JP2017525704A - 第Xa因子解毒剤の凍結乾燥製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.第119(e)条のもとに2014年8月20日に出願された米国仮出願第62/039809号の利益を主張するものであり、その全体をあらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込んだものとする。
範囲を含むすべての数値的指示、例えば、pH、温度、時間、濃度及び分子量は近似値であり、これは、0.1もしくは10%ずつ(+)または(−)に変動する。常に明記されている訳ではないが、すべての数値的指示に「約」という用語が前に付くものと解釈されるべきである。常に明記されている訳ではないが、本明細書に記載される試薬は単に例となるものであり、そのようなものの等価物は当該技術分野において既知であると理解されるべきである。
記述のとおり、野生型fXaは2本鎖のポリペプチドである。r−Antidote(配列番号:3)を含むfXa解毒剤の多くの形態がそうであり、これは、軽鎖のシステイン98(Cys98)と重鎖のシステイン108(Cys108)との間の1つのジスルフィド結合により結合した軽鎖(配列番号4)及び重鎖(配列番号5)を含む。また野生型fXaのように、細胞で発現したr−Antidoteは、翻訳後修飾を受けて、結果として特定のアミノ酸残基、例えば、軽鎖のSer56、Ser72、Ser76及びThr82ならびに重鎖のThr249においてグリコシル化、ならびに軽鎖のAsp29において修飾残基(3R)−3−ヒドロキシAspが生じる。さらに、鎖間ジスルフィド結合に加えて、軽鎖のシステイン16と27、21と36、38と47、55と66、62と75及び77と90の間ならびに重鎖のシステイン7と12、27と43、156と170及び181と209の間に形成される1つ以上の鎖内ジスルフィド結合が存在することがある。
一実施形態において、本開示は、凍結乾燥に適した水性製剤を提供し、この製剤は、本明細書中で開示されているfXa解毒剤またはその生物学的等価物を可溶化剤、安定化剤(または安定剤)及び結晶性薬剤とともに含む。本製剤は、界面活性剤及び/または緩衝剤をさらに含んでもよい。一部の態様において、これらの薬剤のそれぞれの存在が、例えば、フリーズドライ温度が−40℃、−30℃、−20℃、−10℃、0℃、5℃、10℃もしくは15℃よりも高い、20℃または25℃と同じ高さの場合、凍結乾燥中にfXa解毒剤が崩壊するのを妨げる。
一部の実施形態において、本開示の水性製剤を凍結乾燥する方法も提供される。一態様において、本開示は、表8.2に例示される保存的凍結乾燥サイクルを提供し、これは、凍結工程、等温工程、アニーリング工程、一次乾燥工程及び二次乾燥工程を含む。
本開示はまた、fXa阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を処置、予防または低減する治療方法であって、適した溶媒に溶解されたときに有効量の凍結乾燥製剤を対象に投与することを含む方法に関する。本開示の解毒剤または誘導体は、選択的なまたは緊急の状況で使用されることになる持続時間の短い薬物であってもよく、これが有害な血行力学的副作用または損傷に対する増殖性血管反応の悪化を生じることなく、fXa阻害剤の通常の抗凝固特性を安全に特異的に中和することができることが予想される。
イオン強度が0.15のクエン酸リン酸(20mM)緩衝液(NaClで調節した)を、クエン酸一水和物(Fisher、ピッツバーグ、ペンシルベニア州)及びリン酸ナトリウム二塩基性、無水物(Sigma、セントルイス、ミズーリ州)を使用して調製し、6MのHClまたは6MのNaOHのいずれかを使用してpHを調節した。追加の塩を含まないリン酸(20mM)緩衝液を、6.61gのリン酸ナトリウム二塩基性無水物を2.0LのMili−Q水に溶解させることによって調製し、pHを7.5に調節した。塩を含有するリン酸(20mM)緩衝液に関しては(I=0.15M)、14.8gのNaClを上記のリン酸緩衝液に添加した。他に記載がない限り、すべての他の試薬をSigma(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。
温度制御されたサンプル充填チャンバーを備えたMicrocalキャピラリーオート−DSCを使用して示差走査熱量測定(DSC)を行った。60℃/hrのスキャン速度及び25分のスキャン前平衡化時間を用いて6〜100℃の熱的変動を行った。適切な適合バッファーをリファレンスセルに使用したと同時に、適合バッファー中の典型的なサンプル濃度を約0.6mg/mLとした。解析に先立って、すべてのサンプルスキャンから、バッファー対バッファーリファレンススキャンを差し引いて、サーモグラムを濃度により正規化した。Microcalから供給されたソフトウェアを使用してデータを処理した。非2状態フィッティング関数を使用して吸熱反応のピークを単一のピークにフィッティングし、転移温度(Tm)値をフィッティング関数によって算出した。開始温度(Tonset)値を、低温ベースラインとの吸熱反応のピークのずれによって求めた。
