PT2337580E

PT2337580E - Composições estabilizadas para o factor viii produzido de forma recombinante

Info

Publication number: PT2337580E
Application number: PT09782562T
Authority: PT
Inventors: Brita Rippner; Josefin Oesterberg; Ulrika Nilsson; Elsa Ivarsson; Irene Agerkvist
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2012-05-28
Also published as: CN107050437A; CA2735376C; IL211083A0; JP2012502004A; KR101691443B1; AU2009289212B2; CN107049964B; CA2735376A1; ES2382443T3; EP2337580A1; SI2337580T1; KR20160093743A; KR101691070B1; RU2011112787A; MX2011002316A; AU2009289212A1; BRPI0918589B1; IL211083A; US20150190478A1; EP2337580B1

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES ESTABILIZADAS PARA O FACTOR VIII PRODUZIDO DE FORMA RECOMBINANTE" A presente invenção refere-se a formulações liofilizadas com capacidade para proteger o factor VIII produzido de forma recombinante (factor r VIII) de pureza elevada. A invenção também se refere a formulações liquidas de factor r VIII antes da liofilização e após a reconstituição da formulação sólida liofilizada num liquido injectável. 0 factor VIII é uma proteína essencial do plasma sanguíneo envolvida no processo de coagulação do sangue. A deficiência deste factor de coagulação resulta em hemofilia A, uma doença com risco de vida que tem de ser tratada por terapia de substituição de factor VIII. Tradicionalmente, os concentrados de factor VIII derivado de plasma (factor p VIII) purificado têm sido utilizados para a terapia de substituição. Mais recentemente, foi disponibilizado factor VIII produzido de forma recombinante (factor r VIII) que proporciona uma fonte independente de doação de plasma, reduzindo o risco de doenças transmitidas por vírus. 0 factor VIII é uma molécula complexa e uma proteína muito sensível associada à perda de actividade com o tempo. No sangue, outras proteínas do sangue, tais como albumina sérica humana (HSA) e factor de von Willebrand (vWF) ajudam na preservação da actividade coagulante do factor VIII. No entanto, é desejável evitar a presença de proteínas obtidas por purificação de plasma 1 sanguíneo em formulações farmacêuticas de factor r VIII, devido ao risco de transmissão de vírus. Assim, é essencial proporcionar composições de outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para proteger factor r VIII contra a degradação física e química e a agregação, que provocam perda de actividade. Uma técnica correntemente utilizada para evitar a perda da actividade da proteína durante o armazenamento no longo prazo é preparar formulações farmacêuticas sólidas secas por liofilização (criossecagem). Os excipientes farmacêuticos também têm de proteger o factor VIII durante o processo farmacêutico, durante o armazenamento no longo prazo e após a reconstituição da formulação liofilizada numa solução para administração. A sequência do ADN do factor VIII está dividida em seis domínios; três domínios A, dois C e um B e a proteína contém sítios de interacção para outros factores de coagulação, vWF, fosfolípidos e iões metálicos. A forma activa mais pequena da proteína factor VIII carece do domínio B e é composta por uma cadeia leve de 80 kDa associada a uma cadeia pesada de 90 kDa (Wang W. et al., 2003) . Actualmente estão no mercado produtos farmacêuticos de factor r VIII de comprimento total (Kogenate®, Bayer, Helixate®, CSL Behring, Recombinate®, Baxter e Advate®, Baxter) e sem domínio B (ReFacto®, Wyeth e Xyntha®, Wyeth) .

Numa formulação farmacêutica de factor VIII todos os componentes precisam de ser cuidadosamente seleccionados. Cada excipiente proporciona uma função protectora para manter um elevado rendimento de factor VIII ao longo de todo o processo farmacêutico, armazenamento a longo prazo e, finalmente, reconstituição e administração ao doente. Além disso, é considerada a segurança clínica de todos os excipientes. 2 0 objectivo da liofilização (Manning, M. C. et al., 1989, Tang, X. et al., 2004, Schwegman, J. J. et al., 2005) é remover a água da formulação, uma vez que reacções físicas e químicas adversas frequentemente ocorrem na fase aquosa.

Crio/lioprotectores são necessários para proteger a proteína durante o processo de liofilização e durante o armazenamento, por formação de uma matriz amorfa em torno da proteína.

Um agente de volume é incluído para funcionar como um formador de bolo para dar suporte mecânico durante a liofilização e para aumentar o peso seco do produto farmacêutico. 0 agente de volume contribui assim para proporcionar uma qualidade e aparência uniformes de um produto liofilizado.

Um agente tamponante pode ser adicionado para manter o pH num valor adequado para a proteína e para utilização terapêutica do produto.

