CN101415445A - 聚乙二醇化的因子ⅷ - Google Patents

Abstract

本发明是一种蛋白质构造，其包括至少具有完整B结构域部分的因子VIII，该因子VIII与水溶性聚合物相结合，该聚合物例如是分子量大于10,000道尔顿的聚乙二醇。该构造具有天然因子VIII的生物活性的至少80％的生物活性，并且与天然因子VIII的体内半衰期相比，该构造的体内半衰期至少增加了1.5倍。

Description

聚乙二醇化的因子Ⅷ

技术领域

[001]本发明涉及一种蛋白质构造，其包含与至少一种可溶性聚合物相结合的凝血因子VIII(FVIII)，该可溶性聚合物例如是聚(环氧烷烃)，比如聚乙二醇。此外，本发明还涉及一种延长有出血紊乱的哺乳动物血液中的FVIII体内半衰期的方法，其中所述出血紊乱与FVIII功能缺陷或不足有关。

背景技术

[002]在血浆中循环的凝血因子VIII(FVIII)浓度非常低，并且与血管性血友病因子(VWF)以非共价键结合。在止血过程中，FVIII与VWF分离，并且通过提高有钙和磷脂或者细胞膜存在时的活化速率而作为辅因子用于被活化的因子IX(FIXa)-介导因子X(FX)的活化。[003]FVIII合成时是作为一个分子量约为270-330kD的单链的前体，具有A1-A2-B-A3-C1-C2的结构域结构。当其从血浆纯化后，FVIII包含一条重链(A1-A2-B)和一条轻链(A3-C1-C2)。轻链的分子量为80kD，然而因为B结构域内的蛋白质水解，重链的分子量范围为90-220kD。

[004]FVIII也可以作为重组蛋白经合成得到，用于治疗出血紊乱。人们设计了多种体外化验以检测重组体FVIII(r FVIII)作为治疗药物的潜在效果。这些化验均模拟内源性FVIII的体内活性。体外化验测定显示，在体外用凝血酶处理FVIII后，其促凝活性快速上升而后下降。这种活化与失活与重链和轻链中的具体限定的水解是相一致的，该水解可以改变FVIII不同结合表位的可用性，比如，使FVIII与VWF解离并结合至磷脂表面或改变与某种单克隆抗体的结合能力。

[005]FVIII缺少或功能缺陷与最常见的出血紊乱疾病-A型血友病相关。A型血友病治疗的选择之一是导出血浆或者利用rFVIII浓缩液进行替代治疗。严重的A型血友病患者的FVIII水平低于1％，于是通常会接受预防性的治疗以使FVIII在治疗之间的水平高于1％。通过计算外周循环中各种FVIII产物的平均半衰期，这个目标可以通过一周给予2到3次的FVIII治疗来达到。

[006]目前市场上有多种浓缩液用于A型血友病的治疗。其中一种是重组产物，这是由巴克斯特保健有限公司利用CHO细胞得到的。在细胞培养以及纯化、最后的制剂过程中，这种产品中都没有添加人或动物的血浆蛋白或白蛋白。

[007]许多FVIII浓缩液和治疗性蛋白多肽药物的生厂商的目标都是开发下一代产品，该产品具有提高的药效和药代动力学特性，同时保持其他的产品特性。

[008]治疗性的多肽类药物会快速地被蛋白水解酶降解或者被抗体中和。这将降低它们的半衰期和循环时间，从而限制它们的治疗效果。添加可溶性聚合物或者碳水化合物到多肽上已被证实可以阻止其降解并延长多肽的半衰期。比如，多肽药物的聚乙二醇化可以保护药物并改善它们的药效和药代动力学曲线(Harris JM et Chess RB，Nat Rev Drug Discov 2003；2：214-21)。聚乙二醇化的过程是将聚乙二醇的重复单元添加到多肽药物上。分子聚乙二醇化后可以增加药物对酶降解的耐受性，增加体内的半衰期，减少给药频率，降低免疫原性，增加物理和热稳定性，增加可溶性，增加脂稳定性，并且减少聚集。

