CN107073082B

CN107073082B - Xa因子解毒剂的冻干制剂

Info

Publication number: CN107073082B
Application number: CN201580048166.3A
Authority: CN
Inventors: 王娟; 格雷戈里·A·萨夏; 蓬·M·阮
Original assignee: Portola Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: JP2017525704A; US20160237420A1; EP3182993A1; SG11201701247RA; CN113171447A; AU2015305413B2; CN107073082A; US20200299668A1; EP3750556A1; EA201790415A1; US20200299667A1; US20210284986A1; EA202091385A2; IL250413A0; US20180320160A1; EP3182993B1; ZA201701764B; EP3182993A4; EA036091B1; KR20170042776A

Abstract

本公开涉及Xa因子(fXa)解毒剂的溶液和制备其冻干制剂的方法。适用于冻干的合适水性制剂可包括fXa解毒剂、增溶剂、稳定剂和结晶组分，其中所述制剂在冻干期间不崩塌。

Description

XA因子解毒剂的冻干制剂

相关专利申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2014年8月20日提交的美国临时申请62/039809的权益，所述临时申请针对所有目的以引用的方式整体并入本文。

背景

抗凝血剂在市场上用于治疗或预防具有形成血块的倾向的患者的不期望的血栓形成的需要，所述患者例如具有凝血异常、限于不动时期或经历医学手术的那些患者。然而，抗凝血剂疗法的一种主要限制是与治疗有关的出血风险，和在过量用药的情况下或如果需要紧急手术程序，快速地逆转抗凝血剂活性的能力的限制。因此，极其需要针对所有形式的抗凝血剂疗法的具体且有效解毒剂。

当口服递送不切实际或需要立即治疗活性时，通过注射递送生物活性蛋白一般是所选递送途径。然而，如不良的长期存储、摩尔渗透压浓度、溶解度和稳定性的生物、化学和物理障碍使得通过注射至哺乳动物递送生物活性剂成问题。冻干可解决长期存储问题。然而，使用冻干也会出现问题，如冻干物的不良溶解度和稳定性。因此，需要针对抗凝血剂的解毒剂的改进的可注射制剂，其为稳定并且可溶性的。本公开满足这些和其它需要。

本文所提到的任何和所有出版物、专利、专利申请均由此以引用的方式整体并入。

概述

本公开提供Xa因子(fXa)蛋白衍生物(称作“r-解毒剂”)的冻干制剂。与野生型fXa蛋白相比，所述r-解毒剂具有Gla结构域的修饰和活性位点，保持fXa结合于fXa抑制剂的能力，但不会组装成凝血酶原酶复合物。所述r-解毒剂为两链多肽(参见表3中的SEQ IDNO.3，其包括轻链(SEQ ID NO.4)和重链(SEQ ID NO.5)，用在所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。

也如同野生型fXa，所述r-解毒剂经历翻译后修饰，导致某些氨基酸残基的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82和所述重链的Thr249，和在所述轻链的Asp29处的经过修饰的残基(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键以外，在所述轻链的半胱氨酸16与27、21与36、38与47、55与66、62与75、和77与90之间，并且在所述重链的半胱氨酸7与12、27与43、156与170、和181与209之间还形成链内二硫键。

已知所述r-解毒剂的两链结构和多种翻译后修饰，本文中显示提供具有可接受的摩尔渗透压浓度的稳定并且可溶性溶液的稳定冻干制剂的开发提供了巨大挑战。然而，出乎意料地，本发明人能够得到平衡了蛋白溶解度、稳定性、饼结构和摩尔渗透压浓度的溶液。

在一个实施方案中，本公开提供一种水性制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含10mM至55mM精氨酸或8mM至35mM柠檬酸盐、1％至3％蔗糖(w/v)、2％至8％甘露醇(w/v)和至少5mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ ID NO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为7.5至8。

在一些方面，所述制剂包含40mM至50mM精氨酸、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/mL的所述多肽。在一些方面，所述制剂包含10mM至30mM柠檬酸盐、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/mL的所述多肽。

在一些方面，所述制剂包含40mM至50mM精氨酸、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少18、19或20mg/mL的所述多肽。在一些方面，所述制剂包含10mM至30mM柠檬酸盐、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/mL的所述多肽。

在一些方面，所述制剂包含约45mM精氨酸、约2％蔗糖(w/v)、约5％甘露醇(w/v)和约10mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括包含氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、包含氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ ID NO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为约7.8。一方面，所述制剂进一步包括聚山梨醇酯80(0.01％w/v至0.02％w/v)和/或缓冲液。

在一些方面，所述制剂包含约45mM精氨酸、约2％蔗糖(w/v)、约5％甘露醇(w/v)和约20mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括包含氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、包含氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ ID NO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为约7.8。一方面，所述制剂进一步包括聚山梨醇酯80(0.01％w/v至0.02％w/v)和/或缓冲液。

在一些方面，所述多肽包含经过修饰以不同于天然氨基酸的氨基酸残基。在一些方面，所述第一链的残基Asp29在Asp29处修饰为(3R)-3-羟基Asp。在一些方面，所述多肽至少包括针对所述第一和第二链中每一者的链内二硫键。

在一个实施方案中，还提供一种制备两链多肽的冻干制剂的方法，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ ID NO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，所述方法包括冻干如上文所述的水性制剂。

另一实施方案提供通过冻干本公开的水性制剂制备的冻干组合物。

在一个实施方案中，本公开提供一种冻干组合物，其包含至少10％(w/w)的两链多肽和重量比率的范围为(0.6-0.95):(1-3):(2-8)的精氨酸:蔗糖:甘露醇或替代地重量比率的范围为(0.5-1.4):(1-3):(2-8)的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ IDNO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键。

在一些方面，所述冻干组合物包含至少15％、16％、17％、18％或19％(w/w)的所述两链多肽。在一些方面，所述L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)范围内。

还提供一种冻干组合物，其包含至少10％(w/w)的两链多肽和重量比率的范围为(0.15-0.66):(1-3):(2-8)的柠檬酸盐:蔗糖:甘露醇，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链和在SEQ ID NO.4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO.5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键。在一些方面，所述冻干组合物包含至少10％、15％、16％、17％、18％或19％(w/w)的所述两链多肽。在一些方面，所述柠檬酸盐:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.19-0.57):(1.5-2.5):(4.5-5.5)范围内。

本公开的另一实施方案提供通过溶解本公开的冻干组合物制备的溶液。在一些方面，溶剂为水或生理盐水。

另一实施方案提供一种减少经历使用Xa因子抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者的出血的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本公开的溶液。在一些方面，所述Xa因子抑制剂为阿哌沙班、利伐沙班或贝曲西班。

另外，在一个实施方案中还提供一种水性制剂，其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO.3或与SEQ ID NO.3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽、增溶剂、稳定剂和结晶组分，其中所述制剂在冻干期间不崩塌。

在一些方面，所述结晶组分为甘露醇。在一些方面，甘露醇以2％至8％(w/v)的浓度存在。在一些方面，所述增溶剂为精氨酸或柠檬酸盐且所述稳定剂为蔗糖。在一些方面，所述水性制剂进一步包括表面活性剂和缓冲液。在一些实施方案中，提供通过冻干所述水性制剂制备的冻干组合物。

附图简述

图1A-F为示出所述r-解毒剂在不同条件(pH、增溶剂、离子强度)下的溶解度的图。阴影条指示观察到蛋白沉淀并且空心条指示未观察到蛋白沉淀。

图2为针对10mm tris溶液的DSC热流热解曲线，其示出在1℃/min下的冷却和在-32℃下针对tris的结晶放热。

图3为在用95mm精氨酸冷却10mm tris期间的DSC热解曲线。无针对tris的结晶放热。

图4为针对含有10mm tris、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的DSC热解曲线，示出在大约-18℃下甘露醇的结晶。

图5为针对10mm tris、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的DSC热解曲线，示出在-42℃下蔗糖的tg’。溶液在-20℃下退火持续5小时。

图6为针对10mm tris、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的DSC热解曲线，示出在-20℃下持续5小时的退火步骤，无结晶放热的迹象。

图7为针对10mm磷酸钠溶液的DSC热解曲线，示出在大约-10℃下针对磷酸钠的结晶放热。

图8为针对具有2％蔗糖和2％甘露醇的10mm磷酸钠的DSC不可逆热流热解曲线，示出在大约-33℃下开始结晶放热。

图9为针对10mm磷酸钠、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的DSC热流热解曲线，除了融冰吸热以外未展示热事件。

图10为针对10mm tris、10mm柠檬酸盐、2％蔗糖和5％甘露醇的DSC热流热解曲线，示出在-25℃下大约24分钟开始结晶放热。

图11为针对10mm tris、20mm柠檬酸盐、2％蔗糖和5％甘露醇的DSC热流热解曲线，示出在-25℃下大约30分钟开始结晶放热。

图12为与在T0下的冻干制剂相比，针对在5℃下存储长达2周的tris和磷酸盐溶液制剂的UV浓度数据。

图13为与在T0下的冻干制剂相比，针对在25℃下存储长达2周的tris和磷酸盐溶液制剂的UV浓度数据。

图14为与在T0下的溶液制剂相比，针对在25℃下存储的tris和磷酸盐冻干制剂的UV浓度数据。

图15为针对10mm tris、9.5mm精氨酸、2％蔗糖、2％甘露醇和0.01％PS80制剂的DSC热解曲线，示出在-22℃下70分钟(退火的开始时间)时甘露醇开始结晶。

图16为针对10mm tris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、4％甘露醇和0.01％PS80制剂的DSC热解曲线，示出在-25℃下30分钟时甘露醇开始结晶。

图17为当10mm tris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％PS80溶液在1℃/min下冷却至-40oc时针对甘露醇的DSC结晶放热曲线。

图18示出当10mm tris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％PS80溶液在-25℃下退火时针对甘露醇的DSC结晶放热曲线。大约23分钟时开始结晶。

详述

I.定义

所有数字标号(例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)均为以0.1或10％的增量(+)或(-)变化的近似值。应了解，尽管并非始终明确地陈述，所有数字标号之前均有术语“约”。还应了解，尽管并非始终明确地陈述，本文所述的试剂仅为示例性的并且其相等物为本领域中已知的。

如本说明书和权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括多个提及物。例如，术语“药学上可接受的载体”包括多种药学上可接受的载体，包括其混合物。

如本文所用，术语“包含(comprising)”意图意指所述组合物和方法包括所陈述的要素，但不排除其它要素。“主要由……组成”当用于定义组合物和方法时应意指排除对用于预期用途的组合具有任何基本意义的其它要素。因此，主要由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除来自所述分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，如磷酸盐缓冲生理盐水、防腐剂等。“由……组成”应意指排除用于施用本公开的组合物的其它成分和主要方法步骤的超过痕量要素。由这些过渡术语中的每一种定义的实施方案均在本公开的范围内。

术语“蛋白”和“多肽”可互换使用并且以其最广泛意义指代两种或更多种亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚单位可由肽键键联。在另一实施方案中，所述亚单位可由例如酯、醚等其它键键联。蛋白或肽必须含有至少两种氨基酸并且关于可构成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目并无限制。如本文所用，术语“氨基酸”指代天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。天然存在氨基酸的单字母和三字母缩写列于下文。

“Xa因子”或“fXa”或“fXa蛋白”是在凝血途径中的丝氨酸蛋白酶，其由非活性X因子(fX，SEQ ID NO.1，表1)产生。编码人类X因子(“fX”)的核苷酸序列可以登录号“NM_000504”发现于GenBank中。在重链的前52个残基催化裂解时，fX活化为fXa。FXa含有轻链和重链。所述轻链的前45个氨基酸残基(SEQ ID NO.1的残基1-45)被称为Gla结构域，因为其含有11个翻译后修饰的γ-羧基谷氨酸残基(Gla)。其还含有短的(6个氨基酸残基)芳香族栈序列(SEQ ID NO.1的残基40-45)。胰凝乳蛋白酶消化选择性地去除1-44个残基，产生无Gla结构域fXa。fXa的丝氨酸蛋白酶催化结构域位于C端重链处。fXa的重链与其它丝氨酸蛋白酶(如凝血酶、胰蛋白酶和活化蛋白C)高度同源。

“原生fXa”或“野生型fXa”指代天然存在于血浆中或以其原始、未修饰形式分离的fXa，其具有活化凝血酶原的生物活性，因此促进血块形成。所述术语包括从组织样品分离的天然存在多肽以及重组产生的fXa。“活性fXa”指代具有活化凝血酶原的促凝血剂活性的fXa。“活性fXa”可为保留促凝血剂活性的原生fXa或经过修饰的fXa。

