BRPI0918589B1

BRPI0918589B1 - Composições de proteção para fator viii recombinantemente produzido

Info

Publication number: BRPI0918589B1
Application number: BRPI0918589-5A
Authority: BR
Inventors: Brita Rippner; Josefin Osterberg; Ulrika Nilsson; Elsa Ivarsson; Irène Agerkvist
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2021-07-13
Also published as: RU2510279C3; AU2009289212B2; US20110178019A1; CA2735376C; JP2015129158A; JP2012502004A; CN107049964B; EP2337580A1; EP2337580B1; AU2009289212A1; DK2337580T3; RU2011112787A; CN107050437A; IL211083A; PT2337580E; KR20160093743A; CN107049964A; WO2010026186A1; US20170189494A1; ES2382443T3

Abstract

composição de proteção para fator viii recombinantemente produzido. a presente invenção refere-se a uma composição livre de histidina compreendendo: um alto grau de pureza fator viii (fator r-viii); arginina e/ou sacarose; um agente de superfície ativa a fim de evitar ou pelo menos inibir a absorção de superfície do fator viii; uma quantidade de cloreto de cálcio para estabilização especifica do fator viii.

Description

A presente invenção refere-se às formulações liofilizadas com ■ capacidade para proteger o fator VIII recombinantemente produzido (fator r-VIII) de alta pureza. A presente invenção também refere-se às formulações líquidas do fator r-VIII antes da liofilização e após a reconstituição da formulação liofilizada sólida para um líquido injetável.

Fator VIII é uma proteína do plasma do sangue essencial envolvida no processo de coagulação do sangue. A deficiência deste fator de coagulação resulta em hemofilia A, uma doença fatal que deve ser tratada pela terapia de reposição do fator VIII. Tradicionalmente, os concentrados dos derivados purificados do plasma do fator VIII (fator P-VIII) foram utilizados para a terapia de reposição. Mais recentemente, o fator VIII recombinantemente produzido (fator r-VIII) tornou-se disponível, o qual oferece um suprimento independente da doação de plasma, reduzindo o risco de doenças transmitidas por vírus.

Fator VIII é uma molécula complexa e uma proteína muito sensível associado à perda de atividade ao longo do tempo. No sangue, outras proteínas do sangue, tais como albumina de soro humano (HSA) e o fator de von Willebrand (vWF) auxiliam na preservação da atividade coagulante do fator VIII. No entanto, é desejável a fim evitar a presença de proteínas obtidas por meio da purificação do plasma sanguíneo em formulações farmacêuticas do fator r- VIII, por causa do risco de transmissão do vírus. Dessa maneira, é essencial para fornecer as composições de outros excipientes farmaceuticamente a- ceitáveis para proteger o fator r-VIII contra a degradação e agregação física e química, o que causa perda da atividade. Uma técnica comumente utilizada para evitar a perda de atividade da proteína durante o armazenamento a longo prazo é a preparação de formulações farmacêuticas sólidas secas por liofilização (secagem por congelamento). Os excipientes farmacêuticos tam-bém devem proteger o fator VIII durante o processo farmacêutico, durante o armazenamento a longo prazo e após a reconstituição da formulação secada por congelamento a uma solução para a administração.

A sequência de DNA do fator VIII é dividida em seis domínios: domínios três A-, dois C- e um B- e as proteínas contêm sítios de interação de outros fatores da coagulação, vWF, fosfolipídios e íons metálicos. A menor forma ativa da proteína do fator VIII não tem o domínio B e é composta por uma cadeia leve de 80 kDa associada a uma cadeia pesada de 90 kDa (Wang W. et al, 2003). Tanto os produtos do fármaco do fator r-VII de comprimento total (Kogenate®, Bayer, Helixate®, CSL Behring, Recombinate®, Baxter e Advate®, Baxter) quanto de domínio B excluídos (ReFacto®, Wyeth e Xyntha®, Wyeth) estão no no mercado hoje.

Em uma formulação farmacêutica de fator VIII, todos os compo-nentes precisam ser cuidadosamente selecionados. Cada excipiente oferece uma função de proteção para manter um rendimento elevado do fator VIII durante todo o processo farmacêutico, armazenamento a longo prazo e, fi-nalmente, a reconstituição e a administração ao paciente. Além disso, a se-gurança clínica de todos os excipientes é considerada.

