JP2016190856A - 成長因子タンパク質の精製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】先行技術の成長因子タンパク質の精製方法の欠点を、回避する新規の方法の提供。
【解決手段】クロマトグラフィーを用いてＧ−ＣＳＦを精製する方法であって、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程がマルチモーダルレジンを用いて実行されること、４〜６．２の間のｐＨで成長因子タンパク質が負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンドを含むマルチモーダルレジンに結合し、成長因子タンパク質が６．３より高いｐＨで溶出し、そして、成長因子タンパク質の溶出は溶出緩衝液への０．１〜２．０Ｍのアルギニン、及び／又は、塩化ナトリウムの添加により改善され、マルチモーダルレジン工程に引き続いて、酵母由来アフィニティーリガンドレジン工程が実行され、その結果、９０％より高い純度の産物が生じるクロマトグラフィーを用いる、一連の精製で成長因子タンパク質を精製する方法。
【選択図】なし

Description

本発明はクロマトグラフィーを用いる成長因子タンパク質の精製方法に関する。
目的のタンパク質はしばしば微量に存在するのみであり、および、その他の生体高分子、例えば、脂質、タンパク質、または、細胞断片ですら付随するので、天然原料からのタンパク質の精製は挑戦である。さらに、目的のタンパク質は、たいてい、その精製の工程段階の間にしばしば失われる生物学的機能と関係する。
タンパク質のような生体高分子の精製方法の蓄積は大きいものである。沈殿法の他にも、多様な物質に基づくクロマトグラフィー法が知られている。しばしば、その物質は有機性イオン、プロトン化アミンのような陽イオン、または、部分的に、もしくは、完全にアルキル化されたアミンのような化学的部分で修飾される。そのような物質は陰イオン交換体として用いられる。しかし、形状、分子量、および、特に電荷のような目的のタンパク質の物理的特性に応じて、精製方法に陽イオン交換体を用いることもできる。アフィニティークロマトグラフィーが代わりに、または、組み合わせて用いられる。
タンパク質の樹脂への結合は比較的低塩濃度（電気伝導率、浸透圧など）の範囲で、典型的には０．０１〜０．１５Ｍの（塩化ナトリウムなどの）塩濃度の範囲で行われることができるのみであるということが従前のイオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、ＳＰ−、ＣＭ−、Ｑ−、または、ＤＥＡＥセファロースＦＦイオン交換クロマトグラフィー樹脂）の一つの欠点であることが先行技術において知られている。ある用途では、そのタンパク質に対して比較的穏やかな精製条件でイオン交換クロマトグラフィー工程を用いられるようにする必要があるであろう。また、やや上昇したイオン強度で直接（さらに希釈することなく）クロマトグラフィー樹脂に用いることができるようにする必要もあるであろう。上昇したイオン強度はタンパク質溶液中で、特に、目的タンパク質に悪影響を与える可能性がある潜在的なプロテアーゼが溶液中に存在する、組換え技術で作製されたタンパク質産物の回収物、または、血漿由来産物のような粗タンパク質調製物中でタンパク質の安定性にとってかなり有利である可能性がある。プロテアーゼはしばしば（大半の細胞系の場合のように）生理的条件、すなわち、約７のｐＨと約０．１５Ｍの塩濃度でよく働くからである。
ワークアップ条件を変えれば、例えば、塩を加えれば、および／または、ｐＨを変えればプロテアーゼは阻害され得るであろう。しかしながら、これらのパラメータは両方とも従来のイオンクロマトグラフィー工程にとって重要であり、したがって、それらを組み合わせて使用することはしばしば不可能である。プロテアーゼの作用を最小化する条件を用いることができる精製方法を提供する必要がある。
国際公開第ＷＯ−Ａ２−２００８／０７３６２０号は、バキュロウィルス発現システムを用いて昆虫細胞で産生されるポリペプチドの製造方法を開示する。ある実施例において、感染の直前に（例えば、感染の１時間前に）昆虫細胞培養物に脂質混合物が添加される。精製工程の初期に陰イオン交換クロマトグラフィー、または、混合モードクロマトグラフィーを用いる方法で昆虫細胞培養物からポリペプチドが単離される。この工程段階は昆虫細胞由来エンドグリカナーゼ、および、プロテアーゼを除去するのに有用であり、したがって、酵素的分解による所望のポリペプチドの喪失を低減する。別の実施例では、昆虫細胞培養液の迅速な処理、および、前記ポリペプチドの捕捉を可能にするために、混合モードクロマトグラフィーは連続流動法で色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーと組み合わされる。さらに別の実施例では、エンドグリカナーゼ活性、および、タンパク質分解性活性を本質的に持たないポリペプチド溶液を産出する単一ユニットオペレーション中に、中空繊維フィルター、混合モードクロマトグラフィー、および、色素リガンド親和性を組み合わせる方法を用いてポリペプチドが昆虫細胞培養液から単離される。さらなる実施例において、単離されたポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼと修飾型ヌクレオチド糖を用いて高分子（例えば、ＰＥＧ）のような修飾基に任意に結合された昆虫特異的グリコシル化パターンを有する糖ペプチドである。
国際公開第ＷＯ−Ａ２−２００９／０６３０６９号は、限定的ではないが特に、ペプチド溶液からエンドトキシンを除去する方法、前記方法のための試薬を含むキット、および、前記方法で得られた精製ペプチドに関するペプチドの精製方法を開示する。
ダサリ ベンカタ クリシュナ ラオ（Ｄａｓａｒｉ Ｖｅｎｋａｔａ Ｋｒｉｓｈｎａ Ｒａｏ）らはｒｈＧ−ＣＳＦ（組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子）の収量を改善するために開発された工程制御戦略を用いる精製方法を開示する。この研究で９９％以上の純度と２．１８ｇ／ｌの全収率が達成された。精製中の産物の分析により、界面活性剤が核酸を除去することなく７２％のＬＰＳ（リポポリサッカライド）と９８％のＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）を除去することが示された。システインの濃度はタンパク質の再折りたたみで重要なパラメータであった。ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）カラムのベッド高とＨＥＴＰ（理論段相当高さ）値が評価され、分離能に対するその影響が検討された。時間と処理費用を節約するとともに製品の収量を増加させるために、ＳＥＣ中の処方が重要であることが明らかになった。
クゥアン バイ（Ｑｕａｎ Ｂａｉ）らにより、大腸菌で発現された組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）の強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）による再生と精製が研究されている。ＳＡＸによるｒｈＧＭ−ＣＳＦの再生と精製に対する移動相中のｐＨ値、ＧＳＨとＧＳＳＧの濃度の比率、および、尿素濃度の影響がそれぞれ研究された。上述の３つの要素がｒｈＧＭ−ＣＳＦの再生の効率と大量回収に顕著な影響を与えることがその結果により示されている。移動相中へのＧＳＨとＧＳＳＧの添加によってｒｈＧＭ−ＣＳＦにおける正しいジスルフィド結合の形成を改善することができ、その結果、その再生収率が上昇する。さらに、ＳＡＸによるｒｈＧＭ−ＣＳＦの大量回収を向上するために、低濃度の尿素を移動相に加えて変性したタンパク質の凝集を防いだ。至適条件のもと、ｒｈＧＭ−ＣＳＦはたった１工程により３０分以内にＳＡＸカラムで精製と同時に再生された。
シェリー Ａ．ピサロ（Ｓｈｅｌｌｙ Ａ．Ｐｉｚａｒｒｏ）は血管新生と血管透過性をインビボで誘導する潜在的な有糸分裂促進因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ１６５）について報告している。そして、Ｓｈｅｌｌｙ Ａ．Ｐｉｚａｒｒｏは治療上の応用の可能性を創傷治癒促進に示してきた。この報告に記述される方法は、１リッターのブロス当たり約９ｇのｒｈＶＥＧＦを産生することができる細菌発現系、タンパク質の再折りたたみである下流精製方法、および、医薬物質の形成の前の３つのクロマトグラフィー工程を伴う。周辺質封入体中にｒｈＶＥＧＦを産生するために、高細胞密度（ＨＣＤ）半回分発酵法を用いた。封入体が細胞溶解液から回収され、ｒｈＶＥＧＦの精製のために１段階タンパク質可溶化再折りたたみ操作されてｒｈＶＥＧＦが抽出される。タンパク質の再折りたたみとクロマトグラフィーを含む精製の進行の間に見られた回収率の総計は３０±６％であった。実験室規模生産とプロセスロバスト性を示す大規模生産の両方で、目標水準の下にまで宿主細胞の不純物は一貫して取り除かれる。再度折りたたまれ、精製されたｒｈＶＥＧＦの構造は、マススペクトロメトリー、Ｎ末端シークエンシングおよびトリプシン分解ペプチドマッピングにより確認され、変異型産物が多重ＨＰＬＣアッセイにより分析された。
