Producción de una suspensión celular que contiene G-CSF y purificación
Células
La línea celular que se utilizó se derivaba de células renales embrionarias 293 humanas (HEK293), que se habían adaptado al cultivo libre de suero. Este huésped, HEK 293, se transfectó establemente con un casete de expresión que tenía el ADNc que codificaba la secuencia de G-CSF. Se utilizó el promotor fuerte para el casete. El proceso general se describe también en el documento EP 1739179 (Schröder y col).
Procedimiento de cultivo
Las células se cultivaron en medio libre de suero con un equipamiento general y de acuerdo con los procedimientos generales bien conocidos en la técnica, por ejemplo de cultivos removidos o agitados en matraces t, matraces agitadores y biorreactores (sistemas desechables y depósitos de removido convencionales) que se ejecutaron como cultivos por lotes, semicontinuos, perfusión o continuos quimioestáticos (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4ª ed, Wiley-Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York; Enfors, S-O and Häggström, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Högskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA). Típicamente, se utilizó la perfusión del medio para aumentar el número de células y los títulos de producto más allá de los niveles de cultivo por lotes convencional. El rendimiento del producto y la cantidad de proteínas de las células huésped diferían dependiendo del modo de cultivo:
●
el título de producto típicamente aumentará con el número de células
●
el contenido en proteínas totales y el contenido en ADN aumentará típicamente con el número de células
●
el contenido en proteínas totales y el contenido en ADN puede aumentar también con la longevidad del cultivo
●
los cultivos por lotes acumulan proteínas y ADN; no se añade nada externamente, nada se retira
●
los procesos de perfusión aclaran los cultivos celulares de metabolitos, proteínas, ADN y otras impurezas; se utilizan típicamente filtros o centrífugas celulares para la retención de células.
El producto recombinante se libera de las células, y se recolecta la suspensión celular o el sobrenadante de la suspensión celular. Las propiedades de la recolección (títulos de producto e impurezas que se han mencionado anteriormente) difieren dependiendo del modo de cultivo que se utilice.
La suspensión celular se ha utilizado en algunos de los ejemplos de G-CSF descritos posteriormente.
Procedimiento de purificación
El producto recombinante se liberaba de las células y se recolectaba la suspensión celular o el sobrenadante de la suspensión. La purificación que se aplicó comprendía una purificación en 4 etapas. Se utilizó una cromatografía de intercambio catiónico (SP Sefarosa de Flujo rápido (FF)) para la etapa de captura de G-CSF del sobrenadante del cultivo celular, seguida por una etapa de cromatografía de afinidad por metal inmovilizado basada en zinc (IMAC) (Sefarosa de Flujo rápido (FF) quelante de Zn-IDA), una segunda cromatografía de intercambio catiónico (Resource S) para pulir y una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 75) como etapa final.
Preparación del sobrenadante del cultivo celular que contiene G-CSF
Antes de la etapa de captura se determinó la concentración de G-CSF de los lotes de sobrenadante [mg/l] por un ELISA específico de G-CSF con el fin de verificar la cantidad total de G-CSF [mg]. Se descongeló el sobrenadante congelado (a -80 ºC) en un baño de agua ajustado a 20 ± 5 ºC. A continuación el sobrenadante se centrifugó a 9000 x g durante 15 minutos a 4 ºC y luego se filtró además utilizando unidades de filtro de 0,2 µg. El pH del sobrenadante filtrado se ajustó a un pH 4,0 utilizando ácido acético.
Etapa de captura (SP Sefarosa FF)
Se empaquetó una columna XK 16/20 con 10 ml de material de SP Sefarosa FF (1 volumen de columna (VC) = 10 ml). La resina de SP Sefarosa FF se obtuvo en GE Healthcare (Nº de cat. 17-0729-01).
El equilibrado se llevó a cabo con 3 VC del tampón de equilibrado (20 mM de acetato sódico, 100 mM de cloruro sódico, un 0,02% Tween 20, pH 4,0) seguido por la carga del material de partida con un caudal de 2,5 ml/min. Se llevó a cabo a continuación la etapa de lavado con el mismo tampón y caudal, utilizando 5 VC.