実施例2のデータは、r−AntidoteがpH7.5で全体的に安定であることを示した。したがって、賦形剤スクリーニング試験を、pH7.5で20mMのリン酸緩衝液中において行った。Dynapro動的光散乱プレートリーダー機器(Wyatt Technology、サンタバーバラ、カリフォルニア州)を使用してタンパク質の流体力学的直径を測定した。流体力学的直径を拡散係数からキュムラントの方法を使用してStokes−Einsteinの式によって算出した(対数分布型数値に基づく)。与えられたサンプルの均質性を評価するために測定を使用した。
この実施例は、r−Antidoteの溶解性に対するpH、温度、安定剤(例えば、シトラート、アルギニン、グリシン及びリシン)ならびにイオン強度の影響を試験した。
使用した材料は、pH8.0の10mMのトリス中のr−Antidote(4.8mg/ml)及び2%のアルギニンの溶液とした。室温(RT)における溶解性に関しては、少なくとも1〜2時間の物理的な観察により試験を行った。5℃における溶解性に関しては、サンプルを5℃で一晩平衡化し、サンプルに対して物理的な観察を行った。さらに、そのサンプルを5℃で15分間遠心分離し、上清のタンパク質濃度をUV A280nmにより分析した(二倍希釈)。元の原液を対照として日毎に分析した。
凍結乾燥プロセスを、凍結乾燥サイクルのさまざまな段階における製剤構成成分の物理的性質の理解に基づいて合理的なアプローチを使用して開発した。DSC及びフリーズドライ顕微鏡法(FDM)を含む熱的性質決定法を使用して、Tg’(凍結濃縮物のガラス転移温度)及びTc(一次乾燥中の崩壊温度)を測定した。表6に示すサイクルを本凍結乾燥製剤の凍結乾燥に選択した。アニーリング工程はマンニトールの結晶化を可能にし、確実に生成物温度が一次乾燥中の崩壊温度未満に下がらないようにする。一次乾燥温度を、適度な一次乾燥の継続時間とともにケーク崩壊を避けるよう選択した。水分レベルが<1%の凍結乾燥製剤を生成するために2工程の二次乾燥条件を開発した。
実験/試験デザイン
10の異なる製剤を調製して、r−Antidoteの溶解性及び安定性に対する緩衝剤組成物、pH、安定剤及び薬物濃度の影響を試験した(表7)。製剤を、pH7.8及び8.2のトリスまたはリン酸緩衝剤を使用して調製した。溶液を、遠心ろ過を使用して、10mg/mL及び25mg/mLに濃縮した。
1.1℃/分で−40℃まで冷却する
2.−40℃で1時間保持した後、100mTorrの真空にする
3.0.5℃/分で−35℃まで上昇させ、ピラニ真空計測定値が100mTorrのキャパシタンスマノメータ測定値と一致し、生成物温度が棚温度に達するまで保持する。
4.0.5℃/分で20℃まで上昇させ、ピラニ真空計測定値が100mTorrのキャパシタンスマノメータ測定値と一致し、生成物温度が棚温度に達するまで保持する。
凍結乾燥後に、栓をしバイアルにキャップを付けた。最初の時点(T0)の試験のためにサンプルを提出し、残りのバイアルの安定性を評価した。
溶液サンプルの熱挙動を変調型及び標準DSCを使用して調べた。12Lの溶液をTzeroパンに入れ密封することによってサンプルを調べた。溶液を1℃/分で−40℃まで冷却し、等温的に5分間保持した。サンプルの温度を120秒毎に1℃の変調で0.5℃/分で10℃まで上昇させた。アニーリング工程を使用して一部のサンプルを調べた。これらのサンプルを、1℃/分で−40℃まで冷却し、等温的に5分間保持し、温度を1から5℃/分で−15℃または−20℃まで上昇させ、等温的に少なくとも60分間保持することによって調べた。サンプルの温度を5℃/分で−40℃に戻し、等温的に5分間保持し、120秒毎に1℃の変調で0.5℃/分で上昇させた。
サンプルを、Linkamフリーズドライ顕微鏡ステージにある2枚のカバーガラスの間に2から4Lの溶液を置くことによってフリーズドライ顕微鏡法を使用して調べた。サンプルを1℃/分で−40℃以下に冷却し、等温的に2分間保持した。100マイクロメートルで真空にし、サンプルを偏光顕微鏡に搭載されたビデオカメラを使用して視覚的に調べた。乾燥した材料が認められ、撮影されるまでサンプルをその温度でフリーズドライした。その後、サンプルの温度を2℃ずつ上昇させ、フリーズドライしたサンプルを観察するために各温度で保持した。サンプルの温度を完全な崩壊が観察されるまで上昇させた。
A.紫外可視による濃度
溶液の濃度をNano Drop 2000分光光度計(Thermo Scientific)を使用して測定した。2Lの溶液を試験プラットフォームに置き、280nmの範囲でスキャンすることによってスキャンを行った。
