CN103945863A - 包含配体的vlp及其相关方法 - Google Patents

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汪宝忠
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权富希
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CHILDREN S HEATLHCARE OF ATLANTA Inc
Emory University
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Abstract

本公开内容涉及增强对抗原的免疫应答的免疫原性组合物和方法。在某些实施方案中，本公开内容涉及在外部包含TLR5激动剂、无抗原的病毒样载体。

Description

包含配体的VLP及其相关方法
关于联邦资助研究的声明
本发明根据美国国家卫生研究院（National Institutes of Health）提供的基金AI068003和UL1RR025008；和美国国家过敏症和传染病学会（National Institute of Allergy and Infectious Diseases）提供的基金1R43AI091230、1R01AI068003和1R01AI087798，在政府的支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月1日提交的美国临时申请号61/513,695、2011年8月1日提交的美国临时申请号61/513,905、和2011年8月26日提交的美国临时申请号61/527,636的优先权，所有这些申请通过引用全文并入本文。
背景
病毒样颗粒(VLP)疫苗是遗传改造的颗粒病毒样结构的多拷贝蛋白抗原的复合体。以VLP或重组疫苗呈现的病毒蛋白是免疫原性的。产生VLP的方法在美国专利申请公布号2006/02167702中提供。还参见美国专利申请公布号2006/0088909、2010/0047277、2010/0196419、2010/0330190、2011/0097358、2012/0052082、和美国专利7,763,450。
流感是人类最重要的病毒性疾病之一，具有显著的医学和经济负担。接种疫苗是预防流感感染的有效方法。可获得的季节性流感疫苗是三价灭活的(杀死的)病毒疫苗(TIV)或活的、减毒的、三价流感病毒疫苗(LAIV)。这些疫苗被靶向以主要针对与用于接种的病毒同源的毒株的病毒包膜蛋白HA以及NA诱导中和抗体。然而，流感病毒随着时间经历其表面蛋白的变化，称为抗原漂移，允许它们躲避宿主免疫系统和减少对先前感染的免疫效力。由于与疫苗毒株的抗原错配，这种漂移的毒株可危害疫苗引起的免疫，且所得的血清保护比可根据疫苗毒株与循环毒株之间的抗原距离而改变。此外，漂移的毒株的意外出现(由HA亚型和较不频繁地NA亚型被新的亚型代替造成)可导致流感流行。现有疫苗的主要缺陷包括需要每个季节产生新的疫苗、选择正确毒株的不确定性、长的生产时间、以及疫苗通过需要含胚卵的缓慢过程制备的事实。而且，现有的疫苗不针对未来的流感流行进行保护。因此，不仅对于季节性流感，而且对于可能的新的流感流行毒株都需要改进的疫苗。
因为现有疫苗的这些缺陷，基于相对保守的蛋白结构域的通用疫苗将是有希望的方法。前提是抗体对传染性病毒颗粒、完整的受感染细胞、或二者上这些结构域的可及性。甲型流感病毒的M2蛋白是四聚III型膜蛋白，展现pH依赖性质子运输活性。它以高密度在受感染细胞的质膜上表达，且其保守的细胞外结构域(M2e)是M2e特异性抗体可及的。然而，因为仅M2的数个拷贝被掺入流感病毒的包膜中，且小的M2e被大的表面HA和NA隔离不与免疫效应细胞有效相互作用，M2e是免疫原性差的，尽管其是高度保守的。研究已经显示，尽管M2e特异性抗体不能阻止感染，它们限制随后的病毒复制并减少生病和死亡。参见Treanor等人,J Virol,1990,64(3):1375-7。
细菌鞭毛抗原鞭毛蛋白是Toll样受体(TLR)5的天然配体。而且，其可被胞内受体Ipaf识别。当与抗原一起以物理相关形式或在混合物中共施用时，其可用作佐剂。作为蛋白佐剂，鞭毛蛋白可被遗传修饰以产生不同的疫苗制剂。已经知道，在沙门氏菌的大多数分离株中，两种基因编码鞭毛抗原。FliC编码I相鞭毛蛋白FliC，且fljB编码II相鞭毛蛋白FljB。这些基因通过相变化(phase-variation)机制协同表达。FliC和FljB二者共有形成鞭毛细丝骨架的保守的N和C末端，并包含被细胞表面TLR5和胞质Ipaf识别的基序。
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）I相鞭毛蛋白(FliC)的膜锚定形式可被共掺入到流感VLP中作为佐剂分子。参见美国专利申请公布号2010/0330190和Wang等人,J Virol,2008,82(23):11813-23。已经发现FliC的可变中心区对其TLR5结合活性是不必要的。参见Smith等人,NatImmunol,2003,4(12):1247-53。Huleatt等人,Vaccine 2008;26(2):201-14公开了包含连接流感M2e与II相鞭毛蛋白(FljB)的重组融合蛋白的通用候选流感疫苗。WO/2009/079564公开了病毒样颗粒和构造为具有M2e的重复的膜锚定的鞭毛蛋白。Wang等人,PLoS One.,2010,5(11):e13972公开了用掺有膜锚定的鞭毛蛋白的流感VLP鼻内免疫引起强的异亚型的保护。
呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴儿和儿童下呼吸道生病的主要原因。RSV具有编码11个蛋白的10个基因。RSV融合(F)和附着糖蛋白(G)包含中和抗体表位和数个T细胞表位。参见Olson&Varga,Expert RevVaccines,2008;7:1239–55，Moore等人,J Virol 2009;83:4185–94，和美国专利申请公布号2011/0097358。
本文引用的参考文献不是对现有技术的承认。
概述
本公开内容涉及增强对抗原的免疫应答的免疫原性组合物和方法。在某些实施方案中，本公开内容涉及在外部包含TLR5激动剂、无抗原的病毒样载体。在某些实施方案中，本公开内容涉及接种受治疗者的方法，包括在使得足以在健康人类受治疗者、50、60或65岁以上的受治疗者、或4、8或12岁以下的受治疗者中阻止最近的未来感染的量产生抗体和/或记忆性B细胞或T细胞的条件下，联合包含TLR5激动剂的病毒样载体施用抗原，其中所述病毒样载体不包含所述抗原。在某些实施方案中，抗原是病毒、细菌、真菌或寄生虫衍生的分子。
在某些实施方案中，本公开内容涉及针对病毒免疫受治疗者的方法，包括联合包含TLR5激动剂的病毒样载体向受治疗者施用抗原。在某些实施方案中，TLR5激动剂是以膜锚定形式的鞭毛蛋白，例如，是FliC或缺失可变区的FliC。在某些实施方案中，抗原不是病毒样载体的部分，而是联合病毒样载体被施用。在某些实施方案中，抗原是具有由连接基团连接的重复单元的分子。在某些实施方案中，抗原包含流感蛋白，诸如M2e或M2e的重复序列，例如，重复2、3、4、5或6次或更多次的M2e序列。通常，M2e半胱氨酸氨基酸，即，蛋白的半胱氨酸氨基酸，被丝氨酸或丙氨酸氨基酸代替。
