CN110760479A - 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用 - Google Patents

靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110760479A
CN110760479A CN201910412864.7A CN201910412864A CN110760479A CN 110760479 A CN110760479 A CN 110760479A CN 201910412864 A CN201910412864 A CN 201910412864A CN 110760479 A CN110760479 A CN 110760479A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fxa
cell
platelets
platelet
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910412864.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈赛娟
章国卫
陈竺
王大威
邵小虎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Shangyao Ruier Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd filed Critical Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority to CN201910412864.7A priority Critical patent/CN110760479A/zh
Publication of CN110760479A publication Critical patent/CN110760479A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用。具体地，本发明提供了一种造血干细胞，其含有外源的FXa基因表达框，并且该表达框中包含血小板特异性转录启动子。该细胞可以分化成血小板并在血小板中特异性表达及储存FXa，从而治疗血友病。本发明还提供了包含该细胞的制剂及其用途。

Description

靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用。
背景技术
HA和HB是一类严重危及男性的X连锁隐性遗传出血性疾病，其是因为血液中的凝血因子VIII(FVIII)或IX(FIX)分别缺乏或功丧失所致。人群中HA的发病率为1/5000，HB的发病率为1/30000，据报道只有25％的血友病患者得到了有效的治疗及基于重组凝血因子的预防治疗。目前常用的替代治疗方案午饭治愈该疾病，虽然血友病患者可以通过尽早的预防治疗而防止出血，但这些获益均需频繁的接受凝血因子的输注，由此带来的高昂的经济负担让绝大多数的患者，尤其是广大的发展中国家患者难以承受。此外，高达30％的HA患者及5％的HB患者会因替代治疗而产生针对FVIII或FIX的抑制物，这将导致加倍的重组凝血因子使用剂量来维持以前的治疗效果。若产生了高滴度的抑制物，那么替代治疗将会失效。
目前高滴度抑制物的患者主要通过旁路制剂及免疫耐受诱导治疗，现今能够用到的旁路制剂通常是重组的活化凝血因子VII(FVIIa)及活化凝血酶原复合物，但只对约80％的此类患者有效，免疫诱导耐受方案仅对70％的HA及30％的HB患者有效。因此，仍然有一大批该类患者不能够得到有效的治疗。此外，通过旁路制剂治疗的患者其疗效并没有凝血因子输注的效果好，相应的治疗费用及产生的副反应仍然是临床上比较棘手的问题。
凝血因子X(FX)在内源性凝血途径和外源性凝血途径中都起着关键作用。FX先经由FIXa/FVIIIa或FVIIa/组织因子(TF)复合物激活成为有活性的FX(FXa)，FXa再激活凝血酶原为凝血酶以达到止血效果。理论上，FX作为FVIII和FIX下游的凝血因子，可以在FVIII或FIX缺失的情况下启动凝血，可作为旁路治疗血友病的理想靶标。在过去的几十年中，FXa作为血友病的旁路治疗制剂已有许多研究。虽然FXa直接输注血友病患者可以起到止血作用，但其半衰期非常短，且血浆中过高浓度的FXa有导致弥漫性血管内凝血的风险。这些缺陷阻碍了FXa在血友病旁路治疗中的应用。最近，Ivanciu等人开发了一种新的酶原样FXa，其在血浆中并无活性，需与FVa结合才会活化。这种新型酶原样的FXa能够在血友病小鼠模型中矫正出血表型，并且不会导致过度凝血。这项研究表明，如果FXa的缺陷能得以克服，它将有希望成为血友病旁路治疗的理想药物。然而酶原样FXa的半衰期仍然较短，因此它仍不足以用于血友病患者的预防性治疗。
虽然血友病的治疗与管理在过去的十几年取得了巨大的进步，特别是近些年来的血友病基因治疗取得了较大的进展，但是对于产生抑制物的血友病患者的治疗以及基因治疗的疗效持久性仍然是临床及经济上的潜在挑战。基于此，新型的有效治疗方法及药物制剂有待开发。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种细胞，所述的细胞含有外源的用于表达FXa因子的FXa表达盒，并且所述的表达盒包含巨核细胞和/或血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，其中所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接。
在另一优选例中，所述FXa因子的编码序列在巨核细胞和/或血小板中特异性表达。
在另一优选例中，所述的FXa因子储存在血小板中。
在另一优选例中，所述的FXa因子是活化后的FX因子。
在另一优选例中，所述的所述的活化是指蛋白水平上的对FX因子进行剪切(翻译后水平修饰)。
在另一优选例中，所述的细胞包括造血干细胞(造血祖细胞)和/或多能干细胞。
在另一优选例中，所述的造血干细胞可以分化成巨核细胞和/或血小板。
在另一优选例中，所述的造血干细胞在分化成巨核细胞后，FXa因子的编码序列在巨核细胞中转录表达。
在另一优选例中，所述的多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。
在另一优选例中，所述的多能干细胞可以诱导分化成造血干细胞。
在另一优选例中，所述的多能干细胞可以直接诱导分化成巨核细胞和/或血小板。
在另一优选例中，所述的巨核细胞生成血小板后，FXa因子储存在血小板中。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：GPαIIb启动子，GPIbα启动子和GPVI启动子。
在另一优选例中，所述的表达盒部分或全部整合在基因组上。
在另一优选例中，所述的表达盒部分或全部位于表达载体上。
在另一优选例中，所述的载体为质粒或病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的慢病毒载体包括2bFXa慢病毒。
在另一优选例中，所述的表达盒通过基因编辑的方式整合在造血干细胞或多能干细胞的基因组上。
在另一优选例中，所述的FXa因子的编码序列包括野生型FX基因和/或突变型FX基因。
在另一优选例中，所述的突变型FX基因中不包含转录表达激活肽(AP)的DNA片段。
