CN104937423A - 凝血反应的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以各种止血效果的评价方法和各种凝血起始试剂为对象，尝试建立具有凝血因子VIII（FVIII）代替活性的物质介导的凝血反应的评价方法。其结果发现，通过应用包含活化凝血因子XI（FXIa）和磷脂的凝血起始试剂，以血液样品中的凝血酶生成量为指标，能够评价具有凝血因子VIII（FVIII）代替活性的物质在凝血反应中的效果。
Description
技术领域
本发明涉及评价具有凝血因子VIII(FVIII)功能代替活性的物质介导的凝血反应的方法。另外，本发明涉及包含活化凝血因子XI(FXIa)的用于评价凝血反应的试剂、以及包含该试剂的用于评价具有凝血因子VIII(FVIII)功能代替活性的物质介导的凝血反应的试剂盒等。
背景技术
血友病是凝血因子VIII（FVIII）或凝血因子IX（FIX）先天缺乏或功能不全引起的出血性疾病。前者称为血友病A，后者称为血友病B。它们的基因都存在于X染色体上，基因异常通过性连锁隐性遗传传递，因此发病患者中99%以上是男性。已知患病率是出生男子1万人中大约1人，血友病A与血友病B的比率大约是5:1。
血友病患者中主要的出血部位可列举关节内、肌肉内、皮下、口腔内、颅内、消化道、鼻腔内等。其中关节内反复出血进展为关节障碍、伴有步行困难的血友病性关节病，有时最终需要关节置换术。因此，是降低血友病患者的QOL的主要原因。
血友病的严重程度与血液中FVIII活性或FIX活性密切相关。活性不足1%的患者归类为重度、活性为1%以上不足5%的患者归类为中度、活性为5%以上不足40%的患者归类为轻度。占血友病患者约半数的重度患者中，每月出现几次出血症状，这是与中度患者以及轻度患者相比显著高的频率。因此认为，重度血友病患者中，通过FVIII或FIX补充疗法将血液中FVIII活性或FIX活性维持在1%以上，对于阻止出血症状出现是有效的（非专利文献1）。
作为相关的出血异常，除血友病、后天性血友病之外，还已知冯维勒布兰德因子（von Willebrand factor，vWF）功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病。vWF不仅对于血小板与血管壁的损伤部位的内皮下组织正常粘附是必须的，对血小板与FVIII形成复合物保持血液中FVIII水平正常也是必须的。冯维勒布兰德病患者中，这些功能降低，引起止血功能异常。
为了预防和/或治疗血友病患者中的出血，主要应用从血浆纯化或通过基因重组技术制备的凝血因子。
作为监测FVIII等凝血因子的药效的方法，已知活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、基于APTT的一段式凝血法（APTT-based one-stage coagulation method）、凝血酶生成试验(TGA)等。APTT和一段式凝血法长期广泛地用作监测FVIII制剂药效的方法。APTT为下列方法，在被测血浆中加入APTT试剂后，加入CaCl2，测定纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白的时间，即至凝固起始的时间。一段式凝血法为下列方法，将用缓冲液以固定比例稀释的被测血浆加入FVIII缺乏血浆中，以与APTT相同的方法测定凝固时间，由应用连续稀释的正常血浆代替被测血浆得到校准曲线求出被测血浆的FVIII活性。TGA为下列试验，应用针对凝血酶的荧光底物，以酶活性随时间测定凝血反应亢进中生成的凝血酶量(非专利文献2)。TGA中，能够评价从凝血反应的凝血酶生成起始阶段至凝血反应扩增时的凝血酶生成的一系列凝血反应。进一步，对用于TGA的凝固起始试剂，报告了以低浓度的磷脂溶液（4μM）为基础组合低浓度的组织因子的试剂(非专利文献2)、组合FIXa的试剂(非专利文献3、4)、组合FXII活化剂（鞣花酸）的试剂(非专利文献5)、组合低浓度的组织因子及FXII活化剂（鞣花酸）的混合溶液的试剂(非专利文献5)。
近年来，发现了与活化凝血因子IX（FIXa）以及第X因子（FX）二者结合、具有代替FVIII的辅因子功能、即促进FIXa介导的FX活化的功能的功能的双特异性抗体(专利文献1-3)。但是，该双特异性抗体虽然代替FVIII的功能，其作用表现机制与FVIII的该机制不完全相同。例如，FVIII仅在由FXa、凝血酶活化后开始显示辅因子活性，但上述双特异性抗体无需该活化过程显示辅因子活性。因此，现有FVIII的药效监测方法不一定能够适用。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1 : Astermark J. Haemophilia. 2003 9(Suppl.1) 32
非专利文献2 : Pathophysiol Haemost Thromb. 2003;33(1):4
非专利文献3 : J Thromb Haemost. 2011 Aug;9(8):1549-55
非专利文献4 : J Thromb Haemost. 2003 May;1(5):1005-11
非专利文献5 : Int J Hematol. 2009 Dec;90(5):576-82
专利文献
专利文献1 : WO2005/035756
专利文献2 : WO2006/109592