Orion pHメーターモデル920Aを使用して溶液のpHを測定した。Thermo Scientificから購入した予め作製された緩衝液を使用してメーター/プローブをpH7からpH10の範囲に較正した。
Agilent 1100シリーズのHPLCを使用してサイズ排除HPLC分析を行った。0.1Mのリン酸ナトリウム、0.75Mの塩酸アルギニンで調製したpH7.4の移動相を分離に使用した。分析カラムは、YMC−Packジオール−200、300×4.6mm、平均粒子径5μmを使用した。カラムを含むHPLC系の適合性を、基準材料の6回の繰り返し測定を使用して検証し、主なタンパク質ピークに対する保持時間、面積及びパーセント面積に関して評価した。さらに、ゲルろ過スタンダードを使用して、カラムの分離能を評価した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して1mg/mLのタンパク質に希釈し、1回の注入当たり50μgのタンパク質のカラム負荷となるよう注入した。
Agilent 1100シリーズのHPLC使用して逆相HPLC分析を行った。この方法は、HPLCグレードの水に0.1%のトリフルオロ酢酸及びアセトニトリル中に0.08%のトリフルオロ酢酸で調製した移動相を使用した分離のためにグラジエントを利用した。分析カラムは、Vydac C18カラム、150×4.6mm、平均粒子径5μmを使用した。カラムを含むHPLC系の適合性は、基準材料の6回の繰り返し測定ならびに主なタンパク質ピークに関する保持時間、面積及びパーセント面積の評価を使用して検証した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して1mg/mLのタンパク質に希釈し、1回の注入当たり25μgのタンパク質のカラム負荷になるよう注入した。
Agilent 1100シリーズのHPLCを使用してイオン交換HPLC分析を行った。この方法は、pH6.5において20mMのリン酸ナトリウム及びpH6.5において20mMのリン酸ナトリウム、1Mの塩化ナトリウムで調製した移動相を使用してグラジエントを利用した。分析カラムは、Dionex Propac WCX−10、250×4mmを使用した。カラムを含むHPLC系の適合性を、基準材料の6回の反復導入ならびにピーク#2としてラベルされたピークの保持時間、面積及びパーセント面積の評価を使用して検証した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して1mg/mLのタンパク質に希釈し、1回の注入当たり50μgのタンパク質のカラム充填となるよう注入した。
溶液サンプルの一部を、保存的サイクルを使用して凍結乾燥し、25℃及び40℃で2か月間安定性を評価した。凍結乾燥サイクルは、充填体積が小さいためおよそ20時間以内に完了した。場合によってフィルターが破れるため製剤2Aを除いて、すべての凍結乾燥ケークは許容されるように見えた。
r−Antidoteの安定性に対する緩衝剤のタイプ、pH、安定剤及びタンパク質濃度の影響を溶液製剤及び凍結乾燥製剤として調べた。溶液サンプルを5℃及び25℃で最大2週間保管し、凍結乾燥サンプルを25℃及び40℃で最大2か月保管した。2mLのバイアルに0.25mLとして凍結乾燥した製剤は、2か月後に許容できる安定性を示した。しかしながら、熱的性質決定実験は、すべての製剤が−37℃以下の崩壊温度を有し、スケールアップに適していないことを示した。このデータは、崩壊を防ぐため及びさらに高温での凍結乾燥を可能にするために製剤中に結晶化構成成分が必要とされることを示唆している。
実施例6のデータは、フリーズドライ中の崩壊を防ぐためにr−Antidote製剤中に結晶化構成成分が必要とされることを示唆していた。この実施例は、製剤の熱挙動及び凍結乾燥ケークの外観に対するマンニトール及びアルギニン濃度の影響を調べた。2%から4%のマンニトールを含有する製剤をアルギニンの濃度を低減しながら試験した。アルギニンは、濃度が47.5mM以下にならない限りマンニトールの結晶化を妨げた。試験は、10mMのトリス、10mg/mLのr−Antidote、45mMのアルギニン、2%のスクロース、5%のマンニトール及び0.01%のポリソルベート80を含有する製剤が結果として許容される外観ならびに物理的及び化学的安定性を有する凍結乾燥ケークをもたらすことを発見した。凍結乾燥の試験は、−25℃での3時間のアニーリング後に−25℃の一次乾燥棚温度を使用することを裏付けるデータをもたらした。2工程の二次乾燥プロセスは、残存水分値が1%未満のケークをもたらす。
同時に製剤の熱挙動を調べ、保存サイクルを使用して凍結乾燥した製剤の化学的安定性を比較するための試験を設計した。最初の製剤を、95mMのアルギニン、2%のスクロース、2%のマンニトール及び10mMのトリスまたは10mMのリン酸緩衝剤のいずれかを用いてpH7.8で調製した。この製剤はまた、活性成分を10または25mg/mLのいずれかで含むものとした(表8.1)。
1.示差走査熱量測定(DSC)