如本文所用，“fXa衍生物”指代不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有减少的促凝血剂或催化活性或不具有所述活性，并且还结合和/或大体上中和如fXa抑制剂的抗凝血剂的经过修饰的fXa蛋白。在一些方面，fXa蛋白或fXa衍生物的“促凝血剂活性”代指野生型活性fXa多肽携带的酶活性。fXa衍生物的实例提供于美国专利号8,153,590和PCT公布WO2009/042962和WO2010/056765中，并且进一步提供于本文中，如SEQ ID NO:2和3和其生物相等物。

fXa多肽或其衍生物的“酶活性”指代所述多肽催化通过与底物直接相互作用而与所述底物进行生物化学反应的能力。

SEQ ID NO:2相对于野生型fXa含有3种突变。第一种突变是fX的Gla结构域中6-39aa的缺失。第二种突变是用-RKR-置换活化肽序列143-194aa。这产生了连接轻链(SEQ IDNO:4)和重链(SEQ ID NO:5)的-RKRRKR-(SEQ ID NO:6)接头。在分泌时，这种接头裂解，从而产生两链多肽SEQ ID NO:3(r-解毒剂)。第三种突变是活性位点残基S379突变为Ala残基。这种氨基酸取代分别对应于SEQ ID NO:1和3的氨基酸296和290。

术语“r-解毒剂”指代在所述接头裂解后经过加工的两链多肽加工产物SEQ IDNO:2。其由SEQ ID NO:3表示。所述r-解毒剂公开于例如US 8,153,590中，其内容以引用的方式并入本公开中。所述r-解毒剂包括轻链(SEQ ID NO.4)和重链(SEQ ID NO.5)，用在所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。如同野生型fXa，在某些生产批次中，所述r-解毒剂经历翻译后修饰，导致某些氨基酸残基的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82和所述重链的Thr249，和在所述轻链的Asp29处的经过修饰的残基(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键以外，在所述轻链的半胱氨酸16与27、21与36、38与47、55与66、62与75、和77与90之间，并且在所述重链的半胱氨酸7与12、27与43、156与170、和181与209之间还可形成链内二硫键。

表1.非活性人类X因子的多肽序列(SEQ ID NO:1)

表2.在去除-RKRRKR-(SEQ ID NO.6)接头之前所述r-解毒剂的多肽序列(SEQ IDNO:2)

表3.在去除-RKRRKR-(SEQ ID NO.6)接头之后人类Xa因子三倍突变体的多肽序列(SEQ ID NO:3)

本公开还提供r-解毒剂的多种生物相等物(或其前体，由SEQ ID NO:2表示)，或替代地与SEQ ID NO:3具有某些序列同一性的多肽。一方面，所述生物相等物保留SEQ ID NO:3的结构特征，即，经过修饰的活性位点和缺失或经过修饰的Gla结构域。另一方面，所述生物相等物保留SEQ ID NO:3的功能特征，即，不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有减少的促凝血剂(例如，酶或催化)活性或不具有所述活性。

术语“活性位点”指代酶或抗体中发生化学反应的部分。“经过修饰的活性位点”是已经在结构上经过修饰的活性位点以提供具有增加或降低的化学反应性或特异性的活性位点。活性位点的实例包括但不限于人类X因子的催化结构域(包含235-488个氨基酸残基)，和人类Xa因子的催化结构域(包含195-448个氨基酸残基)。经过修饰的活性位点的实例包括但不限于人类Xa因子的催化结构域(包含SEQ ID NO:1中的195-448个氨基酸残基)，在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414或Arg424处具有至少一个氨基酸取代。

“组合物”意图意指活性剂和另一惰性(例如，可检测试剂或标记)或活性化合物或组合物(如佐剂)的组合。

“药物组合物”意图包括活性剂与惰性或活性载体的组合，从而产生适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途的组合物。

术语“冻干制剂”指代经过冷冻干燥的包含所关注多肽的药物制剂或组合物。

如本文所用，术语“膨胀剂”指代向冻干制剂提供膨胀的成分。膨胀剂的实例包括而不限于甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡萄糖、甘油、环糊精、葡聚糖、固体PEG和其衍生物和混合物。在一个实施方案中，本公开的制剂任选地包括膨胀剂。

如本文所用，“药学上可接受的饼”指代在冻干后剩余的非崩塌固体药物产物，其具有某些所需特征，例如药学上可接受、长期稳定性、短复原时间、精致外观和在复原时维持原始溶液的特征。药学上可接受的饼可为固体、粉末或颗粒状材料。药学上可接受的饼也可含有以所述饼的重量计多达5％的水。

如本文所用，术语“冻干”或冷冻干燥指代过程，其中在产品经过冷冻并且放置于真空下之后从所述产品去除水，从而使冰不通过液相直接地从固体改变为蒸气。所述过程由三个独立、独特并且相互依赖的过程组成；冷冻、初始干燥(升华)和二次干燥(解吸附)。用于冻干本公开所用的多肽的方法描述于本文中并且为本领域中众所周知的。

如本文所用，术语“缓冲液”表示药学上可接受的赋形剂，其稳定化药物制剂的pH。合适缓冲液为本领域中众所周知的并且可发现于文献中。药学上可接受的缓冲液包含但不限于tris缓冲液、精氨酸缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、丁二酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。与所用的缓冲液无关，pH可用本领域中已知的酸或碱调节，例如丁二酸、盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、丁二酸盐、柠檬酸盐、tris碱、组氨酸、组氨酸HCl、氢氧化钠和氢氧化钾。合适缓冲液包括而不限于组氨酸缓冲液、2-吗啉代乙烷磺酸(MES)、二甲胂酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丁二酸盐和柠檬酸盐。所述缓冲液的浓度可在约4mM与约60mM，或替代地约4mM至约40mM，或替代地约5mM至约25mM之间。

“冷冻保护剂”为本领域中已知的并且包括而不限于例如蔗糖、海藻糖和甘油。一般使用在生物系统中展现低毒性的冷冻保护剂。

如本文所用，术语“张度剂”表示用于调节制剂的张度的药学上可接受的试剂。等张性一般涉及相对于溶液，通常相对于人类血清的溶液的渗透压。制剂可为张力减退的、等张的或张力亢进的。一方面，所述制剂为等张的。等张制剂为液体或从固体形式(例如从冻干形式)复原的液体并且表示与一些其它与其进行比较的溶液(如生理盐溶液和血清)具有相同张度的溶液。合适等张剂包括但不限于氯化钠、氯化钾、甘油和来自如本文所定义的氨基酸、糖的组的任何组分以及其组合。

如本文所用，术语“表面活性剂”指代具有两亲结构的药学上可接受的有机物质；即，其由具有相反溶解倾向的基团构成，一般为油溶性烃链和水溶性离子基团。表面活性剂可视表面活性部分的电荷分类为阴离子性、阳离子性和非离子性表面活性剂。表面活性剂通常用作用于多种药物组合物和生物材料制剂的湿润剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。在本文所述的药物制剂的一些实施方案中，表面活性剂的量是描述为以重量/体积百分比表示的百分率(w/v％)。合适的药学上可接受的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)或十二烷基硫酸钠(SDS)的组。聚氧乙烯山梨醇酐-脂肪酸酯包括聚山梨醇酯20(以商标Tween 20^TM出售)和聚山梨醇酯80(以商标Tween 80^TM出售)。聚乙烯-聚丙烯共聚物包括以名称

F68或泊洛沙姆188^TM出售的那些。聚氧乙烯烷基醚包括以商标Brij^TM出售的那些。烷基苯酚聚氧乙烯醚包括以商品名Triton-X出售的那些。

“冻干保护剂”指代在冻干(在高真空中快速冷冻并且干燥的过程)期间稳定化蛋白的药学上可接受的物质。冻干保护剂的实例包括而不限于蔗糖、海藻糖或甘露醇。

“抗氧化剂”指代能够减慢或防止其它分子的氧化的分子。氧化是从物质转移电子至氧化剂的化学反应。氧化反应可产生自由基，所述自由基开始使蛋白治疗剂不稳定并且最终影响产物活性的链反应。抗氧化剂通过去除自由基中间物终止这些链反应，并且通过氧化自身来抑制其它氧化反应。因此，抗氧化剂通常为还原剂、螯合剂和氧清除剂，如柠檬酸盐、EDTA、DPTA、硫醇、抗坏血酸或多酚。抗氧化剂的非限制性实例包括抗坏血酸(AA，E300)、硫代硫酸盐、甲硫氨酸、生育酚(E306)、没食子酸丙酯(PG，E310)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基化羟基茴香醚(BHA，E320)和丁基化羟基甲苯(BHT，E321)。

“防腐剂”为天然或合成化学品，其添加至如食物、医药品、涂料、生物样品、木材等产品中以防止因微生物生长或因不期望的化学改变而降解。防腐剂添加剂可单独或联合其它防腐方法使用。防腐剂可为抗微生物防腐剂，其抑制细菌和真菌的生长，或如氧清除剂的抗氧化剂，其抑制组分氧化。常见抗微生物防腐剂包括苯扎氯铵、苯甲酸、氯己啶(cholorohexidine)、甘油、苯酚、山梨酸钾、硫柳汞、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和EDTA二钠。其它防腐剂包括常用于肠胃外蛋白的那些，如苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯代丁醇或对羟基苯甲酸甲酯。

如本文所用，术语“表面活性剂”意指降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂可充当洗涤剂、湿润剂、乳化剂、起泡剂和分散剂。

表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯80、脂肪酸和磺酸烷酯；氯化苄乙氧铵，例如来自Lonza,Inc.(Fairlawn,N.J.)的HY AMINE 1622；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，例如来自Uniqema(Wilmington,Del)的TWEEN系列；和天然表面活性剂，如牛磺胆酸钠、1-棕榈酰基-2-Sn-甘油-3-磷酸胆碱、卵磷脂和其它磷脂。所述表面活性剂例如在产品的复原期间使冻干粒子的聚集减至最少。这些表面活性剂可占约0.001％至约5％w/v。

II.制剂

如所提供，野生型fXa为两链多肽。多种形式的fXa解毒剂也是如此，包括r-解毒剂(SEQ ID NO:3)，其包括轻链(SEQ ID NO.4)和重链(SEQ ID NO.5)，用在所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。也如同野生型fXa，在细胞中表达的r-解毒剂经历翻译后修饰，导致某些氨基酸残基的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82和所述重链的Thr249，和在所述轻链的Asp29处的经过修饰的残基(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键以外，在所述轻链的半胱氨酸16与27、21与36、38与47、55与66、62与75、和77与90之间，并且在所述重链的半胱氨酸7与12、27与43、156与170、和181与209之间还可形成一个或多个链内二硫键。

已知所述fXa解毒剂的两链结构和多种翻译后修饰，本文中显示提供具有可接受的摩尔渗透压浓度的稳定并且可溶性溶液的稳定冻干制剂的开发提供了巨大挑战。

使用所述r-解毒剂作为实例，实验数据示出需要高浓度的增溶剂来维持针对所述r-解毒剂的合理溶解度。具体说来，实施例4中的溶解度研究示出柠檬酸盐和精氨酸均显著增加所述r-解毒剂的溶解度。此外，所述实施例示出当精氨酸的浓度为95mM或至少10mM时，所述r-解毒剂可能保持可溶于溶液中。

此外，在冻干过程期间，确定需要所述蛋白的温度维持低于确定的崩塌温度(约-40℃)以获得可接受的冻干样品(实施例6)。然而，维持所述低产品浓度在实践中不可行。因此，数据证明需要结晶组分(例如，甘露醇)来充当支架，所述支架可在冷冻干燥期间和之后维持非晶蛋白材料于适当位置中。

然而，进一步发现高浓度精氨酸(例如，95mM)的存在防止了甘露醇的结晶(实施例7)。同时，甘露醇的存在增加了所述制剂中糖的总浓度，导致所述溶液的不可接受的摩尔渗透压浓度(实施例7)。

因此，开发用于所述r-解毒剂的合适冻干形成物关于作为增溶剂的精氨酸、作为结晶剂的甘露醇和作为稳定剂的蔗糖的浓度具有相冲突的需求。所述需求是否可能获得平衡以产生可接受的冻干形成物无论如何是不可预测的。

然而，出乎意料地并且意外地，本发明人能够得到平衡了蛋白溶解度、稳定性、饼结构和摩尔渗透压浓度的溶液。更具体说来，为了产生合适冻干形成物，实例r-解毒剂溶液包括约45mM精氨酸(10-55mM)、约2％蔗糖(1-3％)和约5％甘露醇(2-8％)。此外，所述溶液包括约10mM tris和0.01％-0.02％PS80连同所需量的r-解毒剂(例如，10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL或50mg/mL)，并且pH为约7.8。