Se llevó a cabo la elución con un tampón de elución que contenía 20 mM de acetato sódico, 1 M de cloruro sódico, un 0,02% de Tween 20, pH 4,0, aplicando un gradiente lineal desde un 0% a un 40% de tampón de elución con 8 VC con un caudal de 2,5 ml/min, seguido por una etapa de elución con un 100% de tampón de elución con 5 VC.
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La concentración del agrupamiento eluído, que se recolectó del gradiente de elución lineal, se analizó por ELISA específico de G-CSF.
Etapa IMAC (Sefarosa FF quelante Zn-IDA)
Se empaquetó una columna XK 16/20 con 10 ml de Sefarosa FF quelante que se cargó con 2 ml de ZnCl2 0,2 M (1 volumen de columna (VC) = 10 ml). La resina Sefarosa FF quelante se obtuvo en GE Healthcare (Cat. Nº 17-057501). Antes de la carga se ajustó el pH de la carga de la columna IMAC (eluído SP Sefarosa FF) a un pH 8,0 con NaOH.
Se llevó a cabo el equilibrado con 3 VC de tampón de equilibrado (20 mM de Tris/HCl, 150 mM de NaCl, pH 8,0) seguida por la carga del eluído de la SP Sefarosa FF con un caudal de 2 ml/min. Se llevó a cabo la siguiente etapa de lavado con el mismo tampón y caudal, utilizando 2 VC.
La elución se llevó a cabo con un tampón de elución que contenía 20 mM de Tris/HCl, 150 mM de NaCl, pH 4,0, aplicando un gradiente lineal de un 0% a un 100% de tampón de elución con 3 VC con un caudal de 1 ml/min. Después se aplicó un retraso de gradiente con tampón de elución al 100% con 4 VC.
La concentración de G-CSF en el agrupamiento de eluído, que se recolectó de la elución con un tampón de elución al 100%, se analizó por un ELISA específico de G-CSF.
Etapa de pulido (Resource S)
Se equilibró una columna Resource S pre-empaquetada (VC = 6 ml) de GE Healthcare (Nº de cat. 17-1180-01) con 5 VC de tampón de equilibrado (20 mM de acetato sódico, un 0,02% de Tween-20, pH 4,0) con un caudal de 4 ml/min. Antes de la purificación, el pH del eluído IMAC se debe ajustar a 4,0 con ácido acético y se diluye 5 veces utilizando el tampón de equilibrado.
La etapa de lavado se llevó a cabo con 10 VC del tampón de equilibrado con un caudal de 4 ml/min.
La elución se llevó a cabo con un tampón de elución que contenía 20 mM de acetato sódico, 1 M de NaCl, un 0,02% de Tween-20, pH 4,0, aplicando un gradiente lineal de tampón de elución del 0% al 100% con 20 VC con un caudal de 2 ml/min.
La concentración de G-CSF en el agrupamiento de eluído, que se recolectaba del gradiente de elución lineal con un 50-85% de tampón de elución, se analizó con un ELISA específico de G-CSF.
Etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 75)
Para la etapa de exclusión por tamaño se utilizó una columna Hiload 26/60 Superdex 75 Prep Grade preempaquetada (GE Healthcare Nº de cat. 17-1044-01, VC = 320 ml). La columna se equilibró con 1 VC de tampón (20 mM de acetato sódico, 200 mM de NaCl, un 0,02% de Tween-20, pH 6,5) seguido por la carga del eluído de Resource S con un caudal de 2,5 ml/min y un volumen máximo de carga de un 4% del VC.
La concentración de G-CSF del agrupamiento del eluído se analizó por ELISA específico de G-CSF y por (RP)-HPLC de fase inversa. La pureza de la fracción de purificación final se analizó utilizando RP-HPLC, (SE)-HPLC y SDS-PAGE y era típicamente > 95%.
