JP6303379B2 - 抗体の精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体を含む溶液から前記抗体を高純度に精製する方法に関する。
近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造する。
カラムクロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質に対し特異的に結合可能な物質（リガンド）を不溶性の担体に固定化することで得られる吸着剤（以下、アフィニティークロマトグラフィー用担体ともいう）を用いたクロマトグラフィーである。吸着対象物質に対する特異的な結合力は、通常、イオン相互作用、疎水相互作用、水素結合、弱い共有結合、金属とのキレート結合などの形成が複合的かつ立体的に行なわれることで得られている。アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質を含む被精製溶液に含まれる夾雑物（例えば、培養細胞由来のタンパク質（Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＣＰ）、核酸、膜成分や代謝物質、培養液由来の成分、アフィニティークロマトグラフィー用担体を構成するリガンドや担体が剥離したもの）を除去し、前記吸着対象物質を特異的に吸着させることができる。そのため、前記吸着対象物質を高純度に精製可能である。しかしながらアフィニティークロマトグラフィー用担体が吸着対象物質と特異的な結合力で吸着される一方で、被精製溶液に含まれる夾雑物も弱い結合力ながら前記担体に吸着してしまい、このことが前記吸着対象物質の精製純度が低下する要因となっていた。
特にアフィニティークロマトグラフィーは多くの場合、精製工程の最初の段階であるキャプチャー工程に採用されるため、アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムに添加される溶液は、全精製工程の中で最も多くの夾雑物を含んでいる。したがって、たとえ特異性の高いアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いたとしても、吸着対象物質以外の夾雑物が当該担体に非特異的に吸着することで、吸着対象物質の精製純度が低下してしまう問題があった。
抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用担体として一般的には、プロテインＡをリガンドとして固定化した担体が用いられている。プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムを用いて抗体を精製する際は、通常、中性付近で抗体を含む溶液（例えば、抗体を発現可能な細胞の培養液）を添加して当該抗体を担体に吸着させた後、カラムの平衡化に用いた緩衝液で担体を洗浄し、最後に酸性の緩衝液で担体に吸着した抗体を溶出させることで、抗体を高純度に精製する。前述したクロマトグラフィー操作を１回行なうことで、抗体の純度を９０％以上まで向上させることができる。しかしながら、前記操作で得られた抗体溶液中には、培養細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）が数百から数千ｐｐｍの濃度で混入しており（非特許文献１）、他にも、培養細胞に由来する核酸成分、膜成分、代謝成分や、培養液に由来する成分などの混入が問題となっている。前記問題を解決するために、カラムの平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、抗体を溶出させる前に、尿素やイソプロパノールを含んだ緩衝液で追加の洗浄を行なうことで、ＨＣＰなどの夾雑成分の除去効果を高める方法が開示されている（非特許文献２）。しかしながら、非特許文献２で開示の方法をもってしても、ＨＣＰの除去率は最大でも６０％程度であり、残りのＨＣＰは精製抗体溶液に混入したままである。
プロテインＡを固定化した担体以外の抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用担体として、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子であるＦｃ受容体やＦｃ領域結合能を有したＦｃ受容体の部分領域（以下、合わせてＦｃ結合性タンパク質という）をリガンドとして固定化した担体が実用化されている（特許文献１）。Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した担体も、プロテインＡを固定化した担体と同様の高い抗体精製純度を達成することが可能であるが、数千から数万ｐｐｍのＨＣＰが精製した抗体溶液に混入する問題があった。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ，１１０２，２２４−２３１，２００６
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．２４，１１１５−１１２１，２００８
本発明の目的は、抗体を含む溶液からアフィニティークロマトグラフィーを用いて前記抗体を精製する際、前記溶液に含まれる夾雑物を効率的に除去し、前記抗体を高純度に精製する方法を提供することにある。
本願発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を効率的に除去可能な洗浄成分を特定し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の第一の態様は、
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法であって、
前記夾雑物を洗浄する工程が、前記カラムの平衡化に用いた溶液で洗浄する第一の洗浄工程と、終濃度０．２Ｍ以上の塩化ナトリウムを含む中性または塩基性の緩衝液で洗浄する第二の洗浄工程とからなる、前記精製方法である。
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法であって、
前記夾雑物を洗浄する工程が、前記カラムの平衡化に用いた溶液で洗浄する第一の洗浄工程と、終濃度０．２Ｍ以上の塩化ナトリウムを含む中性または塩基性の緩衝液で洗浄する第二の洗浄工程とからなる、前記精製方法である。
また本発明の第二の態様は、抗体を含む溶液に対し０．２Ｍ以上となるよう塩化ナトリウムを添加後、平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程を行なう、第一の態様に記載の精製方法である。
