TW202120522A - 使用吸附劑之抗體之純化方法 - Google Patents

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江島康成
石原尚
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日商協和麒麟股份有限公司
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Abstract

本發明之目的在於：作為以低於先前技術之成本進行抗體製造之方法，提供一種使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式來純化抗體之方法；包括該純化方法之抗體之製造方法、及藉由該製造方法所製造之抗體等。本發明係關於一種使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，以非吸附模式對抗體進行純化之方法、包括該純化方法之抗體之製造方法、及藉由該製造方法所製造之抗體。

Description

使用吸附劑之抗體之純化方法
本發明係關於一種抗體之純化方法及包括該純化方法之抗體之製造方法。
由於基因重組技術發達，故開始供給以各種蛋白質作為有效成分之醫藥品。尤其是近年來開發並售賣有大量以抗體作為有效成分之醫藥品。又，對於生物醫藥品產業而言，大量且高效率地製造該等蛋白質成為越來越重要之問題。
此類蛋白質一般而言，係藉由培養插入有包含編碼目標蛋白質之基因之載體的重組細胞而產生。於該培養液中，除了目標蛋白質以外，還包含多種多樣之來自培養基之成分、來自宿主細胞之成分或來自蛋白質之副生成物等雜質，因此同時實現分離雜質並將目標蛋白質純化至作為醫藥品所要求之純度；及大量且高效率地製造目標蛋白質會十分困難且具有挑戰性。
蛋白質之純化方法一般而言以不同模式之層析法之組合來進行。層析法例如基於分子之電荷、親水性或大小等之不同來將目標蛋白質與雜質分離。
尤其是於目標蛋白質為抗體之情形時，純化製程大多包括使用蛋白A之捕獲步驟及其後之精純步驟。精純步驟係出於如下目的而進行，即去除捕獲步驟後之純化中間物中所含之來自宿主細胞之成分或來自抗體之聚合物(高分子量物種(High Molecular Weight Species)，以下亦記為HMWS)等來自抗體之副生成物、所漏出之蛋白A等雜質。於精純步驟中，進行陽離子交換層析法(cation exchange chromatography，CEX)、陰離子交換層析法(anion exchange chromatography，AEX)、疏水性相互作用層析法(hydrophobic interacton chromatography，HIC)及羥磷灰石層析法等管柱層析法純化。
不同之物質及層析法條件，對管柱載體之吸附性會有所不同，該等管柱層析法係利用此情況。於目標抗體吸附於管柱載體之情形時，於使抗體吸附於管柱載體後對管柱進行洗淨，藉此去除未吸附於管柱載體之物質，之後使導電率或pH變化而使抗體溶出。此種方式之管柱層析法稱為吸附脫附方式。另一方面，於目標抗體未吸附於管柱載體之情形時，使包含抗體與雜質之溶液通過管柱，藉此可去除吸附於管柱載體之物質。此種方式之管柱層析法稱為非吸附(滲濾)方式。非吸附方式與吸附脫附方式相比，可以較高載量進行純化，而且操作簡便(非專利文獻1)。一般而言AEX或HIC係以非吸附方式進行。又，利用CEX之抗體之純化係以吸附脫附方式進行。但是，已知有藉由控制pH及導電率，而以非吸附方式進行CEX之方法(專利文獻1)。
藉由該等管柱層析法所去除之雜質之種類係依層析法載體不同而不同。例如HMWS係藉由CEX或HIC來去除。來自宿主細胞之雜質係藉由AEX、HIC或CEX來去除(非專利文獻1)。
活性白土及矽酸鋁係氧化鋁及二氧化矽以任意比率結合而成之無機化合物。該等為多孔質且具有優異之吸附特性，作為來自天然物之經濟性素材，主要用於植物油之色素之去除、工業用之脫水、焚燒場中之二氧雜環己烯等之吸附。又，沸石係結晶性鋁矽酸鹽之總稱，其特徵在於細孔直徑均一且具有陽離子交換性。
沸石具有吸附蛋白質等生物體高分子之性質，因此正被研究用作層析法載體。已知含有所吸附之生物體高分子之試樣之pH值會影響吸附，於生物體高分子之等電點(pI)附近吸附成為最大(非專利文獻2)。
沸石之矽/鋁比(Si/Al2 ratio)或三維結構係根據製造方法有所不同，其結果為，導致疏水性及離子交換性等性質亦不同。已知不同沸石可吸附之生物體高分子會有所不同(非專利文獻2)。
作為抗體純化方法，已知使用沸石A或沸石X，自2種蛋白質之混合樣本純化IgG之方法(非專利文獻3、4)。該等係使抗體吸附於沸石，在去除雜質後使抗體溶出之方法。
然而，並不知曉就載體使用沸石之以非吸附方式來純化抗體之方法，而且，於重組蛋白質醫藥品或抗體醫藥品之工業性製造步驟中，並無將沸石用作純化基材之報告例。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特表2010-528076號公報 非專利文獻
非專利文獻1：A. A. Shukla et al. Journal of Chromatography B 2007, 848, 28-39 非專利文獻2：M. Matsui et al. Chemistry-European Journal 2001, 7 (7), 1555-1560 非專利文獻3：Y. C. Huang et al. Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 564-569 非專利文獻4：Y. C. Yu et al. Biotechnol. Prog. 1998, 14, 332-337
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於：作為以低於先前技術之成本進行抗體製造之方法，提供一種使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式來純化抗體之方法、包括該純化方法之抗體之製造方法、及藉由該製造方法所製造之抗體等。 [解決問題之技術手段]
本發明者為了解決上述課題而進行了銳意研究，結果令人吃驚的是，發現了具經濟性之使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式將抗體與雜質分離而純化抗體之方法，從而完成了本發明。
本發明係關於以下[1]～[22]。 [1]一種抗體之純化方法，其係使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式將抗體與雜質分離，而獲得雜質含量得到降低之抗體。 [2]如[1]記載之純化方法，其中抗體為基因重組抗體。 [3]如[1]或[2]記載之純化方法，其中雜質為選自宿主細胞蛋白質、來自抗體之聚合物、來自抗體之分解物及DNA中之至少1者。 [4]如[1]或[2]記載之純化方法，其中雜質為來自抗體之聚合物。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為活性白土、矽酸鋁或沸石。 [6]如[1]至[5]中任一項記載之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為矽酸鋁。 [7]如[6]記載之純化方法，其中矽酸鋁具有選自以下(i)～(iv)中之至少任一種特性： (i)比表面積為300～800 m2 /g； (ii)細孔容積為0.1～0.5 mL/g； (iii)平均細孔直徑為1.5～4 nm； (iv)二氧化矽/氧化鋁比為1～5。 [8]如[6]或[7]記載之純化方法，其中矽酸鋁為Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)或Neobead SA(水澤化學工業股份有限公司，Neobead為註冊商標)。 [9]如[1]至[5]中任一項記載之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物係活性白土。 [10]如[9]記載之純化方法，其中活性白土具有選自以下之(i)～(iv)中之至少任一種特性： (i)比表面積為100～400 m2 /g； (ii)細孔容積為0.2～0.6 mL/g； (iii)平均細孔直徑為3～10 nm； (iv)二氧化矽/氧化鋁比為6～10。 [11]如[9]或[10]記載之純化方法，其中矽酸鋁係Galleon Earth NVZ、Galleon Earth NV、Galleon Earth V2R或Galleon Earth V2(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)。 [12]如[1]至[5]中任一項記載之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為沸石。 [13]如[12]記載之純化方法，其中沸石具有選自以下(i)～(iii)中之至少任一種特性： (i)比表面積為100～800 m2 /g； (ii)細孔直徑為0.2～1 nm； (iii)二氧化矽/氧化鋁比為2～1500。 [14]如[12]或[13]記載之純化方法，其中沸石係β型或絲光沸石型之沸石。 [15]如[12]至[14]中任一項記載之純化方法，其中沸石包含作為抗衡陽離子之質子。 [16]如[1]至[15]中任一項記載之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值4～9下進行。 [17]如[1]至[15]中任一項記載之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值6～9下進行。 [18]如[1]至[15]中任一項記載之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值7.5～8.5下進行。 [19]如[1]至[18]中任一項記載之純化方法，其包括利用緩衝液對包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物進行平衡化作為預處理。 [20]一種抗體之製造方法，其包括如[1]至[19]中任一項記載之純化方法。 [21]如[20]記載之製造方法，其包含蛋白A層析法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、混合模式層析法及活性碳層析法中之至少任一者。 [22]一種抗體，其藉由如[20]或[21]記載之製造方法所製造。 [發明之效果]
根據本發明，作為以低於先前技術之成本進行抗體製造之方法，提供一種使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式純化抗體之方法、包括該純化方法之抗體之製造方法、及藉由該製造方法所製造之抗體等。
本發明係關於一種純化方法，其係抗體之純化方法，該純化方法係使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式將抗體與雜質分離，而獲得雜質含量得以降低之抗體。
作為抗體，例如可例舉：小鼠抗體、美洲駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或改變該等之Fc區域等而成之抗體等。作為抗體之分子型，例如可例舉：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Fab、Fc、Fc-融合蛋白、VH、VL、VHH、Fab'2 、scFv、scFab、scDb或scDbFc等。
於本發明之純化方法中，供給包含目標抗體及雜質之含抗體水溶液。
作為含抗體水溶液，例如可例舉：血漿、血清、乳或尿等自生物體所得之組合物；使用基因重組技術或細胞融合技術所得之生產抗體之細胞或大腸桿菌等菌類之培養液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲等所得之組合物；或使用無細胞蛋白質合成技術所得之組合物等。
作為生產抗體之細胞，例如可例舉於宿主細胞中組入編碼所需抗體之基因而成之轉形細胞等。
作為宿主細胞，例如可例舉動物細胞、植物細胞或酵母細胞等細胞株。
具體而言，例如可例舉：中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、作為小鼠骨髓瘤細胞之NS0細胞、SP2/0細胞、作為大鼠骨髓瘤細胞之YB2/0細胞、IR983F細胞、作為來自敍利亞倉鼠腎臟之細胞之BHK細胞、作為人類骨髓瘤細胞之人Burkitt's淋巴瘤細胞、胚胎幹細胞、或受精卵細胞等。
作為培養生產抗體之細胞之培養基，只要為適於培養各種細胞之培養基，則可使用任一種，例如作為培養動物細胞之培養基，可使用通常動物細胞之培養所使用之培養基。例如含血清之培養基、不含血清白蛋白或血清分離物等來自動物之成分之培養基、無血清培養基、或無蛋白培養基等任一種培養基，但可較佳地使用無血清培養基或無蛋白培養基。
具體而言，例如可使用如下培養基：RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、Eagle之MEM培養基[Science, 122, 501 (1952)]、杜貝可改良MEM(DMEM)培養基[Virology, 8, 396 (1959)]、199培養基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)]、F12培養基[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)]、lscove改良杜貝可培養基(IMDM培養基)[J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978)]、EX-CELL302培養基、EX-CELL-CD-CHO培養基、EX-CELL 325培養基(以上係SAFC生物科技公司製造)、CD-CHO培養基、CD DG44培養基(以上係Invitrogen公司製造)或IS CD-CHO培養基(Irvine Scientific公司製造)、或該等之改良培養基、混合培養基或濃縮培養基等。該等之中，較佳為可例舉：RPMI1640培養基、DMEM培養基、F12培養基、IMDM培養基、EX-CELL302培養基、CD-CHO培養基或IS CD-CHO培養基等。
又，視需要，可添加生產抗體之細胞之生長所需之生理活性物質或滋養因子等。該等添加物或於培養前預先含於培養基中，亦或於培養中作為添加培養基或添加溶液適當追加供給至培養液。追加供給之方法可為1種溶液或2種以上之混合溶液等任一形態，又，添加方法可為連續添加或間斷性添加之任一種。
作為生產抗體之基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲，例如可例舉：於細胞內組入有編碼抗體之基因之非人類動物、植物或昆蟲。作為非人類動物，例如可例舉：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔子、狗、羊、豬、山羊、牛或猴子等。作為植物，例如可例舉菸草、馬鈴薯、番茄、胡蘿蔔、大豆、油菜、紫苜蓿、稻米、小麥、大麥或玉米等。
作為含抗體水溶液之生產方法，例如可例舉：國際公開第2007/062245號或國際公開第2007/114496號等所記載之方法。
又，於本發明中，作為含抗體水溶液，例如除含有抗體之血漿或尿等自生物體所得者以外，還可例舉利用純化步驟所得之含抗體水溶液。具體而言，例如可例舉細胞去除液、沈澱物去除液、醇區劃液、鹽析區劃液、層析法溶出液等。
作為細胞去除液，例如可例舉自含抗體水溶液去除細胞所得之溶液，該含抗體水溶液係血漿、血清、乳或尿等自生物體所得之含抗體水溶液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲所得之含抗體水溶液；自使用基因重組技術所構建之細胞所得之含抗體水溶液或利用純化步驟所得之含抗體水溶液。具體而言，例如可例舉藉由如下方法等自細胞培養液去除細胞所得之溶液：離心分離法、掃流過濾法(切向流過濾法)、利用深度過濾器之過濾法、利用膜濾器之過濾法、透析法、或組合該等方法之方法等。
作為沈澱物去除液，例如，可例舉藉由低pH處理或添加辛酸、有機溶劑、聚乙二醇、界面活性劑、鹽、胺基酸或聚合物等進行凝集沈澱(絮凝)或二相分離後，自如下含抗體水溶液去除沈澱物所得之溶液等：自血漿、血清、乳或尿等生物體所得之含抗體水溶液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲所得之含抗體水溶液；自使用基因重組技術所構建之細胞所得之含抗體水溶液；使用無細胞蛋白質合成技術所得之含抗體水溶液或利用純化步驟所得之含抗體水溶液。作為沈澱物之去除方法，例如，可例舉離心分離法、掃流過濾法(切向流過濾法)、利用深度過濾器之過濾法、利用膜濾器之過濾法、透析法、或組合該等方法而成之方法。
作為醇區劃液，例如可例舉藉由添加醇等而自含抗體水溶液製備之區劃液等，該含抗體水溶液係血漿、血清、乳或尿等自生物體所得之含抗體水溶液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲所得之含抗體水溶液；自使用基因重組技術所構建之細胞所得之含抗體水溶液；使用無細胞蛋白質合成技術所得之含抗體水溶液或利用純化步驟所得之含抗體水溶液。具體而言，例如可例舉利用低溫乙醇分離法等方法所得之區劃液。
作為鹽析區劃液，例如可例舉藉由添加硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈉或氯化鉀等鹽，使抗體自含抗體水溶液析出而製備之區劃液等，該含抗體水溶液係血漿、血清、乳或尿等自生物體所得之含抗體水溶液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲所得之含抗體水溶液；自使用基因重組技術所構建之細胞所得之含抗體水溶液；使用無細胞蛋白質合成技術所得之含抗體水溶液或利用純化步驟所得之含抗體水溶液。