O objetivo da liofilização (Manning, M.C. et al, 1989, Tang, X. et al, 2004, Schwegman, J.J. et al, 2005) é retirar a água da formulação, uma vez que as reações físicas e químicas adversas ocorrem frequentemente na fase aquosa.

Crio-Zlioprotetores são obrigados a proteger a proteína durante o processo de secagem por congelamento e durante o armazenamento, por meio da formação de uma matriz amorfa ao redor da proteína.

Um agente de volume está incluído na função como um bolo an-terior para dar apoio mecânico durante o processo de secagem por conge-lamento e para aumentar o peso seco do fármaco. O agente de volume, por-tanto, contribui para proporcionar uma qualidade uniforme e a aparência de um produto liofilizado.

Um agente de tamponamento pode ser adicionado para manter o pH a um valor adequado para a proteína e para a utilização terapêutica do produto.

Devido à elevada potência do fator VIII, a concentração do fator VIII em soluções terapêuticas é baixa. Além disso, o fator VIII absorve facil mente as superfícies, tornando a adsorção da superfície em uma maior fonte de perda de atividade durante a fabricação e após a reconstituição do produto. Para os produtos do fator VIII atualmente comercializados, é geralmente reivindicado que um agente de superfície ativa seja utilizado acima da sua concentração micelar crítica (CMC), que é a concentração da solução em que o agente de superfície ativa forma os agregados micelares. Os valores de cmc dos detergentes não-iônicos contendo polioxietileno são dependentes da temperatura em que o valor da cmc torna-se maior em temperaturas mais baixas (Alexandridis, P. et al, 1994, Nilsson, M. et al, 2007). A cmc de Poloxâmero 188 é pelo menos de 20 a 30 mg / ml a 37°C (Kabanov, A.V. et al, 1995, Alexandridis, P. et al, 1994, Moghimi, S. M. et al, 2004), e aumentando para 100 mg / ml a 20°C (Nakashima, K. et al, 1994). Dessa maneira, de acordo com estes relatórios, a cmc de Poloxâmero 188 está dentro do intervalo de 20 a 100 mg / ml a 25°C.

Os íons metálicos mostraram-se ser envolvidos na associação das cadeias leve e pesada do fator VIII (Wang W et al, 2003) e, portanto, os ions do cálcio (Ca2 +) estão normalmente presentes em formulações de fator VIII para manter a associação do complexo das cadeias de 80 e 90 kDa.

Esforços consideráveis têm sido feitos para encontrar formulações adequadas do fator VIII, por exemplo: A publicação de Õsterberg et al. (1997) descreve uma formulação compreendendo cloreto de sódio como um agente de volume, em combinação com um tensoativo, cloreto de cálcio e sacarose como estabilizadores e histidina como um agente de tamponamento.

US-B-7247707 (Besman et al) descreve as formulações livres de albumina compreendendo cloreto de sódio a 300 a 500 mM, 1 a 4% de um estabilizador escolhido do grupo que consistindo em sacarose, trealose, rafi- nose e arginina, CaCI2 a 1 a 5 mM, e um agente de tamponamento, preferi-velmente histidina. Um tensoativo também está incluído na composição, em uma concentração de até 0,1%.

US-A-5874408 (Nayar) descreve uma formulação do fator VIII recombinante, que compreende glicina, histidina, sacarose, CaCfe e peque- nas quantidades de cloreto de sódio. Nayar descobriu que histidina, que é incluída como um agente de tamponamento em todas as preparações de fator r-VII comercialmente disponíveis hoje, tinha um efeito destabilizador nas formulações liofilizadas de fator VIII. Este efeito foi, porém, superado por meio da adição de sais, glicina e sacarose.

US-A-4877608 (Lee et al.) descreve a utilização de uma formulação altamente purificada da proteína do fator VIII em uma solução aquosa que consiste essencialmente no fator VIII terapeuticamente ativo com uma atividade de pelo menos 130 IU / mg; cloreto de sódio a 0,4 a 1,2 M, cloreto de potássio ou misturas dos mesmos; cloreto de cálcio a 1,5 a 40 mM e histidina a 1 a 50 mM e, opcionalmente, até 10% de açúcar escolhido do grupo que consiste em sacarose, manitol e maltose.

US-A-2005/0256038 (White et al.) ensina uma composição liofili- zada do fator VIII compreendendo um tensoativo, cloreto de cálcio, sacarose, cloreto de sódio, citrato trissódico e um tampão desprovido de aminoácidos.