在另一优选例中，所述的突变型FX基因中，用PACE/弗林酶切位点对应的编码序列替换激活肽编码序列。
在另一优选例中，所述的突变型FX基因转录表达的FXa因子中，重链与轻链之间仅通过两个PACE/弗林酶切位点连接。
在本发明的第二方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包含本发明第一方面所述的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞制剂用于治疗血友病。
在另一优选例中，所述的细胞包括自体细胞和异体细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种核酸构建物，所述的核酸构建物包含表达FXa因子的FXa表达盒，并且所述的表达盒包含巨核细胞和/或血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，其中所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接。
在另一优选例中，所述的核酸构建物中的FXa因子的编码序列可以在巨核细胞和/或血小板中特异性表达，并且所述的FXa因子储存在血小板中。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第三方面所述的构建物。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体特异性感染造血干细胞或多能干细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含：(a)本发明第一方面所述的细胞、本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第四方面所述的表达载体，和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物包含生物学上可整合本发明第三方面所述的核酸构建物的载体。
在本发明的第六方面，提供了一种本发明第一方面所述的细胞、本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第四方面所述的表达载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于治疗血友病。
在另一优选例中，所述的血友病包括血友病A(HA)、血友病B(HB)。
在另一优选例中，所述的血友病包括产生抑制物的血友病。
在本发明的第七方面，提供了一种体外的制备基因工程化细胞的方法，包括步骤：
(a)提供一造血干细胞或多能干细胞，并将一外源的用于表达FXa因子的FXa表达盒导入所述造血干细胞或多能干细胞，从而获得基因工程化的造血干细胞或多能干细胞；
其中所述的表达盒包含血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，并且所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接；
(b)任选地，将所述的基因工程化的造血干细胞或多能干细胞与药学上可接受的载体进行混合，从而制得含所述表达盒的基因工程化的造血干细胞或多能干细胞的细胞制剂。
在另一优选例中，所述的造血干细胞包括自体的或异体的造血干细胞。
在另一优选例中，所述的造血干细胞包括骨髓采集分离的造血干细胞(BMSC)和外周血动员后采集分离的造血干细胞(PBSC)。
在另一优选例中，所述的多能干细胞通过体细胞重编程获得。
在另一优选例中，所述的基因工程化细胞是人细胞。
在本发明的第八方面，提供了一种体外的制备基因工程化细胞的方法，包括步骤：
(a)提供一造血干细胞或多能干细胞，并将一外源的用于表达FXa因子的FXa表达盒导入所述造血干细胞或多能干细胞，从而获得基因工程化的造血干细胞或多能干细胞；
其中所述的表达盒包含血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，并且所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接；
(b)对所述基因工程化的造血干细胞或多能干细胞进行培养和分化，从而获得经分化的基因工程化的巨核细胞和/或血小板；
(c)任选地，将所述的基因工程化的巨核细胞和/或血小板与药学上可接受的载体进行混合，从而制得含所述的基因工程化的巨核细胞和/或血小板的细胞制剂。
在另一优选例中，所述的基因工程化细胞是人细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了FXa的构建及体内外活性评估及抗原检测分析。其中，图1A显示了FX及FXa表达框的结构图。激活肽(AP)与轻链之间通过弗林酶切位点序列(RKR)连接，FXa的AP被RKR替换，SP为信号肽。图1B显示了通过293T细胞转染PCI-FX及PCI-FXa质粒后收集细胞裂解液测定hFXa的抗原及活性水平。图1C显示了通过Dami细胞转染PCI-2bFX及PCI-2bFXa质粒后收集细胞裂解液测定hFXa的抗原及活性水平，分析αIIb启动子的特异性表达。图1D显示了PCI-FX及PCI-FXa质粒在体高压注射HA小鼠后，通过hFX特异性的ELISA检测小鼠血浆中FX抗原含量。图1E显示了高压注射HA小鼠后，通过FXa的发色底物法测定其血浆中FXa活性。(高压注射小鼠的数量如图所示)
图2显示了2bFXa在HA受体小鼠中的疗效评估及安全性分析。其中，图2A显示了HA移植小鼠外周血血小板中FXa的活性监测。从移植后4周的整个监测周期内测定其血小板裂解液中FXa的活性。图2B显示了检测移植小鼠4周、16周的血浆及血小板中的hFX抗原含量，其中移植小鼠血浆中并无hFX的表达。图2C显示了HA移植小鼠外周血血小板hFXa释放实验结果。分离小鼠血小板并激活，通过测定其释放上清中hFXa的活性模拟体内血小板激活释放FXa参与止血。图2D显示了通过血栓弹力图测定HA移植小鼠全血凝血时间，野生型小鼠及HA小鼠用作对照。图2E显示了通过测定HA移植小鼠的剪尾出血量反映靶向血小板表达2bFXa的止血功能。图2F显示了HA移植小鼠稳态情况下血浆中D-Dimer的表达水平。图2G及图2H分别显示了HA移植小鼠在稳态及LPS诱导的炎症模型中外周血中凝血酶抗凝血酶复合物III(TAT)及纤维蛋白原的含量变化，野生型小鼠及HA小鼠作为对照。其中，在稳态情况下各组并无明显差异；在LPS诱导的炎症模型中，TAT的表达水平在野生型及移植鼠中分别升高了2.1及3.5倍，纤维蛋白原的表达水平则分别升高了2.3及1.6倍。图2I显示了通过免疫组化分析移植小鼠及野生型小鼠的肝脏纤维蛋白沉积情况。移植小鼠相关实验在移植8周后进行，实验用小鼠数量如图所示。(*P<.05，**P<0.01，***P<.001及****P<.0001。NS，无显著性差异)
图3显示了FXa在HA受体小鼠血小板中的定位分析。其中，图3A显示了HA移植小鼠及HA对照小鼠血小板的共聚焦显微镜分析。FXa及VWF分别染色表达绿色及红色荧光，两者在血小板中有共定位现象。标尺，100μm。图3B显示了通过免疫电镜分析2bFXa蛋白在HA移植小鼠血小板中的亚细胞定位。hFXa通过10nm的胶体金颗粒标记，内源性的VWF通过6nm的胶体金颗粒标记。结果展示了hFXa定位在HA移植小鼠的血小板α颗粒中。标尺，100μm。