作為層析法溶出液，例如可例舉藉由使含抗體水溶液吸附於層析法所使用之載體或膜並以適量溶出液溶出；或以非吸附模式使含抗體水溶液通過封入有載體等之管柱或膜等而獲得之抗體溶出液等，該含抗體水溶液係血漿、血清、乳或尿等自生物體所得之含抗體水溶液；自基因轉殖非人類動物、植物或昆蟲所得之含抗體水溶液；自使用基因重組技術所構建之細胞所得之含抗體水溶液；使用無細胞蛋白質合成技術所得之含抗體水溶液或利用純化步驟所得之含抗體水溶液。
作為層析法所使用之載體或膜，例如可例舉親和性載體、離子交換載體、離子交換膜、凝膠過濾載體、疏水性相互作用載體、逆相載體、羥磷灰石載體、氟磷灰石載體、硫酸纖維素載體、硫酸瓊脂糖載體、混合模式(Multimodal)載體或活性碳等。
作為離子交換載體或離子交換膜，可例舉使具有離子交換基之分子直接或間接地結合至基礎載體或膜而成之載體或膜，該具有離子交換基之分子例如有硫酸基、甲基硫酸基、磺苯基、磺丙基、羧甲基、四級銨基、四級胺基乙基或二乙基胺基乙基等，該基礎載體或膜例如有由纖維素、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、聚葡萄胺糖、丙烯酸聚合物或苯乙烯-二乙烯苯共聚合物等聚合物及其衍生物(包含交聯聚合物)、二氧化矽粒子、玻璃粒子、陶瓷粒子或其表面處理粒子等所構成之聚合物等。具體而言，例如可例舉：Q Sepharose XL、Q Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、ANX Sepharose FF、Capto Q、Capto DEAE或Capto Q ImpRes(以上係GE Healthcare公司製造，Capto為註冊商標)、TOYOPEARL GigaCap Q-650或TOYOPEARL SuperQ-650(以上係東曹公司製造，TOYOPEARL為註冊商標)、Fractogel DEAE、Fractogel TMAE、Fractogel TMAE Hicap或Eshmuno Q(以上係Merck Millipore公司製造)、Cellufine MAX-Q(JNC公司製造)、Mustang Q(Poul公司製造)、Sartobind Q、Sartobind STIC(以上係賽多利斯公司製造)、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose XL或Capto S(以上係GE Healthcare公司製造)、Poros 50 HS或Poros 50 XS(以上係Applied Biosystems公司製造)、Eshmuno S、Fractogel COO-、Fractogel SO3-或Fractogel SE Hicap(以上係Merck Millipore公司製造)、TOYOPEARL GigaCap S-650或TOYOPEARL GigaCap CM-650(以上係東曹公司製造，TOYOPEARL為註冊商標)、Cellufine MAX-S(JNC公司製造，Cellufine為註冊商標)、Mustang S(Poul公司製造)、Sartobind S(賽多利斯公司製造)或Diaion PK、Diaion PA、Diaion CR或Diaion AMP(以上係三菱化學公司製造，Diaion為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為親和性載體，可例舉使對目標抗體具有親和性之分子直接或間接地結合至與上述相同之基礎載體而成之載體，該對目標抗體具有親和性之分子例如有蛋白A、蛋白G或蛋白L等。具體而言，例如可例舉：MabSelect、Protein A Sepharose FF、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、Protein G Sepharose FF或Capto L(以上係GE Healthcare公司製造，MabSelect為註冊商標)、Prosep vA Hicapacity或Prosep vA Ultra、Prosep Ultraplus(以上係Merck Millipore公司製造，Prosep為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為凝膠過濾載體，例如可例舉包含如下聚合物之載體，該聚合物係由葡聚糖、烯丙基葡聚糖、N,N'-亞甲雙丙烯醯胺、纖維素、瓊脂糖、苯乙烯、二乙烯苯、聚乙烯醇、二氧化矽或聚葡萄胺糖等所構成。具體而言，例如可例舉：Sephacryl(註冊商標)S系列、Sepharose(註冊商標)系列、Sephadex(註冊商標)系列、Superdex(註冊商標)系列或Sephacryl(註冊商標)系列(以上係GE Healthcare公司製造)、TOYOPEARL(註冊商標)HW系列或TSKgel(註冊商標)PW系列(以上係東曹公司製造)、Bio gel Agarose或Bio gel P Polyacrylamide(以上係Bio-Rad公司製造，Bio gel為註冊商標)、Cellufine GH或Cellufine GCL(以上係JNC公司製造，Cellufine為註冊商標)、Trisacryl GF05、Trisacryl GF2000或Ultrogel AcA(以上係Poul公司製造，Trisacryl為註冊商標)或Fractogel BioSEC(Merck Millipore公司製造)等，但並不限定於該等。
作為疏水性相互作用載體，可例舉使具有疏水性之分子直接或間接地結合至與上述相同之基礎載體而成之載體，該具有疏水性之分子例如有甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第三丁基、辛基、醚基或苯基等。具體而言，例如可例舉：Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high-sub)、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(low-sub)、Octyl Sepharose 4 Fast Flow或Butyl Sepharose 4 Fast Flow(以上係GE Healthcare公司製造)、TOYOPEARL Hexyl-650、TOYOPEARL Butyl-650、TOYOPEARL Phenyl-650、TOYOPEARL Ether-650、TOYOPEARL PPG-600、TOYOPEARL Butyl-600或TOYOPEARL Super Butyl-550(以上係東曹公司製造，TOYOPEARL為註冊商標)、Mactro-Prep t-Butyl或Macro-Prep Methyl(以上係Bio-Rad公司製造)、QMA Spherosil、Methyl Ceramic Hyper D(以上係Poul公司製造)、Fractogel Phenyl(S)或Fractogel Propyl(S)(以上係Merck Millipore公司製造)、Phenyl-cellulofine(JNC公司製造)、Diaion HP或Diaion SP(以上係三菱化學公司製造，Diaion為註冊商標)或丁基化Chitopearl或苯基化Chitopearl(以上係FUJIBO控股公司製造，Chitopearl為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為逆相載體，例如可例舉使烴基直接或間接地鍵結至固相基質而成之載體。作為烴基，例如可例舉：三甲基、丁基、苯基、辛基或十八烷基及改變該等之末端而成之官能基等。具體而言，例如可例舉：RESOURCE RPC系列或SOURCE RPC系列(以上係GE Healthcare公司製造，RESOURCE為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為羥磷灰石載體，例如可例舉：CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I或Type II(以上係Bio-Rad公司製造)，但並不限定於此。又，作為氟磷灰石載體，例如可例舉CFT Ceramic Fluoroapatite(Bio-Rad公司製造)等，但並不限定於此。
作為混合模式載體，可例舉使具有不同選擇性之2種以上之官能基、較佳為與上述相同之離子交換基及與上述相同之疏水性相互作用基直接或間接地鍵結至與上述相同之基礎載體而成之載體。具體而言，例如可例舉：Capto adhere或Capto MMC(以上係GE Healthcare公司製造)、HEA HyperCel、PPA HyperCel或MEP HyperCel(以上係Poul公司製造)或TOYOPEARL MX-Trp-650M(東曹公司製造，TOYOPEARL為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為活性碳，例如可例舉：Carboraffin、強力白鷺、純化白鷺、特製白鷺、白鷺A、白鷺C、白鷺C-1、白鷺DO-2、白鷺DO-5、白鷺DO-11、白鷺DC、白鷺DO、白鷺Gx、白鷺G、白鷺GH、白鷺FAC-10、白鷺M、白鷺P、白鷺PHC、白鷺Gc、白鷺GH、白鷺GM、白鷺GS、白鷺GT、白鷺GAA、白鷺GOC、白鷺GOX、白鷺APRC、白鷺TAC、白鷺MAC、白鷺XRC、白鷺NCC、白鷺SRCX、白鷺Wc、白鷺LGK、白鷺KL、白鷺WH、白鷺W、白鷺WHA、白鷺LH、白鷺KL、白鷺LGK、白鷺MAC-W、白鷺S、白鷺Sx、白鷺X2M、白鷺X7000、白鷺X7100、白鷺DX7-3或分子篩活性碳(以上係Japan Enviro Chemicals公司製造，白鷺為註冊商標)、ACF或太閣(以上係富士化學公司製造，太閣為註冊商標)、GLC(以上係可樂麗化學公司製造)、太閣S、太閣K或太閣Q(以上係FUTAMURA化學公司製造，太閣為註冊商標)、或GAC、CN、CG、CAP/CGP、SX或CA(以上係Norit Japan公司製造)等，但並不限定於該等。
