KR101951446B1

KR101951446B1 - 성장 인자 단백질을 정제하는 방법

Info

Publication number: KR101951446B1
Application number: KR1020127025750A
Authority: KR
Inventors: 구스타브 길리암; 스테판 빈게; 마야 티메예르
Original assignee: 옥타파마 아게
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2019-02-22
Also published as: US10214575B2; ES2596727T3; WO2011121031A1; KR20130010897A; EP3040346A1; CN102858797B; AU2011234532B2; IL221652B; AU2011234532A1; US20130096279A1; EP3040346B1; EP2552948B1; DK2552948T3; RU2015149979A3; RU2571926C2; CA2793143A1; US20170051028A1; ZA201207228B; EP2552948A1; RU2012146074A

Abstract

성장 인자 단백질을 크로마토그래피를 이용한 정제순서 (purification sequence)로 정제하는 방법에 있어서,
- 다중 모드 수지를 이용한 하나 이상의 크로마토그래피가 수행된다.
- pH 4 내지 6.2에서 성장 인자 단백질이 다중 모드 수지에 결합하며, 성장 인자 단백질이 pH 6.3 이상에서 용출되며 성장인자 단백질의 용출이 용출 버퍼로 아르기닌 및/또는 NaCl의 첨가로 향상된다.
- 다중 모드 수지 단계 뒤에 효모 유래 친화 리간드 수지 단계가 수행되어, 90%이상의 생산물 순도 결과를 가져온다.
를 특징으로 하는 단계.

Description

성장 인자 단백질을 정제하는 방법{Process for the purification of a growth factor protein}

본 발명은 크로마토그래피를 이용하여 성장 인자 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

목적 단백질은 종종 미량으로 존재하며, 지질, 단백질, 또는 세포 조각 등과 같은 기타 생체 고분자를 동반하기 때문에, 천연 물질로부터의 단백질의 정제는 하나의 도전이다. 더욱이 목적 단백질은 대부분 정제를 위한 공정 단계에서 종종 상실될 수 있는 생리학적 기능과 관련되어 있다.

단백질과 같은 생체 고분자를 정제하는 방법의 집단 (arsenal)은 크다. 침전 방법 외에, 다양한 종류의 물질에 대한 크로마토그래피 방법이 알려져 있다. 빈번하게, 물질은 양성자화된 아민 또는 부분적 또는 완전히 알킬화된 아민과 같은 양이온, 유기 이온과 같은 화학적 모이어티 (moiety)에 의해 변형된다. 이와 같은 물질은 음이온 교환기로 사용된다. 그러나 양이온 교환기도 목적 단백질의 형태, 분자량 및 특히 전하와 같은 물리적 특징에 따라서 정제 방법에 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 조합으로 친화성 크로마토그래피가 이용된다.

전통적인 이온 교환 크로마토그래피 수지 (예를 들어 SP-, CM-, Q- 또는 DEAE Sepharose FF 이온 교환 크로마토그래피 수지)의 하나의 단점은 상대적으로 낮은 염 농도 (전도도, 삼투압 등), 전형적으로 0.01-0.15 M의 염 (NaCl 등) 농도에서만 단백질의 수지로의 결합을 수행할 수 있다는 것이 종래 기술에서 알려져 있다. 일부 적용에서는 이온 크로마토그래피 단계가 단백질들에, 또한 다소 증가된 이온 강도에서 직접적으로 (추가적 희석 없이) 크로마토그래피 수지에 가하는 상대적으로 온화한 (mild) 정제 조건의 이용에 대한 요구가 있다. 증가된 이온 강도는 단백질 용액 중 단백질 안정성에 유의성 있는 장점이 될 수 있다; 특히, 표적 단백질에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 잠재적 프로테아제 (protease)가 용액에 존재하는 재조합 생산 단백질 산물의 회수물 (harvest) 또는 혈장 유래 산물과 같은 원 조 단백질 제제 (crude protein prepatation)에서 유의성 있는 장점이 될 수 있다. 프로테아제는 생리학적 조건 (대부분의 세포 시스템의 경우와 같음) 즉, pH가 약 7 및 염분 농도가 약 0.15M에서 가장 잘 작용한다. 프로테아제는 염의 첨가 및/또는 pH의 변화 등과 같은 워크-업 (work-up) 조건의 변화에 의해 억제될 수 있지만, 이러한 파라미터 모두는 통상적인 이온 크로마토그래피의 성능에 결정적이고, 이에 따라 종종 이들의 조합의 사용은 불가능하다. 프로테아제의 영향을 최소시키는 조건이 이용될 수 있는 정제 방법의 제공에 대한 요구가 있다.

WO-A2-2008/073620은 바큘로바이러스 (baculoviral) 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포로부터 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 개시한다. 일 실시예에서, 곤충세포 배양물이 감염 직전 (예를 들어 감염 전 1시간) 지질 혼합물로 보충된다. 폴리펩타이드는 음이온 교환 또는 혼합 모드 (mixed-mode) 크로마토그래피를 정제 과정의 초반에 사용하는 방법을 이용하여 곤충 세포 배양물로부터 분리된다. 이 공정 단계는 곤충세포 유래 엔도글루카나아제 (endoglycanase) 및 프로테아제 (protease)를 제거하여 효소에 의한 분해 (enzymatic degradation)에 기인한 목적 폴리펩타이드의 손실을 줄이는데 유용하다. 또 다른 실시예에서, 혼합 모드 (mixed-mode) 크로마토그래피가 곤충-세포 배양액의 빠른 가공 및 폴리펩티드의 포획 (capture)을 가능하게 하기 위해 연속-흐름 방식 (continuous-flow manner)으로 염료-리간드 친화성 크로마토그래피와 조합된다. 또 다른 실시예에서, 중공사 여과 (hollow fiber filtration), 혼합 모드 (mixed-mode) 크로마토그래피 및 염료-리간드 친화성을 단일 단위 운용으로 조합하여, 그 결과 엔도글루카나아제 (endoglycanase) 및 단백질 가수분해 활성이 본질적으로 없는 폴리펩티드 용액을 생산하는 방법으로 곤충 세포 배양액으로부터 폴리펩티드를 분리한다. 또 다른 실시예에서, 분리된 폴리펩티드는 곤충 특이적 글루코실화 패턴 (glycosylation pattern)을 갖는 글루코펩타이드 (glycopeptide)이며, 이는 글리코실전달효소 (glycosyltransferase) 및 변형된 핵산당 (modified nucleotide sugar)을 이용하여 폴리머 (예를 들어, PEG)와 같은 변형기 (modifying group)에 선택적으로 접합된다.

WO-A2-2009/063069는 특별히 그러나 배타적으로, 펩티드 용액으로부터 엔도톡신 (endotoxin)을 제거하는 방법, 상기 방법을 위한 시약을 포함하는 키트 및 상기 방법에 의해 얻어진 정제된 펩티드를 개시한다.

Dasari Venkata Krishna Rao 등은 rhG-CSF (recombinant human granolocyte colony-stimulating factor)의 수율을 향상시키기 위하여 개발된 공정 제어-전략을 적용한 정제 과정을 개시한다. 전체 수율 2.18 g/l에서 99 % 이상의 순도가 본 연구에 의하여 달성되었다. 정제 동안의 산물 분석은 디터전트 (detergent)가 핵산의 제거 없이, 72 %의 LPS (lipopolysaccharide) 및 98 % 의 HCP (host cell protein)를 제거하였음을 나타냈다. 시스테인 농도는 단백질 리폴딩 (refolding)에서 주된 파라미터이다. SEC (size-exclusion chromatography, 크기 배제 크로마토그래피) 컬럼에서의 베드 높이 (bed height)와 HETP (height equivalent theoretical plates) 값이 평가되었으며 그의 분할능 (resolution)에 대한 효과를 탐구하였다. SEC 동안의 포뮬레이션 (formulation)이 산물 수율의 증가, 시간 및 공정 비용의 절감에 결정적임을 발견하였다.

Quan Bai 등은 강한 음이온-교환 크로마토그래피(strong anion-exchange chromatography, SAX)를 이용하여 대장균 (Escherichia coli)에서 발현되는 재조합 인간 과립대식세포콜로니자극인자 (recombinant human granulocyte macrophage colony stimulation factor, rhGM-CSF)를 복원 (renaturation) 및 정제하는 방법에 대하여 연구하였다. SAX를 이용한 rhGM-CSF의 복원 및 정제에 대한 pH 값, GSH/GSSG의 농도비, 및 이동상 (mobile phase)중 요소 (urea) 농도의 영향을 각각 연구하였다. 그 결과는 전술된 3가지 요소 (factor)가 rhGM-CSF의 복원 및 회수율 (mass recovery)의 효율성에 지대한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이동상 (mobile phase)중 GSH/GSSG의 첨가는 rhGM-CSF에서의 정확한 이황화 결합 (disulfide bond) 형성을 개선하여 복원 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, SAX에 의한 rhGM-CSF 회수율 (mass recovery)를 개선하기 위하여, 낮은 농도의 요소 (urea)를 이동상에 첨가하여 변성된 단백질 응집을 방지했다. 선택적인 조건 하에서, rhGM-CSF가 SAX 컬럼에서 하나의 단계만으로 30분 이내에 복원됨과 동시에 정제되었다.