El eluído de la exclusión por tamaño se utilizó en alguno de los ejemplos de G-CSF que se describen posteriormente.
Purificación de rhG-CSP utilizando resina Capto MMC como etapa de captura.
Ejemplo 1 (Experimento 1)
Material de partida
Se diluyó el rhG-CSF en un tampón de equilibrado para disminuir la concentración total de proteína y para conseguir un volumen más conveniente antes de cargarse en una columna Capto MMC. El rhG-CSF estaba disuelto antes de la dilución en 20 mM de acetato sódico, 0,5 M de NaCl, un 0,02% de Tween-20, pH 4,0.
Resina y columna cromatográficas
Se utilizó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (nº de cat. 17-5317) como etapa de captura para la molécula de rhG-CSF. La Capto MMC es una resina catiónica débil que tiene interacciones hidrófobas y tiófilas y enlaces hidrógeno. Se empaquetó una columna Tricorn 5/150 (GE Healthcare) con resina Capto MMC hasta una altura de lecho de 15 cm. El volumen de columna (VC) de Capto MMC era de 3 ml.
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Tampones
Tampón de equilibrado: 20 mM de acetato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0
Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Sistema experimental
Se equilibró la columna con tampón de equilibrado seguido por la carga del material de partida con un caudal de 1 ml/min. Se continuó con una etapa de lavado con el tampón de equilibrado, y luego se eluyó la columna utilizando el tampón de elución. Las muestras se retiraron y se analizaron en cuanto a rhG-CSF por un procedimiento HPLC. Como se aprecia en la Tabla 1 no se encontró G-CSF en la fracción del flujo continuo. El tampón de elución contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, y el pH se modificó a 7,0. La recuperación de G-CSF era del 89%, y el perfil de elución era un pico más concentrado. La columna se limpió tras la elución en el mismo lugar con una solución de NaOH 1 M. Se visualizó un pico muy pequeño del lavado con NaOH 1 M de la columna. El cromatograma se muestra en la Figura 1.
Tabla 1.
Muestra
Volumen ml rhG-CSF µg/ml Total rhG-CSF µg % Rendimiento
Material de partida
8,71 111 966,8 100
Flujo continuo y lavado equil.
18 0 0 0
Eluído
12 72 864 89
Conclusión
Todo el G-CSF cargado se unía a Capto MMC a pH 4,0. Se obtuvo un alto rendimiento (del 89%) en la fracción de elución que se recolectó en tres volúmenes de columna. El tampón de elución tenía un pH de 7,0, y estaba incluido 0,5 M de monoclorhidrato de arginina.
Leyenda de la Figura 1.
Experimento 1; Un cromatograma de la purificación de G-CSF en una columna Capto MMC a pH 4,0 utilizando un tampón de acetato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH de 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un doble pico de la elución. El doble pico se recolectó como una fracción.
Ejemplo 2 (Experimento 2)
Material de partida
Se diluyó el rhG-CSF purificado en un tampón de equilibrado para disminuir la concentración de proteína total y para conseguir un volumen más conveniente antes de cargarse en una columna Capto MMC. El rhG-CSF se disolvió antes de la dilución en 20 mM de acetato sódico, 0,5 M de NaCl, un 0,02% de Tween 20, pH 4,0.
Resina y columna cromatográficas
Se utilizó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (nº de cat. 17-5317), como etapa de captura para la molécula de rhG-CSF. La capto MMC es una resina catiónica débil que tiene interacciones hidrófobas y tiófilas y enlaces hidrógeno. Se empaquetó una columna Tricorn 5/150 (GE Healthcare) con resina Capto MMC hasta una altura de lecho de 15 cm. El volumen de la columna (VC) de Capto MMC era de 3 ml.