また本発明の第三の態様は、第二の洗浄工程で用いる緩衝液が、水溶性有機溶媒、非イオン性界面活性剤、疎水性アミノ酸、終濃度０．３Ｍ以上の尿素のうちいずれか一つ以上をさらに含む、前記第一または第二の態様に記載の精製方法である。
また本発明の第四の態様は、水溶性有機溶媒がイソプロパノール、アセトニトリル、エタノールのいずれかである、前記第三の態様に記載の精製方法である。
また本発明の第五の態様は、疎水性アミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシンのいずれかである、前記第三の態様に記載の精製方法である。
さらに本発明の第六の態様は、
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、
抗体を含む溶液に対し０．２Ｍ以上となるよう塩化ナトリウムを添加する工程と、
前記平衡化したカラムに前記抗体を含む溶液を添加する工程と、
前記カラムの平衡化に用いた溶液で前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、
溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、
抗体の精製方法である。
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、
抗体を含む溶液に対し０．２Ｍ以上となるよう塩化ナトリウムを添加する工程と、
前記平衡化したカラムに前記抗体を含む溶液を添加する工程と、
前記カラムの平衡化に用いた溶液で前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、
溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、
抗体の精製方法である。
また本発明の第七の態様は、アフィニティクロマトグラフィー用担体が、Ｆｃ結合性タンパク質またはプロテインＡを固定化した担体である、前記第一から第六の態様のいずれかに記載の精製方法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の精製方法の一態様は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含み、かつ前記夾雑物を洗浄する工程が、前記カラムの平衡化に用いた溶液で洗浄する第一の洗浄工程と、終濃度０．２Ｍ以上の塩化ナトリウムを含む中性または塩基性の緩衝液で洗浄する第二の洗浄工程とからなることを特徴としている。
前記カラムを平衡化する工程および第一の洗浄工程で用いる溶液は、一般には、ｐＨが中性付近の緩衝液（緩衝液の濃度は数十ｍＭから１００ｍＭ程度）やＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）が用いられる。
第二の洗浄工程で用いる緩衝液は、終濃度０．２Ｍ（０．２ｍｏｌ／Ｌ）以上の塩化ナトリウムを含むことを特徴としている。ＰＢＳに含まれる塩化ナトリウム濃度が０．１３７Ｍであるため、第二の洗浄工程ではＰＢＳよりも高い塩化ナトリウム濃度を含む緩衝液で洗浄することになる。第二の洗浄工程で用いる緩衝液に含まれる塩化ナトリウム濃度に特に上限はないものの、好ましくは終濃度０．２Ｍから１．２Ｍの範囲、さらに好ましくは終濃度０．３Ｍから１．０Ｍの範囲、最も好ましくは終濃度０．３５Ｍから０．６Ｍの範囲である。第二の洗浄工程で用いる緩衝液のｐＨは７以上であればよいが、極端にｐＨが高いと（極端な塩基性だと）アフィニティークロマトグラフィー用担体を構成するリガンドが変性する可能性があるため、好ましくはｐＨ７からｐＨ１２の範囲、より好ましくはｐＨ８からｐＨ１０の範囲である。緩衝液を構成する緩衝剤は、使用するｐＨに応じて当業者が通常用いる緩衝剤の中から適宜選択すればよく、リン酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ホウ酸、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムが例示できる。また、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）やＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）といったグッドバッファー系緩衝剤を用いてもよい。
第二の洗浄工程で用いる緩衝液に、疎水性を高める水溶性有機溶媒、非イオン系界面活性剤、疎水性アミノ酸のうちいずれか一つ以上をさらに含む（添加する）と、物質とアフィニティークロマトグラフィー用担体との疎水的な相互作用をコントロールできるため好ましい。水溶性有機溶媒の一例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、ブタノール、アセトニトリル、アセトン、ベンジルアルコールがあげられる。水溶性有機溶媒の添加量は、抗体とアフィニティークロマトグラフィー用担体の吸着力が弱くならない程度に添加すればよく、好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）から２５％（ｖ／ｖ）の範囲、より好ましくは５％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。非イオン系界面活性剤の一例としては、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０（以上商品名）等）やＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）があげられる。界面活性剤の添加量は臨界ミセル濃度以上の常用濃度となるように添加すればよく、好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）から１％（ｖ／ｖ）の範囲である。疎水性アミノ酸の一例としては、ロイシン、イソロイシン、バリンがあげられる。疎水性アミノ酸の添加量は溶解可能な濃度域であれば良く、好ましくは１００ｍＭから１Ｍの範囲、より好ましくは２００ｍＭから４００ｍＭの範囲である。
第二の洗浄工程で用いる緩衝液に、水素結合の形成を阻害する物質をさらに含む（添加する）と、水素結合の強さをコントロールできるため好ましい。好ましい水素結合の形成を阻害する物質としては尿素があげられ、その他グアニジン塩酸塩などのグアニジウム塩が使用できる。添加量は尿素の場合、少なくとも終濃度で０．３Ｍ（０．３ｍｏｌ／Ｌ）以上添加する必要があり、好ましくは終濃度０．５Ｍ以上、より好ましくは終濃度０．５Ｍから３Ｍの範囲である。