在某些实施方案中，抗原是包含SEQ ID NO:1的M2e多肽或其片段。在某些实施方案中，片段是SEQ ID NO:1中的四个、五个或六个或更多个连续氨基酸。在某些实施方案中，抗原包括M2e多肽SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD(SEQ ID NO:29)、SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSS(SEQ ID NO:30)、SLLTEVETPIRNEWGSRSNDS(SEQ ID NO:31)、SLLTEVETPIRNEWGSRSND(SEQ ID NO:32)、SLLTEVETPIRNEWGSRSN(SEQ ID NO:33)、SLLTEVETPIRNEWGSRS(SEQ ID NO:34)、SLLTEVETPIRNEWGSR(SEQID NO:35)、SLLTEVETPIRNEWGS(SEQ ID NO:36)、SLLTEVETPIRNEWG(SEQ ID NO:37)、SLLTEVETPIRNEW(SEQ ID NO:38)、SLLTEVETPIRNE(SEQ ID NO:39)、SLLTEVETPIRN(SEQ ID NO:40)、SLLTEVETPIR(SEQ ID NO:41)、SLLTEVETPI(SEQ ID NO:42)、SLLTEVETP(SEQ ID NO:43)、SLLTEVET(SEQ ID NO:44)、SLLTEVE(SEQ ID NO:45)、SLLTEV(SEQ ID NO:46)、SLLTE(SEQ ID NO:47)、SLLT(SEQ ID NO:48)、LLTE(SEQ ID NO:49)、LLTEV(SEQ ID NO:50)、LLTEVE(SEQ ID NO:51)、LLTEVET(SEQ ID NO:52)、LLTEVETP(SEQID NO:53)、LLTEVETPI(SEQ ID NO:54)、LLTEVETPIR(SEQ ID NO:55)、LLTEVETPIRN(SEQ ID NO:56)、LTEV(SEQ ID NO:57)、LTEVE(SEQ IDNO:58)、LTEVET(SEQ ID NO:59)、LTEVETP(SEQ ID NO:60)、LTEVETPI(SEQ ID NO:61)、LTEVETPIR(SEQ ID NO:62)、LTEVETPIRN(SEQ IDNO:63)、TEVE(SEQ ID NO:64)、TEVET(SEQ ID NO:65)、TEVETP(SEQID NO:66)、TEVETPI(SEQ ID NO:67)、TEVETPIR(SEQ ID NO:68)、TEVETPIRN(SEQ ID NO:69)、EVET(SEQ ID NO:70)、EVETP(SEQ IDNO:71)、EVETPI(SEQ ID NO:72)、EVETPIR(SEQ ID NO:73)、EVETPIRN(SEQ ID NO:74)、VETPI(SEQ ID NO:75)、VETPIR(SEQ ID NO:76)、VETPIRN(SEQ ID NO:77)、ETPI(SEQ ID NO:78)、ETPIR(SEQ ID NO:79)、ETPIRN(SEQ ID NO:80)或TPIRN(SEQ ID NO:81)。
在某些实施方案中，抗原是活的减毒的病毒或杀死的病毒，即灭活疫苗。在某些实施方案中，鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可变区的FliC且病毒样载体不包含抗原，即基本上由作为佐剂的鞭毛蛋白组成的病毒样载体。在某些实施方案中，本公开内容涉及包含本文公开的鞭毛蛋白序列的病毒样载体。在某些实施方案中，鼻内或肌内施用抗原和病毒样载体。
在某些实施方案中，本公开内容涉及用于本文公开的用途的药物组合物，所述药物组合物包含在外部包含鞭毛蛋白、无抗原的病毒样载体。在某些实施方案中，本公开内容涉及本文公开的病毒样载体在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的用途。
在某些实施方案中，本公开内容涉及包含抗原和/或包含鞭毛蛋白的病毒样载体的免疫原性组合物，其中病毒样载体包含TLR5激动剂，其中病毒样载体不包含抗原。抗原可以是病毒蛋白，诸如M2e，其中M2e半胱氨酸氨基酸被丝氨酸氨基酸代替。抗原是由连接基团连接的重复多肽序列。TLR5激动剂可以是鞭毛蛋白，或鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可变区的FliC，例如，本文公开的多肽，诸如SEQ ID NO:28的多肽。
在某些实施方案中，本公开内容涉及包含表面具有流感病毒基质蛋白和RSV蛋白或糖蛋白的病毒样载体的免疫原性组合物。在某些实施方案中，流感病毒基质蛋白是M1。在某些实施方案中，RSV蛋白是F蛋白或G蛋白。在某些实施方案中，免疫原性组合物还包括包含TLR5激动剂的病毒样载体，例如鞭毛蛋白。在某些实施方案中，鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可变区的FliC。在某些实施方案中，病毒样载体在同一病毒样载体中包括鞭毛蛋白和RSV蛋白或糖蛋白。在某些实施方案中，病毒样载体包括鞭毛蛋白且不包含RSV蛋白或糖蛋白。在某些实施方案中，病毒样载体是病毒样颗粒。
在某些实施方案中，本公开内容涉及接种受治疗者的方法，包括联合包含TLR5激动剂的病毒样载体施用表面具有流感病毒基质蛋白和RSV蛋白的病毒样载体。通常，流感病毒基质蛋白是M1且RSV蛋白是F蛋白或G蛋白。通常，TLR5激动剂是鞭毛蛋白，例如，FliC或其中不存在可变区的FliC。在某些实施方案中，包含鞭毛蛋白的病毒样载体和RSV蛋白或糖蛋白在同一病毒样载体中。在某些实施方案中，包含鞭毛蛋白的病毒样载体不包含RSV蛋白或糖蛋白。通常，病毒样载体是病毒样颗粒。
在某些实施方案中，本公开内容涉及包含表面具有流感病毒基质蛋白和RSV蛋白，任选地包含鞭毛蛋白，而不存在F蛋白或糖蛋白的病毒样载体的免疫原性组合物，其中流感病毒基质蛋白是M1且RSV蛋白是G蛋白或糖蛋白。
通过用编码RSV-G和M1，任选地包含编码鞭毛蛋白的基因，而非RSV-F基因的重组病毒，例如rBV感染昆虫细胞，例如Sf9或Sf21细胞来产生的RSV-G病毒样颗粒。
在某些实施方案中，本公开内容涉及接种受治疗者的方法，包括施用本文公开的免疫原性组合物。在某些实施方案中，受治疗者是人类。
在某些实施方案中，本公开内容涉及编码本文公开的多肽的核酸序列。
附图简述
图1显示氨基酸序列和构建体的示意图。显示的M2e序列是人类甲型流感病毒M2e的共有序列。在位点17和19的半胱氨酸被丝氨酸氨基酸取代。在4.M2e中，四个重复性M2e区域(加下划线的序列)串联定位。斜体的序列是柔性接头。在4.M2e-tFliC融合蛋白中，FliC的中央免疫原性区域(结构域3，D3，Aa177-401)被4.M2e序列代替。在膜锚定的4.M2e-tFliC中，蜂毒肽（mellitin）信号肽(SP)与4.M2e-tFliC的N末端(FliC中N末端结构域1和2，ND1-2)融合以使得其胞外域能够到达细胞外途径，且在成熟蛋白中被昆虫细胞信号肽酶去除。A/PR8HA的跨膜和胞质结构域(TM/CT)附着到4.M2e-tFliC融合蛋白的C末端(FliC中C末端结构域2和1，CD2-1)。
图2显示对融合蛋白和M2e VLP表征的数据。A.M1衍生的VLP的简图。4M2e-tFliC融合蛋白的膜锚定形式插入包膜的双层脂质中；B.VLP的EM；C、D和E.VLP的表征。将VLP样品施加到SDS-PAGE，随后为蛋白质印迹分析。泳道1，4.M2e-tFliC/M1VLP；泳道2，FliC/M1VLP；泳道3，M1VLP。蛋白条带通过以下检测：C，抗FliC抗体；D，抗M2e(14C2)抗体；E，抗M1抗体；F.融合蛋白或VLP中鞭毛蛋白的TLR5激动剂活性。表达TLR-2和-4而未表达TLR-5的小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7用于确定M2e-鞭毛蛋白融合蛋白或包含鞭毛蛋白的VLP的生物活性。表达TLR-5的RAW264.7细胞通过用表达人类TLR-5的载体pUNO-hTLR5转染来制备。数据代表三次重复的平均值±标准误差。
图3显示血清IgG端点滴度(A)和M2特异性IgG结合(B)的数据。A.为了确定血清IgG滴度，用100μl/孔的合成的M2e肽(5μg/ml)包被ELISA检验板。最后一次免疫后4周的免疫血清以2×步幅（step）稀释，并将100μl稀释的样品施加到板用于抗体结合。结合的抗体通过结合HRP-山羊抗小鼠IgG抗体来检测并用TMB底物来显色。展示高于阴性对照(未处理组)的OD450 2×的OD450的最高稀释被标为端点滴度。代表性数据是最后一次免疫后4周每组中六只小鼠的M2e特异性IgG滴度的几何平均值(GM)±95%置信区间(CI)。B.利用细胞表面ELISA确定识别天然M2蛋白的血清IgG。用A/PR8病毒以MOI1感染MDCK细胞。未感染的细胞用作对照。感染后12h，用PBS洗涤细胞并用10%甲醛固定。施加稀释的样品以检测抗体结合。数据描述感染的细胞的OD450(平均值+SD)减去未感染的细胞的背景。组1至4代表分别用4.M2e、4.M2e-tFliC、4.M2e-tFliC/M1VLP、和4.M2e加FliC/M1VLP免疫的小鼠组。P<0.05(*)，P<0.01(*)，P<0.001(***)。
图4显示免疫的小鼠肺灌洗液中分泌型IgA(A)和IgG(B)端点滴度的数据。最后一次免疫后四周，收集肺并用每个肺1ml含0.05%Tween 20的PBS灌洗两次。A.sIgA端点滴度如图3A中对血清IgG端点滴度描述的确定，但使用的二抗是HRP共轭的山羊抗小鼠IgA抗体。B.IgG滴度如对血清IgG滴度描述的确定。代表性数据是每组中六只小鼠的GM±95%CI。
