ES2826123T3 - Método de purificación de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un método de purificación de un anticuerpo, consistiendo el método en: (a) cargar una muestra, que comprende el anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) y tiene un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm, en una columna de intercambio catiónico equilibrada, lavar la columna de intercambio catiónico y, a continuación, eluir el anticuerpo unido a la columna con tampón de elución; (b) hacer pasar la fracción eluida de la etapa (a) a través de un filtro de múltiples capas y recoger el filtrado, en el que la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (b) se somete a inactivación vírica y se ajusta a un pH de 5,5-7,0 antes de pasarla a través del filtro de múltiples capas; y (c) hacer pasar el filtrado de la etapa (b) a través de una columna de intercambio aniónico y recoger el flujo continuo, en el que el anticuerpo tiene un punto isoeléctrico de 7-10.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de purificación de anticuerpos

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un método para purificar un anticuerpo con alta pureza y alta calidad mediante la eliminación de impurezas a través del uso secuencial de una columna de intercambio catiónico, un filtro de múltiples capas y una columna de intercambio aniónico sin utilizar una columna de proteína A que es una columna de cromatografía de afinidad, que generalmente se usa para la purificación de anticuerpos.

[Técnica anterior]

Los métodos de purificación de anticuerpos monoclonales generalmente comprenden las siguientes cuatro etapas fundamentales: (1) recolección: separación de las células hospedadoras de los productos del cultivo de fermentación; (2) captura: separación de anticuerpos de la mayoría de los componentes de los materiales recolectados purificados; (3) purificación fina: eliminación de los contaminantes y agregados restantes de la célula hospedadora; y (4) formulación: introducir los anticuerpos en vehículos adecuados para asegurar la máxima estabilidad y período de almacenamiento de los anticuerpos. Sin embargo, estas etapas no siempre producen composiciones de anticuerpos que tienen la pureza suficiente para su uso en circunstancias farmacéuticas. Por tanto, es particularmente importante tener un método para producir y purificar un anticuerpo deseado que tenga una pureza adecuada para uso farmacéutico.

La cromatografía de proteína A permite purificar los anticuerpos de forma sustancialmente completa, particularmente IgG, a partir de sobrenadantes de cultivos celulares en una sola etapa y, por lo tanto, se usa ampliamente en la producción industrial de anticuerpos. Sin embargo, una columna de cromatografía de proteína A tiene el problema de que un ligando puede filtrarse algo de la columna debido al uso repetido de la columna. Esta proteína A o fragmento de proteína A tiene afinidad por la IgG para formar un complejo con el anticuerpo de manera que contamina el anticuerpo y también es difícil de eliminar de un anticuerpo purificado. En particular, dado que la proteína A es una proteína bacteriana, puede inducir una respuesta inmunitaria no deseada y, por tanto, debe eliminarse de un anticuerpo purificado. En consecuencia, los procesos de purificación de anticuerpos mediante cromatografía de proteína A tienen el problema de que es necesario controlar y eliminar la proteína A restante en cada proceso.

Sin embargo, las grandes empresas farmacéuticas extranjeras utilizan principalmente cromatografía de proteína A para la purificación de anticuerpos, debido a que la cromatografía de proteína A puede lograr la purificación de anticuerpos de alta pureza, aunque es caro. Sin embargo, debido al problema descrito anteriormente, es necesario desarrollar un proceso capaz de sustituir la cromatografía de proteína A. Si se desarrollara un proceso de purificación de anticuerpos altamente económico capaz de sustituir la cromatografía de proteína A, podría ser muy ventajoso en términos de costes porque podría reducir el coste del proceso hasta en un 50-70 % en comparación con los procesos existentes, y también podría prevenir la contaminación por proteína A.

Sin embargo, en el desarrollo de un proceso de purificación de anticuerpos que no utiliza una columna de cromatografía de proteína A, es importante desarrollar un proceso que pueda mostrar una eficiencia de eliminación de impurezas comparable a la de un proceso que utiliza una columna de cromatografía de proteína A. En particular, los cultivos de anticuerpos producidos a partir de células animales, particularmente las células CHO, contienen, además de un anticuerpo deseado, grandes cantidades de impurezas, tales como la proteína de la célula hospedadora (PCH) y el ADN de la célula hospedadora (ACH), derivado de las células CHO, y también contiene factores de crecimiento celular. Por tanto, si un anticuerpo se va a purificar sin utilizar una columna de cromatografía de proteína A, es particularmente importante determinar la cantidad de impurezas que se pueden eliminar en una etapa inicial. Sin embargo, para desarrollar un proceso de purificación de anticuerpos que pueda dar como resultado un nivel bajo de PCH sin utilizar cromatografía de proteína A, es necesario determinar el tipo y orden de los procesos cromatográficos adecuados y desarrollar procedimientos para la optimización de los procesos, pero es difícil lograr esta determinación y desarrollo.

El documento WO2010/127069 desvela un proceso para purificar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo mediante cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico.