Tampones
Tampón de equilibrado: 20 mM de acetato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0
Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Sistema experimental
Se equilibró la columna con tampón de equilibrado seguido por la carga del material de partida con un caudal de 1 ml/min. Se continuó con una etapa de lavado con el tampón de equilibrado, y luego se eluyó la columna utilizando el tampón de elución. Las muestras se retiraron y se analizaron en cuanto a rhG-CSF por un procedimiento HPLC. Como se aprecia en la Tabla 2 no se encontró rhG-CSF en el flujo continuo. El tampón de elución tenía un pH de 7,0. Se encontró más del 90% del rhG-CSF cargado en la columna Capto MMC en la fracción eluída. El pico de elución era más amplio que en el experimento 1, en el que se incluía arginina en el tampón de elución. Se dobló el
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volumen de elución.
Tabla 2.
Muestra
Volumen ml rhG-CSF µg/ml Total rhG-CSF µg % Rendimiento
Material de partida
8,92 77,47 691 100
Flujo continuo y lavado equil.
30 0 0 0
Eluído
24 26,07 626 90,5
Conclusión
El G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) se une a la resina Capto MMC a pH 4 y se podía eluir a pH 7 en una solución tampón con citrato sódico.
Ejemplo 3 (Experimento 3)
Material de partida
Se diluyó el rhG-CSF purificado en un tampón de equilibrado para disminuir la concentración total de proteína y para conseguir un volumen más conveniente antes de cargarse en una columna Capto MMC. El rhG-CSF se diluyó antes de la dilución en 20 mM de acetato sódico, 0,5 M de NaCl, un 0,02% de Tween 20, pH 4,0.
Resina y columna cromatográficas
Se utilizó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (nº de cat. 17-5317), como etapa de captura para la molécula de rhG-CSF. Capto MMC es una resina catiónica débil que tiene interacciones hidrófobas y tiófilas y enlaces de hidrógeno. Se empaquetó una columna Tricorn 5/150 (GE Healthcare) con resina Capto MMC hasta una altura de lecho de 15 cm. El volumen de columna (VC) de Capto MMC era de 3 ml.
Tampones
Tampón de equilibrado: 20 mM de acetato de sodio, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0
Tampón de elución: 20 mM de HEPES, 0,3 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Sistema experimental
La columna se equilibró con tampón de equilibrado seguido por la carga del material de partida con un caudal de 1 ml/min. Se continuó con una etapa de lavado con tampón de equilibrado, y luego se eluyó la columna utilizando el tampón de elución. Las muestras se retiraron y se analizaron en cuanto a rhG-CSF por un procedimiento HPLC. Como se aprecia en la tabla 3 no se encontró rhG-CSF en el flujo continuo. El tampón de elución tenía un pH de 7,0, y la concentración de NaCl se elevó a 0,3 M en comparación con el experimento 2. Todo el rhG-CSF cargado en la columna de Capto MMC se encontraba en la fracción eluída. El perfil de cromatografía se muestra en la Figura 2. Se obtuvo un amplio pico de elución, y el pico de elución completo se recolectó en una fracción de elución.
Tabla 3.
Muestra
Volumen ml rhG-CSF µg/ml Total rhG-CSF µg % Rendimiento
Material de partida
8,8 71,2 627 100
Flujo continuo y lavado equil.
30 0 0 0
Eluído
24 27,1 650 103,7
Conclusión
El rhG-CSF se unía a la resina Capto MMC a pH 7 y se eluyó al 100% a pH 7 cuando se incluía el NaCl 0,3 M en el tampón de elución. El volumen de elución era grande, el doble de volumen comparado con el que incluía arginina en el tampón de elución. Esto significa que el NaCl 0,3 M no tenía el mismo efecto sobre la elución de G-CSF en una resina Capto MMC como la arginina 0,5 M.
Leyenda de la Figura 2.