進而，含抗體水溶液於存在粒子等不溶物之情形時，亦可預先去除該等不溶物，於去除不溶物後供於本發明之純化方法。作為粒子等不溶物之去除方法，例如可例舉離心分離法、掃流過濾法(切向流過濾法)、利用深度過濾器之過濾法、利用膜濾器之過濾法、透析法、或組合該等方法而成之方法。又，視需要調整下述含抗體水溶液之pH值、導電率、緩衝液或抗體濃度、或包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之每單位體積或每單位重量之抗體負載量等後，供於本發明之純化方法。
作為調整pH值、導電率、緩衝液或抗體濃度、或包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之每單位體積或每單位重量之抗體負載量等的方法，例如可例舉使用超過濾膜之超過濾法等。
作為超過濾膜，除通常之超過濾膜以外，亦包含附加有正或負電荷之超過濾膜。具體而言，例如可例舉：Pellicon 3 Ultracel膜、Pellicon 3 Biomax膜、Pellicon 2 Ultracel膜或Pellicon 2 Biomax膜(以上係Merck Millipore公司製造)、Omega Membrane(Poul公司製造)或Kvick膜(GE Healthcare公司製造)等，但並不限定於該等。
於本發明中，作為雜質，可例舉：宿主細胞蛋白質(HCP)、來自抗體之聚合物(HMWS)、來自抗體之分解物、經改性、糖鏈成分之去除、氧化或脫醯胺等之來自抗體之修飾體、DNA、來自培養基之成分、培養添加物、自宿主細胞溶出之酵素類或於捕獲步驟中混入之蛋白A等，較佳為可例舉宿主細胞蛋白質、來自抗體之聚合物、來自抗體之分解物或DNA。
於本發明中，來自抗體之聚合物只要為複數個抗體分子締合或凝集而成者，則包含任意者，較佳為可溶性之聚合物。具體而言，可例舉二聚物、三聚物、四聚物、或5個以上之抗體分子締合或凝集而成之聚合物，但並不限定於該等。
於本發明中，作為來自抗體之分解物，例如可例舉抗體之雙硫鍵或肽鍵斷鍵而成者。具體而言，可例舉：單株抗體之重鏈或輕鏈之一部分或全部脫落而成者，但並不限定於該等。又，亦包含Fab片段、Fab片段之重鏈及輕鏈進一步斷鍵而成者等。
作為自宿主細胞溶出之酵素類，例如可例舉：糖分解酵素類、蛋白質水解酵素類或氧化還原酵素類等。
作為糖分解酵素，具體而言，例如可例舉：神經胺酸酶(唾液酸酶)、半乳糖苷酶或聚糖酶等。作為蛋白質分解酵素，具體而言，例如可例舉：絲胺酸蛋白酶、酯酶、半胱胺酸蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、胺肽酶、天冬胺酸蛋白酶或組織蛋白酶等。作為氧化還原酵素，具體而言，例如可例舉：硫氧化還原蛋白還原酶等硫氧化還原蛋白相關酵素等。作為胺基酸異構化酵素，具體而言，例如可例舉轉麩胺醯胺酶等。
作為本發明之純化方法所使用之包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，只要為適於製造醫藥品之包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，則可使用任一種，可單獨地使用1種包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，亦可於混合2種以上之包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物後使用，或不加以混合而使用。
作為包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，例如可例舉：沸石、活性白土、矽酸鋁、酸性白土、高嶺土或膨潤土，較佳為可例舉沸石、活性白土或矽酸鋁，特佳為可例舉沸石或矽酸鋁，最佳為可例舉沸石。
作為本發明中所使用之沸石，包含任何結構之沸石，例如可例舉A型、β型、ZSM-5型、鎂鹼沸石型、絲光沸石型、L型或Y型之沸石。作為於本發明中所使用之沸石，較佳為絲光沸石型或β型之沸石，更佳為絲光沸石型。
又，本發明中所使用之沸石於晶體結構中包含模板或抗衡陽離子。上述所謂模板，亦指結構導向劑。作為上述抗衡陽離子，只要為帶正電荷之原子或原子團，則包含任一者，例如可例舉：質子、銨離子、鈉離子或鉀離子。作為本發明中所使用之沸石所含之抗衡陽離子，較佳為質子。
本發明中所使用之沸石之比表面積較佳為100～800 m2 /g，更佳為150～700 m2 /g，進而較佳為350～600 m2 /g，最佳為350～500 m2 /g。本發明中所使用之沸石之細孔直徑較佳為0.2～1 nm，更佳為0.5～0.8 nm，進而較佳為0.6～0.75 nm，最佳為0.65～0.75 nm。本發明中所使用之沸石之二氧化矽/氧化鋁比較佳為2～1500，更佳為10～1500，進而較佳為15～300。
作為本發明中所使用之沸石，具體而言，例如可例舉：ZEORUM A-3、ZEORUM A-4、ZEORUM A-5、ZEORUM F-9、ZEORUM NSA-700、HSZ-920NHA、HSZ-930NHA、HSZ-940NHA、HSZ-931HOA、HSZ-940HOA、HSZ-941HOA、HSZ-960HOA、HSZ-980HOA、HSZ-990HOA、HSZ-820NHA、HSZ-840NHA、HSZ-822HOA、HSZ-840HOA、HSZ-890HOA、HSZ-891HOA、HSZ-720NHA、HSZ-770NAA、HSZ-720KOA、HSZ-722HOA、HSZ-642NAA、HSZ-620HOA、HSZ-640HOA、HSZ-660HOA、HSZ-690HOA、HSZ-500KOA、HSZ-341NHA、HSZ-320NAA、HSZ-320HOA、HSZ-330HUA、HSZ-331HSA、HSZ-350HUA、HSZ-360HUA、HSZ-385HUA或HSZ-390HUA(以上係東曹股份有限公司，ZEORUM及HSZ為註冊商標)或ZEEKLITE SGW、或ZEEKLITE SGW-B(以上係ZEEKLITE股份有限公司)等，但並不限定於該等。
本發明中所使用之活性白土之比表面積較佳為100～400 m2 /g，更佳為200～350 m2 /g，進而較佳為240～310 m2 /g。本發明中所使用之活性白土之細孔容積較佳為0.2～0.6 mL/g，更佳為0.3～0.5 mL/g。本發明中所使用之活性白土之平均細孔直徑較佳為3～10 nm，更佳為5～7 nm。本發明中所使用之活性白土之二氧化矽/氧化鋁比較佳為6～10。
作為發明中所使用之活性白土，具體而言，例如可例舉：Galleon Earth NVZ、Galleon Earth NV、Galleon Earth V2R或Galleon Earth V2(以上係水澤化學工業股份有限公司，Galleon及Galleon Earth為註冊商標)、活性白土SA35、活性白土SA1或活性白土R-15(以上係東新化成股份有限公司)或ACTAL20X、ACTAL20或ACTAL10(以上係Nikki Universal股份有限公司)等，但並不限定於該等。
本發明中所使用之矽酸鋁之比表面積較佳為300～800 m2 /g，進而較佳為500～600 m2 /g。本發明中所使用之矽酸鋁之細孔容積較佳為0.1～0.5 mL/g，更佳為0.25～0.4 mL/g。本發明中所使用之矽酸鋁之平均細孔直徑較佳為1.5～4 nm，更佳為2～3 nm。本發明中所使用之矽酸鋁之二氧化矽/氧化鋁比較佳為1～5，更佳為3.5～4.5。
作為本發明中所使用之矽酸鋁，具體而言，例如可例舉：Galleon Neutral D2-Y或Neobead SA(以上係水澤化學工業股份有限公司，Galleon及Neobead為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為本發明中所使用之酸性白土，具體而言，例如可例舉：MIZUKAS＃20、MIZUKAS＃200、MIZUKAS＃600或MIZULITE (以上係水澤化學工業股份有限公司，MIZUKAS為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為本發明中所使用之高嶺土，具體而言，例如可例舉：Hydrite TS90、Hydrite UF90或Kaopaque 10(以上係林化成股份有限公司)或RC-1或Glomax LL(以上係竹原化學工業股份有限公司)等，但並不限定於該等。