此外，尽管已知为用于治疗蛋白的良好稳定剂，柠檬酸盐已经示出具有抗凝血活性。参见例如Wright等人,Nephrology(Carlton).2011年5月；16(4):396-402。因此，由于所述r-解毒剂意图作为抗凝血剂(fXa抑制剂)的解毒剂，柠檬酸盐被认为不适合与所述r-解毒剂一起使用。意外地，本文中发现柠檬酸盐实际上不会体内干扰所述r-解毒剂的活性。在适合用于冻干的溶液中，除了约2％蔗糖(1-3％)和约5％甘露醇(2-8％)以外，发现柠檬酸盐的合适浓度为约10mM至约25mM。

因此，当所述溶液冻干时，其将形成干燥组合物，所述组合物包括在(0.5-1.4):(1-3):(2-8)范围内的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的重量比率。例如，如果在5mg/mL与50mg/mL之间的r-解毒剂用于所述溶液中，那么L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇:r-解毒剂的重量比率在(0.5-1.4):(1-3):(2-8):(0.5-5)范围内。

相反地，当所述冻干制剂溶解于水、生理盐水或其它相似溶剂中时，其可提供具有约10-55mM精氨酸、约1-3％蔗糖和约2-8％甘露醇的溶液。

同样，当使用柠檬酸盐作为增溶剂的溶液冻干时，其将形成干燥组合物，所述组合物包括在(0.15-0.66):(1-3):(2-8)范围内的柠檬酸盐:蔗糖:甘露醇的重量比率。例如，如果在5mg/mL与50mg/mL之间的r-解毒剂用于所述溶液中，那么L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇:r-解毒剂的重量比率在(0.15-0.66):(1-3):(2-8):(0.5-5)范围内。相反地，当所述冻干制剂溶解于水、生理盐水或其它相似溶剂中时，其可提供具有约8-35mM柠檬酸盐、约1-3％蔗糖和约2-8％甘露醇的溶液。

用所述r-解毒剂观察到的结果可容易地外推至具有相似结构的其它fXa解毒剂，包括r-解毒剂的生物相等物(或其前体，由SEQ ID NO:2表示)。一方面，所述生物相等物与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。一方面，所述生物相等物包括两条肽链，各链分别与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。一方面，所述生物相等物保留SEQ ID NO:3的结构特征，即，经过修饰的活性位点和缺失或经过修饰的Gla结构域。另一方面，所述生物相等物保留SEQ ID NO:3的功能特征，即，不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有减少的促凝血剂(例如，酶或催化)活性或不具有所述活性。

另外，预期精氨酸可由另一增溶剂取代，甘露醇可由另一结晶剂取代，并且蔗糖可由另一稳定剂取代，其中每一者的适当实例可在本领域中获得并且提供于本公开中。

A.适用于冻干的多肽溶液

在一个实施方案中，本公开提供适用于冻干的水性制剂，所述制剂包括如此处所公开的fXa解毒剂或其生物相等物，连同增溶剂、稳定剂(stabilizing agent)(或稳定剂(stabilizer)和结晶剂。所述制剂可进一步包括表面活性剂和/或缓冲液。在一些方面，这些试剂中的每一者的存在均防止fXa解毒剂在冻干期间崩塌，例如当冷冻干燥温度高于-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃或15℃，高达20℃或25℃时。

本公开的一个实施方案提供可用于冻干的水性制剂。所述水性制剂包括fXa衍生物多肽，例如包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。除了所述多肽以外，所述制剂进一步包括增溶剂、稳定剂和结晶组分。所述制剂在所需条件下不会在冻干期间崩塌。一方面，所需条件是在高于-40℃，或替代地高于-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃或15℃的温度下冷冻干燥。另一方面，所需条件是在低于25℃，或替代地低于20℃、15℃、10℃或5℃的温度下冷冻干燥。

一方面，如与野生型fXa蛋白相比，所述fXa衍生物多肽具有Gla结构域的修饰和活性位点。一方面，所述fXa衍生物多肽保持fXa结合于fXa抑制剂的能力，但不会组装成凝血酶原酶复合物。一方面，所述fXa衍生物多肽为具有氨基酸序列SEQ ID NO.3的两链多肽，其包括轻链(SEQ ID NO.4)和重链(SEQ ID NO.5)，用在所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。一方面，所述水性制剂包括至少5mg/mL的所述多肽。一方面，所述水性制剂包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/mL的所述多肽。

在一些方面，结晶组分以适用于在冷冻干燥过程期间形成结晶基质的浓度包括于所述制剂中。所述结晶基质的制剂适用于防止崩塌，如实施例中所证明。

“结晶组分”指代在冷冻干燥过程期间在包括多肽的制剂中形成结晶基质的分子。结晶组分的非限制性实例包括甘露醇和甘油。

在一些方面，所述结晶组分为甘露醇(例如，结晶甘露醇)。一方面，所述水性制剂中所述结晶组分的浓度为至少1％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述结晶组分的浓度为至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述结晶组分的浓度不高于8％，或替代地不高于7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％或4％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述结晶组分的浓度为约1％至约8％、或约2％至约6％、或约3％至约5.5％、或约4.5％至约5.5％、或约4.6％至约5.4％、或约4.7％至约5.3％、或约4.8％至约5.2％、或约4.9％至约5.1％、或约4％、4.5％或5％(w/v)。

在一些方面，增溶剂包括于所述水性制剂中。术语“增溶剂”指代盐、离子、碳水化合物、络合剂、聚合物和其它化合物，其在存在于溶液中时增加所述溶液中另一分子(例如，活性成分)的溶解度。增溶剂的非限制性实例包括精氨酸和柠檬酸盐。一方面，所述增溶剂为精氨酸。一方面，所述增溶剂为柠檬酸盐。

本文中证明所述增溶剂的存在适用于使所述fXa多肽保持在所述制剂中可溶并且稳定。在一些方面，所述增溶剂(例如，精氨酸)的浓度为至少10mM，或替代地至少20mM、25mM、30mM、36mM或40mM。在一些方面，所述增溶剂(例如，精氨酸)的浓度不高于100mM、96mM、90mM、80mM、70mM、60mM或50mM。在一些方面，所述增溶剂的浓度为约10mM或20mM至约60mM、约10mM或20mM至约55mM、约35mM至约55mM、约40mM至约50mM、约41mM至约49mM、约42mM至约48mM、约43mM至约47mM、约44mM至约46mM、或约40mM、45mM或50mM。应注意如本文所用，术语精氨酸指代所述氨基酸或其盐(例如，精氨酸HCl)。精氨酸具有约174.2道尔顿的分子量并且精氨酸HCl(例如，L-精氨酸HCl)具有约210.7道尔顿的分子量。

在一个实施方案中，所述增溶剂为柠檬酸盐或其盐。所述柠檬酸盐的盐为柠檬酸钠。一方面，所述柠檬酸盐包含约1.0mM至约200.0mM的浓度。另一方面，所述柠檬酸盐的浓度为约25mM。另一方面，所述柠檬酸盐的浓度为约50mM。在另一实施方案中，所述柠檬酸盐的浓度为约5mM、10mM或20mM。在另一实施方案中，所述柠檬酸盐包含约0.05M至约0.2M的浓度。

在一些方面，稳定剂包括于所述水性制剂中。术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其保护活性成分(例如，fXa衍生物多肽)和/或所述制剂在制造、存储和应用期间免于化学和/或物理降解。稳定剂的实例可包括蔗糖、精氨酸、柠檬酸盐、甘露醇、海藻糖、甘油、氯化钠、葡聚糖和葡萄糖。一方面，所述稳定剂为蔗糖。

一方面，所述水性制剂中所述稳定剂(例如，蔗糖)的浓度为至少约0.5％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述稳定剂(例如，蔗糖)的浓度为至少约0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述稳定剂(例如，蔗糖)的浓度不大于约5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％或2％(w/v)。一方面，所述水性制剂中所述稳定剂(例如，蔗糖)的浓度为约1％至约5％、或约1％至约4％、或约1％至约3％、或约1.5％至约2.5％、或约1.6％至约2.4％、或约1.7％至约2.3％、或约1.7％至约2.2％、或约1.9％至约2.1％、或约1％、1.5％、2％、2.5％或3％(w/v)。

在一些方面，所述水性制剂可进一步包括表面活性剂、缓冲液、等张剂、冷冻保护剂、表面活性剂、冻干保护剂、防腐剂或其组合。

在一些方面，所述水性制剂的pH为6或更高、或6.5或更高、或7或更高、或7.5或更高。在一些方面，所述pH不高于9、8.5或8。在一些方面，所述pH在6与9之间，在6.5与8.5之间，在7与8.5之间，在7.5与8.2之间，在7.6与8.1之间，在7.7与7.9之间，或为约7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8。

一方面，所述水性制剂包括约45mM精氨酸、约2％蔗糖(w/v)、约5％甘露醇(w/v)和约10mg/mL的两链r-解毒剂，其中所述制剂的pH为约7.8。一方面，所述水性制剂包括约45mM精氨酸、约2％蔗糖(w/v)、约5％甘露醇(w/v)和约20mg/mL的两链r-解毒剂，其中所述制剂的pH为约7.8。一方面，所述水性制剂包括约45mM精氨酸、约2％蔗糖(w/v)、约5％甘露醇(w/v)和约40mg/mL的两链r-解毒剂，其中所述制剂的pH为约7.8。一方面，所述水性制剂进一步包括0.01％-0.02％(w/v)聚山梨醇酯80和缓冲液。

B.冻干和冻干组合物

在一些实施方案中还提供冻干本公开的水性制剂的方法。一方面，本公开提供如表8.2中所示例的保守冻干循环，其包括冷冻步骤、等温步骤、退火步骤、初始干燥步骤和二次干燥步骤。

另一方面，所述冻干循环包括如表6中所述的步骤。进一步注意，一旦鉴别出适用于冻干的水溶液，冻干所述溶液的方法即可相应地由本领域中已知的方法得到。一方面，在-40℃或更高的温度下进行一个或多个或所有干燥步骤。一方面，所述干燥步骤是在-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃或0℃或更高，但不高于10℃、15℃、20℃或25℃的温度下进行。

在一些方面，还提供通过冻干本公开的水性制剂制备的冻干组合物。基于所述水性制剂中各试剂的浓度，可容易地确定冻干组合物中所述试剂的相对含量。

一方面，所述冻干组合物包括至少5％，或替代地至少10％、15％、20％、25％、30％或35％(w/w)的所述fXa衍生物多肽。此时，在其它主要成分中，例如，可有重量比率在(0.5-1.4):(1-3):(2-6)范围内的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇。在一些方面，L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)、或(0.91-0.99):(1.6-2.4):(4.6-5.4)、或(0.92-0.98):(1.7-2.3):(4.7-5.3)、(0.93-0.97):(1.8-2.2):(4.8-5.2)、或(0.94-0.96):(1.9-2.1):(4.9-5.1)范围内。在一些方面，所述冻干组合物进一步包括表面活性剂和/或缓冲液的固体部分。

另外，在一些方面，提供通过将本公开的冻干组合物溶解于溶剂中制备的溶液。在一些方面，溶剂为水或生理盐水。一方面，溶剂为水。一方面，所述溶液包括至少5mg/ml或替代地至少10mg/ml的靶标多肽。

在一个实施方案中，本公开提供包含至少10％(w/w)的r-解毒剂和重量比率为约0.95:2:5的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的冻干组合物。在一个实施方案中，本公开提供包含至少20％(w/w)的r-解毒剂和重量比率为约0.95:2:5的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的冻干组合物。在一个实施方案中，本公开提供包含至少40％(w/w)的r-解毒剂和重量比率为约0.95:2:5的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的冻干组合物。

III.使用所述制剂的方法

本公开还涉及治疗、预防或减少经历使用fXa抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者的出血的治疗方法，其包括向受试者施用有效量的溶解于合适溶剂中的冻干制剂。预期本公开的解毒剂或衍生物可为欲用于选择性或紧急情形中的短持续时间药物，其可安全地并且特异性地中和fXa抑制剂的常规抗凝血剂特性而不引起有害的血液动力学副作用或对损伤的增生性血管反应的恶化。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文中用于意指获得所需的药理学和/或生理学效应。所述效应就完全地或部分地预防病症或其病征或症状来说可为预防性的，和/或就病症和/或可归因于所述病症的不良效应的部分或完全治愈来说可为治疗性的。

“治疗”还涵盖哺乳动物中病症的任何治疗，并且包括：(a)预防可易感染病症但可能尚未诊断出患有所述病症的受试者中出现病症，例如预防具有抗凝血剂过量用药的患者中的出血；(b)抑制病症，即阻止其发展，例如抑制出血；或(c)减轻或改善所述病症，例如减少出血。

如本文所用，“治疗”进一步包括与病理学相关的症状的全身性改善和/或症状发作的延迟。“治疗”的临床和亚临床迹象将随着病理学、个体和治疗而变化。

“施用”可以一个剂量在治疗过程中连续地或间歇地实现。确定施用的最有效方式和剂量的方法为本领域技术人员已知的并且将随着用于疗法的组合物、疗法的目的、所治疗的靶标细胞和所治疗的受试者而变化。单一或多次施用可以治疗医师所选择的剂量水平和模式进行。合适剂量制剂和施用所述试剂的方法为本领域中已知的。诊断或治疗的“受试者”为细胞或哺乳动物，包括人类。诊断或治疗的非人类动物受试者包括例如鼠科动物(如大鼠、小鼠)、犬科动物(如狗)、兔科动物(如兔)、家畜、运动动物和宠物。

