KR20170026521A - 단백질의 정제를 위한 방법 및 시약 - Google Patents

단백질의 정제를 위한 방법 및 시약 Download PDF

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그레고리 스콧 블랭크
지운-리앙 린
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제이에이치엘 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본원은 크로마토그래피 공정을 사용하여 DNase와 같은 단백질을 정제하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 단일 크로마토그래피 단계 및 고농도 염 완충제의 사용을 포함한다. 본 발명은 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계 및 매우 고 전도성을 갖는 적어도 1종의 완충제로 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 완충제는 약 50 mS/cm, 약 60 mS/cm, 약 70 mS/cm, 약 80 mS/cm 또는 그 이상의 전도도를 갖는다. 추가의 구현예에서, 단백질은 매우 고 전도성 완충제로 세정한 후 용출 완충제에 의해 칼럼으로부터 용출된다.

Description

단백질의 정제를 위한 방법 및 시약{METHODS AND REAGENTS FOR PURIFICATION OF PROTEINS}
본 발명은 단백질의 정제를 위한 방법 및 시약에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2014년 6월 25일자로 출원된 미국 가출원 제 62,017,153 호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
연구용 및 상업용으로 유용한 데옥시리보뉴클레아제(DNase)와 같은 효소를 비롯한 단백질은 재조합 방법을 사용하여 생산되거나 자연적으로 생산되는 세포로부터 정제될 수 있다. 어느 경우에나, 이러한 단백질의 정제는 사용하기에 적합한 단백질을 생성시키는 중요한 단계이다. DNase 및 기타 단백질은 일반적으로 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼을 사용하는 방법을 비롯한 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된다. 그러나, 편리하고 고순도 및 고 수율을 제공하는 DNase와 같은 효소의 정제 방법에 대한 당업계의 명백히 미충족된 요구가 있다.
본 발명은 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계 및 매우 고 전도성을 갖는 적어도 1종의 완충제로 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 완충제는 약 50 mS/cm, 약 60 mS/cm, 약 70 mS/cm, 약 80 mS/cm 또는 그 이상의 전도도를 갖는다. 추가의 구현예에서, 단백질은 매우 고 전도성 완충제로 세정한 후 용출 완충제에 의해 칼럼으로부터 용출된다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충제는 또한 매우 높은 전도도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충제는 약 50 mS/cm, 약 60 mS/cm, 약 70 mS/cm, 약 80 mS/cm 또는 그 이상의 전도도를 갖는다.
일부 구현예에서, 매우 높은 전도도를 갖는 세정 완충제는 (NH4)2SO4, Na2SO4 및 CH3COONa로 구성된 군으로부터 선택된 염을 포함한다. 추가의 구현예에서, 세정 완충제는 0.8 M (NH4)2SO4를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충제는 NaCl, KCl 및 NaOAc로 구성된 군으로부터 선택된 염을 포함한다. 추가의 구현예에서, 용출 완충제는 1 M NaCl을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 2개 이상의 세정 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 낮은 전도도를 갖는 완충제로 칼럼을 세정하는 제1 세정 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 낮은 전도도를 갖는 완충제는 약 2 mS/cm 또는 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는다. 이러한 구현예에서, 제2 세정 단계는 매우 고 전도성 완충제로 칼럼을 세정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (i) 낮은 전도도를 갖는 제1 완충제로 칼럼을 세정하는 단계; (ii) 매우 높은 전도도를 갖는 제2 완충제로 칼럼을 세정하는 단계; 및 (iii) 낮은 전도도를 갖는 제3 완충제로 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는, 3개의 세정 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제3 세정 단계는 동일한 완충제를 사용한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충제는 CaCl2를 포함한다. 추가의 구현예에서, 완충제는 1 mM CaCl2를 포함한다.