Shelly A. Pizarro는 생체내에서 혈관형성 (angiogenesis)과 혈관투과 (vascular permeability)를 유도하는 강력한 유사분열물질 (mitogen)인 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor) (VEGF165)에 대하여 보고하고, 상처 회복의 가속화를 위한 치료적 응용에서 잠재력을 입증하였다. 이 보고서에 개시된 방법은 배양액 (broth) 리터당 약 9 g의 rh VEGF를 생산할 수 있는 박테리아 발현 시스템 및 약물 물질의 제제화 전 단백질 리폴딩 (refolding) 및 3개의 크로마토그래피 단계의 하류 (downstream) 정제 방법을 포함한다. 높은 세포 밀도 (high cell density, HCD) 유가 발효 (fed-batch fermentation) 방법이 주변세포질 봉입체 (perisplasmic inclusion bodies) 중 rhVEGF를 생산하는데에 사용되었다. 정제를 위하여 rhVEGF를 추출하기 위해, 봉입체 (inclusion bodies)를 세포 용해물 (lysate)로부터 회수하고, 단일 단계 단백질 가용화 (solubilization) 및 리폴딩 (refolding)을 수행한다. 리폴딩 및 크로마토그래피를 포함하는 진행 (development) 동안의 총 회수 수율은 30±6 %였다. 숙주세포 불순물은 실험실 및 큰 규모에서 모두 일관성 있게 목표 수준 이하로 제거되어, 공정 강건성 (robustness)를 입증했다. 리폴딩되고 정제된 rhVEGF의 구조는 질량분석, N-말단 서열분석, 및 트립신 펩티드 맵핑 (mapping)을 이용하여 확인하고, 산물 변이체는 다중 HPLC 분석에 의해 분석하였다.

Kimberly A. Kaleas는 혼합 모드 (mixed-mode) 크로마토그래피 수지가 어려운 공급원료 (challenging feedback)의 정제 도구로써 대중성을 얻고 있다는 것을 개시하고, 알칼리성 공급원료로부터 Capto MMC로 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자 (recombinant human vascular endothelial growth factor, rhVEGF)를 선택적으로 수득하기 위한 산업적 적용의 개발을 개시한다. Capto MMC 수지는 단백질과의 이온, 소수성, 및 수소 결합 상호작용에 참여하는 잠재력을 가지며, 고도로 교차 결합된 아가로스 비드 매트릭스 (cross-linked agarose bead matrix)에 결합된 리간드를 포함한다. VEGF는 신생 혈관 생성 (angiogenesis)에 관여하는 주요한 성장 인자이며, 상처 회복 치료를 위한 치료적 적용을 갖는다. 이는 Escherichia coli에서 봉입체 (inclusion bodies)로 발현된다. 고형물을 세포 용해물 (lysate)로부터 회수하고, rhVEGF를 pH 9.8에서 요소 (urea) 및 산화환원제 존재하에서 가용화 (solubilize)시키고 리폴딩시킨다. Capto MMC의 특이적 혼합 모드 특성은 최소의 로드 조건화 (load conditioning)의 이 염기성 단백질의 수득을 가능하게 하며, 숙주세포 단백질의 함유량을 1.2 %미만으로 감소시키면서, 95 % 보다 높은 수율로, 하류 가공을 위한 농축된 풀 (pool)을 전달했다. 이 연구는 로딩 조건과 체류기간 (residence time)의 동적인 결합 능력에 대한 영향 및 최적 정제 성능을 위한 용출 조건의 개발을 탐구한다. 다양한 용출 버퍼의 평가 뒤, L-아르기닌 HCl이 수지와 rhVEGF간의 다중 상호작용을 성공적으로 방해하기 때문에, Capto MMC 혼합 모드 (mixed-mode) 수지로부터 rhVEGF를 탈착하기 위한 효과적인 용출제로 밝혀졌다. 실험실 규모의 노력은 상업적 생산 규모로 성공적으로 구현된 강건한 크로마토그래피 단계를 가져왔다.

본 발명의 목적은 새로운 방법을 제공함으로써 종래 기술의 성장 인자 단백질 정제방법이 갖는 문제점을 회피하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 목적은 과립세포 콜로니 자극인자 (Granulocyte Colony Stimulating Factor. G-CSF) 또는 과립-대식세포 CSF (granulocyte-macrophage CSF, GM-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (Colony Stimulating Factor, CSF), 인터루킨 3 (interleukin 3, IL-3), 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor), 표피성장인자 (Epidermal growth factor) 및 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor) (acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 성장인자단백질을 크로마토그래피를 이용한 정제순서 (purification sequence)로 정제하는 방법으로서,

- 다중 모드 수지 (multimodal resin)를 이용한 하나 이상의 크로마토그래피가 수행되고,

- pH 4 내지 6.2에서 성장 인자 단백질이 다중 모드 수지에 결합하며, 및

- 6.3 보다 높은 pH에서 성장 인자 단백질이 상기 다중모드 수지로부터 용출되는 것인 방법에 의해 달성된다.

본 발명은 유리하게 프로테아제 (protease)의 영향을 최소화할 수 있는 방법을 제공한다. 이는 표적 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제가 존재하는 조 담백질 (crude protein) 샘플에 염을 첨가하고 및/또는 pH를 변경하고 및 단백질 용액을 별도의 조치 없이 가공하고 표적 단백질을 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합시킬 수 있게 하고, 그에 의해 조 샘플 중 표적 단백질을 농축 및 정제하는 최적화된 단계를 제공하는 것과 표적 단백질에 대한 특이적 친화성 크로마토그래피를 이용한 후속 정제에 적합하게 만드는 것을 가능하게 하고, 후속 과정에서 프로테아제 및/또는 DNA 함유량을 감소시킨다. 이는 정제 동안 표적 단백질의 분해를 피하며, 조 단백질 용액에서 포획 단계로 이용하는 다중 모드 (multimodal) 크로마토그래피의 조합을 가능하게 하는 것에 특정한 중요성이 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 다중 모드 (multimodal) 수지상의 크로마토그래피는 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계와 조합된다. 효모 유래 친화성 리간드를 이용하는 크로마토그래피 단계는 표적 단백질을 높은 수율 및 변하지 않은 분자 온전성 (integrity) (분해 등)으로 정제하기에 특히 적합하다.

성장 인자 단백질은 G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)와 같은 콜로니 자극인자 (Colony Stimulating Factor, CSF)이다. 이는 조혈 조절 당 단백질의 한 종류로, 줄기세포로부터 조혈세포의 분화 및 증식에 관여한다. 성장 인자 단백질은 과립-대식세포 CSF (granulocyte-macrophage CSF, GM-CSF), 인터루킨 3(interleukin 3, IL-3), 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor), 표피성장인자 (Epidermal growth factor) 및 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor) (acid)이다. 모든 성장 인자 단백질은 IP≤6을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 다중모드 수지는 매트릭스에 결합된 모이어티 (moteties)를 포함하며, 이 모이어티는 이온 상호작용, 및 수소 결합, 소수성 및 호황성 (thiophilic) 상호작용과 같은 기타 종류의 상호작용을 이용하여 혼합물 중 성장 인자 단백질과 상호작용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 친화성 리간드는 성장 인자 단백질을 표적하는 효모 유래 Fab 단편이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 다중 모드 (multimodal) 수지 단계는 성장 인자 단백질을 조 단백질 용액으로부터 포획하기 위하여 진행되며, 그 뒤 결과적으로 수득되는 다중모드 크로마토그래피의 용출액에 대하여 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계를 수행하고 상기 친화성 크로마토그래피 단계로부터의 성장 인자 단백질의 용출 후에, 단백질 및 DNA 대비 약 90% 보다 높은 순도를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 최종 성장 인자 단백질 산물에서 99% 보다 높은 순도를 얻기 위하여, 상기 다중 모드 수지 단계 및 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계는 다른 크로마토그래피 정제 단계와 조합된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 성장 인자 단백질을 포함하는 혼합물은 용액이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성장 인자 단백질은 재조합 생장 인자 단백질이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성장 인자 단백질은 산물을 분해할 수 있는 프로테아제를 잠재적으로 포함하고 있는 조 단백질 용액에 존재한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성장 인자 단백질은 pH 6.3 보다 높은 pH 변화로 용출된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산 및/또는 높은 이온강도를 포함하는 용출제 (eluting agent)로 용출을 수행하였다. 대안적으로 또는 조합으로, pH의 변화로도 용출을 수행할 수 있다. pH의 변화는 예를 들어 수산화 나트륨 또는 아세트산으로 용출 버퍼의 원하는 pH로 조정하고 그 뒤 버퍼를 다중 모드 수지에 적용하는 것에 의해 수행되며, 이온강도 조절은 다중모드 수지에의 적용 이전에 용출 버퍼 조성에 염을 첨가하는 것으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 염은 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 포함된 것일 수 있으며, 예를 들어 염화나트륨 및 염화 칼륨일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용출제의 농도는 특히 약 0.1M 내지 약 2 M의 범위내이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 성장 인자 단백질은 약 pH 6.0에서 다중 모드 수지에 결합하는 반면, 상기 성장 인자 단백질은 다중모드 수지로부터 pH 약 6.5 또는 그 이상, 특히 pH 약 7.0에서 용출된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 특히 pH가 약 4 내지 8의 범위 내에서 버퍼 물질은 구연산 나트륨, 히스티딘, 2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄 설폰산 (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethane sulfonic acid, HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄 설폰산 (2-(N-Morpholino)ethane sulfonic acid, MES), 트리스 (Tris) 염기 및 아세트산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 물질을 포함하는 버퍼 물질이 사용된다.