El documento 2006/110277 desvela un método para purificar una proteína diana de una mezcla mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inducción de carga hidrófoba.

El documento WO2007/108955 desvela un método para purificar una proteína diana a partir de una mezcla usando cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de intercambio aniónico.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar un método capaz de purificar un anticuerpo con alta pureza y alta calidad sin usar una costosa columna de cromatografía de proteína A que se usa generalmente para la purificación de anticuerpos y, como resultado, han descubierto que, cuando un sobrenadante de cultivo libre de células con pH y conductividad controlados se purifica secuencialmente mediante una columna de intercambio catiónico, un filtro de múltiples capas y una columna de intercambio aniónico, se puede preparar un agente de anticuerpos de alta calidad eliminando de manera eficiente impurezas como la proteína de la célula hospedadora (PCH), completando de esta forma la presente invención.

[Solución técnica]

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para purificar un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) cargar una muestra, que comprende el anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) y tiene un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm en una columna de intercambio catiónico equilibrada, lavar la columna de intercambio catiónico y, a continuación, eluir el anticuerpo unido a la columna con tampón de elución; (b) hacer pasar la fracción eluida de la etapa (a) a través de un filtro de múltiples capas y recoger el filtrado, en el que la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (b) se somete a inactivación vírica y se ajusta a un pH de 5,5-7,0 antes de pasarla a través del filtro de múltiples capas; y (c) hacer pasar el filtrado de la etapa (b) a través de una columna de intercambio aniónico y recoger el flujo continuo, en el que el anticuerpo tiene un punto isoeléctrico de 7-10.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo purificado mediante el método descrito anteriormente.

[Efectos ventajosos]

El uso del método de purificación de anticuerpos de acuerdo con la presente invención hace posible purificar un anticuerpo con alta pureza y alta calidad eliminando de manera efectiva impurezas tales como proteína de la célula hospedadora, sin usar una costosa columna de proteína A.

[Descripción de los dibujos]

La figura 1 muestra un perfil de elución general en cromatografía Fractogel™ EMD SO3 que se incluye tanto en el proceso B como en el proceso A de la presente invención.

La figura 2 muestra el flujo constante convencional durante los perfiles de carga y lavado en una etapa de cromatografía Q Sepharose Fast Flow™ que se incluye tanto en el proceso B como en el proceso A de la presente invención.

La figura 3 es un diagrama gráfico que muestra la reducción escalonada de PCH en el proceso B que usa un filtro de múltiples capas y el proceso A que no usa filtro de múltiples capas.

La figura 4 es un diagrama de bloques que muestra todas las etapas de un método de purificación de anticuerpos representativo de acuerdo con la presente invención.

[Mejor modo]

La presente invención proporciona un método para purificar un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) cargar una muestra, que comprende el anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) y tiene un pH de 5,5­ 7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm en una columna de intercambio catiónico, lavar la columna de intercambio catiónico y, a continuación, eluir el anticuerpo unido a la columna con tampón de elución; (b) hacer pasar la fracción eluida de la etapa (a) a través de un filtro de múltiples capas y recoger el filtrado, en el que la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (b) se somete a inactivación vírica y se ajusta a un pH de 5,5-7,0 antes de pasarla a través del filtro de múltiples capas; y (c) hacer pasar el filtrado de la etapa (b) a través de una columna de intercambio aniónico y recoger el flujo continuo, en el que el anticuerpo tiene un punto isoeléctrico de 7-10.

De acuerdo con el método de la presente invención, se puede producir un anticuerpo purificado que comprende una cantidad significativamente reducida de proteína de la célula hospedadora (PCH) a partir de una mezcla que comprende un anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) sin tener que utilizar un proceso de columna de proteína A. En el caso de que un anticuerpo deba expresarse en células hospedadoras tales como células animales y recolectarse de ellas, puede existir, además de la proteína deseada, proteína de la célula hospedadora (PCH), ADN de la célula hospedadora (ACH) y factores de crecimiento, así como isómeros (por ejemplo, isómeros ácidos e isómeros básicos del anticuerpo deseado). Por tanto, para producir un agente de anticuerpo, se requiere un proceso de purificación que elimine las impurezas para proporcionar un anticuerpo con alta pureza y alta calidad, y, particularmente, se requiere un proceso de purificación capaz de eliminar eficazmente la proteína de la célula hospedadora. Sin embargo, una columna de cromatografía de proteína A es una resina cara y, por tanto, un anticuerpo purificado usando la misma es considerablemente caro. Por este motivo, el uso de cromatografía de proteína A en experimentos o estudios que utilizan anticuerpos ha sido limitado. Por tanto, se ha requerido una tecnología capaz de purificar anticuerpos sin utilizar cromatografía de proteína A. Sin embargo, para desarrollar un proceso capaz de reducir la proteína A en un anticuerpo para permitir que el anticuerpo sea utilizado como agente farmacéutico y optimizar este proceso, es necesario determinar el tipo de columna utilizada, el orden de purificación y las condiciones optimizadas, y, por esta razón, fue difícil desarrollar realmente este proceso. En consecuencia, los presentes inventores han descubierto que, cuando se purifica un anticuerpo controlando el pH y la conductividad de un sobrenadante de cultivo de células hospedadoras que expresan el anticuerpo y aplicando el cultivo de sobrenadante controlado secuencialmente a la cromatografía de intercambio catiónico, un filtro de múltiples capas y cromatografía de intercambio aniónico, el nivel de proteína de la célula hospedadora en el anticuerpo puede reducirse significativamente incluso mediante un proceso de cromatografía en dos etapas. En función de este hallazgo, la presente invención proporciona un método para purificar un anticuerpo.