일부 구현예에서, 목적 단백질은 임의의 단백질이다. 추가의 구현예에서, 단백질은 세포에 의해 생산되는 임의의 단백질이다. 세포는 자연적으로 단백질을 생산할 수 있거나 세포가 유전적으로 변형되어 목적 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 샘플은 세포 배양물로부터 수거되어 칼럼 상에 로딩된다. 일부 구현예에서, 단백질은 DNase 또는 RNase와 같은 효소이다. 특정 구현예에서, 단백질은 재조합 DNase이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼은 음이온 교환 칼럼 또는 양이온 교환 칼럼과 같은 이온 교환 칼럼이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼은 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼이고, 예를 들어, 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼은 캡토 어드히어(Capto Adhere) 칼럼과 같은 멀티-모달(multimodal) 음이온 교환기이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩된 샘플은 약 5.0 내지 약 9.0, 또는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 로딩된 샘플의 pH는 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 로딩된 샘플의 pH는 샘플 중의 단백질의 pI와 거의 동일하다. 다른 구현예에서, 로딩된 샘플의 pH는 단백질의 pI보다 높다. 예를 들어, 일부 구현예에서, pH는 약 5.0 내지 약 9.0이고 목적 단백질의 pI는 약 2.5 내지 약 4.5이다. 특정 구현예에서, 단백질은 DNase이고, 로딩된 샘플의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0이다.
일부 구현예에서, 고 전도성 세정 완충제 저 전도성 세정 완충제 및/또는 용출 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0이다. 다른 구현예에서, 고 전도성 세정 완충제, 저 전도성 세정 완충제 및/또는 용출 완충제의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 다른 구현예에서, 고 전도성 세정 완충제, 저 전도성 세정 완충제 및/또는 용출 완충제의 pH는 약 7.0이다.
한 측면에서, 본 발명은 샘플을 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하기 전에 샘플에 대한 세제(detergent)를 포함하는 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 세제는 트리톤(Triton) X-100, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 테트라데실 설페이트, 나트륨 헥사데실 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 및 NP40으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 세제는 트리톤 X-100이고, 샘플 중의 세제의 최종 농도는 약 0.1% 내지 약 1%, 또는 약 0.5%이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 예를 들어 SDS-PAGE 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단백질의 순도를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) DNase를 발현하는 세포로부터 수확된 세포 배양액(HCCF)을 수집하는 단계, (ii) HCCF 샘플에 세제를 첨가하는 단계, (iii) 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼에 샘플을 로딩하는 단계, (iv) 1 mM CaCl2를 포함하는 제1 세정 완충제로 칼럼을 세정하는 단계, (v) 0.8 M (NH4)2SO4 및 1 mM CaCl2를 포함하는 제2 세정 완충제로 칼럼을 세정하는 단계, 및 (vi) 1.0M NaCl 및 1mM CaCl2를 포함하는 용출 완충제에 의해 칼럼으로부터 DNase를 용출하는 단계를 포함하는, 세포 배약 샘플로부터 DNase를 정제하는 방법을 제공한다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 1 mM CaCl2를 포함하는 세정 완충제로 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는, 단계 (v)와 단계 (vi) 사이의, 제3 세정 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 시약 조합물 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 시약 조합물 또는 키트는 본원에 기재된 바와 같이 매우 고 전도성 세정 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약 조합물 또는 키트는 본원에 기재된 바와 같이 매우 고 전도성 세정 완충제 및 매우 고 전도성 용출 완충제 모두를 포함한다. 추가의 구현예에서, 시약 조합물 또는 키트는 약 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 세정 완충제 및 약 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 용출 완충제를 포함한다. 추가의 구현예에서, 세정 완충제는 약 0.8M (NH4)2SO4를 포함하고, 용출 완충제는 약 1M NaCl을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세정 완충제 및 용출 완충제는 각각 1 mM CaCl2를 포함한다.
도 1은 HCCF 샘플로부터의 DNase의 정제를 나타내는 크로마토그램이다.