专利文献3 : WO2012/067176。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明是鉴于这种状况作出的。本发明的目的是，提供评价具有凝血因子VIII(FVIII)代替活性的物质在凝血反应中的药效的方法、用于该方法的凝血起始试剂、以及包含该试剂的试剂盒。
解决问题的手段
本发明人为了解决上述问题，以各种止血效果评价方法和各种凝血起始试剂为对象，尝试构建评价具有凝血因子VIII(FVIII)代替活性的物质介导的凝血反应的方法。结果，本发明人发现，通过使用包含活化凝血因子XI(FXIa)的凝血起始试剂，以血液样品中凝血酶生成量为指标，能够以适当灵敏度评价具有凝血因子VIII(FVIII)代替活性的物质在凝血反应中的效果。另外，本发明人成功地发现了，应用包含活化凝血因子XI(FXIa)的凝血起始试剂的凝血酶生成试验方法。本发明基于上述发现，涉及以下[1]至[9]。
[1]评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法，其包含步骤(i)以及(ii)：
(i) 向包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的、从被测者分离的血液来源样品中，加入包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂，
(ii)测定步骤(i)得到的血液来源样品的凝血酶生成量。
[2][1]中记载的方法，其中具有凝血因子VIII代替活性的物质是与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及与凝血因子X结合的双特异性抗体。
[3][1]或[2]中记载的方法，其中被测者是出血性疾病患者。
[4][3]中记载的方法，其中出血性疾病是以凝血因子VIII或活化凝血因子VIII活性降低或缺乏为原因的疾病。
[5][3]或[4]中记载的方法，其中出血性疾病是选自血友病、后天性血友病、以及冯维勒布兰德因子（vWF）功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病的疾病。
[6][1]至[5]的任一项中记载的方法，其中凝血起始试剂是包含活化凝血因子XI以及磷脂的试剂。
[7]用于在[1]至[6]的任一项中记载的方法中使用的凝血起始试剂，其包含活化凝血因子XI。
[8][7]中记载的凝血起始试剂，其进一步包含磷脂。
[9]用于在[1]至[6]的任一项中记载的方法中使用的试剂盒，其包含[7]或[8]中记载的凝血起始试剂。
发明效果
通过本发明，提供了以血液来源样品的凝血酶生成量为指标评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法。具有凝血因子VIII代替活性的物质、特别是与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体的辅因子活性的表现机制与凝血因子VIII的该机制不完全相同。因此，用双特异性抗体治疗血友病等出血性疾病中，广泛应用的药效评价方法不一定能够适用，有可能无法适当评价双特异性抗体的效果。通过本发明，即使在利用上述双特异性抗体的出血性疾病治疗中，也能准确评价其效果。
附图简述
图1示出与活化凝血因子IX以及凝血因子X结合的双特异性抗体之一hBS23的FVIII功能代替活性。hBS23在FIXa/FX/磷脂存在下显示FXa产生促进活性。
图2示出FVIII缺乏血浆、或具有抑制剂的FVIII缺乏血浆的凝血酶生成试验参数（峰高度(A)以及ETP(B)）中，hBS23以及基因重组人凝血因子VIII（rhFVIII）的效果。各血浆批次得自确认了重度血友病A（血浆1, 2, 3）或具有抑制剂的重度血友病A（具有抑制剂的血浆1, 2）的单一供体。抑制剂滴度是，具有抑制剂的血浆1、2分别是292、148贝提斯达单位(Bethesda units)。在FVIII缺乏血浆以及具有抑制剂的FVIII缺乏血浆中，hBS23在FXIa/磷脂试剂诱导条件下浓度依赖性地增加峰高度（Peak height）以及ETP。
实施本发明的方式
本发明涉及评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法，其包含以下步骤(i)以及(ii)：
(i) 在包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的、从被测者分离的血液来源样品中，加入包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂，
(ii)测定步骤(i)得到的血液来源样品的凝血酶生成量。
通过使用本发明方法，能够适当评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的辅因子活性。特别地，与作为凝血因子的药效监测方法的之前广泛使用的利用活化部分凝血活酶时间（APTT）值的方法、利用包含低浓度组织因子的凝固起始试剂诱导的凝血酶生成试验比较，认为本发明能够以适当灵敏度监测止血效果。