La etapa (a) en el método de la presente invención es una primera etapa de purificación para purificar una muestra que comprende el anticuerpo que se va a purificar y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) mediante una columna de intercambio catiónico para eliminar la proteína de la célula hospedadora de la muestra. De manera específica, la etapa (a) es una etapa de cargar una muestra, que comprende un anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) y tiene un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm, en una columna de intercambio catiónico equilibrada, lavar la columna de intercambio catiónico y eluir el anticuerpo, unido a la columna, con tampón de elución.

Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra que comprende un anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora" significa un sobrenadante de cultivo de células que producen el anticuerpo, un lisado de las células o una muestra parcialmente purificada de las mismas, que comprende el anticuerpo deseado a purificar y la proteína de la célula hospedadora. Como se usa en el presente documento, la expresión "parcialmente purificado" significa un estado en el que están presentes otras proteínas además del anticuerpo a purificar, incluso después de realizado el proceso de purificación.

En el presente documento, la muestra puede ser una controlada para que tenga un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm con el fin de eliminar eficazmente la proteína de la célula hospedadora de la misma de acuerdo con el método de la presente invención. Si una muestra que tiene dicho pH y conductividad se aplica a la cromatografía de intercambio catiónico, la proteína a purificar se puede adsorber fácilmente en la columna de intercambio catiónico, mientras que las impurezas, tales como la proteína de la célula hospedadora, pueden liberarse por flujo constante durante la carga o pueden unirse débil o inespecíficamente a la resina de intercambio catiónico para eliminarse fácilmente en una etapa de lavado.

Como se usa en el presente documento, el término "conductividad" significa la capacidad de una solución acuosa para hacer pasar corriente eléctrica entre dos electrodos. En una solución, la corriente eléctrica fluye por transporte de iones. Por tanto, si aumenta la cantidad de iones en una solución acuosa, la solución tendrá una conductividad iónica aumentada. Debido a que la conductividad eléctrica significa la capacidad de los iones en una solución para transportar corriente eléctrica, la conductividad de la solución se puede cambiar cambiando la concentración de iones de la solución. Por ejemplo, para obtener la conductividad deseada, la concentración de tampón y/o sal (por ejemplo, cloruro de sodio, acetato de sodio o cloruro de potasio) en una solución se puede cambiar. Preferentemente, la conductividad deseada se puede obtener cambiando la concentración de sal de varios tampones.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una sustancia que se produce mediante la estimulación de un antígeno en el sistema inmunológico y que se une específicamente a un antígeno específico para provocar una reacción antígeno-anticuerpo en los linfocitos y la sangre. Para los fines de la presente invención, el anticuerpo es una proteína que debe purificarse con alta pureza y alta calidad y puede purificarse eficazmente de acuerdo con el método de la presente invención.

En particular, un grupo de anticuerpos purificado por el método de la presente invención está compuesto por anticuerpos obtenidos del mismo grupo, pero puede incluir anticuerpos que tienen una mutación de origen natural, que puede estar presente en cantidades muy pequeñas. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" también pretende incluir un grupo de anticuerpos que incluye uno o más anticuerpos.

El anticuerpo generalmente tiene un alto punto isoeléctrico en comparación con otras proteínas y, por lo tanto, cuando un sobrenadante de cultivo se adsorbe en una columna de resina de intercambio catiónico y se eluye, el anticuerpo puede purificarse principalmente con una pureza relativamente alta. Como se usa en el presente documento, el término "punto isoeléctrico (pI)" significa el pH al cual la carga neta promedio de la superficie de la molécula de proteína, es decir, el potencial de la doble capa eléctrica de la molécula de proteína, es 0. En otras palabras, el término significa el punto en el que el grupo de proteínas se disocia para que el número de cationes y aniones sea igual y, por lo tanto, la carga neta de la proteína sea 0. Un anticuerpo que puede purificarse eficazmente mediante el método de la presente invención puede tener, preferentemente, un punto isoeléctrico de 6-11, y, más preferentemente, 7-10, pero sin limitaciones. Los anticuerpos que pueden purificarse eficazmente mediante el método de la presente invención mientras tienen el punto isoeléctrico descrito anteriormente incluyen, pero sin limitaciones, el anticuerpo Bevacizumab que está dirigido al VEGF-A (factor de crecimiento endotelial vascular A) y el anticuerpo Adalimumab, que está dirigido al TNF-a, así como todos los anticuerpos terapéuticos que se usan generalmente en la técnica mientras tienen el punto isoeléctrico descrito anteriormente. En un ejemplo de la presente invención, se demostró que, cuando se utilizó el método de la invención que comprende un proceso de columna de dos etapas y una etapa de filtración por múltiples capas, La PCH podría reducirse a 1,0 ppm para Bevacizumab y 0,38 ppm para Adalimumab (Ejemplos 3 y 4).