도 2는 DNase 정제 실험으로부터 얻은 여러 분획의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 레인 1은 마커 레인이다. 레인 2는 미결합된 불순물(칼럼에 미결합된 불순물)을 나타낸다. 레인 3은 2개 세정에 의해 칼럼으로부터 세정된 결합된 불순물을 나타낸다. 레인 4는 용출된 DNase를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 샘플로부터 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 방법을 제공한다. 예상치 못하게, 본 발명자들은 고농도 염 완충제가 크로마토그래피를 통해 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견했다. 일부 구현예에서, 본 발명은 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 직접 로딩함으로써 단백질을 샘플로부터 정제될 수 있는 것을 제공한다. 추가의 구현예에서, 로딩 단계 이후에 고농도 염 완충제를 사용하여 세정 및/또는 용출 단계가 수행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 유리하게는 단백질을 함유하는 샘플의 특성 또는 성분을 현저하게 변화시키지 않고 및/또는 크로마토그래피 칼럼을 최소한으로 조정하여 샘플로부터 단백질을 정제할 수 있게 한다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 로딩된 샘플의 전도도, pH 또는 다른 특성을 변화시키지 않고, 또한 단백질을 함유하는 샘플을 한외 여과, 정용 여과 또는 희석할 필요 없이 샘플로부터 단백질을 정제할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 매우 고 전도성을 갖는 하나 이상의 고농도 염 완충제를 사용하여 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 2개의 세정 단계, 미결합된 불순물을 제거하기 위한 하나의 단계, 결합된 불순물을 제거하기 위한 다른 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 미결합된 불순물을 제거하기 위해 저 전도성을 갖는 고염 완충제를 사용하는 제1 세정 단계; 목적 단백질을 용출시키지 않고 결합된 불순물을 제거하기 위해 매우 고 전도성을 갖는 고염 완충제를 사용하는 제2 세정 단계; 및 칼럼으로부터 생성물을 용출시키는 고 전도성을 갖는 고염 완충제를 사용하는 용출 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 크로마토그래피에 의한 단백질 정제 방법을 제공하는데, 이 방법은 단백질을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 직접 로딩하는 단계, 매우 고 전도성을 갖는 고염 완충제로 칼럼을 세정하는 단계, 및 매우 고 전도성을 갖는 고염 완충제에 의해 칼럼으로부터 단백질을 용출시키는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 단일 크로마토그래피 단계를 사용하여 고도로 정제된 단백질을 수득하는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 방법은 재조합 방법을 사용하여 세포에서 자연적으로 생성된 단백질 및 세포에서 생성된 단백질을 비롯한 임의의 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 효소이다. 추가의 구현예에서, 효소는 데옥시리보뉴클레아제(DNase)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 완충제는 DNase 활성에 필수적인 CaCl2를 포함한다. 다른 구현예에서, 효소는 리보뉴클레아제(RNase)이다.
일부 구현예에서, 단백질을 함유하는 샘플은 높은 전도도 하에 칼럼 상에 직접 로딩된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질을 함유하는 샘플은 약 8 mS/cm 초과, 약 9 mS/cm 초과, 약 10 mS/cm 초과, 약 11 mS/cm 초과, 약 12 mS/cm 초과, 약 13 mS/cm 초과, 약 14 mS/cm 초과, 약 15 mS/cm 초과, 약 20 mS/cm 초과, 또는 약 25 mS/cm 초과의 전도도 하에서 칼럼에 로딩된다. 일부 구현예에서, 단백질을 함유하는 샘플은 약 6 mS/cm 내지 약 25 mS/cm 또는 약 8 mS/cm 내지 약 15 mS/cm, 또는 약 9.5 mS/cm 내지 약 14.5 mS/cm, 또는 약 13 mS/cm의 전도도 하에서 칼럼에 로딩된다. 일부 구현예에서, 단백질이 칼럼에 결합하고 다량의 불순물은 칼럼에 결합하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 칼럼에 결합하고, 불순물의 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상은 칼럼에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 0 내지 14.0이다. 일부 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 약 3.0 내지 10.0이다. 일부 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 약 4.0 내지 9.0이다. 일부 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 약 5.0 내지 8.0이다. 