キンバリー Ａ．カレアス（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ａ．Ｋａｌｅａｓ）は、混合モードクロマトグラフィー樹脂は難しい原料に向いた精製手段として普及してきていることを開示し、そして、アルカリ性原料から組換えヒト血管内皮成長因子（ｒｈＶＥＧＦ）をカプトＭＭＣに選択的に捕捉する工業用途の開発を開示する。カプトＭＭＣ樹脂はタンパク質とのイオン性相互作用、疎水性相互作用、および、水素結合相互作用に関与する潜在能力を持ち、および、高架橋アガロースベースのマトリックスに結合するリガンドを含む。ＶＥＧＦは血管新生に関与する重要な成長因子であり、創傷治癒のための治療上の用途を有する。ＶＥＧＦは封入体として大腸菌で発現される。細胞溶解液から固形物が回収され、尿素と酸化還元剤の存在下、ｐＨ９．８でｒｈＶＥＧＦが可溶化され、再び折りたたまれる。カプトＭＭＣの独特の混合モード特性が最小ロード条件でこの塩基性タンパク質を捕捉することを可能にし、９５％より高い収率で下流工程に濃縮された蓄積物を供給しつつ、宿主細胞タンパク質の含量を１．２％より下にまで低減させる。この研究はロード条件と滞留時間の動的結合能に対する影響、ならびに、最適な精製成績のための溶出条件の開発を調査する研究である。様々な溶出緩衝液を評価した後、Ｌ−アルギニン塩酸が樹脂とｒｈＶＥＧＦの間の多重相互作用を破壊するのに成功したので、Ｌ−アルギニン塩酸がカプトＭＭＣ混合モード樹脂からのｒｈＶＥＧＦの解離に効果的な溶出剤であることが示された。研究室レベルでの努力が、商業生産規模で成功裏に実施されるロバストなクロマトグラフィー工程を生み出した。
本発明は、先行技術の成長因子タンパク質の精製方法の欠点を、新規の方法を提供することによって回避することを１つの目的とした。
本発明によれば、以下の方法により目的が達成される。
−少なくとも１つのクロマトグラフィーがマルチモーダル樹脂を用いて実行され、
−成長因子タンパク質が４〜６．２の間のｐＨでマルチモーダル樹脂に結合する、および、
−成長因子タンパク質が６．３より高いｐＨでマルチモーダル樹脂から溶出している、
クロマトグラフィーを用いる一連の精製において、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）または顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、肝細胞増殖因子、上皮成長因子、および、線維芽細胞成長因子（酸）からなる群より選択される成長因子タンパク質を精製する方法。
本発明は、有利にプロテアーゼの作用を最小にすることができる方法を提供する。目的タンパク質を分解することができるであろう潜在的なプロテアーゼを含む粗タンパク質試料に塩を加えること、および／または、ｐＨを変えることを可能にし、さらに手段をとることなくそのタンパク質溶液を処理し、その目的タンパク質を混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させることを可能にし、そうして粗試料中の目的タンパク質の濃縮と精製に最適な工程を提供し、精製中のプロテアーゼ、および／または、ＤＮＡ含量の低減によって、目的タンパク質に対する特異的なアフィニティークロマトグラフィー工程を用いるさらなる下流の精製に適したものとすること。これは、精製中の目的タンパク質の分解を避けるために特に重要であり、粗タンパク質溶液での捕捉工程としてのマルチモーダルクロマトグラフィーの組合せを作り出す。
ある実施形態において、マルチモーダル樹脂に基づくクロマトグラフィーは、酵母由来アフィニティーリガンドクロマトグラフィー工程と組み合わされる。その酵母由来アフィニティーリガンドを用いるクロマトグラフィー工程は、高収率での目的タンパク質の精製と分子の完全性の維持（分解など）に特に適している。
成長因子タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）である。これは幹細胞からの造血細胞の増殖と分化に関与する造血制御性糖タンパク質のメンバーである。成長因子タンパク質は、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、肝細胞増殖因子、上皮成長因子、および、線維芽細胞成長因子（酸）である。成長因子タンパク質はすべて６以下のＩＰを示す。本発明のさらなる実施形態において、前記マルチモーダル樹脂はマトリックスに結合する部分を含み、その部分はイオン性相互作用、ならびに、水素結合、疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用のようなその他の種類の相互作用により、混合物中で前記成長因子タンパク質と相互作用することができる。
本発明のさらなる実施形態において、前記アフィニティーリガンドは前記成長因子タンパク質に対する酵母に由来するＦａｂ断片である。
本発明のさらなる実施形態においては、粗タンパク質溶液から前記成長因子タンパク質を捕捉するためにマルチモーダル樹脂工程が実行され、その後、得られたマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂の溶出液を酵母由来アフィニティーリガンドクロマトグラフィー工程のために処理する。アフィニティークロマトグラフィー工程から成長因子タンパク質を溶出した後にタンパク質とＤＮＡに関して９０％を超える純度が得られる。
本発明の別のさらなる実施形態において、マルチモーダル樹脂工程と酵母由来アフィニティーリガンドクロマトグラフィー工程は、その他のクロマトグラフィー精製工程と組み合わされ、最終成長因子タンパク質産物において９９％より高い純度が得られる。
本発明のさらに別の実施形態において、成長因子タンパク質を含む混合物は溶液である。
本発明のさらに別の実施形態において、成長因子タンパク質は組換え成長因子タンパク質である。
本発明のさらに別の実施形態において、成長因子タンパク質は、産物を分解することができるプロテアーゼを潜在的に含む粗タンパク質溶液である。
別の実施形態において、前記成長因子タンパク質はｐＨ６．３より高いｐＨへの変化によって溶出する。
本発明のさらなる実施形態においては、塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／または、高イオン強度を含む溶出剤を用いて溶出が行われる。代わりに、または、組み合わせて、ｐＨを変えることにより溶出を実行することもできる。ｐＨの変化は溶出緩衝液のｐＨを、例えば、水酸化ナトリウム、または、酢酸で所望のｐＨに調節することにより行われ、その後、緩衝液をマルチモーダル樹脂にする。イオン強度の調整は、マルチモーダル樹脂にアプライする前に、塩、例えば、ホフマイスターシリーズに含まれる塩、例えば塩化ナトリウムと塩化カリウム、を溶出緩衝組成物に加えることにより行われ得る。
本発明によれば、溶出剤の濃度は特に約０．１Ｍ〜約２Ｍまでの範囲である。
本発明の別の実施形態によれば、成長因子タンパク質は約ｐＨ６．０でマルチモーダル樹脂に結合し、一方、成長因子タンパク質はｐＨ６．５以上で、特に約ｐＨ７．０で前記マルチモーダル樹脂から溶出する。
本発明のさらなる実施形態において、特に約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲で、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス塩基、および、酢酸ナトリウムからなる群より選択される物質のうちの少なくとも１つを好ましくは含む緩衝物質が用いられる。
本発明の方法では、使用する緩衝液のいずれにも１つの非イオン性界面活性剤が存在することができ、非イオン性界面活性剤はポリソルベート類（ポリソルベート２０、４０、６０、８０）およびプルロニックＦ６８からなる群より特に選択される。
本発明の方法のさらなる実施形態において、アルギニン、リジン、および、ヒスチジンを含む塩基性側鎖を有するアミノ酸の群よりアミノ酸を選択することができる。有機塩は塩化カリウム、および、塩化ナトリウムからなる群より選択することができる。
本発明の別の実施形態において、洗浄工程は、マルチモーダル樹脂から成長因子タンパク質を溶出する前に、約ｐＨ４〜約ｐＨ６の範囲のｐＨで行われ、洗浄緩衝液が塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／または、高イオン強度を含む洗浄剤を含むことを特徴とする。イオン強度の調整は、マルチモーダル樹脂にアプライする前に洗浄緩衝液組成物に塩、例えば、ホフマイスターシリーズに含まれる塩、例えば塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、を加えることで行うことができる。