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de la célula hospedadora (PCH)" significa una proteína diferente del anticuerpo, que es una proteína derivada de una fuente para la producción de anticuerpos, es decir, células hospedadoras. En un anticuerpo que puede usarse como fármaco, preferentemente, la PCH se elimina del agente de anticuerpo original. Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de la célula hospedadora que se elimina" pretende incluir todas las impurezas, excluyendo el anticuerpo que se va a purificar, incluyendo, además de la propia proteína de la célula hospedadora, el ADN y los factores de crecimiento celular derivados de las células hospedadoras. Por tanto, cuando se elimina la proteína de la célula hospedadora, la pureza del anticuerpo se puede incrementar significativamente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cromatografía de intercambio catiónico" significa cromatografía que utiliza una columna empaquetada con resina de intercambio catiónico. En la etapa (a), impurezas, particularmente la proteína de la célula hospedadora, puede eliminarse realizando una cromatografía de intercambio catiónico. La resina de intercambio catiónico es una resina sintética que intercambia sus cationes con cationes de una solución acuosa y el anticuerpo tiene un alto punto isoeléctrico y, por lo tanto, se vuelve catiónico en un tampón de pH que tiene un punto isoeléctrico más bajo que el del anticuerpo. Por tanto, de acuerdo con el método de la presente invención, la eficacia de la purificación del anticuerpo puede aumentarse utilizando la resina de intercambio catiónico capaz de adsorber el anticuerpo catiónico. En particular, la eficacia de la purificación del anticuerpo se puede incrementar aún más cargando una muestra que tenga un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm en la resina de intercambio catiónico.

De acuerdo con la presente invención, cuando se carga una muestra que comprende el anticuerpo que se va purificar y la proteína de la célula hospedadora en la resina de intercambio catiónico, el anticuerpo se une a la resina de intercambio catiónico y las impurezas, incluida la proteína de la célula hospedadora, pasan a través de la columna (cromatografía de flujo continuo) sin unirse o uniéndose solo débilmente a la columna. Por tanto, el anticuerpo que se va a purificar se puede obtener cargando la muestra en la resina de intercambio catiónico, tratando la columna con tampón de lavado para eliminar la proteína de la célula hospedadora unida débilmente a la columna y, a continuación, tratando la columna con tampón de elución.

La resina de intercambio catiónico que se usa en la presente invención puede ser una que se use generalmente en la técnica. Preferentemente, puede tener un grupo funcional como carboximetil (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) o sulfonato (S), pero sin limitaciones. Más preferentemente, puede tener carboxilato (COO-) o sulfonato (SO3) como grupo funcional. Como resina de intercambio catiónico que tiene un grupo sulfonato como grupo funcional, se puede usar Fractogel™ EMD SO3, pero sin limitaciones.

Un método para purificar un anticuerpo usando Fractogel™ EMD SO3 como la resina de intercambio catiónico puede comprender, preferentemente, la etapa de: (i) cargar una muestra que comprende el anticuerpo en una columna Fractogel™ EMD SO3 equilibrada con un tampón de equilibrio que comprende fosfato 10-50 mM (pH 5,5-7,0); (ii) lavar la columna con un tampón que comprende cloruro de sodio 20-40 mM y fosfato 10-50 mM (pH 6,0-7,0); y (iii) eluir el anticuerpo con un tampón de elución que comprende cloruro de sodio 50-200 mM y fosfato 10-50 mM (pH 6,0-7,0).

El contenido de proteína de la célula hospedadora (PCH) en la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) puede ser menor que el de la muestra cargada en un 90-99,9 %, preferentemente 95-99,5 %.

En un ejemplo de la presente invención, se demostró que la tasa de reducción de PCH fue de aproximadamente 99,3 % para el anticuerpo Bevacizumab (Ejemplo 3) y de aproximadamente 98,8 % para el anticuerpo Adalimumab (Ejemplo 4).

La etapa (b) en el método de la presente invención es una segunda etapa de purificación para eliminar la proteína de la célula hospedadora pasando la fracción eluida de la etapa (a) a través de un filtro de múltiples capas y recolectando el filtrado.