作為本發明中所使用之膨潤土，具體而言，例如可例舉：Kunipia-F、Kunipia-G、MOISTNITE-U、MOISTNITE-S或MOISTNITE-HC (以上係KUNIMINE工業股份有限公司，Kunipia及MOISTNITE為註冊商標)等，但並不限定於該等。
作為本發明之純化方法之手段，並無特別限定，例如可例舉：分批法、膜處理法或管柱層析法等，視各手段來選擇適當種類及/或形狀之包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物。視需要，亦可以如下形態來使用：將包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物封入至多孔性聚合物或凝膠中而成之粒子等形態；或使用聚丙烯或纖維素等支持劑或纖維等將包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物進行吸附、固定或成形而成之膜或者由膜夾住粉體而成之筒等形態等。
又，亦可根據目標抗體及上述純化方法之手段，適當選擇所使用之包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之晶體結構、比表面積、細孔直徑、二氧化矽/氧化鋁比及/或pH值等。
本發明之純化方法係以非吸附模式進行。所謂非吸附模式，意指使含抗體水溶液與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物進行接觸，不使目標抗體吸附於該包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物來回收非吸附部分。具體而言，預先調整含抗體水溶液之pH值、導電率、緩衝液、抗體濃度、包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之每單位體積之抗體負載量、溫度或與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之接觸時間等來使含抗體水溶液與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物接觸，藉此可不使目標抗體吸附於包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，而使雜質吸附於包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物，從而回收非吸附組分中雜質含量得到降低之抗體。
作為本發明之純化方法之一態樣，可例舉如下純化方法，其包括利用緩衝液對包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物進行平衡化作為預處理。平衡化係藉由使調整至適當pH值及濃度之緩衝液與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物接觸來進行。例如，可例舉：使適量緩衝液通過包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之方法；或使包含二氧化矽及鋁之無機化合物與緩衝液混合適當時間之方法。是否得到平衡化可藉由測定與該無機化合物接觸後之緩衝液之pH值來確認。例如在與無機化合物接觸後之緩衝液之pH值為接觸前之pH值±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1時，包含二氧化矽及鋁之無機化合物得到平衡化。
與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物接觸之含抗體水溶液、或用於包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之平衡化之緩衝液之pH值較佳為4～9，更佳為5～9，特佳為6～9，進而較佳為7.5～8.5。又，作為構成上述含抗體水溶液或用於平衡化之緩衝液之鹽，例如可例舉：磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、硼酸鹽、Tris(鹼)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物)、PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、MOPS(3-嗎啉丙磺酸)、TES(三羥甲基甲胺基乙磺酸)、Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘胺酸)等。該等之濃度較佳為0.01 mol/L～0.5 mol/L。又，上述鹽亦可與例如0.01 mol/L～0.5 mol/L、較佳為0.01 mol/L～0.5 mol/L之氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨等其他鹽組合來使用。進而，緩衝液成分亦可與例如甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、天冬胺酸或組胺酸等胺基酸；葡萄糖、蔗糖、乳糖、唾液酸等糖或其衍生物等組合來使用。
與包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物接觸之含抗體水溶液或用於包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之平衡化之緩衝液之溫度較佳為4℃至60℃，更佳為10℃至50℃，特佳為20℃至40℃。
於本發明中，藉由回收包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之非吸附組分，可以較高回收率獲得雜質含量得到降低之抗體。具體而言，作為雜質含量，來源於抗體之聚合物之含量可較佳為5%以下，更佳為2%以下，特佳為1%以下。關於雜質含量是否得到降低，例如可藉由算出吸附於包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之雜質之比率(雜質吸附率)來確認。尤其是於雜質為來自抗體之聚合物(HMDS)之情形時，HMDS吸附率較佳為10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、70%以上、80%以上或90%以上。作為回收率，可較佳為35%以上，更佳為45%以上，進而較佳為60%以上。
於本發明中，測定抗體及雜質之含量時可應用通常抗體純化中所使用之分析法。例如分別為：抗體之含量可藉由吸光度或蛋白A等親和HPLC法等分析法進行測定；宿主細胞蛋白質之含量可藉由ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法、西方墨點法或電化學發光法等分析法進行測定；來自抗體之聚合物或來自抗體之分解物之含量可藉由凝膠過濾HPLC法、離子交換HPLC法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法、光散射法或超離心法等分析法測定；DNA可藉由PicoGreen法、Threshold法或QPCR法等分析法進行測定。
又，本發明係關於一種抗體之製造方法，其包括使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物將抗體與雜質分離，而獲得雜質含量得到降低之抗體的純化方法。
於本發明之製造方法中，使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法可與其他純化方法組合。作為與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之純化方法，只要為適於製造醫藥品之方法即可，可使用任一者，例如可例舉：層析法、醇分離、沈澱物去除、鹽析、緩衝液交換、濃縮、稀釋、過濾、病毒失活化、病毒去除等。與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之純化方法亦可複數個種類、數量組合。又，該等純化方法於使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法之前後皆可實施。
作為與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之層析法中所使用的載體或膜，可例舉與上述相同之親和性載體、離子交換載體、離子交換膜、凝膠過濾載體、疏水性相互作用載體、逆相載體、羥磷灰石載體、氟磷灰石載體、硫酸纖維素載體、硫酸瓊脂糖載體、混合模式載體等。
與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之層析法係視其目的以吸附模式或非吸附模式來進行。作為層析法，例如可例舉：蛋白A層析法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、混合模式層析法及活性碳層析法。