緩衝剤製剤の熱挙動に対するそれぞれの構成成分の影響を判定するために、各緩衝剤構成成分の個々の溶液を調製し、DSCを使用して試験した。一般に、製剤の熱挙動は、最も高い濃度で存在する構成成分によって決まる。熱挙動の変化は、他の賦形剤または薬物の添加により起こる可能性がある。例えば、塩の添加により、製剤中の非結晶の材料のTg’が低下することがある。提示する薬物製剤は、マンニトールを含む。結晶化増量剤として働くようマンニトールを賦形剤として凍結乾燥製剤に添加する。マンニトールは、溶液中で初めに凍結されると非結晶である。マンニトールがケークのための構造体を提供できるようマンニトールの結晶化を促進するために凍結中にアニーリング工程が一般に含まれる。製剤中のその他の賦形剤及び/または活性成分がマンニトールの結晶化を妨げるか、または遅延させる場合がある。本セクションで論述する試験は、マンニトールの結晶化及び溶液の熱挙動に対するトリス、リン酸塩及びアルギニンの影響を試験した。
10mg/mLのr−Antidote、95mMのアルギニン、2%のスクロース及び2%のマンニトールとともに10mMのリン酸塩または10mMのトリスを用いてpH7.8で調製した製剤を、FDMを使用して調べた。トリス製剤を用いて行った実験は、−25℃で最大3時間アニーリングした場合、およそ−34℃で製剤崩壊の開始を示していた。
95mMのアルギニン、2%のスクロース及び2%のマンニトールとともに10mg/mL及び25mg/mLのr−Antidoteを用いてpH7.8で調製したリン酸塩製剤及びトリス製剤を溶液及び凍結乾燥サンプルとして安定性に関して調べた。それぞれの溶液を各バイアル当たり0.20mLで3mLのバイアルに入れた。サンプルの一部を5℃及び25℃で最大2週間保管し、サンプルの残りの部分を保存的サイクルを使用して凍結乾燥し、25℃で最大3か月間及び40℃で最大2か月間安定性を評価した。
熱挙動及びケークの外観に対するアルギニン濃度及びマンニトール濃度の影響を試験するためにプラセボ製剤を使用してこの実施例を行った。この試験は、トリス緩衝剤を用いて調製したプラセボ製剤に焦点を当てた。トリス緩衝剤は原薬溶液を調製するために使用される緩衝剤であり、トリス及びリン酸ナトリウムを用いて調製したサンプルの化学的安定性に差がなかったためトリス緩衝剤を選択した。
熱分析実験の目的は、製剤中の固体の濃度を実質的に増加させることなくマンニトールの結晶化を促進するアルギニンの濃度及びマンニトールの濃度を求めることであった。高濃度の固体は、凍結乾燥中の物質移動に対する抵抗力を増加させ、極端に長い凍結乾燥サイクルをもたらす可能性がある。
熱分析実験と同時に凍結乾燥の試験を行った。10mMのトリス、9.5mMから23.75mMのアルギニン、2%のスクロース及び2%から4%のマンニトールを用いて、または4%のスクロースあり、もしくはなしで47.5mMのアルギニンとともに10mMのトリスを用いてプラセボ溶液を調製した。10mMのトリス、47.5mMのアルギニン、2%のスクロース及び5%のマンニトールを含有する製剤も含まれた。その溶液を、各バイアル当たり3mLの溶液を使用して20mLのバイアルに入れた。保存的で非従来的な凍結乾燥サイクルを、許容できるケークが生成できるか判定するために使用した。サンプルを1℃/分で−20℃まで冷却し、3時間アニーリングし、1℃/分で−40℃まで冷却し、2時間保持した。100mTorrの真空にし、棚温度を0.5℃/分で−30℃まで上昇させた。ピラニ真空計の値がキャパシタンスマノメータ(CM)の値と一致するまでサンプルを−30℃に保持し、その後、0.5℃/分で25℃の二次乾燥に進んだ。ピラニ真空計の値がCMの値と一致したとき二次乾燥が完了した。およそ30時間後に一次乾燥が完了し、二次乾燥は数時間だけ必要とされた。
Claims (21)
- 10mMから55mMのアルギニン、1%から3%のスクロース(w/v)、2%から8%のマンニトール(w/v)ならびに配列番号4のアミノ酸配列を含む第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列を含む第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む少なくとも5mg/mLの2本鎖のポリペプチドを含み、7.5から8のpHを有する、水性製剤。
- 40mMから50mMのアルギニン、1.5%から2.5%のスクロース(w/v)、4.5%から5.5%のマンニトール(w/v)及び少なくとも10mg/mLの前記ポリペプチドを含む、請求項1に記載の製剤。
- 少なくとも18mg/mLの前記ポリペプチドを含む、請求項2に記載の製剤。
- 前記ポリペプチドは、天然アミノ酸とは異なるよう修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項2に記載の製剤。
- 前記第1の鎖の残基Asp29は、Asp29において(3R)−3−ヒドロキシAspに修飾されている、請求項4に記載の製剤。