La segunda etapa de purificación se realiza para aumentar aún más la pureza del anticuerpo mediante la eliminación de impurezas, incluida la proteína de la célula hospedadora, que no se eliminaron en la primera etapa de purificación. En esta etapa, la proteína de la célula hospedadora se puede eliminar de forma más eficaz utilizando un dispositivo de filtración capaz de eliminar la proteína de la célula hospedadora mediante cargas electrostáticas y reacciones hidrófobas de acuerdo con un mecanismo de separación diferente al de la columna de intercambio catiónico de la primera etapa de purificación.

Esta fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) que se inyecta en el filtro de múltiples capas incluye la propia fracción eluida de anticuerpo resultante de la etapa (a) o una forma obtenida procesando la fracción eluida. Por ejemplo, la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) que se usa en la etapa (b) de la presente invención puede someterse a inactivación vírica antes de pasarla a través del filtro de múltiples capas.

En el presente documento, la inactivación vírica incluye la inactivación del virus comprendido en la fracción eluida o la eliminación del virus de la fracción eluida.

Los métodos para inactivar o eliminar el virus incluyen, pero sin limitaciones, métodos de inactivación por calor, de inactivación por pH y de inactivación química. Preferentemente, se puede utilizar el método de inactivación por pH. El método de inactivación por pH es un método para tratar la fracción eluida a un pH en el que el virus en la fracción eluida puede inactivarse suficientemente. Este método de inactivación por pH incluye un método de inactivación vírica a pH bajo, que se puede realizar titulando la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) a un pH de 3,0-4,0, preferentemente 3,8, pero sin limitaciones.

Además, la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) puede ajustarse a un pH de 5,5-7,0, preferentemente 6,0, después de la etapa de inactivación vírica, pero antes de su paso por el filtro de múltiples capas, pero sin limitaciones.

En el presente documento, el pH de la fracción eluida de anticuerpo se puede ajustar usando un tampón. El tampón que se usa en el presente documento puede ser, preferentemente, tampón bis-Tris o fosfato, y, más preferentemente, tampón Bis-Tris, pero sin limitaciones.

Además, es preferible ajustar el pH o la conductividad de la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a) antes de pasar la fracción eluida a través del filtro de múltiples capas. En este caso, la fracción eluida de anticuerpo se puede ajustar a un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 1,2-10 mS/cm, preferentemente 1,3-5 mS/cm.

Como se usa en el presente documento, la expresión "filtro de múltiples capas" significa un dispositivo de filtración que comprende tierra de diatomeas. Este filtro de múltiples capas puede estar compuesto por una serie de filtros apilados que tienen tamaños de poros que disminuyen gradualmente y pueden tener una estructura de matriz tridimensional, tal como un laberinto. Los ejemplos del mecanismo de acción de este filtro de múltiples capas incluyen, pero sin limitaciones, un mecanismo en el que el filtro de múltiples capas es catiónico y, por lo tanto, se une a sustancias aniónicas como el ADN y la proteína de la célula hospedadora, eliminando así eficazmente la proteína de la célula hospedadora. El filtro de múltiples capas que se usa en la presente invención puede ser uno que se use generalmente en la técnica. Preferentemente puede ser X0HC, A1HC (Millipore) o similares, y, más preferentemente, X0HC, pero sin limitaciones.

La cantidad de proteína de la célula hospedadora (PCH) en la fracción eluida de anticuerpo obtenida a través de este proceso de filtración de múltiples capas puede ser, preferentemente, de 1.200-2.500 veces menor que la de la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (a).

En un ejemplo de la presente invención, se demostró que el contenido de PCH se redujo a 2,2 ppm (aproximadamente 1/2.200) para el anticuerpo Bevacizumab (Ejemplo 3) y 6,58 ppm (aproximadamente 1/1.400) para el anticuerpo Adalimumab (Ejemplo 4).

La etapa (c) en el método de la presente invención es una etapa de eliminación de la proteína de la célula hospedadora usando una columna de intercambio aniónico. De manera específica, la etapa (c) es una tercera etapa de purificación que consiste en hacer pasar el filtrado de la etapa (b) a través de una columna de intercambio aniónico y recoger el flujo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cromatografía de intercambio aniónico" significa cromatografía que emplea una columna empaquetada con resina de intercambio aniónico. En esta etapa, impurezas, particularmente la proteína de la célula hospedadora, puede eliminarse realizando una cromatografía de intercambio aniónico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "resina de intercambio aniónico" significa una resina sintética que intercambia sus aniones con los aniones de una solución acuosa. La columna de intercambio aniónico puede adsorber una proteína que se vuelve aniónica por encima del punto isoeléctrico. El anticuerpo tiene un alto punto isoeléctrico y, por lo tanto, cuando se usa un tampón de pH neutro, el anticuerpo pasa a través de la columna sin unirse a la resina de intercambio aniónico. Sin embargo, las impurezas, incluida la proteína de la célula hospedadora, tienen un punto isoeléctrico bajo y, por tanto, pueden eliminarse por adsorción sobre la resina de intercambio aniónico. En consecuencia, usando este principio, se puede realizar la tercera etapa de purificación.