本发明的“评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法”可称为“评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的辅因子活性的方法”。另外，也可称为“评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的出血性疾病治疗效果的方法”。或者，也可称为“评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的出血性疾病的预防效果的方法”。进一步地，“评价方法”也可表达为“判定方法”、“测定方法”。
凝血因子VIII是牵涉凝血的一系列分子之一，被凝血酶或活化凝血因子X活化时表现辅因子活性，促进活化凝血因子IX介导的凝血因子X活化反应。本发明的具有凝血因子VIII代替活性的物质在促进活化凝血因子IX介导的凝血因子X活化方面与凝血因子VIII共通，但在例如不需要凝血酶、活化凝血因子X的活化方面与凝血因子VIII不同。
本发明的具有凝血因子VIII代替活性的物质也可称为具有凝血因子VIII样活性的物质。本发明中“代替凝血因子VIII的功能”意味着，识别凝血因子IX（FIX）或凝血因子IXa（FIXa）、和凝血因子X（FX），促进FIXa介导的FX活化（促进FIXa介导的FXa产生）。FXa产生促进活性可应用例如由FIXa、FX、合成底物S-2222（FXa的合成底物）、磷脂组成的测定体系评价。该测定体系显示与血友病A症例中疾病的严重程度和临床症状有相关性(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23)。
本发明中记载的具有代替凝血因子VIII的功能的活性的物质的优选实施方式可列举，与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体。该抗体可根据例如WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176等中记载的方法取得。具体地，基于针对凝血因子IX和/或活化凝血因子IX的抗体和针对凝血因子X的抗体的序列，应用本领域技术人员公知的基因重组技术，能够制备抗体。可基于针对凝血因子IX和/或活化凝血因子IX的抗体和针对凝血因子X的抗体的序列构建编码抗体的多核苷酸，将其导入表达载体后，在适当的宿主细胞中表达（例如，参考Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137）。
本发明的双特异性抗体可从宿主细胞内或细胞外（培养基等）分离，并纯化为实质上纯的均一抗体。抗体的分离、纯化可使用通常的抗体纯化中使用的分离、纯化方法，不限于特定方法。例如，可适当选择、组合层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、再结晶等，来分离、纯化抗体。本发明的双特异性抗体包含WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176等中记载的抗体。
双特异性抗体包含能够与至少2种不同抗原特异性结合的第一抗原结合部位和第二抗原结合部位。第一抗原结合部位和第二抗原结合部位分别具有与凝血因子IX和/或活化凝血因子IX以及与凝血因子X的结合活性即可，没有特别限定，例如，可列举抗体、支架分子（抗体样分子）、肽等与抗原结合的必要部位、或包含该部位的片段。支架分子是通过与靶分子结合而发挥功能的分子。可应用任何多肽，只要是能够与至少1个靶抗原结合的立体结构稳定的多肽。该多肽的例子可列举，例如，抗体可变区、纤连蛋白（WO2002/032925）、蛋白A结构域（WO1995/001937）、LDL受体A结构域（WO2004/044011, WO2005/040229）、锚蛋白（WO2002/020565）等，以及Nygren等（Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997)、Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004))、Binz等(Nature Biotech 23:1257-1266(2005))、Hosse等(Protein Science 15:14-27(2006))中记载的分子。另外，也可应用Curr Opin Mol Ther. 2010 Aug;12(4):487-95.和Drugs. 2008;68(7):901-12.中记载的能够与靶抗原结合的肽分子。
双特异性抗体可应用例如基因重组技术制备（例如，参考Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 在the United Kingdom由MACMILLAN PUBLISHERS LTD公开, 1990）。重组型抗体可如下获得，从杂交瘤或产生抗体的敏化淋巴细胞等抗体产生细胞克隆编码它的DNA，掺入适当的载体，将其导入宿主（宿主细胞）而产生。
双特异性抗体不仅可包含全抗体，也可包含抗体片段、低分子化抗体、以及抗体修饰物。
例如，抗体片段、低分子化抗体包括双抗体(diabody；Db)、线状抗体、单链抗体（下文也称为scFv）分子等。此处，“Fv”片段是最小的抗体片段，包含完整的抗原识别部位和结合部位。
双特异性抗体包括人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等，其来源不限。另外，也可为嵌合抗体、人化抗体等基因修饰抗体。