图5显示A/Philippines(H3N2)活病毒攻击的数据。最后一次免疫后4周，用5×LD50的小鼠适应的A/Philippines病毒(250pfu)i.n.感染每组的6只小鼠。持续15天监测和记录小鼠存活(A)和体重变化(B)来指示疫苗的保护效力。在B中，数据代表每组中6只小鼠体重变化(攻击前的百分比)的平均值。
图6显示A/PR8(H1N1)病毒攻击的数据。最后一次免疫后4周，用5×LD50的小鼠适应的A/PR8(125pfu)i.n.感染小鼠。如图5所述地监测和记录小鼠存活(A)和体重变化(B)。
图7显示攻击后第4天肺病毒载量的数据。最后一次免疫后4周，用5LD50的小鼠适应的PR8(H1N1)或Philippines(H3N2)病毒i.n.感染每组的3只小鼠。攻击后第4天收集小鼠肺。研磨每个肺并在1ml DMEM中澄清。肺提取物的病毒滴度利用标准空斑测定以MDCK细胞滴定。肺病毒滴度表示为pfu/肺。数据描述每组3只小鼠的几何平均值±95%CI。组1至4代表分别用4.M2e、4.M2e-tFliC、4.M2e-tFliC/M1VLP、和4.M2e加FliC/M1VLP i.m.或i.n.免疫的小鼠组。
图8显示对pFastBac载体的病毒样颗粒(VLP)-构建体的表征的数据。呼吸道合胞病毒(RSV)融合F基因(A)、附着糖蛋白G基因(B)和流感M1基因(C)在pFastBac载体中。通过PCR或RT-PCR扩增基因。载体中F、G和M1的大小通过用EcoRI和XhoI切割来证实，且核苷酸序列通过DNA测序来证实。包含M1和RSV F(D)或RSV G(E)的VLP通过蔗糖梯度超速离心从SF9细胞培养物上清液纯化，并通过蛋白质印迹显现。如所示地每泳道上样20μg、5μg和1μg VLP(D、E)。
图9显示在负染EM(H-7500，Hitachi)后显现的包含M1和呼吸道合胞病毒(RSV)F(A)或RSV G(C)的病毒样颗粒(VLP)和确定的其尺寸分布(B、D)。来自170个颗粒的五十五(55%)的RSV F VLP分布在60nm和100nm之间(B)，且来自161个颗粒的66%的RSV-G VLP分布在尺寸40nm和100nm之间(D)。
图10显示实验安排和对RSV-F或RSV-G病毒样颗粒(VLP)的呼吸道合胞病毒(RSV)-A2特异性抗体响应。A，如所示地以4周间隔肌内免疫小鼠组两次。加强免疫后4周，用RSV-A2病毒感染攻击小鼠，并在攻击后第4天时收集小鼠肺以确定肺病毒载量。用完整RSV病毒包被酶联免疫吸附测定(ELISA)板。在初免和加强后使用连续稀释的血清。确定来自RSV-FVLP免疫的小鼠的对RSV-F VLP的总免疫球蛋白(Ig)G(B)、同种型IgG2a(C)、IgG1(D)响应、和IgG2a与IgG1的比(E)，和对RSV-G VLP的总IgG(F)、同种型IgG2a(G)、IgG1(H)响应、和IgG2a与IgG1的比(I)。
图11显示在攻击后第4天收集的肺提取物样品中呼吸道合胞病毒(RSV)A2特异性免疫球蛋白(Ig)G、IgG2a、和IgG1响应和IgG2a与IgG1的比的数据。使用连续稀释的肺样品以确定用RSV-F病毒样颗粒(VLP)免疫或用RSV-G VLP免疫的小鼠中的IgG(A、C)、IgG2a、和IgG1(B、D)响应和比(E)。
图12显示针对细胞表面表达的呼吸道合胞病毒(RSV)-A2蛋白的免疫球蛋白(Ig)G、IgG1和IgG2a响应的数据。如方法中所述地用RSV A2感染96孔培养板中的HEp-2细胞。将连续稀释的小鼠血清加到孔中。确定来自RSV-F病毒样颗粒(VLP)免疫(A、B)或用RSV-G VLP免疫(D、E)的小鼠的IgG、IgG2a和IgG1响应。还利用RSV A2感染的HEp-2细胞或未感染的对照通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定总IgG响应。在初免后第2周，从用RSV-F VLP(C)或RSV-G VLP(F)免疫的小鼠获得血清。
图13显示血清中和活性的数据。检验补体灭活的小鼠血清对呼吸道合胞病毒(RSV)-A2空斑形成的抑制。补体灭活连续稀释的加强后第3周的小鼠血清并与活的RSV-A2一起培养。稀释病毒并以750PFU/孔使用。
图14显示呼吸道合胞病毒(RSV)-A2攻击后肺病毒载量和体重变化的数据。实验重复两次。A，肺病毒载量。在攻击后第4天收集每组(6只小鼠)中来自单独小鼠的肺，并确定每只小鼠中的肺病毒载量(空斑形成单位[PFU]的数目)。病毒检测的限值是50PFU/mL。B，RSV-F与RSV-G病毒样颗粒(VLP)的肺病毒载量的比较。Y轴的刻度下段(lower scale)用于观察RSV-F与RSV-G VLP免疫之间的肺病毒载量差异。C，体重变化。用活的RSV-A2病毒攻击接种的小鼠(6只小鼠)。每天监测体重，其中在第0天观察到100%体重。
详细讨论
流感
现有的流感疫苗诱导针对HA和以较低程度针对NA蛋白的中和抗体，并对紧密匹配的病毒毒株是保护性的。然而突变的快速出现允许病毒躲避现存的抗流感免疫。高致病性禽病毒对人类的适应的可能性还增加了现有的流感疫苗策略的风险。
在某些实施方案中，本公开内容涵盖包括表位诸如流感M2蛋白的细胞外结构域(M2e)的流感候选疫苗的宽保护效力的使用。M2e在所有甲型流感病毒中是保守的。使用系统化方法以靶向M2e用于通用流感疫苗的开发。首先，通过用多个M2e肽(4.M2e)代替FliC的可变区来产生融合蛋白(4.M2e-tFliC)。第二，将来自流感HA的膜-锚（membrane-anchor）遗传附着到4.M2e-tFliC融合蛋白并将这一膜锚定形式掺入到M1衍生的VLP中。VLP作为免疫原在诱导强的免疫应答方面是有益的，因为它们模拟免疫系统逐步形成以攻击的病毒的结构。
HA胞质结构域包含引导包膜糖蛋白组装到M1衍生的VLP中的信号。可将具有HA膜-锚的融合蛋白掺入M1衍生的VLP中。将可以以颗粒形式递送M2e，并将在其天然外-膜-微环境（external-membrane-microenvironment）中展示。这使得能够使用FliC的颗粒形式(FliC VLP)作为佐剂以增强由多个M2e肽诱导的免疫应答。尽管串联重复的使用增加分子中靶表位的密度，可能的顾虑是，诱导的抗体响应可能不识别天然M2。Mozdzanowska等人,Vaccine2003;21(19-20):2616-26暗示，由多个M2e重复诱导的总抗体响应的平均10%与病毒感染的细胞表面的天然M2交叉反应。然而在本研究中已经发现，在合适的条件中，M2e诱导高水平的M2特异性免疫和针对致死剂量的活病毒攻击的完全保护。
由于FliC的可变区是高免疫原性的，缺失FliC的可变区或用M2e重复代替FliC的可变区的益处避免可能的抗体介导的其TLR5信号传导的中和。FliC的特有先天TLR5信号传导活性可将任何适合的外来B细胞决定簇转化为可能强的免疫原。
几种不同免疫途径已经被用于递送M2e衍生的抗原用于诱导保护性免疫。发现i.n.免疫与其他途径相比在诱导保护性免疫方面是有益的方法。用4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP i.n.免疫诱导高的系统免疫应答以及强的粘膜免疫，并赋予对活病毒攻击的更有效的保护，如由针对PR8或Philippines攻击的完全保护、和最少的体重减少证明的。而且，病毒复制被限制在肺中，如由较低肺病毒滴度揭示的。i.n.免疫刺激鼻咽相关的淋巴网状组织(NALT)，并诱导局部粘膜免疫。而且，已经发现可变区截短的鞭毛蛋白作为如以上讨论的粘膜佐剂是更有效的。这些观察结果提供以下发现的基础：特定M2e-tFliC融合蛋白还促进增强的粘膜免疫。
最令人惊讶的发现是，用i.n.施用的4.M2e加FliC VLP混合物免疫的小鼠实现最佳的免疫应答。
呼吸道合胞病毒(RSV)
在小鼠模型中，肌内接种后研究以病毒样颗粒形式产生的RSV疫苗的保护效力。VLP接种提供针对RSV感染的有效保护。RSV-F或RSV-G VLP引起显著水平的主要IgG2a的RSV特异性IgG抗体响应并显著减少攻击后的肺病毒复制和体重减少。
VLP靶向全长RSV融合F蛋白(RSV-F)和附着G糖蛋白(RSV-G)，它们具备中和表位以及多个T细胞表位。在VLP中使用流感M1蛋白而非RSV基质(M)作为核心蛋白，因为基质蛋白对于病毒粒子形态重要且RSV是比流感病毒更多形的。而且，在不存在NP和包膜糖蛋白共表达时一些副粘病毒M蛋白对于VLP形成不是足够的。RSV-F或RSV-G VLP显示球形的颗粒形状。从无血清的昆虫细胞rBV产生的VLP疫苗具有超过哺乳动物细胞中产生的VLP的益处，因为需要证实哺乳动物细胞产生的VLP不含源自细胞和/或血清的病毒或致癌物质。