图4显示了2bFXa在产生抑制物的HA受体小鼠模型中的表达及疗效评估。其中，图4A显示了对HA小鼠移植前后的FVIII抑制物滴度检测。移植前后的抑制物滴度分别在最后一次免疫一周后及移植四周后测定。图4B显示了产生FVIII抑制物的HA小鼠移植四周后血小板裂解液及激活释放液中的FXa活性。图4C显示了产生FVIII抑制物的HA移植小鼠经优化后剪尾实验的存活率分析，实验小鼠的数量如图中所示。
图5显示了2bFXa在HB受体小鼠模型中的表达及疗效分析。其中，图5A显示了在整个监测周期内对HB移植小鼠血小板中表达的FXa活性动态检测。图5B显示了HB移植小鼠血小板激活释放液中FXa的活性监测。图5C显示了移植后四周的HB受体小鼠外周血白细胞2bFXa的拷贝数分析。图5D显示了HB移植小鼠在移植后4周及16周分别测定其血浆与血小板裂解液中的hFX的抗原表达水平。实验小鼠数量如图所示。图5E显示了2bFXa移植后的HB小鼠经修改后的剪尾出血试验生存率分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用。具体地，本发明通过将FXa异位表达并储存在血小板中，当血小板在出血部位被激活后释放入血参与止血；同时可以避免FXa在血浆中的暴露，降低其清除机率而延长其作用时间，限制其过度活化凝血反应导致机体高凝状态及血栓形成风险。此外，FXa作为内源性及外源性凝血途径的共同通路，靶向血小板的FXa表达具有同时基因治疗血友病A与B的潜力。同时，该递送方式在产生凝血因子VIII及IX抑制物的个体中仍能发挥治疗作用，具有极其广泛的血友病治疗潜力及临床转化潜质。
具体地，本发明通过巨核细胞/血小板特异性的组织启动子GPαIIb构建了靶向血小板特异表达的FXa基因表达框(2bFXa)，利用慢病毒转导的策略将该基因表达框(2bFXa-LV)整合到血友病小鼠的造血干祖细胞(HSPCs)并移植到血友病模型小鼠。通过移植后的观察发现移植后的受体小鼠血小板能够长期稳定的表达并储存FXa，当血小板被激活后可以释放入血参与凝血反应，并且该血小板特异表达的FXa并未在其他谱系的造血终末细胞中表达。此外，血小板表达的FXa能够在血友病A(HA)及血友病B(HB)模型小鼠中成功地矫正其出血表型而起到治疗作用；同样的治疗效果在HA的抑制物小鼠模型也得到证实。通过对受体小鼠的血浆检测并未发现FXa的存在，表明生理情况下其在血小板中的表达并未发生渗漏，也没有发现受体小鼠产生血液高凝状态乃至血栓形成的风险，进一步证实了该基因治疗策略的安全性。
综上所述，本发明为HA、HB以及产生抑制物的血友病患者提供了一个新的安全且有效的基因治疗方式，具有极大的临床转化应用价值而造福于所有类型的血友病患者。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
血友病
血友病为一组X染色体伴性遗传的凝血功能障碍所致的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血，以全身大关节及肌肉的出血常见，极易因反复频繁出血导致关节畸形而致残。
血友病包括以下类型：
1.血友病A(血友病甲，HA)，即因子Ⅷ促凝成分(Ⅷ：C)缺乏症，也称AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。
2.血友病B(血友病乙，HB)，即因子Ⅸ缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数量较血友病A少。但本型中有出血症状的女性传递者比血友病A多见。
近些年来血友病的基因治疗研究方兴未艾，相关的临床试验似如火如荼之势迅猛开展，并且根据相关报道若干临床试验已经取得了不错的疗效，但总的来说仍有各种不足，具体情况如下。
1.目前大多数临床试验采用的是腺相关病毒(AAV)介导的靶向肝脏基因治疗血友病的策略，虽然目前取得了不错的疗效。但众所周知，AAV作为非整合型的病毒载体，其以附加体的形式存在在感染细胞内，随着靶细胞的不断有丝分裂，其在靶器官的表达水平会不断稀释，其疗效的持久性有待进一步的确认。
2.此外，近年来报道FVIII的分泌细胞并非肝脏实质细胞，而是肝窦内皮细胞为主的内皮细胞。现今AAV靶向肝脏的FVIII表达并非是生理性的FVIII分泌，其对肝脏细胞的影响及功能是否会有所改变仍未明确。
3.肝脏作为人体的最大代谢器官，其担负着重要的机体功能。而在一些肝功能损伤患者，或者因长期输注血源性血液制品而感染肝炎病毒等的血友病患者，以及处于慢性炎症状态及免疫系统抑制的患者均不能使用该策略治疗，限制了基因治疗血友病患者的普适性。
4.处于自然界的人体大多数受过AAV的感染，机体会存在AAV的抗体，使得基于AAV的基因治疗策略需要筛选合适血清型的AAV；并且衣壳蛋白进入机体后亦会诱导自身的固有免疫应答或适应性免疫反应，有可能机体自身免疫细胞攻击转导成功的肝细胞，从而使得能够分泌凝血因子的肝细胞死亡，进而使得其表达水平逐步丢失，有可能丧失疗效。
5.血友病患者可能产生针对衣壳蛋白的抗体，倘若该治疗方案不能够一次性彻底治愈该疾病，那么后续的再次基因治疗则不能继续选用以前的AAV，进而不断缩小了治疗载体的选择范围。并且高剂量的病毒剂量的使用量容易导致肝功能受损，需要额外的干预及治疗。
6.靶向肝脏直接介导的凝血因子治疗在应用过程还有可能引起不同的并发症。比如血友病患者机体缺乏相应的凝血因子，外源凝血因子的直接表达入血后虽能起到矫正出血表型的作用，但机体亦会因为外源蛋白而产生相应的抗体，形成抑制物后严重影响了其疗效。而且该治疗方案对已经产生抑制物的患者亦可能无效，这也极大的限制了AAV基因治疗的应用范围。
FXa的异位表达
FX是一种维生素K依赖的蛋白，通过共聚焦显微镜及免疫电镜分析移植后受体小鼠的血小板，发现FXa可以定位在血小板的α颗粒中。通过血小板的激活释放实验，同样发现FXa能够从激活的血小板中释放出来，通过分析得知其释放的比例约为85.7％。以上数据能够证实FXa可以稳定地表达并储存在血小板中。在本发明中，血小板中的FXa表达水平约为血浆中FX的6％至8.68％，根据临床资料判定其足够矫正血友病小鼠的出血表型。因为血小板储存的FXa会在发生血小板聚集的地方局部释放，所以精确地测定在损伤部位的FXa浓度显得比较困难，但在损伤局部的FXa浓度会比该蛋白在血浆中的浓度更大。
血浆中高水平的FXa具有血栓形成倾向，这是既往研究利用FXa治疗血友病动物模型均会面临的问题。先前报道利用靶向血小板的FIX表达治疗HB的研究中，在小鼠血浆中发现了少量的FIX渗漏。但在本发明中发现了一个令人惊喜的现象，使用FXa靶向血小板表达并未在受体小鼠的血浆中检测出FXa。导致这两种蛋白质差异的原因尚不清楚。然而，仅根据目前的数据，仍然不能完全排除有FXa从血小板泄漏到血浆的可能性。因为FXa在血浆中会被迅速清除，所以即便有少量FXa泄漏入血，也会因其被快速清除而无法检出。这也可以解释FX高压注射组的hFX抗原水平会高于FXa高压注射组。总之，本发明的结果表明靶向血小板的FXa会特异性储存在血小板，并不会出现因血浆FXa水平升高而导致血栓形成的风险。本发明的动物实验结果也支持这一结论。处于稳态条件下的移植小鼠均处于健康状态度，在整个研究期间血小板数量维持正常水平，血浆D-二聚体、凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)及纤维蛋白原水平均与未经处理的小鼠无明显差异。此外，在LPS诱导的炎症小鼠模型中，野生型小鼠与对应的移植后受体小鼠在血浆D-二聚体、TAT和纤维蛋白原水平以及纤维蛋白沉积等指标亦没有显著差别。以上数据表明这种新的基因治疗策略不仅可以起到止血效果，即便在血栓形成前状态下也不会有额外的血栓形成或DIC风险。