La resina de intercambio aniónico que se usa en la presente invención puede ser una que se use generalmente en la técnica. preferentemente puede ser Q Sepharose, aminoetilo cuaternario o amina cuaternaria (Q), y, más preferentemente, Q Fast Flow™, pero sin limitaciones.

En la cromatografía de intercambio aniónico que utiliza Q Fast Flow™, se puede usar tampón Bis-Tris o tampón fosfato como tampón de equilibrio. En un ejemplo de la presente invención, Se usó Q Fast Flow™ como resina de intercambio aniónico y se usó tampón Bis-Tris como tampón de equilibrio (Ejemplo 1-4).

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de la célula hospedadora que se elimina" pretende incluir todas las impurezas, excluyendo el anticuerpo que se va a purificar, incluyendo, además de la propia proteína de la célula hospedadora, el ADN y los factores de crecimiento celular derivados de las células hospedadoras. Por tanto, cuando se elimina la proteína de la célula hospedadora, el anticuerpo que se va a purificar se puede purificar con alta pureza.

Además, la columna de intercambio aniónico es eficaz para la eliminación no solo de la proteína de la célula hospedadora, sino también de endotoxinas. Por tanto, tiene la ventaja de que puede eliminar la endotoxina junto con la proteína de la célula hospedadora en la etapa final de purificación, purificando así el anticuerpo deseado con alta pureza.

Mediante el método de purificación de anticuerpos que comprende las etapas (a) a (c) de la presente invención, es decir, el proceso de columna de dos etapas, un anticuerpo del cual las impurezas, particularmente la proteína de la célula hospedadora, se han eliminado de manera eficiente, se puede purificar con alta pureza y alto rendimiento.

El contenido de proteína de la célula hospedadora en el anticuerpo después de la etapa final de purificación puede ser, preferentemente, de 0,001-10 ppm y, más preferentemente, de 0,01-5 ppm. En un ejemplo de la presente invención, se demostró que el contenido de proteína de la célula hospedadora se redujo a menos de 5.000 ppm después de la primera etapa de purificación, menos de 5 ppm después de la segunda etapa de purificación, y menos de 1,0 ppm después de la tercera etapa de purificación (Ejemplo 3). En particular, se descubrió que el anticuerpo Adalimumab podía mostrar un contenido de PCH de 0,38 ppm incluso en solo tres etapas (etapa de columna de intercambio catiónico, etapa de filtro de múltiples capas y etapa de columna de intercambio aniónico), lo que sugiere que el método de la presente invención tiene un efecto excelente (Ejemplo 3). Por tanto, el método de la presente invención muestra un efecto de purificación del anticuerpo con una pureza del 99,9 % o superior, lo que indica que el método de la presente invención puede usarse ventajosamente para la purificación de anticuerpos.

Además, el método de la presente invención puede proporcionar un anticuerpo con una pureza deseada incluso solo mediante el proceso de columna de dos etapas (columna de intercambio catiónico ^ filtro de múltiples capas ^ columna de intercambio aniónico), pero puede comprender una etapa de purificación adicional. De manera específica, los ejemplos del proceso de purificación adicional que se pueden realizar antes, después o durante el proceso de cromatografía de intercambio iónico incluyen fraccionamiento en cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH), precipitación en etanol, precipitación en sulfato amónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad (usando, por ejemplo, proteína A, proteína G, sustrato específico de anticuerpos, ligando 0 antígeno como reactivo de captura).

Modo de la invención

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle con referencia a ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son para fines ilustrativos y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Método de purificación de bevacizumab mediante columna de intercambio iónico de dos etapas: proceso A

Ejemplo 1-1: Etapa de pretratamiento

Se cultivaron células CHO recombinantes que expresan el anticuerpo Bevacizumab para expresar el anticuerpo Bevacizumab. A continuación, para adsorber el anticuerpo en una columna de intercambio catiónico, se añadió tampón de glicina HCl 1 M (pH 3,0) al sobrenadante del cultivo para ajustar el pH a 6,0 y la conductividad a 6,5 mS/cm.

Ejemplo 1-2: Cromatografía en columna de intercambio catiónico

En este ejemplo, la columna Fractogel™ EMD SO3 se utilizó como columna de intercambio catiónico y la cromatografía en columna de intercambio catiónico se realizó de la siguiente manera.

Para el equilibrio, la columna se equilibró con tampón fosfato 20 mM (pH 6,0) y el sobrenadante pretratado del Ejemplo 1 se cargó en la columna en una cantidad igual o menor que la capacidad de adsorción de SO3. La cantidad de carga fue de 30 g o menos de proteína por litro de resina y la velocidad de carga fue de 150 cm/h.

Tras la carga, la columna se lavó una vez con tampón fosfato 20 mM (pH 6,0), se lavó con tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) que comprendía cloruro de sodio 30 mM, y, a continuación, se eluyó con tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) que comprendía cloruro de sodio 60 mM, obteniendo así una fracción eluida primaria.