第二の洗浄工程で用いる緩衝液に、前述した水溶性有機溶媒と前述した水素結合の形成を阻害する物質とを組み合わせた形で含んでも（添加しても）よく、これにより第二の洗浄工程による夾雑物の除去効果をさらに高めることができる。組み合わせの態様は、アフィニティークロマトグラフィー用担体と抗体との結合力が充分保持される範囲で適宜検討すればよい。
また本発明の精製方法では、アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填した平衡化済のカラムに抗体を含む溶液を添加する工程を行なう際、あらかじめ抗体を含む溶液に対して０．２Ｍ（０．２ｍｏｌ／Ｌ）以上となるよう塩化ナトリウムを添加してから前記工程を行なってもよく、これまで説明した精製方法と同様、抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を効率的に除去することができる。なお本方法を採用する場合は、前述した第二の洗浄工程を省略してもよい。
本発明の精製方法で使用するアフィニティークロマトグラフィー用担体は、抗体への特異的吸着能を有するリガンドを有した担体であれば特に限定なく、一例としてプロテインＡを固定化した担体やＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体が例示できる。Ｆｃ結合性タンパク質の例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質や、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質や、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において以下の（１）から（３４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１２−１４５８５０号）があげられる。
（１）配列番号１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（１）配列番号１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
本発明の精製方法は、０．２Ｍ（０．２ｍｏｌ／Ｌ）以上の塩化ナトリウムを、抗体を含む溶液および／または洗浄液に添加することで、抗体とアフィニティークロマトグラフィー用担体との結合力を維持しながら前記担体と夾雑物との結合力を弱めて、抗体を含む溶液に含まれる夾雑物の洗浄を効果的に行なえる。したがって従来の精製方法と比較し、抗体の精製純度を向上させることができる。本発明の精製方法により、後段の精製プロセス負荷を大きく軽減させることができるため、結果として純度の高い抗体を安価に製造することができる。
以下、実施例および参考例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡで大腸菌を形質転換して形質転換体を得た。得られた形質転換体を培養し、さらに得られた菌体から前記Ｆｃ結合性タンパク質を精製することによって、前記Ｆｃ結合性タンパク質を得た。
（２）分離剤用ビニルポリマーゲル（トヨパール、東ソー社製）にある水酸基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミンを順次反応させることによってアミノ基を導入後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させて、マレイミド基にて活性化されたトヨパールを得た。得られた前記活性化トヨパールに（１）で調製したＦｃ結合性タンパク質を反応させることにより、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを得た。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（４）抗ＩＬ−８抗体を生産するＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２４４５）を培養し、培養上清を清澄化して得られた、前記抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清（以下、単に「ＣＨＯ細胞培養上清」という）１ｍＬを、あらかじめＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムに添加した。
（５）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｖｏｌｕｍｅ））通液することでカラムを洗浄後、５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）流すことで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（６）回収した抗体溶液に含まれる培養細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＣＹＧＮＵＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法にて添付のプロトコールに従い定量した。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡで大腸菌を形質転換して形質転換体を得た。得られた形質転換体を培養し、さらに得られた菌体から前記Ｆｃ結合性タンパク質を精製することによって、前記Ｆｃ結合性タンパク質を得た。
（２）分離剤用ビニルポリマーゲル（トヨパール、東ソー社製）にある水酸基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミンを順次反応させることによってアミノ基を導入後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させて、マレイミド基にて活性化されたトヨパールを得た。得られた前記活性化トヨパールに（１）で調製したＦｃ結合性タンパク質を反応させることにより、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを得た。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（４）抗ＩＬ−８抗体を生産するＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２４４５）を培養し、培養上清を清澄化して得られた、前記抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清（以下、単に「ＣＨＯ細胞培養上清」という）１ｍＬを、あらかじめＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムに添加した。