Devido à elevada potência de factor VIII, a concentração de factor VIII em soluções terapêuticas é baixa. Além disso, o factor VIII facilmente adsorve a superfícies, tornando a adsorção a superfícies uma importante fonte de perda de actividade durante o fabrico e após a reconstituição do produto. Para produtos de factor VIII actualmente comercializados, é geralmente afirmado que é utilizado um agente tensioactivo acima da sua concentração micelar crítica (cmc), que é a concentração da solução à qual o agente tensioactivo forma agregados micelares. Os valores da cmc de detergentes não iónicos contendo polioxietileno são dependentes da temperatura na medida em que o 3 valor da cmc se torna maior a temperaturas mais baixas (Alexandridis, P. et ai., 1994, Nilsson, M. et al., 2007). A cmc de Poloxâmero 188 é de pelo menos 20-30 mg/mL a 37 °C (Kabanov, A. V. et al., 1995, Alexandridis, P. et al.r 1994, Moghimi, S. M. et al., 2004 ) e aumentando para 100 mg/mL a 20 °C (Nakashima, K. et al., 1994) . Assim, de acordo com estes relatórios, a cmc do Poloxâmero 188 está dentro do intervalo de 20-100 mg/mL a 25 °C.

Demonstrou-se que os iões metálicos estão envolvidos na associação das cadeias leve e pesada do factor VIII (Wang W. et al., 2003) e, portanto, iões cálcio (Ca2+) estão normalmente presentes em formulações de factor VIII para manter a associação do complexo das cadeias de 80 e 90 kDa. Têm sido feitos esforços consideráveis para encontrar formulações de factor VIII adequadas, por exemplo:

Uma publicação por Õsterberg et ai. (1997) descreve uma formulação compreendendo cloreto de sódio como agente de volume, em combinação com um tensioactivo, cloreto de cálcio e sacarose como estabilizador, e histidina como agente tamponante. O documento US-B-7247707 (Besman et al.) divulga formulações isentas de albumina compreendendo 300 a 500 mM de cloreto de sódio, 1 a 4% de um estabilizador escolhido do grupo consistindo em sacarose, trealose, rafinose e arginina, 1 a 5 mM de CaCl2 e um agente tamponante, de um modo preferido histidina. Está também incluído um tensioactivo na composição, numa concentração até 0,1%. 4 0 documento US-A-5874408 (Nayar) descreve uma formulação de factor VIII recombinante, que compreende glicina, histidina, sacarose, CaCl2 e pequenas quantidades de cloreto de sódio. Nayar verificou que a histidina, que está incluida como agente tamponante em todas as preparações de factor r VIII actualmente disponíveis comercialmente, tinha um efeito destabilizador em formulações de factor VIII liofilizadas. Este efeito foi, no entanto, eliminado pela adição de sais, glicina e sacarose. 0 documento US-A-4877608 (Lee et al.) descreve a utilização de uma formulação de proteína factor VIII altamente purificada numa solução aquosa consistindo essencialmente em factor VIII terapeuticamente activo com uma actividade de, pelo, menos 130 Ul/mg; cloreto de sódio, cloreto de potássio ou as suas misturas 0,4 a 1,2 M; cloreto de cálcio 1,5 a 40 mM e histidina 1 a 50 mM e, opcionalmente, até 10% de açúcar escolhido do grupo consistindo em manitol, sacarose e maltose. O documento US-A-2005/0256038 (White et al.) ensina uma composição de factor VIII liofilizada compreendendo um tensioactivo, cloreto de cálcio, sacarose, cloreto de sódio, citrato trissódico e um tampão isento de aminoácidos. O documento WO-A-99/10011 (Kanellos et al.) divulga formulações tratadas termicamente para factor VIII do plasma, com pureza elevada. A formulação compreende uma quantidade eficaz estabilizadora de sacarose, trealose e, pelo menos, um aminoácido. O aminoácido que é preferido é lisina, mas outros que podem ser utilizados são isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, alanina, arginina, histidina, prolina, serina e glicina. 5 0 documento ΕΡ-Α-1016673 (Õsterberg et al.) ensina a utilização de formulações compreendendo um tensioactivo não iónico como um estabilizador e factor VIII tendo uma actividade especifica superior a 5000 Ul/mg. Além disso, afirma-se que a concentração de tensioactivo deve estar acima da concentração micelar crítica, numa quantidade de, pelo menos, 0,01 mg/mL. O documento US-B-6887852 (Paik et al.) descreve uma formulação de factor VIII liofilizada compreendendo uma mistura de L-arginina, L-isoleucina e ácido L-glutâmico como um estabilizador. A formulação básica compreende pequenas quantidades de cloreto de sódio, cloreto de cálcio e histidina. Não é adicionado nenhum agente tensioactivo à composição, uma vez que a formulação descrita apresenta uma melhor estabilidade em comparação com formulações compreendendo tensioactivo. 0 melhor US-A-5565427 (Freudenberg) ensina a utilização de uma solução estável de factor VIII que compreende um detergente e um aminoácido ou um dos seus sais. A actividade específica da proteína é de, pelo menos, 2000 Ul/mg. 0 melhor US-A-5328694 (Schwinn) divulga uma solução injectável estável compreendendo factor VIII purificado a partir de plasma e uma combinação de dissacáridos e um ou mais aminoácidos. De um modo preferido, o aminoácido é lisina ou glicina. A presente invenção refere-se a composições de factor VIII produzido de forma recombinante (factor r VIII) de elevada pureza. As composições estão isentas de histidina. De modo a exercer efeitos protectores máximos, as composições presentemente inventadas baseiam-se em selecções propositadas de 6 excipientes, tais como um crio/lioprotector, um agente de volume e um agente tensioactivo. Cada excipiente adicionado pode não exercer os seus efeitos protectores em todas as fases, i. e. durante o processo farmacêutico, armazenamento a longo prazo e durante a reconstituição e administração.