일부 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 약 7.0이다. 다른 구현예에서, 로딩된 단백질의 pH는 약 1.0, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0, 약 10.0, 약 11.0, 약 12.0, 약 13.0, 또는 약 14.0이다. 샘플의 pH는 당업자에게 널리 공지된 방법에 따라 시험되고 로딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 DNase이고, 로딩된 샘플의 pH는 약 4.5 내지 14.0이다. 추가의 구현예에서, 단백질은 DNase이고, 로딩된 샘플의 pH는 약 6.0 내지 8.0이다. 추가의 구현예에서, 단백질은 DNase이고, 로딩된 샘플의 pH는 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 칼럼은 매우 고 전도성의 고염 세정 완충제를 사용하여 세정되어 결합된 불순물을 제거한다. 매우 고 전도성의 세정 완충제 중의 염은 (NH4)2SO4, Na2SO4 및 CH3COONa로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 0.4M 내지 약 1.5M 농도의 (NH4)2SO4를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 0.5M 내지 약 1.2M 농도의 (NH4)2SO4를 포함한다. 추가의 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 0.6M 내지 약 1.0M의 농도의 (NH4)2SO4를 포함한다. 추가의 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 0.8M 농도의 (NH4)2SO4를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 0.5mM 내지 약 1.5mM의 농도의 CaCl2를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 약 1 mM 농도의 CaCl2를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 0.8M (NH4)2SO4, 1mM CaCl2 및 50mM HEPES를 포함한다.
일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제로 세정하면 결합된 불순물이 칼럼으로부터 제거된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세정은 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 결합된 불순물을 제거한다.
일부 구현예에서, 단백질은 매우 고 전도성의 고염 완충제(본원에서 용출 완충제로 언급됨)를 사용하여 칼럼으로부터 용출된다. 용출 완충제 중의 염은 NaCl, KCl 및 NaOAc로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 용출 완충제는 약 0.5M 내지 약 1.5M 농도의 NaCl을 포함한다. 추가의 구현예에서, 용출 완충제는 약 0.7M 내지 약 1.3M의 농도의 NaCl을 포함한다. 추가의 구현예에서, 용출 완충제는 약 0.9 M 내지 약 1.1 M의 농도의 NaCl을 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충제는 약 1.0M의 농도의 NaCl을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충제는 약 0.5mM 내지 약 1.5mM의 농도로 CaCl2를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 용출 완충제는 약 1 mM 농도의 CaCl2를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충제는 1.0M NaCl, 1mM CaCl2 및 50mM HEPES를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출 완충제는 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 목적한 결합된 단백질을 용출시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제의 pH는 약 5.0 내지 9.0이다. 다른 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제의 pH는 약 6.0 내지 8.0이다. 추가의 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제의 pH는 약 7.0이다.
일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 및 용출 완충제는 각각 약 70 mS/cm 초과, 약 75 mS/cm 초과, 약 80 mS/cm 초과, 약 85 mS/cm 초과, 약 90 mS/cm 이상, 약 95 mS/cm 초과, 또는 약 100 mS/cm 초과의 전도도를 갖는다. 일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제의 전도도는 약 25 mS/cm 내지 100 mS/cm, 또는 약 40 mS/cm 내지 100 mS/cm, 또는 약 50 mS/cm 내지 90 mS/cm, 또는 약 70 mS/cm 내지 90 mS/cm이다. 일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제는 약 70 mS/cm, 약 75 mS/cm, 약 80 mS/cm, 약 85 mS/cm, 약 90 mS/cm, 약 95 mS/cm 또는 약 100 mS/cm의 전도도를 갖는다.