本公开的试剂和组合物可用于制造药剂并且通过根据常规程序施用而用于治疗人类和其它动物，如药物组合物中的活性成分。

本公开的试剂可通过任何合适途径，具体说来通过肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)施用而施用于疗法。还应了解，优选途径将随着接受者的状态和年龄和所治疗的疾病而变化。

短语“药学上可接受的聚合物”指代可结合于一种或多种此处所述的多肽的化合物的组。预期聚合物与所述多肽的结合能够体内和体外延长所述多肽的半衰期。非限制性实例包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纤维素衍生物、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、糖、多元醇和其混合物。

“抗凝血剂(Anticoagulant agent/anticoagulant)”是抑制血块形成的试剂。抗凝血剂的实例包括但不限于凝血酶的特定抑制剂、IXa因子、Xa因子、XIa因子、XIIa因子或VIIa因子、肝素和衍生物、维生素K拮抗剂和抗组织因子抗体。凝血酶的特定抑制剂的实例包括水蛭素、比伐卢定

阿加曲班和来匹卢定

肝素和衍生物的实例包括未分级肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素

达肝素

和达那肝素

和合成戊糖，如磺达肝素

维生素K拮抗剂的实例包括华法林

苯香豆素、醋硝香豆素

氯茚二酮、双香豆素、二苯茚酮、双香豆乙酸乙酯(ethyl biscoumacetate)、苯丙香豆素、苯茚二酮和噻氯香豆素(tioclomarol)。在一个实施方案中，所述抗凝血剂为Xa因子的抑制剂。在一个实施方案中，所述抗凝血剂为贝曲西班。

“抗凝血剂疗法”指代施用于患者以预防不期望的血块或血栓形成的治疗方案。抗凝血剂疗法包含在所述患者中以适用于治疗或预防不期望的血块或血栓形成的剂量和方案施用一种、或两种或更多种抗凝血剂或其它试剂的组合。

术语“Xa因子抑制剂”或“Xa因子的抑制剂”指代可体外和/或体内直接地或间接地抑制凝血因子Xa催化凝血酶原转化为凝血酶的活性的化合物。

“直接Xa因子抑制剂”直接地结合于fXa并且非限制性实例包括NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂(TFPI)、DX-DX-9065a(如例如Herbert,J.M.等人,J Pharmacol ExpTher.1996276(3):1030-8中所述)、YM-60828(如例如Taniuchi,Y.等人,ThrombHaemost.199879(3):543-8中所述)、YM-150(如例如Eriksson,B.I.等人,Blood 2005；106(11),摘要1865中所述)、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292(如例如PipelineInsight:Antithrombotics-Reaching the Untreated Prophylaxis Market,2007中所述)、奥米沙班、依杜沙班(如例如Hylek EM,Curr Opin Invest Drugs 20078(9):778-783中所述)、LY517717(如例如Agnelli,G.等人,J.Thromb.Haemost.20075(4):746-53中所述)、GSK913893、雷扎沙班、贝曲西班或其药学上可接受的盐和其组合。在一个特定方面，所述直接Xa因子抑制剂为利伐沙班。在一些方面，直接fXa抑制剂为小分支化合物。

fXa活性的“间接Xa因子抑制剂”抑制由一种或多种其它因子介导。间接Xa因子抑制剂的非限制性实例包括磺达肝素、依达肝素、生物素标记的依达肝素、依诺肝素、法安明、亭扎肝素、低分子量肝素(“LMWH”)和其组合。在一个特定方面，所述间接Xa因子抑制剂为依诺肝素。

在一个实施方案中，所述Xa因子抑制剂是选自贝曲西班、利伐沙班、LMWH、DX-9065a、YM-60828、YM-150、PD-348292、奥米沙班、依杜沙班、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、阿哌沙班和其组合。

术语“贝曲西班”指代化合物“[2-({4-[(二甲基氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”或其药学上可接受的盐。“[2-({4-[(二甲基氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”指代具有以下结构的化合物：

或其互变异构体或药学上可接受的盐。

贝曲西班描述于美国专利号6,376,515和6,835,739和2006年11月7日提交的美国专利申请公布号2007/0112039中，其内容以引用的方式并入本文中。已知贝曲西班为Xa因子的特定抑制剂。

“中和”、“逆转”或“抵消”fXa抑制剂的活性或相似短语指代抑制或阻断fXa抑制剂的Xa因子抑制或抗凝血剂功能。这些短语指代体外和/或体内部分抑制或阻断所述功能，以及抑制或阻断大部分或所有fXa抑制剂活性。

“有效量”指代足以诱导所需生物和/或治疗结果的衍生物的量。所述结果可为疾病的病征、症状或原因的减轻，或生物系统的任何其它所需改变。在本公开中，所述结果一般将涉及以下一者或多者：已经施用于患者的fXa抑制剂的中和、所述fXa抑制剂的抗凝血剂活性的逆转、所述fXa抑制剂从血浆去除、止血的恢复和出血的减少或停止。有效量将视所用的特定解毒剂、已经施用于受试者的特定fXa抑制剂、所述fXa抑制剂的给药方案、所述解毒剂的施用时间安排、所治疗的受试者和疾病状态、所述受试者的重量和年龄、所述疾病状态的严重程度、施用方式等变化，其均可由本领域技术人员容易地确定。

在某些方面，施用所述溶液以递送约10毫克(mg)至约2克(g)的量的所述fXa衍生物(例如，r-解毒剂)。所用的r-解毒剂的其它量包括约100mg至约1.5g；约200mg至约1g；和约400mg至约900mg。在一些方面，所用的r-解毒剂的量为约400mg或960mg。在一些方面，所用的r-解毒剂的量为约10mg至约100mg；约15mg至约95mg；和约20mg至约80mg。

在另一实施方案中，所述溶液以中和量施用持续至少约30分钟的时期，所述中和量为r-解毒剂的循环浓度与所述Xa因子抑制剂的循环浓度的至少约1:1摩尔比率。在其它实施方案中，所述摩尔比率为约1:1或约2:1或约4:1。

所述制剂在施用时中和所述Xa因子抑制剂达至少约20％，或至少约50％，或至少约75％，或至少约90％，或至少约95％。

可通过多种体外分析确定所述方法(即，Xa因子抑制剂的抑制或逆转)是否实现，如凝血酶产生分析和临床凝血分析(如aPTT、PT和ACT)。

本公开的一方面涉及在经历使用fXa抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中选择性地结合和抑制外源施用的fXa抑制剂的方法，其包括向所述受试者施用有效量的所述冻干制剂的溶液。适用于这种疗法的患者已经经历先前抗凝血剂疗法，例如，其已经施用一种或多种抗凝血剂，如fXa的直接或间接抑制剂。

在一些实施方案中，所述溶液在过量用药的fXa抑制剂施用后或在手术前施用，所述手术可使受试者暴露于出血风险。所述受试者可为细胞或哺乳动物，如人类。

另一方面，本文所提供的方法在经历使用Xa因子抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中选择性地结合和抑制外源施用的Xa因子抑制剂，其包括向所述受试者施用所述冻干制剂的溶液。所述受试者可为细胞或哺乳动物，如人类。

将受益于溶解的本文所述的冻干制剂的施用和随附方法的受试者包括正在经历或易感染临床严重出血事件或临床上显著的非严重出血事件的那些。临床严重出血事件的实例是选自由出血、出血至生命器官中、需要再手术或新治疗程序的出血和具有相关的明显出血的≥2.0的出血指数组成的组。(Turpie AGG等人,NEJM,2001,344:619-625。)另外，所述受试者可正在经历或易感染非严重出血事件，所述非严重出血事件选自由以下组成的组：持续或复发并且大量或无介入的情况下将不停止的鼻出血，不会上升至需要治疗程序的程度的直肠或尿道出血，在注射位点处或别处自发或伴随轻微创伤出现的实质血肿，与不需要引流的手术程序相关的超出一般的实质失血，和需要意外输血的出血。

在一些实施方案中，溶解的冻干制剂在过量用药的fXa抑制剂施用后或在手术前施用，所述手术可使受试者暴露于出血风险。

在任何本文所述的方法中，应了解即使并非始终明确地陈述，有效量的溶解的冻干制剂施用于所述受试者。所述量可由治疗医师凭经验确定并且将随着受试者的年龄、性别、重量和健康状态变化。治疗医师将考虑的额外因素包括但不限于可能已经施用的Xa因子抑制剂的身份和/或量、所述冻干制剂将施用于所述受试者的方法或模式和所述患者的治疗终点。考虑到这些变量，本领域技术人员将施用治疗有效量至欲治疗的受试者。

实施例

本公开进一步通过参考以下实施例来理解，所述实施例意图仅示例本公开。本公开的范围不受所示例的实施方案限制，所述实施方案意图仅说明本公开的单一方面。在功能上相等的任何方法均在本公开的范围内。除本文所描述的那些修饰外，本领域技术人员由前述描述和附图还将显而易知本公开的多种修饰。所述修饰属于随附权利要求书的范围。

除非另外陈述，否则所有温度均以摄氏度计。另外，在这些实施例中和别处，缩写具有以下含义：

hr ＝小时

INR ＝国际标准化比率

IV ＝静脉内

kg ＝千克

M ＝摩尔

mg ＝毫克

mg/kg ＝毫克/千克

mg/mL ＝毫克/毫升

min ＝分钟

mL ＝毫升

PPP ＝贫血小板血浆

PRP ＝富血小板血浆

PT ＝凝血酶原时间

U/mL ＝单位/毫升

μL或uL ＝微升

μM ＝微摩尔

实施例1.制备r-解毒剂

具有离子强度0.15(用NaCl调节)的柠檬酸盐-磷酸盐(20mM)缓冲液使用柠檬酸单水合物(Fisher,Pittsburgh,PA)和无水磷酸二钠(Sigma,St.Louis,MO)制备并且pH使用6MHCl或6M NaOH进行调节。无额外盐的磷酸盐(20mM)缓冲液通过将6.61g无水磷酸二钠溶解于2.0L Mili-Q水中来制备并且pH调节至7.5。关于含有盐(I＝0.15M)的磷酸盐(20mM)缓冲液，14.8g NaCl添加至上述磷酸盐缓冲液中。除非另外注明，否则所有其它试剂均购自Sigma(St.Louis,MO)。

所述r-解毒剂(SEQ ID NO.3)的多肽以大约5mg/ml的浓度存储于含有2％精氨酸的10mM Tris(pH 8.0)中的储备溶液中。所述r-解毒剂的透析在4℃下使用

透析盒3000MWCO(Pierce,Rockford,IL)针对具有所选pH值的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液执行。为了防止透析期间的聚集，所述储备蛋白溶液在装载至盒中之前用经过过滤的透析缓冲液稀释至0.5mg/ml。在透析后，所述r-解毒剂稀释至0.3mg/ml并且蛋白浓度用UV吸光光谱法(A₂₈₀)使用1.16ml·mg^-1·cm^-1的消光系数测量。通过这种方法产生的r-解毒剂用于以下实施例中。

实施例2.针对稳定性监测的差示扫描量热法(DSC)

使用Microcal capillary自动DSC用温度控制样品装载室执行差示扫描量热法(DSC)。以60℃/h的扫描速率和25分钟预扫描平衡时期从6-100℃执行热匀变。适当匹配缓冲液用于参考池，而匹配缓冲液中的典型样品浓度为约0.6mg/mL。从所有样品扫描中减去缓冲液对缓冲液参考物扫描并且热解曲线在分析之前进行浓度标准化。使用由Microcal供应的软件处理数据。吸热峰使用非双态拟合函数拟合至单一峰，并且通过所述拟合函数计算转变温度(Tm)值。开始温度(T开始)值通过从低温基线推导吸热峰来确定。

DLS通常用于示出异源样品中多个群体的存在。使用Wyatt板式读取器DLS仪器，在20℃下在单组实验中测量在不同pH条件下的10-20μL蛋白溶液(0.3mg/mL)。所述样品在3000rpm下离心持续5min以去除任何气泡，并且获得各20秒的5次扫描以产生平均样品半径。在pH 5.0-7.5下，观察到流体动力学半径为约3nm的单个群体。

实施例3.鉴别稳定剂

来自实施例2的数据证明所述r-解毒剂在pH 7.5下大体稳定。因此，在pH 7.5下在20mM磷酸盐缓冲液中执行赋形剂筛选研究。使用Dynapro动态光散射板式读取器仪器(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)测量所述蛋白的流体动力学直径。所述流体动力学直径通过Stokes-Einstein方程使用累积量方法(基于对数正态数)由扩散系数计算。所述测量用于评估所供应的样品的均质性。