As formulações liofilizadas da presente invenção não estão limitadas a ter o mesmo volume de enchimento e volume de reconstituição. Para um especialista na matéria será evidente que o produto formulado também pode ser reconstituído numa forma mais diluída. A presente invenção está relacionada com uma composição de acordo com a reivindicação 1 tendo uma capacidade para proteger factor VIII produzido de forma recombinante.

As composições de factor r VIII isentas de histidina de acordo com a presente invenção geralmente incluem uma combinação de arginina e sacarose; um agente de volume que é cloreto de sódio ou arginina; um agente tensioactivo; e, opcionalmente, um agente tamponante de pH. 0 termo "isento de histidina" quando surge no presente contexto não significa composições "desprovidas de histidina", já que quantidades minoritárias podem acompanhar a substância farmacológica bruta em passos de fabrico anteriores, mas sim que não foi adicionada histidina durante o processamento farmacêutico. A histidina é frequentemente utilizada como agente tamponante em composições de factor VIII e enquanto que algumas fontes descrevem um efeito estabilizador sobre o factor VIII (documento EP-A-1016673, Õsterberg et al.), outras fontes descrevem um efeito desestabilizador em formulações de factor VIII (documento US-A- 5874408, Nayar). A presente invenção, quando apropriado, 7 incorpora citrato de sódio, ácido maleico ou Tris (tris(hidroximetil)-aminometano) como um agente tamponante de pH. 0 agente tamponante é, e. g., citrato de sódio, presente numa quantidade para manter um pH na gama de 6,5 a 7,5. Uma forma adequada de citrato de sódio é o sal di -hidrato.

Geralmente, as composições de acordo com a invenção podem estar na forma liofilizada, mas também são representadas por soluções, tais como uma solução a ser liofilizada e uma solução reconstituída a partir de uma composição liofilizada.

As composições podem ainda compreender cloreto de cálcio numa quantidade de cerca de 0,5 a 10 mM para melhorar a estabilização especifica da molécula de factor VIII. As composições podem ainda compreender outros compostos como antioxidantes, tais como glutationa ou metionina.

Um agente de volume refere-se a um excipiente presente na formulação para proporcionar suporte mecânico ao bolo liofilizado e para aumentar o peso seco. O agente de volume pode estar num estado cristalino, como cloreto de sódio, ou num estado amorfo, como arginina.

Um agente tamponante de pH refere-se a um composto com uma capacidade tamponante na gama de pH entre cerca de pH 5 e 9. A capacidade tamponante refere-se a um valor de pKa do agente tamponante dentro do referido intervalo de pH.

Um fornecedor de força iónica é referido como um composto iónico que está presente na formulação para aumentar a força iónica. 8

Um crio- e lioprotector (crio/lioprotector) é um composto presente na formulação para diminuir ou mesmo evitar a perda da actividade da proteína durante os passos de congelação e secagem de um processo de liofilização e durante o armazenamento subsequente do produto liofilizado.

Um agente tensioactivo significa um composto que adsorve a superfícies e interfaces e neutraliza, assim, a perda de actividade do factor VIII devida à adsorção. Este tipo de perda de actividade pode ocorrer durante todo o processamento farmacêutico, bem como, durante o manuseamento do produto reconstituído antes e durante a administração a um doente. Alguns agentes tensioactivos formam agregados micelares em solução. A concentração micelar crítica de um agente tensioactivo é a concentração acima da qual são formadas micelas.

Uma composição protectora de factor VIII significa uma formulação composta por excipientes seleccionados, proporcionando cada um dos excipientes uma função protectora para manter um rendimento elevado de factor VIII ao longo de todo o processamento farmacêutico, armazenamento a longo prazo e, finalmente, a reconstituição e administração ao doente. 0 processamento farmacêutico refere-se particularmente às últimas fases do processo de fabrico, começando a partir da chegada da substância farmacêutica bruta da produção até ao final da liofilização do produto farmacêutico formulado. Deve entender-se que os passos do processamento farmacêutico são genericamente bem conhecidos por um especialista na formulação de proteínas e incluem passos como formulação, filtração estéril, enchimento em frasquinhos e liofilização. 9

Perda de factor VIII activo tem um significado abrangente, incluindo, mas não limitado a perda devida a adsorção a superfícies, agregação, alterações físicas e/ou químicas da estrutura da proteína ou perda por descarte de liofilizados de aspecto insatisfatórios. 0 factor r VIII, em particular, é um derivado de delecção parcial ou totalmente desprovido do domínio B, proporcionando assim uma actividade específica que pode exceder em muito 5000 Ul/mg antes da formulação. Exemplos desses derivados parcial ou totalmente desprovidos dos seus domínios B são divulgados e preparados nos documentos EP-A-1136553 (Hauser et al.) e EP-A-1739179 (Schrõder et ai.) a partir de linhas celulares humanas. É reconhecido que as composições presentemente inventadas, como descrito na secção seguinte, são especialmente adequadas para proteger esses derivados de factor VIII.