본 발명의 방법에서 하나의 비-이온성 디터전트 (detergent)가 사용되는 버퍼에 존재할 수 있으며, 이 비-이온성 디터전트는 특히 폴리소르베이트 (Polysorbate 20, 40, 60, 80) 및 플루로닉 (Pluronic) F68로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한, 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며; 유기 염은 KCl 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 세척 단계는 다중모드 수지로부터 성장 인자 단백질을 용출하기 전에, pH 약 4 내지 약 6 의 범위 내에서 수행되며, 세척 버퍼는 염기성 곁사슬 및/또는 높은 이온 강도를 갖는 아미노산을 포함하는 세척제를 포함하며, 이온 강도 조절은 다중모드 수지에 적용되기 전에 세척 버퍼 조성물로의 염, 예를 들어 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 포함된 염, 예를 들어 염화 나트륨 및 염화칼륨의 첨가에 의해 수행될 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 세척제의 농도는 특히 약 0.1 M 내지 약 2 M의 범위이다.

성장 인자 단백질이 방출되기 전에, 오염물질 (프로테아제, DNA 등)을 제거하고, 성장 인자 단백질을 유지하기 위해 세척 버퍼를 다중모드 수지에 적용하는 것이 유리할 수 있다.

특히, pH 6 내지 8에서 양전하를 띠는 아미노산의 농도는 6.3 미만의 pH에서 세척 버퍼에 2 M 이하의 양으로 존재한다. 통상적으로, 아르기닌의 양은 세척 버퍼 중 0.1 내지 1.0 M의 범위, 특히 0.5 M이다.

pH>6.3의 용출 버퍼에서 아르기닌의 양은 통상적으로 0.1 내지 2 M이며, 특히 0.5 M이다.

pH≥6.3의 용출 버퍼에서, 염화나트륨은 0.1 내지 2.0 M의 범위로, 특히 0.1 내지 1 M로 포함된다.

pH<6.3의 세척 버퍼에서, 염화 나트륨은 0.1 내지 2.0 M, 특히 0.1 내지 1 M의 범위로 포함된다.

비-이온성 디터전트 (detergent)의 양은 일반적으로 0.001 내지 1 %의 범위, 특히 다중 모드 크로마토그래피를 위한 버퍼에서는 0.02 %이다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 다중 모드 크로마토그래피는 하기의 모이어티 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

a. 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (N-Benzyl-N-methyl ethanolamine) 리간드,

b. 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 (2-(benzoylamino) butanoic acid) 리간드,

c. 페닐프로필 (phenylpropyl) 리간드,

d. N-헥실 (N-hexyl) 리간드,

e. 4-머캅토-에틸-피리딘 (4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 리간드,

f. 3-((3-메틸-5-((테트라히드로퓨란-2-일메틸)-아미노)-페닐)-아미노)-벤조산 리간드 (3-((3-methyl-5-((tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-amino)-phenyl)-amino)-benzoic acid) 또는 이들의 조합.

특히, 본 발명에 따라 사용하는 다중 모드 크로마토그래피 수지는 상업적으로 입수 가능한 하기의 수지 HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 정제 순서 (purification sequence)는 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계, 크기 기초 제거 단계, 크로마토그래피 단계 또는 이들의 조합을 포함하는 병원체 제거/불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단계들은 제거 대상 병원체의 상이한 생리학적 특성에 기초한다.

본 발명의 방법의 특정 구체예에서, 정제 순서는 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:

1. Capto MMC와 같은 양이온 다중모드 수지;

2. 외피 (enveloped) 바이러스를 위한 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계, 특히, EP-A-131　740에서 개시하는 바와 같은 트리-n-부틸 포스페이트 (tri-n- butyl phosphate) 및 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 이용한 용매/디터전트-불활성화 단계;

3. 효모에서 발현된 리간드에 기초한 친화성 수지;

4. SP Sepharose 또는 Resource S와 같은 양이온 교환기;

5. 플라노바 20N (Planova 20N)과 같은 약 20nm의 평균 공극 크기를 이용한 병원체 여과 제거 단계;

6. 개략적 컷오프 (cut off)가 1 내지 5 kDa인 초미세여과 (ultra filtration)와 같은 버퍼 교환 및/또는 농축 단계;

7. Superdex 75와 같은 크기 배제 크로마토그래피.

도 1은 pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 pH 4.0에서 출발물질에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 pH 4.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 pH 5.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 pH 5.5에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 pH 6.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 pH 6.5에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용하여 Capto MMC 컬럼으로부터 G-CSF를 정제한 것에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 출발 물질 및 Capto MMC로부터의 용출액에서 은 염색 (silver stain)된 SDS-PAGE 및 단백질 분리를 나타낸다. MES 버퍼가 수행 버퍼 (running buffer)로 사용되었다.
도 11은 세포 불포함 상청액으로부터의 G-CSF 정제의 크로마토그램을 보여준다.
도 12는 친화성 크로마토그래피 단계 후 용출액을 보여주는 쿠마시 염색(Coomassie stain)된 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 13은 출발물질, 친화성 크로마토그래피 단계 후의 통과액 및 용출액을 보여주는 은 염색 (silver stain)된 SDS-PAGE를 나타낸다.

본 발명은 G-CSF 정제를 예시하는 하기의 비한정적인 실시예에 의해서 좀더 설명된다.

실시예

분석 방법의 설명

G- CSF 특이적 ELISA 를 이용한 G- CSF 함유량의 결정

효소결합 면역흡착 분석법 (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA)의 원리는 단백질에 대한 항체로의 특이적 결합에 의한 단백질 (항원)의 정량이다. G-CSF Duo Set ELISA (R&D Systems, Cat No DY214)에 기초한 샌드위치 ELISA로 G-CSF 정량을 실시했다. 보정 표준 (calibration standard)으로는 대장균 (E. coli)유래 재조합 인간 G-CSF (R&D systems, Cat No. 214-CS-005, 0.015-1 ng/ml)를 이용하였다. 96-윌 마이크로타이터 플레이트에 포획 항체 (capturing antibody) (마우스 항-인간 G-CSF)를 결합시켰다. G-CSF 항원의 포획 및 세척 단계 뒤, G-CSF 항원에 비오틴화된 (biotinylated) 검출 항체 (염소 항-인간 G-CSF)를 결합시켰다. 2차 세척 단계 후, Horse Raddish Peroxidase (Streptavidin-HRP)에 접합된 스트렙타비딘 (streptavidin)를 적용했고, 이는 비오틴화된 검출 항체에 결합했다. 정량을 위하여 과산화수소 존재하에서 페록시다아제 (peroxidase) 기질인 테트라메틸벤지딘 (Tetramethylbenzidine, TMB)을 첨가하였으며 청색이 발색되었다. 황산을 이용하여 반응을 중지시킨 뒤, 황색 염료가 발색한다. 황색 염료의 농도는 결합된 페록시다아제의 양과 비례적이며 따라서 G-CSF 항원 양과 비례한다. 염료의 농도는 450 nm에서 광도계로 측정한다. 미지 샘플의 G-CSF 농도는 언제나 >0.99의 선형 상관계수 (r)를 갖는, 재조합 인간 G-CSF 표준 곡선으로부터 계산했다.

역상 ( reversed - phase ) HPLC 를 이용한 G- CSF 함유량의 결정

RP-HPLC는 단백질의 극성에 따른 분리를 수반한다; 용질 분자의 비극성 모이어티와 HPLC 컬럼의 비극성 고정상간의 소수성 상호작용이 단백질 분자의 유지 (retention)을 좌우한다. 단백질 측정을 위하여 UV 검출기와 Jupiter C18, 300A, 5 μm, 4.6 x 150 mm 컬럼 (Phenomenex, Cat. no. 00F-4053-EO)이 갖추어진 HPLC 시스템 (Dionex Ultimate 3000)을 사용하였다. 20±5 ℃로 유지시킨 컬럼을 물 중 0.1 % (v/v) 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA) (이동상 A)을 이용하여 평형화시켰다. 용출을 위하여, 아세토나이트릴 (acetonitrile) 중 0.1 % (v/v) TFA (이동상 B)를 유속 1.0 ml/분에서 선형 구배 (0-5 분 5% B, 5-12 분 55% B, 12-17 분 100 % B, 17-22 분 5 % B)로 사용하였다. 최대 100 ㎕의 샘플 중 총 주입 (injection) 부피 로드는 주입 당 30 ㎍ 이었다. 검출은 214 nm에서의 UV 흡광도 측정으로 수행하였다. Ph.Eur 2.5-40 ㎍ (2.5-5-10-20-40 ㎍)의 필그라스팀 CRS (Filgrastim CRS)를 표준 곡선으로 사용하였다. Filgrastim CRS 표준을 실험수 (WFL)로 농도 0.4 mg/mL로 예비 희석시켰다. 필요한 경우, 샘플의 WFL 중 예비 희석을 30 ㎍의 주입량까지 수행하였다. 언제나 >0.99의 선형 상관계수 (r)를 갖는 Filgrastim CRS 표준곡선을 이용하여 미지 샘플의 G-CSF 함유량을 계산하였다.