WO-A-99/10011 (Kanellos et al.) descreve as formulações tratadas termicamente para o plasma do fator VIII, com elevado grau de pureza. A formulação compreende uma quantidade eficaz de estabilização da trealo- se, sacarose e pelo menos um aminoácido. O aminoácido que é preferido é a lisina, mas outros que podem ser utilizados são isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, alanina, arginina, histidina, serina, prolina e glicina.

EP-A-1016673 (Õsterberg et al.) ensina a utilização de formulações compreendendo um tensoativo não-iônico como um estabilizador e o fator VIII possuindo uma atividade específica de mais de 5000 UI / mg. Além disso, é referido que a concentração de tensoativo deve estar acima da concentração micelar crítica, em uma quantidade de pelo menos 0,01 mg / ml.

US-B-6887852 (Paik et al.) descreve uma formulação liofilizada do fator VIII compreendendo uma mistura do ácido L-arginina, L-isoleucina e L-glutâmico como estabilizadores. A formulação básica compreende pequenas quantidades de cloreto de sódio, cloreto de cálcio e histidina. Nenhum agente de superfície ativa é adicionado à composição, uma vez que a formu lação como descrita mostra uma maior estabilidade em comparação com as formulações compreendendo tensoativo.

US-A-5565427 (Freudenberg) ensina a utilização de uma solução estável de fator VIII compreendendo um detergente e um aminoácido ou um de seus sais. A atividade específica da proteína é de pelo menos 2000 IU / mg.

US-A-5328694 (Schwinn) descreve uma solução estável injetável compreendendo o fator VIII purificado a partir do plasma e uma combinação de dissacarídeos e um ou mais aminoácidos. Preferivelmente, o aminoácido é lisina ou glicina.

A presente invenção refere-se às composições de fator VIII re- combinante produzida (fator r-VIII) de alta pureza. As composições são livres de histidina. A fim de exercer um máximo efeito protetor, as composições presentemente inventadas baseiam-se em seleções propositais dos excipi- entes, tais como um crio-/lioprotetor, um agente de volume e um agente de superfície ativa. Cada excipiente adicionado não pode exercer seus efeitos protetores em todas as fases, isto é, durante o processo farmacêutico, o ar-mazenamento a longo prazo e durante a reconstituição e a administração.

As formulações liofilizadas da presente invenção não se limitam a ter o mesmo volume cheio e o volume de reconstituição. Para um versado na técnica torna-se evidente que o produto formulado também pode ser re-constituído em uma forma mais diluída.

A presente invenção está relacionada com uma composição de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma capacidade para proteger o fator VIII recombinantemente produzido.

As composições livres de histidina de fator r-VIII de acordo com a presente invenção geralmente incluem um crio-/lioprotetor que é a arginina ou a sacarose, ou uma combinação de arginina e de sacarose, um agente de volume que é o cloreto de sódio ou a arginina; um agente de superfície ativa, e, opcionalmente, um agente de tamponamento de pH. O termo "livre de histidina", quando aparece nos contextos presentes, não significa composições "sem histidina", já que pequenas quantidades podem acompanhar a substância de volume do fármaco a partir das etapas de fabricação anterio- res, mas sim que nenhuma histidina foi adicionada durante o processamento farmacêutico. Histidina é frequentemente utilizada como agente de tampo-namento em composições de fator VIII e enquanto algumas fontes relatam um efeito estabilizador sobre o fator VIII (EP-A-1016673, Õsterberg et al.), outras fontes relatam um efeito desestabilizador em formulações de fator VIII (US-A-5874408 Nayar). A presente invenção, quando for o caso, incorpora o citrato de sódio, ácido maleico ou Tris (tris(hidroximetil)aminometano) como agente de tamponamento do pH. O agente de tamponamento é, por exemplo, citrato de sódio, presente em uma quantidade para manter um pH variando de 6,5 a 7,5. Uma forma adequada do citrato de sódio é o sal di- hidratado. Geralmente, as composições de acordo com a presente invenção, podem ser na forma liofilizada, mas também são representadas por meio de soluções tais como uma solução a ser liofilizada e uma solução concentrada de uma composição liofilizada.

As composições podem ainda compreender o cloreto de cálcio em quantidades de cerca de 0,5 a 10 mM para melhorar a estabilização específica da molécula do fator VIII. As composições podem incluir ainda outros compostos como antioxidantes, tais como glutationa ou metionina.