本発明によれば、洗浄剤の濃度は特に約０．１Ｍ〜約２Ｍまでの範囲である。
成長因子タンパク質が解離される前に、夾雑物（プロテアーゼ、ＤＮＡなど）を洗い流し、成長因子タンパク質を保持するために、洗浄緩衝液をマルチモーダル樹脂にアプライすることは有利である可能性がある。
特に、ｐＨ６〜８で正に荷電するアミノ酸が、２Ｍまでの濃度でｐＨが６．３より低い洗浄緩衝液中に存在する。アルギニンの量は洗浄緩衝液において０．１〜１．０Ｍの範囲、特に０．５Ｍであるのが典型的である。
ｐＨが６．３より高い溶出緩衝液において、アルギニンの量は０．１〜２Ｍの範囲、特に０．５Ｍであるのが典型的である。
ｐＨが６．３以上の溶出緩衝液において、塩化ナトリウムは０．１〜２．０Ｍの範囲、特に０．１〜１Ｍの範囲で含まれる。
ｐＨが６．３より低い洗浄緩衝液において、塩化ナトリウムは０．１〜２．０Ｍの範囲、特に０．１〜１Ｍの範囲で含まれる。
非イオン性界面活性剤の量は０．００１〜１％の範囲、特にマルチモーダルクロマトグラフィー用の緩衝液では０．０２％であるのが典型的である。
本発明に従って用いられ得る前記マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は次の成分の少なくとも１つ、または、これらの組合せを含むことができる。
ａ．正に荷電したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、
ｂ．負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンド、
ｃ．フェニルプロピルリガンド、
ｄ．Ｎ−ヘキシルリガンド、
ｅ．４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、
ｆ．３−（（３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−アミノ）−フェニル）−アミノ）−安息香酸リガンド、
特に、本発明に従って用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は次の市販の樹脂、ＨＥＰハイパーセル（商標）、ＰＰＡハイパーセル（商標）、カプトアドヒア（商標）、カプトＭＭＣ（商標）、ＭＥＰハイパーセル（商標）から選択される。
本発明の別の実施形態においては、一連の精製は、化学作用に基づく不活化工程、サイズに基づく除去工程、クロマトグラフィー工程、または、これらの組合せを含む、除去される病原体に対する様々な生理的特性に基づく病原体除去／不活化工程をさらに含んでいてもよい。
特定の実施形態においては、本発明の方法である一連の精製は次の工程をさらに含む：
１．カプトＭＭＣのような陽イオン交換マルチモーダル樹脂、
２．エンベロープウィルス向けの化学作用に基づく不活化工程、特に欧州特許第ＥＰ−Ａ−１３１ ７４０号で開示されるトリ−ｎ−ブチルリン酸とトライトンＸ−１００を用いる溶媒／界面活性剤不活化工程、
３．酵母で発現されたリガンドに基づくアフィニティー樹脂、
４．ＳＰセファロース、または、リソースＳのような陽イオン交換体、
５．プラノバ２０Ｎのような約２０ｎｍの平均孔径を用いる病原体濾過除去工程、
６．約１〜５ｋＤａの分子量カットオフを有する限外濾過のような緩衝液交換、および／または、濃縮工程、
７．スーパーデックス７５のようなサイズ排除クロマトグラフィー樹脂。
図１は、酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図２は、酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図３は、酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図４は、酢酸ナトリウム緩衝液を用いた出発物質のｐＨ４．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図５は、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図６は、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ５．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図７は、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ５．５におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図８は、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．０におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図９は、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．５におけるカプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図１０ａと図１０ｂは銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、出発物質とカプトＭＭＣからの溶出液中のタンパク質の分離を示す。 図１１は、無細胞上清からのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラムを示す。 図１２は、アフィニティークロマトグラフィー工程の後の溶出液を表すクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 図１３は、出発物質、通過画分、および、アフィニティークロマトグラフィー工程の後の溶出液を表す銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
本発明は、Ｇ−ＣＳＦの精製により例証された次の非限定的な実施例によってさらに説明される。
分析方法の説明
Ｇ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡによるＧ−ＣＳＦ含量の測定
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の原理は、あるタンパク質（抗原）に対する抗体の特異的な結合によるタンパク質の定量である。Ｇ−ＣＳＦデュオセットＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＤＹ２１４）に基づき、サンドウィッチＥＬＩＳＡを用いてＧ−ＣＳＦの定量を行った。校正標準として大腸菌由来組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２１４−ＣＳ−００５、０．０１５〜１ｎｇ／ｍｌ）を適用した。捕捉抗体（マウス抗ヒトＧ−ＣＳＦ）を９６穴マイクロタイタープレートのウェルに結合した。Ｇ−ＣＳＦ抗原の捕捉と洗浄工程の後、ビオチン化検出抗体（ヤギ抗ヒトＧ−ＣＳＦ）がＧ−ＣＳＦ抗原に結合された。二回目の洗浄工程の後、ビオチン化検出抗体に結合するストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）がアプライされた。定量のために過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えられ、青色が発色する。硫酸で反応を止めた後、安定的な黄色色素が発色する。黄色色素の濃度は結合したペルオキシダーゼの量に比例し、したがって、Ｇ−ＣＳＦ抗原の量に比例する。４５０ｎｍの波長で、測光法で前記色素の濃度を測定する。０．９９より大きい線形相関係数（ｒ）を常に与える組換えヒトＧ−ＣＳＦ検量線から、未知試料のＧ−ＣＳＦ濃度を計算した。
逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによるＧ−ＣＳＦ含有量の測定