매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제는 본원에서 예시된 염으로 달성된 결과를 생성하는 임의의 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 매우 고 전도성 세정 완충제는 (NH4)2SO4, Na2SO4, CH3COONa 또는 유사한 결과를 생성할 수 있는 임의의 염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제는 (NH4)2SO4를 포함한다. 용출 완충제는, 제한 없이, NaCl, KCl, NaOAc 또는 유사한 결과를 생성하는 임의의 염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충제는 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제 또는 용출 완충제는 2 개 이상의 염을 포함한다. 당업자는 2 개의 완충제 중의 (NH4)2SO4 및 NaCl의 농도, 또는 (NH4)2SO4 또는 NaCl에 상당하는 염의 농도가 어느 정도 변화될 수 있고 여전히 유사한 결과를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 매우 고 전도성 세정 완충제와 용출 완충제 사이의 전도도의 차이는 작다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 매우 고농도 염 완충제 0.8 M (NH4)2SO4를 세정 완충제로 사용하고 매우 고농도 염 완충제 1.0 M NaCl을 용출 완충제로 사용한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 세정 완충제가 저 전도성 완충제 인 하나 이상의 추가의 세정 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 제1 세정 완충제가 약 2 mS/cm 미만, 또는 약 1 mS/cm 미만 또는 약 0.5 mS/cm 미만의 낮은 전도도를 갖는 제1 세정 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세정 완충제는 약 0.1 mS/cm 내지 약 5 mS/cm, 또는 약 0.5 mS/cm 내지 약 2 mS/cm, 또는 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 구현예에서, 저 전도성 세정 완충제의 pH는 로딩된 샘플의 pH와 동일하다. 일부 구현예에서, 저 전도성 세정 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0, 또는 약 6.0 내지 약 8.0, 또는 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 저 전도성 세정 완충제는 CaCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 임의의 잔존하는 미결합된 불순물을 제거한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 저 전도성 완충제를 사용하는 제1 세정 단계; 매우 고 전도성 고농도 염 완충제를 사용하는 제2 세정 단계; 및 저 전도성 완충제를 사용하는 제3 세정 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: 약 9.5 내지 약 14 mS/cm의 높은 전도도 및 약 7.0의 pH에서 크로마토그래피 칼럼에 샘플을 직접 로딩하는 단계; 약 1 mS/cm의 낮은 전도도 및 약 7.0의 pH를 갖는 세정 완충제로 칼럼을 세정하는 단계; 약 80 mS/cm 이상의 전도도 및 약 7.0의 pH를 갖는 매우 고 전도성 완충제로 칼럼을 세정하는 단계; 약 1 mS/cm의 낮은 전도도 및 약 7.0의 pH를 갖는 세정 완충제로 칼럼을 세정하는 단계; 및 약 80 mS/cm 이상의 전도도 및 약 7.0의 pH를 갖는 매우 고 전도성 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 단백질을 용출시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 크로마토그래피 칼럼 상에 샘플을 로딩하기 전에 샘플에 세제를 첨가하는 것을 포함한다. 세제는 당업계에 공지되어 있으며, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤(Triton) X-100), 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 테트라데실 설페이트, 나트륨 헥사데실 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 및 NP40를 포함하나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세제는 트리톤 X-100이다. 이론에 얽매이지 않고, 샘플에 세제를 첨가하면 샘플에서 바이러스가 효과적으로 비활성화된다. 당업자는 본원에 제공된 방법에 따라 샘플에 첨가할 적절한 양의 세제를 용이하게 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플 중 트리톤 X-100의 최종 농도는 약 0.01% 내지 10%, 또는 약 0.05% 내지 5%, 또는 약 0.1% 내지 1%, 또는 약 0.5%이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어있다.
본원에 사용된 용어 "약"은 "대략" 수정되는 대상의 ±10 퍼센트를 나타낸다. 본원에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "낮은 전도도(성)"는 약 5 mS/cm 이하의 전도도를 지칭하며; "높은 전도도(성)"라는 용어는 약 5 mS/cm 내지 약 25 mS/cm의 전도도를 지칭하며; "매우 높은 전도도(성)"라는 용어는 25 mS/cm 이상, 예를 들면, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 또는 적어도 약 80 mS/cm의 전도도를 지칭한다.
본 발명은 세포 배양물로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포주" 또는 "세포 배양물"은 시험관내 성장 또는 유지되는 박테리아, 식물, 곤충 또는 고등 진핵세포를 의미한다. 단백질은 세포에 의해 자연적으로 생성되거나 재조합 방법을 통해 생산될 수 있다. 재조합 방법은 재조합 플라스미드 또는 벡터와 같은 외인성 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해 숙주 세포를 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다. 재조합 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Sambrook et al., 2001)(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 및 다른 실험실 교과서에 기술되어있다.