所謂上述層析法中之吸附模式，意指使供於該層析法之水溶液與該載體或該膜接觸，使目標抗體吸附於該載體或該膜後，視需要進行洗淨，其後，利用變更了pH值、導電率、緩衝液成分、鹽濃度或添加物等之緩衝液使目標抗體溶出，回收吸附部分。所謂該層析法中之非吸附模式，意指使供於該層析法之水溶液與該載體或該膜接觸，不使目標抗體吸附於該載體或該膜而回收非吸附部分。
作為本發明之抗體之製造方法，例如可例舉：與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之所有層析法皆以非吸附模式進行的抗體之製造方法(All negative Chromatography)。
關於供於與使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物之純化方法組合之層析法的水溶液或用於洗淨之緩衝液，分別針對pH值、導電率、緩衝液成分、鹽濃度或添加物等選定適宜之條件。
選定層析法之條件後，可利用目標抗體與欲分離之化合物在物理化學性質上之差異、例如等電點、電荷、疏水性度、分子尺寸或立體結構等之差異。作為吸附模式之溶出方法，可例舉：一階段溶出法，其使如目標抗體與載體之親和性會降低之特定鹽濃度或pH值的緩衝液通過而使目標抗體溶出；逐步法，其階段性地使鹽濃度或pH值變化而使目標抗體溶出；或梯度法，其連續性地使鹽濃度或pH值變化而使目標抗體溶出。
作為構成緩衝液之鹽，例如可例舉：磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、硼酸鹽、Tris(鹼)、HEPES、MES、PIPES、MOPS、TES或Tricine等。又，上述鹽可與例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、檸檬酸鈉、硫酸鈉或硫酸銨之類之其他鹽組合使用。進而，緩衝液成分可與例如甘胺酸、丙胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、天冬胺酸或組胺酸等胺基酸；葡萄糖、蔗糖、乳糖、唾液酸等糖或其衍生物等組合使用。
藉由本發明之製造方法，可以較高回收率獲得雜質含量得到降低之抗體。具體而言，作為雜質含量，來自抗體之聚合物之含量可較佳為5%以下，更佳為2%以下，特佳為1%以下。作為回收率，可較佳為35%以上，更佳為45%以上，進而較佳為60%以上。 [實施例]
以下，藉由實施例對本發明進一步詳細地進行說明，但本發明並不限定於該等實施例。
[實施例1]利用活性白土、矽酸鋁之自培養上清液吸附抗體聚合物之效果的研究 將包含IgG型人類單株抗體(Mab A)之CHO細胞培養液藉由精密過濾進行澄清化，使用檸檬酸及三羥甲基胺基甲烷將pH值調整至7.0從而製備成培養上清液。所製備之培養上清液之抗體濃度為4.63 mg/mL。
繼而向4 mL該溶液分別添加表1所示之水澤化學工業公司製造之4種活性白土及2種矽酸鋁之任一種各62、123或247 mg，倒置混和約16小時。將所使用之吸附劑中2種矽酸鋁之特性示於表2。混和液係以2900×g進行10分鐘離心分離，利用精密過濾膜(Merck公司製造之Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除各吸附劑。
利用使用蛋白A親和管柱之HPLC測定濾液中所含之抗體之濃度，算出回收率。回收率係定義為藉由以下計算式所算出之值。
[回收率(%)]＝[吸附劑處理後抗體濃度(mg/mL)]÷[吸附劑處理前抗體濃度(mg/mL)]×100
進而，利用尺寸排除層析法測定濾液中之抗體之聚合物(HMWS)之比率，算出各吸附劑之HMWS吸附率。HMWS吸附率係定義為根據以下計算式所算出之值。式中，培養上清液之HMWS之含量係表示HMWS之峰面積相對於HPLC之總峰面積的比率(%)。
[HMWS吸附率(%)]＝{[吸附劑處理前之培養上清液之HMWS之含量(%)]－[吸附劑處理後之培養上清液之HMWS之含量(%)]}÷[吸附劑處理前之培養上清液之HMWS之含量(%)]×100
藉由HMWS吸附率及回收率對各吸附劑之性能進行評估。將各種吸附劑之HMWS吸附率及回收率示於表1。表1中，Galleon Earth、Galleon及Neobead為註冊商標。
[表1]
吸附劑之 種類 吸附劑之名稱 形狀 比表面積(m2 /g) 細孔容積(mL/g) 平均細孔直徑(nm) 二氧化矽/氧化鋁比 添加量(mg)*1 HMWS 吸附率(%) 回收率(%)
活性白土 Galleon Earth NVZ 粉末 250 0.35 5.6 6.5 62 32.9 98.7
123 70.5 94.7
247 94.7 83.1
活性白土 Galleon Earth NV 粉末 250 0.4 6.4 7.5 62 35.4 98.9
123 73.0 92.6
247 97.5 75.4
活性白土 Galleon Earth V2R 粉末 305 0.48 6.3 8.3 62 38.6 98.7
123 80.8 88.6
247 98.1 67.9
活性白土 Galleon Earth V2 粉末 290 0.46 6.3 9.2 62 36.4 98.8
123 75.0 90.6
247 97.4 73.7
矽酸鋁 Galleon Neutral D2-Y 粉末 530 0.3 2.3 4.0 62 18.0 99.0
123 58.9 98.9
247 75.5 98.4
矽酸鋁 Neobead SA 球狀 550 0.36 2.6 無資料 62 11.2 100.0
123 23.4 100.2
247 45.0 100.7
*1 添加至培養上清液4 mL中之吸附劑量
如表1所示，所有活性白土及矽酸鋁均與各吸附劑之添加量成比例地提高了HMWS吸附率，表現出自培養上清液中降低HMWS之含量之效果。於向培養上清液4 mL添加吸附劑247 mg之條件下，所有4種活性白土之回收率皆為67%以上，顯示94%以上之HMWS吸附率。
又，於吸附劑為矽酸鋁之情形時，若使用Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)，則回收率為98%，HMWS吸附率為76%。又，若使用Neobead SA(水澤化學工業股份有限公司，Neobead為註冊商標)，則抗體之回收率為100%，HMWS吸附率為45%。
根據以上之結果，明確活性白土及矽酸鋁具有自培養上清液中高選擇性地吸附HMWS之效果。
[實施例2]有關矽酸鋁(Galleon Neutral D2-Y)(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)之添加量與自培養上清液吸附HMWS之效果之關係的研究 針對所評估之吸附劑中抗體之回收率較高且HMWS吸附率相對較高之矽酸鋁之一即Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)，對HMWS吸附率及回收率與添加量之關係進行評估。
將含有IgG1型人類單株抗體(Mab A)之CHO細胞培養液藉由精密過濾進行澄清化，使用檸檬酸及三羥甲基胺基甲烷將pH值調整至7.6從而製備成培養上清液。所製備之培養上清液之抗體濃度為6.15 mg/mL。
繼而向該溶液3 mL添加70、140、280、560或1120 mg之Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)。倒置混和約16小時。混和液係以2900×g離心分離10分鐘，利用精密過濾膜(Merck公司製造 Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除吸附劑。
針對濾液，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率及回收率，評估最佳之吸附劑之添加量。將結果示於表2。
[表2]
添加量(mg)*1 吸附率(%) 回收率(%)
70 20.9 98.6
140 45.2 98.3
280 63.1 97.5
560 88.6 103.0
1120 90.5 88.9
*1 添加至培養上清液3 mL中之吸附劑量
如表2所示，直至Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)之添加量為560 mg為止，若將添加量設為2倍，則HMWS吸附率約提高20%，回收率大致維持在100%。另一方面，於添加量為1120 mg之條件下，相比添加量為560 mg之條件，吸附率幾乎未提高，另一方面回收率降低至88.9%。根據以上之結果明確，作為維持回收率並且顯示較高吸附率之添加量，最佳為560 mg，若換算為每單位吸附劑(1 mg)之抗體處理量(mg)，則最佳為0.033 mg/mg之處理量。
[實施例3]矽酸鋁(Galleon Neutral D2-Y)(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)自各種抗體種類之培養上清液吸附HMWS之效果的確認試驗 對矽酸鋁(Galleon Neutral D2-Y)(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)對於來自各種抗體之HMWS之吸附效果進行評估。