ＲＰ−ＨＰＬＣはタンパク質の極性に基づくそれらの分離に関係し、そのタンパク質分子の滞留は溶質分子の非極性部分とＨＰＬＣカラムの非極性固定相の間の疎水性相互作用によって左右される。紫外線検出器とジュピターＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社、カタログ番号００Ｆ−４０５３−ＥＯ）を装備したＨＰＬＣシステム（ダイオネクス社、アルティメット（Ｕｌｔｉｍａｔｅ）３０００）をタンパク質の測定に用いた。２０±５℃で運転して、前記カラムを０．１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液（移動相Ａ）で平衡化した。溶出のために、１．０ｍｌ／分の流速による線形濃度勾配（０〜５分、５％Ｂ；５〜１２分、５５％Ｂ；１２〜１７分、１００％Ｂ；１７〜２２分、５％Ｂ）で０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液（移動相Ｂ）を用いた。全注入体積の最大１００μＬにおいて、試料のロードは１回の注入につき３０μｇとした。２１４ｎｍでの紫外線吸収を測定して検出を行った。ヨーロッパ薬局方に基づく２．５〜４０μｇ（２．５、５、１０、２０、４０μｇ）のフィルグラスチムＣＲＳを検量線に用いた。フィルグラスチムＣＲＳ標準品は０．４ｍｇ／ｍｌの濃度にまで実験室用の水（ＷＦＬ）に前希釈された。必要に応じて、試料のＷＦＬでの前希釈は、３０μｇの注入量となるように行った。０．９９より大きい線形相関係数（ｒ）を常に与えるフィルグラスチムＣＲＳ検量線から未知試料のＧ−ＣＳＦ含量を計算した。
逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによる純度の測定
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度の測定に用いられる方法と機器はＧ−ＣＳＦ含量の測定のための方法と同等である。全ピーク面積に対するＧ−ＣＳＦのピーク面積の割合を決めることでＧ−ＣＳＦ含有溶液の純度［％］を計算した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度の測定、および、分子量分布
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タンパク質のサイズに基づく分離に関する。還元条件下でＧ−ＣＳＦ含有試料の純度の測定と分子量分布の分析を行った。この目的のために、トリス‐トリシン濃度勾配ゲル（１０〜２０％、アナメド（Ａｎａｍｅｄ）社より、カタログ番号ＴＲ１２０１２）およびトリス塩酸濃度勾配ゲル（１０〜２０％、バイオラッド社より、カタログ番号３４５−００４３）を使用した。トリス‐トリシン濃度勾配ゲルには、バイオラッド社のポリペプチドＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量標準品（カタログ番号１６１−０３２６、１．４〜２６．６ｋＤａ）を分子量標準品としてアプライした。トリス塩酸濃度勾配ゲルには、バイオラッド社のプレシジョンプラスタンパク質オールブルー標準品（カタログ番号１６１−０３７３、１０〜２５０ｋＤａ）をアプライした。電気泳動により分離したタンパク質のバンドは銀染色、または、クマシー染色で可視化される。大腸菌由来組換えヒトＧ−ＣＳＦ（非グリコシル化、Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２１４−ＣＳ−００５）、ＣＨＯ由来グリコシル化市販品グラノサイト（中外製薬）をＧ−ＣＳＦ基準品（対照試料）として用いた。標準品、基準品（対照試料）、および、分析試料の出現を判断して質量と純度の評価が視覚的に行われる。
組換えＧ−ＣＳＦ
Ｇ−ＣＳＦ含有細胞懸濁液の製造と精製
細胞
使用された細胞株はヒト胚性腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）の無血清増殖に順化した派生株である。Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡコード配列を持つ発現カセットでこの宿主、ＨＥＫ２９３Ｆを安定的に形質移入した。そのカセットのために強力なプロモーターを用いた。一般的な方法はまた欧州特許第ＥＰ １７３９１７９号（Ｓｃｈｒoｄｅｒら）にも記載される。
培養方法
前記細胞を無血清培地中で一般的な設備を用い、当該技術分野で周知の方法に従って培養した。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪用フラスコ、および、バイオリアクター（使い捨てのシステム、および、従来の撹拌タンク）内での振盪培養、または、撹拌培養が、回分培養、半回分培養、灌流培養、または、連続ケモスタット培養として実行される（フレシュニー，ＲＩ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＲＩ）著（２０００年）動物細胞の培養：基礎技術の手引き 第４版、ワイリー‐リス社；シュパイアー，ＲＥ（Ｓｐｉｅｒ，ＲＥ）編（２０００年）、細胞工学百科事典、ワイリー社、ニューヨーク；エンフォース，Ｓ−Ｏ（Ｅｎｆｏｒｓ，Ｓ−Ｏ）およびヘッグストレーム，Ｌ（Ｈaｇｇｓｔｒoｍ，Ｌ）著（２０００年）、バイオプロセス技術：原理と応用、大学出版会（Ｈoｇｓｋｏｌｅｔｒｙｃｋｅｒｉｅｔ），王立工科大学，ストックホルム；ビンチ，ＶＡ（Ｖｉｎｃｉ，ＶＡ）およびパレク，ＳＲ（Ｐａｒｅｋｈ，ＳＲ）（２００３年），工業用細胞培養ハンドブック：哺乳類細胞、微生物細胞、および、植物細胞、ヒューマナプレス社、米国）。標準的な回分培養の水準を超えて細胞数と産物のタイターを増加させるために、培地の灌流を用いるのが典型的である。産物収量と宿主細胞タンパク質の量は培養モードに応じて異なる：
・産物のタイターは典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量とＤＮＡ量は典型的には細胞数と共に増加するであろう。
・総タンパク質量とＤＮＡ量はまた、培養物の持続時間と共に増加することができる。
・回分培養はタンパク質とＤＮＡを蓄積する。何も外部から加えられないし、何も取り除かれない。
・灌流方法では代謝物、タンパク質、ＤＮＡ、および、その他の不純物から細胞培養物が洗い落される。フィルターと細胞遠心分離機が細胞の保持のために典型的に使用された。
組換え産物は細胞から放出され、および、細胞の懸濁液、または、細胞懸濁液の上清が回収される。回収物の特性（上述した産物のタイター、および、不純物）は使用した培養モードに応じて異なる。
以下で説明するＧ−ＣＳＦの実施例のいくつかにおいては、前記細胞懸濁液が使用された。
精製方法
組換え産物は細胞から放出され、細胞の懸濁液、または、細胞懸濁液の上清が回収される。４精製工程を含む精製が用いられた。細胞培養液の上清からＧ−ＣＳＦの捕捉工程のために陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰセファロースファーストフロー（ＦＦ））を用い、引き続いて、亜鉛ベースの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）工程（Ｚｎ−ＩＤＡキレーティングセファロースファーストフロー（ＦＦ））、最終精製のための２回目の陽イオン交換クロマトグラフィー工程（リソースＳ）、および、最終工程としてサイズ排除クロマトグラフィー工程（スーパーデックス７５）が用いられた。
Ｇ−ＣＳＦ含有細胞培養物上清の調製
捕捉工程の前に、全Ｇ−ＣＳＦ量［ｍｇ］を確認するために、数回分の上清のＧ−ＣＳＦ濃度［ｍｇ／Ｌ］をＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡにより測定した。凍結された上清（−８０°Ｃ）を２０±５℃に調整した水浴中で融解した。その後、上清を４℃、９０００×ｇで１５分間遠心分離し、それから０．２μｇフィルターユニットを用いてさらに濾過した。濾過された上清のｐＨは酢酸を用いてｐＨ４．０に調整された。
捕捉工程（ＳＰセファロースＦＦ）
１０ｍｌのＳＰセファロースＦＦ材でＸＫ１６／２０カラムを充填した（１カラム容積（ＣＶ）＝１０ｍｌ）。ＳＰセファロースＦＦ樹脂（カタログ番号１７−０７２９−０１）は、ＧＥヘルスケアから入手した。
３ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０）で平衡化を行い、引き続いて、２．５ｍｌ／分の流速での出発物質のロードが行われた。５ＣＶの同じ緩衝液を同じ流速で用いて次の洗浄工程を実行した。
２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０を含む溶出緩衝液を用い、２．５ｍｌ／分の流速で８ＣＶ以内の０％〜４０％までの溶出緩衝液の線形濃度勾配を適用して溶出を行い、引き続いて、５ＣＶの１００％溶出緩衝液を用いる段階溶出が行われた。
濃度勾配溶出から回収された溶出液のプールのＧ−ＣＳＦ濃度をＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
ＩＭＡＣ工程（Ｚｎ−ＩＤＡキレーティングセファロースＦＦ）
ＸＫ１６／２０カラムを、２ｍｌの０．２Ｍ塩化亜鉛により荷電された１０ｍｌのキレーティングセファロースＦＦで充填する（１カラム容積（ＣＶ）＝１０ｍｌ）。キレーティングセファロースＦＦ樹脂（カタログ番号１７−０５７５−０１）は、ＧＥヘルスケアから入手した。
ロードの前に、ＩＭＡＣカラムロード試料（ＳＰセファロースＦＦ溶出液）のｐＨを水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。
３ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）で平衡化を行い、引き続いて、２ｍｌ／分の流速でＳＰセファロースＦＦ溶出液のロードが行われた。２ＣＶの同じ緩衝液を同じ流速で用いて次の洗浄工程を実行した。
ｐＨ４．０の２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液を用い、１ｍｌ／分の流速で３ＣＶ以内の０％〜１００％までの溶出緩衝液の線形濃度勾配を適用して溶出を行った。その後、４ＣＶの１００％溶出緩衝液によるグラジエント遅延が適用された。
１００％溶出緩衝液による溶出から回収された溶出液のプールのＧ−ＣＳＦ濃度をＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
最終精製工程（リソースＳ）
４ｍｌ／分の流速で５ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０２％ツイーン−２０、ｐＨ４．０）を用いてＧＥヘルスケアから入手した充填済みリソースＳカラム（ＣＶ＝６ｍｌ）（カタログ番号１７−１１８０−０１）カラムを平衡化する。精製前に前記ＩＭＡＣ溶出液を酢酸でｐＨ４．０に調整し、平衡化緩衝液を用いて５倍に希釈する。
４ｍｌ／分の流速で１０ＣＶの平衡化緩衝液を用いて洗浄工程を行った。
ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、を含む溶出緩衝液を用い、２ｍｌ／分の流速で２０ＣＶ以内の０％〜１００％までの溶出緩衝液の線形濃度勾配を適用して溶出を行った。
５０〜８５％の溶出緩衝液での線形濃度勾配溶出から回収された溶出液のプールのＧ−ＣＳＦ濃度をＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー工程（スーパーデックス７５）
サイズ排除工程のために、充填済みのハイロード２６／６０スーパーデックス７５プレップグレードカラム（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７−１０４４−０１、ＣＶ＝３２０ｍｌ）を用いた。１ＣＶの緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．５）でカラムを平衡化し、引き続いて、２．５ｍｌ／分の流速、および、４％ＣＶの最大ロード容量でリソースＳ溶出液のロードを行った。
溶出液のプールのＧ−ＣＳＦ濃度をＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡと逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣにより分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて最終精製画分の純度が分析され、純度は９５％よりも高いのが典型的である。
以下で説明するＧ−ＣＳＦの実施例のいくつかにおいて、前記サイズ排除溶出液が使用された。
捕捉工程としてカプトＭＭＣ樹脂を用いるｒｈＧ−ＣＳＦの精製
実施例１（実験１）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に、総タンパク質濃度を低下させ、および、より扱いやすい体積にするために精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。希釈の前にｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂、および、カラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
平衡化緩衝液で前記カラムを平衡化し、引き続いて、１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードを行った。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。表１に見られるように、通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。溶出緩衝液は０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含み、ｐＨを７．０に変更した。Ｇ−ＣＳＦの回収率は８９％であり、溶出プロファイルはより幅が狭いピークであった。溶出の後に１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で前記カラムを洗浄した。カラムの１Ｍ水酸化ナトリウム洗浄に非常に小さいピークが見られた。図１にクロマトグラムを示す。
結論
ロードされたＧ−ＣＳＦの全てがｐＨ４．０でカプトＭＭＣに結合した。３カラム容量回収された溶出画分で高い収率（８９％）が得られた。溶出緩衝液はｐＨが７．０であり０．５Ｍのアルギニン１塩酸塩が含まれた。
図１の説明文
実験１；酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含むｐＨ７．０の緩衝液を用いてカラムを溶出した。溶出により二重のピークを得た。その二重のピークを１つの画分として回収した。
実施例２（実験２）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に総タンパク質濃度を低下させ、より扱いやすい体積にするために精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。希釈の前にｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
平衡化緩衝液でカラムを平衡化し、引き続いて、１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードを行った。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。表２に見られるように、通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。溶出緩衝液はｐＨ７．０とした。カプトＭＭＣカラムにロードされたｒｈＧ−ＣＳＦの９０％超が溶出画分に検出された。アルギニンが溶出緩衝液に含まれる実験１よりも、溶出ピークの幅が広かった。溶出体積は２倍であった。
結論
組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）はｐＨ４でカプトＭＭＣ樹脂に結合し、クエン酸ナトリウムで緩衝される溶液中にｐＨ７で溶出することができた。
実施例３（実験３）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に、総タンパク質濃度を低下させ、より扱いやすい体積にするために精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。希釈の前にｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
平衡化緩衝液でカラムを平衡化し、引き続いて、１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードを行った。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。表３に見られるように、通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。溶出緩衝液はｐＨが７．０で、実験２と比較して塩化ナトリウム濃度が０．３Ｍに上げられた。カプトＭＭＣカラムにロードされたｒｈＧ−ＣＳＦの全てが溶出画分に検出された。図２にクロマトグラフィープロファイルを示す。幅が広い溶出ピークが得られ、溶出ピークの全体が１つの溶出画分として回収された。
結論
ｒｈＧ−ＣＳＦはｐＨ７でカプトＭＭＣ樹脂に結合する。そして、溶出緩衝液が０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むとき、ｐＨ７で１００％までｒｈＧ−ＣＳＦが溶出された。溶出体積は大きく、溶出緩衝液がアルギニンを含むときと比較して２倍の体積であった。このことは、カプトＭＭＣ樹脂からのＧ−ＣＳＦの溶出に対して、０．３Ｍ塩化ナトリウムは０．５Ｍアルギニンと同じ溶出効果を持たないことを意味する。
図２の説明文
実験３；酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いてカラムを溶出した。溶出により二重のピークを得た。その幅が広い二重のピークを１つの画分として回収した。