Um agente de volume é referido como um excipiente presente na formulação para fornecer suporte mecânico ao bolo liofilizado e para aumentar o peso seco. O agente de volume pode estar tanto em um estado cristalino, tal como o cloreto de sódio, quanto em um estado amorfo, tal como a arginina.

Um agente de tamponamento do pH é conhecido como um composto com uma capacidade de tamponamento na faixa de pH entre cerca de pH 5 e 9. A capacidade de tamponamento refere-se a um valor de pKa do agente de tamponamento, dentro do dito intervalo de pH. Um provedor de força iônica é referido como um composto iôni- co, que está presente na formulação para aumentar a força iônica.

Um Crio- e lioprotetor (crio-Zlioprotetor) é um composto presente na formulação para diminuir ou até mesmo evitar a perda de atividade da proteína durante as etapas de congelamento e de secagem de um processo de liofi- lização e durante o armazenamento subsequente do produto liofilizado.

Um agente de superfície ativa significa um composto que absorve as superfícies e interfaces e, portanto, compensa a perda de atividade do fator VIII devido à adsorção. Este tipo de perda de atividade pode ocorrer durante todo o processamento farmacêutico, bem como durante o manuseio do produto reconstituído, antes e durante a administração a um paciente. Alguns agentes de superfície ativa formam agregados micelares na solução. A concentração micelar crítica de um agente de superfície ativa é a concentração acima da qual micelas são formadas.

Uma composição de proteção do fator VIII significa uma formulação composta de excipientes selecionados, cada um dos excipientes, oferecendo uma função de proteção para manter um rendimento elevado do fator VIII em todo o processo farmacêutico, o armazenamento a longo prazo e, finalmente, a reconstituição e a administração ao paciente. O processo farmacêutico refere-se particularmente aos últimos estágios do processo de fabricação, a partir da chegada da substância de volume do fármaco da produção até o final da liofilização do fármaco formulado. Deve ser entendido que as etapas do processo farmacêutico são geralmente bem-conhecidas para um versado na formulação de proteínas e incluem as etapas como a formulação, a filtração estéril, o enchimento de frascos e a liofilização.

A perda de ativos do fator VIII tem um sentido amplo incluindo, mas não limitado a, perda devido a superfície de adsorção, agregação física e/ou alterações químicas na estrutura da proteína, ou perda de descarte in-satisfatório dos liofilizados que aparecem.

O fator r-VIII, em particular, é um derivado da supressão total ou parcialmente, sem o domínio B, proporcionando, portanto, uma atividade específica que pode vastamente exceder a 5000 IU / mg antes da formulação. Exemplos de tais derivados da supressão total ou parcialmente, sem os seus domínios B, são descritos e preparados em EP-A-1136553 (Hauser et al.) e EP-A-1739179 (Schrõder et al.) de linhagens de células humanas. Reconhece-se que as composições presentemente inventadas, como descritas na seção seguinte, são especialmente adequadas para proteger os tais derivados da supressão do fator VIII.

De acordo com a presente invenção, o crio-/lioprotetor é arginina ou sacarose, ou uma combinação de arginina e de sacarose. A arginina pode ser tipicamente um sal ou um derivado da arginina, tal como um cloridrato de arginina.

O agente de volume de acordo com a presente invenção também possui a função adicional de ser um provedor de força iônica, o qual minimiza o número de componentes necessários para um produto clínico adequado. Os agentes de volume de acordo com a presente invenção podem ser cloreto de sódio ou arginina. A arginina pode ser em forma de sal, em especial na forma de cloridrato.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, o crio- /lioprotetor é uma combinação de arginina e sacarose. O agente de volume e o provedor de força iônica, em particular, é cloreto de sódio. Se o cloreto de sódio atua como agente de volume, a composição da presente invenção é, em particular, compreendida como crio / lioprotetor de cerca de 3 a 15 mg / ml de sacarose e de cerca de 3 a 15 mg / ml de arginina, com a ressalva de que pelo menos 6 mg / ml de Crio / lioprotetor está presente, e como um a- gente de volume de cerca de 10 mg / ml a cerca de 40 mg / ml de cloreto de sódio. A composição pode incluir, particularmente, cerca de 3 mg / ml a cerca de 10 mg / ml, particularmente cerca de 4,5 mg / ml a cerca de 9 mg / ml de sacarose, cerca de 3 mg / ml a cerca de 8 mg / ml, particularmente cerca de 4,5 mg / ml a cerca de 6,8 mg / ml e arginina, particularmente cerca de 15 mg / ml a cerca de 23 mg / ml de cloreto de sódio. Outras faixas de concentração adequadas consistem, particularmente, em cerca de 4,5 a cerca de 6,8 mg / ml de sacarose, cerca de 4,5 mg / ml a cerca de 6,8 mg / ml de arginina e cerca de 15 mg / ml a cerca de 23 mg / ml cloreto de sódio. Preferivelmente, arginina e sacarose estão presentes em quantidades iguais. A composição compreende, então, até cerca de 9 mg / ml arginina e até cerca de 9 mg / ml de sacarose. Além disso, a composição pode incluir cloreto de cálcio, um agente de superfície ativa e, opcionalmente, citrato de sódio como agente de tamponamento do pH. Em uma outra modalidade, a composição da presente invenção compreende sacarose em uma quantidade de cerca de 10 mg / ml a cerca de 25 mg / ml e cloreto de sódio em uma quantidade de 10 mg / ml a 40 mg / ml.