已经报道，包含RSV-G蛋白的RSV VLP疫苗在小鼠模型中诱导保护。参见Murawski等人,J Virol 2010;84:1110-23。在这一报告中，使用了其中胞外域来自RSV G蛋白、但胞质和跨膜结构域和M蛋白来自新城疫病毒(NDV)的嵌合蛋白。未确定来自用这些VLP接种的IgG亚型响应。
现在公开的实验集中于VLP中的全长RSV-F或-G蛋白。RSV-G VLP比RSV-F VLP诱导更好的保护。RSV-F不要求其他病毒蛋白的融合活性并可在表达后经历融合前至融合后的触发。未预期某些实施方案被任何特定机制限制；然而，VLP表面的一些F可处于融合后形式是可能的，可能在攻击病毒上低呈现（underrepresented）。可选地，与哺乳动物细胞相比，RSV-F和/或-G在用于产生VLP的昆虫细胞中可以被差异糖基化，且G的低糖基化可使得免疫集中在保护表位（protectope）(例如，G的中心区)。RSV-F VLP将提供针对A和B亚组的RSV分离株的保护，而由RSV-G VLP引起的保护可以是更具亚组特异性的。在小鼠和棉鼠中，亚组混杂的保护是用F抗原免疫容易实现的，且用RSV G抗原通常观察到显著但部分的亚组混杂的保护。在抗原性亚组中，基于RSV G的高变羧基末端区的序列分析，RSV可被进一步分为进化枝（clade）。
开发了ELISA测定来通过利用细胞表面表达的RSV蛋白检测IgG、IgG2a和IgG1抗体。因为利用细胞表面RSV-A2蛋白作为结合抗原发现了抗体响应与保护的相关性，利用这一方法检测抗体可以更可靠并将有助于RSV疫苗研究。RSV-F和RSV-G VLP疫苗诱导非常高水平的IgG2a同种型响应和非常低水平的IgG1同种型响应。这是鼓舞人的，因为RSV攻击后增强的疾病被报告与Th2(IgG1)过敏症样或Th2相关响应相关。已经报告，F和G蛋白亚基RSV疫苗是弱免疫原性的并引起增强的肺组织病理学。与之相比，委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒(VRP)、以及表达RSV G的新城疫VLP，是更具免疫原性的、有效的，且不引起增强的RSV病。由于VLP中的RSV蛋白以重复性、颗粒病毒样结构展现，它们可以是高度免疫原性的并诱导保护性体液、细胞和粘膜免疫应答。
相信这是证明并比较由包含全长融合(F)或附着(G)糖蛋白的VLP引起的保护的首个报告。RSV-F或RSV-G VLP成功地抑制肺中的病毒复制并保护小鼠不受感染。RSV-F或RSV-G VLP是有希望的候选疫苗。
术语
如本文所用的，“鞭毛蛋白”是指鞭毛中的单体亚基，例如，鼠伤寒沙门氏菌中FliC和FljB、和嗜肺性军团病杆菌（L.pneumophila）中FlaA的鞭毛蛋白基因产物、或其变体、类似物、同源物、衍生物、片段或组合，诸如结构域或结构域中的多肽序列。通常，鞭毛蛋白单体包含D0、D1、D2和D3结构域。来自不同革兰氏阴性物种的氨基酸序列的比对显示氨基和羧基末端结构域中高程度的相似性。这些蛋白的中心区可以是相当趋异的。Smith,K.D.等人,Nature Immunol.(2003)4:1247-1253公开了，TLR5识别鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白(FliC)上由N末端残基78-129和135-173与C末端残基395-444构成的位点。术语“鞭毛蛋白”不预期限于任何特定氨基酸序列，只要其具有与已知鞭毛蛋白序列的一些同源性且分子保持刺激先天免疫应答的能力。已知鞭毛蛋白的先天免疫应答包括响应于TLR(包括TLR5)活化的细胞因子产生和响应于某些NLR(包括Ipaf)的半胱天冬酶-1活化和IL-lβ分泌。在某些实施方案中，设想鞭毛蛋白在序列中包括另外的氨基酸，诸如在融合或嵌合蛋白的情形中，只要这些蛋白继续影响包括TLR5介导的免疫应答、Ipaf介导的免疫应答或二者的先天免疫应答。还具体设想所述鞭毛蛋白的片段、变体、类似物、同源物、或衍生物、和其组合，只要这些分子继续影响包括TLR5介导的免疫应答、Ipaf介导的免疫应答或二者的先天免疫应答。鞭毛蛋白可从天然来源分离，通过合成或重组技术或其组合分离。
单独的沙门氏菌血清型通常在产生两种形式的鞭毛蛋白，称为1相和2相之间交替，各自由分别的结构基因FliC和FljB指定。鼠伤寒沙门氏菌的1相鞭毛蛋白(FliC)的氨基酸序列列在SEQ ID NO:12中，
MAQVINTNSL SLLTQNNLNKSQSALGTAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTANIKG 61 LTQASRNANDGISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELAVQSA NSTNSQSDLD SIQAEITQRL 121NEIDRVSGQT QFNGVKVLAQ DNTLTIQVGA NDGETIDIDL KQINSQTLGLDTLNVQQKYK 181 VSDTAATVTG YADTTIALDN STFKASATGL GGTDQKIDGDLKFDDTTGKY YAKVTVTGGT 241 GKDGYYEVSV DKTNGEVTLAGGATSPLTGG LPATATEDVK NVQVANADLT EAKAALTAAG 301VTGTASVVKM SYTDNNGKTI DGGLAVKVGD DYYSATQNKD GSISINTTKYTADDGTSKTA 361 LNKLGGADGK TEVVSIGGKT YAASKAEGHNFKAQPDLAEA AATTTENPLQ KIDAALAQVD 421 TLRSDLGAVQ NRFNSAITNLGNTVNNLTSA RSRIEDSDYA TEVSNMSRAQ ILQQAGTSVL 481 AQANQVPQNVLSLLR.
鼠伤寒沙门氏菌的2相鞭毛蛋白(FljB)的氨基酸序列列在SEQ ID NO：13中，
MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSALGTAIERLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTANIKG 61 LTQASRNAND GISIAQTTEGLNEINNNLQ RVRELAVQSA NSTNSQSDLD SIQAEITQRL 121 NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQ DNTLTIQVGA NDGETIDIDL KQINSQTLGL DSLNVQKAYD 181VKDTAVTTKA YANNGTTLDV SGLDDAAIKA ATGGTNGTAS VTGGAVKFDADNNKYFVTIG 241 GFTGADAAKN GDYEVNVATD GTVTLAAGATKTTMPAGATT KTEVQELKDT PAVVSADAKN 301 ALIAGGVDATDANGAELVKM SYTDKNGKTI EGGYALKAGD KYYAADYDEA TGAIKAKTTS361 YTAADGTTKT AANQLGGVDG KTEVVTIDGK TYNASKAAGHDFKAQPELAE AAAKTTENPL 421 QKIDAALAQV DALRSDLGAV QNRFNSAITNLGNTVNNLSE ARSRIEDSDY ATEVSNMSRA 481 QILQQAGTSV LAQANQVPQNVLSLLR.
鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白的F41片段的氨基酸序列列在SEQ ID NO：14中，
FTANIKGLTQ ASRNANDGIS IAQTTEGALNEINNNLQRVR ELAVQ SANST NSQSDLDSIQ61AEITQRLNEI DRVSGQTQFNGVKVLAQDNT LTIQVGANDG ETIDIDLKQI NSQTLGLDTL 121 NVQQKYKVSDTAATVTGYAD TTIALDNSTF KASATGLGGT DQKIDGDLKF DDTTGKYYAK 181VTVTGGTGKD GYYEVSVDKT NGEVTLAGGA TSPLTGGLPA TATEDVKNVQVANADLTEAK 241 AALTAAGVTG TASVVKMSYT DNNGKTIDGGLAVKVGDDYY SATQNKDGSI SINTTKYTAD 301 DGTSKTALNK LGGADGKTEVVSIGGKTYAA SKAEGHNFKA QPDLAEAAAT TTENPLQKID 361 AALAQVDTLRSDLAAVQNRF NSAITNLGNT VNNLTSAR.