在以往FVIII靶向血小板表达的研究中，证实其在已产生抑制物的HA小鼠体内仍能发挥有效的止血功能，但进一步提高FVIII的表达水平以期提高疗效仍相当困难。另一方面，同样的策略却不能用于治疗产生FIX抑制物的HB小鼠。Ohmori等人采用相同的策略在血小板中表达FVIIa，其研究证实血小板释放的FVIIa在FVIII抑制物存在的情况下，仍能够启动凝血纠正HA小鼠的出血表型。后续临床实践证明FVIIa是一种安全有效的旁路药物。该研究说明血小板储存的旁路凝血因子在血小板活化后同样可以有效地启动凝血反应而纠正出血症状。但在FVIIa靶向血小板表达的研究中，血小板储存的FVIIa治疗效果仍然较低。本发明则进一步支持靶向血小板表达的旁路制剂作为一种有效的血友病基因治疗方法。FXa已被尝试作为一种旁路制剂来治疗血友病，但将FXa直接输注入血并不能有效的治疗血友病。最近，Camire实验室开发了一种酶原样FXa，它可以保持FX一样的非激活状态，但若一旦与FVa结合其即可被激活，这种新型酶原样FXa比FVIIa在HA和HB小鼠中展现出更好的治疗效果。这些研究表明FXa可能作为一种更好的血友病旁路治疗药物。然而，酶原样FXa需要进一步的改进才能用于血友病的预防性治疗。本发明亦是聚焦于FXa在基因治疗中的应用。通过血小板的异位表达，FXa可以储存在血小板中。当血小板在损伤部位被激活时，血小板储存的FXa就可得到释放并启动凝血反应，进而纠正HA和HB小鼠的出血症状。该策略在产生抑制物的HA小鼠中是也有明显的疗效，因此它也有望被用于治疗产生抑制物的血友病患者。在凝血酶原活化过程中，FXa和FVa形成凝血酶原酶复合物。FV本身存储在血小板的α颗粒中，故而存储在血小板中的FXa可能会促进其与FVa的结合，这也很有可能是靶向血小板表达的FXa启动止血的一个有利因素。在后续的研究中，非常有必要进一步探讨血小板表达的FXa是否比先前报道的血小板表达的FVIII、FIX和FVIIa具有更好的治疗效果。同时，比较不同靶向血小板表达的凝血因子的差异也可以为认识靶向血小板基因治疗的安全性提供帮助。
在血友病的治疗甚至是基因治疗过程中，产生针对该蛋白的抑制物仍然是目前治疗中不可回避的关键问题。FX作为血友病患者机体本身存在的内源性蛋白，在用其作为治疗蛋白的过程中并不会触发针对FXa的免疫应答，从而避免产生相应的自身抗体影响疗效。包装在血小板中的FXa更进一步减少了自身抗体形成的几率。因此，这是使用靶向血小板的FXa基因治疗血友病的另一大优势所在。
总之，本发明证实靶向血小板的FXa表达能够在血小板中形成FXa的储存池，并且在血浆中没有FXa的存在。血小板中储存的FXa能够在血小板激活后释放，并且功能性的FXa能够矫正血友病小鼠的出血症状，对产生抑制物的HA小鼠模型仍然有效。本发明证实靶向血小板表达的FXa可以作为一个新型基因治疗策略用以治疗产生抑制物的血友病患者。
本发明的治疗方案
本发明将修饰过的FXa异位表达于血小板，当血小板在出血部位被激活后释放入血参与止血；同时可以避免FXa在血浆中的暴露，降低其清除机率而延长其作用时间，限制其过度活化凝血反应导致血栓形成的风险，故而有用于血友病基因治疗的潜力。本发明的治疗方案可用于HA及HB患者，也可用于治疗产生抑制物的病人，加之FXa的表达不会诱发产生针对FX的抗体，具备长期的治疗效果。因此该策略具有极大的临床转化潜质，为各类型的血友病患者提供理想的治疗途径。
此外，机体正常的止血过程分为一期止血及二期止血反应，一期止血主要是由血小板在血管受损部位的激活而介导；二期止血反应则是多种凝血因子共同参与的凝血反应，分为内源性及外源性凝血反应。FX是内源性及外源性凝血反应的共同通路，FXa作为凝血反应的必要及关键节点，通过将其靶向表达于血小板中，其在机体止血过程中可与血小板发挥协同效应，从而起到1+1>2的作用。
血小板的生存期较短，在机体大约为7-14天。基于疗效持久性的考虑，故不能直接转导血小板表达FXa用于血友病的基因治疗。造血干细胞(HSC)来源于中胚层的血管干细胞，其存在于成人的骨髓、外周血及脐带血中，具有高度的自我更新的功能，并可以分化为所有的终末分化造血谱系细胞，包括髓系、淋巴系细胞、红细胞及巨核细胞等。因此，本发明将其作为血液系统遗传性疾病基因治疗的理想细胞载体，经2bFXa慢病毒感染的HSC可以分化为巨核细胞、血小板，而在αIIb启动子的驱动下，FXa特性表达并储存在分化的血小板中，并可用于后续的基因治疗研究。理论上其具有持久性的表达能力，发挥“一次给药、终身治愈”的功效，具有极大的转化应用价值。
本发明的载体
本发明也涉及包含表达FXa因子的FXa表达盒的载体，以及利用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。
术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。对于载体而言，通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。优选的，本发明载体为慢病毒载体。
可以利用本领域技术人员熟知的方法构建本发明的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到本发明载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。本发明载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，本发明载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞、动物细胞等。优选的，本发明的宿主细胞为人或非人哺乳动物细胞，较佳地为造血干细胞(造血祖细胞)和多能干细胞。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
药物组合物和施用方法
本发明还提供了一种含有本发明第一方面所述细胞或本发明第三方面所述核酸构建物或本发明第四方面所述表达载体的药物组合物，用于治疗血友病。
在本发明中，本发明的造血干细胞(含有用于表达FXa因子的FXa表达盒)可直接用于疾病治疗，本发明的核酸构建物和/或表达载体可以用于感染造血干细胞，从而表达制备含有表达FXa因子的FXa表达盒的造血干细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的造血干细胞或表达载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本发明造血干细胞还可与其他治疗剂一起使用。
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。
使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明将修饰过的FXa异位表达于血小板，当血小板在出血部位被激活后释放入血参与止血。
(b)本发明可以避免FXa在血浆中的暴露，降低其清除机率而延长其作用时间，
(c)本发明可以避免FXa过度活化凝血反应导致血栓形成的风险
(d)本发明可用于HA及HB患者，也可用于治疗产生抑制物的病人。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料与方法：
1.载体构建及慢病毒包装