実施例４（実験４）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に総タンパク質濃度を低下させ、より扱いやすい体積にするために、精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。希釈の前に前記ｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
実験構成
平衡化緩衝液でカラムを平衡化し、引き続いて、１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードが行われた。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、前記溶出緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。表４に見られるように、通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。溶出緩衝液はアルギニンを含み塩化ナトリウムを含まない緩衝液に変更し、ｐＨは４．０であった。溶出画分にｒｈＧ−ＣＳＦは検出されなかった。
結論
ｐＨを変更することなく前記緩衝液に０．５Ｍのアルギニン１塩酸塩を加えることだけでカプトＭＭＣ樹脂からｒｈＧ−ＣＳＦを溶出することはできなかった。これは洗浄工程として機能することができる。
実施例５（実験５）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に、総タンパク質濃度を低下させ、より扱いやすい体積にするために精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。希釈の前に前記ｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ４．０に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍアルギニン１塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
実験構成
平衡化緩衝液でカラムを平衡化し、引き続いて、１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードが行われた。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。その分析は、緩衝液条件の間にｒｈＧ−ＣＳＦがカプトＭＭＣ樹脂に結合することを示した。表５に見られるように、通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。溶出緩衝液はアルギニンを含み塩化ナトリウムを含まない緩衝液に変更し、ｐＨは平衡化緩衝液と同じ４．０であった。溶出画分にｒｈＧ−ＣＳＦは検出されなかった。このことは、より高い濃度のアルギニン（１Ｍ）がカプトＭＭＣカラムからのｒｈＧ−ＣＳＦの溶出に対して少しも効果を持たなかったことを意味する。しかし、図３に見られるように、ｐＨ４で１Ｍアルギニンを含む溶出緩衝液でカラムを溶出したときピークが得られた。２番目に大きいピークは１Ｍ水酸化ナトリウム洗浄による結果である。
結論
ｐＨを変更することなく緩衝液に１Ｍのアルギニン１塩酸塩を加えることだけでは、カプトＭＭＣ樹脂からｒｈＧ−ＣＳＦを溶出することはできなかった。これは洗浄工程として機能することはできる。
図３の説明文
実験５；酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ４．０で１Ｍアルギニンを含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。溶出により二重のピークが得られた。１つピークを溶出液画分に得た。１Ｍ水酸化ナトリウムの洗浄により大きいピークが得られた。
実施例６（実験６、７、８、９、１０、１１）
出発物質
カプトＭＭＣカラムへのロードの前に、総タンパク質濃度を低下させ、より扱いやすい体積にするために精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを平衡化緩衝液に希釈した。そして、また各実験の所望のｐＨにするために。希釈の前に前記ｒｈＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．５に溶解した。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。トリコーン５／１５０カラム（ＧＥヘルスケア）は１５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は３ｍｌであった。
緩衝液
実験６
平衡化緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
洗浄緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０，０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験７
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験８
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験９
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験１０
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ５．５
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験１１
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
次のように各実験を行った。使用する平衡化緩衝液で精製されたｒｈＧ−ＣＳＦを約２０分の１に希釈した。出発物質のｐＨはコントロールされ、全ての実験で調整なしで平衡化緩衝液と同じであった。平衡化緩衝液でカラムを平衡化し、引き続いて１ｍｌ／分の流速で出発物質のロードが行われた。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。実験６では、溶出の前に１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で前記カラムの洗浄もされた。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。
実験６の図４に見られるように、１Ｍ塩化ナトリウムでの洗浄でピークは得られなかった。このことは、ｒｈＧ−ＣＳＦがカプトＭＭＣカラムから洗い落とされなかったことを示す。酢酸ナトリウム緩衝液、または、クエン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ４で用いる場合（実験６、および、実験１１）、カプトＭＭＣカラムでＧ−ＣＳＦを独立に精製すると、同じ溶出プロファイルが得られた。
表６は、どのレベルでｒｈＧ−ＣＳＦがカプトＭＭＣに結合し、そして、どの収率が得られるのか明らかにする分析の結果を示す。
ｐＨ４〜６で通過画分中に物質を少しも失うことなくＧ−ＣＳＦがカプトＭＭＣ樹脂に結合することを表６のデータは示している。しかし、出発物質のｐＨが６．５のとき、検出されたＧ−ＣＳＦの大部分は通過画分で検出された。
０．５Ｍアルギニンを含むｐＨ７とした緩衝液で前記カプトＭＭＣカラムを溶出した。ｐＨ４〜６で材料がカラムにロードされるとき、Ｇ−ＣＳＦの回収率は高かったが、ｐＨ６．５が出発物質に用いられるとき、溶出液中の収率は低かった。
以下のクロマトグラムにおいて（図４、５、および、６）、ｒｈＧ−ＣＳＦがｐＨ４、または、５の緩衝液に存在するとき、二重ピークとしてカプトＭＭＣカラムから溶出することが示される。一方、前記出発物質のｐＨが５．５、６．０、または、６．５のとき（図７、８、および、９）、一重ピークが得られた。銀染色されたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（図１０Ａ）に示されるように、実験８（ｐＨ６．０）、実験９（ｐＨ６．５）、および、実験１０（ｐＨ５．５）からの溶出液は見事な一本のバンドを有する。一方、実験６（ｐＨ４．０）、および、実験７（ｐＨ５．０）の溶出液は銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥでより多くのバンドを示す（図１０Ｂ）。
結論
これらの実験の結果は、ｒｈＧ−ＣＳＦはｐＨ４．０、５．０、５．５、６．０でカプトＭＭＣに結合することができることを示す。ｐＨ６．５でのカプトＭＭＣへのｒｈＧ−ＣＳＦの結合はより強くなく、ｐＨ４〜６の場合と異なり通過画分にｒｈＧ−ＣＳＦを検出した。