- 前記ポリペプチドは、前記第1及び第2の鎖のそれぞれに関して少なくとも鎖内ジスルフィド結合を含む、請求項1に記載の製剤。
- 約45mMのアルギニン、約2%のスクロース(w/v)、約5%のマンニトール(w/v)ならびに配列番号4のアミノ酸配列を含む第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列を含む第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む約10mg/mLの2本鎖のポリペプチドを含み、約7.8のpHを有する、水性製剤。
- 約45mMのアルギニン、約2%のスクロース(w/v)、約5%のマンニトール(w/v)ならびに配列番号4のアミノ酸配列を含む第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列を含む第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む約20mg/mLの2本鎖のポリペプチドを含み、約7.8のpHを有する、水性製剤。
- 10mMから55mMのアルギニン、1%から3%のスクロース(w/v)、2%から8%のマンニトール(w/v)ならびに配列番号4のアミノ酸配列を含むか、または配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有する第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列のまたは、配列番号5と少なくとも90%の配列同一性を有する第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む少なくとも5mg/mLの2本鎖のポリペプチドを含み、7.5から8のpHを有する、水性製剤。
- 前記2本鎖のポリペプチドはGlaドメインに修飾を有し、活性部位は、野生型fXaタンパク質と比較した場合、fXa阻害剤と結合することができるが、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成しない、請求項9に記載の製剤。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することを含む凍結乾燥製剤を調製する方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥組成物。
- 配列番号4のアミノ酸配列の第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列の第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む少なくとも10%(w/w)の2本鎖のポリペプチドならびにL−アルギニンHCl:スクロース:マンニトールを(0.5〜1.4):(1〜3):(2〜8)の範囲の重量比で含む、凍結乾燥組成物。
- 少なくとも18%(w/w)の前記2本鎖のポリペプチドを含む、請求項13に記載の凍結乾燥組成物。
- 前記L−アルギニンHCl:スクロース:マンニトールの重量比は、(0.9〜1):(1.5〜2.5):(4.5〜5.5)の範囲である、請求項13に記載の凍結乾燥組成物。
- 配列番号4のアミノ酸配列の第1の鎖、配列番号5のアミノ酸配列の第2の鎖及び配列番号4の98位の第1のシステイン残基(Cys98)と配列番号5の108位の第2のシステイン残基(Cys108)との間のジスルフィド結合を含む少なくとも10%(w/w)の2本鎖のポリペプチドならびにL−アルギニンHCl:スクロース:マンニトールを約0.95:2:5の重量比で含む、凍結乾燥組成物。
- 第Xa因子阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を低減する方法であって、請求項13〜16のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物を水性溶媒に溶解させることによって調製された溶液を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記第Xa因子阻害剤はアピキサバン、リバーロキサバンまたはベトリキサバンである、請求項17に記載の方法。
- 配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、可溶化剤、安定剤及び結晶性構成成分を含み、凍結乾燥中に崩壊しない、水性製剤。
- 前記結晶性構成成分は2%から8%(w/v)の濃度で存在するマンニトールであり、前記可溶化剤はアルギニンであり、前記安定剤はスクロースである、請求項19に記載の製剤。
- 界面活性剤及び緩衝剤をさらに含む、請求項19または20に記載の製剤。
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