（５）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｖｏｌｕｍｅ））通液することでカラムを洗浄後、５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）流すことで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（６）回収した抗体溶液に含まれる培養細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＣＹＧＮＵＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法にて添付のプロトコールに従い定量した。
結果、回収した抗体溶液中には６９９８ｎｇのＨＣＰが含まれていた。
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製における第二の洗浄の検討
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ）カラムに通液することで第一の洗浄を行なった後、洗浄液を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで第二の洗浄を行ない、最後に５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（３）実施例１（６）に記載の方法で回収した抗体溶液中のＨＣＰを定量した。
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ）カラムに通液することで第一の洗浄を行なった後、洗浄液を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで第二の洗浄を行ない、最後に５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（３）実施例１（６）に記載の方法で回収した抗体溶液中のＨＣＰを定量した。
まず第二の洗浄で用いる洗浄液のｐＨの検討を行なった。その結果、ｐＨ８以上の緩衝液で洗浄することで、第二の洗浄を行なわないときと比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少した（図２）。また前記緩衝液に塩化ナトリウムを添加すると、抗体溶液中のＨＣＰ量がさらに減少した（図２）。
そこで緩衝液に添加する塩化ナトリウム濃度を検討した。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に対し様々な濃度の塩化ナトリウムを添加した洗浄液を用いて第二の洗浄を行なった結果、塩化ナトリウムを終濃度で０．２Ｍ以上添加すると、塩化ナトリウム無添加の緩衝液で第二の洗浄を行なったときと比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少していた。特に塩化ナトリウムを終濃度で０．４Ｍから０．５Ｍ添加した緩衝液で第二の洗浄を行なったとき、抗体溶液中のＨＣＰ量がより減少していた（図３）。
次に塩化ナトリウムを終濃度で０．５Ｍ添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）にさらに有機溶媒を添加した洗浄液によるＣＨＯ細胞培養上清からの抗体精製を検討した。結果、イソプロパノールやアセトニトリルといった水溶性有機溶媒をさらに添加した洗浄液で第二の洗浄を行なうことで、水溶性有機溶媒無添加時と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量がさらに減少した（図４）。なお水溶性有機溶媒のうちイソプロパノールについて、添加量を変えて検討したところ、イソプロパノール添加量の増加に伴い抗体溶液中のＨＣＰ量が減少し、５％（ｖ／ｖ）以上添加すると、水溶性有機溶媒無添加時と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が約３分の１以下となった（図４）。
次に塩化ナトリウムを終濃度で０．５Ｍ添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）にさらに尿素を添加した洗浄液によるＣＨＯ細胞培養上清からの抗体精製を検討した。結果、尿素を終濃度で０．５Ｍ以上添加した洗浄液で第二の洗浄を行なうと、尿素無添加時と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量がさらに減少した（図５）。一方、尿素の添加量が終濃度で０．１Ｍのときは効果が認められなかった（図５）。
図６は図２から図５の結果をまとめたものである。なお塩化ナトリウムを終濃度で０．５Ｍ添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に、水溶性有機溶媒であるイソプロパノールおよび尿素を添加した洗浄液を用いて第二の洗浄を行なうと、イソプロパノールまたは尿素のみを添加した洗浄液を用いて第二の洗浄を行なったときと比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量がさらに減少した（図６）。
実施例３ プロテインＡ固定化アガロースゲルによる抗体精製
（１）プロテインＡ固定化アガロースゲルであるＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（２）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムに添加した。
（３）実施例１（５）および（６）に記載の方法で抗体の精製およびＨＣＰの定量を行なった。
（１）プロテインＡ固定化アガロースゲルであるＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（２）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムに添加した。
（３）実施例１（５）および（６）に記載の方法で抗体の精製およびＨＣＰの定量を行なった。
結果、回収した抗体溶液中には５５８ｎｇのＨＣＰが含まれていた。
参考例１ プロテインＡ固定化アガロースゲルによる抗体精製における第二の洗浄の検討
