JP2015155469A - 第fviii因子ポリマー結合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、第VIII因子の炭水化物部分を介して水溶性ポリマーと結合体化された第VIII因子分子を含むタンパク質性構築物、及びそれを調製する方法である。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸(PSA)、またはデキストランから選択される。本発明は、ポリエチレングリコールなどのポリ(アルキレンオキシド)を含めて、少なくとも1個の水溶性ポリマーに結合した凝固第VIII因子(FVIII)を含むタンパク質性構築物に関する。さらに、本発明は、FVIIIの機能的欠陥又は欠損に関連した出血性疾患を有するほ乳動物の血液中のFVIIIのin vivo半減期を延長する方法に関する。
【選択図】なし
Description
本出願は、2007年3月29日に出願された米国特許出願第11/729,625号の一部継続出願であり、この米国特許出願第11/729,625号は、2006年6月6日に出願された米国仮特許出願第60/790,239号、および2006年3月31日に出願された米国仮特許出願第60/787,968号に対する優先権を主張する。
凝固第VIII因子(FVIII)は、血漿中をごく低濃度で循環し、フォンウィルブランド因子(VWF)に非共有結合する。止血の間、FVIIIはVWFから分離し、カルシウム及びリン脂質又は細胞膜の存在下で活性化速度を増加させることによって、活性化第IX因子(FIXa)によって媒介される第X因子(FX)活性化の補因子として作用する。
本発明は、第VIII因子の炭水化物部分を介して水溶性ポリマーと結合体化された第VIII因子分子を含むタンパク質性構築物、及びそれを調製する方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
水溶性ポリマーと第VIII因子の酸化炭水化物部分とを結合体化する方法であって、結合体化を可能とする条件下で前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む、方法。
(項目2)
前記水溶性ポリマーがPEG、PSA及びデキストランからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記活性化水溶性ポリマーがPEG−ヒドラジド、PSA−ヒドラジン及びアルデヒド活性化デキストランからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記炭水化物部分が、NaIO4を含むバッファー中でのインキュベーションによって酸化される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記FVIIIの酸化炭水化物部分が第VIII因子のBドメインに存在する、項目1に記載の方法。
(項目6)
項目1から5のいずれか一項に記載の方法によって製造される修飾第VIII因子。
(項目7)
(a)第VIII因子分子、及び
(b)前記第VIII因子分子に結合した少なくとも1個の水溶性ポリマーを含むタンパク質性構築物であって、前記水溶性ポリマーが、前記第VIII因子のBドメインに存在する1個以上の炭水化物部分を介して前記第VIII因子に結合している、
タンパク質性構築物。
(項目8)
前記水溶性ポリマーが、PEG、PSA及びデキストランからなる群から選択される、項目7に記載のタンパク質性構築物。
本発明は、水溶性ポリマーに結合した、完全な(intact)Bドメインの少なくとも一部を有するFVIII分子を含むタンパク質性構築物である。水溶性ポリマーとしては、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、又はポリシアル酸(PSA)、デキストランなどの炭水化物が挙げられる。本発明の一実施形態においては、水溶性ポリマーは、10,000ダルトンを超える分子量を有するポリエチレングリコール分子である。別の実施形態においては、水溶性ポリマーは、10,000Daを超えて約125,000Daまで、約15,000Daから20,000Da、又は約18,000Daから約25,000Daの分子量を有する。一実施形態においては、構築物は、標準の治療用FVIII製品の完全な機能活性を保持し、標準の治療用FVIII製品よりも長いin vivo半減期を与える。別の実施形態においては、構築物は、未変性第VIII因子に対して少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140又は150パーセント(%)の生物活性を保持する。関連の態様においては、構築物及び未変性第VIII因子の生物活性は、色素生産活性とFVIII抗原値の比によって求められる(FVIII:Chr:FVIII:Ag)。本発明の更に別の実施形態においては、構築物の半減期は、未変性第VIII因子のin vivo半減期に対して0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍減少又は増加する。
AR.Structure and Function of the Factor
VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11−29(2002)が挙げられる(参照によりその全体を本明細書に援用する)。
mPEGコハク酸スクシンイミジルを用いたrFVIIIのリジン残基のPEG化
Advate製造プロセス由来のrFVIIIバルクの溶液(3,400U/ml)を、0.5%スクロース及び0.1%ポリソルベート80を含む20mM Hepesバッファー、150mM NaCl、pH7.4を用いたEcono−Pac 10DGカラム(Bio−Rad)を使用してゲルろ過した。次いで、この溶液に鎖長5,000DaのmPEGコハク酸スクシンイミジル(Abuchowski et al.Cancer Biochim Biophys 1984;7:175−86)(PEG−SS5000)を静かに撹拌しながら添加し(PEG−SS 5mg/mgタンパク質)、0.5M NaOHを滴下してpH値を7.4に調節した。次いで、静かに撹拌しながらPEG化を室温で1時間実施した。
PEG化rFVIIIのin vitroでの生化学的特性分析
Advate製造プロセス由来のrFVIIIを、実施例1に従ってPEG化し、PE
G化FVIII生成物を生化学的に特徴づけた。PEG−rFVIIIの機能活性を、FVIII色素形成アッセイを使用して決定した(Rosen S,Scand J Haematol 1984;33(Suppl40):139−45)。この方法は、Ph.Eur.5th edition(5.05)2.7.4 Assay of Blood Coagulation Factor VIIIに基づく。
SDS−PAGE及び免疫ブロット技術によるPEG化rFVIIIの特性分析
Invitrogen(Carlsbad、Calif.、USA)から入手した4〜12%ポリアクリルアミド勾配ゲルを使用し、製造者の指示に従って、還元条件下でSDS PAGEによって未変性rFVIIIの特性を分析した。分子量マーカー(MW)として、Bio−Rad(Hercules、Calif.、USA)から入手したPrecision Plusマーカー(10kD〜250kD)を使用した。次いで、そのタンパク質を、Bio−Rad(Hercules、Calif.、USA)から入手したPVDF膜上にエレクトロブロッティングによって移し、続いてCedarlane(Hornby、Ontario、Canada)から入手したポリクローナルヒツジ抗ヒトFVIII:C抗体と一緒にインキュベートした。免疫染色手順の最終段階は、Accurate(Westbury、N.Y.、USA)から入手したアルカリホスファターゼ(ALP)結合体化抗ヒツジ抗体と一緒のインキュベーションと、それに続くALP基質キット(Bio−Rad、Hercules、Calif.、USA)の使用による最終可視化であった。結果を図1に要約する。このブロットは、未変性rFVIII及びPEG化rFVIIIのドメイン構造を示す。PEG化rFVIIIは、未変性組換えタンパク質よりも広いバンド及びより高い分子量を有することが判明した。
FVIII欠損ノックアウトマウスモデルにおけるPEG化rFVIIIの薬物動態学
Bi等(Nat Genet 1995;10:119−21)によって詳述されたFVIII欠損マウスを重度ヒト血友病Aのモデルとして使用した。5匹のマウスの群(複数)に、実施例1に従って調製されたPEG−rFVIII(PEG−SS、5K)又は未変性rFVIIIをFVIII200IU/kg体重の用量で尾静脈を介してボーラス注射した(10ml/kg)。麻酔後の心臓穿刺によるクエン酸塩血漿を、それぞれの群から、注射5分、3、6、9及び24時間後に調製した。血漿試料中のFVIII活性レベルを測定した。この実験結果を図2に要約する。平均半減期は1.9時間(未変性rFVIIIについて)から4.9時間(PEG化rFVIIIについて)に増加し、曲線下面積(AUC)は13.0から25.2時間*IU/mlに増加した。MicroMath Scientistの、薬物動態学的ライブラリー由来のモデル1(MicroMath、Saint Louis、Mo.、USA)を使用して半減期計算を実施した。
SDS−PAGE及び免疫ブロット技術によるrFVIIIのPEG化の詳細な分析
未変性及びPEG化rFVIIIを1nMトロンビンを用いて60℃で60分間消化すると、FVIII分子の特異的切断が起こり、明確に定義された分解産物が生成した。これらの重鎖及び軽鎖断片を、実施例3に記載のように、SDS−PAGE、続いてエレクトロブロッティングによって分離した。切断断片を可視化するために、重鎖A1およびA2ドメイン、Bドメイン及び軽鎖N末端A3ドメインに対するポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体を適用した。
PEG化rFVIIIのトロンビン抵抗性
FVIIIをin vitroでトロンビン処理すると、その凝血促進活性が急速に増加し、続いて減少する。活性化と不活性化の速度は、トロンビン濃度及びFVIIIの完全性に依存し、以下のようにFIXa補因子アッセイによってモニターされた。
分枝2,3−ビス(メチルポリオキシエチレン−オキシ)−1−(1,5−ジオキソ−5−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ)プロパンを用いたrFVIIIのリジン残基のPEG化