鞭毛蛋白融合蛋白的氨基酸序列列在SEQ ID NO：15中，
MALTVNTNIA SLNTQRNLNN SSASLNTSLQ RLSTGSRINSAKDDAAGLQI ANRLTSQVNG 61 LNVATKNAND GISLAQTAEG ALQQSTNILQRMRDLSLQSA NGSNSDSERT ALNGEVKQLQ 121 KELDRISNTT TFGGRKLLDGSFGVASFQVG SAANEIISVG IGGGKLMIKL KFGVFFTVLL 181 SSAYAHGTPQNITDLCAEYH NTQIHTLNDK IFSYTESLAG KREMAIITFK NGATFQVEVP 241GSQHIDSQKK AIERMKDTLR IAYLTEAKVE KLCVWNNKTP HAIAAISMAN.
鞭毛蛋白的多肽片段包括
SEQ ID NO：16，GALNEINNNLQRVRELAVQ SANSTNSQS DLDSIQAE ITQ；SEQ ID NO：17，TQFSGVKVLAQDNTLTIQVGANDGET IDIDLKQINS QTLGLDTL；SEQ ID NO：18，EGALNEINN NLQRVRELA VQSANSTNS QSDLDSIQAEITQRLNEIDRVNG；SEQID NO：19，MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANF TANIKGLTQA SRNANDGISI AQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQS；SEQ ID NO：20，LQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNL；SEQ ID NO：21，TLRSDLGAVQN RFN SAITN LGNTVNN LSS；和SEQ ID N O：22，EQAAKTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSS.
鞭毛蛋白的片段的组合包括
SEQ ID NO：23，MetArg Gly SerHis His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thrl Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp LeuTyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser LeuLeu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu SerSer Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg PheThr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile AlaGln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu LeuSer Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser Ile Gln Asp Glu IleGln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys ValLeu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr IleAsp Leu Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Ser Pro GlyIle Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Leu Asp Ser Met Gly Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala AlaAla Ala Lys Lys Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val AspAla Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Thr Asn Leu GlyAsn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr GluVal Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln AlaAsn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg.
这一蛋白还称为CBLB502(AA’)，如在通过引用特此并入的美国公布的专利申请号2009/0011982中提供的。CBLB502目前处于治疗急性辐射综合征(ARS)的临床研究中。
如本文所用的，“RSV G”蛋白或类似术语是指附着RSV糖蛋白G和其所有已知的变体或实质片段。一个实例是MSKNKDQRTA KTLERTWDTL NHLLFISSCL YKLNLKSVAQ ITLSILAMIISTSLIIAAII 61 FIASANHKVT PTTAIIQDAT SQIKNTTPTY LTQNPQLGISPSNPSEITSQ ITTILASTTP 121 GVKSTLQSTT VKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQRQNKPPSKPN NDFHFEVFNF VPCSISNNP 181 TWAIKRIP NKKPGKKTTTKPTKKPTLKT TKKDPKPQTT KSKEVPTTKP TEEPTINTTK 241 TNIITTLLTSNTTGNPELTS QMETFHSTSS EGNPSPSQVS TTSEYPSQPS SPPNTPRQ(SEQ ID NO：88)。其他实例包括由以下登录号指定的那些：P03423.1、P27022.1、AA51765.1、AAD02944.1、AA83874.1、AAD02941.1、AA83870.1、P27021.1、AEO45938.1、AA51761.1、AA83871.1、AAU43727.1、AEO45918.1、AEO45888.1、AEO45878.1、AEO45849.1、AEC32086.1、AEQ98767.1、AEQ63333.1、CAA83875.1、AEO45908.1、AEO45948.1、AEO45898.1、AEO45928.1、AAC36327.1、ACO83296.1、AEO45829.1、AEQ66845.1、ACI03570.1、AEO45868.1、P20895.2、AAD02943.1、AAX23993.1、AEQ66853.1、AEO45839.1、AEJ87998.1和AEJ88006.1。术语“RSV G”不预期限于任何特定氨基酸序列，只要其与已知RSV G序列具有大致同源性。涵盖可选的糖基化。在某些实施方案中，已知的RSV G序列具有2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代，或多肽的N或C末端上2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸已被缺失。在某些实施方案中，设想RSV G在序列中包括另外的氨基酸，诸如在融合或嵌合蛋白的情形中。在某些实施方案中，变体可包含保守的氨基酸取代或用常见的化学基团诸如保护基或卤素获得的衍生物。在某些实施方案中，片段是250至200、200至150、150至100、100至50、或25个氨基酸。
如本文所用的，术语“佐剂分子”包括能够在宿主中引发免疫应答的细菌表面蛋白。特别是，术语包括能够靶向宿主Toll样受体(TLR)蛋白的细菌表面蛋白，诸如但不限于，靶向宿主TLR5蛋白的细菌鞭毛蛋白。在特定实施方案中，佐剂分子是佐剂分子的“膜锚定形式”，这表示佐剂分子已被工程化以包括信号肽(SP)和膜锚定序列以指导蛋白的运输和膜定向。如此，在实施方案中，佐剂分子的膜锚定形式是包括融合于SP的细菌蛋白(诸如细菌鞭毛蛋白)的部分和膜锚序列的重组蛋白。
如本文所用的术语“病毒样载体”是指病毒样颗粒、病毒核蛋白颗粒（virosome）、或二者。
如本文所用的术语“病毒样颗粒”(VLP)是指具有病毒包膜蛋白的膜包围的病毒核心结构。此外，佐剂分子可在VLP上表达。而且，病毒核心蛋白位于VLP的膜内。如本领域已知的，VLP的另外组分，可被包含在VLP内或布置在VLP上。VLP通常不包含完整病毒核酸，且它们是非感染性的。
如本文所用的术语“病毒核蛋白颗粒”是指与病毒样颗粒类似的病毒样载体，除了病毒核蛋白颗粒不包含病毒核心蛋白。
“截短的”病毒表面包膜糖蛋白是具有少于全长蛋白(例如，胞质结构域的一部分已被去除)的病毒表面包膜糖蛋白，它保留针对其产生免疫应答、优选地保护性免疫应答的表面抗原决定簇，且它保留足够的包膜序列用于适当的膜插入。熟练技术人员可利用公众容易获得的重组DNA技术和病毒编码序列制备截短的病毒包膜蛋白。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”是指通过偶联氨基酸残基产生的分子，即氨基酸序列。这些序列从氨基向羧基末端从左至右的方向书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列由三字母或单字母编码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(GIn，Q)、谷氨酸(GIu，E)、甘氨酸(GIy，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(lie，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(VaI，V)。
“变体”是指与参考多肽或多核苷酸不同、但保持基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一、参考多肽不同。通常，差异是有限的，从而参考多肽与变体的序列总体上紧密相似(同源)、且在一些区域中相同。变体和参考多肽可在氨基酸序列方面依据一个或多个修饰(例如，取代、添加、和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或可以是已知非天然存在的变体。
可对本公开内容的多肽结构进行修饰和改变并仍产生具有与多肽相似的特征的分子(例如，保守氨基酸取代)。例如，序列中某些氨基酸可被其他氨基酸取代，而没有活性的显著丧失。由于多肽的相互作用能力和性质决定多肽的生物功能活性，可在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代而获得具有类似特性的多肽。
在进行此类改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用的生物功能中的重要性是本领域一般理解的。已知某些氨基酸可被具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸取代并仍产生具有类似生物活性的多肽。基于其疏水性和电荷特征，每个氨基酸已被分配亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
认为氨基酸的相对亲水特征决定所得多肽的二级结构，其转而界定多肽与其他分子诸如酶底物、受体、抗体、抗原等等的相互作用。本领域已知，氨基酸可被具有类似亲水指数的另一氨基酸取代并仍获得功能上相当的多肽。在此类改变中，亲水指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是尤其优选的，且在±0.5内的那些是甚至更尤其优选的。
相似氨基酸的取代还可基于亲水性进行，尤其是当从而产生的生物功能上相当的多肽或肽预期用于免疫实施方案中时。以下亲水性值已被分配于氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0)、谷氨酸(+3.0)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5)、苏氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、和色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可被具有类似亲水性值的另一氨基酸取代并仍获得生物相当的、且尤其是免疫相当的多肽。在此类改变中，亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是尤其优选的，且在±0.5内的那些是甚至更尤其优选的。