將含有表3所示之4種抗體之CHO細胞培養液藉由精密過濾進行澄清化，使用檸檬酸及三羥甲基胺基甲烷將pH值調整至6.0從而製備成培養上清液。
繼而向各培養上清液4 mL以每單位吸附劑(mg)之抗體處理量(mg)成為0.033 mg/mg之方式添加Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)(表3)，倒置混和約16小時。混和液係以2900 G離心分離10分鐘，利用精密過濾膜(Merck公司製造Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除吸附劑。
對於各濾液，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率及回收率。將結果示於表3。
[表3]
抗體種類 亞型 抗體濃度 (mg/ml) 對於培養上清液4 ml之吸附劑添加量(mg) 吸附率(%) 回收率(%)
MabA IgG1 4.63 563 92.6 91.2
MabB IgG1 2.80 340 85.4 94.6
MabC IgG1 1.97 240 46.0 98.4
MabD IgG1 1.34 163 60.7 93.2
MabE IgG4 2.31 281 76.5 96.7
如表3所示，雖根據抗體之種類不同而HMWS吸附率出現差異，但所有培養上清液皆維持90%以上之回收率並且顯示40%以上之HMWS吸附率。根據以上情況明確，Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)不論抗體之種類如何，皆具有自培養上清液中高選擇性地吸附HMWS之效果。
[實施例4]利用沸石吸附培養上清液中之HMWS之效果的研究 將含有IgG1型人類單株抗體(Mab A)之CHO細胞培養液藉由精密過濾進行澄清化，使用檸檬酸及三羥甲基胺基甲烷將pH值調整至6.0從而製備成培養上清液。所製備之培養上清液之抗體濃度為4.07 mg/mL。
繼而向該溶液4 mL分別添加表4所示之東曹公司製造之38種沸石各124、248或496 mg，倒置混和約16小時。混和液係以2900×g離心分離10分鐘，利用精密過濾膜(Merck公司製造Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除沸石。
[表4]
沸石名稱 結晶型 陽離子 二氧化矽氧化鋁比 細孔直徑(nm) 比表面積(m2 /g)
A-3 4-8# A型 鉀 2 0.3 ND
A-4 4-8# A型 鈉 2 0.4 ND
A-5 4-8# A型 鈣 2 0.5 ND
F-9 4-8# X型 鈉 2.5 0.9 ND
920NHA β型 模板 18 0.65 580
930NHA β型 模板 27 0.65 590
940NHA β型 模板 40 0.65 580
931HOA β型 質子 28 0.65 510
940HOA β型 質子 40 0.65 530
941HOA β型 質子 40 0.65 520
960HOA β型 質子 100 0.65 560
980HOA β型 質子 500 0.65 500
990HOA β型 質子 1500 0.65 470
820NHA ZSM-5型 銨 23 0.58 510
840NHA ZSM-5型 銨 40 0.58 330
822HOA ZSM-5型 質子 24 0.58 330
840HOA ZSM-5型 質子 40 0.58 330
890HOA ZSM-5型 質子 1500 0.58 310
891HOA ZSM-5型 質子 1500 0.58 310
720NHA 鎂鹼型 銨 18 0.48 260
770NAA 鎂鹼型 鈉 100 0.48 240
720KOA 鎂鹼型 鉀 18 0.48 170
722HOA 鎂鹼型 質子 18 0.48 ND
642NAA 絲光沸石型 鈉 18 0.7 ND
620HOA 絲光沸石型 質子 15 0.7 400
640HOA 絲光沸石型 質子 18 0.7 380
660HOA 絲光沸石型 質子 30 0.7 400
690HOA 絲光沸石型 質子 240 0.7 450
500KOA L型 鉀 6.1 0.8 290
341NHA Y型 銨 7 0.9 700
320NAA Y型 銨 5.5 0.9 660
320HOA Y型 鈉 5.5 0.9 550
330HUA Y型 質子 6 0.9 550
331HSA Y型 質子 6 0.9 600
350HUA Y型 質子 10 0.9 650
360HUA Y型 質子 15 0.9 550
385HUA Y型 質子 100 0.9 600
390HUA Y型 質子 500 0.9 630
針對所得之樣本，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率及回收率，對各沸石之性能進行評估。將各種沸石之HMWS吸附率示於圖1，將回收率示於圖2。
如圖1所示，38種沸石中之24種之HMWS吸附率係與沸石之添加量成比例地提高，表現出使培養上清液中之HMWS之含量降低之效果。進而明確，其中930NHA、960HOA、980HOA、990HOA、660HOA及690HOA於在培養上清液4 mL添加有248 mg或496 mg之沸石時，顯示70%以上之回收率及50%以上之HMWS吸附率，具有自培養上清液中高選擇性地吸附HMWS之效果。
930NHA、960HOA、980HOA及990HOA屬於β型沸石，又，660HOA及690HOA屬於絲光沸石型沸石，提示出具有該等晶體結構之沸石適於選擇性地吸附HMWS。
針對經660HOA處理之試樣，藉由尺寸排除層析法進行分析，將分析所得之溶出圖案示於圖3(A)及(B)。圖3(A)係表示利用吸附劑處理前之溶出圖案，圖3(B)係表示利用吸附劑處理後之溶出圖案。如圖3(A)及(B)所示，於利用吸附劑進行處理後峰面積明顯變小，由此亦提示出沸石具有HMWS之吸附效果。
[實施例5]利用沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)自培養上清液中吸附HMWS之效果的研究 為了對沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)對於來自各種抗體之HMWS之吸附效果進行評估，而進行了以下之試驗。
將含有表5所示之3種抗體之CHO細胞培養液藉由精密過濾進行澄清化，而製備培養上清液。向該等培養上清液4 mL添加表5所示之量之HSZ-660HOA(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)，倒置混和約16小時。混和液係以2900×g離心分離10分鐘，利用精密過濾膜(Merck公司製造Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除吸附劑。
關於濾液，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率及回收率。將結果示於表5。
[表5]
抗體種類 亞型 抗體濃度(mg/ml) 每單位吸附劑之抗體處理量 (mg/mg) 對於培養上清液4 ml之吸附劑添加量 (mg) 吸附率(%) 回收率(%)
Mab A IgG1 4.00 0.0375 427 46.3 92.3
Mab B IgG1 5.60 0.075 299 77.0 86.6
Mab F IgG1 2.53 0.0375 270 30.0 93.0
如表5所示，雖根據抗體之種類不同而吸附率出現差異，但於使用所有培養上清液之情形時皆維持86%以上之回收率並且顯示30%以上之HMWS吸附率。根據以上情況明確，沸石不論抗體之種類如何，皆具有自培養上清液中高選擇性地吸附HMWS之效果。
[實施例6]利用沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)吸附粗純化試樣中之HMWS之效果的研究 評估沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)對於純化含有Mab A之培養上清液所得之粗純化試樣所含之HMWS的吸附效果。將利用與實施例1相同之方法所得之含有Mab A或Mab D之培養上清液負載於GE公司製造之MabSelect SuRe，利用10 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.0)洗淨後，利用100 mM甘胺酸-鹽酸緩衝液(pH值3.2)使上述Mab A或Mab D溶出，使用三羥甲基胺基甲烷將pH值中和至7.0而製備粗純化試樣。
稱量表6所示之量之HSZ-660HOA(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)，利用以下所示方法進行平衡化。平衡化係使用100 mM磷酸緩衝液(pH值7)。
