CN109847406B - 一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，包括：a将纯化血红蛋白后的阴离子交换层析柱的进出液口调整；b用去离子水清洗所述层析柱，去掉所述层析柱在使用后残留的洗脱液，然后用酸性水溶液清洗所述层析柱；c用去离子水清洗所述层析柱洗掉草酸，然后用含有Trion X‑100和乙二胺四乙酸的水溶液清洗所述层析柱，该水溶液的PH值为4.3‑5.5；d用去离子水清洗所述层析柱，洗掉Trion X‑100和乙二胺四乙酸。本发明用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，可快速去除纯化血红蛋白后残留在层析柱中的杂质，节省批间操作时间，延长填料使用寿命，降低成本并保证纯化产品质量。

Description

一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法
技术领域
本发明属于药物领域，特别是涉及一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法。
背景技术
阴离子交换层析法是大量生产目的蛋白的首选方法，在生物制药领域，被广泛应用。阴离子交换层析柱在纯化血红蛋白后，填料中会残留一些深色杂质，会对下次使用造成影响，缩短填料的使用寿命，并导致纯化产品质量下降。现有的清洗方法主要用水或用盐溶液、酸、碱等溶液浸泡冲洗，但现有的方法无法快速清洗纯化血红蛋白后残留的深色杂质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的快速清洗方法，该方法可快速去除纯化血红蛋白后层析柱上残留的杂质，节省批间操作时间，延长填料使用寿命，降低成本并保证纯化产品质量。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的快速清洗方法，其包括如下步骤：
a、将纯化血红蛋白后的阴离子交换层析柱的进出液口调整，使清洗液体通过层析柱的方向与处理血红蛋白的方向相反；
b、用去离子水清洗所述层析柱，去掉所述层析柱在使用后残留的洗脱液，然后用酸性水溶液清洗所述层析柱；
c、用去离子水清洗所述层析柱洗掉草酸，然后用含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液清洗所述层析柱，该水溶液的PH值为4.3-5.5；
d、用去离子水清洗所述层析柱，洗掉Trion X-100和乙二胺四乙酸。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤b中，所述酸性水溶液为盐酸或草酸，优选草酸。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤b中，所述酸性水溶液的摩尔浓度为0.1-0.3M，优选为0.3M。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤c中，所述含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液中，Trion X-100的体积浓度为0.5％-2％，优选为2％，乙二胺四乙酸的摩尔浓度为0.1-0.3M，优选为0.3M。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤c中，所述含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液的PH值为4.3。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤b、c或d中，所述通过层析柱的液体流速为5-10ml/min。
上述用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述层析柱内的填料型号为Q Sepharose X L。
本发明的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法具有如下有益效果：
1、本发明的清洗方法，针对纯化血红蛋白的离子交换柱清洗效果好，内毒素与总有机碳的残留非常低，能够延长填料使用寿命，降低成本并保证纯化产品质量；
2、本发明的清洗方法，能耗低，处理快速，可快速去除纯化血红蛋白后残留在层析柱中的杂质，在短时间内进行下一批的纯化，节省批间操作时间，提高生产效率。
具体实施方式
下面结合实施例详细描述本发明。
本发明中涉及的术语解释如下：
1、阴离子交换层析：一种蛋白分离技术，主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷微小差异进行蛋白质分离。
2、去离子水：指除去水中的离子态杂质而得到的近于纯净的水。
3、柱体积：指填料装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积，常用CV表示，即1CV＝1个柱体积。
4、总有机碳：是指水体中溶解性和悬浮性有机物含碳的总量，通常作为评价水体有机物污染程度的重要依据，常用单位有ppm或ppb，1ppm＝1000ppb。
5、内毒素：指革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，单位是Eu/ml。
实施例1
a、将纯化血红蛋白后的阴离子交换层析柱(填料型号为Q Sepharose X L，柱型号为MILLIPORE，高10cm，直径1.6cm，柱体积约20ml)的进出液口调整，使清洗液体通过层析柱的方向与处理血红蛋白的方向相反；
b、用4个层析柱体积的去离子水清洗层析柱，去掉层析柱在使用后残留的洗脱液，然后用2个层析柱体积的摩尔浓度为0.2M的草酸水溶液清洗层析柱,通过层析柱的液体流速为10ml/min；
c、用4个层析柱体积的去离子水清洗层析柱，洗掉草酸，然后用2个层析柱体积的含有Trion X-100和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液清洗层析柱，该水溶液中Trion X-100的体积浓度为1％，乙二胺四乙酸的摩尔浓度为0.2M，水溶液的PH值为4.3，通过层析柱的液体流速为5ml/min；
d、用4个层析柱体积的去离子水清洗所述层析柱，洗掉Trion X-100和乙二胺四乙酸，通过层析柱的液体流速为8ml/min。
取步骤d得到的清洗液，采用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果为131ppb，测定结果低于500ppb，并且使用内毒素分析仪测定该清洗液，测定结果低于0.04EU/ml，表示清洗合格，清洗结果见表1。
实施例2-5和对比例1
实施例2-5和对比例1与实施例1的清洗方法相同，不同之处在于草酸、Trion X-100和乙二胺四乙酸的浓度不同，详见表1。
表1
Figure BDA0001986884210000041
通过表1可知，采用实施例1-5的清洗方法，清洗后清洗液中内毒素均低于0.04EU/ml，总有机碳均低于500ppb，均达到了合格标准。而对比例1中，清洗液采用较低浓度时，最终清洗层析柱后，残留的杂质含量均不合格。
实施例6、7和对比例2
实施例6、7和对比例2与实施例1的清洗方法相同，不同之处在于步骤c中，含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液的pH值不同，详见表2。
表2
实施例1 实施例6 实施例7 对比例2
pH 4.3 5.0 5.5 6.0
内毒素(Eu/ml) ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04
总有机碳(ppb) 131 187 412 573
通过表2可知，本发明中，含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液采用pH值为4.3-5.5，清洗层析柱后，总有机碳残留均低于500ppb，均能够将层析柱清洗干净，对比例2中，清洗液的pH值达到6，此时步骤4中清洗层析柱后的清洗液中总有机碳已经超出500ppb，清洗不合格，因此，本发明含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液采用的ph值为4.3-5.5。
实施例8
与实施例1的清洗方法相同，不同之处在于所述步骤b中采用盐酸水溶液清洗层析柱，清洗结果见表3。
对比例3
与实施例1的清洗方法相同，不同之处在于步骤a中进出液口不进行调整，清洗液体通过层析柱的方向与处理血红蛋白的方向相同，清洗结果见表3。
对比例4
与实施例1的清洗方法相同，不同之处在于所述步骤c中，不是采用Trion X-100和乙二胺四乙酸的混合溶液清洗层析柱，而是先采用体积浓度为1％的Trion X-100溶液清洗层析柱，之后再采用摩尔浓度为0.2M的乙二胺四乙酸溶液清洗层析柱，清洗结果见表3。
表3
Figure BDA0001986884210000051
通过表3，可知，实施例8中，在步骤b中采用盐酸水溶液清洗层析柱，清洗后，清洗液中内毒素含量小于0.04Eu/ml，总有机碳含量为219ppb，高于实施例1中采用草酸溶液的清洗效果，因此本发明中优选采用草酸溶液作为清洗液。
对比例3中没有调整进出液口，这种情况下清洗层析柱后，清洗液中残留内毒素为0.17Eu/ml，总有机碳含量高达1167ppb，远远高于500ppb，清洗不合格。
对比例5中，将Trion溶液和EDTA溶液分别对层析柱进行清洗，清洗耗时72min，清洗后总有机碳的含量为162ppb，而实施例1中将Trion和EDTA组成混合溶液清洗层析柱，大幅缩短了清洗时间，仅仅用时48min，而且清洗后总有机碳含量为131ppb，低于对比例5中的162ppb。因此，本发明中将Trion和EDTA组成混合溶液清洗层析柱不仅提升了清洗效果，而且显著缩短了清洗时间，提高了清洗效率。