De acordo com uma outra modalidade, a composição é como uma alternativa essencialmente livre de cloreto de sódio, a sacarose é crio- /lioprotetor e o agente de volume e o fornecedor de força iônica é arginina. Em particular, a composição compreende cerca de 5 a 25 mg / ml de sacarose e cerca de 20 a 70 mg / ml de arginina. Além disso, esta composição pode também incluir cloreto de cálcio, um agente de superfície ativa e, op-cionalmente, citrato de sódio como agente de tamponamento. O termo "es-sencialmente livre de cloreto de sódio", quando aparecendo nos contextos presentes, não deve significar composições "desprovidas de qualquer cloreto de sódio", mas sim que contém traços de NaCI, por exemplo, <1%, uma vez que pequenas quantidades de cloreto de sódio podem acompanhar a substância do volume do fármaco a partir das etapas de fabricação anteriores, mas sim que nenhum de cloreto de sódio foi adicionado durante o processo farmacêutico.

Normalmente, a composição é fornecida na forma liofilizada. Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a composição é fornecida na forma de uma solução a ser liofilizada ou sob a forma de uma solução reconstituída preparada a partir de uma composição liofilizada e um diluente.

Em uma modalidade adicional na composição da presente invenção, o agente de superfície ativa é uma proteína, em particular, uma proteína recombinante. A proteína é, em particular, a albumina recombinante produzida, por exemplo, em uma quantidade de cerca de 0,5 mg / ml a cerca de 5 mg / ml. Esta quantidade é consideravelmente menor que e diferente da quantidade comumente utilizada em formulações tradicionais de derivados do plasma do fator VIII, onde a albumina funciona apenas como crio / Liopro- tetor. Surpreendentemente, a albumina, em particular, a albumina recombinante é muito adequada para a utilização como agente de superfície ativa em formulações de fator VIII recombinante a serem armazenadas em temperatura ambiente.

Em uma outra modalidade da presente invenção, o agente de superfície ativa é um tensoativo não-iônico, por exemplo, um copolímero de polioxietileno- polioxipropileno. De acordo com a presente invenção, o agente de superfície ativa está presente em uma concentração abaixo da concentração micelar crítica, por exemplo, copolímeor de polioxietileno - polioxipropileno inferior a cerca de 5 mg / ml.

Em uma modalidade da presente invenção, a composição com-preende um fator r-VIII possuindo uma atividade específica > 5000 IU / mg de proteína.

De acordo com uma modalidade adicional ainda, a composição possui um crio-/lioprotetor e um agente de volume que é a arginina, que também atua como um fornecedor de força iônica. Em particular, a arginina está presente em uma quantidade de cerca de 20 mg / ml a cerca de 70 mg / ml. Além disso, esta composição pode também incluir cloreto de cálcio, um agente de superfície ativa e, opcionalmente, o citrato de sódio como um a- gente de tamponamento.