全长人FX(hFX)cDNA扩增自人胎肝，通过5’端的XhoI酶切位点及3’端的SalI酶切位点酶切后连接到PCI-neo载体构建PCI-FX。FXa的构建通过使用PACE/furin酶切序列Arg-Lys-Arg(RKR)替代激活肽片段(AP)(图1-A)构建出PCI-FXa。而后通过利用XhoI和NotI酶切位点分别切割PCI-FXa及PCI-FX获得FXa及FX片段，克隆进PCI-2bF9载体，分别获得PCI-2bFX及PCI-2bFXa质粒。此外，通过I-PpoI和SalI酶切位点切割PCI-2bFXa载体获得2bFXa表达框，并克隆进PWPT-2bF9慢病毒载体获得PWPT-2bFXa载体。所有构建的载体均通过测序验证。
2bFXa慢病毒生产通过磷酸钙瞬时转染293T细胞获得。慢病毒通过PWPT-2bFXa、PCMV R8.91及VSV-G三质粒系统包装，包装用细胞在滚瓶系统中培养，分别在转染后的24小时及48小时收集转染上清高速离心获取2bFXa-LV慢病毒，并用X-vivo 15培养基重悬分装保存于-80℃。取少量病毒抽提RNA通过qRT-PCR测定滴度。
2.小鼠模型
血友病A小鼠遗传背景为S129，系在上海南方模式动物中心购置；血友病B小鼠遗传背景为C57BL/6，来源于Jackson实验室；野生型C57BL/6及S129小鼠通过上海斯莱克实验动物有限责任公司购买，均饲养在上海交通大学医学院瑞金医院实验动物中心SPF级屏障环境。所用小鼠的使用经过上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会的批准，并严格按照相关规程进行。
3.FXa的体外表达
抽提高纯度和浓度的质粒，用Lipo2000转染293T或者巨核细胞系Dami细胞，转染6h后换Opti-MEM培养基，培养基中加入终浓度为4μg/ml的维生素K3(Sigma)。转染48h后收集上清和细胞，细胞用0.5％CHAPS裂解，冰上30min，离心取上清为细胞裂解液。
4.FXa活性及hFX抗原检测
FX:C测定采用Biophen FX试剂盒。先分别稀释样本及标准品，取酶标板分别加入上述标准和样品25μl，再向各孔加入25μl R1并混匀，37℃2min；向各孔加25μl R2混匀，37℃2min；加入25μl的2％柠檬酸钠溶液中止反应；酶标仪读取405nm读数，做标准曲线；分析数据。FXa:C的测定使用FX:C的测定方法，只是不加R2试剂RVV。
hFX抗原的检测采用双抗体夹心ELISA。用0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释Goatanti-FX pAb(Haematologic Technologies)至1μg/mL，4℃包被过夜；移去包被液，用洗涤缓冲液洗3次，每次5min；5％BSA室温2h；洗涤后加检测标本，室温孵育2h；继续洗涤后加检测抗体：用稀释缓冲液稀释Goat anti-human FX IgG-HRP(Haematologic Technologies)，每孔加0.1ml，室温孵育2h；洗涤后加可溶性TMB，37℃培养箱孵育20min；加2M硫酸0.1mL后酶标仪测定450nm吸光值。根据标准曲线计算相应样品中FX含量；
5.凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)、纤维蛋白原及D二聚体检测
采集小鼠眼眶内眦静脉血并制备乏血小板血浆用来检测TAT、纤维蛋白原及D-二聚体含量。其中TAT(Abcam,USA)及纤维蛋白原(Assaypro,USA)的检测均是使用商业化的ELISA试剂盒按指导说明操作。D二聚体同样也是使用双抗体夹心ELISA测定，按照Biomatik公司(加拿大)的试剂盒操作说明执行。6.纤维蛋白沉积试验
移植小鼠通过脚底皮内注射5μg的脂多糖(LPS,Sigma)免疫，24小时后继续静脉注射300μg的LPS。二次免疫后6小时采集小鼠的外周血，而后麻醉小鼠通过左心室灌注20毫升PBS缓冲液，分离其肝脏、肾脏、肺及心脏等器官固定在10％福尔马林溶液中，经石蜡包埋切片后，依次进行脱水、抗原修复、过氧化物酶阻断及非特异性蛋白封闭等步骤，在湿盒中用兔抗小鼠纤维蛋白原的抗体(Abcam)孵育过夜，羊抗兔过氧化物酶二抗继续孵育30分钟，形成的抗原抗体复合物通过DAB显色试剂盒检测。
7.共聚焦及免疫电镜分析
分离新鲜的小鼠血小板甩片后按照常规的免疫荧光操作流程进行染色。羊抗人FX多抗及兔抗人血管性血友病因子(VWF)作为共聚焦荧光检测的一抗，Alexa Fluor 488-驴抗羊抗体及Alexa Fluor 594-驴抗兔抗体(Invitrogen)作为二抗。制备的切片用TCS SP8共聚焦显微镜(Leica)观察FXa的定位。电镜用血小板制备则是通过将分离的血小板团块固定在4％多聚甲醛及0.2％戊二醛的固定液中，LRwhite树脂包被后在铜网格上切成90nm的超薄切片。切片同样行后续的山羊抗人FX多抗(Affinity Biologicals)及绵羊抗人VWF(Abcam)等一抗孵育流程，而后分别标记兔抗山羊(10nm,Sigma)及驴抗绵羊(6nm,Abcam)的胶体金二抗。完成上述操作后通过我校电镜室的H-7650透射电镜(HITACHI,Japan)观察血小板的超微结构，所有观察均在80kv电压条件下进行，HA小鼠的血小板作为对照使用。
8.小鼠高压注射及移植实验
将无内毒素的200μg质粒稀释到生理盐水补充体积到2ml，使用2ml注射器将2ml的质粒混合液在6-8秒之内全部通过尾静脉注射到HA小鼠体内。高压注射24小时后采血，分离血浆测定人FX含量及活性。
从HA及HB小鼠的股骨及胫骨分离骨髓细胞，通过Sca-1磁珠(Miltenyi Biotec)分选Sca-1阳性造血干祖细胞用作后续感染实验。Sca-1阳性细胞经过包含SCF、FLT-3L、TPO及IL-6等细胞因子的培养液预刺激培养48小时，而后使用感染复数为20的2bFXa-LV慢病毒离心感染2小时，并间隔24小时重复感染一次，感染时添加8μg/mL的凝聚胺增加感染效率。收集感染了Sca-1阳性细胞按2×105/只的剂量尾静脉注射到致死剂量辐照后的HA和HB小鼠。移植后4周开始采血分析受体小鼠的各项指标。
9.2bFXa拷贝数分析
移植小鼠外周血分离白细胞抽提基因组DNA，通过实时定量PCR的方法测定2bFXa的拷贝数。2bFXa的拷贝数通过WPRE的拷贝数间接判定，其通过小鼠白蛋白内参基因的定量参比而计算得出，HA及HB小鼠的外周血基因组DNA作为阴性对照。
10.HA抑制物小鼠模型建立
HA小鼠采用人重组FVIII(Baxter,USA)和弗式完全佐剂(sigma)联合免疫诱导形成抗FVIII抗体。将两者混合至总体积200μl后行小鼠腹腔注射，而后按每三周间隔继续免疫HA小鼠，其操作除了选用弗式非完全佐剂(sigma)代替完全佐剂外，余同前。完成免疫三周后，尾静脉采血测定抗FVIII抗体的滴度。
抑制物的滴度测定参照修改的Bethesda法进行，将序贯稀释的小鼠血浆与等体积的1U/mL的重组人FVIII在37℃孵育2小时，样本中残留的FVIII活性通过发色法测定(Hyphen BioMed,France)。将稀释的血浆样本中的起始FVIII活性被抑制掉50％的抑制物含量定义为1个Bethesda单位。
11.TEG及剪尾出血实验