Claims (7)

1.一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其包括如下步骤：
a、将纯化血红蛋白后的阴离子交换层析柱的进出液口调整，使清洗液体通过层析柱的方向与处理血红蛋白的方向相反；
b、用去离子水清洗所述层析柱，去掉所述层析柱在使用后残留的洗脱液，然后用酸性水溶液清洗所述层析柱，所述酸性水溶液为草酸；
c、用去离子水清洗所述层析柱洗掉草酸，然后用含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液清洗所述层析柱，该水溶液的PH值为4.3-5.5；
d、用去离子水清洗所述层析柱，洗掉Trion X-100和乙二胺四乙酸。
2.如权利要求1所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤b中，所述酸性水溶液的摩尔浓度为0.1-0.3M。
3.如权利要求2所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤b中，所述酸性水溶液的摩尔浓度为0.3M。
4.如权利要求1所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤c中，所述含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液中，Trion X-100的体积浓度为0.5%-2% ，乙二胺四乙酸的摩尔浓度为0.1-0.3M。
5.如权利要求4所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤c中，所述含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液中，Trion X-100的体积浓度为2%，乙二胺四乙酸的摩尔浓度为0.3M。
6.如权利要求1或3所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述步骤c中，所述含有Trion X-100和乙二胺四乙酸的水溶液的PH值为4.3。
7.如权利要求1所述的用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，其中，所述层析柱内的填料型号为Q Sepharose X L。
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