De acordo com a presente invenção, o crio/lioprotector é uma combinação de arginina e sacarose. A arginina pode ser tipicamente um sal ou um derivado de arginina, como o cloridrato de arginina. O agente de volume de acordo com a presente invenção também tem a função adicional de ser um fornecedor de força iónica, que minimiza o número de componentes necessários para um produto clínico adequado. Agentes de volume de acordo com a presente invenção podem ser cloreto de sódio ou arginina. A arginina pode estar numa forma de sal, em particular na forma de cloridrato.

De acordo com a presente invenção, o crio/lioprotector é uma combinação de arginina e de sacarose. O agente de volume e o 10 fornecedor de força iónica em particular é cloreto de sódio. Se o cloreto de sódio actua como agente de volume, a composição da invenção em particular compreende como um crio/lioprotector 15 mg/mL de sacarose e 15 mg/mL de arginina com a condição de que estão presentes, pelo menos, 6 mg/mL de crio/lioprotector, e como um agente de volume 10 mg/mL a 40 mg/mL de cloreto de sódio. A composição pode compreender particularmente cerca de 3 mg/mL a 10 mg/mL, particularmente 4,5 mg/mL a 9 mg/mL de sacarose, 3 mg/mL a cerca de 8 mg/mL, particularmente 4,5 mg/mL a 6,8 mg/mL de arginina e em particular 15 mg/mL a 23 mg/mL de cloreto de sódio. Outras gamas de concentração adequadas incluem, em particular, 4,5 a 6,8 mg/mL de sacarose, 4,5 mg/mL a 6,8 mg/mL de arginina e 15 mg/mL a 23 mg/mL de cloreto de sódio. De um modo preferido, a arginina e a sacarose estão presentes em quantidades iguais. A composição compreende, então, até 9 mg/mL de arginina e até 9 mg/mL de sacarose. Além disso, a composição pode compreender cloreto de cálcio, um agente tensioactivo e, opcionalmente, citrato de sódio como agente tamponante do pH. Noutra forma de realização, a composição da invenção compreende sacarose numa quantidade de 10 mg/mL a 25 mg/mL e cloreto de sódio numa quantidade de 10 mg/mL a 40 mg/mL.

De acordo com outra forma de realização, a composição está como uma alternativa essencialmente isenta de cloreto de sódio, o crio/lioprotector é sacarose e o agente de volume e fornecedor de força iónica é arginina. Em particular, a composição compreende 5 a 25 mg/mL de sacarose e 20 a 70 mg/mL de arginina. Além disso esta composição pode compreender cloreto de cálcio, um agente tensioactivo e, opcionalmente, citrato de sódio como agente tamponante. A expressão "essencialmente isenta de cloreto de sódio", quando surge nos presentes contextos não deve significar composições "destituído de qualquer cloreto de 11 já que sódio", mas que contém vestígios de NaCl, e. g., <1%, quantidades minoritárias de cloreto de sódio podem acompanhar a substância farmacêutica em massa desde passos de fabrico iniciais de produção, mas antes que nenhum cloreto de sódio foi adicionado durante o processamento farmacêutico.

Tipicamente, a composição é proporcionada na forma liofilizada. Em ainda outra forma de realização da invenção, a composição é proporcionada na forma de uma solução a ser liofilizada ou na forma de uma solução reconstituída preparada a partir de uma composição liofilizada e diluente.

Numa forma de realização adicional, na composição da invenção o agente tensioactivo é uma proteína, em particular uma proteína recombinante. A proteína é em particular albumina produzida de forma recombinante, e. g., numa quantidade de 0,5 mg/mL a 5 mg/mL. Esta quantidade é consideravelmente menor do que e difere da quantidade normalmente utilizada em formulações tradicionais de factor VIII derivado do plasma, em que a albumina funciona como o único crio/lioprotector. Surpreendentemente a albumina, em particular albumina recombinante, é muito adequada para utilização como agente tensioactivo em formulações de factor VIII recombinante a serem armazenadas à temperatura ambiente.

Noutra forma de realização da invenção, o agente tensioactivo é um agente tensioactivo não iónico, e. g., um copolímero de polioxietileno-polioxipropileno. De acordo com a invenção, o agente tensioactivo está presente numa concentração abaixo da concentração micelar crítica, e. g., para copolímero de polioxietileno-polioxipropileno inferior a cerca de 5 mg/mL. 12

Numa forma de realização da invenção, a composição compreende um factor r VIII tendo uma actividade especifica > 5000 Ul/mg de proteína.

De acordo com ainda outra forma de realização, a composição tem um crio/lioprotector e um agente de volume que é arginina, que também actua como um fornecedor de força iónica. Em particular, a arginina está presente numa quantidade de 20 mg/mL a 70 mg/mL. Além disso, esta composição pode compreender cloreto de cálcio, um agente tensioactivo e, opcionalmente, citrato de sódio como agente tamponante.