Todas as composições de várias modalidades compreendem um agente de superfície ativa que, em um aspecto, é um detergente não-iônico, em particular, um tensoativo polimérico não-iônico do tipo copolímero em bloco, tal como um copolímero de polioxietileno - polioxipropileno, por exemplo, Poloxâmero 188, ou um tensoativo não-iônico do tipo polioxietileno sor- bitano do éster de ácido graxo, por exemplo, Polissorbato 20, ou Polissorba- to 80. Um tensoativo não-iônico adequado é Poloxâmero 188, que pode ser utilizado em uma concentração abaixo da concentração micelar crítica (CMC), preferivelmente, em particular, em concentrações abaixo de 5 mg / ml. A cmc de Poloxâmero 188 foi relatada estar na faixa de 20 a 100 mg / ml a 25°C (Kabanov, A. V. et al, 1995, Alexandridis, P. et al, 1994, Moghimi, S. M. et al, 2004, Nakashima, K. et al, 1994).

Em um outro aspecto, o agente de superfície ativa é uma outra proteína recombinante produzida da proteína do Fator VIII, em particular, da albumina recombinante humana, particularmente, tais composições compre-endem albumina recombinante produzida em uma quantidade de cerca de 0,5 mg / ml a cerca de 5 mg / ml.

As várias modalidades serão descritas em mais detalhes nos exemplos a seguir, os quais ilustram a presente invenção, mas não devem ser considerados como uma restrição ou limitação do escopo da presente invenção.

Exemplos

O fator VIII utilizado nos experimentos é um domínio B recombi- nante humano que foi excluído da proteína do Fator VIII, produzido na linhagem celular humana HEK293F, de acordo com o processo descrito em EP 1739179 (Schrõder et al). O processo de purificação consistiu em cinco etapas de cromatografia e gerou uma preparação de elevado grau de pureza da proteína do fator VIII (Winge et al, Pedido de Patente Europeu 08 158 893.1), com uma glicosilação humana como padrão (Sandberg et al, Pedido de Patente Europeu 08 162 765.5).

A atividade da proteína foi medida com um ensaio cromogênico ou com o ensaio de estágio um.

O ensaio cromogênico é um método de dois estágios de fotometria, que mede a atividade biológica do fator VIII como um cofator. O fator VIII ativa o fator X em fator Xa, que por sua vez é enzimaticamente clivado em um produto que pode ser espectrofotometricamente quantificado.

O ensaio de estágio um é baseado na habilidade de uma amostra contendo o fator VIII para corrigir o tempo de coagulação do plasma deficiente de fator VIII, na presença de fosfolipídios, ativador de contato e íons de cálcio. O tempo de aparecimento de um coágulo de fibrina é medido em uma única etapa.

EXEMPLO 1

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento compara uma formulação possuindo um crio-Zlioprotetor que é uma combinação de arginina e da sacarose com formulações possuindo tanto a sacarose quanto a arginina como crio-Zlioprotetor. O cloreto de sódio funciona como um agente de volume e um fornecedor de força iônica.

As formulações foram investigadas para a recuperação do fator VIII em formulações liofilizadas, em uma concentração inicial de 150 IU / ml. As composições investigadas são apresentadas na Tabela 1.

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizadas, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 12 meses a 5 ° C, 25 ° C e 40 ° C, para avaliar a atividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e analisadas com o ensaio cromogênico, descritas na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na Tabela II. TABELA II - Resultados

n.a. não-analisado

Os resultados do Exemplo 1 mostram que, surpreendentemente, há um efeito sinérgico aditivo do crio-Zlioprotetor entre a sacarose e a arginina, como a formulação 1A mostra uma melhor recuperação de atividade ao longo do tempo em relação às formulações 1B e 1C.

EXEMPLO 2

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento investiga as * formulações possuindo a sacarose como crio-Zlioprotetor e a arginina como 5 agente de volume e fornecedor de força iônica. As formulações foram investigadas para a recuperação do fator VIII em formulações liofilizadas, em uma concentração inicial de 150 IU / ml. As composições investigadas são mostradas na Tabela III. TABELA III - Composição

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizadas, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 12 meses a 5 ° C, 25 0 C e 40 ° C, para avaliar a atividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e analisadas com o ensaio cromogênico, descritas na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na Tabela IV, como porcentagem do valor incial. Tabela IV - Resultados

Tabela IV continuação-

n.a. não-analisado

Os resultados do Exemplo 2 mostram que a arginina funciona de forma satisfatória como agente de volume e fornecedor de força iônica, em 5 combinação com a sacarose como um crio-Zlioprotetor.