[009]因此，添加可溶性聚合物，如通过聚乙二醇化是改善FVIII产品特性的一种方法。该项工艺被许多专利和专利申请所记录。

[010]US6037452描述了一种多聚(环氧烷烃)-FVIII或者FIX结合物，其中蛋白质与多聚(环氧烷烃)通过FVIII的羰基共价结合。

[011]EP1258497B1描述了一种制备FVIII与一种生物相容性聚合物的结合物的方法。该专利由Roestin等发表的文献做出了补充(Bioconj Chem 2000；11：387-96)。该结合物包含了用单甲氧基聚乙二醇修饰的切除了B结构域的重组FVIII。该结合物降低了FVIII的功能，并且，其凝血活性随修饰的程度而快速降低。

[012]WO04075923A3描述了聚合物-FVIII分子结合物，该结合物包含多元性的结合，每一个结合具有1到3个水溶性的聚合物与一个FVIII分子的共价结合。FVIII分子切除了B结构域。

[013]US4970300描述了一种修饰的FVIII，该难熔性的结合包括一种具有FVIII功能的蛋白质，其共价结合到一种无抗原性的配体上。

[014]US6048720描述了一种多肽与生物相容性聚合物的结合。

[015]WO94/15625描述了FVIII结合至优选分子量不大于5,000道尔顿的聚乙二醇。

发明内容

[016]这里仍然存在一种需要，将FVIII结合至可溶性聚合物以使其体内的半衰期延长，比如，聚乙二醇化的FVIII，将全长的FVIII结合分子量大于10,000道尔顿的聚乙二醇，使其与未聚乙二醇化的FVIII相比，在保持功能活性的同时提供更长的体内半衰期。

附图说明

[017]图1显示采用经SDS-PAGE和随后的免疫印迹法观察到rFVIII结合至PEG后其宽度和量均有增加。

[018]图2显示了血友病小鼠中PEG-rFVIII结合物与未结合rFVIII的药代动力学的对比。开口方形：PEG rFVIII，剂量200IU rFVIII/kg。闭合菱形：天然rFVIII，剂量200IU rFVIII/kg。

[019]图3显示了采用不同的抗FVIII抗体后经SDS-PAGE分析的聚乙二醇化位点的详细分析。

[020]图4显示了天然FVIII以及聚乙二醇化的rFVIII在凝血酶诱导时的活化与失活。

[021]图5显示了证实天然与聚乙二醇化的rFVIII的结构域的条带。

[022]图6显示了天然与聚乙二醇化的rFVIII中不同结构域的聚乙二醇化程度。

[023]图7显示了天然与聚乙二醇化的rFVIII的凝血酶失活速率。

具体实施方式

[024]本发明涉及一种蛋白质构造，其包括至少具有完整B结构域部分、结合于水溶性的聚合物的因子VIII，该聚合物是聚环氧烷烃、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚恶唑啉、聚丙烯酰吗啉或碳水化合物如多聚唾液酸(PSA)。在本发明的一种具体实施方式中，该水溶性聚合物为分子量大于10,000道尔顿的聚乙二醇。与标准治疗用FVIII相比，该构造保存了标准治疗用FVIII全部的生物活性，而且可以提供更长的体内半衰期。

[025]本发明的起始材料为FVIII，可以从人血浆分离得到，或者通过重组工程技术得到，如专利US4757006、US5733873、US5198349、US5250421、US5919766以及EP306968所描述。

[026]在此，术语“因子VIII”或“FVIII”是指包括至少具有一份完整B结构域的任何一种FVIII，其可以抑制与天然FVIII相关的生物活性。在本发明的一种具体实施方式中，FVIII是全长的因子VIII。FVIII分子是由能够与编码因子VIII：C的DNA杂交的DNA序列编码的蛋白质。该蛋白可以包含在A1-A2-B-C1-C2(US4868112)结构域之间或其中的不同位点的氨基酸缺失。FVIII分子也可以是天然FVIII的类似物，其中一个或多个氨基酸残基通过定点突变而被置换。

[027]在示例中，FVIII分子可以通过各种化学方法进行聚乙二醇化(Roberts JM et al.，AdvanDrug Delivery Rev 2002；54：459-76)。比如，FVIII可以通过下述方法被聚乙二醇化：使用马来酰亚胺化学试剂将聚乙二醇结合至游离的SH基团，或者在预先氧化后使PEG酰肼或PEG胺和FVIII的碳水化合物部分耦合。