如以上概述的，氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑到一个或多个上述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并包括但不限于(最初残基:示例性取代):(Ala.GIy,Ser)、(Arg Lys)、(Asn.GIn,His)、(Asp:GIu1Cys,Ser)、(GIn.Asn)、(GIu.Asp)、(GIy.Ala)、(His.Asn,GIn)、(lie Leu,VaI)、(Leu:lie,VaI)、(Lys:Arg)、(Met:Leu,Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp,Phe)、和(VaI-lie,Leu)。如此，本公开内容的实施方案涵盖如以上列出的多肽的功能或生物等价物。具体地，多肽的实施方案可包括与目标多肽具有约50%、60%、70%、80%、90%和95%序列同一性的变体。本文使用的术语“大致上同源”表示与参考序列具有约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、和优选地约95%序列同一性的本公开内容的多肽。序列同一性百分比通过以上讨论的常规方法确定。一般，本公开内容的同源多肽通过具有一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或添加来表征。
如本领域已知的“同一性”，是两个或多个多肽序列之间的关系，如通过比较序列确定的。在本领域中，“同一性”还是指多肽之间序列亲缘关系的程度，如通过此类序列串之间的匹配确定的。“同一性”和“相似性”可通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于以下资料中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编著,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I1 Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana Press,New Jersey,1994，Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48.1073,(1988)。设计确定同一性的优选方法以得出所测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被整理在公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可通过利用合并有Needelman&Wunsch(J MoI Biol,48443-453,1970)算法的分析软件(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,Madison,Wis)(例如NBLAST和XBLAST)确定。使用缺省参数确定本公开内容的多肽的同一性。通过示例，多肽序列可以与参考序列相同，即100%相同，或其可包括与参考序列相比达到某一整数的氨基酸改变，使得%同一性小于100%。此类改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，且其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方，在参考序列中氨基酸之间单独地散布，或以参考序列中一个或多个连续基团散布。对于给定%同一性的氨基酸改变数目通过如下确定：将参考多肽中氨基酸的总数乘以各自同一性百分比(除以100)的数字百分比，且然后从所述参考多肽中氨基酸的总数减去该乘积。
保守氨基酸变体还可包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基-甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷胱甘肽、哌可酸、噻唑烷羧酸、二氢脯氨酸（dehydroprohne）、3-和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯基-丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。本领域已知将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白的几种方法。例如可采用体外系统，其中利用化学氨基酰化的抑制型tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌（E coli）S30提取物和市售可得的酶和其他试剂的无细胞系统中进行。蛋白通过色谱纯化(Robertson等人,J Am Chem Soc,113 2722,1991，Ellman等人,Methods Enzymol,202 301,1991，Chung等人,Science,259 806-9,1993，和Chung等人,Proc Natl Acad Sci USA,90 10145-9,1993)。在第二种方法中，通过微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制型tRNA，在爪蟾卵中进行翻译(Turcatti等人,J Biol Chem,271 19991-8,1996)。在第三种方法中，在将被代替的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在和在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸被掺入蛋白中代替其天然对应物(Koide等人,Biochem,33 7470-6,1994)。天然存在的氨基酸残基可通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可与定点诱变组合以进一步扩展取代范围(Wynn等人,Protein Sci,2 395-403,1993)。
此外，除非上下文另外要求，否则术语肽、多肽和蛋白可互换地使用，是指其中氨基酸残基被共价肽键或替代地(其中翻译后加工已经去除了内部区段)被共价二硫键等连接的氨基酸。氨基酸链可以是任何长度并可包括至少两个氨基酸，所述氨基酸链可包括蛋白的结构域或全长蛋白。除非另外指出，否则术语肽、多肽和蛋白还涵盖其多种修饰形式，包括但不限于糖基化形式、磷酸化形式、等等。
“施用”是指引入本公开内容的组合物(例如，疫苗、佐剂或免疫原性组合物)到受治疗者。可使用任何施用途径，诸如口服、局部、皮下、腹膜、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻、引入脑脊液、或滴注到身体部位。
“免疫原性组合物”是当注射到受治疗者中时导致特定抗体产生或细胞免疫的组合物。此类免疫原性组合物或疫苗可用于，例如，针对感染和/或病毒引起的损伤的免疫。
“免疫原性量”是指在已经施用疫苗的宿主中能够引发针对病毒的抗体产生的量。优选地，设计施用途径和免疫原性组合物以优化粘膜表面的免疫应答，例如，利用免疫原性组合物的鼻施用(经由气雾剂)。
本文使用的术语“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于动物或人类时不产生不利的、过敏或其他不适当的反应的分子实体和组合物。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指任何载体、赋形剂、稀释剂、佐剂或载运体，诸如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等。此类介质和剂用于药学活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则设想了其在治疗组合物中的使用。附加的活性成分也可被掺入组合物中作为适当的治疗组合。本文使用的术语“受治疗者”包括人类、哺乳动物(例如，猫、犬、马、等等)和家畜。本公开内容的实施方案可施用的典型受治疗者将是哺乳动物、尤其是灵长类，特别是人类。对于兽医应用，宽范围的受治疗者将是适合的，例如，家畜诸如牛（cattle）、绵羊、山羊、奶牛（cow）、猪、等等，家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡、等等，和家养动物特别是宠物诸如犬和猫。
术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”是用于获得有益或期望临床结果的方法。为了本公开内容的实施方案的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于，症状的减轻、疾病程度的减少、疾病的稳定(例如，不恶化)、阻止疾病的蔓延、延迟或减慢疾病发展、疾病状态的改善或缓和、和可检测或不可检测的减轻(部分或全部)。此外，“治疗（treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”还可表示与未接受治疗的预计存活相比延长的存活。
实验
细胞系和病毒
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9细胞如通过引用特此并入的Wang等人,J Virol,2008,82(23):11813-23中所述地维持。将Madin-Darby犬肾(MDCK，ATCC号PTA-6500)细胞在Dulbecco最小必需培养基(DMEM,Cellgro)加10%胎牛血清(FBS)中培养。小鼠适应的流感A/PR/8/34(H1N1)和A/Philippines/2/82/X-79(H3N2)病毒如通过引用特此并入的Quan等人,JVirol 2007;81(7):3514-24中所述地制备。这些毒株的LD50(引起50%死亡的致死剂量)通过用连续的病毒稀释液感染小鼠来确定。将RAW264.7(ATCC号TIB-71)细胞在DMEM加10%FBS中培养。
膜锚定的鞭毛蛋白基因的构建
全长膜锚定的鞭毛蛋白编码基因通过分别符合读框地融合来自蜜蜂蜂毒肽蜂毒肽的信号肽(SP)MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPINMTGS(SEQ ID NO:26)和来自甲型流感病毒PR8血凝素(HA)的跨膜(TM)和胞质尾(CT)区的编码序列于鞭毛蛋白基因的5′和3′末端来产生。流感病毒HATM是DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWAC(SEQ ID NO:24)且CT是QKGNIRCNICI(SEQ ID NO:25)。显示用来自蜜蜂蜂毒肽的信号肽(SP)取代HIV Env信号肽(SP)促进HIV-1gp120在昆虫细胞中较高水平的表达和分泌。发现用源自小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)包膜糖蛋白、流感病毒血凝素或杆状病毒(BV)gp64的序列取代HIV TM-CT增强Env向VLP中的掺入。