역상 ( reversed - phase , RP ) HPLC 를 이용한 순도 결정

RP-HPLC를 이용한 순도 결정을 위해 사용된 방법 및 기기는 G-CSF 함량 결정 방법과 동일하다. G-SCF 함유 용액의 순도 [%]는 총 피크 면적 (peak area)에 대한 G-CSF 피크의 피크 면적과의 비율로 계산하였다.

SDS - PAGE 에 의한 순도 결정 및 분자량 분포

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)은 단백질을 그들의 크기로 분리하는 것을 수반한다. G-CSF 함유 샘플의 순도 결정 및 분자량 분포의 분석을 환원 조건하에서 수행하였다. 이러한 목적을 위하여, Tris-Tricine 구배 겔 (10-20%, Anamed, Cat No. TR12012) 및 Tris-HCl 구배 겔 (10-20%, Biorad, Cat No. 345-0043)를 사용하였다. Tris-Tricine 구배 겔에서는 BioRad의 Polypeptide SDS-PAGE Molecular Weight Standard (Cat No. 161-0373, 10-250 kDa)를, Tris-HCl 구배 겔에서는 BioRad의 Precision Plus Protein All Blue Standard (Cat No. 161-0373, 10-250 kDa)를 분자량 표준으로 사용하였다. 전기영동에 의해서 분리된 단백질 밴드를 은 (silver) 또는 구마시 (comassie) 염색으로 시각화하였다. E. coli 유래 재조합 인간 G-CSF (글리코실화되지 않음, R&D systems, Cat No. 214-CS-005)와 글리코실화된 CHO 유래 상업 제품 Granocyte (Chugai)를 G-CSF 기준 (reference) (대조군 샘플) 으로 이용하였다. 표준, 기준 (대조군 샘플) 및 분석 샘플의 출현 (apperance)을 판단하여 분자량 및 순도의 평가를 시각적으로 수행한다.

재조합 G- CSF

G-CSF 함유 세포 현탁액의 제조 및 정제

세포

사용된 세포주는 무혈청 증식에 적응된 인간 배아 신장 (human embryonic kidney) 세포 293 (HEK 293)의 파생물 (derivative)이다. 이 숙주세포, HEK 293을 G-CSF의 cDNA 코딩 서열을 운반하는 발현 카세트를 이용하여 안정적으로 형질감염시켰다. 본 카세트에는 강력한 프로모터를 사용하였다. 일반적인 방법은 EP 1739179 (Schroder et al)에 또한 개시되었다.

배양 방법

세포를 해당 기술분야에서 잘 알려진 일반적인 장치 및 일반적인 방법으로 무혈청 배지에 배양하였으며, 그 예로는 회분, 유가 (fed-batch), 관류 (perfusion) 또는 연속화성분 배양 (continuous chemostat culture)으로 수행되는 t-플라스크, 진탕 플라스크 및 생물반응기 (일회용 시스템 및 통상적인 교반 탱크)에서의 진탕 또는 교반 배양이 있다 (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4th ed, Wiley- Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York; Enfors, S-O and Haggstrom, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA). 통상적으로, 세포수 및 생성물 역가 (product titer)를 표준 회분 배양 수준 이상으로 증가시키기 위하여 배지의 관류를 이용했다. 생산물 수율과 숙주세포 단백질의 양은 배양 방식에 따라서 상이하다.

- 생산물 역가는 일반적으로 세포 수에 따라서 증가할 것이다.

- 총 단백질 함량과 DNA 함량은 일반적으로 세포 수에 따라서 증가할 것이다.

- 총 단백질 함량과 DNA 함량은 배양 수명 (culture longetivity)에 따라 증가할 수 있다.

- 회분 배양은 단백질과 DNA를 축적한다; 어느 것도 외부로부터 첨가되지 않고, 제거되지 않는다.

- 관류 과정은 세포 배양물을 대사산물, 단백질, DNA 및 기타 불순물로부터 세정한다; 세포 유지 (cell retension)을 위하여 필터 또는 세포 원심분리를 일반적으로 사용하였다.

재조합 생산물은 세포로부터 분비되며 세포 현탁액 또는 세포 현탁액의 상청액이 회수물 (harvest)이다. 회수물의 특성 (상기 언급한 바와 같이 생산물 역가 및 불순물)은 사용된 배양방법에 따라서 달라진다.

세포현탁액을 아래에 기술한 G-CSF 실시예 중 일부에서 사용했다.

정제 방법

재조합 산물이 세포로부터 분비되며, 세포 현탁액 또는 세포 현탁액 상청액이 회수물 (harvest)이다. 적용한 정제는 4 단계 정제를 포함한다. 양이온 교환 크로마토그래피 (SP Sepharose Fast Flow (FF))를 세포 배양 현탁액으로부터 G-CSF를 포획하는 단계에 이용하고, 뒤이어 아연 기반 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 단계 (Zn-IDA chelating Sepharose Fast Flow (FF)), 폴리싱 (polishing)을 위한 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계 (Resource S) 및 마지막 단계로써 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex75)를 이용하였다.

G- CSF 를 함유한 세포 배양 상청액의 준비

포획 단계에 앞서, 총 G-CSF 양 [mg]을 확인하기 위하여 상청액 배치 (batch) 의 G-CSF 농도 [mg/L]를 G-CSF 특이적 ELISA를 이용하여 결정하였다. 동결된 상청액 (-80℃)을 20±5℃로 조절한 물수조에서 해동시켰다. 그 뒤, 상청액을 4℃에서 15분간 9000xg로 원심분리하고, 추가적으로 0.2 ㎍여과 단위를 이용하여 여과시켰다. 아세트산을 이용하여 여과된 상청액의 pH를 pH 4.0으로 조절하였다.

포획 단계 ( SP Sepharose FF )

XK 16/20 컬럼에 10ml의 SP Sepharose FF (1　column volume (CV) = 10 ml)를 채웠다. SP Sepharose FF 수지는 GE Healthcare (Cat No. 17-0729-01)으로부터 얻었다.

평형화는 평형화 버퍼 (20 mM 아세트산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 0.02% Tween20, pH 4.0) 3 CV로 수행하고, 2.5 ml/분의 유속으로 출발물질을 로딩시켰다. 그 뒤 동일한 버퍼 및 동일한 유속으로 5CV를 이용하여 세척단계를 수행하였다.

용출은 20 mM 아세트산 나트륨, 1 M 염화 나트륨, 0.02% Tween20, pH4.0을 포함하는 용출 버퍼를 0% 에서 40%까지 선형 구배 (linear gradient)로 2.5 ml/min의 유속으로 수행하였으며, 그 뒤 5 CV를 100 % 용출 버퍼를 이용하여 계단 용출 (step elution)을 8 CV내에서 수행하였다.

선형 구배 용출로부터 얻은 용출액 풀(pool)의 G-CSF 농도는 G-CSF 특이적 ELISA로 분석하였다.

IMAC 단계 ( Zn - IDA Chelating Sepharose FF )

XK 16/20 컬럼을 2 ml 0.2 M ZnCl₂ (1　column volume (CV) = 10 ml)으로 충전 (charge)한 10ml의 Chelating Sepharose FF로 채웠다. Chelating Sepharose FF 수지는 GE Healthcare (Cat No. 17-0575-01)로부터 얻었다.

로딩 전에 IMAC 컬럼 로드 (SP Sepharose FF eluate)의 pH를 NaOH를 이용하여 pH 8.0으로 조절하였다. 3 CV의 평형화 버퍼 (20 mM Tris/HCl, 150mM NaCl, pH 8.0)로 평형화를 수행하고, SP Sepharose FF 용출액을 유속 2 ml/min로 로딩시켰다. 그 뒤, 2 CV를 이용하여 동일한 버퍼 및 유속으로 세척단계를 수행하였다.

용출은 3 CV를 20 mM Tris/HCl, 150mM NaCl, pH 4.0를 포함하는 용출 버퍼를 0%부터 100%까지의 선형 구배 (linear gradient)를 3 CV 내에서 1 ml/분 유속으로 적용하여 수행하였다. 100% 용출 버퍼에 의한 구배 지연 (gradient delay)을 4 CV로 차후 적용시켰다.