As várias composições consubstanciadas compreendem todas elas um agente tensioactivo que, num aspecto, é um detergente não iónico, em particular um tensioactivo não iónico polimérico de tipo copolímero de blocos, tal como um copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, e. g., Poloxâmero 188 ou um tensioactivo não iónico do tipo éster de ácido gordo e polioxietileno sorbitano, e. g., Polissorbato 20 ou Polissorbato 80. Um tensioactivo não iónico adequado é Poloxâmero 188, que pode ser utilizado numa concentração abaixo da sua concentração micelar crítica (cmc), de um modo preferido, em particular em concentrações inferiores a cerca de 5 mg/mL. A cmc de Poloxâmero 188 foi descrita como estando na gama de 20-100 mg/mL a 25 °C (Kabanov, A. V. et al., 1995, Alexandridis, P. et al., 1994, Moghimi, S. M. et al., 2004, Nakashima, K. et al., 1994).

Noutro aspecto o agente tensioactivo é uma proteína produzida de forma recombinante que não é a proteína factor VIII, em particular albumina humana recombinante, particularmente, essas composições compreendem albumina 13 produzida de forma recombinante numa quantidade de 0,5 mg/mL a 5 mg/mL.

As várias formas de realização vão ser descritas em mais pormenor nos exemplos seguintes que ilustram a invenção mas não devem ser considerados como sendo uma restrição ou uma limitação do âmbito da invenção.

Exemplos O factor VIII utilizado nas experiências é proteína factor VIII sem domínio B humano recombinante, produzido na linha celular humana HEK293F de acordo com o processo descrito no documento EP 1739179 (Schrõder et al.) O processo de purificação consistiu em cinco passos de cromatografia e gerou uma preparação de proteína factor VIII de pureza elevada (Winge et ai., pedido de patente europeia 08158893.1) com um padrão semelhante a uma glicosilação humana (Sandberg et al., pedido de patente europeia 08162765.5). A actividade da proteína foi medida com um ensaio cromogénico ou com o ensaio numa etapa. O ensaio cromogénico é um método fotométrico em duas etapas que mede a actividade biológica de factor VIII como um cofactor. O factor VIII activa o factor X a factor Xa, que por sua vez é clivado enzimaticamente a um produto que pode ser quantificado espectrofotometricamente. O ensaio numa etapa baseia-se na capacidade de uma amostra contendo factor VIII de corrigir o tempo de coagulação de plasma 14 deficiente em factor VIII na presença de fosfolipido, activador de contacto e iões cálcio. 0 tempo de aparecimento de um coágulo de fibrina é medido num passo. EXEMPLO 1 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental apresentada acima. Esta experiência compara uma formulação tendo um crio/lioprotector, que é uma combinação de arginina e sacarose, com formulações tendo ou sacarose ou arginina como crio/lioprotector. 0 cloreto de sódio funciona como um agente de volume e fornecedor de força iónica.

As formulações foram investigadas quanto à recuperação do factor VIII em formulações liofilizadas, a uma concentração inicial de 150 UI/mL. As composições investigadas estão apresentadas na Tabela I. TABELA I - Composição IA 1B 1C Sacarose, mg/mL 9 - 9 Arginina HC1, mg/mL 9 9 - Cloreto de sódio, mg/mL 30 30 30 Di-hidrato de cloreto de cálcio, mg/mL 0,5 0, 5 0, 5 Poloxâmero 188, mg/mL 2 2 2 Di-hidrato de citrato de sódio, mg/mL 2 2 2 15

Alíquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. As amostras liofilizadas foram armazenadas durante até 12 meses a +5 °C, +25 °C e +40 °C para avaliar a actividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções e analisadas com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental acima. Os resultados estão sumariados na Tabela II. TABELA II - Resultados

Actividade do Factor VIII ao longo do tempo (meses) (% do valor inicial)_ Õ 075 Ϊ 2 3 6 9 12

Os resultados do Exemplo 1 mostram que, surpreendentemente, há um efeito crio/lioprotector sinérgico aditivo entre sacarose e arginina, uma vez que a formulação IA mostra uma melhor recuperação de actividade ao longo do tempo em comparação com as formulações 1B e 1C. 16 EXEMPLO 2 O factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental apresentada acima. Esta experiência investiga formulações tendo sacarose como crio/lioprotector e arginina como agente de volume e fornecedor de força iónica. As formulações foram investigadas quanto à recuperação de factor VIII em formulações liofilizadas, numa concentração inicial de 150 UI/mL. As composições investigadas estão apresentadas na Tabela III. TABELA III - Composição 2A 2B 2C Sacarose, mg/mL 10 10 10 Arginina HC1, mg/mL 50 35 70 Di-hidrato de cloreto de cálcio, mg/mL 0,5 0, 5 0, 5 Poloxâmero 188, mg/mL 2 2 2 Di-hidrato de citrato de sódio, mg/mL 2 2 2

Alíquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. As amostras liofilizadas foram armazenadas durante até 12 meses a +5 °C, +25 °C e +40 °C para avaliar a actividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções e analisadas com o ensaio cromogénico, como descrito na secção experimental acima. Os resultados estão sumariados na Tabela IV, como percentagem do valor inicial. 17

TABELA IV

Resultados

Actividade do Factor VIII ao longo do tempo (meses) (% do valor inicial)_ 0 1 3 6 9 12 2A 5 °C 100 94 80 92 89 101 25 °C 100 94 84 86 74 84 40 °C 100 90 81 n.a. n.a. n.a. 2B 5 °C 100 99 89 90 85 105 25 °C 100 99 93 86 80 86 40 °C 100 97 82 n.a. n.a. n.a. 2C 5 °C 100 97 88 93 88 97 25 °C 100 93 78 87 76 80 40 °C 100 90 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. = não analisado

Os resultados do Exemplo 2 mostram que a arginina funciona satisfatoriamente como um agente de volume e fornecedor de força iónica em combinação com sacarose como um crio/lioprotector. EXEMPLO 3 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental referida acima. Esta experiência compara formulações com Poloxâmero 188 ou Polissorbato 80 como um agente tensioactivo com uma formulação isenta de agente tensioactivo. O crio/lioprotector é uma combinação de arginina e sacarose, e utiliza-se cloreto de sódio como um agente de volume e fornecedor de força iónica. As formulações indicadas na Tabela V foram investigadas quanto à 18 recuperação do factor VIII durante o passo de liofilizaçao, numa concentração inicial de factor VIII de 150 UI/mL. TABELA V - Composição 3A 3B 3C Sacarose, mg/mL 9 9 9 Arginina HC1, mg/mL 9 9 9 Cloreto de sódio, mg/mL 30 30 30 Di-hidrato de cloreto de cálcio, mg/mL 0,5 0, 5 0, 5 Poloxâmero 188, mg/mL 2 - - Polissorbato 80, mg/mL - 0,2 - Di-hidrato de citrato de sódio, mg/mL 2 2 2

Aliquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. Foram colhidas amostras antes da liofilização e congeladas. As amostras liofilizadas foram reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções antes da análise. A actividade de factor VIII foi analisada com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental acima. Os resultados da recuperação de actividade nas amostras congeladas-descongeladas e durante o passo de liofilização estão apresentados na Tabela VI. 19

TABELA VI - Resultados, recuperação da actividade durante o passo de liofilização.

Actividade de Factor VIII. (% da quantidade adicionada)

Quantidade Reconstituída

Descongelada adicionada após liofilização 3A 100 104 93 3B 100 101 97 3C 100 18 0

Os resultados do Exemplo 3 mostram que um agente tensioactivo é necessário na formulação para contrariar as perdas de proteína provavelmente causadas por adsorção a superfícies durante um passo de congelação-descongelação e durante o processo de liofilização. Este exemplo mostra ainda que o agente tensioactivo polimérico não iónico Poloxâmero 188, quando utilizado numa concentração inferior à concentração micelar crítica (cmc), protege eficazmente o factor VIII durante a liofilização. 0 efeito protector é tão elevado como o do agente tensioactivo não iónico Polissorbato 80, utilizado acima do seu valor da cmc. EXEMPLO 4 O Exemplo 3 mostrou que um agente tensioactivo é necessário na formulação para evitar perda de actividade de factor VIII provocada por adsorção às superfícies e este exemplo investiga se albumina recombinante pode ser utilizada para esta finalidade. 20 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental acima. As formulações apresentadas na Tabela VII foram investigadas quanto à recuperação da actividade de factor VIII em solução, numa concentração inicial de factor VIII de 140 UI/mL. As formulações de proteínas foram armazenadas a 25 °C e foram analisadas no dia 0, 3, 7 e 10 com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental acima. Os resultados estão apresentados na Tabela VIII, como percentagem do valor inicial. TABELA VII - Composição 4A 4B 4C 4D Sacarose, mg/mL 9 9 9 9 Arginina HC1, mg/mL 9 9 9 9 Cloreto de sódio, mg/mL 30 30 30 30 Cloreto de cálcio, mg/mL 0,5 0,5 0,5 0,5 Poloxâmero 188, mg/mL 2 - - - Albumina recombinante, mg/mL - 1 2 4 Citrato de sódio, mg/mL 2 2 2 2

Tabela VIII - Resultados

Actividade de Factor VIII (% do valor inicial) ao longo do tempo (dias) 0 3 7 10 4A 100 93 87 83 4B 100 103 99 96 4C 100 110 104 100 4D 100 96 95 85 21

Os resultados do Exemplo 4 mostram que a albumina recombinante pode proteger factor r VIII contra perdas de actividade provavelmente provocada por adsorção a superfícies. EXEMPLO 5 0 Exemplo 3 mostrou que é necessário um agente tensioactivo na formulação para evitar perda de actividade de factor VIII provavelmente provocada por adsorção às superfícies e o Exemplo 4 mostrou que pode ser utilizada albumina recombinante para evitar a perda de actividade da proteína em solução. Este exemplo investiga se a albumina recombinante protege da perda de actividade de proteína provavelmente devido à adsorção a superfícies também no passo de liofilização. 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental apresentada acima. As formulações estão desprovidas de detergente não iónico, mas com albumina recombinante adicionada para evitar perdas de actividade. 0 crio/lioprotector é uma combinação de arginina e sacarose e utiliza-se cloreto de sódio como um agente de volume e fornecedor de força iónica. As formulações apresentadas na Tabela VII foram investigadas quanto à recuperação do factor VIII em formulações liofilizadas, numa concentração inicial de factor VIII de 150 UI/mL.

Alíquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. As amostras liofilizadas são armazenadas durante até 12 meses a +5 °C, +25 °C e +40 °C para avaliar a actividade da proteína ao longo do tempo. As amostras 22 são reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções e analisadas com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental apresentada acima. Os resultados estão sumariados na Tabela IX. TABELA IX - Resultados.

Actividade do Factor VIII ao longo do tempo (meses) (% do valor inicial) 0 1 3 6 9 12 4A 5 °C 100 110 117 93 112 100 25 °C 100 104 95 75 74 59 O 0 O 100 84 47 n.a. n.a. n.a. 4B cn o O 100 99 100 94 97 95 25 °C 100 100 98 92 95 92 O O 1 ° 100 81 74 n.a. n.a. n.a. 4C Cn o O 100 101 114 103 106 112 25 °C 100 106 105 102 102 102 O O O 100 108 101 n.a. n.a. n.a. 4D Cn o O 100 100 103 99 96 101 25 °C 100 99 112 103 99 99 O O O 100 101 93 n.a. n.a. n.a. n.a. = não analisado

Os resultados do Exemplo 5 mostram que a albumina recombinante pode substituir um detergente não iónico em formulações de factor r VIII (formulações 4B a 4D) para evitar perdas de actividade provavelmente provocada por adsorção a superfícies no passo de liofilização. Também mostra que a albumina recombinante é muito adequada para utilização como um 23 agente tensioactivo em formulações de factor VIII recombinante a ser armazenadas à temperatura ambiente. EXEMPLO 6 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental apresentada acima. As formulações estão desprovidas de detergente não iónico, mas com albumina recombinante adicionada para evitar perdas de actividade que podem ser devidas a adsorção a superfícies. 0 crio/lioprotector é sacarose e utiliza-se cloreto de sódio como um agente de volume e fornecedor de força iónica. As formulações apresentadas na Tabela X foram investigadas quanto à recuperação do factor VIII em formulações liofilizadas, numa concentração inicial de factor VIII de 160 UI/mL. TABELA X - Composição 6A 6B Sacarose, mg/mL 24 24 Cloreto de sódio, mg/mL 30 30 Cloreto de cálcio, mg/mL 0,5 0,5 Albumina recombinante, mg/mL 2 4 Citrato de sódio, mg/mL 2 2

Aliquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. As amostras liofilizadas são armazenadas durante até 6 meses a +5 °C, +25 °C e +40 °C para avaliar a actividade da proteína ao longo do tempo. As amostras são reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções e analisadas 24 com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental acima. Os resultados estão sumariados na Tabela XI. TABELA XI - Resultados.

Actividade do Factor VIII ao longo do tempo (meses) (% do valor inicial) 0 1 2 3 6 6A 5 °C 100 n.a. n.a. 93 101 25 °C 100 96 n.a. 106 101 40 °C 100 99 89 89 n.a. 4B 5 °C 100 n.a. n.a. 95 107 25 °C 100 102 n.a. 79 104 40 °C 100 101 99 102 n.a. n.a. = nao analisado

Os resultados do Exemplo 6 mostram que albumina recombinante pode substituir um detergente não iónico em formulações de factor r VIII para evitar perdas de actividade que podem ser provocadas pela adsorção em superfícies no passo de liofilização. Também mostra que a albumina recombinante é muito adequada para utilização como um agente tensioactivo em formulações de factor VIII recombinante a serem armazenadas à temperatura ambiente. EXEMPLO 7

Este exemplo investiga a recuperação da actividade de factor VIII numa solução contendo histidina como um agente 25 tamponante de pH em comparação com uma solução desprovida de agente tamponante de pH. 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição da secção experimental acima. As soluções indicadas na Tabela XII foram investigadas quanto à recuperação da actividade de factor VIII em solução, numa concentração inicial de factor VIII de 100 UI/mL. TABELA XII - Composição 7A 7B Cloreto de sódio, mg/mL 18 18 Di-hidrato de cloreto de cálcio, mg/mL 0, 5 0,5 Polissorbato 80, mg/mL 0,2 0,2 Histidina, mg/mL 3 -

As formulações de proteínas foram armazenadas a +25 °C e foram analisadas no dia 0 e após 3 e 7 dias com o ensaio cromogénico, descrito na secção experimental acima. Os resultados estão apresentados na Tabela XIV, como percentagem do valor inicial. 26