首先使用SpectraMax M3板式读取器通过在60℃、pH 7.5下用0.3mg/ml的蛋白在赋形剂存在或不存在下监测蛋白聚集动力学来鉴别潜在稳定化赋形剂。来自公认安全(GRAS)的赋形剂的文库的32种赋形剂全部如表4.1中所列进行测试。

表4.1赋形剂列表和通过OD 350nm动力学研究测试的浓度

已确定在所测试的赋形剂中，蔗糖、山梨醇和柠檬酸盐具有最大稳定化效应。赋形剂组合对蛋白稳定性的影响的后续测试是基于如表4.2中所概述的这三种赋形剂。一式两份运行OD 350nm熔融并且如上文所述计算针对各制剂的ΔT值。基于表2中示出的ΔT值，鉴别出制剂3、4、5和6具有最大稳定化效应。

表4.2所测试的赋形剂组合的列表和相应的ΔT值和溶液摩尔渗透压浓度。

所述ΔT是在pH 7.5下单独蛋白与具有赋形剂的不同组合的蛋白的转变温度之间的差异。摩尔渗透压浓度由一式三份测量求平均值并且ΔT由一式两份测量求平均值。

这些制剂中的治疗蛋白的聚集特性进一步在这些组合制剂中使用OD 350nm熔融方法在不具有NaCl的20mM磷酸盐缓冲液中在pH7.5下进行研究。一般说来，在不具有NaCl的情况下聚集程度低得多。实际上，OD 350nm熔融最初从35-75℃运行，并且由于未观察到明显聚集，所述熔融实验用相同样品从75至100℃再运行。因此，在75℃下在OD 350nm曲线中可观察到断裂，因为在这一温度下停留约10min。即使在匀变直至100℃之后，在制剂3、4、5和6中也未观察到蛋白的明显聚集。去除额外NaCl的另一益处是与具有NaCl的那些制剂相比，所述制剂的相应摩尔渗透压浓度低得多。

实施例4.溶解度测试

这一实施例测试了pH、温度、稳定剂(例如，柠檬酸盐、精氨酸、甘氨酸和赖氨酸)和离子强度对所述r-解毒剂的溶解度的影响。

材料和方法

所用的材料是r-解毒剂(4.8mg/ml)于10mM Tris pH8.0和2％精氨酸中的溶液。关于室温(RT)下的溶解度，通过物理观察持续至少1-2h来进行测试。关于5℃下的溶解度，样品在5℃下平衡过夜并且对所述样品进行物理观察。另外，所述样品在5℃下离心持续15min并且通过UV A280nm分析上清液中的蛋白浓度(一式两份稀释)。作为对照，每日分析初始储备溶液。

当观察到蛋白沉淀时，由上清液浓度确定的溶解度被解释为<XX mg/mL(相应图中的阴影条)。这是由于过量蛋白存在和具有接近缓冲液pH的PI的蛋白子群体的优先沉淀。当未观察到蛋白沉淀时，由溶液浓度确定的溶解度被解释为>XX mg/mL(图中的空心条)。

室温下pH对溶解度的影响用不同pH(包括5.0、6.0、7.0和8.0)进行测试。如图1A中所示，所述r-解毒剂在pH 8.0下具有最高溶解度(42.2mg/mL，无可见沉淀)。相比之下，溶解度在pH 5.0、6.0和7.0下分别为3.5mg/mL(无沉淀)、12.3mg/mL(观察到沉淀)和24.4mg/mL(观察到沉淀)。

表5.1列出在5℃下针对溶解度进行测试的样品。如所示，UF缓冲液由42mM MES、4mM磷酸钠、833mM NaCl、8mM Tris和浓缩至约5mg/mL的58mM精氨酸构成。

表5.1在不同pH下用不同增溶剂(柠檬酸盐或精氨酸)测试r-解毒剂溶解度的样品

在pH 7.3下，10mM柠檬酸盐略微改进解毒剂5℃溶解度。无柠檬酸盐或精氨酸的情况下，5℃溶解度具有以下等级次序：pH 7.55>pH 7.80>pH 7.30(图1B)。所述UF缓冲液(pH7.48)看来具有最佳溶解度(50mg/mL)，这可能由于在合适pH 7.5下58mM精氨酸+833mMNaCl的存在(图1B)。

表5.2列出用于测试在pH 7.55下精氨酸对柠檬酸盐的效应的样品。如图1C中所示，在pH 7.55下，柠檬酸盐和精氨酸均显著改进r-解毒剂5℃溶解度。此外，看来在相同摩尔浓度下柠檬酸盐比精氨酸更有效：–10mM柠檬酸盐～50mM精氨酸>20mM精氨酸>10mM精氨酸。

表5.2在pH 7.55下在柠檬酸盐和精氨酸中测试r-解毒剂溶解度的样品

精氨酸对柠檬酸盐的效应进一步在pH 7.8和8.0下使用表5.3中的样品进行测试。图1D示出所述r-解毒剂在5℃下在pH 8.0下比在pH 7.8下略微更可溶。10mM柠檬酸盐和20mM精氨酸在pH 7.8和8.0下均改进溶解度至至少15mg/mL。

表5.3在pH 7.8和8下在柠檬酸盐和精氨酸中测试r-解毒剂溶解度的样品

精氨酸的效应还在pH 7.8下与甘氨酸和赖氨酸进行比较(表5.4)并且结果在图1E中示出。如图中所示，甘氨酸和赖氨酸在5℃下对r-解毒剂溶解度不具有影响并且在5℃下在pH 8.0对pH 7.55下关于20mM精氨酸观察到更强增溶效应。

表5.4在pH 7.8下在甘氨酸、赖氨酸和精氨酸中测试r-解毒剂溶解度的样品

还测试离子强度对r-解毒剂的溶解度的影响(表5.5)。如图1F中示出，在5℃下在精氨酸或柠檬酸盐不存在下离子强度增加r-解毒剂溶解度，并且所述效应看来在>0.10M的离子强度下突出。

表5.5在pH 7.8下在不同离子强度下测试r-解毒剂溶解度的样品

总之，这一实例证明在室温下在如精氨酸和柠檬酸盐的增溶剂不存在下，所述r-解毒剂在pH 8.0下具有最高溶解度。在5℃下，pH 8.0对于所述r-解毒剂最佳。此外，柠檬酸盐和精氨酸均显著改进所述r-解毒剂的5℃溶解度。然而，甘氨酸和赖氨酸(其均增加针对所述r-解毒剂的Tm)对溶解度无影响。总的说来，在5℃下所述r-解毒剂的最高溶解度是在pH 7.8下用95mM精氨酸实现。10天后未观察到沉淀。

实施例5.初始冻干工艺

所述冻干工艺是使用合理方法基于对冻干循环的不同阶段中制剂组分的物理性质的理解开发的。使用包括DSC和冷冻干燥显微术(FDM)的热表征方法来测量Tg’(冷冻浓缩物的玻璃转变温度)和Tc(初始干燥期间的崩塌温度)。选择表6中示出的循环用于冻干制剂的冻干。所述退火步骤允许甘露醇的结晶以确保产物温度不会在初始干燥期间降至崩塌温度之下。选择初始干燥温度以在初始干燥的合理持续时间内避免饼崩塌。开发2步二次干燥条件以产生具有<1％的水分含量的冻干制剂。

表6.冻干循环

实施例6.无结晶组分的情况下的冻干

实验/研究设计

制备十种不同制剂以测试缓冲液组成、pH、稳定剂和药物浓度对所述r-解毒剂的溶解度和稳定性的影响(表7)。所述直接使用Tris或磷酸盐缓冲液在pH 7.8和8.2下制备。溶液使用离心过滤浓缩至10mg/mL和25mg/mL。

在tris或磷酸盐缓冲液中制备的浓缩溶液的样品针对短期稳定性放置于2-8℃和25℃下持续2周。同时，各溶液的样品用于冷冻/解冻研究并且检查沉淀和聚集。用于冷冻/解冻研究的样品由2mL I型玻璃管瓶中的0.5mL各制剂组成。所述0.5mL样品在冷冻前并且在各冷冻/解冻循环后进行目视检查。各样品放置于-80℃下持续大约2小时，在室温下解冻持续大约15至30分钟，目视检查持续大约1-2分钟，并且返回-80℃冷冻器。在第3冷冻循环后取出各制剂的250L样品并且提交至实验室供分析用。剩余溶液经受2个额外冷冻循环并且接着提交至实验室供分析用。

所有剩余溶液均使用保守循环冷冻为0.25mL样品并且所述样品针对加速稳定性放置于25℃和40℃下。

使用无聚山梨醇酯溶液制备两种额外制剂以在保护剂不存在下测试冷冻/解冻和冻干对所述分子的影响(表7中的制剂5和6)。保存所述溶液的样品并且使用已调制的DSC和冷冻干燥显微术用于热表征。

表7.制剂编号、组分、浓度和pH值

编号	组分	浓度	pH
				1A	10mM Tris、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	10mg/mL	7.8
1B	10mM Tris、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	25mg/mL	7.8
				2A	10mM Tris、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	10mg/mL	8.2
2B	10mM Tris、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	25mg/mL	8.2
				3A	10mM磷酸、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	10mg/mL	7.8
3B	10mM磷酸、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	25mg/mL	7.8
				4A	10mM磷酸、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	10mg/mL	8.2
4B	10mM磷酸、4％蔗糖、95mM精氨酸、PS80 0.01％	25mg/mL	8.2
				5	10mM Tris、95mM精氨酸	25mg/mL	7.8
6	10mM磷酸、95mM精氨酸	25mg/mL	7.8

所述制剂使用以3mg/mL、3.3mg/mL和4.8mg/mL供应的具有和不具有聚山梨醇酯80(PS80)的散装原料药制备。

制剂5和6首先使用各制剂的19mL散装药物溶液制备。所述散装体积放置于具有10K膜的透析盒中并且所述盒放置于2L 10mM Tris或10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中。所述溶液透析大约2小时，透析溶液用另外2L新鲜缓冲溶液置换并且再透析持续至少2小时。所述溶液从各盒中取出并且放置于Amicon Ultra Ultracel 10K离心滤管中。所述溶液以3/4速度离心持续大约30分钟。剩余溶液从所述离心管中取出并且添加95mM精氨酸，随后调节浓缩溶液的pH和体积。

使用相同程序来制备制剂1A至4A和1B至4B。使用具有3mg/mL的散装溶液制备的制剂使用13.5mL散装材料来制备10mg/mL溶液并且使用33.5mL散装材料来制备25mg/mL溶液。使用4.8mg/mL的散装溶液的制剂使用8.4mL散装材料来制备10mg/mL溶液并且使用20.9mL散装材料来制备25mg/mL溶液。

最终体积的样品溶液所需浓度的蔗糖和精氨酸在浓缩所述溶液之后添加至所述散装溶液中并且接着调节所述溶液至适当pH和最终体积。PS80加入至最终样品溶液中以使用1％PS80溶液产生0.01％浓度。

所述溶液通过0.22μm针筒过滤器过滤并且接着分至小瓶中。2mL小瓶各自填充250L溶液并且使用以下条件冻干。

1.在1℃/min下冷却至-40℃

2.在-40℃下保持1小时，接着在100毫托下起始真空

3.在0.5℃/min下匀变至-35℃并且保持直至皮拉尼压力计测量匹配100毫托的电容压力计测量并且产物温度达到搁板温度。

4.在0.5℃/min下匀变至20℃并且保持直至皮拉尼压力计测量匹配100毫托的电容压力计测量并且产物温度达到搁板温度。

在冻干后安置塞子并且对小瓶盖帽。样品提交用于初始时间点(T0)测试并且剩余小瓶针对稳定性放置。

已调制的差示扫描量热法(DSC)

使用已调制并且标准DSC检查溶液样品的热性为。通过将12L溶液放置于T0盘中来检查样品并且进行密封。所述溶液在1℃/min下冷却至-40℃并且等温保持5分钟。所述样品的温度在0.5℃/min下匀变至10℃，其中每120秒调节1℃。使用退火步骤检查一些样品。那些样品通过在1℃/min下冷却至-40℃，等温保持5min，在1至5℃/min下使温度匀变至-15℃或-20℃并且等温保持至少60分钟。所述样品的温度在5℃/min下恢复-40℃，等温保持5min，并且在0.5℃/min下匀变，其中每120秒调节1℃。

冷冻干燥显微术

使用冷冻干燥显微术通过将2至4L溶液放置于冷冻干燥显微镜镜台中的2个盖玻片之间来检查样品。所述样品在1℃/min下冷却至-40℃或更低并且等温保持2min。在100微米处起始真空并且使用安装于偏振光显微镜上的摄影机目视检查所述样品。所述样品在这一温度下冷冻干燥直至干燥材料可见并且拍照。其后，所述样品的温度以2℃增量增加并且在各温度下保持以观察冷冻干燥的样品。所述样品的温度增加直至观察到完全崩塌。