人抗体的获得方法是已知的，例如，可用目的抗原免疫具有人抗体基因的全部组成部分的转基因动物获得目的人抗体（参考国际专利申请公开号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735）。
基因修饰抗体可应用已知方法制备。具体地，例如嵌合抗体是由免疫动物的抗体H链和L链可变区、以及人抗体的H链和L链恒定区组成的抗体。将编码免疫动物来源的抗体的可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其掺入表达载体，导入宿主生产，可得到嵌合抗体。
人化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的修饰抗体。人化抗体通过将免疫动物来源的抗体的CDR移植到人抗体互补决定区而构建。其一般基因重组方法也是已知的（参考欧州专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO 96/02576、Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856、国际专利申请公开号WO 99/51743）。
本发明中，从被测者分离包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的血液来源样品。该血液样品可从施用了具有凝血因子VIII代替活性的物质的被测者获得。被测者可列举，体内任何部位伴有出血性症状的患者（出血性疾病患者）。主要的出血部位可列举，关节内、肌肉内、皮下、口腔内、颅内、消化道、鼻腔内等，但不限于这些。出血性疾病患者优选地列举，以凝血因子VIII和/或活化凝血因子VIII的活性降低或缺乏为原因的出血性疾病患者。以凝血因子VIII和/或活化凝血因子VIII的活性降低或缺乏为原因的出血性疾病患者是具有出血性症状的患者，可列举先天或后天地凝血因子VIII以及活化凝血因子VIII任一或二者的活性降低或缺乏的患者。凝血因子VIII、活化凝血因子VIII的活性降低可列举，与健康者比较，这些活性优选地不足40％（例如不足40％、不足30％、不足20％、不足10％）、更优选地不足10％（例如不足10％、不足9％、不足8％、不足7％、不足6％）、进一步优选地不足5％（例如不足5％、不足4％、不足3％、不足2％）、特别优选地不足1％的患者，但不限于这些。凝血因子VIII、活化凝血因子VIII的活性的测定方法是本领域技术人员公知的(例如，“みんなに役立つ血友病の基礎と临床”，白幡聡，医薬ジャーナル社，2009等)。
更具体地，这些疾病的例子可列举，选自血友病（血友病A、血友病B）、后天性血友病、以及冯维勒布兰德因子（vWF）功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病的疾病，但不限于这些。血液来源样品包含血清、血浆、或全血。本发明中，优选使用血浆样品。从被测者获得血液来源样品的方法是本领域技术人员公知的。
本发明中，在从上述被测者获得的血液来源样品中，加入活化凝血因子XI、或包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂。
本发明的活化凝血因子XI可如下纯化制备：将凝血因子XI利用活化凝血因子XII、凝血酶等活化，并通过离子交换、反相、凝胶过滤等层析、或将活化凝血因子XI的抗体固定于柱的亲和层析、或进一步组合多个这些柱而纯化制备。
人凝血因子XI的氨基酸序列和编码它的核酸的碱基序列分别已知为GenBank: NP_000119（序列编号：2）和 NM_000128（序列编号：1）。但是，此处所述的凝血因子XI不限于人凝血因子XI，也可以是其它动物物种(例如，马、牛、猪、兔、大鼠、小鼠)的凝血因子XI。凝血因子XI除天然蛋白质外，也可制备为利用公知的基因重组技术得到的重组蛋白质。重组蛋白质可通过本领域技术人员公知的方法制备。重组蛋白质可如下纯化制备，例如，将编码凝血因子XI的核酸掺入适当的表达载体中，将其导入适当的宿主细胞中，回收得到的转化体，获得提取物后，通过离子交换、反相、凝胶过滤等层析、或将凝血因子XI的抗体固定于柱的亲和层析或进一步组合多个这些柱而纯化制备。
另外，凝血因子XI作为与谷胱甘肽 S-转移酶蛋白质的融合多肽、或添加多数组氨酸的重组多肽在宿主细胞（例如，动物细胞、大肠杆菌等）中表达时，表达的重组多肽可应用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。
上述载体在例如以大肠杆菌为宿主时，为了使载体在大肠杆菌（例如、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等中大量扩增而大量制备，只要具有用于在大肠杆菌中扩增的“ori”，进一步具有转化大肠杆菌的选择基因（例如，可用某些药剂（氨苄西林、四环素、卡那霉素、氯霉素）鉴别的耐药基因）即可，没有特别制限。