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、プロテインＡ固定化アガロースゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例３（１）で作製したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍ（終濃度）の尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、プロテインＡ固定化アガロースゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例３（１）で作製したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍ（終濃度）の尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
結果を図７に示す。洗浄液による第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかったときと比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少していた。しかしながら、クエン酸緩衝液を洗浄液として用いた場合は、ゲルに吸着した抗体の一部が洗浄液中にリークしたことによる、抗体溶液中への抗体回収率の減少が確認され、塩化ナトリウムは添加せずイソプロパノールと尿素のみを添加した緩衝液を洗浄液として用いた場合のＨＣＰ量減少率は１５％程度にとどまった。
実施例４ プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる抗体精製
（１）プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０Ｆ（東ソー社製）０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（２）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムに添加した。
（３）実施例１（５）および（６）に記載の方法で抗体の精製およびＨＣＰの定量を行なった。
（１）プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０Ｆ（東ソー社製）０．１ｍＬを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、液体クロマトグラフ装置に設置した。
（２）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムに添加した。
（３）実施例１（５）および（６）に記載の方法で抗体の精製およびＨＣＰの定量を行なった。
結果、回収した抗体溶液中には１００１ｎｇのＨＣＰが含まれていた。
実施例５ プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる抗体精製における第二の洗浄の検討
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例４（１）で作製したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍの尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
図１に示す、第二の洗浄を入れたプロトコールによる、プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる抗体精製を検討した。
（１）実施例４（１）で作製したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍの尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
結果を図８に示す。洗浄液による第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少しており、塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加した緩衝液を洗浄液として用いた場合は特にＨＣＰ量が減少していた（イソプロパノールと尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液を用いた場合６３２ｎｇ、塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加したホウ酸緩衝液を用いた場合１０２ｎｇ）。
実施例６ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製における洗浄成分添加の検討
実施例２および５ならびに参考例１では第二の洗浄を追加して抗体の精製を行なったが、本実施例では第二の洗浄の代わりに、第二の洗浄で用いる洗浄液に添加する成分をあらかじめ被精製溶液に添加して抗体の精製を行なった。プロトコールを図９に示す。
（１）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに各成分を添加後、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラム（実施例１（３）で作製）またはプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラム（実施例４（１）で作製）に添加した。なお添加する成分は、塩化ナトリウム（ＣＨＯ細胞培養上清に対し０．５Ｍ）、イソプロパノール（１０％（ｖ／ｖ））、または塩化ナトリウム（ＣＨＯ細胞培養上清に対し０．５Ｍ）＋イソプロパノール（１０％（ｖ／ｖ））のいずれかである。
（２）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ）カラムに通液することで洗浄後、５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（３）実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。
実施例２および５ならびに参考例１では第二の洗浄を追加して抗体の精製を行なったが、本実施例では第二の洗浄の代わりに、第二の洗浄で用いる洗浄液に添加する成分をあらかじめ被精製溶液に添加して抗体の精製を行なった。プロトコールを図９に示す。
（１）実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに各成分を添加後、あらかじめＰＢＳで洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラム（実施例１（３）で作製）またはプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラム（実施例４（１）で作製）に添加した。なお添加する成分は、塩化ナトリウム（ＣＨＯ細胞培養上清に対し０．５Ｍ）、イソプロパノール（１０％（ｖ／ｖ））、または塩化ナトリウム（ＣＨＯ細胞培養上清に対し０．５Ｍ）＋イソプロパノール（１０％（ｖ／ｖ））のいずれかである。