ｐＨ５．５〜６．５が用いられたとき、溶出プロファイルはより良く、これらのｐＨがロード物質に用いられたとき、産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥでより良く見える。
ｐＨ６．５を用いたとき、カプトＭＭＣカラムからＧ−ＣＳＦが漏れたため、ロード物質にｐＨ５．５〜６．０を用いるのが好ましい。
全ての実験で、結合した物質はｐＨ７で溶出された。そして、溶出緩衝液が０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含むとき、ピークはより幅が狭くなった。Ｇ−ＣＳＦを少しも失うことなく１Ｍ塩化ナトリウムでの洗浄工程をｐＨ４で行うことができる。
図４〜１０の説明文
図４
実験６；酢酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。溶出により二重のピークが得られた。その二重ピークを１つの画分として採取した。
図５
実験１１；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ４．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。溶出により二重のピークが得られた。その二重ピークを１つの画分として採取した。
図６
実験７；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ５．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。溶出により二重のピークが得られた。その二重ピークを１つの画分として採取した。
図７
実験１０；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いるｐＨ５．５、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。溶出により一本のやや不均一なピークが得られた。
図８
実験８；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．０、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。一本の幅が狭い均一なピークが得られた。
図９
実験９；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．５、カプトＭＭＣカラムでのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。一本の幅が狭い均一なピークが得られた。
図１０Ａおよび図１０Ｂ
実験６、７、８、９、１０；様々なｐＨの値を出発物質に用いる、出発物質とカプトＭＭＣ実験からの溶出液の中のタンパク質の分離。試料は還元され（ＳＤＳで処理され）、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離される。銀染色によりタンパク質を可視化した。
実施例７（実験１２）
出発物質
組換えヒトＧ−ＣＳＦはＨＥＫ２９３細胞で産生した。細胞を取り除き、無細胞上清を出発物質としてカプトＭＭＣカラムにロードした。
クロマトグラフィー樹脂およびカラム
ｒｈＧ−ＣＳＦ分子の捕捉工程としてＧＥヘルスケアから入手した混合モード樹脂であるカプトＭＭＣ（カタログ番号１７−５３１７）を用いた。カプトＭＭＣは疎水性相互作用、および、チオフィリック相互作用、および、水素結合を有する弱カチオン樹脂である。ＸＫ１６カラム（ＧＥヘルスケア）は１３．５ｃｍのベッド高までカプトＭＭＣ樹脂で充填された。カプトＭＭＣのカラム容積（ＣＶ）は２７ｍｌであった。
緩衝液
平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０
溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン１塩酸塩、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
実験構成
無細胞上清のｐＨを６．０に調整した。平衡化緩衝液で前記カラムを平衡化し、引き続いて、ｐＨを調整した出発物質のロードを１３．５ｍｌ／分の流速で行った。続いて、平衡化緩衝液での洗浄工程を行い、次に、溶出緩衝液を用いてカラムを溶出した。試料を回収し、ＨＰＬＣ法によりｒｈＧ−ＣＳＦを分析した。その分析は、前記カラムに負荷された全てのｒｈＧ−ＣＳＦが緩衝液条件の間に前記カプトＭＭＣ樹脂に結合し、通過画分にｒｈＧ−ＣＳＦが検出されないことを示した。溶出緩衝液は２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、および、０．０２％ポリソルベート８０を含み、ｐＨは７．０とした。カプトＭＭＣ樹脂に結合したタンパク質の溶出の結果、一本の主要なピークと小さい第２のピークが生じた。前記カプトＭＭＣカラムに負荷された全てのＧ−ＣＳＦが前記の主要なピークに見出だされ、第２の小さいピークにＧ−ＣＳＦは検出されなかった（図１１）。
結論
無細胞培地中の組換えヒトＧ−ＣＳＦはｐＨ６．０でカプトＭＭＣ樹脂に結合した。
前記通過画分にＧ−ＣＳＦは検出されなかった。
ｐＨを７に変更し、０．５Ｍアルギニンを加えることにより結合した物質は前記カプトＭＭＣ樹脂から溶出され、溶出ピークの幅は狭くなった。
図１１の説明文
実験１２；クエン酸ナトリウム緩衝液を用いたｐＨ６．０、カプトＭＭＣカラムでの無細胞上清からのＧ−ＣＳＦ精製のクロマトグラム。測定された２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、および、電気伝導率（ｍＳ／ｃｍ）が図に示される。ｐＨ７．０で０．５Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液を用いて前記カラムを溶出した。二重ピークが得られたが、Ｇ−ＣＳＦは主要なピークにのみ検出された。
実施例８
カラムおよび樹脂
トリコーン５／５０カラム（ＧＥヘルスケア）はカプトＭＰベースのマトリックスに結合した酵母由来Ｆａｂ断片ベースのアフィニティーリガンドで充填された。ベッド高は約２ｃｍであり、約０．４ｍｌの樹脂容積を生じた。アフィニティー樹脂の原型（Ｇ−ＣＳＦ８）はＢＡＣ ＢＶ社から入手した。
出発物質
使用された出発物質はＨＥＫ２９３Ｆ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦ含有細胞上清であった。
緩衝液組成
緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．０、２５℃での電気伝導率３２ｍＳ／ｃｍ
緩衝液Ｂ（溶出緩衝液Ｉ）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ３．０、２５℃での電気伝導率３２ｍＳ／ｃｍ
カラムは平衡化緩衝液Ａで平衡化され、引き続いて、出発物質のロードが行われた。その後、前記樹脂を平衡化緩衝液Ａで洗浄し、その後、溶出緩衝液ＢでＧ−ＣＳＦを溶出した。出発物質と溶出液の中のＧ−ＣＳＦ含量を分析した（表７）。
図１２は、アフィニティークロマトグラフィー工程の後の溶出液を表すクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
レーンと試料
レーン１、分子量標準物質
レーン２、溶出液（実施例８）
実施例８の結論
Ｇ−ＣＳＦの溶出に低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３）を用いるとき、優れた純度と回収率が達成された。
実施例９
カラムおよび樹脂
トリコーン５／５０カラム（ＧＥヘルスケア）はカプトＭＰベースのマトリックスに結合した酵母由来Ｆａｂ断片ベースのアフィニティーリガンドで充填された。ベッド高は約２ｃｍであり、約０．４ｍｌの樹脂容積を生じた。アフィニティー樹脂の原型（Ｇ−ＣＳＦ８）はＢＡＣ ＢＶ社から入手した。
出発物質
使用された出発物質はＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来のＧ−ＣＳＦ含有細胞上清であった。
緩衝液組成
緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．０、２５℃での電気伝導率３２ｍＳ／ｃｍ
緩衝液Ｃ（溶出緩衝液ＩＩ）
１．０Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．８Ｍアルギニン、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．０、２５℃での電気伝導率８９ｍＳ／ｃｍ
平衡化緩衝液と溶出緩衝液は、記載されたｐＨ、濃度、および、緩衝液の種類、塩、または、界面活性剤に限定されない。
カラムは平衡化緩衝液Ａで平衡化され、引き続いて、出発物質のロードが行われた。その後、樹脂を平衡化緩衝液Ａで洗浄し、その後、溶出緩衝液Ｃで結合したＧ−ＣＳＦを溶出した。出発物質と溶出液の中のＧ−ＣＳＦ含量を分析した（表８）。