载体的例子可列举，M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亚克隆、切出为目的时，除上述载体外，还可列举例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在产生凝血因子XI的目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如，以在大肠杆菌中表达为目的时，载体除具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外，在宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，也必须具有能够在大肠杆菌中高效表达的启动子例如lacZ启动子（Ward等, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araB启动子（Better等, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、或T7启动子等。除上述载体外，这些载体还可列举pGEX-5X-1（Pharmacia）、“QIAexpress system”（Qiagen）、pEGFP、或pET等。
另外，载体可包含用于多肽分泌的信号序列。在大肠杆菌周质中产生时，用于多肽分泌的信号序列可使用pelB信号序列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）。载体向宿主细胞的导入可应用例如氯化钙法、电穿孔法实施。
除大肠杆菌以外，载体可列举例如哺乳动物来源的表达载体（例如，pcDNA3 (Invitrogen)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17)，p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫细胞来源的表达载体（例如，“Bac-to-BAC baculovairus expression system”（Gibco-BRL）、pBacPAK8）、植物来源的表达载体（例如pMH1、pMH2）、动物病毒来源的表达载体（例如，pHSV、pMV、pAdexLcw ）、逆转录病毒来源的表达载体（例如，pZIPneo）、酵母来源的表达载体（例如，“Pichia Expression Kit”（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌来源的表达载体（例如，pPL608、pKTH50）等。
以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达为目的时，必须具有用于在细胞内表达的必要启动子，例如SV40启动子（Mulligan等，Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子（Mizushima等, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMV启动子等，更优选具有用于选择对细胞的转化的基因（例如，可用药剂（新霉素、G418等）鉴别的耐药基因）。具有这种特性的载体可列举，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
另外，在体内生产多肽的系统可列举，例如，使用动物的生产系统、使用植物的生产系统。在该动物或植物中导入编码凝血因子XI的核酸，在动物或植物体内产生凝血因子XI并回收。
使用动物时，具有应用哺乳类动物、昆虫的生产系统。哺乳类动物可应用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。另外，应用哺乳类动物时，可应用转基因动物。
如此得到的凝血因子XI可从宿主细胞内或细胞外（培养基等）分离，作为实质上纯且均一的多肽纯化。多肽的分离、纯化应用通常的多肽纯化中使用的分离、纯化方法即可，没有任何限制。例如，可适当选择、组合层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、再结晶等来分离、纯化多肽。
另外，通过在纯化前或纯化后使适当的蛋白质修饰酶作用于凝血因子XI，也可任选地加入修饰或除去部分肽。蛋白质修饰酶应用例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
另外，凝血因子XI也包含1个或多数氨基酸改变、潜在地具有使凝血因子IX活化为活化凝血因子IX的功能的蛋白质。另外，在该范围内也包含凝血因子XI的片段。
改变氨基酸残基时，期望变为保留氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可列举疏水性氨基酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、亲水性氨基酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、具有脂肪族侧链的氨基酸（G、A、V、L、I、P）、具有含羟基侧链的氨基酸（S、T、Y）、具有含硫原子侧链的氨基酸（C、M）、具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸（D、N、E、Q）、具有含碱侧链的氨基酸（R、K、H）、以及具有含芳香族侧链的氨基酸（H、F、Y、W）（括号内均表示氨基酸的单字母标记）。这些各组内的氨基酸置换称为保守置换。已知具有对给定氨基酸序列进行1或多个（例如2、3、4、5、10、20、30、40、50、或100个）氨基酸残基的缺失、添加和/或置换为其它氨基酸而修饰的氨基酸序列的多肽保持其生物学活性（Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6；Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13）。该变体与氨基酸改变前的凝血因子XI或凝血因子XI片段的氨基酸序列具有至少70%、更优选地至少75％、更优选地至少80%、进一步优选地至少85%、进一步优选地至少90%、并且最优选地至少95%的氨基酸序列同一性。本说明书中的序列同一性定义为，按需要比对序列、导入适当空隙使得序列同一性最大后，与原始重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列残基相同的残基比例。