크로마토그래피 물질 및 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌(Chromatography: 제 6 판 (E. Heftmann, 2004))에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참고로 인용된다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 크로마토그래피 물질은 혼합된 형태(예컨대, 캡토 어드히어(Capto Adhere), 캡토(Capto) MMC 또는 하이드록시아파타이트), 이온 교환(즉, 양이온 교환, 음이온 교환), 친화성, 소수성 상호작용, 역상, 크기 배제 및 흡착 물질을 포함한다. 본 발명은 또한 아가로오스, 셀룰로오스, 실리카 및 폴리(스티렌-디비닐벤젠)(PSDVB)를 포함하는 많은 지지체를 고려한다. 당업자는 또한 칼럼의 크기(즉, 직경 및 길이)가 로딩되는 물질의 부피, 정제될 단백질의 농도, 및 원하는 분해능 또는 순도에 따라 달라짐을 알 것이다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 정제된 단백질의 순도는 환원 또는 비-환원성 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 크기 배제 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), 모세관 전기영동, MALDI(매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화) 질량 분석법, 또는 ELISA(효소 결합 면역 흡착 분석법)을 비롯한 이들에 한정되지 않는 임의의 방법으로 측정될 수 있다.
인용된 모든 공보는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다. 본원에서 논의된 간행물들은 본원의 출원일 이전의 그 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 간행물에 앞서 존재할 가치가 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 특정 구현예와 관련하여 기술되었지만, 본 발명은 추가의 변형이 가능하고, 본원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 관행 또는 통상적인 관행에 속하고 본원에 전술한 본질적인 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 한 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 개조를 포함하는 것을 의도한 것으로 이해해야 할 것이다.
실시예 1. DNase 의 정제
재조합 DNase는 DNase 유전자를 발현하는 세포 배양물에서 발현되었다.
세포 배양물의 상등액을 수확하고, 트리톤 X-100을 수확한 세포 배양액(HCCF)에 0.5%의 최종 농도로 첨가하였다. 생성된 샘플은 명세서에 기술된 바와 같은 pH 및 전도성을 가졌다. 이 트리톤 X-100 처리된 샘플을 혼합 모드 이온 교환 수지, 캡토 어디히어에 로딩하였다. 이러한 조건 하에서, DNase가 수지에 결합하였고, 많은 양의 불순물은 수지에 결합하지 않았다. 로딩 후, 남아있는 미결합된 불순물을 pH 7.0, 50mM HEPES 중에 1mM CaCl2를 함유하는 저 전도성 완충제로 칼럼으로부터 세정하였다. 0.8M (NH4)2SO4, pH 7.0의 1mM CaCl2, 50mM HEPES를 함유하는 완충제로 세정하여 결합된 불순물을 칼럼으로부터 제거하였다. 이들 결합된 불순물을 제거한 후, 칼럼을 pH 7.0, 50mM HEPES 중에 1mM CaCl2를 함유하는 저 전도성 완충제로 세정하고, 1M NaCl, pH 7.0의 1mM CaCl2, 50mM HEPES를 함유하는 완충제로 DNase를 용출시켰다. 유속은 100 cm/hr이었다.
연구 결과는 도 1 및 2에 나타내었고, 이는 HCCF로부터 정제된 매우 높은 순도의 DNase를 나타내었다. 도 1은 실험 결과로 얻은 크로마토그램을 보여준다. 도 2는 각 분획의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 특히, 도 2의 레인 4는 용출 단계 후 DNase의 매우 높은 순도를 보여준다.