[028]在本发明的一种具体实施方式中，通过使用含有活性N—羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)如琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯或者琥珀酰亚胺丙酸酯的聚乙二醇衍生物，借助赖氨酸残基改造FVIII。这些衍生物和FVIII的赖氨酸残基在温和条件下反应形成稳定的酰胺键。在本发明的一个具体实施方式中，聚乙二醇衍生物的链长为5,000道尔顿。也可以使用其它线型结构和支化结构的聚乙二醇衍生物，衍生物的链长为500至2,000道尔顿、2,000至5,000道尔顿、大于5,000道尔顿至10,000道尔顿或者是大于10,000至20,000道尔顿大于20,000至150,000道尔顿。

[029]氨基基团聚乙二醇化的另一种方法是通过形成氨基甲酸乙酯键与聚乙二醇碳酸酯进行化学结合，或者通过还原氨基化形成二级酰胺键而与醛或酮进行反应。

[030]在本发明中，通过商品化的聚乙二醇衍生物来化学修饰FVIII分子。这些衍生物可以是线型结构，也可以是支化结构。含有NHS基团的聚乙二醇衍生物的例子包括下述物质。

[031]下列聚乙二醇衍生物是购自Nektar Therapeutics(亨茨维尔，阿拉巴马州；参见www.nektar.com/PEG reagent catalog；Nektar Advanced PEGylation，price list 2005-2006)的商品化的样品：

mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)

mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯-α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)

mPEG-CM-HBA-NHS(CM＝羧甲基；HBA＝羟基丁酸)

支化聚乙二醇衍生物的结构式(Nektar Therapeutics)：

支化PEG N—羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)

[032]Kozlowski等人详细描述了这一含有支化结构的试剂(Bio Drugs 2001；5：419-29)。

[033]聚乙二醇衍生物的其它例子可在NOF公司(东京，日本；参见：www.nof.co.jp/english：catalogue 2005)购得。

线型结构聚乙二醇衍生物的普适结构式(NOF公司)：

X＝羧甲基

X＝羧戊基

x＝琥珀酸酯

mPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯

x＝戊二酸酯

mPEG琥珀酰亚胺戊二酸酯

支化结构聚乙二醇衍生物的结构式(NOF公司)：

2，3—二(甲基聚氧乙烯—氧)—1—(1，5—二氧—5—琥珀酰亚胺氧基，戊氧基)丙烷

2，3—二(甲基聚氧乙烯—氧)—1—(琥珀酰亚胺氧基羧戊基氧基)丙烷

[034]这些丙烷衍生物显示了具有1，2取代基模式的丙三醇主链。在本发明中，使用了基于含1，3—取代基的丙三醇结构的支化聚乙二醇衍生物或是在US2003/0143596A1中描述的其它支化结构。

[035]在本发明中也可使用可降解的聚乙二醇衍生物(如：水解交联剂)，正如Tsubery等人(J Biol Chem 2004；279：38118-24)和Shechter等人(WO04089280A3)所描述。

[036]令人惊奇的是，本发明中的聚乙二醇化的FVIII显示出全部功能活性，同时显示出FVIII的体内半衰期延长了的特性。此外，聚乙二醇化的rFVIII似乎更能抵抗凝血酶的失活作用。这一特性在各种体外体内的测试中被验证，同样也被下列实施例所证实。

实施例1

使用mPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯使rFVIII中赖氨酸残基聚乙二醇化

[037]从Advate制造工艺得到rFVIII本体的溶液(3400U/ml)，通过使用Econo-Pac 10DG柱(Bio-Rad公司)对溶液进行凝胶过滤，使用20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、pH为7.4、含0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80的溶剂作洗脱液。然后，缓慢搅拌下在该溶液中加入含链长5,000道尔顿(PEG-SS 5000)的mPEG琥珀酰亚胺琥珀酸脂(Abuchowski等人，Cancer Biochim Biophys 1984，7：175-86)(5mg PEG-SS/mg蛋白质)，并逐滴加入0.5M的氢氧化钠溶液调节pH值为7.4。然后，在室温缓慢搅拌一小时实现聚乙二醇化。