分析方法

A.通过UV-Vis得到的浓度

使用Nano Drop 2000分光光度计(Thermo Scientific)测量所述溶液的浓度。通过将2L溶液放置于测试平台上并且在280nm范围内扫描来进行扫描。

B.pH

使用型号为920A的Orion pH计测量溶液的pH。使用购自Thermo Scientific的预制缓冲溶液在pH 7至pH 10范围内校准所述计/探针。

C.SEC-HPLC

使用Agilent 1100系列HPLC执行尺寸排阻HPLC分析。在0.1M磷酸钠、0.75M精氨酸盐酸盐(pH 7.4)中制备的流动相用于分离。所用的分析柱为YMC-Pack diol-200，300×4.6mm，5μm平均粒径。使用参考材料的六次重复注射验证包括所述柱在内的HPLC系统的适用性并且针对主要蛋白峰评估保留时间、面积和百分比面积。另外，使用凝胶过滤标准物来评估所述柱的分离能力。使用制剂缓冲液将样品稀释至1mg/mL的蛋白并且注射以获得每次注射50μg蛋白的柱负荷。

D.RP-HPLC

使用Agilent 1100系列HPLC执行反相HPLC分析。所述方法使用利用在HPLC级水中的0.1％三氟乙酸和乙腈中的0.08％三氟乙酸中制备的流动相的分离梯度。所用的分析柱为Vydac C18柱，150×4.6mm，5μm平均粒径。使用参考材料的六次重复注射验证包括所述柱在内的HPLC系统的适用性并且针对主要蛋白峰评估保留时间、面积和百分比面积。使用制剂缓冲液将样品稀释至1mg/mL的蛋白并且注射以获得25μg蛋白/注射的柱负荷。

E.IEX

使用Agilent 1100系列HPLC执行离子交换HPLC分析。所述方法使用利用在20mM磷酸钠(pH 6.5)和20mM磷酸钠、1M氯化钠(pH6.5)中制备的流动相的梯度。所用的分析柱为Dionex Propac WCX-10，250×4mm。使用参考材料的六次重复注射验证包括所述柱在内的HPLC系统的适用性并且针对标记为峰#2的峰评估保留时间、面积和百分比面积。使用制剂缓冲液将样品稀释至1mg/mL的蛋白并且注射以获得每次注射50μg蛋白的柱负荷。

结果：

使用保守循环冻干所述溶液样品的子集并且针对稳定剂放置于25℃和40℃下持续2个月。所述冻干循环由于低填充体积在大约20小时内完成。所有冻干的饼看来均为可接受的，除了制剂2A，其可能归因于过滤器撕裂。

一般说来，使用SEC和RP获得的数据看来区别所述制剂之间的差异。这表明所述方法为稳定性指示并且可用于比较样品。数据支持所述r-解毒剂的稳定性受pH影响。数据证明在pH 7.8下制备的制剂的稳定剂由于在pH 8.2下制备的制剂的稳定性。关于存储于40℃下的样品，尤其如此。

这一研究包括针对所述r-解毒剂的稳定性比较缓冲液类型。所述缓冲液包括在pH7.8和8.2下制备的tris和磷酸盐。数据表明缓冲液类型不会影响所述r-解毒剂的稳定性并且稳定性的差异主要为pH的函数。

所述研究中的两种制剂(制剂5和6)不使用蔗糖和聚山梨醇酯80制备。蔗糖用作冻干保护剂并且聚山梨醇酯80用于防止蛋白由于与小瓶的壁的相互作用和在冷冻步骤期间与冰的相互作用而聚集。不使用保护剂制备的制剂展现百分比聚集物的增加，如在40℃下存储1个月之后通过SEC所确定。数据支持所述制剂中对赋形剂的需要以改进所述蛋白的稳定性。

所述稳定性研究还支持冻干样品比作为溶液制备的制剂更稳定。所述溶液样品的比较证明了当存储于5℃下时所述溶液样品的稳定性优于当存储于更高温度下时。

用于所述稳定性研究的样品使用每个2mL小瓶0.25mL来制备。仅当存在不充足固体来支撑样品2A中的饼时，观察到崩塌。所有其它样品看来均为可接受的，然而当使用所述低填充体积时确定饼收缩的程度是不可行的。与所述稳定性研究并行地进行热表征研究以确定在满量程下冻干所述制剂的可行性。

使用已调制的DSC检查制剂5和6。两种制剂均含有大约25mg/mL的所述r-解毒剂和95mM精氨酸HCl，但制剂5用10mM Tris制备并且制剂6用10mM磷酸盐制备。当使用总热流、不可逆热流或可逆热流观察时，在加温匀变期间未观察到热事件。总热流热解曲线将示出动力学相关事件和非动力学相关事件。不可逆热流热解曲线将示出动力学相关事件(如结晶)并且可逆热流热解曲线将示出非动力学相关事件(如玻璃转变)。可观察到的事件的缺乏可表明所述组分的浓度过低而无法产生具有充足强度的信号。

进行冷冻干燥显微术实验以确定崩塌温度是否将匹配关于使用MDSC确定的Tg’所观察到的结果。预期所有样品的热行为相似，因为其均具有在相似浓度下的相同赋形剂。

用大约25mg/mL的r-解毒剂浓度制备制剂5和6并且其均含有95mM精氨酸(pH7.8)。所述制剂之间的唯一差异为缓冲液。制剂5含有10mM tris并且制剂6含有10mM磷酸盐。制剂5展现在-40℃下崩塌并且制剂6展现在-39℃下崩塌。数据支持所述产物的温度需要维持在确定的崩塌温度之下以获得可接受的冻干样品。维持所述低产物温度在实验室或满量程冻干器中不可行。

尽管针对所述冻干制剂的稳定性数据看来是可接受的，热表征数据证明所述制剂由于低崩塌温度而无法经受按比例扩大。使用MDSC和冷冻干燥显微术获得的热表征表明所述制剂在冷冻和干燥后保持非晶形并且组分的组合导致低崩塌温度。产生可经受按比例扩大的制剂的唯一方式是添加结晶组分以充当支架，所述支架可在冷冻干燥期间和之后维持非晶材料于适当位置中。添加至药物制剂中的最常见结晶组分是甘露醇。所有进一步制剂和工艺开发工作研究了不同浓度的甘露醇的添加。含有甘露醇的制剂的开发和针对所述制剂的稳定性研究描述于独立开发报告中。

结论

检查缓冲液类型、pH、稳定剂和蛋白浓度对呈溶液和冻干制剂形式的所述r-解毒剂的稳定性的影响。溶液样品存储于5℃和25℃下持续长达2周并且冻干样品存储于25℃和40℃下持续长达2个月。以2mL小瓶中的0.25mL形式冻干的制剂在2个月后展现可接受的稳定性。然而，热表征实验证明所有制剂具有-37℃或更低的崩塌温度并且不可经受按比例扩大。数据表明所述制剂中需要结晶组分以防止崩塌并且允许在较高温度下冻干。

实施例7.缓冲液类型和甘露醇对所述制剂的热行为和稳定性的影响。

来自实施例6的数据表明所述r-解毒剂制剂中需要结晶组分以防止冷冻干燥期间的崩塌。这一实施例检查了甘露醇和精氨酸浓度对所述制剂的热行为和冻干的饼外观的影响。在降低精氨酸的浓度的情况下研究含有2％至4％甘露醇的制剂。精氨酸防止甘露醇的结晶，除非浓度为47.5mM或更低。研究发现含有10mM tris、10mg/mL r-解毒剂、45mM精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80的制剂产生具有可接受的外观和物理和化学稳定性的冻干的饼。冻干研究提供数据来支持在-25℃下退火持续3小时之后使用-25℃的初始干燥搁板温度。两步二次干燥工艺产生具有小于1％的残留水分值的饼。

实验/研究设计

设计研究以并行地检查所述制剂的热行为并且比较使用保守循环冻干的制剂的化学稳定性。初始制剂用95mM精氨酸、2％蔗糖、2％甘露醇和10mM tris或10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)制备。所述制剂还含有10或25mg/mL的活性成分(表8.1)。

表8.1在pH 7.8下用甘露醇制备的初始制剂。

解冻的药物溶液的等分试样放置于具有3K截留分子量(MWCO)膜的透析盒中。所述盒放置于含有具有精氨酸、蔗糖和甘露醇的tris或磷酸盐的缓冲溶液中。含有所述药物溶液的各盒放置于2L缓冲溶液中并且透析持续4小时。所述缓冲溶液在2小时后更新并且所述溶液在2-8℃下再透析持续4小时或过夜。所述溶液使用具有18G针的BD针筒从所述透析盒取出并且放置于具有3K MWCO膜的离心滤管中。所述管在大约3000RPM下离心持续20至30分钟并且使用NanoDrop2000分光光度计检查所述溶液的浓度。溶液浓缩至大于10mg/mL或25mg/mL并且使用适当缓冲溶液稀释至适当浓度并且使用1％聚山梨醇酯80溶液将聚山梨醇酯浓度调节至0.01％。所述溶液通过0.22μm针筒过滤器过滤并且以每个小瓶0.25mL和0.8mL填充至3mL玻璃管瓶中。所述溶液使用保守循环(表8.2)冷冻干燥并且针对稳定性放置于25℃和40℃下持续长达2个月。

表8.2用于含甘露醇制剂的保守冻干循环。

步骤	详情
		冷冻	以1℃/min匀变至-40℃
等温	保持120min
		退火	以1℃/min匀变至-25℃，保持180min
初始干燥	-30℃，保持直至皮拉尼(Pirani)＝CM
		二次干燥	以0.5℃/min匀变至40℃，保持直至皮拉尼＝CM

在冷冻干燥之前各溶液的样品保存供使用DSC和FDM进行热分析。

使用不具有蛋白的情况下制备的缓冲溶液完成额外热分析和冻干循环开发研究。进行所述实验以确定所述制剂中所需的精氨酸的最小浓度以使蛋白稳定化而不干扰甘露醇的结晶。由客户进行溶解度研究以确定使蛋白稳定化所需的精氨酸的最小浓度。₁通过Baxter进行实验以测试精氨酸和甘露醇浓度对热行为、冻干循环条件和饼外观的影响。所述缓冲溶液含有具有2％蔗糖的10mM tris(pH 7.8)。精氨酸浓度从95mM至9.5mM变化并且甘露醇浓度在2％与5％之间变化。

基于热行为、饼外观和短期加速稳定性数据鉴别良好的制剂候选物。针对进一步开发所提出的制剂含有10-25mg/mL r-解毒剂、10mM tris(pH 7.8)、45mM精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80。早期研究使用每个3mL小瓶0.2mL至1mL。使用25mg/mL的药物浓度进行使用低精氨酸制剂的初始稳定性研究并且使用保守循环冻干。样品针对稳定性放置于25℃和40℃下持续长达3个月。

为确认所述过程所进行的循环使用以每个小瓶5mL填充至10mL小瓶中的药物溶液。相同小瓶和填充体积用于在二次干燥研究期间研究水分含量的效应。使用药物溶液制备用于这些研究的制剂，所述药物溶液使用实验室规模切向流过滤(TFF)单元更换为适当缓冲液。所述TFF单元配备有用于所述溶液的容纳容器，所述容纳容器连接至具有管的切向流过滤器。使所述容器填充药物溶液，更换为适当缓冲液，并且通过经过10KDa MWCO膜过滤而浓缩至10至25mg/mL。添加足量的1％聚山梨醇酯80(PS80)以产生0.01％PS80浓度。最终溶液通过0.22μm针筒过滤器或真空过滤系统过滤。

所述冻干循环检查工艺参数，如冷却匀变速率和在初始与二次干燥之间的匀变速率以及在退火和初始干燥期间的搁板温度。通过在二次干燥开始时并且在40℃下4、8和10小时之后取出样品来进行残留水分研究。通过在40℃下8小时之后并且在50℃下1和2小时之后取出样品来进行二次研究。使用Karl Fischer分析来测试所述样品的残留水分并且当残留水分的值达到稳定时期时，认为干燥完全。通过在二次干燥期间对应于特定残留水分值的时间取出样品来测试残留水分对所述制剂的稳定性的影响。所述样品针对稳定性放置于40℃下持续长达2个月并且在50℃下持续1周。