또한, 상기 연구 결과는 놀랍게도 DNase를 함유하는 샘플을 단일 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 고도로 정제할 수 있고 고 전도성 조건하에 칼럼에 DNase-함유 샘플을 직접 로딩한 후 매우 고 전도성 세정 및 매우 고 전도성 용출 완충제를 사용하여 용출시킬 수 있는 정제 방법을 보여준다. 부분적으로, 혼합 모드 수지에 대한 최적 로딩 조건은 pH가 로딩 단계에서 단백질의 등전점(pI)보다 훨씬 낮은 조건으로 예상되었기 때문에 상기 결과는 놀라웠다. 그러나, 본원에 제공된 방법에서, 로딩의 pH(본원에 예시된 방법에서 약 7.0)는 DNase의 pI(약 4.0 내지 4.5)보다 훨씬 높았다.

Claims (35)

  1. 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계,
    상기 칼럼을, 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 세정 완충제로 세정하는 단계, 및
    용출 완충제로 상기 칼럼으로부터 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는, 샘플로부터 단백질을 정제하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세정 완충제는 (NH4)2SO4, Na2SO4 및 CH3COONa로 이루어진 군으로부터 선택되는 염을 포함하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 세정 완충제는 약 0.8 M (NH4)2SO4의 농도를 포함하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 용출 완충제는 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 용출 완충제는 NaCl, KCl 및 NaOAc로 이루어진 군으로부터 선택되는 염을 포함하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 용출 완충제는 약 1 M NaCl의 농도를 포함하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 적어도 2개의 세정 단계를 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    제1 세정 단계는 2 mS/cm 이하의 전도도를 갖는 완충제로 상기 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    제3 세정 단계를 더 포함하고, 상기 제3 세정 단계는 2 mS/cm 이하의 전도도를 갖는 완충제로 상기 칼럼을 세정하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 단백질은 효소인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 효소는 DNase 또는 RNase인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 DNase는 재조합 DNase인 방법.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 효소는 DNase이고, 상기 방법에 사용된 완충제는 CaCl2를 포함하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 방법에 사용된 완충제는 1 mM CaCl2를 포함하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 크로마토그래피 칼럼은 이온 교환 또는 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 혼합 모드 칼럼은 멀티-모달(multimodal) 음이온 교환기인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 혼합 모드 칼럼은 캡토 어드히어(Capto Adhere) 칼럼인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 샘플은 세포 배양 샘플인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 로딩된 샘플의 pH는 5.0 내지 9.0인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 로딩된 샘플의 pH는 6.0 내지 8.0인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 로딩된 샘플의 pH는 약 7.0인 방법.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 로딩된 샘플의 pH는 상기 단백질의 pI와 같거나 높은 방법.
  23. 청구항 1에 있어서,
    상기 세정 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 세정 완충제의 pH는 약 7.0인 방법.
  25. 청구항 1에 있어서,
    상기 용출 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 9.0인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 용출 완충제의 pH는 약 7.0인 방법.
  27. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플을 상기 크로마토그래피 칼럼에 로딩하기 전에 상기 샘플에 세제(detergent)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 세제는 트리톤(Triton) X-100인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 세제는 0.5%의 최종 농도로 상기 샘플에 첨가되는 방법.
  30. 세포 배양 샘플에 세제를 첨가하는 단계;
    상기 샘플을 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼에 직접 로딩하는 단계;
    상기 칼럼을 제1 세정 완충제로 세정하는 단계;
    상기 칼럼을 제2 세정 완충제로 세정하는 단계; 및
    용출 완충제로 상기 칼럼으로부터 DNase를 용출시키는 단계를 포함하는, 세포 배양 샘플로부터 DNase를 정제하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 제2 세정 완충제 및 상기 용출 완충제는 각각 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 방법.
  32. 청구항 30에 있어서,
    상기 제2 세정 완충제는 0.8 M (NH4)2SO4를 포함하는 방법.
  33. 청구항 30에 있어서,
    상기 용출 완충제는 1 M NaCl을 포함하는 방법.
  34. 약 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 세정 완충제 및 약 80 mS/cm 이상의 전도도를 갖는 용출 완충제를 포함하는 키트(kit).
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 세정 완충제는 약 0.8M (NH4)2SO4를 포함하고, 상기 용출 완충제는 약 1M NaCl을 포함하는 키트.
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