[038]接着，反应混合物被施加到在含20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、pH为7.4、含0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80的溶液中平衡后的离子交换色谱树脂(Fractogel EMD TMAE650M/Pharmacia XK-10柱，床层高度15厘米)。然后，用20cV平衡缓冲液冲洗层析柱，去除多余的试剂，同时聚乙二醇化了的rFVIII用洗脱缓冲液(20mM Hepes、1.0M氯化钠、0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80、pH为7.4)洗脱。借助含有再生纤维素、截留分子量为30000道尔顿的膜，通过超滤/渗滤作用浓缩洗出液，其中所用缓冲体系为：20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、0.5％蔗糖、pH值为7.4。

实施例2

体外聚乙二醇化rFVIII的生物化学表征

[039]依据实施例1，将Advate制造工艺中获得的rFVIII聚乙二醇化，表征聚乙二醇化的FVIII产物的生物化学特性。通过使用FVIII色原化验法(Rosen S，Scand J Haematol 1984；33(Suppl 40)：139-45)确定PEG—rFVIII的功能活性。这一方法是基于Ph.Eur.第五版(5.05)2.7.4血凝结素因子VIII的化验。

[040]在含钙离子的缓冲液中将含有因子VIII(FVIII：C)的样品与凝血酶、活化因子IX(FIXa)、磷脂和因子X(FX)混合。FVIII被凝血酶活化，随后形成含磷脂、FIXa和钙离子的复合体。这一复合体使得因子X活化为因子Xa，其依序切割显色底物FXa—1(AcOH^*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)。对硝基苯胺(pNA)释放的时间过程是通过一个酶标仪在405nm波长处测得。反应斜率与因子VIII浓度成比例。通过使用经过细微改动的商品化的ELISA体系(Cedarlane，Homby，安大略省，加拿大)，测得FVIII抗原值。从这些数据中可计算出FVIII色原和FVIII抗原比。通过测量280nm波长处的光密度确定制品中的蛋白质含量。从这些数据中计算出蛋白质含量(Hoyer LW in：人类蛋白质数据，1—6部分；Heberli主编；Wiley VCH，Weinheim，德国，1998)，标度为毫克每毫升(mg/ml)。

表1

 

	天然rFVIII	PEG-rFVIIIPEG-SS5000(5毫克每毫克蛋白质)
			FVIII：Chr活性[U/ml]	3,430	64
FVIII：Ag[U/ml]	4,067	81
			FVIII：Chr/FVIII:Ag比率	0.84	0.79
生物活性恢复(％)	100	94

[041]表1中的数据显示，设天然rFVIII的生物活性为100％，聚乙二醇化的rFVIII制样中，生物活性(以FVIII色原活性对FVIII抗原的比率表示)复原到90％以上。

实施例3

通过SDS-PAGE和免疫印迹技术表征聚乙二醇化rFVIII

[042]依据厂商的说明，使用购自Invitrogen(Carlsbad，加州，美国)含4—12％聚丙烯酰胺梯度凝胶，在还原性条件下由SDS PAGE表征天然rFVIII。使用了分子量指标Precision Plus指标(10000—250,000道尔顿)，该指标购自Bio-Rad。然后，通过免疫印迹法(电转印)将蛋白质转移到购自Bio-Rad(Hercules，加利福尼亚州，美国)的PVDF膜上，然后以购自Cedarlane(Hornby，安大略省，加拿大)的多克隆绵羊抗人类FVIII：C抗体孵育。免疫感染处理的最后步骤有：以购自Accurate(Westbury，纽约，美国)的结合碱性磷酸酶(ALP)的抗绵羊抗体孵育，接着用ALP底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚州，美国)使之最终可视化。结果总结在图1中。印迹显示了天然和聚乙二醇化rFVIII的结构域结构。结果显示，聚乙二醇化rFVIII比天然重组蛋白有更宽的条带和高分子量。