EXEMPLO 3

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento compara as formulações tanto com um Poloxâmero 188 quanto com um Polissorbato 80 10 como um agente de superfície ativa com uma formulação desprovida de agentes de superfície ativa. O crio-Zlioprotetor é uma combinação de arginina e de sacarose e o cloreto de sódio é utilizado como um agente de volume e um fornecedor de força iônica. As formulações apresentadas na Tabela V, foram investigadas para a recuperação do fator VIII durante a etapa de 15 liofilização, a uma concentração inicial do fator VIII de 150 IU / ml. TABELA V - Composição

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizadas, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras foram colhidas antes da liofilização e congeladas. As amostras liofilizadas foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções antes da análise. A atividade do fator VIII foi analisada com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados da recuperação da atividade em amostras de congelamento - descongelamento e sobre a etapa de liofili-zação são mostrados na Tabela VI. Tabela VI - Resultados, recuperação da atividade sobre a etapa de liofilização.

Os resultados do Exemplo 3 mostram que um agente de superfície ativa é necessário na formulação para combater as perdas de proteína, provavelmente causada pela adsorção superficial tanto durante uma etapa de congelamento-descongelamento quanto sobre o processo de liofilização. Este exemplo mostra ainda que um agente de superfície ativa não-iônico polimérico Poloxâmero 188, quando utilizado em uma concentração abaixo da concentração micelar crítica (CMC), protege eficazmente o fator VIII durante a liofilização. O efeito protetor é tão elevado como o do agente de superfície ativa não-iônico Polissorbato 80, utilizado acima do seu valor de CMC.

EXEMPLO 4

O Exemplo 3 mostrou que um agente de superfície ativa é necessário em uma formulação a fim de evitar a perda da atividade de fator VIII causada pela adsorção da superfície e este exemplo investiga se a albumina recombinante pode ser utilizada para esta finalidade.

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. As formulações apresentadas na Tabela VII foram investigadas para a recuperação da atividade do fator VIII em solução, a uma concentração inicial de fator VIII de 140 IU / ml. As ' formulações de proteínas foram armazenadas a 25 ° C e analisadas no dia 5 0, 3, 7 e 10 com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são apresentados na Tabela VIII, como porcentagem do valor inicial. TABEI-A VII - Composição

TABELA VIII - Resultados

Os resultados do Exemplo 4 mostram que a albumina recombi nante pode proteger o fator r-VIII contra a perda de atividade, provavelmente causada pela adsorção de superfície.

EXEMPLO 5

O Exemplo 3 mostrou que um agente de superfície ativa é ne- cessário na formulação a fim de evitar a perda da atividade de fator VIII, pro- vavelmente causada pela adsorção de superfície e o Exemplo 4 mostrou que a albumina recombinante pode ser utilizada para evitar a perda de atividade da proteína na solução. Este exemplo investiga se a albumina recombinante protege a perda de atividade da proteína, provavelmente devido à superfície de adsorção também na etapa de liofilização.

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. As formulações são desprovidas de detergente não-iônico, mas com a albumina recombinante adicionada para evitar a perda de atividade. O crio-Zlioprotetor é uma combinação de arginina e de sacarose e o cloreto de sódio é utilizado como um agente de volume e fornecedor de força iônica. As formulações apresentadas na Tabela VII foram investigadas para a recuperação do fator VIII em formulações liofiliza- das, em uma concentração inicial de fator VIII de 150 IU / ml.

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizadas, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras liofilizadas são armazenadas por até 12 meses a 5 ° C, 25 ° C e 40 ° C, para avaliar a atividade da proteína ao longo do tempo. As amostras são reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e analisadas com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na Tabela IX. TABELA IX - Resultados.

TABELA IX - continuação-

n.a. não-analisado

Os resultados do Exemplo 5 mostram que a albumina recom binante pode substituir um detergente não-iônico nas formulações do fator r- VIII (formulações 4B a 4D) a fim de evitar as perdas de atividade provavelmente causadas pela adsorção de superfície na etapa de liofilização. Ele também mostra que a albumina recombinante é muito adequada para a utilização como um agente de superfície ativa em formulações de fator VIII recombinante para ser armazenada em temperatura ambiente.