以下实验均采用移植后8周的受体鼠，通过眼眶内眦静脉采血并按9:1的比例与3.8％的枸橼酸钠混合并转到Kaolin管，取340μl混合后的全血加入到预置20μl 0.2M氯化钙的一次性检测杯中，于37℃孵育并上TEG5000分析仪记录凝血过程，其中的R值被定义为全血凝血时间(WBCT)。剪尾实验中将预先麻醉小鼠的尾巴置于37℃生理盐水中预热10分钟，而后在小鼠尾尖直径约1.5mm处横断，并将其浸泡在2ml的37℃生理盐水中，大约10分钟后取出鼠尾并止血。出血量的数值通过测量该生理盐水中的血红蛋白浓度评估，取100μl含有血液的生理盐水加入到2ml的血红蛋白裂解液中(南京建成公司)，分光计下测定540nm下的吸光度。通过同时测定的标准曲线将吸光度转换为nmol的血红蛋白含量。小鼠剪尾生存试验的操作略有修改，若小鼠在剪尾6小时后仍有出血则将其出血部位电凝止血并视为不能通过该生存试验。所有实验用鼠在完成分析后实行安乐死。
12.统计分析
统计分析采用GraphPad Prism 6软件，所有结果按均值±标准差的形式展示。P值的评估通过双尾t检验进行，以其值小于0.05作为显著性差异的判定标准。
实施例1
FXa的体内外表达及鉴定
通过使用PACE/弗林酶切位点对人FX激活肽序列的替换，使得FXa的重链与轻链之间仅通过两个PACE/弗林酶切位点连接(图1-A)。通过hFX特异性的ELISA方法检测构建的FXa是否能够在293T的瞬时转染后表达FXa，来验证FXa表达框的正确性。
结果显示，FXa在293T转染后的表达量为2333.3±215ng/mL(图1-B)。FXa活性(FXa:C)通过发色底物法测定，结果显示，其平均活性为101.4±12.1mU/mL。与之相反的是，野生型FX无法检测出FXa:C，虽然其抗原表达水平处于较高的水平(11900±1652.3ng/mL)。上述数据显示，构建的FXa载体能够成功表达活化状态的FX(FXa)。
采用αIIb这一巨核细胞/血小板特异性的启动子驱动下的FXa实现组织特异性的靶向血小板表达。为了验证αIIb启动子是否可以控制FXa的特异性表达，将PCI-2bFX及PCI-2bFXa分别转染一种巨核细胞系Dami细胞。转染后的Dami细胞裂解液用作抗原及活性检测，同293T细胞的转染实验结果类似，hFX抗原在FXa及FX组均可检出(两者表达量分别为377.6±67.9ng/mL和729±171.1ng/mL)，但是FXa:C只能在FXa转染组测出(22.03±11.4mU/mL)(图1-C)。上述结果确认功能性的FXa可以在αIIb启动子的驱动下合成并表达。
此外，通过高压注射的方式检测FXa在体内的表达情况。FXa及FX分别高压注射到HA小鼠，24小时后分别收集注射后小鼠血浆进行hFX:Ag和FXa:C的测定。与上述的体外表达实验相一致，FX及FXa组均能检测到hFX抗原表达，其水平分别为3850±2770ng/mL和750±540ng/mL(图1-D)，但FXa:C只能在FXa注射组小鼠血浆中检测到，其活性水平为67.2±47.8mU/mL(图1-E)。综合这些结果表明FXa可以在HA小鼠体内表达，同时生成的FXa具有凝血活性。
实施例2
2bFXa在HA移植小鼠中的治疗作用及安全性评估
采用基于造血干细胞(HSC)体外转导策略来实现靶向血小板的FXa表达，通过从HA小鼠骨髓细胞分离出Sca-1阳性细胞体外预刺激培养后，给予2bFXa慢病毒转导后移植到受致死剂量辐照的HA受体小鼠体内。移植4周后开始采集不同时间点的移植小鼠外周血样本进行多方面的分析。FXa可以在移植鼠的血小板裂解液中检测到，移植4周的FXa:C为3.72±2.83mU/108血小板，并且能够在长达48周的实验周期内保持稳定的表达(图2-A)。移植第4周的血小板裂解液hFX:Ag为47.57±18.05ng/108血小板，第16周为41.28±8.9ng/108血小板(图2-B)，并且在所有受体小鼠的两个时间点内均没有检测到血浆中的hFX抗原表达(图2-B)。为了明确FXa是否能够从移植小鼠血小板中释放，通过使用血小板激动剂激活分离的血小板，收集释放后的上清测定FXa:C。在移植第4周的血小板释放FXa:C为3.19±1.45mU/108血小板，通过与血小板裂解液FXa:C比较，大约有85.7％的FXa在血小板激活后释放出来。并在整个监测周期内持续具有释放FXa的能力(图2-C)。通过血栓弹力图分析移植小鼠的全血凝血时间，移植小鼠的凝血时间(CT)为843±279秒，显著短于HA对照小鼠的CT值2762±452秒(图2-D)。通过剪尾试验分析基于血红蛋白浓度评估的出血量，发现移植小鼠的出血量与野生型小鼠接近，且均明显少于HA对照小鼠(图2-E)。以上数据均证实血小板表达的FXa能够矫正HA的出血症状，起到增强止血的作用。
为了进一步评估FXa基因治疗的潜在血栓形成风险，测定移植小鼠血浆的D二聚体水平反映潜在的血栓风险，通过ELISA法检测的结果显示移植鼠与野生型小鼠及HA对照小鼠之间的D二聚体水平并没有明显差异(图2-F)，同时对血浆中纤维蛋白原及凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)的抗原水平检测发现移植鼠与对照小鼠之间亦没有明显差异。此外，为了进一步评估血小板表达的FXa是否在炎性等病理情况下的促血栓形成风险，通过对移植小鼠注射LPS建立炎性模型。结果显示纤维蛋白原的水平在WT小鼠及移植小鼠分别增加了2.3倍及1.6倍(图2-G)；TAT水平在两者间分别增加了2.1倍及3.5倍(图2-H)。从中可以判定在LPS的病理模型下，移植小鼠及野生型对照小鼠的纤维蛋白原及TAT改变并没有明显的差异。纤维蛋白沉积的结果提示在LPS处理后的移植小鼠及野生型小鼠肝脏组织中均产生了相似的纤维蛋白沉积，而在未处理小鼠肝脏组织中并未发现纤维蛋白的沉积(图2-I)。总之，在LPS诱导的炎性状态下，血小板表达的FXa并没有增加移植小鼠的血栓形成风险，表明其用于HA治疗的安全性。
实施例3
FXa在血小板中的表达与定位
为了明确FXa在血小板中的储存情况，分离了移植受体小鼠的血小板，通过共聚焦显微镜及免疫电镜分析FXa的血小板定位。通过FX与VWF的免疫染色，发现血小板中储存的FXa与VWF有共定位现象(图3-A)。接着为了进一步明确FXa的亚细胞定位，通过血小板的透射电镜观察到其与VWF均储存在血小板的α颗粒中，这与靶向血小板的FVIII及FIX定位相一致，并且在未移植的对照HA小鼠血小板中没有检测到FX的存在(图3-B)。
实施例4
2bFXa在产生HA抑制物的移植小鼠模型中的表达及疗效分析
前面的结果表明血小板储存的FXa可以矫正HA小鼠的出血症状，进一步验证其在产生抑制物的小鼠中是否仍然可以发挥同样的功效。通过使用重组人FVIII制剂免疫HA小鼠建立产生FVIII抑制物的HA小鼠模型，所有建立的抑制物小鼠模型均产生了高滴度的FVIII抑制物(图4-A)。而后采用2bFXa-LV感染的Sca-1阳性细胞移植此小鼠模型，四周后检测移植小鼠的FVIII抑制物滴度有所下降，但仍然维持在大于100BU/mL的较高水平(图4-A)。血小板裂解液及激活释放试验上清的FXa活性测定分别为2.99±1.14mU/108血小板(约为血浆FX活性水平的6％)及2.31±0.61mU/108血小板(图4-B)。而在剪尾生存试验的8只小鼠中有7只通过挑战存活(图4-C)。未能通过挑战的小鼠其血小板裂解液FXa活性为1.06mU/108血小板，在该组所有小鼠中活性最低。综合上述结果发现，血小板表达的FXa仍然能够矫正高滴度FVIII抑制物的HA小鼠出血表型。
实施例5
2bFXa在HB移植小鼠中的表达及治疗作用