实施例4

在FVIII缺乏敲除小鼠模型中的聚乙二醇化rFVIII的药效动力学研究

[043]Bi等人(Nat Genet 1995；10：119—21)详细描述了FVIII缺乏的小鼠，这类小鼠被用作严重的人类血友病A的模型。5只小鼠组成一组，数组老鼠尾部静脉团注(10ml/kg)依据实施例1制备的PEG-rFVIII(PEG-SS 5000)或者天然rFVIII，每千克体重注射200IU FVIII的剂量。在麻醉后通过心脏穿刺得到各个小组的柠檬酸抗凝血血浆，各样品分别在注射后的5分钟、3、6、9和24小时分别获取。测量的血浆样品的FVIII活性水平。图2显示了本实验的相关结果。半衰期的平均值从1.9小时(天然rFVIII)上升到4.9小时(聚乙二醇化的rFVIII)，曲线下方面积(AUC)从13.0上升到25.2小时^*IU/ml。半衰期的计算是由MicroMathScientist执行，采用药效动力学库的第一模型(MicroMath，圣路易斯，密苏里州，美国)。

实施例5

通过SDS-PAGE和免疫印迹技术对rFVIII的聚乙二醇化的详细分析

[044]天然的和聚乙二醇化的rFVIII在60摄氏度下用1nM凝血酶消化60分钟，从而形成FVIII分子的特殊裂解片段和可定义的降解产物。这些重链和轻链片段通过SDS-PAGE和免疫印迹得到分离，正如实施例3中所述。为使被裂解片段可视化，使用了抗重链的A1和A2结构域、B结构域和抗轻链的氮端A3结构域的多克隆抗体和单克隆抗体。

[045]在图3中显示了所有聚乙二醇化的结构域，尽管程度不同。B结构域被强烈地聚乙二醇化。重链的A1和A2结构域部分地聚乙二醇化。而轻链的A3结构域上可以观察到各种程度的聚乙二醇化(单体、二聚体、三聚体......)。与实施例6一致，聚乙二醇化FVIII似乎具有更高的凝血酶抗性。

实施例6

聚乙二醇化的rFVIII的凝血酶抗性研究

[046]体外对FVIII的凝血酶处理，导致其促凝血能力的迅速上升和随后的下降。活化和失活的速率取决于凝血酶的浓度和FVIII的完整性。这一速率由FIXa辅因子化验监控，具体如下：

[047]FVIII在37摄氏度下用0.5nM或1nM凝血酶孵育。每隔0.5到40分钟不等的时间间隔抽取亚样品，并将其加入FIXa，FX、PL囊泡和氯化钙、以及含有特定凝血酶抑制剂的混合物，从而中止进一步的凝血酶介导的反应，随后再孵育3分钟。添加亚样品到显色底物上，FXa选择性裂解亚样品，同时底物中所含的EDTA能中止进一步的Xa活化。在15分钟的孵育后，用乙酸终止反应。吸光度(A405)值正比于FXa的浓度，并由ELISA阅读器测定。随后通过纯化的FXa参照曲线，将吸光度转化为FXa的浓度。以这一得到的FXa浓度对凝血酶孵育时间作图。

[048]将曲线的衰减部分用单指数模型拟合求得FVIII的准一级失活速率。

表2

[049]如图4和表2所示，在使用两种浓度的凝血酶浓度下，聚乙二醇化的FVIII都显示出更慢的失活速率。

实施例7

使用支化2，3—二(甲基聚氧乙烯—氧)—1—(1，5—二氧—5—琥珀酰亚胺氧基，戊氧基) 丙烷将rFVIII中的赖氨酸残基的聚乙二醇化

[050]用含489IU FVIII/ml的本体材料经Advate制造工艺来制备rFVIII的溶液，溶剂为：20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、pH为7.4，含0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80。在153毫升该溶液中，缓慢搅拌下加入购自NOF公司(东京，日本)、分子量为20,000道尔顿的支化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(PEG-SG)试剂(2，3—二(甲基聚氧乙烯—氧)—1—(1，5—二氧—5—琥珀酰亚胺氧基，戊氧基)丙烷)(5mg试剂/mg蛋白质)。在10分钟后，逐滴加入0.5M的氢氧化钠溶液，调节pH值为7.4。然后，在室温下缓慢搅拌一小时实现聚乙二醇化。