EXEMPLO 6

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. As formulações são desprovidas de detergente não-iônico, mas com a albumina recombinante adicionada a fim de evitar a perda de atividade provavelmente causada devido a superfície de adsorção. O crio-Zlioprotetor é a sacarose e o cloreto de sódio é utilizado como um agente de volume e fornecedor de força iônica. As formulações apresentadas na Tabela X foram investigadas para a recuperação do fator VIII em formulações liofilizadas, em uma concentração inicial de fator VIII de 160 lU/ml. TABELA X - Composição

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizados, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras liofilizadas são armazenadas por até 6 meses a 5 ° C, 25 ° C e 40 ° C, para avaliar a ' atividade da proteína ao longo do tempo. As amostras são reconstituídas em 5 1,5 ml de água para injeções e analisadas com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são mostrados na Tabela XI. TABELA XI - Resultados

n.a. não-analisado

Os resultados do Exemplo 6 mostram que a albumina recom binante pode substituir um detergente não-iônico nas formulações do fator VIII a fim de evitar as perdas de atividade provavelmente causadas pela adsorção de superfície na etapa de liofilização. Ele também mostra que a albumina recombinante é muito adequada para a utilização como um agente de superfície ativa em formulações de fator VIII recombinante para ser armazenada em temperatura ambiente.

EXEMPLO 7

Este exemplo investiga a recuperação da atividade do fator VIII em uma solução contendo histidina como um agente de tamponamento do pH em comparação com uma solução desprovida do agente de tampona-mento do pH.

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. As soluções apresentadas na Tabela XII, foram investigados para a recuperação da atividade do fator VIII na solução, a uma concentração inicial do fator VIII de 100 IU / ml. TABELA XII - Composição

As formulações de proteínas foram armazenadas a 25 ° C e analisadas no dia 0 e após 3 e 7 dias com o ensaio cromogênico, descrito na seção experimental acima. Os resultados são apresentados na Tabela XIV, como a porcentagem do valor inicial. TABELA XIV - Resultados

Os resultados do Exemplo 7 mostram que uma formulação livre de histidina protege o fator VIII melhor do que uma formulação contendo histidina.

EXEMPLO 8

O fator VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na seção experimental acima. Este experimento investiga as formulações possuindo arginina tanto como crio-Zlioprotetor, agente de volume quanto fornecedor de força iônica. As formulações foram investigadas para a recuperação do fator VIII em formulações liofilizadas, em uma concentração inicial de 160 IU / ml. As composições investigadas são mostradas na tabela XV. TABELA XV - Composição

As alíquotas a 1,5 ml da solução foram liofilizadas, em escala laboratorial de secagem por congelamento. As amostras liofilizadas foram armazenadas por até 9 meses em 5 ° C, 25 ° C e 40 ° C, para avaliar a atividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 ml de água para injeções e analisadas com o ensaio cromogênico, como descrito na seção experimental acima. Os resultados são resumidos na Tabela XVI, como porcentagem do valor inicial. TABELA XVI - Resultados

n.a. não-analisado

Os resultados do Exemplo 8 mostram que a arginina pode ser um excipiente multifuncional, pois funciona de forma satisfatória tanto como agente de volume e fornecedor de força iônica, bem como crio / lioprotetor.

LISTAGEM DE REFERÊNCIA

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Claims

1. Composição livre de histidina caracterizado pelo fato de a composição compreender: um alto grau de pureza de fator VIII (fator r-VIII) produzido recombinantemente; arginina e sacarose, em que a quantidade combinada de arginina e sacarose é de pelo menos 6 mg/ml, a quantidade de sacarose é 3-15 mg/ml e a quantidade de arginina é de 315 mg/ml; um agente de superfície ativa a fim de evitar ou pelo menos inibir a adsorção de superfície do fator r-VIII, em que o agente tensoativo compreende Poloxâmero 188 em uma concentração abaixo da concentração micelar crítica de menos de 5 mg/ml; 0,5-10 mM cloreto de cálcio para a estabilização específica do fator r-VIII; e 10 mg/ml a 40 mg/ml de cloreto de sódio.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator r-VIII é uma exclusão dos derivados do fator VIII nativo, parcial ou totalmente desprovido do domínio B do fator VIII nativo.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato da composição estar na forma liofilizada.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato da composição estar na forma de uma solução a ser liofilizada ou sob a forma de uma solução reconstituída preparada a partir de uma composição liofilizada e diluente.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da quantidade de sacarose ser de 3 mg/ml a 10 mg/ml, e a quantidade de arginina ser de 3 mg/ml a 8 mg/ml.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato do agente de superfície ativa compreender ainda uma proteína recombinante.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato da proteína ser albumina recombinantemente produzida em uma quantidade de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato da atividade específica do fator r-VIII ser > 5000 IU/mg de proteína.