TABELA XIV

Resultados

Actividade de factor VIII ao longo do tempo (dias) (% do valor inicial) 0 3 7 7A 25 °C 100 81 72 7B 25 °C 100 95 90

Os resultados do Exemplo 7 mostram que uma formulação isenta de histidina protege o factor VIII melhor do que uma formulação contendo histidina. EXEMPLO 8 inicial de 160 apresentadas na 0 factor VIII recombinante foi preparado de acordo com a descrição na secção experimental acima. Esta experiência investiga formulações tendo arginina como crio/lioprotector, agente de volume e fornecedor de força iónica. As formulações foram investigadas quanto à recuperação de factor VIII em formulações liofilizadas, numa concentração UI/mL. As Tabela XV. composições investigados estão 27 TABELA XV - Composição

8A

Arginina HC1, mg/mL 70 Di-hidrato de cloreto de cálcio, mg/mL O ΟΊ Poloxâmero 188 , mg/mL 2 Di-hidrato de citrato de sódio, mg/mL 2

Alíquotas de 1,5 mL das soluções foram liofilizadas num liofilizador à escala laboratorial. As amostras liofilizadas foram armazenadas durante até 9 meses a +5 °C, +25 °C e +40 °C para avaliar a actividade da proteína ao longo do tempo. As amostras foram reconstituídas em 1,5 mL de água para injecções e analisadas com o ensaio cromogénico, como descrito na secção experimental acima. Os resultados estão sumariados na Tabela XVI, como percentagem do valor inicial. TABELA XVI - Resultados.

Actividade do factor tempo (meses) (% do valor inicial) VIII ao longo do 0 1 2 3 6 9 8A 5 °C 100 88 n.a. 98 85 92 25 °C 100 83 n.a. 97 81 80 O o O 100 85 79 85 n.a. n.a. n.a. = não analisado

Os resultados do Exemplo 8 mostram que a arginina pode ser um excipiente multifuncional uma vez que funciona 28 satisfatoriamente como agente de volume e como fornecedor de força iónica, bem como crio/lioprotector.

Lista de referências

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Lisboa, 18 de Maio de 2012 30

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição isenta de histidina compreendendo: factor VIII ou factor r VIII de elevado grau de pureza; arginina e/ou sacarose; um agente tensioactivo para evitar ou, pelo menos, inibir a adsorção a superfícies de factor VIII; uma quantidade de cloreto de cálcio para estabilização especifica de factor VIII.
2. Composição isenta de histidina da reivindicação 1, em que está presente cloreto de sódio como agente de volume se arginina e sacarose estiverem a actuar como crio/lioprotector mas não como agente de volume.
3. Composição isenta de histidina da reivindicação 1, em que essencialmente não está presente cloreto de sódio, em particular se a arginina for utilizada como crio/lioprotector e agente de volume.
4. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o factor r VIII é um derivado de delecção de factor VIII nativo, que não tem, parcialmente ou totalmente, o domínio B do factor VIII nativo.
5. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em forma liofilizada.
6. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 na forma de uma solução a ser liofilizada ou na forma de 1 uma solução reconstituída preparada a partir de uma composição liofilizada e diluente.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 4 a 6 que compreende como um crio/lioprotector 3-15 mq/mL de sacarose e 3-15 mg/mL de arginina com a condição de estarem presentes, pelo menos, 6 mg/mL de crio/lioprotector, e como um agente de volume 10 mg/mL a 40 mg/mL de cloreto de sódio.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que o crio/lioprotector inclui em simultâneo arginina e sacarose, em particular 3 mg/mL a 10 mg/mL, particularmente 4,5 mg/mL a 9 mg/mL de sacarose, 3 mg/mL a 8 mg/mL, particularmente 4,5 mg/mL a 6,8 mg/mL de arginina e 10 a 40 mg/mL de NaCl, em particular 15 mg/mL a 23 mg/mL de cloreto de sódio.
9. Composição da reivindicação 1 ou 2, em que sacarose está presente numa quantidade de 10 mg/mL a 25 mg/mL e cloreto de sódio está presente numa quantidade de 10 mg/mL a 40 mg/mL.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6 que compreende um crio/lioprotector que é sacarose e um agente de volume que é arginina, em particular 5 mg/mL a 25 mg/mL de sacarose e 20 mg/mL a 70 mg/mL de arginina.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, em que a arginina funciona como agente de volume e crio/lioprotector, em particular numa quantidade de 20 mg/mL a 70 mg/mL. 2
12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o aqente tensioactivo é uma proteína, em particular uma proteína recombinante, tal como albumina produzida de forma recombinante, em particular numa quantidade de 0,5 mq/mL a 5 mg/mL.
13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o agente tensioactivo é um tensioactivo não iónico, em particular numa concentração inferior à concentração micelar crítica.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o tensioactivo não iónico é um copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, em particular numa concentração de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL.
15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicação 1 a 14, em que a actividade específica do factor r VIII é > 5000 Ul/mg de proteína. Lisboa, 18 de Maio de 2012 3