为了评估血小板储存的FXa是否同样可以矫正HB的出血表型，对HB小鼠采用同样的基因治疗策略。移植后四周，血小板裂解液检测FXa的活性为4.34±0.43mU/108血小板(大约相当8.68％的血浆FX水平)，血小板激活释放试验检测释放出的FXa活性为4.03±0.51mU/108血小板，并且在整个24周的检测周期内均保持稳定表达(图5-A,B)。移植鼠外周血2bFXa的拷贝数为0.43±0.19拷贝/细胞(图5-C)，hFX抗原水平在移植第4周的血小板裂解液中的表达水平为67.46±11.71ng/108血小板，第16周为62.94±8.18ng/108血小板，同时在受体小鼠的血浆中并未测定到hFX抗原的表达(图5-D)。同时所有的移植受体小鼠均通过了剪尾试验(图5-E),表明血小板表达的FXa同样可以矫正HB小鼠的出血表型。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有外源的用于表达FXa因子的FXa表达盒，并且所述的表达盒包含巨核细胞和/或血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，其中所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的细胞包括造血干细胞、多能干细胞。
3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的造血干细胞或多能干细胞可以分化成巨核细胞、血小板，且所述FXa因子的编码序列在巨核细胞和/或血小板中特异性表达。
4.一种细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂包含权利要求1所述的细胞。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包含表达FXa因子的FXa表达盒，并且所述的表达盒包含巨核细胞和/或血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，其中所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接。
6.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求5所述的构建物。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括病毒载体，较佳地，所述的病毒载体选自下组：慢病毒载体、AAV载体、腺病毒载体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含：(a)权利要求1所述的细胞、权利要求5所述的核酸构建物或权利要求6所述的表达载体，和(b)药学上可接受的载体。
9.一种权利要求1所述的细胞、权利要求5所述的核酸构建物或权利要求6所述的表达载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于治疗血友病。
10.一种体外的制备基因工程化细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一造血干细胞或多能干细胞，并将一外源的用于表达FXa因子的FXa表达盒导入所述造血干细胞或多能干细胞，从而获得基因工程化的造血干细胞或多能干细胞；
其中所述的表达盒包含血小板特异性转录启动子以及FXa因子的编码序列，并且所述血小板特异性转录启动子与所述FXa因子的编码序列操作性连接；
(b)对所述基因工程化的造血干细胞或多能干细胞进行培养和分化，从而获得经分化的基因工程化的巨核细胞和/或血小板；
(c)任选地，将所述的基因工程化的巨核细胞和/或血小板与药学上可接受的载体进行混合，从而制得含所述的基因工程化的巨核细胞和/或血小板的细胞制剂。
CN201910412864.7A 2019-05-17 2019-05-17 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用 Pending CN110760479A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910412864.7A CN110760479A (zh) 2019-05-17 2019-05-17 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910412864.7A CN110760479A (zh) 2019-05-17 2019-05-17 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110760479A true CN110760479A (zh) 2020-02-07

Family

ID=69329084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910412864.7A Pending CN110760479A (zh) 2019-05-17 2019-05-17 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110760479A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148425A1 (en) * 2005-10-28 2009-06-11 Tsukasa Ohmori Therapeutic method for blood coagulation disorder
CN101514231A (zh) * 2008-12-26 2009-08-26 重庆大学 靶向性抗血栓形成的融合蛋白及其制备方法和应用
US20140356387A1 (en) * 2011-12-08 2014-12-04 Bloodcenter Research Foundation Method for inducing immune tolerance through targetted gene expression
CN107073082A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 博尔托拉制药公司 Xa因子解毒剂的冻干制剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090148425A1 (en) * 2005-10-28 2009-06-11 Tsukasa Ohmori Therapeutic method for blood coagulation disorder
CN101514231A (zh) * 2008-12-26 2009-08-26 重庆大学 靶向性抗血栓形成的融合蛋白及其制备方法和应用
US20140356387A1 (en) * 2011-12-08 2014-12-04 Bloodcenter Research Foundation Method for inducing immune tolerance through targetted gene expression