针对所提出的含有10mg/mL r-解毒剂、10mM tris、45mM精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80(pH 7.8)的药物产物制剂创建冻干循环设计空间。所述制剂使用每个小瓶5mL溶液填充至10mL玻璃管瓶中。所述设计空间的开发需要知道与所述制剂的崩塌温度和所述小瓶的传热系数组合的设备能力。所述小瓶的传热系数使用用于所述产物的精确玻璃管瓶、用水填充所述小瓶并且使用预期用于干燥所述产物的搁板温度使冰升华来确定。在室压力从大约25毫托变化为大约400毫托的情况下收集产物温度和质量流数据。在各压力下使用可调谐二极管激光吸收光谱法(TDLAS)收集质量流数据并且使用随压力而变的质量流率的改变来计算所述小瓶的传热系数。

结果：

1.差示扫描量热法(DSC)

制备各缓冲液组分的个别溶液并且使用DSC进行测试以确定各组分对缓冲液制剂的热行为的影响。一般地，所述制剂的热行为由以最高浓度存在的组分指示。热行为的改变可在添加其它赋形剂或所述药物的情况下发生。例如，盐的添加可降低所述制剂中的非晶材料的Tg’。所提出的药物制剂含有甘露醇。甘露醇作为赋形剂添加至冻干制剂中以充当结晶膨胀剂。当最初在溶液中冷冻时，甘露醇为非晶形。在冷冻期间一般包括退火步骤以促进甘露醇的结晶，使得其可提供用于饼的结构。制剂中的其它赋形剂和/或活性成分可防止或延迟甘露醇的结晶。这一部分中讨论的研究调查了tris、磷酸盐和精氨酸对甘露醇的结晶和所述溶液的热行为的影响。

在pH 7.8下制备的10mM tris溶液使用DSC在1℃/min下冷却至-50℃(图2)。热解曲线示出在大约-20℃下开始冰的结晶放热，随后在-32℃下开始的tris的结晶放热。

当95mM精氨酸包括于所述制剂中时，结晶放热不再存在(图3)。在这一研究的温度范围内除冰的熔融吸热以外未观察到热事件。

当10mM Tris、95mM精氨酸制剂含有4％蔗糖时，观察到具有大约-42℃的中点的Tg’。单独蔗糖的Tg’的中点一般为约-33℃。所述研究证明了tris/精氨酸混合物降低蔗糖的Tg’。具有低于-40℃的Tg’的溶液并非冻干的良好候选物。在初始干燥期间难以维持所述低产物温度。如甘露醇的结晶组分的添加可提供结构并且改进冻干机会，只要甘露醇在初始干燥开始之前结晶即可。

甘露醇以2％W/V添加至所述制剂中并且蔗糖浓度降低至2％，使得所述制剂中的总糖含量维持于4％下。用10mM tris、2％蔗糖和2％甘露醇制备的溶液证明了甘露醇在大约-20℃下开始结晶(图4)。当95mM精氨酸添加至所述溶液中时，防止甘露醇的结晶(图5)。即使当冷冻溶液在-20℃下退火持续长达5小时之时，甘露醇也不结晶(图6)。

关于用10mM磷酸钠制备的溶液进行相同热分析的集合以测试缓冲液对所述制剂的热行为的影响。当制备为10mM溶液(pH 7.8)时，磷酸钠在冷却步骤期间结晶(图7)。

10mM磷酸钠与95mM精氨酸和4％蔗糖的混合物展现具有大约-38℃的中点的Tg’。

与tris溶液相似，含有蔗糖和甘露醇的磷酸盐溶液展现甘露醇的结晶放热(图8)。当95mM精氨酸添加至所述混合物中时，未观察到结晶放热(图9)。与用tris制备的制剂相似，即使当磷酸盐制剂在-20℃下退火持续5小时之时，也未观察到结晶放热。

所述研究证明了95mM精氨酸添加至含有tris或磷酸盐的制剂中将急剧降低蔗糖的Tg’并且将防止甘露醇的结晶。数据证明制剂的改变是必需的以便促进甘露醇的结晶供成功冻干的饼用。在进行这一研究时，数据表明需要95mM精氨酸或10mM至20mM柠檬酸盐来维持所述蛋白的溶解度。因此，使用含有具有2％蔗糖和5％甘露醇的10mM tris中的10mM或20mM柠檬酸盐的溶液进行研究，所述溶液作为所述制剂中的精氨酸的替代物。增加甘露醇浓度并且降低蔗糖浓度以增加甘露醇结晶的可能性。使用2％蔗糖和5％甘露醇连同精氨酸的研究稍后描述于这一报告中。

含有柠檬酸盐的溶液在-25℃下退火。在-25℃下在10mM柠檬酸盐中24分钟时开始观察到结晶放热(图10)并且在-25℃下在20mM柠檬酸盐中30分钟时开始观察到结晶放热(图11)。

2.冷冻干燥显微术(FDM)

使用FDM检查用10mM磷酸盐或10mM tris和10mg/mL r-解毒剂、95mM精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇在pH 7.8下制备的制剂。用所述tris制剂进行的实验示出当在-25℃下退火持续长达3小时之时，所述制剂在大约-34℃下开始崩塌。

含有10mM磷酸盐的制剂具有较高的崩塌温度。在-32℃下观察到一致干燥层并且在-30℃下观察到崩塌开始。

FDM数据表明两种制剂均可使用可经受常规生产的条件冻干。这与使用DSC获得的数据不相关。使用FDM进行的实验利用了与温度控制镜台直接接触的两个盖玻片之间溶液的薄层。这些条件表明干燥的简易性并且因此无法与DSC数据相关，假定其相关性的后续测试依赖于所述DSC数据。

3.冻干和稳定性

用10mg/mL和25mg/mL r-解毒剂和95mM精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇在pH 7.8下制备的磷酸盐和tris制剂以溶液和冻干样品形式检查稳定性。各溶液以每个小瓶0.20mL填充至3mL小瓶中。一部分样品存储于5℃和25℃下持续长达2周并且另一部分样品使用保守循环冻干并且针对稳定性放置于25℃下持续长达3个月并且在40℃下持续长达2个月。

所述样品在-25℃下退火持续1小时，接着在-30℃下冻干。还使用具有20℃搁板温度的保守条件进行二次干燥。使用保守、非常规循环，因为关于所述蛋白的温度敏感性所知甚少。所述冻干循环在大约21小时内完成。所述小瓶用塞子密封，接着从冻干器中取出，盖帽，并且针对稳定性进行放置。

冻干的饼看来是可接受的，其中无崩塌迹象，并且用纯水快速地复原。并行地进行使用不具有所述药物的相同制剂的第二研究以确保甘露醇的结晶(如果发生的话)不会引起小瓶的破裂。安慰剂制剂以各10mL溶液填充至20mL小瓶中。一个完整托盘的小瓶在1℃/min下冷却至-40℃，等温保持120分钟，并且接着在1℃/min下匀变至-25℃持续3小时的退火。小瓶的第二集合冷却至-25℃，等温保持3小时，冷却至-35℃并且接着转移至含有所述完整托盘的小瓶的干燥器中。所有小瓶均在-30℃下冻干并且在25℃下干燥供二次干燥用。在含有两种制剂的小瓶中观察到崩塌。

这表明甘露醇不结晶并且支持在热分析期间使用DSC作出的结论：精氨酸防止甘露醇的结晶。因此，未来实验依赖于DSC和冻干数据(假定其与制剂开发的相关性)，而非FDM结果。

下一实施例中描述的研究聚焦于精氨酸的减少和其对所述蛋白的溶解度和甘露醇的结晶的影响。用上述95mM精氨酸制备的磷酸盐和tris制剂针对稳定性加以保持以提供初始数据。

当存储于5℃和25℃下持续长达2周时在溶液样品中未观察到浓度损失并且在T0处液体与冻干样品之间并无浓度差异(图12和13)。

同样，在存储于25℃下持续长达3个月(图14)或在40℃下持续长达2个月的任何冻干制剂中均未观察到浓度损失。

SEC数据示出当溶液制剂存储于5℃下持续长达2周时主峰并无损失。当存储于25℃下持续长达2周时，百分比主峰在10mg/mL样品中降低超过1％并且在25mg/mL样品中降低超过3％。

因此，尽管所述制剂的化学稳定性看来是可接受的，由于冻干期间的不良物理稳定性而必需所述制剂的改变。不良物理稳定性由关于安慰剂制剂所观察到的崩塌的饼证明。来自DSC实验的数据表明降低精氨酸浓度和增加甘露醇浓度应促进甘露醇的结晶并且改进冻干的饼的物理稳定性。

实施例8.精氨酸和甘露醇浓度对冻干样品的热行为和外观的影响

进行这一实施例以调查在使用安慰剂制剂时精氨酸浓度和甘露醇浓度对热行为和饼外观的影响。所述研究聚焦于用tris缓冲液制备的安慰剂制剂。选择Tris缓冲液是因为它是用于制备散装药物溶液的缓冲液并且因为用tris和磷酸钠制备的样品的化学稳定性无差异。

以下研究检查使用9.5mM至95mM的精氨酸浓度范围和2％至5％的甘露醇浓度范围。

1.热分析

所述热分析实验的目标是确定促进甘露醇的结晶而不会大体上增加所述制剂中的固体浓度的精氨酸和甘露醇浓度。高浓度的固体可增加冻干期间对质量转移的抵抗并且产生过长的冻干循环。

精氨酸浓度在10mM tris、2％蔗糖、2％甘露醇和0.01％PS80制剂中降低，同时保持甘露醇浓度恒定。制剂在-15℃至-25℃下退火持续长达5小时以促进结晶。仅当精氨酸浓度降低至9.5mM并且退火温度为-22℃或更高时才观察到甘露醇的结晶。甘露醇的结晶在-22℃下在退火开始时开始(图15)。

当所述浓度增加至4％并且精氨酸浓度从95mM降低至47.5mM时，在-25℃下退火30分钟之后甘露醇开始结晶(图16)。调查较低退火温度，因为当退火发生于较高温度下时观察到冻干的饼的外观改变。外观改变包括当在-15℃下进行退火时发生的饼收缩。

当精氨酸浓度大于47.5mM时，甘露醇(当所述制剂中使用2％浓度时)的结晶延迟或受到阻止。可包括于所述制剂中而不影响甘露醇结晶的最大精氨酸浓度为47.5mM。这一陈述使用冻干实验得到确认，所述冻干实验使用具有2％甘露醇和47.5mM、71mM或85.5mM精氨酸的安慰剂制剂进行。用47.5mM精氨酸制备的样品是药学上可接受的，但用更多精氨酸制备的样品展现崩塌。增加甘露醇浓度可增加结晶的可能性。当精氨酸浓度大于47.5mM时，当甘露醇浓度增加至4％和5％时需要冷冻溶液的退火以促进结晶。

甘露醇在含有5％甘露醇和47.5mM精氨酸的制剂中容易地结晶。含有10mM tris、47.5mM精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％PS80的制剂在1℃/min下缓慢地冷却至-40℃(图17)。当所述制剂在1℃/min下冷却时，在冷却步骤期间观察到甘露醇的结晶放热。

所述制剂的样品快速地冷却(比10℃/min更快冷却)至-40℃并且接着在-25℃下退火(图18)。当所述溶液在-25℃下退火时，23分钟后甘露醇结晶。所述实验证明了甘露醇将容易地在所述制剂中结晶，只要精氨酸浓度低于47.5mM。

热分析数据支持如果精氨酸浓度为47.5mM或更低，那么在4％或更大浓度下的甘露醇将容易地在冻干工艺期间在合理时间范围内结晶。

2.冻干

与热分析实验并行地进行冻干研究。用10mM tris、9.5mM至23.75mM精氨酸、2％蔗糖和2％至4％甘露醇、或具有47.5mM精氨酸并且具有或不具有4％蔗糖的10mM tris制备安慰剂溶液。还包括含有10mM tris、47.5mM精氨酸、2％蔗糖和5％甘露醇的制剂。所述溶液使用每个小瓶3mL溶液填充至20mL小瓶中。使用保守、非常规冻干循环来确定是否可能产生可接受的饼。所述样品在1℃/min下冷却至-20℃，退火持续3小时，在1℃/min下冷却至-40℃，并且保持2小时。在100毫托下起始真空并且搁板温度在0.5℃/min下匀变至-30℃。样品保持在-30℃下直至皮拉尼压力计值匹配电容压力计(CM)值并且接着在0.5℃/min下推进至25℃下的二次干燥。当皮拉尼压力计值匹配CM值时，二次干燥完成。初始干燥在大约30小时后完成并且二次干燥仅需要几个小时。

用单独tris和精氨酸制备的样品展现完全崩塌并且包括4％蔗糖的那些样品展现饼收缩。

所有含有47.5mM精氨酸或更少精氨酸和2％至5％甘露醇的制剂均呈可接受的饼出现。

包括用以测试使用10mL填充体积时在冷却匀变期间退火的效应的研究。所述研究使用由10mM tris、2％蔗糖和23.75mM和47.5mM精氨酸、和2％至5％甘露醇制备的样品。所述溶液在1℃/min下冷却至-25℃，保持3小时，在100毫托下起始真空，并且搁板温度在0.5℃/min下增加至-20℃。所述样品在-20℃下干燥并且搁板加温至25℃供二次干燥用。所有样品均看来是可接受的，无崩塌迹象。