150mM NaCl、0.5%スクロース及び0.1%ポリソルベート80を含む20mM HepesバッファーpH7.4中のrFVIIIの溶液を、FVIII489IU/mlを含む、Advate製造プロセス由来のバルク材料から調製した。NOF Corporation(東京、日本)から入手した分子量20kDの分枝PEGグルタル酸スクシンイミジル(PEG−SG)試薬(2,3−ビス(メチルポリオキシエチレン−オキシ)−1−(1,5−ジオキソ−5−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ)プロパン)を、この溶液153mlに静かに撹拌しながら添加し(試薬5mg/mgタンパク質)、10分後に0.5M NaOHを滴下してpH値を7.4に調節した。次いで、rFVIIIのPEG化を、静かに撹拌しながら室温で1時間実施した。
分枝PEG−SG20kDでPEG化されたrFVIIIのin−vitro特性分析
Advate製造プロセス由来のrFVIIIを実施例7に従って分枝PEG−SG試薬を用いてリジン残基を介してPEG化し、PEG化rFVIII生成物を実施例2に記載のように生化学的に特徴づけた。
炭水化物部分を介したrFVIIIのPEG化
炭水化物残基を介したPEG−rFVIII結合体の調製のために、rFVIII溶液(最終濃度1.2mg/ml)を25mMリン酸バッファー、pH6.7で調製する。炭水化物残基の酸化のために、NaIO4を添加する(最終濃度0.3mM)(Roberts et al.;Advanced Drug Del Rev.;54:459−76(2002);Meir and Wilchek;Meth Enzymol;138:429−42(1987))。最終濃度10%でグリセロールを添加して反応をクエンチし、Amicon Micron−10装置(Amicon、Billerica、MA)を用いて遠心分離を繰り返して過剰の試薬を分離した。PEG−ヒドラジド(MW3300Da/Nektar、Huntsville、Alabama)を添加して、最終濃度1.5mMの試薬を得た。次いで、PEG化を室温で2時間実施した。続いて、得られた結合体と過剰の試薬を、25mMリン酸バッファー、pH6.7を用い、Amicon Micron−10装置による遠心分離を繰り返して分離した。
PSA−ヒドラジンを用いたrFVIIIのポリシアル化
炭水化物残基を介したPSA−rFVIII結合体の調製のために、rFVIII溶液(最終濃度1mg/ml)を20mM酢酸ナトリウムバッファー、pH6.0で調製する。炭水化物残基の酸化のために、NaIO4を添加する(最終濃度0.25mM)。酸化を4℃で暗所で60分間実施する。亜硫酸水素ナトリウム(最終濃度25mM)を添加して反応を停止させる。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムをDG−10カラム(Bio−Rad)のゲルろ過によって分離する。続いて、(国際公開第2006/016168号に従って調製した)鎖長20kDのPSA−ヒドラジンを添加する(最終濃度10mM)。ポリシアル化手順を室温で2時間実施する。ポリシアル化rFVIIIをButyl−Sepharose(GE−Healthcare)のHICによって精製する。5M NaCl溶液をその混合物に添加して最終濃度3M NaClにする。この混合物をButyl−Sepharose(GE−Healthcare)充填カラムにかけ、6.7mM CaCl2を含む50mM Hepesバッファー、pH7.4を使用してrFVIII−PSA結合体を溶出させる。結合体の溶出後、pHをpH6.9に調節する。
ポリシアル酸の精製及び誘導体化
国際公開第06016161号A1に記載のように、ポリシアル酸をQ−Sepharose FFの陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。25mM NaClを含む10mMトリエタノールアミンバッファー、pH7.4(=出発バッファー)50mLにPSA5グラムを溶解させた。この溶液を、出発バッファーで平衡化したQ−Sepharose FF(GE Healthcare、Munich、Germany)を充填したPharmacia XK50カラムにかけた。次いで、カラムを8カラム体積(CV)の出発バッファーで洗浄し、出発バッファー中の3CVの200mM NaCl、350mM NaCl及び500mM NaClで段階的に結合PSAを溶出させた。350mM NaClで溶出された画分は、SDSゲル電気泳動によって示されるように分子量が20kDaであった。この画分を再生セルロースでできた5kD膜(Millipore、Billerica、MA)を用いた限外ろ過によって濃縮し、続いて50mMリン酸バッファー、pH7.2で透析ろ過した。国際公開第05016973号A1に記載のように、PSAをNaIO4で酸化し、末端第一級アミノ基を還元アミノ化によって導入した。還元アミノ化のために、2M NH4Cl溶液11mLを、50mMリン酸バッファー、pH7.2中の酸化PSA58mg/mlを含有する溶液20mLに添加した。次いで、1M NaOH中の5M NaCNBH3溶液を添加して、最終濃度75mMにした。反応を室温でpH8.0で5日間実施した。
ヘテロ二官能性架橋剤を使用したrFVIIIのポリシアル化