氨基酸序列、碱基序列的同一性可应用Karlin和Altschul的算法BLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）确定。基于BLAST的算法开发称为BLASTN和BLASTX的程序（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。应用BLASTN分析碱基序列时，参数为，例如分数＝100、字长＝12。另外，应用BLASTX分析氨基酸序列时，参数为，例如分数＝50、字长＝3。应用BLAST和Gapped BLAST程序时，应用各程序的缺省参数。这些分析方法的具体技术是公知的。
作为用于制备编码氨基酸序列改变的蛋白质的DNA的方法，定点诱变法（Kramer, W. and Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）、杂交技术（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）、PCR技术（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）等是本领域技术人员公知的。
另外，本发明中，优选在活化凝血因子XI中加入磷脂。本发明中的磷脂没有特别限定。磷脂可列举，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、神经磷脂（sphyngomyelin）以及它们2种以上的组合，但不限于这些。本发明中，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺的组合是优选的。
本发明中，活化凝血因子XI可作为试剂形式加入从被测者分离的血液来源样品。本发明中，该试剂称为“凝血起始试剂”。本发明的“凝血起始试剂”除活化凝血因子XI外还可包含磷脂、钙、镁等盐。
活化凝血因子XI和/或磷脂可以以足以测定下述凝血酶生成量的量加入血液来源样品。活化凝血因子XI可以以每血浆样品1ml例如0.00001 pmol至1000 nmol之间的量加入，但不限于这些。另外，磷脂可以以每血浆样品1ml例如0.001 nmol至10000 nmol之间的量加入，但不限于这些。
本发明中，测定通过该步骤得到的血液来源样品的凝血酶生成量。本发明人阐明了，以血液来源样品的凝血酶生成量为指标，可评价与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体介导的辅因子活性。即，通过本发明，提供了以血液来源样品的凝血酶生成量为指标，评价具有凝血因子VIII代替活性的物质（优选地，与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体）介导的凝血反应的方法。血液来源样品的凝血酶生成量可由本领域技术人员通过公知方法测定。例如，可加入用于换算样品中的凝血酶量的试剂、用市售装置算出最大凝血酶量（峰高度）以及总凝血酶量（ETP）而测定，但不限于这些。
本发明中，以血液来源样品的凝血酶生成量为指标，可以以适当灵敏度评价与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体介导的辅因子活性。对于止血作用所必需的辅因子活性，例如，考虑下列方法：根据具有凝血因子VIII代替活性的物质的临床效果与本发明方法中凝血酶生成量的相关性进行判断的方法、比较本发明方法中包含具有第VIII因子代替活性的物质的血液来源样品的凝血酶生成量与包含凝血因子VIII活性的血液来源样品的凝血酶生成量的方法等。例如，本发明中，如果调节凝血起始试剂中活化凝血因子XI和磷脂浓度，使得具有1%凝血因子VIII活性（FVIII:C）的血液来源样品或加入凝血因子VIII使得FVIII:C为1%的血液来源样品中可见检测灵敏度下限的凝血酶生成反应，则通过凝血酶生成反应，向被测者施用的具有凝血因子VIII代替活性的物质可评价为具有引起凝血反应的活性、即具有止血效果。或者，例如，本发明中，从施用了具有凝血因子VIII代替活性的物质的被测者(重度血友病A患者)分离的血液来源样品的凝血酶生成量与不含具有凝血因子VIII代替活性的物质或在该物质作用不显示状态下相同被测者血液来源样品中添加0.01 U/mL凝血因子VIII的样品(比较样品)的凝血酶生成量比较大致相同或更高时，向被测者施用的具有凝血因子VIII代替活性的物质可评价为具有引起凝血反应的活性、即具有止血效果。凝血酶生成量大致相同意味着，施用具有凝血因子VIII代替活性的物质的被测者的血液来源样品的凝血酶生成量相对于比较样品的凝血酶生成量可列举为，例如加减100％以内、优选地50％以内、特别优选地20％以内，但不限于这些。凝血酶生产量例如可以以最大凝血酶量（峰高度）、总凝血酶量（ETP）为指标。