CN107073082A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 博尔托拉制药公司 Xa因子解毒剂的冻干制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG DAWEI: "Targeting Factor Xa Expression in Platelets As a Potential Gene Therapy Strategy for Hemophilia with Inhibitors", BLOOD, vol. 128, no. 22 *
张子彦: "遗传性血液病学", 科学技术文献出版社, pages: 279 - 280 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7374527B2 (ja) α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を発現する遺伝子改変された間葉系幹細胞
Gao et al. Potential long-term treatment of hemophilia A by neonatal co-transplantation of cord blood-derived endothelial colony-forming cells and placental mesenchymal stromal cells
Li et al. Binding to WGR domain by salidroside activates PARP1 and protects hematopoietic stem cells from oxidative stress
Rick et al. Congenital bleeding disorders
US20230220350A1 (en) Gene-engineered mesenchymal stem cells and applications thereof
US9592259B2 (en) APC-mediated tolerance induction for therapy of multiple sclerosis
EP2684045A1 (en) Methods to characterize patients suffering from hemolysis
US20210069330A1 (en) Methods and compositions for tumor radiosensitization
Gao et al. Gene transfer of cocaine hydrolase suppresses cardiovascular responses to cocaine in rats
US20040009158A1 (en) Promotion of neovascularization using bone marrow-derived endothelial-progenitor cells
Felker et al. Differential CXCR4 expression on hematopoietic progenitor cells versus stem cells directs homing and engraftment
CN110760479A (zh) 靶向血小板表达的凝血因子Xa及其应用
Wang et al. Activated factor X targeted stored in platelets as an effective gene therapy strategy for both hemophilia A and B
Yang et al. Platelet-derived factor V promotes angiogenesis in a mouse hind limb ischemia model
EP4146797A1 (en) Treatment for neurodegenerative diseases
US20220213462A1 (en) Red blood cells expressing von willebrand factor protease and methods of use thereof
Gong et al. Improved intravenous lentiviral gene therapy based on endothelial-specific promoter-driven factor VIII expression for hemophilia A
Melhem et al. Endothelial cell indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 alters cardiac function following myocardial infarction through kynurenine
US20230159620A1 (en) Compositions and methods of treatment for vascular diseases and thrombosis
EP3658676B1 (en) Endothelial-specific promoter sequences and uses thereof
TW202242099A (zh) 基因工程間充質幹細胞及其應用
Joshi Hypoxic Regulation of Angiotensin-Converting Enzyme 2 and Mas Receptor in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells: A Translational Study
WO2011102890A1 (en) Methods of treatment of hemophilia
Haaften Mesenchymal stem cells protect the lung from oxygen-induced experimental bronchopulmonary dysplasia
Shangaris Can we treat congenital blood disorders by transplantation of stem cells, gene therapy to the fetus?

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230407

Address after: Room 501, 5th Floor, No. 175 Weizhan Road, Lingang New Area, China (Shanghai) Free Trade Pilot Zone, Pudong New Area, Shanghai, 201208

Applicant after: Shanghai Shangyao Ruier Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 197 Ruijin 2nd Road, Huangpu District, Shanghai 200025

Applicant before: RUI JIN HOSPITAL AFFILIATED TO SHANGHAI JIAO TONG University SCHOOL OF MEDICINE

TA01 Transfer of patent application right