100%의 용출 버퍼를 이용한 용출으로부터 수집한 용출액 풀 (pool)의 G-CSF의 농도는 G-CSF 특이적 ELISA를 이용하여 분석하였다.

폴리싱 단계 ( Polishing step ) ( Resource S)

GE Healthcare (Cat No. 17-1180-01)의 미리 채워진 ResourceS 컬럼 (CV = 6ml)을 5 CV의 평형화 버퍼 (20 mM 아세트산 나트륨 , 0.02% Tween-20, pH 4.0)를 이용하여 유속 4ml/min으로 평형화시켰다. 정제 전에 IMAC 용출액을 아세트산을 이용하여 pH 4.0으로 조절하고 평형화 버퍼를 이용하여 5배 희석시켰다.

10 CV의 평형화 버퍼를 이용하여 4ml/min의 유속으로 세척단계를 수행하였다.

용출은 20mM 아세트산 나트륨 , 1 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 4.0를 포함하는 용출 버퍼를 이용하여 0% 내지 100% 용출 버퍼의 선형 구배를 이용하여 20 CV내에서 2 ml/분의 유속으로 수행하였다.

50-85%의 용출 버퍼의 선형 구배로부터 수집한 용출액 풀 (pool)의 G-CSF 농도는 G-CSF 특이적 ELISA를 이용하여 분석하였다.

크기 배제 크로마토그래피 단계 ( Size exclusion chromatography step ) ( Superdex75 )

크기 배제 단계를 위하여 미리 채워진 Hiload 26/60 Superdex 75 Prep Grade column (GE Healthcare Cat No. 17-1044-01, CV = 320 ml)을 사용하였다. 컬럼은 1 CV 버퍼(20 mM sodium acetate, 200 mM NaCl, 0.02% Tween20, pH 6.5)로 평형화시키고, 유속 2.5ml/ 분 및 4 % CV의 최대 로딩 부피로 ResourceS 용출액을 로딩하였다.

용출액 풀 (pool)의 G-CSF 농도는 G-CSF 특이적 ELISA 및 Reversed Phase (RP)-HPLC로 분석하였다. 최종 정제 분획의 순도는 RP-HPLC, 크기 배제-HPLC (Size Exclusion (SE)-HPLC) 및 SDS-PAGE를 이용하여 분석하며, 일반적으로 95 %보다 높다.

크기 배제 용출액은 하기에 기술하는 G-CSF 샘플의 일부에서 사용했다.

포획 단계로서 Capto MMC 수지를 이용한 rhG - CSF 의 정제

실시예 1 (실험 1)

출발 물질

정제된 rhG-CSF는 Capto MMC 컬럼에 로딩하기 전에, 총 단백질 농도를 낮추고 더 유용한 부피를 얻기 위하여 평형화 버퍼를 이용하여 희석시켰다. 희석에 ㅇ앞서 G-CSF를 20mM 아세트산 나트륨, 0.5M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 4.0으로 용해시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자의 포획 단계에서 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼 (GE Healthcare)를 베드 높이 (bed height) 15cm까지 Capto MMC로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (column volume (CV))는 3ml였다.

버퍼

평형화 버퍼: 20mM 아세트산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.0

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드 (arginine mono hydrochloride), 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고, 그 뒤 출발물질을 1ml/min의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척을 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 rhG-CSF를 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 표 1에서 표시된 바와 같이 통과액 (flow through) 분획에서는 G-CSF를 발견할 수 없었다. 용출 버퍼는 0.5M 의 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함하며 pH는 7.0으로 변했다. G-CSF의 회수율 (recovery)은 89 % 였으며 용출 프로파일 (elution profile)은 더욱 농축된 피크였다. 용출 뒤 컬럼을 1M NaOH 용액으로 세척하였다. 컬럼의 1 M NaOH 세척액에서 매우 작은 피크를 볼수 있었다. 크로마토그램을 도 1에 표시한다.

샘플	부피 ml	rhG - CSF ㎍/ ml	총 rhG - CSF ㎍	수율 %
출발 물질	8.71	111	966.8	100
통과액 및 평형화 세척	18	0	0	0
용출액	12	72	864	89

결론

로딩된 모든 G-CSF는 pH 4.0에서 Capto MMC에 결합한다. 3 컬럼 부피 (CV)로 수집한 용출 분획에서 높은 (89%)의 수율을 얻었다. 용출 버퍼는 7.0의 pH를 가졌고, 0.5 M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함했다.

도 1의 도면의 설명

실험 1; pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 사용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)에서의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도 1에 표시한다. 컬럼은 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 용출시켰다. 용출액에 의해 이중 피크 (double peak)를 얻었다. 이 이중 피크는 하나의 분획으로 수집되었다.

실시예 2 (실험 2)

출발 물질

정제된 rhG-CSF는 Capto MMC 컬럼에 로딩하기 전에, 총 단백질 농도를 낮추고 더 유용한 부피를 얻기 위하여 평형화 버퍼를 이용하여 희석시켰다. 희석에 앞서 rhG-CSF는 20 mM 아세트산 나트륨, 0.5 M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 4.0에 용해시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼 (GE Healthcare)을 베드 높이 (bed height) 15cm까지 Capto MMC로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (column volume (CV))는 3ml였다.

버퍼

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 그 뒤 출발물질을 1ml/분의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척을 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 rhG-CSF를 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 표 2에서 표시한 바와 같이 통과액에서 rhG-CSF는 발견할 수 없었다. 용출 버퍼는 7.0의 pH를 가졌다. Capto MMC 컬럼에 로딩시킨 90 %이상의 rhG-CSF를 용출된 분획에서 발견하였다. 용출 피크는 아르기닌이 용출 버퍼에 포함되어 있는 실험 1 보다 더넓었다. 용출 부피는 2배였다.

샘플	부피 ml	rhG - CSF ㎍/ ml	총 rhG - CSF ㎍	수율 %
출발 물질	8.92	77.47	691	100
통과액 및 평형화 세척	30	0	0	0
용출액	24	26.07	626	90.5

결론

재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF)는 pH 4에서 Capto MMC에 결합하며 구연산나트륨으로 완충된 용액으로 pH7에서 용출시킬 수 있다.

실시예 3 (실험 3)

출발물질

정제된 rhG-CSF는 Capto MMC 컬럼에 로딩하기 전에, 총 단백질 농도를 낮추고 더 유용한 부피를 얻기 위하여 평형화 버퍼를 이용하여 희석시켰다. rhG-CSF을 희석에 앞서 20mM 아세트산 나트륨, 0.5M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 4.0에 용해시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자 포획 단계에서 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 column (GE Healthcare)를 베드 높이 (bed height) 15cm까지 Capto MMC로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (column volume (CV))는 3ml였다.

버퍼

용출 버퍼: 20mM HEPES, 0.3M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0

실험 구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시켰으며 그 뒤 출발물질을 1ml/min의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척을 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 rhG-CSF를 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 표 3에 표시된 바와 같이 통과액에서는 rhG-CSF를 발견하지 못하였다. 용출 버퍼는 7.0의 pH를 가지며 NaCl 농도는 실험 2와 비교하여 0.3M로 상승하였다. Capto MMC 컬럼에 로딩된 모든 rhG-CSF는 용출된 분획에서 확인할 수 있었다. 크로마토크래피 프로파일 (profile)이 도 2에 표시된다. 넓은 용출 피크를 얻었으며, 전체 용출 피크는 하나의 용출 분획으로 수집되었다.

샘플	부피 ml	rhG - CSF ㎍/ ml	총 rhG - CSF ㎍	수율 %
출발물질	8.8	71.2	627	100
통과액 및 평형화 세척	30	0	0	0
용출액	24	27.1	650	103.7

결론

rhG-CSF는 pH 7에서 Capto MMC와 결합하며 0.3M NaCl이 용출 버퍼에 포함 될 때 pH 7에서 100% 용출되었다. 용출액 부피는 아르기닌이 용출 버퍼에 포함되어 있을 때에 비하여 2배 컸다. 이것은 0.3 NaCl의 Capto MMC 수지로부터 G-CSF의 용출 효과는 0.5M의 아르기닌과 동일하지 않다는 것을 의미한다.

도 2의 도면의 설명

실험 3; pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정한 280nm (mAU)에서의 흡광도 및 전도도를 도면에 나타내었다. 0.3M NaCl을 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 이 용출에 의하여 이중 피크를 얻었다. 넓은 이중 피크는 하나의 분획으로부터 수집되었다.

실시예 4 (실험 4)

출발 물질

정제된 rhG-CSF는 Capto MMC 컬럼에 로딩하기 전에, 총 단백질 농도를 낮추고 더 유용한 부피를 얻기 위하여 평형화 버퍼를 이용하여 희석시켰다. rhG-CSF는 희석에 앞서 20mM 아세트산 나트륨, 0.5M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 4.0에 용해시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자의 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼 (GE Healthcare)을 베드 높이 (bed height) 15cm까지 Capto MMC로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (column volume (CV))는 3ml였다.