如在通过引用特此并入的Wang等人,J.Virol.,2007,81:10869-10878中所描述的，蜂毒肽SP-编码片段通过使用引物5′-GGTTCTAGAATGAAATTCTTAGTC-3′(SEQ ID NO:2)和5′-GTGGGATCCTTTCATGTTGATCGG-3′(SEQ ID NO:3)(XbaI和BamHI位点)从质粒M-TM.CTMMTV PCR扩增并克隆到带有XbaI/BamHI位点的克隆载体pBluescript(–)中，产生质粒pBluescript-SP。肠沙门氏菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium）鞭毛蛋白基因(fliC;GenBank登录号D13689)通过使用引物5′-GCAGGATCCATGGCACAAGTCAT-3′(SEQ ID NO:4)和5′-CGCGAATTCACGCAGTAAAGAGAG-3′(SEQ ID NO:5)从质粒pEM045pEF6 FliC stop(来自Alan Aderem,Institute of Systems Biology,Seattle,WA的惠赠)扩增并插入到pBluescript-SP中，产生pBluescript-SP-FliC。HATM-CT通过使用引物5′-GCTAGAATTCCAGATTCTGGCGATC-3′(SEQ IDNO:6)和5′-GCTAGGGCCCTTATCAGATGCATATTCT-3′(SEQ ID NO:7)从包含全长HA基因的质粒pc/pS1扩增并克隆到pBluescript-SP-FliC中，产生pBluescript-SP-FliC-HA尾。全长膜锚定的鞭毛蛋白基因通过使用引物5′-GCTCGTCGACATGAAATTCTTAG-3′(SEQ ID NO:8)和5′-GCTACTCGAGTTATCAGATGCATATTC-3′(SEQ ID NO:9)从pBluescript-SP-FliC-HA尾扩增并克隆到pFastBac1中处于多角体蛋白启动子的控制下。膜锚定的鞭毛蛋白基因的序列通过DNA测序证实。
编码M2e的4个重复(4.M2e)和包含4.M2e的融合蛋白的基因的构建
编码共有序列M2e(SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP)(SEQ IDNO:1)的单独重复和柔性接头序列(AAASLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPAAGTSAAASLLTEVETPIRNEW GSRSNDSSDPAAALQAAASLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPAAAACAAASLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPAAAACKL)(SEQ ID NO:11)的四个DNA片段通过引物延伸PCR产生，并连接在一起以产生编码4.M2e的基因。M2e在位点17和19包含两个半胱氨酸残基SLLTEVETPIRNEWGCRC NDSSDP(SEQ ID NO:10)。因为这些半胱氨酸可导致分子内二硫键的形成和氧化条件下颗粒的聚集，用两个丝氨酸残基代替M2e中的两个半胱氨酸残基。为了产生编码其中FliC的可变区被4.M2e代替的融合蛋白的基因，从Fli基因(fli，GenBank登录号D13689，来自Dr.Alan Aderem的惠赠)缺失编码可变区(Fli中的AA 177-401)的DNA片段，并通过重叠PR用4.M2e编码序列代替该DNA片段。将N末端蜂毒肽信号肽(SP)和末端组氨酸(His)标签编码序列符合读框地添加至以上融合构建体用于蛋白产生和纯化。此外，4.M2e-Fli构建体的膜锚定形式通过符合读框地添加流感HA(A/PR8)膜-锚编码序列到4.M2e-Fli编码基因的C末端来产生，如通过引用特此并入的Wang等人，J Virol，2008，82(23)：11813-23中公开的。构建体的完整性通过DNA测序证实。
带有HA跨膜/胞质结构域的截短的鞭毛蛋白的DNA序列。
TGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGGACCCGATCAACATGACCGGATCCATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGGGCGCGCCGGTCTACCCGTATGACGTGCCGGACTACGCGTCGCCATGGACAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCTGCTTTGGCACAGGTTGACACGTTACGTTCTGACCTGGGTGCGGTACAGAACCGTTTCAACTCCGCTATTACCAACCTGGGCAACACCGTAAACAACCTGACTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTGAATTCGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGATAA(SEQ ID NO：27)
带有HA跨膜/胞质结构域的截短的鞭毛蛋白的蛋白序列。
MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPINMTGSMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVGAPVYPYDVPDYASPWTTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLREFGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO：28)
蛋白纯化
将以上基因克隆到转移载体pFastBac-1(Invitrogen)中并利用Bac-to-Bac昆虫细胞蛋白表达系统(Invitrogen)根据制造商的说明用于产生重组杆状病毒(rBV)。利用镍亲和性色谱(Qiagen)通过按照制造商的说明纯化加His标签的4.M2e和4.M2e-tFliC。通过离心(8000rpm，20min)澄清用表达以上蛋白的rBV感染的Sf9细胞培养物。从上清液纯化蛋白，对PBS透析并储存在-80℃。
鞭毛蛋白VLP产生
表达膜锚定的4.M2e-tFliC的重组BV如上所述地产生。表达膜锚定的FliC和M1的重组BV描述在通过引用特此并入的Wang等人，J Virol，2008，82(23)：11813-23中。4.M2e-FliC VLP通过分别以感染复数(MOI)6和3用表达膜锚定的4.M2e-FliC和M1的rBV共感染sf9细胞产生。当通过蛋白质印迹利用纯化的4.M2e作为标准时，4.M2e-tFliC VLP中的M2e含量是1.5％。FliC VLP通过以MOI6和3用表达FliC和M1的rBV共感染sf9细胞来产生。通过利用Quixstand Benchtop系统(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)的多孔纤维过滤、随后蔗糖密度梯度超速离心，从感染后60h的Sf9细胞培养物的上清液浓缩VLP。VLP通过蛋白测定、蛋白质印迹、无菌度测定(sterility assay)和电镜法(EM)表征。负染VLP用于EM观察。
TLR-5特异性生物活性测定
利用基于RAW264.7细胞的测定评价以上包含FliC的融合蛋白和VLP的TLR5结合活性。可溶性FliC用作阳性对照。仅包含M1的VLP用作阴性对照。用含10%FBS的DMEM培养基以10倍步幅将所有蛋白或VLP从10μg/ml稀释到0.001ng/ml。用这些稀释的蛋白或VLP溶液处理细胞培养物。处理24h后，收集细胞培养物上清液。TLR5阳性和阴性细胞培养物中被以上VLP的融合蛋白刺激的肿瘤坏死因子α(TNF-α)产生的水平通过ELISA利用TNF-α测定试剂盒(eBioscience,San Diego,CA)按照制造商的说明确定。TLR5生物活性展示为TLR5阳性细胞中TNF-α产生的水平减去TLR5阴性细胞中TNF-α产生的水平。
免疫和攻击
将六只近交的雌性BALB/c小鼠(来自Charles River Laboratory)的组用融合蛋白或M2e VLP以如表1中所示的剂量通过肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)途径以4周间隔免疫三次。初免免疫前1周收集血清样品作为免疫前血清。最后一次免疫后4周收集免疫血清和肺灌洗液样品。通过眼窝后网状组织穿刺收集血液样品。对于病毒攻击，通过吸入异氟烷轻微麻醉小鼠，并将25μl PBS体积中的5LD50小鼠适应的PR8或Philippines病毒施用到小鼠鼻孔中。持续15天每天监测小鼠体重和存活。在感染后第4天处死感染小鼠的组以确定肺病毒载量。确定肺病毒滴度。
抗体响应
血清M2e特异性IgG端点滴度通过ELISA确定。在4℃用100μl碳酸盐缓冲液(pH9.4,5μg/ml)中M2e肽(17个氨基酸，2至18，SLLTEVETPIRNEWGCR(SEQ ID NO:89)，在Emory University BiochemicalCore Facility合成)包被96孔ELISA板(Nunc Life Technologies)过夜。以两倍步幅连续稀释血清样品。提供两倍于无稀释的无处理组的OD450的最高稀释标为抗体端点滴度。利用细胞表面ELISA确定血清M2特异性抗体水平。将96孔培养板中的MDCK细胞生长到接近90%汇合，且然后用PR8病毒以MOI 1(5×104pfu)感染。生长12h后，洗涤板并在4℃用0.5%戊二醛固定细胞30min。用PBS洗涤三次后，将测试血清的连续稀释加入孔并在室温培养2h。结合未感染的MDCK细胞的抗体作为背景被减去。M2特异性抗体水平展示为OD450的值。
对于确定粘膜抗体水平，如以上对血清IgG描述的，利用HRP共轭的兔抗小鼠IgA作为二抗评价免疫的小鼠的肺灌洗液的IgA和IgG端点滴度。
融合蛋白的纯化和VLP的产生
重复性形式的M2e是免疫原性的。发现附着于鼠伤寒（typhimurium）II相鞭毛蛋白fljB的C末端的4.M2e的融合蛋白在诱导抗M2免疫方面在数量和品质上优于M2e。Huleatt等人,Potent immunogenicity and efficacy ofa universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusionprotein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin.Vaccine2008;26(2):201-14。产生编码共有序列M2e肽(图1中的上图)的DNA片段。还构建了加组氨酸(His)标签的融合蛋白4.M2e-tFliC(图1中的下图)，其中FliC的可变区被4.M2e代替，且在基于BV的蛋白表达系统中从sf9细胞培养物产生该融合蛋白。还构建加his标签的4.M2e并纯化作为对照。
为了进一步改进M2e的免疫原性，构建膜锚定的融合蛋白4.M2e-tFliC基因(图1中的下图)并掺入流感M1衍生的VLP中，如图2A中示例的。VLP的完整性通过电镜法证实(图2B)。VLP中膜锚定的4.M2e-tFliC的掺入通过蛋白质印迹测定利用抗FliC抗体(图2C中的泳道1)或抗M2e抗体(14C2，图2D中的泳道1)证实。产生FliC/M1VLP作为对照。FliC向FliC/M1VLP中的掺入通过蛋白质印迹利用抗FliC抗体(图2C中的泳道2)或抗M1抗体(图2E)证实。
因为TLR5是鞭毛蛋白的细胞外传感器，确定了可溶性M2e-tFliC融合蛋白或VLP中膜锚定的融合蛋白作为TLR5配体起作用的能力。如图2F中所示的，包含FliC的融合蛋白或VLP显示TLR5特异性生物活性，诱导小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7产生0.01ng至1000ng/ml浓度范围的TNF-α。4.M2e-tFliC的50%有效浓度(产生最大活性的50%的浓度，EC50)是5ng，且4.M2e-tFliC VLP的50%有效浓度是60ng。可溶性鞭毛蛋白的EC50是0.8ng/ml。考虑到可溶性FliC具有比融合蛋白或VLP低得多的分子量，EC50滴度在预计范围内。
4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP诱导高的IgG响应
为了评价多种包含M2e的融合蛋白或VLP作为通用流感疫苗的潜力，以4周的间隔用表1中所示的剂量免疫小鼠组(每组中6只小鼠)三次。通过肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)免疫比较免疫应答。图3A中的结果显示，融合蛋白和VLP组二者通过i.m.或i.n.途径触发牢固的针对M2e的体液应答，与之相比4.M2e组显示非常低的血清IgG响应。i.m.和i.n.免疫的血清IgG滴度分别是6.5×105和4.0×105。有趣的观察结果是，可溶性4.M2e蛋白当用鞭毛蛋白VLP作为佐剂时诱导较高水平的血清IgG滴度(对于i.m 8.2×105，对于i.n 6.4×105，几何平均值)，证明颗粒形式的FliC的佐剂作用。
表1.免疫的小鼠组.
i.m.,肌内；i.n.,鼻内.