実施例９の結論
塩化ナトリウムとアルギニンの混合物を用いて前記アフィニティーカラムからＧ−ＣＳＦを溶出することができる。
実施例１０
カラムおよび樹脂
トリコーン５／５０カラム（ＧＥヘルスケア）はカプトＭＰベースのマトリックスに結合した酵母由来Ｆａｂ断片ベースのアフィニティーリガンドで充填された。ベッド高は約２ｃｍであり、約０．４ｍｌの樹脂容積を生じた。アフィニティー樹脂の原型（Ｇ−ＣＳＦ８）はＢＡＣ ＢＶ社から入手した。
出発物質
使用された出発物質はＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来のＧ−ＣＳＦ含有細胞上清であった。
緩衝液組成
緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．２５℃での電気伝導率０、３２ｍＳ／ｃｍ
緩衝液Ｄ（溶出緩衝液ＩＩＩ）
２．０Ｍ塩化マグネシウム、０．０２Ｍトリス、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ７．５、２５℃での電気伝導率１４４ｍＳ／ｃｍ
平衡化緩衝液と溶出緩衝液は、記載されたｐＨ、濃度、および、緩衝液の種類、塩、または、界面活性剤に限定されない。
カラムは平衡化緩衝液Ａで平衡化され、引き続いて、出発物質のロードが行われた。その後、樹脂を平衡化緩衝液Ａで洗浄し、続いて溶出緩衝液Ｄで結合したＧ−ＣＳＦを溶出した。出発物質と溶出液の中のＧ−ＣＳＦ含量を分析した（表９）。
実施例１０の結論
溶出剤として２Ｍ塩化マグネシウムを用いて前記アフィニティーカラムからＧ−ＣＳＦを溶出することができる。
実施例１１
カラムおよび樹脂
トリコーン５／５０カラム（ＧＥヘルスケア）はカプトＭＰベースのマトリックスに結合した３つの異なる酵母由来Ｆａｂ断片ベースのアフィニティーリガンドの原型で充填された。ベッド高は約２ｃｍであり、約０．４ｍｌの樹脂容積を生じた。記アフィニティー樹脂の原型（Ｇ−ＣＳＦ２、Ｇ−ＣＳＦ３、および、Ｇ−ＣＳＦ６）は、ＢＡＣ ＢＶ社から入手した。
出発物質
使用された出発物質はＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来のＧ−ＣＳＦ含有細胞上清であった。
緩衝液組成
緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ６．０、２５℃での電気伝導率３２ｍＳ／ｃｍ
緩衝液Ｂ（溶出緩衝液Ｉ）
０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、０．０２％ツイーン２０、ｐＨ３．０、２５℃での電気伝導率３２ｍＳ／ｃｍ
カラムは平衡化緩衝液Ａで平衡化され、引き続いて、出発物質のロードが行われた。その後、樹脂を平衡化緩衝液Ａで洗浄し、続いて溶出緩衝液Ｂで結合したＧ−ＣＳＦを溶出した。出発物質、通過画分、および、溶出液の中のＧ−ＣＳＦ含量を分析した（表）。
図１３は、出発物質、アフィニティークロマトグラフィー工程の後の通過画分、および、溶出液を表す銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
図の説明
レーンと試料
レーン１、Ｇ−ＣＳＦ２の出発物質；レーン２、Ｇ−ＣＳＦ２の通過画分；レーン３、ブランク；レーン４、Ｇ−ＣＳＦ２の溶出液；レーン５、ブランク；レーン６、Ｇ−ＣＳＦ３の通過画分；レーン７、ブランク；レーン８、Ｇ−ＣＳＦ３の溶出液；レーン９、ブランク；レーン１０、Ｇ−ＣＳＦ６の通過画分；レーン１１、ブランク；レーン１２、Ｇ−ＣＳＦ６の溶出液
実施例１１の結論
溶出剤として低ｐＨを用いた通過画分中のＧ−ＣＳＦの検出、および、溶出画分における様々な回収率で示されるように、異なるアフィニティーリガンドの原型は異なるＧ−ＣＳＦ結合能をもたらす。しかしながら、図１３に示されるように、全てのアフィニティーリガンドは、溶出液に同様に優れた純度プロファイルをもたらす。

Claims (12)

  1. クロマトグラフィーを用いる一連の精製においてＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）を精製する方法であって：
    少なくとも１つのクロマトグラフィーは、負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンドを含むマルチモーダル樹脂を用いて行われ；
    Ｇ−ＣＳＦは４〜６．２の間のｐＨで前記マルチモーダル樹脂に結合し；及び
    前記Ｇ−ＣＳＦは５．５〜６．５のｐＨで溶出し、アルギニンを０．１Ｍ〜２．０Ｍの範囲の濃度で用いることで溶出が行われること、を特徴とする方法。
  2. 前記Ｇ−ＣＳＦに対する酵母由来Ｆａｂ断片を用いる、アフィニティーリガンドクロマトグラフィー工程を組み合わせる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｇ−ＣＳＦは組換えＧ−ＣＳＦである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記Ｇ−ＣＳＦはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０で前記マルチモーダル樹脂に結合し、前記Ｇ−ＣＳＦはｐＨ６．５以上で前記マルチモーダル樹脂より溶出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジニル）−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス塩基、及び酢酸ナトリウムを含む緩衝物質を使用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 使用される緩衝液のいずれかに非イオン性洗浄剤が存在し、非イオン性洗浄剤はポリソルベート類から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記Ｇ−ＣＳＦの溶出前のｐＨ４．０〜６．０の範囲での洗浄工程において、０．１Ｍ〜２Ｍ塩化ナトリウム又は０．１Ｍ〜２Ｍアルギニン１塩酸塩を含む緩衝液が使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 夾雑物を洗い流し、前記Ｇ−ＣＳＦを保持するために、前記Ｇ−ＣＳＦが解離される前に洗浄緩衝液を前記マルチモーダル樹脂に適用することを特徴とし、前記洗浄緩衝液は塩基性側鎖を有するアミノ酸、及び／又は、ホフマイスターシリーズに従い選択される塩を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 下記の工程：
    負に荷電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンドを含むマルチモーダル樹脂を使用するクロマトグラフィーを行う工程；
    エンベロープウィルス向けの、化学作用に基づく不活性化工程；
    酵母で発現された前記Ｇ−ＣＳＦに対するＦａｂ断片に基づいたアフィニティー樹脂を使用するクロマトグラフィーを行う工程；
    陽イオン交換体を使用するクロマトグラフィーを行う工程；
    ２０ｎｍの平均孔径を用いる病原体濾過除去工程；
    １〜５ｋＤａのカットオフの緩衝液交換及び／又は濃縮工程；
    サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を使用するクロマトグラフィーを行う工程、
    を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記マルチモーダルクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程と組み合わされ、前記アフィニティーは前記Ｇ−ＣＳＦに対する酵母由来Ｆａｂ断片によりもたらされ、前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂から生じた産物の純度は９０％より高いことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィーから選択される追加のクロマトグラフィー工程を行うことを特徴とし、最終産物の純度は９９％よりも高いことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記の一連の精製は、除去される病原体に対する様々な生理的特性に基づいている、化学作用に基づく不活性化工程、サイズに基づく除去工程、クロマトグラフィー工程、又はこれらの組合せを含む病原体除去／不活性化工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
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