（２）ＰＢＳを１０分間（５０ＣＶ）カラムに通液することで洗浄後、５０ｍＭのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３分間（１５ＣＶ）カラムに通液することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させ回収した。
（３）実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。
Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いたときの結果を図１０に、プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを用いたときの結果を図１１に、それぞれ示す。いずれの場合も塩化ナトリウムを被精製溶液（ＣＨＯ細胞培養上清）にあらかじめ添加してから精製を行なうことで、被精製溶液をそのまま精製するときと比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が大きく減少した。なおＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いたときは、イソプロパノールをさらに被精製溶液に添加することで、抗体溶液中のＨＣＰ量がより減少した（図１０）。
実施例７ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その１）
実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清に含まれる抗体は約０．０８ｍｇ／ｍＬであるが、近年の抗体生産技術の進歩により、培養上清に含まれる抗体濃度は１ｍｇ／ｍＬ以上、さらには１０ｍｇ／ｍＬ以上となる例も報告されている。そこで、本発明の抗体の精製方法が、抗体を高濃度含む溶液に対しても適用可能か検討した。
（１）ヒトガンマグロブリン（化学及血清療法研究所製）を終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるようＣＨＯ細胞上清に添加して、抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清を作製した。
（２）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（３）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
実施例１（４）で得られたＣＨＯ細胞培養上清に含まれる抗体は約０．０８ｍｇ／ｍＬであるが、近年の抗体生産技術の進歩により、培養上清に含まれる抗体濃度は１ｍｇ／ｍＬ以上、さらには１０ｍｇ／ｍＬ以上となる例も報告されている。そこで、本発明の抗体の精製方法が、抗体を高濃度含む溶液に対しても適用可能か検討した。
（１）ヒトガンマグロブリン（化学及血清療法研究所製）を終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるようＣＨＯ細胞上清に添加して、抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清を作製した。
（２）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（３）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
結果を図１２に示す。イソプロパノールと塩化ナトリウムを添加した中性または塩基性緩衝液を用いて第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が１０分の１以下まで減少した。
実施例８ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その２）
実施例６において、洗浄液に添加する成分を被精製溶液にあらかじめ添加して精製を行なうと、第二の洗浄を行なわなくても抗体溶液中のＨＣＰ量が減少することを確認している。そこで、洗浄液に添加する成分を被精製溶液に添加し、さらに第二の洗浄を行なうことでＨＣＰ量がさらに減少するか確認した。
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを０．５Ｍ添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラム（実施例１（３）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、１０％（ｖ／ｖ）のエタノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、または２０％（ｖ／ｖ）のエタノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
実施例６において、洗浄液に添加する成分を被精製溶液にあらかじめ添加して精製を行なうと、第二の洗浄を行なわなくても抗体溶液中のＨＣＰ量が減少することを確認している。そこで、洗浄液に添加する成分を被精製溶液に添加し、さらに第二の洗浄を行なうことでＨＣＰ量がさらに減少するか確認した。
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを０．５Ｍ添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラム（実施例１（３）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、１０％（ｖ／ｖ）のエタノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、または２０％（ｖ／ｖ）のエタノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
結果を図１２に示す。イソプロパノールやエタノールといった水溶性有機溶媒と塩化ナトリウムとを添加した緩衝液で第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が７分の１以下まで減少した。また被精製溶液を直接カラムに添加する場合（実施例７）と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少していることがわかる。すなわち、第二の洗浄を行ない、かつ第二の洗浄に用いる洗浄液に添加する成分を被精製溶液にも添加して精製することで、抗体溶液中のＨＣＰ量がさらに減少することがわかる。