另外，本发明提供了用于在本发明的凝血反应评价中应用的凝血起始试剂。本发明的凝血起始试剂包含活化凝血因子XI。本发明的凝血起始试剂可进一步包含磷脂。磷脂的例子在上文记载。本发明的凝血起始试剂可额外包含钙、镁等盐。
用于在本发明的凝血反应评价中应用的凝血起始试剂可称为“活化凝血因子XI、或活化凝血因子XI以及磷脂在用于评价凝血反应的凝血起始试剂的制备中的应用”。另外，也可称为“用于评价凝血反应的活化凝血因子XI、或活化凝血因子XI以及磷脂”。进一步地，本发明的凝血起始试剂也可表达为“用于评价凝血反应的凝血起始试剂的制备方法，包括将活化凝血因子XI或活化凝血因子XI以及磷脂、以及药学或生理学容许的载体配制成制剂的步骤”。本说明书中的活化凝血因子XI也包含凝血因子XI，只要其外部加入血液来源样品。本发明的活化凝血因子XI可为市售、从血浆纯化、或通过基因重组技术制备中的任一。这些取得方法是本领域技术人员公知的。
根据本发明的凝血反应评价方法所必需的凝血起始试剂等各种试剂类可预先包装作为试剂盒提供。除凝血起始试剂外，本发明的试剂盒中还可包含从血液中凝血因子VIII活性、凝血因子IX活性正常的人分离的血浆样品的阳性对照，具有凝血因子VIII代替活性的物质，可用于凝血酶生成分析的物质（例如，对于凝血酶的荧光底物、用于换算样品中的凝血酶量的试剂等）。另外，试剂盒中包含的各种试剂根据其使用方式可制为粉末状或液体。另外，可将它们收纳在适当容器中，在适当时使用。
另外，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考并入本说明书。
实施例
下文通过实施例对本发明进行更详细说明，但本发明不限于这些实施例。
具有FVIII功能代替活性的抗FIXa/FX双特异性抗体的制备以及FVIII功能代替活性的测定
具有FVIII功能代替活性的抗FIXa/FX双特异性抗体用WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176中记载的方法取得。将WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176中记载的抗体基因掺入动物细胞表达载体，将其转染到HEK293细胞中，瞬时表达双特异性抗体。随后，用蛋白A以及过滤纯化细胞培养上清中包含的双特异性抗体。
如此纯化的双特异性抗体的FVIII功能代替活性的测定通过以下所示的酶分析进行。在室温下，将1 nM人FIXa(Enzyme Research Laboratories)、140 nM人FX(Enzyme Research Laboratories)、20 μM磷脂（10%磷脂酰丝氨酸、60%磷脂酰胆碱、30%磷脂酰乙醇胺）以及双特异性抗体在包含5 mM CaCl2和0.1%牛血清白蛋白的tris缓冲生理盐水溶液中混合后，温育2分钟，进行FIXa介导的FX活化反应。本反应通过EDTA的添加停止。随后，添加FXa特异性显色底物溶液S-2222（CHROMOGENIX），应用SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices)测定405 nm的吸光度变化。根据已知浓度的人FXa(Enzyme Research Laboratories)产生的吸光度变化制成校准曲线，评价双特异性抗体介导的FXa产生促进活性。
APTT测定
应用Thrombocheck APTT-SLA（Sysmex）作为APTT试剂，按照标准APTT测定方案进行测定。向包含双特异性抗体或重组人FVIII（rhFVIII，Bayer）的50μL因子VIII（FVIII）缺乏人血浆（市售品，George King Bio-Medical）或具有抑制剂的FVIII缺乏血浆（市售品，George King Bio-Medical）中，加入50μL的APTT试剂。温育3分钟后，添加50μL的0.02 mol/L氯化钙溶液起始凝固反应，用凝血自动测定装置（KC4 Delta、Trinity Biotech）测定APTT。
凝血酶生成分析
应用装备了激发波长390 nm/荧光波长460 nm滤片装置、分配器、分析软件（Thrombinoscope software version 3.0.0.29，Thrombinoscope BV）的96孔荧光板荧光光度计（Thermo Fisher Scientific Instruments），通过校准自动化凝血图像仪（calibrated automated thrombography）得到凝血图（thrombogram）。向各孔中添加包含双特异性抗体或重组人FVIII（rhFVIII，bayer）的80 μL的因子VIII（FVIII）缺乏人血浆或具有抑制剂的FVIII缺乏血浆（George King Bio-Medical）。随后，添加20 μL的包含0.47 nM人因子XIa (Enzyme Research Laboratories)与20 μM磷脂的凝固起始试剂（FXIa/磷脂试剂）或PPP-Reagent LOW（Thrombinoscope BV）。为了换算为凝血酶量，代替凝固起始试剂添加20 μL的Thrombin Calibrator（Thrombinoscope BV）。为了起始反应，通过程序化装置自动分配从FluCa试剂盒（Thrombinoscope BV）制备的20 μL的FluCa试剂。应用装置的软件，算出凝血图、峰高度（最大凝血酶量）、以及ETP（总凝血酶量）。