버퍼

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.0.

실험 구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 그 뒤 출발물질을 1ml/분의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용하며 세척단계를 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 rhG-CSF를 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 표 4에서 표시된 바와 같이 rhG-CSF는 통과액 (flow through)에서 발견할 수 없었다. 용출 버퍼가 아르기닌을 포함하며 염화나트륨을 포함하지 않는 버퍼로 바꾸었고 pH가 4.0이었다. rhG-CSF는 용출 분획에서 발견할 수 없었다.

샘플	부피 ml	rhG - CSF ㎍/ ml	총 rhG - CSF ㎍	수율 %
출발 물질	9	69.4	625	100
통과액 및 평형화 세척	27	0	0	0
용출액	27	0	0	0

결론

pH의 변경 없이 0.5M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드 만을 버퍼에 첨가하는 것으로는 rhG-CSF를 Capto MMC 수지로부터 용출 시킬수 없다. 이는 세척 단계로 작용할 수 있다.

실시예 5 (실험 5)

출발물질

크로마토그래피 수지 및 컬럼

버퍼

용출 버퍼: 20mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 1M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.0.

실험 구성

컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 그 뒤 출발물질을 1ml/min의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척 단계를 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 rhG-CSF는 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 분석은 이러한 버퍼 조건에서 rhG-CSF가 Capto MMC 수지에 결합하였다는 것을 나타내었다. 표 5에서 표시된 바와 같이 통과액 (flow through)에서는 rhG-CSF를 발견할 수 없었다. 용출 버퍼가 아르기닌을 포함하며 염화 나트륨을 포함하지 않는 버퍼로 변했고 pH는 평형화 버퍼와 동일한 4.0이었다. 용출 분획에서 rhG-CSF를 발견할 수 없었다. 이것은 보다 높은 아르기닌 농도 (1 M)가 Capto MMC 컬럼으로부터의 rhG-CSF의 용출에 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 그러나 도 3에서 표시된 바와 같이 컬럼을 1M 아르기닌을 포함하는 pH 4의 용출 버퍼로 용출시킬 때에 피크를 얻을 수 있었다. 두번째의 큰 피크는 1 M NaOH 세척의 결과이다.

샘플	부피 ml	rhG - CSF ㎍/ ml	총 rhG - CSF ㎍	수율 %
출발 물질	9.04	79.98	723	100
통과액 및 평형화 세척	18	0	0	0
용출액	9	0	0	0

결론

pH의 변경 없이, 1M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 버퍼에 첨가하는 것만으로는 rhG-CSF를 Capto MMC 수지로부터 용출시킬 수 없다. 이는 세척 단계로 작용할 수 있다.

도 3의 도면의 설명

실험 5; pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)에서의 흡광도와 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 1 M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 4.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 이 용출로 이중 피크를 얻었다. 용출 분획에서 단일 피크를 얻었다. 큰 피크는 1 M NaOH 세척으로 얻었다.

실시예 6 (실험 6, 7, 8, 9, 10, 11)

출발 물질

정제된 rhG-CSF는 Capto MMC 컬럼에 로딩하기 전에, 총 단백질 농도를 낮추고 더 유용한 부피를 얻기 위하여 평형화 버퍼를 이용하여 희석시켰다. 또한 각 실험에서 요구되는 pH를 얻기 위함이다. 희석에 앞서, rhG-CSF를 20mM 아세트산 나트륨, 0.2M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 6.5에 용해시켰다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자의 포획단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. Tricorn 5/150 컬럼 (GE Healthcare)을 베드 높이 (bed height) 15cm까지 Capto MMC로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (column volume (CV))는 3ml였다.

버퍼

실험 6

평형화 버퍼: 20 mM 아세트산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.0

세척 버퍼: 20 mM NaAc, 1M NaCl, 0,02% 폴리소르베이트 80, pH 4,0

용출 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 7

평형화 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 5.0

용 출버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 8

평형화 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.0

실험 9

평형화 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.5

용출 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.1 M NaCl, 0.02 % 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 10

평형화 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 5.5

실험 11

평형화 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.0

실험 구성

각 실험을 아래와 같이 수행하였다. 사용될 평형화 버퍼를 이용하여 rhG-CSF을 약 20에 1로 희석시켰다. 출발 물질의 pH를 제어하고, 모든 실험에서 조절 없이 평형화 버퍼와 동일했다. 컬럼을 평형화 버퍼로 평형화시키고, 뒤이어 출발물질을 유속 1 ml/분으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척 단계를 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 실험 6에서는 용출 이전에 컬럼을 1M NaCl를 포함하는 버퍼로 세척하였다. 샘플을 채취하고 HPLC 방법을 이용하여 rhG-CSF를 분석하였다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, 실험 6에서는 1M NaCl 세척에서 피크를 얻을 수 없었으며, 이는 Capto MMC 컬럼으로부터 rhG-CSF가 세척에 의해 제거되지 않았음을 나타낸다. pH 4의 아세트산 나트륨 버퍼 또는 구연산 나트륨 버퍼를 사용하는 경우, Capto MMC 컬럼에서 G-CSF를 정제할 때에 독립적으로 동일한 용출 프로파일 (elution profile)을 얻었다 (실험 6 및 실험 11).

어느 수준의 rhG-CSF가 Capto MMC에 결합하는지 및 어느 수준의 수율이 얻어지는지를 나타내기 위한 분석의 결과가 표 6에 표시된다.

실험 번호 실험	로드 샘플의 pH	통과액에서의 G- CSF %	용출액에서의 G- CSF %	도
6	4.0	0	105	4
11	4.0	0	100	5
7	5.0	0	98	6
10	5.5	0	97	7
8	6.0	0	97	8
9	6.5	26.8	25.7	9

표 6의 데이터는 G-CSF가 통과액에서 손실 없이 Capto MMC 수지에 pH 4 내지 6에서 결합한다는 것을 보여준다. 그러나 출발물질이 pH 6.5인 경우에는, 검출된 G-CSF의 대부분을 통과액 분획에서 발견하였다.

Capto MMC 컬럼은 pH 7 이고 0.5 M의 아르기닌을 포함하는 버퍼로 용출시켰다. 물질이 pH 4 내지 6에서 컬럼으로 로딩되는 때 G-CSF 리커버리가 높았던 반면, pH 6.5가 출발물질에 사용되었을 때에는 용출액에서의 수율이 낮았다.

크로마토크램 (도 4, 5 및 6)에서, rhG-CSF가 pH4 4 내지 5의 버퍼에 존재하는 경우, 이는 Capto MMC 컬럼으로부터 이중 피크로 용출된다는 것이 확인된다. 그에 반하여, 출발물질의 pH가 5.5, 6.0 또는 6.5 (도 7, 8 및 9)인 경우에는 단일 피크를 얻었다. 은 염색 (silver stain)된 SDS PAGE (도 10a)에 나타난 바와 같이, 실험 8 (pH 6.0), 실험 9 (pH 6.5) 및 실험 10 (pH 5.5)의 용출액은 깨끗한 단일 밴드 (band)를 나타낸다. 그에 반하여 실험 6 (pH 4.0) 및 실험 7 (pH 5.0)의 용출액은 은 염색 (silver stain)된 SDS-PAGE에서 더 많은 밴드를 나타낸다.

결론

이 실험들의 결과는 pH 4.0, 5.0, 5.5, 6.0에서 rhG-CSF가 Capto MMC에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. pH 6.5에서 Capto MMC로의 rhG-CSF 결합은 덜 강하고, pH 4 내지 6인 경우와는 다르게 rhG-CSF가 통과액 분획에서 발견되었다.

용출 프로파일 (elution profile)은 pH 5.5 내지 6.5가 사용되었을 때 더 우수했고, 이러한 pH가 로딩 물질에 사용되었을 때 SDS-PAGE에서 산물이 더 우수해 보인다.

pH 6.5가 사용된 경우, Capto MMC 컬럼상에서 G-CSF의 유출 (leakage) 때문에, 바람직하게는 로딩 물질에서 pH 5.5내지 6.0이 이용된다.

결합된 물질은 모든 실험에서 pH 7로 용출하였으며, 0.5M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드가 용출 버퍼에 포함되어 있는 경우 피크는 더욱 집중되었다. 1M의 NaCl 세척은 G-CSF의 손실 없이 pH 4에서 수행할 수 있다.

도 4 내지 10에 대한 도면의 설명

도 4

실험 6; pH 4.0에서 아세트산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서 출발물질 중 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 용출액에 의해 이중 피크를 얻었다. 이중 피크는 하나의 분획으로부터 수집되었다.

도 5.

실험 11; pH 4.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 용출에 의해 이중 피크를 얻었다. 이중 피크는 하나의 분획으로 수집되었다.

도 6.

실험 7; pH 5.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼 에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 용출액에 의해 이중 피크를 었었다. 이중 피크는 하나의 분획으로 수집되었다.

도 7.

실험 10; pH 5.5에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 용출액에 의해 하나의 미세하게 불균일한 피크를 얻었다.