なお洗浄液のｐＨが高い（塩基性側）ほうが、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少する点で好ましいといえる。またエタノールもイソプロパノールと同様、添加量の増加に伴い抗体溶液中のＨＣＰ量が減少していることがわかる。
実施例９ プロテインＡ固定化アガロースゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その１）
（１）実施例３（１）で作製したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍ（終濃度）の尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
（１）実施例３（１）で作製したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと１．０Ｍ（終濃度）の尿素を添加したＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
結果を図１３に示す。塩化ナトリウムを添加せずイソプロパノールと尿素のみを添加した緩衝液を用いて第二の洗浄を行なった場合、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量減少率は２５％程度であった。一方、塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加した緩衝液で第二の洗浄を行なうと抗体溶液中のＨＣＰ量は２０分の１以下にまで減少した。
実施例１０ プロテインＡ固定化アガロースゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その２）
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを０．５Ｍとなるよう添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラム（実施例３（１）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを０．５Ｍとなるよう添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化アガロースゲルを充填したカラム（実施例３（１）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加した緩衝液で第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少した（第二の洗浄なし：４４３ｎｇ、リン酸緩衝液使用時：１０７ｎｇ、ホウ酸緩衝液使用時：１０９ｎｇ）。
実施例１１ プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その１）
（１）実施例４（１）で作製したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
（１）実施例４（１）で作製したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加した緩衝液で第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少した（第二の洗浄なし：１１５７ｎｇ、リン酸緩衝液使用時：８１ｎｇ、ホウ酸緩衝液使用時：８５ｎｇ）。
実施例１２ プロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その２）
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍとなるよう添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラム（実施例４（１）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
（１）実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬに対し塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍとなるよう添加後、あらかじめＰＢＳにて洗浄、平衡化したプロテインＡ固定化ビニルポリマーゲルを充填したカラム（実施例４（１）で作製）に添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７）、または１０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加したホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた。
塩化ナトリウムとイソプロパノールを添加した緩衝液で第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少した（第二の洗浄なし：５１８ｎｇ、リン酸緩衝液使用時：９１ｎｇ、ホウ酸緩衝液使用時：６９ｎｇ）。
実施例１３ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その３）
（１）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）、または０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）を用いた。
（１）実施例１（３）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）、または０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０と０．５Ｍ（終濃度）の塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７、ｐＨ９またはｐＨ１０）を用いた。
結果を図１４に示す。非イオン系界面活性剤と塩化ナトリウムを添加した中性または塩基性緩衝液を用いて第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が６０％から８０％減少した。
実施例１４ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる、抗体を高濃度含む溶液からの抗体精製（その４）