Experimento 3; Un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 4,0 utilizando un tampón de acetato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que
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Sistema experimental
Se equilibró la columna con tampón de equilibrado seguido por la carga del material de partida con un caudal de 1 ml/min. Se continuó con una etapa de lavado con el tampón de equilibrado, y luego se eluyó la columna utilizando el tampón de elución. Las muestras se retiraron y se analizaron en cuanto a rhG-CSF por un procedimiento HPLC. El análisis demostraba que el rhG-CSF se unía a la resina Capto MMC con estas condiciones de tampón. Como se aprecia en la Tabla 5 no se encontró rhG-CSF en el flujo continuo. El tampón de elución se cambió por un tampón que contenía arginina y no cloruro sódico, y el pH era de 4,0, el mismo que en el tampón de equilibrado. No se encontró rhG-CSF en la fracción eluída. Esto significa que una concentración de arginina más alta (1 M) no tenía ningún efecto sobre la elución de rhG-CSF de la columna de Capto MMC. Pero como se aprecia en la Figura 3 se obtuvo un pico cuando se eluyó la columna por el tampón de elución que contenía 1 M de arginina y pH 4. El segundo gran pico era resultado del lavado con NaOH 1 M.
Tabla 5.
Muestra
Volumen ml rhG-CSF µg/ml Total rhG-CSF µg % Rendimiento
Material de partida
9,04 79,98 723 100
Flujo continuo y lavado equil.
18 0 0 0
Eluído
9 0 0 0
Conclusión
El rhG-CSF no se podía eluir de la resina Capto MMC añadiendo solo 1 M de monoclorhidrato de arginina al tampón, sin cambiar el pH. Esto puede funcionar como una etapa de lavado.
Leyenda de la Figura 3.
Experimento 5; Un cromatograma de la purificación de G-CSF en una columna Capto MMC a pH 4,0 utilizando un tampón de acetato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con pH 4,0 que contenía 1 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un doble pico de la elución. Un único pico se obtuvo de la fracción eluída. Un gran pico se obtuvo con el lavado con NaOH 1 M.
Ejemplo 6 (Experimentos 6, 7, 8, 9, 10, 11)
Material de partida
El rhG-CSF purificado se diluyó en un tampón de equilibrado para disminuir la concentración de proteína total y para conseguir un volumen más conveniente antes de cargarse en una columna Capto MMC. Y también para conseguir el pH que se necesitaba para cada experimento. El rhG-CSF se disolvió antes de la dilución en 20 mM de acetato sódico, 0,2 M de NaCl, un 0,02% de Tween 20, pH 6,5.
Resina y columna cromatográficas
Se utilizó Capto MMC, una resina de modo mixto de GE Healthcare (nº de cat. 17-5317), como etapa de captura para la molécula de rhG-CSF. Capto MMC es una resina catiónica débil que tiene interacciones hidrófobas y tiófilas y enlaces de hidrógeno. Se empaquetó una columna Tricorn 5/150 (GE Healthcare) con resina Capto MMC hasta una altura de lecho de 15 cm. El volumen de columna (VC) de Capto MMC era de 3 ml.
Tampones
Experimento 6
Tampón de equilibrado: 20 mM de acetato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0 Tampón de lavado: 20 mM de NaAc, 1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Experimento 7
Tampón de equilibrado: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% Polisorbato 80, pH 5,0 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
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Experimento 8
Tampón de equilibrado: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 6,0 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0
Experimento 9
Tampón de equilibrado: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 6,5 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0
Experimento 10
Tampón de equilibrado: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 5,5 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Experimento 11
Tampón de equilibrado: 20 mM de citrato sódico, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 4,0 Tampón de elución: 20 mM de citrato sódico, 0,5 M de monoclorhidrato de arginina, 0,1 M de NaCl, un 0,02% de Polisorbato 80, pH 7,0.
Sistema experimental
Cada experimento se llevó a cabo de la siguiente manera. El rhG-CSF purificado se diluyó aproximadamente 1 en 20 con el tampón de equilibrado que se iba a utilizar. El pH del material de partida se controló y era el mismo en todos los experimentos que el del tampón de equilibrado sin ajustarse. La columna se equilibró con el tampón de equilibrado seguido por la carga del material de partida con un caudal de 1 ml/min. Se continuó con una etapa de lavado con el tampón de equilibrado, y luego la columna se eluyó utilizando el tampón de elución. En el experimento 6 la columna también se lavó con un tampón que contenía 1 M de NaCl antes de la elución. Las muestras se retiraron y se analizaron en cuanto a rhG-CSF por un procedimiento HPLC.