平衡化方法：向HSZ-660HOA(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)添加緩衝液40 mL，倒置混和約1小時。混和液係以2000×g 離心分離10分鐘，去除上清液。反覆進行緩衝液之添加、去除直至所去除之上清液之pH值成為7。
向經平衡化之沸石添加包含Mab A或Mab D之粗純化試樣各4 mL，倒置混和約16小時。混和液係以2000×g離心分離10分鐘，將上清液利用精密過濾膜(Merck公司製造Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除沸石。
關於濾液，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率。將結果示於表6。
[表6]
抗體種類 亞型 抗體濃度 (mg/ml) 每單位吸附劑之抗體處理量 (mg/mg) 對於粗純化試樣4 ml之吸附劑添加量 (mg) 吸附率(%) 回收率(%)
Mab A IgG1 18.39 0.0375 1997 37.3 54.1
Mab D IgG1 10.60 0.0375 1254 61.6 59.5
雖根據抗體之種類不同而吸附率出現差異，但對於所有粗純化試樣皆出現HMWS之吸附效果。根據以上情況明確，沸石不論抗體之種類如何，不僅具有自培養上清液中吸附HMWS之效果，亦具有自粗純化試樣中吸附HMWS之效果。
針對利用660HOA進行純化前與純化後之包含Mab D之粗純化試樣，利用尺寸排除層析法進行分析，將分析所得之溶出圖案示於圖4(A)及(B)。圖4(A)係利用吸附劑處理前之溶出圖案，圖4(B)係利用吸附劑處理後之溶出圖案。如圖4(A)及(B)所示，於利用吸附劑處理後HMWS之峰面積變小[反應前之峰面積：987430(μV＊秒)、反應後之峰面積：388219(μV＊秒)]，由此亦提示出沸石具有HMWS之吸附效果。
[實施例7]沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)對於粗純化試樣中之HMWS之吸附效果的最適pH值之研究 評估沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)對於純化含有Mab D之培養上清液所得之粗純化試樣所含的HMWS之吸附效果。
針對利用與實施例6相同之方法所得之Mab D之粗純化試樣，藉由鹽酸及三羥甲基胺基甲烷將pH值調整至6、7或8。稱量表7所示之量之HSZ-660HOA，利用實施例6所示之方法進行平衡化。平衡化係使用100 mM磷酸緩衝液(pH值6、7或8)。
向經平衡化之沸石添加pH值調整後之包含Mab D之粗純化試樣各4 mL，倒置混和約16小時。混和液係以2000×g離心分離10分鐘，將上清液利用精密過濾膜(Merck公司製造Millex GV 0.22 μm、Millex為註冊商標)進行過濾，去除沸石。
關於濾液，利用實施例1所記載之方法算出HMWS吸附率。將結果示於表7。
[表7]
粗純化試樣及平衡化用緩衝液之pH值 抗體濃度 (mg/ml) 每單位吸附劑之抗體處理量(mg/mg) 對於粗純化試樣4 ml之吸附劑添加量 (mg) 吸附率(%) 回收率(%)
pH值6 11.02 0.0375 1254 51.4 38.4
pH值7 11.19 0.0375 1254 60.0 40.5
pH值8 11.20 0.0375 1254 68.9 42.6
如表7所示，調整至任一pH值之粗純化試樣皆出現HMWS之吸附效果。其中，pH值8時HMWS之吸附率最高。根據以上情況明確，用於沸石吸附聚合物之最佳pH值為8。
根據以上情況顯示，活性白土、矽酸鋁及沸石等包含矽原子及鋁原子之無機粉體可用於非吸附模式之抗體之純化。
已詳細且參照特定之實施形態對本發明進行了說明，但對於業者而言明顯可知，於不脫離本發明之精神與範圍之情況下能夠進行各種變更及變化。本申請案係基於2019年7月31日提出申請之日本專利申請(日本專利特願2019-141768)，並藉由引用將其全文併入至本說明書中。
圖1係表示Mab A之培養上清液經各種沸石處理後之HMWS吸附率。縱軸表示HMWS吸附率(%)。白色、灰色及黑色之條帶分別表示添加有124 mg、248 mg及496 mg之沸石時之結果。 圖2係表示Mab A之培養上清液經各種沸石處理後之回收率。縱軸表示回收率(%)。白色、灰色及黑色之條帶分別表示添加有124 mg、248 mg及496 mg之沸石時之結果。 圖3(A)及(B)係表示利用尺寸排除層析法對沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)處理前及後之Mab A之培養上清液進行分析所得之溶出圖案。圖3(A)表示利用吸附劑處理前之溶出圖案，圖3(B)表示利用吸附劑處理後之溶出圖案。 圖4(A)及(B)係表示利用尺寸排除層析法對沸石(HSZ-660HOA)(東曹股份有限公司，HSZ為註冊商標)處理前及後之Mab D之粗純化試樣進行分析所得之溶出圖案。圖4(A)係表示利用吸附劑處理前之溶出圖案，圖4(B)係表示利用吸附劑處理後之溶出圖案。

Claims (22)

  1. 一種抗體之純化方法，其使用包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物並以非吸附模式將抗體與雜質分離，而獲得雜質含量得到降低之抗體。
  2. 如請求項1之純化方法，其中抗體為基因重組抗體。
  3. 如請求項1或2之純化方法，其中雜質為選自宿主細胞蛋白質、來自抗體之聚合物、來自抗體之分解物及DNA中之至少一種。
  4. 如請求項1或2之純化方法，其中雜質為來自抗體之聚合物。
  5. 如請求項1至4中任一項之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為活性白土、矽酸鋁或沸石。
  6. 如請求項1至5中任一項之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為矽酸鋁。
  7. 如請求項6之純化方法，其中矽酸鋁具有選自以下(i)～(iv)中之至少任一種特性： (i)比表面積為300～800 m2 /g； (ii)細孔容積為0.1～0.5 mL/g； (iii)平均細孔直徑為1.5～4 nm； (iv)二氧化矽/氧化鋁比為1～5。
  8. 如請求項6或7之純化方法，其中矽酸鋁為Galleon Neutral D2-Y(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)或NeobeadSA(水澤化學工業股份有限公司，Neobead為註冊商標)。
  9. 如請求項1至5中任一項之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為活性白土。
  10. 如請求項9之純化方法，其中活性白土具有選自以下(i)～(iv)中之至少任一種特性： (i)比表面積為100～400 m2 /g； (ii)細孔容積為0.2～0.6 mL/g； (iii)平均細孔直徑為3～10 nm； (iv)二氧化矽/氧化鋁比為6～10。
  11. 如請求項9或10之純化方法，其中矽酸鋁為Galleon Earth NVZ、Galleon Earth NV、Galleon Earth V2R或Galleon Earth V2(水澤化學工業股份有限公司，Galleon為註冊商標)。
  12. 如請求項1至5中任一項之純化方法，其中包含二氧化矽及氧化鋁之無機化合物為沸石。
  13. 如請求項12之純化方法，其中沸石具有選自以下(i)～(iii)中之至少任一種特性： (i)比表面積為100～800 m2 /g； (ii)細孔直徑為0.2～1 nm； (iii)二氧化矽/氧化鋁比為2～1500。
  14. 如請求項12或13之純化方法，其中沸石為β型或絲光沸石型之沸石。
  15. 如請求項12至14中任一項之純化方法，其中沸石含有作為抗衡陽離子之質子。
  16. 如請求項1至15中任一項之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值4～9下進行。
  17. 如請求項1至15中任一項之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值6～9下進行。
  18. 如請求項1至15中任一項之純化方法，其中抗體與雜質之分離係於pH值7.5～8.5下進行。
  19. 如請求項1至18中任一項之純化方法，其包括利用緩衝液對含有二氧化矽及氧化鋁之無機化合物進行平衡化作為預處理。
  20. 一種抗體之製造方法，其包括如請求項1至19中任一項之純化方法。
  21. 如請求項20之製造方法，其包括蛋白A層析法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、混合模式層析法及活性碳層析法中之至少任一種。
  22. 一種抗體，其藉由如請求項20或21之製造方法所製造。
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