도 8.

실험 8; pH 6에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 하나의 집중된 균일한 피크를 얻었다.

도 9.

실험 9; pH 6.5에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼에서의 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 나타내었다. 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 하나의 집중된 균일한 피크를 얻었다.

도 10a 및 도 10b

실험 6, 7, 8, 9, 10; 각기 다른 pH 값을 출발물질에 사용한 Capto MMC 실험에서의 출발 및 용출액의 단백질의 분리. 샘플을 환원 (SDS 처리)시키고 10 % 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였다. 단백질을 은 염색 (silver staining)을 이용하여 시각화하였다.

실시예 7 (실험 12)

출발 물질

재조합 인간 G-SCF를 HEK 293 세포로부터 생산하였다. 세포를 제거하고 세포 불포함 상청액이 Capto MMC 컬럼에 로딩되는 출발물질이었다.

크로마토그래피 수지 및 컬럼

GE Healthcare의 혼합 모드 (mixed mode) 수지인 Capto MMC (cat no. 17-5317)를 rhG-CSF 분자의 포획 단계로 사용하였다. Capto MMC는 소수성, 호황성 상호작용 및 수소결합을 갖는 약한 양이온성 수지이다. XK16 컬럼 (GE Healthcare)를 베드 높이 (bed height) 13.5cm까지 Capto MMC 수지로 채웠다. Capto MMC의 컬럼 부피 (CV)는 27ml이었다.

버퍼

용출 버퍼: 20 mM 구연산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.5M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.0.

실험 구성

세포 불포함 상청액의 pH를 6.0으로 조절하였다. 컬럼을 평형화 버퍼를 이용하여 평형화시키고 그 뒤 pH를 조절한 출발 물질을 13.5ml/min의 유속으로 로딩시켰다. 그 뒤 평형화 버퍼를 이용한 세척 단계를 수행하고 용출 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 샘플을 채취하고 HPLC 방법으로 rhG- CSF를 분석하였다. 분석 결과로부터 이러한 버퍼 조건 하에서 컬럼으로 로딩된 모든 rhG-CSF는 Capto MMC 수지에 결합하였다는 것을 알 수 있었으며, 통과액 분획에서는 G-CSF가 발견되지 않았다. 용출 버퍼는 20mM NaCitrate, 0.5M 아르기닌, 0.1M NaCl 및 0.02% 폴리소르베이트 80를 포함하며 pH는 7.0이었다. Capto MMC 수지에 결합된 단백질의 용출은 하나의 주 피크와 작은 제2 피크를 초래했다. Capto MMC 컬럼에 로딩된 모든 G-CSF는 주 피크에서 발견되었으며 두번째 작은 제2 피크에서는 어떠한 G-CSF도 발견되지 않았다 (도 11).

결론

세포 불포함 배양 배지 중 재조합 인간 G-CSF는 pH 6.0에서 Capto MMC 수지에 결합했다. 통과액 분획물에서는 어떠한 G-CSF도 발견되지 않았다. 용출액 피크를 모으기 위하여 pH를 7로 변경하고 0.5 M의 아르기닌을 첨가하여 결합 물질을 Capto MMC 수지로부터 용출시켰다.

도 11의 도면의 설명

실험 12; pH 6.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 이용한 Capto MMC 컬럼으로부터 세포 불포함 상청액 중 G-CSF 정제의 크로마토그램. 측정된 280nm (mAU)에서의 흡광도 및 전도도 (mS/cm)를 도면에 표시하였다. 0.5 M 아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 포함하는 pH 7.0의 버퍼를 이용하여 컬럼을 용출시켰다. 이중 피크를 얻었으나 G-CSF는 주 피크에서만 발견되었다.

실시예 8

컬럼 및 수지

Tricorn 5/50 컬럼 (GE Healthcare)을 Capto MP 베이스 매트릭스 (base matrix)에 결합된 효모 유래 Fab 단편 기반 친화성 리간드로 채웠다. 베드 높이 (bed height)는 약 2cm였으며, 수지 부피는 약 0.4ml 였다. 친화성 수지 프로토타입 (prototype) (G-CSF8)은 BAC BV로부터 얻었다.

출발 물질

사용한 출발 물질은 HEK293F 세포로부터 생산한 G-CSF 함유 세포 상청액이었다.

버퍼 조성 요소:

버퍼 A (평형화 버퍼)

0.3M NaCl, 0.02M Na-citrat, 0.02% Tween 20, pH 6.0, +25℃에서 전도도 32 mS/cm.

버퍼 B (용출 버퍼 I)

0.3M NaCl, 0.02M Na-citrat, 0.02% Tween 20, pH 3.0, +25℃에서 전도도 32 mS/cm.

컬럼을 평형화 버퍼 A로 평형화시키고, 그 뒤 출발 물질을 로딩하였다. 그 뒤 수지를 평평화 버퍼 A로 세척하고 결합된 G-CSF를 용출 버퍼 B로 용출시켰다. 출발 물질 및 용출액에서의 G-CSF의 함유량을 분석하였다 (표 7).

G-CSF 친화성 수지 실험의 결과, pH 3에서의 용출.

샘플	부피 ( ml )	G- CSF (㎍/ ml )	총 G- CSF 양 (㎍)	수율 (%)
출발 물질(로드)	100	2	200	100
용출액 (버퍼 B)	1.5	111	170	83

도 12는 친화성 크로마토그래피 단계 이후의 용출액을 보여주고 있는 쿠마시 염색 (Coomassie stain) 된 SDS-PAGE를 나타낸다.

레인 샘플 ( Lane sample )

1 분자량 표준 (Molecular weight standard)

2 용출액 (실시예 8)

실시예 8의 결론

G-CSF의 용출에 낮은 pH 버퍼를 사용하는 경우 (pH 3) 탁월한 순도 및 회수율 (recovery)를 얻을 수 있었다.

실시예 9

컬럼과 수지

Tricorn 5/50 컬럼 (GE Healthcare)을 Capto MP 베이스 매트릭스 (base matrix)에 결합한 효모 유래 Fab 단편 기반 친화성 리간드로 채웠다. 베드 높이 (bed height)는 약 2cm이었으며, 수지 부피는 약 0.4ml 였다. 친화성 수지 프로토타입 (prototype) (G-CSF8)은 BAC BV로부터 얻었다.

출발 물질

사용한 출발 물질은 HEK293F 세포로부터 유래한 G-CSF 함유 세포 상청액이었다.

버퍼 구성 요소:

버퍼 A (평형화 버퍼)

0.3 M NaCl, 0.02 M Na-citrate, 0.02% Tween 20, pH 6.0, +25℃에서 전도도 32 mS/cm.

버퍼 C (용출 버퍼 II )

1.0 M NaCl, 0.02 M Na-citrate, 0.8M 아르기닌(Arg), 0.02% Tween 20, pH 6.0, +25℃에서 전도도 89 mS/cm.

평형화 및 용출 버퍼는 언급된 pH, 농도, 및 버퍼 타입, 염 또는 디터전트에 한정하지 않는다.

컬럼을 평형화 버퍼 A로 평형화시키고, 그 뒤 출발 물질을 로딩시켰다. 수지를 그 뒤 평형화 버퍼 A로 세척하고 결합한 G-CSF를 뒤이어 용출 버퍼 C로 용출시켰다. 출발 물질 및 용출액 중 G-CSF의 함유량을 분석하였다 (표 8).

G-CSF 친화성 수지 실험 결과, 아르기닌을 이용한 용출.

샘플	부피 (ml)	G-CSF (㎍/ml)	총 G-CSF양 (㎍)	수율 (%)
출발 물질 (로드)	100	2	200	100
용출액 (버퍼 C)	3.7	30	110	56

실시예 9의 결론

염화나트륨과 아르기닌의 혼합물을 이용하여 친화성 컬럼으로부터 G-CSF를 용출하는 것이 가능하다.

실시예 10

컬럼과 수지

Tricorn 5/50 컬럼 (GE Healthcare)을 Capto MP 베이스 매트릭스 (base matrix)에 결합한 효모 유래 Fab 단편 기반 친화성 리간드로 채웠다. 베드 높이 (bed height)는 약 2cm였으며, 수지 부피는 약 0.4ml 였다. 친화성 수지 프로토타입 (prototype) (G-CSF8)은 BAC BV로부터 얻었다.

출발 물질

사용한 출발 물질은 HEK293F 세포로부터 유래된 G-CSF를 함유 세포 상청액이었다.

버퍼 조성:

버퍼 A (평형화 버퍼)

0.3 M NaCl, 0.02M Na-citrat, 0.02% Tween 20, pH 6.0, +25℃에서의 전도도 32 mS/cm.

버퍼 D (용출 버퍼 III )

2.0 M MgCl₂, 0.02M Tris, 0.02% Tween 20, pH 7.5, +25℃에서의 전도도 144 mS/cm.

컬럼을 평형화 버퍼 A로 평형화시키고, 그 뒤 출발 물질을 로딩시켰다. 수지는 그 뒤 평형화 버퍼 A로 세척하고 결합한 G-CSF는 뒤이어 용출 버퍼 D로 용출시켰다. 출발 물질 및 용출액 중 G-CSF의 함유량을 분석하였다 (표 9).