使用相同制剂来检查冷却速度对冻干的饼的外观的影响。样品的一个集合在1℃/min下冷却至-25℃并且退火持续3小时。样品的第二集合在5℃/min下冷却至-25℃并且退火持续3小时。所述样品的集合组合于单一干燥器中并且在-30℃下冻干供初始干燥用，随后在25℃下冻干供二次干燥用。

所有样品均看来是可接受的，无崩塌迹象。数据支持在1℃/min与5℃/min之间的冷却速率不影响所述样品的外观。

由客户进行的溶解度研究支持如果精氨酸浓度在7.5至8.2的pH范围内为36mM或更大，那么所述蛋白将保持可溶于溶液中。已决定使用含有45mM精氨酸的溶液，因为其将确保所述蛋白的完全溶解，同时还充分低于将防止甘露醇的结晶的浓度。选择甘露醇浓度为5％以确保其在所述循环期间容易地结晶。因此，最佳制剂候选物为10mM tris、10mg/mL或25mg/mL r-解毒剂、45mM精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和在pH 7.8下制备的0.01％PS80。

用安慰剂溶液完成的冻干研究证明了当精氨酸浓度为47.5mM或更低并且具有2％甘露醇或更多甘露醇时可能产生可接受的饼。所述溶液使用高达-20℃的搁板温度冻干，无崩塌迹象。样品在冷却步骤期间或在-40℃下的冷冻步骤之后在-20℃下退火持续3小时，对饼的外观无影响。保守和常规方法是首先在-40℃下冷冻样品，随后在初始干燥下进行退火步骤。选择这种方法用于所述冻干循环。初始干燥在-20℃下的退火步骤之后进行，随后在0.5℃/min下增加搁板温度至25℃供二次干燥用。后续冻干开发研究聚焦于适当二次干燥搁板温度和持续时间。

开发所述冻干制剂的目标包括(1)至少10mg/mL的蛋白浓度；(2)改进在2-8℃下的稳定性；(3)≤5min的复原时间；和(4)稳固冻干工艺。

执行数轮制剂筛选以评估个别变量对蛋白稳定性(呈冻干的饼形式和呈溶液形式)和5℃下的溶解度的影响。在制剂筛选期间使用保守冻干循环。平行地执行冻干工艺开发。

所述测试证明了就蛋白浓度来说，在室温下2天后，高浓度(例如25mg/mL)溶液不如较低浓度溶液(例如10mg/mL)稳定(即，通过SEC获得的总聚集物和通过RP-HPLC获得的β峰％的较大增加)。针对r-解毒剂稳定性(冻干产物和呈溶液形式)的最佳pH经过确认为pH7.80±0.3。

在其它稳定组分(即，蔗糖和精氨酸)存在下在tris与磷酸盐缓冲液之间未观察到稳定性的显著差异。

就稳定剂类型和浓度来说，2％和4％w/w蔗糖均提供良好稳定效应。需要≥36mM的精氨酸浓度以维持所述r-解毒剂在5℃、pH 7.80±0.3下≥50mg/mL的溶解度。

在≥4％w/w的浓度下的结晶组分(膨胀剂)甘露醇(在10mM tris、2％w/w蔗糖、45mM精氨酸存在下)是重要的以避免初始干燥期间的饼崩塌。此外，少量聚山梨醇酯80的存在是至关重要的以确保在剪切条件(在室温下的振荡)下r-解毒剂在溶液中的稳定性。

下文所示的组合物示例了用于冻干的合适溶液。

表8.3用于注射50mg/小瓶的r-解毒剂的组合物²

¹在冻干期间去除。

²待用4.70mL无菌注射用水(SWFI)复原。

所述冻干制剂改进r-解毒剂药物产物的稳定性并且可存储于2-8℃下。下表比较了冷冻的液体药物产物和复原的冻干的药物产物的组合物。提供100mg/小瓶和400mg/小瓶的冻干的药物产物的组合物和示例性复原组合物的实例。

表8.4r-解毒剂冷冻液体药物产物的制剂，用于注射，3mg/mL

成分	每个小瓶的量	量(mg/mL)
			r-解毒剂	30mg	3mg/mL
Tris	12.1mg	1.21mg/mL(10mM)
			L-精氨酸盐酸盐	200mg	20.0mg/mL(95mM)
蔗糖	400mg	40.0mg/mL(4％w/w)
			聚山梨醇酯80	1.0mg	0.1mg/mL(0.01％w/w)
注射用水	适量至10g
			盐酸溶液，1N	适量至pH＝7.8
氢氧化钠溶液，1N	适量至pH＝7.8
			pH	7.8±0.3	7.8±0.3

表8.5r-解毒剂冻干的药物产物的制剂，用于注射，50mg/小瓶

表8.6r-解毒剂冻干的药物产物的制剂，用于注射，100mg/小瓶

表8.7r-解毒剂冻干的药物产物的制剂，用于注射，400mg/小瓶

对两种不同制剂执行冷冻干燥显微术。大约0.15mL溶液分配至玻璃槽中，所述玻璃槽放置于温度控制冷冻干燥镜台上。热电偶放置于所述槽的底部和中心上以监测样品温度。液体以0.5℃/min的速率冷却至-50℃，在-20℃下退火持续1小时，并且再冷冻至-50℃。对所述室抽真空并且以0.5℃/min的速率加热。基于这一崩塌温度，造成低于所述崩塌温度的产物温度的冷冻干燥温度和压力的组合将产生无崩塌的饼。例如，在100毫托下高达20℃的产物温度可能用于产生无崩塌的饼。

在用SWFI复原用于注射的r-解毒剂之后，50mg/小瓶为pH 7.8，具有约480mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。因此，复原DP是静脉内施用可接受的。

r-解毒剂BDS在10mM Tris(pH 7.8±0.3)、4％蔗糖、95mM精氨酸中以3.0mg/mL配制并且在-60℃或更冷温度下冷冻存储。用于注射的r-解毒剂的制造由3mg/mL r-解毒剂BDS的解冻和汇集、针对制剂缓冲液(10mM tris、2％蔗糖、5％甘露醇、45mL精氨酸HCl，pH7.8)超滤/透滤至10mg/mL的最终浓度、加入聚山梨醇酯80至0.01％w/w、无菌填充、冻干、塞塞子、盖帽和在用于注射的r-解毒剂容器盖系统中贴标签组成。

用于注射的r-解毒剂制造工艺利用了针对其它无菌液体药物产物的生产开发的程序。用于产生用于注射的r-解毒剂的灭菌方法为0.2μm过滤。所述r-解毒剂为热不稳定的；因此，0.2μm过滤是制造用于注射的无菌r-解毒剂的最适当方式。

所述冻干工艺是使用合理方法基于对冻干循环的不同阶段中制剂组分的物理性质的理解开发的。使用包括差示扫描量热法(DSC)和冷冻干燥显微术(FDM)的热表征方法来测量Tg’(冷冻浓缩物的玻璃转变温度)和Tc(初始干燥期间的崩塌温度)。选择下表中示出的循环用于原型批次J7128的冻干。所述退火步骤允许甘露醇的结晶以确保产物温度不会在初始干燥期间降至崩塌温度之下。选择初始干燥温度以在初始干燥的合理持续时间内避免饼崩塌。开发2步二次干燥条件以产生具有<1％的水分含量的冻干DP(参见例如表6)。

序列表

<110> 博尔托拉制药公司

<120> XA因子解毒剂的冻干制剂

<130> 37JE-195856-WO

<140> PCT/US2015/046173

<141> 2015-08-20

<150> 62/039,809

<151> 2014-08-20

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> 人类

<400> 1

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu

20 25 30

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp

35 40 45

Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly

50 55 60

Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn

65 70 75 80

Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys

85 90 95

Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly

115 120 125

Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val

130 135 140

Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp

145 150 155 160

Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp

165 170 175

Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu

180 185 190

Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp

195 200 205

Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr

210 215 220

Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln

225 230 235 240

Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu

245 250 255

Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn

260 265 270

Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu

275 280 285

Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro

290 295 300

Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile

305 310 315 320

Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg

325 330 335

Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu

340 345 350

Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp

355 360 365

Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

370 375 380

Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly

385 390 395 400

Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr

405 410 415

Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro

420 425 430

Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 2

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr

85 90 95

Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ile

100 105 110

Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu

115 120 125

Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser

130 135 140

Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg

145 150 155 160

Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly

165 170 175

Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr

180 185 190

Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro

195 200 205

Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp

210 215 220

Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly

225 230 235 240

Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met

245 250 255

Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser

260 265 270

Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln

275 280 285

Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe

290 295 300

Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys

305 310 315 320

Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu

325 330 335

Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys

340 345 350

Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

355 360 365

<210> 3

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 3

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr

85 90 95

Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys

100 105 110

Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn

115 120 125

Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr

130 135 140

Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val

165 170 175

Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe

180 185 190

Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn

195 200 205

Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu

210 215 220

Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu

225 230 235 240

Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val

245 250 255

Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn

260 265 270

Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly

275 280 285

Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val

290 295 300

Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr

305 310 315 320

Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser

325 330 335

Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val

340 345 350

Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

355

<210> 4

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 4

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr

85 90 95

Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg

100 105

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 5

Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu

20 25 30

Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys

35 40 45

Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly

50 55 60

Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe

65 70 75 80

Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr

85 90 95

Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg

100 105 110

Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser

115 120 125

Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys

130 135 140

Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys

165 170 175

Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg

180 185 190

Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly

195 200 205

Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe

210 215 220

Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala

225 230 235 240

Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

245 250

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成多肽

<400> 6

Arg Lys Arg Arg Lys Arg

1 5

Claims

1.一种水性制剂，其包含40 mM至50 mM精氨酸、1%至3%蔗糖(w/v)、2%至8%甘露醇(w/v)和5至50 mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO. 4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO. 5的第二链和在SEQ ID NO. 4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO. 5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为7.7至7.9。

2.如权利要求1所述的制剂，其包含40 mM至50 mM精氨酸、1.5%至2.5%蔗糖(w/v)、4.5%至5.5%甘露醇(w/v)和至少10 mg/mL的所述多肽。

3.如权利要求2所述的制剂，其包含至少18 mg/mL的所述多肽。

4.如权利要求2所述的制剂，其中所述多肽包含经过修饰以不同于天然氨基酸的氨基酸残基。

5.如权利要求4所述的制剂，其中所述第一链的残基Asp29在Asp29处修饰为(3R)-3-羟基Asp。

6.如权利要求1所述的制剂，其中所述多肽至少包括针对所述第一链和第二链中每一者的链内二硫键。

7.如权利要求1所述的制剂，其中所述两链多肽如与野生型fXa蛋白相比具有Gla结构域的修饰和活性位点，能够结合于fXa抑制剂，但不会组装成凝血酶原酶复合物。

8.一种水性制剂，其包含45 mM精氨酸、2%蔗糖(w/v)、5%甘露醇(w/v)和10 mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO. 4的第一链、具有氨基酸序列SEQID NO. 5的第二链和在SEQ ID NO. 4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ IDNO. 5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为7.8。

9.一种水性制剂，其包含45 mM精氨酸、2%蔗糖(w/v)、5%甘露醇(w/v)和20 mg/mL的两链多肽，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO. 4的第一链、具有氨基酸序列SEQID NO. 5的第二链和在SEQ ID NO. 4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ IDNO. 5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键，其中所述制剂的pH为7.8。

10.一种制备冻干制剂的方法，其包括冻干如权利要求1至9中任一项所述的水性制剂。

11.一种可通过冻干如权利要求1至9中任一项所述的水性制剂获得的冻干组合物。

12.一种冻干组合物，其包含至少10% (w/w)的两链多肽和重量比率的范围为(0.5-1.4):(1-3):(2-8)的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQID NO. 4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO. 5的第二链和在SEQ ID NO. 4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO. 5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键。

13.如权利要求12所述的冻干组合物，其包含至少18% (w/w)的所述两链多肽。

14.如权利要求12所述的冻干组合物，其中所述L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)范围内。

15.一种冻干组合物，其包含至少10% (w/w)的两链多肽和重量比率为0.95:2:5的L-精氨酸HCl:蔗糖:甘露醇，所述两链多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO. 4的第一链、具有氨基酸序列SEQ ID NO. 5的第二链和在SEQ ID NO. 4的位置98处的第一半胱氨酸残基(Cys98)与在SEQ ID NO. 5的位置108处的第二半胱氨酸残基(Cys108)之间的二硫键。

16.通过将如权利要求12至15中任一项所述的冻干组合物溶解于水性溶剂中制备的溶液在制备用于减少经历使用Xa因子抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者的出血的药物中的应用。

17.如权利要求16所述的应用，其中所述Xa因子抑制剂为阿哌沙班、利伐沙班或贝曲西班。