Como se ve en la Figura 4 en el Experimento 6 no se obtuvo ningún pico en el lavado con 1 M de NaCl, lo que indicaba que no se lavó nada de rhG-CSF de la columna Capto MMC. El mismo perfil de elución se obtuvo cuando el G-CSF se purificó en una columna Capto MMC independientemente de si se utilizaba un tampón de acetato sódico o un tampón de citrato sódico a un pH de 4 (Experimento 6 y Experimento 11).
Los resultados del análisis para demostrar a qué nivel se unía el rhG-CSF al Capto MMC y qué rendimiento se obtenía se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6.
Nº de Experimento
pH en la muestra de carga G-CSF en el flujo continuo % G-CSF en el eluído % Figura
6
4,0 0 105 4
11
4,0 0 100 5
7
5,0 0 98 6
10
5,5 0 97 7
8
6,0 0 97
8
9
6,5 26,8 25,7
9
Los datos de la tabla 6 muestran que el G-CSF que se une a la resina Capto MMC a pH 4 o 6 sin ninguna pérdida de material en el flujo continuo. Pero con pH 6,5 en el material de partida, la mayoría del G-CSF detectado se encontró en la fracción del flujo continuo.
La columna de Capto MMC se eluyó con un tampón a un pH fijado en 7 y contenía 0,5 M de arginina. La recuperación de G-CSF era alta cuando el material se cargaba en la columna a un pH de 4 a 6, mientras que cuando se utilizaba un pH de 6,5 en el material de partida el rendimiento en el eluído era bajo.
En los cromatogramas posteriores (Figura 4, 5 y 6) se muestra que cuando el rhG-CSF estaba en un tampón con un pH de 4 o 5, se eluía de la columna de Capto MMC como un pico doble. Mientras que se obtenía un único pico
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cuando el pH del material de partida estaba a 5,5, 6,0 o 6,5 (Figura 7, 8 y 9). Como se muestra en la SDS PAGE teñida con plata (Figura 10A) el eluído del Experimento 8 (pH 6,0), Experimento 9 (pH 6,5) y Experimento 10 (pH 5,5) tiene una clara banda única mientras que los eluídos del Experimento 6 (pH 4,0) y el Experimento 7 (pH 5,0) mostraban más bandas en la SDS-PAGE teñida con plata (Figura 10B).
Conclusión
Los resultados de estos experimentos muestran que rhG-CSF puede unirse a Capto MMC a un pH de 4,0, 5,0, 5,5, 6,0. La unión de rhG-CSF a Capto MMC a pH 6,5 es menos fuerte y el rhG-CSF se encontraba en la fracción de flujo continuo lo cual no es el caso cuando el pH es de 4 a 6.
El perfil de elución es mejor cuando se utilizó un pH de 5,5 a 6,5 y el producto se ve mejor en una SDS-PAGE cuando se utilizaban estos pH en el material de carga.
Debido al escape de G-CSF en la columna Capto MMC cuando se utilizaba el pH 6,5, se usaba preferentemente un pH de 5,5 a 6,0 en el material de carga.
El material unido se eluía a pH 7 en todos los experimentos, y el pico era más concentrado cuando se incluía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina en el tampón de elución. Un lavado con 1 M de NaCl se llevó a cabo a pH 4 sin ninguna pérdida de G-CSF.
Leyenda de las figuras 4-10
Figura 4
Experimento 6; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 4,0 del material de inicio utilizando un tampón de acetato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un doble pico de la elución. El doble pico se recolectó como una fracción.
Figura 5
Experimento 11; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 4,0 utilizando un tampón de citrato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un doble pico de la elución. El doble pico se recolectó como una fracción.
Figura 6
Experimento 7; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 5,0 utilizando un tampón de citrato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un doble pico de la elución. El doble pico se recolectó como una fracción.
Figura 7
Experimento 10; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 5,5 utilizando un tampón de citrato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un pico ligeramente no uniforme de la elución.