Ejemplo 1-3: Inactivación y equilibrio víricas

A la fracción eluida primaria obtenida en el Ejemplo 1-2, se le añadió tampón de glicina-HCl 1 M (pH 3,0) y, a continuación, la solución se sometió a inactivación vírica a un pH de 3,8 durante 1 hora. Una vez completada la inactivación vírica, la solución se filtró a través de un filtro de 0,2 pm y, después, se ajustó el pH de la muestra a 6,0 añadiendo tampón Tris-HCl 1 M (pH 9,0) a la misma. La muestra después de la inactivación vírica se sustituyó por tampón Bis-Tris 20 mM (pH 6,0).

Ejemplo 1-4: Cromatografía en columna de intercambio aniónico

Una columna de intercambio aniónico adsorbe una proteína que se vuelve aniónica por encima de su punto isoeléctrico. Por tanto, cuando se utiliza un tampón de pH neutro, un anticuerpo que tiene un punto isoeléctrico de 7 o más (8,3 para Bevacizumab) fluirá a través de la columna sin unirse a la resina de intercambio aniónico. En consecuencia, para determinar una resina de intercambio aniónico y las condiciones del tampón adecuadas para su uso en el proceso de purificación de la presente invención, se realizó el siguiente experimento.

De manera específica, en este Ejemplo, se usó la serie de amina cuaternaria Q Sepharose™ Fast Flow que se usa con frecuencia en la escala de producción como resina de intercambio aniónico para realizar la purificación.

En primer lugar, la muestra para cargar en la resina de intercambio aniónico se ajustó a un pH de 6,0 y una conductividad de 1,4 mS/cm mediante sustitución con tampón de equilibrio Bis-Tris 20 mM (pH 6,0), después de la cromatografía en columna de intercambio catiónico del sobrenadante del cultivo, se realizaron inactivación vírica y la primera ultrafiltración como se describe en el ejemplo anterior.

La cantidad de carga fue de 30 g o menos de proteína por litro de resina y la velocidad de carga y elución fue de 150 cm/h. Cuando la absorbancia a 280 nm aumentó, se recogió la fracción de flujo constante de la columna. La columna se regeneró con NaCl 1 M y luego se equilibró con tampón de equilibrio.

El proceso A como se ha descrito anteriormente se resume en la Tabla 1 que se expone a continuación.

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Ejemplo 2: Método de purificación de bevacizumab con filtro de múltiples capas - proceso B

La etapa de pretratamiento, la cromatografía en columna de intercambio catiónico y la etapa de inactivación/equilibrio viral en el proceso B fueron como se describen en los Ejemplos 1-1 a 1-3.

Ejemplo 2-1: Filtración en múltiples capas (filtrado en profundidad)

Un filtro de múltiples capas puede reducir las cantidades de ADN de la célula hospedadora (ACH), proteína de la célula hospedadora (PCH) y similares por sus propiedades electrostáticas. En consecuencia, se preparó un filtro de múltiples capas de tipo XOHC y se equilibró con agua destilada triple y tampón Bis-Tris 20 mM (pH 6,0). A continuación, la muestra con inactivación de virus se sustituyó con tampón Bis-Tris 20 mM (pH 6,0) como se describe en el Ejemplo 1­ 4 y, a continuación, se filtró a través del filtro de múltiples capas a un caudal de 100 LMH (litros/m2/hora). La muestra filtrada se recogió y se sometió a cromatografía en columna de intercambio aniónico como se describe en el Ejemplo 2-2 a continuación.

Ejemplo 2-2: Cromatografía en columna de intercambio aniónico

La cromatografía en columna de intercambio aniónico es como se describe en el Ejemplo 1-4 anterior. Sin embargo, la muestra se cargó en la columna de cromatografía de columna aniónica, después de la cromatografía en columna de intercambio catiónico del sobrenadante del cultivo, la inactivación vírica, la primera ultrafiltración y la filtración a través del filtro de múltiples capas se realizaron como se ha descrito anteriormente.

En el presente documento, la cantidad de carga fue de 30 g o menos por litro de resina y la velocidad de carga y elución fue de 150 cm/h. Cuando la absorbancia a 280 nm aumentó, se recogió la fracción de flujo constante de la columna. La columna se regeneró con NaCl 1 M y luego se equilibró con tampón de equilibrio.

El proceso B como se ha descrito anteriormente se resume en la Tabla 2 a continuación.

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Ejemplo 3: Detección y comparación de las proteínas de la célula hospedadora (PCH)

Para medir la concentración de proteína de la célula hospedadora (PCH) en la muestra de anticuerpo obtenida en los ejemplos descritos anteriormente, se utilizó el método ELISA de PCH.