G-CSF 친화성 수지 실험의 결과, MgCl₂를 이용한 용출.

샘플	부피 ( ml )	G- CSF (㎍/ ml )	G- CSF 총량 (㎍)	수율 (%)
출발 물질 (로드)	100	12	1200	100
용출액 (버퍼 B)	2.5	390	970	81

실시예 10의 결론

2M의 MgCl₂를 용출제로 이용하여 G-CSF를 친화성 컬럼으로부터 용출하는 것이 가능하다.

실시예 11

컬럼 및 수지

Tricorn 5/50 컬럼 (GE Healthcare)을 Capto MP 베이스 매트릭스 (base matrix)에 결합된, 3 종의 상이한 효모 유래 Fab 단편 기반 친화성 리간드 프로토타입 (prototype)으로 채웠다. 베드 높이 (bed height)는 약 2cm였으며, 수지 부피는 약 0.4ml 였다. 친화성 수지 프로토타입 (prototype) (G-CSF2, G-CSF3 및 G-CSF6)은 BAC BV로부터 얻었다.

출발 물질

사용한 출발 물질은 HEK293F 세포로부터 유래된 G-CSF 함유 세포 상청액이었다.

버퍼 조성:

버퍼 A (평형화 버퍼)

0.3 M NaCl, 0.02 M Na-citrat, 0.02% Tween 20, pH 6.0, +25℃에서의 전도도 32 mS/cm.

버퍼 B (용출 버퍼 I)

0.3 M NaCl, 0.02 M Na-citrat, 0.02% Tween 20, pH 3.0, +25℃에서의 전도도 32 mS/cm.

컬럼을 평형화 버퍼 A로 평형화시킨 뒤 출발물질을 로딩하였다. 그 뒤 수지는 평형화 버퍼 A로 세척하고, 결합한 G-CSF는 뒤이어 용출 버퍼 B로 용출시켰다. 출발 물질, 통과액 분획 및 용출액 중 G-CSF의 함량을 분석하였다 (표 10).

G-CSF 친화성 수지 실험의 결과, 상이한 친화성 리간드 프로토타입 (prototype)의 테스트, pH 3에서의 용출.

샘플	부피 ( ml )	G- CSF (㎍/ ml )	G- CSF 총량 (㎍)	수율 (%)
리간드 G- CSF2
출발 물질(load)	100	10	1100	100
통과액 분획	112.5	4	500	45
용출액 (버퍼 B)	2	290	570	57
리간드 G- CSF3
출발 물질 (load)	100	11	1100	100
통과액 분획	112.5	0	0	0
용출액 (버퍼 B)	2	510	1020	93
리간드 G- CSF6
출발 물질 (load)	100	12	1200	100
통과액 분획	112.5	2	200	19
용출액 (버퍼 B)	1.5	450	670	56

도 13은 출발 물질, 친화성 크로마토그래피를 수행한 뒤의 통과액 및 용축액을 나타내는 은 염색 ( silver staining)한 SDS - PAGE 를 보여준다.

기호:

레인 ( lane ) 샘플

1 G-CSF2 출발; 2 G-CSF2 통과액; 3 블랭크 (Blank); 4 G-CSF2 용출; 5. 블랭크; 6 G-CSF3 통과액; 7 블랭크 ; 8 G-CSF3 용출액; 9. 블랭크; 10 G-CSF6 통과액; 11 블랭크 12 G-CSF6 용출액

실시예 11의 결론

통과액 중 G-CSF의 검출 및 낮은 pH를 용출제로 이용한 용출액 분획에서의 상이한 회수율 (recovery)에 의해 나타난 바와 같이 상이한 친화성 리간드 프로토타입 (prototype)은 G-CSF의 상이한 결합능력을 제공한다. 그러나 도 13에서 나타난 바와 같이, 모든 친화성 리간드는 용출액에서 동일하게 탁월한 순도 프로파일을 제공한다.

Claims

과립세포 콜로니 자극인자 (Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF)를 G-CSF를 포함하는 혼합물로부터 크로마토그래피를 이용한 정제순서 (purification sequence)로 정제하는 방법으로서,
- 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 (2-(benzoylamino) butanoic acid) 리간드를 포함하는 다중 모드 수지를 이용한 하나 이상의 크로마토그래피가 수행되고,
- pH 4 내지 6에서 G-CSF가 상기 다중 모드 수지에 결합되며,
- pH 5.5 내지 6.5에서 G-CSF가 용출되며; 및 상기 용출은 0.1M 내지 2.0M 범위의 농도를 가지는 아르기닌(arginine)과 함께 수행되는 것이고,
- 상기 하나 이상의 크로마토그래피는 G-CSF에 대한 효모 유래 F_ab단편을 사용하는 효모 유래 친화성 리간드 크로마토그래피 단계와 조합되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 모드 수지는 매트릭스에 결합된 모이어티를 포함하고 상기 모이어티는 이온 상호작용, 및 수소결합 및 소수성 상호작용과 같은 상호작용에 의하여 혼합물 내의 G-CSF와 상호작용할 수 있는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 G-CSF를 포함하는 혼합물은 용액인 것인 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G-CSF는 재조합 G-CSF인 것인 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 결합, 용출 또는 결합 및 용출은 구연산 나트륨 (sodium citrate), 아세트산 나트륨 (sodium acetate), HEPES 또는 이들의 조합을 포함하는 버퍼 물질에서 수행되고, 상기 버퍼 물질은 구연산 나트륨, 히스티딘, 2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피테라지닐)-에탄 설폰산 (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethane sulfonic acid, HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄 설폰산 (2-(N-Morpholino)ethane sulfonic acid (MES), 트리스 (Tris) 염기 및 아세트산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 결합, 용출 또는 결합 및 용출은 비이온성 디터전트 (non-ionic detergent)를 포함하는 버퍼 물질 중에 수행되고, 상기 비이온성 디터전트는 폴리소르베이트 및 플루로닉 (Pluronic) F68로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
삭제
청구항 1에 있어서, G-CSF의 용출 전에 pH 4.0 내지 6.0의 범위에서 0.1 M 내지 2 M의 염화나트륨 또는 0.1 M 내지 2 M의 아르기닌 모노 하이드로클로라이드로 이루어진 버퍼가 세척-단계에서 사용되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, G-CSF가 용출되기 전에, 세척 버퍼가 상기 다중 모드 수지에 적용되어 오염물질을 제거하고 G-CSF를 유지시키며, 상기 세척 버퍼는 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산 또는 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)에 따라 선택된 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기의 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a. 양전하를 띤 N-벤질-N-메틸 에탄올아민 (N-Benzyl-N-methyl ethanolamine) 리간드,
b. 음전하를 띤 2-(벤조일아미노) 부탄산 (2-(benzoylamino) butanoic acid) 리간드,
c. 페닐프로필 (phenylpropyl) 리간드,
d. N-헥실 (N-hexyl) 리간드,
e. 4-머캅토-에틸-피리딘 (4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 리간드,
f. 3-((3-메틸-5-((테트라히드로퓨란-2-일메틸)-아미노)-페닐)-아미노)-벤조산 리간드 (3-((3-methyl-5-((tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-amino)-phenyl)-amino)-benzoic acid) 또는 이들의 조합.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기 상업적으로 입수 가능한 수지 HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
- Capto MMC와 같은 양이온 다중모드 수지;
- 외피 (enveloped) 바이러스에 대한 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계로, 트리-n-부틸 포스페이트 (tri-n- butyl phosphate) 및 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 이용한 용매 또는 디터전트-불활성화 단계;
- 효모에서 발현된 리간드에 기초한 친화성 수지;
- SP Sepharose 또는 Resource S와 같은 양이온 교환기;
- 플라노바 20N (Planova 20N)과 같은 20nm의 평균 공극 크기를 이용한 병원체 여과 제거 단계;
- 개략적 컷오프 (cut off)가 1 내지 5 kDa인 초미세여과 (ultra filtration)와 같은 버퍼 교환 및/또는 농축 단계; 또는
- Superdex 75와 같은 크기 배제 크로마토그래피.
청구항 16에 있어서, 상기 다중 모드 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 단계와 조합되고, 상기 친화성은 효모에서 발현된 단백질에 기초한 리간드로부터 제공되고, 친화성 크로마토그래피 수지로부터 결과적으로 수득된 산물의 순도가 90%보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 17에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (immobilized metal affinity chromatography)로부터 선택된 추가적인 크로마토그래피가 수행되며, 최종 산물의 순도는 99% 보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 정제 순서는 화학적 불활성화 (chemically based inactivation) 단계, 크기 기반 제거 단계, 크로마토그래피 단계 또는 이들의 조합을 포함하는 병원체 제거 또는 불활성 단계를 추가로 포함하고, 상기 단계들은 제거대상 병원체에 대한 상이한 생리학적 특성에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 비이온성 디터전트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.