PSA−SHとrFVIIIのカップリングのために、炭水化物選択的ヒドラジド及びスルフヒドリル反応性マレイミド基を含むヘテロ二官能性架橋剤MBPH(4−[4−N−マレイミドフェニル]酪酸ヒドラジドHCl/Pierce、Rockford、IL)を使用した(Chamow et al.,J Biol Chem;267:15916−22(1992))。活性スルフヒドリル基を含むPSA−SHを実施例11に従って調製した。
rFVIIIとデキストランの結合体化
rFVIIIとデキストランの結合体化のために、rFVIII(638mg、3.4mg/mlタンパク質)2mlを、脱塩カラム(Bio−Rad Econopac 10DG)を使用して製造者の指示に従って酸化バッファー(50mM酢酸ナトリウム、pH6)に移した。次いで、そのタンパク質を0.25mM NaIO4で酸化した(4℃で暗所で1時間)。酸化タンパク質を、まず、MWCO30kDaのvivaspin限外ろ過スピンカラム(Sartorius Stedim Biotech GmbH)を使用して製造者の指示に従って濃縮した。次いで、試料を反応バッファー(50mMリン酸ナトリウムpH7)で終夜4℃で透析した。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019139416A1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-07-18 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 체내 지속형 재조합 혈액응고 제 8인자 및 이의 제조방법 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006071801A2 (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-06 | Baxter International Inc | Polymer-von willebrand factor-conjugates |
WO2007126808A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Baxter International Inc | Pegylated factor viii |
WO2008025856A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified glycoproteins |
WO2008074032A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Baxter International Inc. | Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life |
US20090076237A1 (en) * | 2006-03-31 | 2009-03-19 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII Polymer Conjugates |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006071801A2 (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-06 | Baxter International Inc | Polymer-von willebrand factor-conjugates |
WO2007126808A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Baxter International Inc | Pegylated factor viii |
US20090076237A1 (en) * | 2006-03-31 | 2009-03-19 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII Polymer Conjugates |
WO2008025856A2 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified glycoproteins |
WO2008074032A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Baxter International Inc. | Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019139416A1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-07-18 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 체내 지속형 재조합 혈액응고 제 8인자 및 이의 제조방법 |
CN111788220A (zh) * | 2018-01-12 | 2020-10-16 | 财团法人牧岩生命科学研究所 | 体内持续释放重组凝血因子ⅷ及其制备方法 |
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