[051]接着，反应混合物被施加到在含20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、pH为7.4、含0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80的溶液中平衡好的离子交换色谱树脂(Fractogel EMD TMAE650M/Pharmacia XK-50柱，床层高度14.5厘米)，采用线性流速为1cm/min。然后，用25CV平衡缓冲液冲洗层析柱，去除多余的试剂(线性流速为2cm/min)，同时聚乙二醇化了的rFVIII用洗脱缓冲液(20mM Hepes、1.0M氯化钠、0.5％蔗糖和0.1％聚山梨醇酯80、pH为7.4)洗脱，线性流速为0.5cm/min。借助含有再生纤维素和截留分子量为30000道尔顿的膜，通过超滤/渗滤作用浓缩洗出液，其中缓冲体系为：20mM Hepes缓冲液、150mM NaCl、0.5％蔗糖、pH值为7.4。

实施例8

用分子量为20,000道尔顿的支化PEG-SG进行聚乙二醇化的rFVIII的体外表征

[052]根据实施例7，使用支化的PEG-SG试剂，借助赖氨酸残基，将Advate制造工艺中获得的rFVIII聚乙二醇化，并根据实施例2所述方法表征聚乙二醇化的rFVIII产物的生物化学特性。

表3

 

	天然rFVIII	PEG-rFVIIIPEG-SS5000(5毫克每毫克蛋白质)
			FVIII：Chr活性[U/ml]	9,950	1,040
FVIII：Ag[U/ml]	20,807	1,763
			FVIII：Chr/FVIII:Ag比率	0.48	0.59
生物活性恢复(％)	100	120

[053]表3中的数据显示，设天然rFVIII的生物活性为100％，聚乙二醇化的rFVIII制样中的生物活性(以FVIII色原活性对FVIII抗原的比率表示)完全复原。

[054]如实施例3所述，在还原条件下使用4—12％聚丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-PAGE和免疫印迹技术表征聚乙二醇化的rFVIII。图5显示了相关结果。印迹显示了天然和聚乙二醇化rFVIII的结构域结构。结果显示，聚乙二醇化rFVIII比天然重组蛋白有更宽的条带和高分子量。

[055]为了更细致地分析rFVIII的聚乙二醇化，可使用SDS-PAGE和免疫印迹技术。天然的和聚乙二醇化的rFVIII在60摄氏度下用1nM凝血酶消化60分钟，从而形成FVIII分子的特殊裂解和可定义的分解产物，正如实施例5所述。这些片段在SDS-PAGE和免疫印迹的作用下得到分离，并通过不同的抗FVIII抗体得到可视化。正如图6所示，尽管程度不同，所有的结构域都被聚乙二醇化。B结构域被强烈地聚乙二醇化。而轻链的A3结构域上可以观察到各种程度的聚乙二醇化(单体、二聚体、三聚体......)。这些结果显示，聚乙二醇化FVIII似乎具有更高的凝血酶抗性。

[056]如实施例6所述，凝血酶的活化和失活速率通过FIXa辅因子化验监控。将曲线的衰减部分用单指数模型拟合求得FVIII的准一级失活速率。

表4

[057]如图7和表4所示，在使用的两种凝血酶浓度下，聚乙二醇化的FVIII都显示出更慢的失活速率。

Claims (10)

1.一种蛋白质构造，其包括：

(a)至少具有完整B结构域部分的因子VIII分子；和

(b)结合在上述因子VIII分子上的至少一个聚乙二醇分子，所述聚乙二醇分子分子量大于10,000道尔顿；

所述构造具有天然因子VIII至少80％的生物活性，其中所述构造和天然因子VIII的生物活性通过色原活性与抗体的比率确定(FVIII:Chr/FVIII:Ag)，并且其中所述构造的体内半衰期较之天然因子VIII的体内半衰期提高了1.5倍。

2.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述构造具有天然因子VIII生物活性的至少90％的生物活性。

3.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述因子VIII分子是重组体因子VIII。

4.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述因子VIII分子是全长因子VIII。

5.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量大于10,000道尔顿，直至约125,000道尔顿。

6.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为约15,000～约20,000道尔顿。

7.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为约18,000～约25,000道尔顿。

8.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为约20,000道尔顿。

9.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为约20,000～约150,000道尔顿。

10.如权利要求1所述的蛋白质构造，其特征在于，所述聚乙二醇具有线型结构或支化结构。

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