（１）実施例１（１）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、０．５Ｍ（終濃度）のＬ−バリンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．２Ｍ（終濃度）のＬ−ロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．４Ｍ（終濃度）のＬ−ロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．２Ｍ（終濃度）のＬ−イソロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．４Ｍ（終濃度）のＬ−イソロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．０５Ｍ（終濃度）のグリシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、または０．２Ｍ（終濃度）のグリシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）を用いた。
（１）実施例１（１）で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムをＰＢＳにて洗浄、平衡化した後、実施例７（１）で作製した抗体を高濃度含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを添加した。
（２）実施例２（２）に記載の方法で抗体の精製を行ない、実施例１（６）に記載の方法でＨＣＰの定量を行なった。なお洗浄液は、０．５Ｍ（終濃度）のＬ−バリンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．２Ｍ（終濃度）のＬ−ロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．４Ｍ（終濃度）のＬ−ロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．２Ｍ（終濃度）のＬ−イソロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．４Ｍ（終濃度）のＬ−イソロイシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、０．０５Ｍ（終濃度）のグリシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）、または０．２Ｍ（終濃度）のグリシンと０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ１０）を用いた。
結果を図１５に示す。疎水性アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）と塩化ナトリウムを添加した塩基性緩衝液を用いて第二の洗浄を行なうことで、第二の洗浄を行なわなかった場合やアミノ酸未添加の緩衝液（ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０））で洗浄した場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が減少した。一方、グリシンと塩化ナトリウムを添加した塩基性緩衝液を用いて第二の洗浄を行なうと、アミノ酸未添加の緩衝液（ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０））で洗浄した場合と比較し、抗体溶液中のＨＣＰ量が増加した。
本発明の精製方法は、従来のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いた抗体の精製方法と比較し、抗体の精製純度を向上させることができる。本発明の精製方法により後段の精製プロセス負荷を大きく軽減させることができるため、結果として純度の高い抗体を安価に製造することができる。
Claims (7)
- アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法であって、
前記夾雑物を洗浄する工程が、前記カラムの平衡化に用いた溶液で洗浄する第一の洗浄工程と、終濃度０．２Ｍ以上の塩化ナトリウムを含む中性または塩基性の緩衝液で洗浄する第二の洗浄工程とからなり、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体がFc結合性タンパク質を固定化した担体である、前記精製方法。 - アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法であって、
前記夾雑物を洗浄する工程が、前記カラムの平衡化に用いた溶液で洗浄する第一の洗浄工程と、終濃度０．３５Ｍから０．６Ｍの塩化ナトリウムを含む中性または塩基性の緩衝液で洗浄する第二の洗浄工程とからなり、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体がFc結合性タンパク質を固定化した担体である、前記精製方法。 - 抗体を含む溶液に対し０．２Ｍ以上となるよう塩化ナトリウムを添加後、平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加する工程を行なう、請求項１または２に記載の精製方法。
- 第二の洗浄工程で用いる緩衝液が、水溶性有機溶媒、非イオン性界面活性剤、疎水性アミノ酸、終濃度０．３Ｍ以上の尿素のうちいずれか一つ以上をさらに含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の精製方法。
- 水溶性有機溶媒がイソプロパノール、アセトニトリル、エタノールのいずれかである、請求項４に記載の精製方法。
- 疎水性アミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシンのいずれかである、請求項４に記載の精製方法。
- アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、
抗体を含む溶液に対し０．２Ｍ以上となるよう塩化ナトリウムを添加する工程と、
前記平衡化したカラムに前記抗体を含む溶液を添加する工程と、
前記カラムの平衡化に用いた溶液で前記抗体を含む溶液に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、
溶出液を用いて前記抗体を溶出させる工程とを含み、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体がFc結合性タンパク質を固定化した担体である、抗体の精製方法。
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