De manera específica, de acuerdo con el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el antígeno de PCH que comprende la muestra de anticuerpo se unió al anticuerpo primario inmovilizado. A continuación, se bloquearon las regiones inespecíficas con caseína. A continuación, la muestra se incubó mientras la molécula de antígeno era capturada por el anticuerpo primario. A continuación, se añadió a la misma anticuerpo secundario conjugado con HRP (peroxidasa de rábano picante) y se fijó al antígeno (proteína de la célula hospedadora CHO). Se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) a la muestra para desarrollar un color y, a continuación, se añadió ácido sulfúrico para detener la reacción. El color de la solución de reacción cambió a amarillo. La intensidad del color fue directamente proporcional a la cantidad de antígeno unido al pocillo.

El contenido de proteína de la célula hospedadora se midió mediante ELISA de PCH como se HA descrito anteriormente y los datos se expresaron en ng de PCH/mg (ppm) (Tabla 3).

En el caso del proceso A, un contenido de PCH de 671.922,5 ppm antes de la carga en la columna de intercambio catiónico se redujo a 4.791,2 ppm (aproximadamente 1/140) después de la purificación mediante la columna de intercambio catiónico. A continuación, el contenido de PCH se redujo a 61,4 ppm (aproximadamente 1/75) después de la purificación mediante la columna de intercambio aniónico.

En el caso del proceso B, el contenido de PCH se redujo a aproximadamente 1/670.000. De manera específica, en la etapa de cromatografía de intercambio de columna catiónica, el contenido de PCH se redujo a 1/140 y en la etapa de filtro de múltiples capas que sigue a la etapa de cromatografía de intercambio de columna catiónica, el contenido de PCH se redujo a 1/2.100 en comparación con el de la fracción eluida primaria. En la etapa final de cromatografía en columna de intercambio aniónico, el contenido de PCH se redujo a aproximadamente 1/2.

Se pudo ver que, en comparación con el proceso A que redujo el contenido de PCH a aproximadamente 1/11.000, el proceso B redujo mucho más el contenido de PCH porque se realizó la etapa de filtrado en múltiples capas.

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Ejemplo 4: Purificación de Adalimumab

Con el fin de purificar el anticuerpo Adalimumab de una mezcla de Adalimumab y proteína de la célula hospedadora (PCH), se añadió un tampón a un sobrenadante de cultivo sin células para ajustar el pH y la conductividad del sobrenadante y se filtró el sobrenadante para preparar una muestra para cargar en una columna de intercambio catiónico. A continuación, la muestra se sometió a las etapas de filtrado en múltiples capas y de cromatografía en columna de intercambio aniónico de la misma manera que se describe en el Ejemplo 2. Se recogió una muestra del proceso de purificación de Adalimumab y se analizó el contenido de PCH en la muestra recogida. Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 4 que se expone a continuación. Cuando se utilizó el proceso de la invención que comprende la etapa de filtrado en múltiples capas para purificar Adalimumab, el contenido de PCH pudo reducirse a aproximadamente 1/2.000.000.

Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones ilustrativas particulares, los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención pueden entender que la presente invención puede realizarse en otras formas específicas sin apartarse del espíritu técnico o las características esenciales de la presente invención. Por tanto, las realizaciones descritas anteriormente se consideran ilustrativas en todos los aspectos y no restrictivas. Adicionalmente, debe entenderse que todas las modificaciones o variaciones derivadas de los significados y alcance de la presente invención y sus equivalentes están incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un método de purificación de un anticuerpo, consistiendo el método en:

(a) cargar una muestra, que comprende el anticuerpo y al menos una proteína de la célula hospedadora (PCH) y tiene un pH de 5,5-7,0 y una conductividad de 5-7 mS/cm, en una columna de intercambio catiónico equilibrada, lavar la columna de intercambio catiónico y, a continuación, eluir el anticuerpo unido a la columna con tampón de elución;

(b) hacer pasar la fracción eluida de la etapa (a) a través de un filtro de múltiples capas y recoger el filtrado, en el que la fracción eluida de anticuerpo de la etapa (b) se somete a inactivación vírica y se ajusta a un pH de 5,5-7,0 antes de pasarla a través del filtro de múltiples capas; y

(c) hacer pasar el filtrado de la etapa (b) a través de una columna de intercambio aniónico y recoger el flujo continuo, en el que el anticuerpo tiene un punto isoeléctrico de 7-10.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es Bevacizumab o Adalimumab.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la columna de intercambio catiónico tiene un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la columna de intercambio catiónico que tiene sulfonato como grupo funcional es Fractogel™ EMD SO3.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la etapa (a) consiste en: (i) cargar la muestra que comprende el anticuerpo en una columna Fractogel™ EMD SO3 equilibrada con un tampón de equilibrio que comprende fosfato 10-50 mM (pH 5,5-7,0); (ii) lavar la columna con un tampón que comprende cloruro de sodio 20-40 mM y fosfato 10­ 50 mM (pH 6,0-7,0); y (iii) eluir el anticuerpo con un tampón de elución que comprende cloruro de sodio 50-200 mM y fosfato 10-50 mM (pH 6,0-7,0).

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el filtro de múltiples capas es A1HC o XOHC.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la columna de intercambio aniónico en la etapa (c) es Q Fast Flow™.