血友病A模型
首先，从用人FVIII免疫的小鼠制备杂交瘤，鉴定与食蟹猴交叉且与猪不交叉的抗FVIII中和抗体。与食蟹猴以及猪的交叉性通过向各柠檬酸血浆中加入该抗体、用APTT或凝血酶生成试验测定凝血是否抑制而确认。该抗FVIII抗体以使APTT延长2倍的用量施用于食蟹猴，成为后天性血友病A状态。随后，作为被测药物，将双特异性抗体之一的hBS23 0.3 mg/kg（n=3）或猪FVIII 1 U/kg（n=3）施用于动物静脉内。猪FVIII通过常规方法应用基因重组技术制备并纯化。将不施用药剂的组（n=6）设定为对照。麻醉下在动物中人工诱导出血（用18G的针对前臂、上臂和大腿肌肉进行穿刺），随后，观察动物直至3日后。在施用1 U/kg猪FVIII的组中，1日2次（共6次；观察最后1日不施用）向动物静脉内额外施用 1 U/kg猪FVIII。这是设计以维持血浆中FVIII活性为0.01 U/mL或以上的方案。出血的指标采用血红蛋白值（反映失血引起的贫血）以及皮肤的变紫部分（出血痕迹）面积。
结果
＜双特异性抗体的FVIII功能代替活性＞
双特异性抗体之一hBS23在FIXa/FX/磷脂存在下显示FXa产生促进活性，表明具有FVIII功能代替活性（图1）。
＜双特异性抗体的体内止血活性＞
对照动物中，至3日后，观察到血红蛋白值的进行性降低以及皮肤变紫部分的扩大。这些通过hBS23的单次静脉内施用或1 U/kg猪FVIII的反复静脉内施用（1日2次）抑制。抑制程度二者几乎同等。
实验期间hBS23的血浆中浓度是约30 nM（组均值为40 - 18 nM），认为该浓度附近具有大约与将血浆中FVIII活性维持在0.01 U/mL (FVIII活性1%)或以上的方案（1 U/kg猪FVIII的反复静脉内施用（1日2次））同等的止血活性。
＜血浆分析中双特异性抗体的活性＞
双特异性抗体之一hBS23在FVIII缺乏血浆中在FXIa/磷脂试剂诱导条件下，浓度依赖性地增加凝血酶生成参数峰高度（最大凝血酶量）以及ETP（总凝血酶量）(图2)。峰高度分析中，hBS23在30 nM具有与0.01 U/mL的rhFVIII (FVIII活性1%)相当的活性，在300 nM具有接近0.1 U/mL的rhFVIII (FVIII活性10%)的活性。如前述，在体内试验中，通过将血浆中hBS23浓度保持为约30 nM，得到与将血浆中FVIII活性维持在0.01 U/mL (FVIII活性1%)或以上的方案同等的止血活性。因此暗示，凝血酶生成试验是以适当灵敏度反映hBS23的止血作用的监测法。
另一方面，在PPP-Reagent LOW（包含低浓度的组织因子的凝固起始试剂）诱导条件下进行凝血酶生成试验时，与FXIa/磷脂试剂诱导条件下比较，hBS23活性和hFVIII的测定灵敏度低，判断为难以适当反映体内止血作用。另外，应用APTT值评价hBS23的FVIII比活性时，计算为hBS23在30 nM以上具有FVIII 1 U/mL (FVIII活性 100%)以上的比活性。根据该结果暗示，通过APTT值计算的hBS23的FVIII活性可能大于体内试验的止血作用。
产业上的利用可能性
通过本发明，提供了评价凝血反应中具有FVIII功能代替活性的双特异性抗体的效果的方法。通过应用本发明方法，在利用该双特异性抗体的血友病等出血性疾病的治疗中，能够以适当灵敏度判断其效果。
序列表
Claims (9)
1.评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法，其包含步骤(i)以及(ii)：
(i) 向包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的、从被测者分离的血液来源样品中，加入包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂，
(ii)测定步骤(i)得到的血液来源样品的凝血酶生成量。
2.权利要求1中记载的方法，其中具有凝血因子VIII代替活性的物质是与凝血因子IX或活化凝血因子IX、以及与凝血因子X结合的双特异性抗体。
3.权利要求1或2中记载的方法，其中被测者是出血性疾病患者。
4.权利要求3中记载的方法，其中出血性疾病是以凝血因子VIII或活化凝血因子VIII活性降低或缺乏为原因的疾病。
5.权利要求3或4中记载的方法，其中出血性疾病是选自血友病、后天性血友病、以及冯维勒布兰德因子（vWF）功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病的疾病。
6.权利要求1至5的任一项中记载的方法，其中凝血起始试剂是包含活化凝血因子XI以及磷脂的试剂。
7.用于在权利要求1至6的任一项中记载的方法中使用的凝血起始试剂，其包含活化凝血因子XI。
8.权利要求7中记载的凝血起始试剂，其进一步包含磷脂。
9.用于在权利要求1至6的任一项中记载的方法中使用的试剂盒，其包含权利要求7或8中记载的凝血起始试剂。
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