Figura 8
Experimento 8; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 6,0 utilizando un tampón de citrato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un pico uniforme concentrado.
Figura 9
Experimento 9; un cromatograma de la purificación de G-CSF sobre una columna Capto MMC a pH 6,5 utilizando un tampón de citrato sódico. Se presentan en la figura la absorbancia a 280 nm (mAU) y la conductividad (mS/cm) que se midieron. La columna se eluyó utilizando un tampón con un pH 7,0 que contenía 0,5 M de monoclorhidrato de arginina. Se obtuvo un pico uniforme concentrado.
Figura 10A y Figura 10B
Experimento 6, 7, 8, 9, 10; Separación de las proteínas en el material de partida y el eluído de los experimentos Capto MMC en los que se utilizaron diferentes valores del pH en el material de partida. Las muestras se redujeron
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0,3 M NaCl, 0,02 M de Na-citrato, un 0,02% Tween 20, pH 6,0, conductividad 32 mS/cm a +25 ºC. Tampón B (Tampón de elución I) 0,3 M NaCl, 0,02 M Na-citrato, un 0,02% de Tween 20, pH 3,0, conductividad 32 mS/cm a +25 ºC. La columna se equilibró con tampón de equilibrado A seguido por la carga con el material de partida. La resina se
lavó a continuación con tampón de equilibrado A y el G-CSF se eluyó posteriormente con el tampón de elución B. Se
analizó el contenido en G-CSF en el material de partida y el eluído (Tabla 7).
Tabla 7. Resultados del experimento de G-CSF con la resina de afinidad, elución con un pH 3
Muestra
Volumen (ml) G-CSF (ug/ml) Cantidad total G-CSF (ug) Rendimiento (%)
Material de partida (carga)
100 2 200 100
Eluído (Tampón B)
1,5 111 170 83
La Figura 12 muestra una SDS-PAGE teñida con Coomasie que muestra el eluído después de la etapa de cromatografía de afinidad.
Calle de muestra
1 Peso molecular de referencia 2 Eluído (Ejemplo 8)
Conclusión del Ejemplo 8
Se consiguió una pureza y recuperación excelentes cuando se utilizaba un tampón de pH bajo (pH 3) para la elución de G-CSF.
Ejemplo 9
Columna y resina Se empaquetó una columna Tricorn 5/50 (GE Healthcare) con un ligando de afinidad basado en un fragmento Fab derivado de una levadura dirigido contra G-CSF acoplado a una matriz con base de Capto MP. La altura del lecho
era aproximadamente de 2 cm, dando un volumen de resina de aproximadamente 0,4 ml. Se obtuvo el prototipo (G-CSF8) de la resina de afinidad en BAC BV. Material de partida El material de partida que se utilizó era el G-CSF que estaba contenido en un sobrenadante celular de células
HEK293F. Composiciones tampón Tampón A (tampón de equilibrado) 0,3 M de NaCl, 0,02 M de Na-citrato, un 0,02% de Tween 20, pH 6,0, conductividad 32 mS/cm a +25 ºC Tampón C (tampón de elución II) 1,0 M de NaCl, 0,02 M de Na-citrato, 0,8 M de Arg, un 0,02% de Tween 20, pH 6,0, conductividad 89 mS/cm a +25
ºC.
Los tampones de equilibrado y elución no se limitan al pH, concentraciones, y el tipo de tampón, sales o detergente establecidos. La columna se equilibró con tampón de equilibrado A seguido por la carga del material de partida. La resina se lavó
a continuación con tampón de equilibrado A, y el G-CSF unido se eluyó con el tampón de elución C. Se analizó el contenido de G-CSF en el material de partida y el eluído (Tabla 8).
Tabla 8. Resultados del experimento de G-CSF en resina de afinidad, elución con arginina
Muestra
Volumen (ml) G-CSF (ug/ml) Cantidad total G-CSF (ug) Rendimiento (%)
Material de partida (carga)
100 2 200 100
Eluído (Tampón B)
3,7 30 110 56
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  1. imagen1
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