以4周间隔进行三次免疫。
尽管4.M2e-tFliC融合蛋白或其在VLP中的膜锚定形式诱导高水平的M2e特异性抗体响应，只有能够靶向天然四聚M2的抗体可赋予保护。流感病毒感染的MDCK细胞在细胞膜上表达高水平的M2并可用于确定M2特异性抗体结合。因此通过基于MDCK细胞的ELISA评价与天然M2蛋白结合的抗体。如图3B中所示的，ELISA中，免疫血清中的抗体识别并结合在MDCK细胞表面表达的M2。来自4.M2e肽免疫的小鼠的血清显示非常低的结合，接近背景。4.M2e加FliC VLP的混合物诱导最高的M2特异性抗体响应。
相比之下，i.m.免疫比i.n.途径诱导更好的系统免疫应答。所有组中对细胞表面M2的抗体-结合水平显示与M2e特异性IgG滴度的相似性，证明M2e特异性抗体赋予M2识别并与对天然M2的结合相关。
4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP诱导增强的粘膜免疫应答
呼吸道是流感病毒感染和复制的主要位置。有效的粘膜抗体响应可阻止呼吸道中病毒感染的开始。已经报道缺失可变区的FliC是有效的粘膜佐剂。Nempont等人,J Immunol,2008,181(3):2036-43。图4中的结果显示，在i.n.免疫后4.M2e-tFliC融合蛋白和VLP二者在呼吸分泌物中诱导较高滴度的分泌型IgA(sIgA,图4A)和IgG(图4B)。数据还证明，包含鞭毛蛋白的VLP当与4.M2e混合时作为粘膜佐剂非常有效，在粘膜表面诱导高滴度的sIgA(3.2×104)和IgG(8×104)响应。这些数据证明，鞭毛蛋白当与M2e抗原在融合蛋白或VLP、或M2e和FliC VLP的混合物中联合时作为粘膜佐剂是有效的。
4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP的保护效力的宽度
以上结果证明，M2e的免疫原性通过插入4.M2e到FliC中代替可变区，或通过组装膜锚定的4.M2e-tFliC到VLP中被增强。为了确定以上候选疫苗是否赋予对流感病毒攻击增强的保护，用5LD50(250pfu)小鼠适应的A/Philippines(H3N2)病毒i.n.攻击免疫的小鼠，所述病毒中M2e具有与用于制备融合蛋白或VLP的共有序列相同的序列(图1)。而且，这一序列是人类流感病毒毒株中最常见的序列。如图5中所示的，五组(i.n.递送的4.M2e-tFliC融合蛋白、i.m.和i.n.二者递送的4.M2e-tFliC VLP、和4.M2e加FliC VLP的混合物)免疫的小鼠完全幸免于Philippines病毒攻击(图5A)。用4.M2e和FliC VLP的混合物免疫的小鼠体重失去较少(i.n.和i.m.免疫分别是8%和10%，图5B)，揭示最佳的相当保护。用4.M2e-tFliC VLP和4.M2e-FliC融合蛋白i.n.免疫的小鼠分别失去其体重的12%和17%(图5B)。攻击中用4.M2e-tFliC融合蛋白i.m.免疫的小鼠存活67%(6只小鼠中4只，图5A)，具有20-25%体重减少(图5B)。用4.M2e蛋白i.n.或i.m.免疫的小鼠，以及未处理小鼠，达到其端点(图5A和B)。
进一步评价由4.M2e-tFliC融合蛋白或VLP诱导的针对A/PR8病毒攻击的保护。这一研究中使用的PR8M2的M2e序列具有与共有序列的一个氨基酸差异，且没有其他人类流感病毒共有这一M2e序列。最后一次免疫后四周，用5LD50(125pfu)剂量的小鼠适应的PR8活病毒i.n.感染小鼠。鼻内免疫的小鼠显示针对PR8攻击的完全保护(图6A)。一些i.m.免疫的小鼠存活，除了4.M2e肽加FliC VLP的混合物(图6A)，其通过i.n.或i.m.免疫诱导完全保护。
以上攻击结果的一个共同特征是，i.n.免疫在针对流感病毒感染提供保护方面有效的多。如图5中所示的，i.n和i.m.递送的4.M2e-tFliC融合蛋白分别诱导针对Philippines病毒攻击的100%和67%(6只小鼠中4只)的保护。用4.M2e-tFliC VLP i.n.免疫的小鼠幸免于Philippines和PR8攻击二者，但i.m.免疫的小鼠的17%(6只中1只)在PR8攻击后终止(图6A)。尽管以4.M2e和FliC VLP的混合物i.m.和i.n.免疫的小鼠在Philippines或PR8病毒攻击中分别100%存活，i.n.免疫的小鼠体重失去较少，如图5B和6B中所示的。在所有以上免疫的小鼠中，i.m.免疫比i.n免疫诱导更高滴度的血清M2特异性IgG响应，如图3中所示的，但i.n.接种诱导更好的保护，证明粘膜免疫在M2e引起的保护性免疫方面的益处。
由于M2e特异性抗体不中和流感病毒的感染性而是相反在感染的细胞水平施加其保护作用，进一步评价了4.M2e-tFliC或VLP在减少小鼠肺中病毒复制的作用。如图7中所示的，所有存活的组都具有对于PR8攻击低于1×104、或对于Philippines攻击低于1×105的肺病毒载量。i.n.免疫的小鼠显示比i.m.组低的肺病毒滴度，进一步证明粘膜免疫的益处。
表达RSV F、RSV G和流感M1的rBV的构建
通过PCR扩增来自RSV毒株A2的RSV-F和RSV-G基因，并通过RT-PCR用包含限制性酶位点的引物扩增流感M1基因。将基因克隆到pFastBac载体中，且RSV-F、RSV-G和流感M1在pFastBac表达载体中的插入通过用酶位点EcoRI和XhoI切割来证实(图8A–C)。通过DNA测序发现RSV-F、RSV-G和流感M1基因的核苷酸序列与此前公布的序列(登录号对于F是FJ614814、对于G是AF035006、对于M1是FJ966085，所有都通过引用特此并入)相同。
利用来自感染的HEp-2细胞的RNA聚合酶链式反应(PCR)-扩增RSVA2F和G基因，如通过引用特此并入的Moore等人,A chimeric A2 strain ofrespiratory syncytial virus(RSV)with the fusion protein of RSV strain line 19exhibits enhanced viral load,mucus,and airway dysfunction,J Virol,2009,83:4185–94中所述的。通过使用引物5-AAAGAATTCACCATGGAGGAGTTGCTAATCCTCAA-3(SEQ ID NO:82)和5-TTACTCGAGTTAGTTACTAAATGCAATATTATT-3(SEQ ID NO:83)(EcoRI和XhoI加下划线)从A2F的互补DNA(cDNA)克隆PCR扩增RSF-F基因，并克隆到带有EcoRI/XhoI位点的pFastBac中，产生质粒pFastBac-F。通过使用引物5-AAAGAATTCACCATGTCCAAAAACAAGGACCAAC-3(SEQ ID NO:84)和5-TTACTCGAGTACTGGCGTGGTGTGTTG-3(SEQ ID NO:85)(EcoRI和XhoI加下划线)从A2G的cDNA克隆PCR扩增RSV-G基因，并克隆到带有EcoRI/XhoI位点的pFastBac中，产生质粒pFastBac-G。
对于流感M1基因克隆，将A/California/04/2009病毒接种到MDCK细胞中并利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取总病毒RNA。对提取的病毒RNA利用One-Step RT-PCR系统(Invitrogen)用基因特异性寡核苷酸引物进行逆转录(RT)和PCR。以下引物对用于M1:5-AAAGAATTCACCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3(SEQ ID NO:86)和5-TTACTCGAGTTACTCTAGCTCTATGTTGAC-3(SEQ ID NO:87)(EcoRI和XhoI加下划线)。RT-PCR后，将包含M1基因的cDNA片段克隆到pFastBac载体中。
产生表达RSV F、RSV G或流感M1的重组杆状病毒(rBV)。包含以上基因的DNA的转染利用cellfectin II(Invitrogen)以SF9细胞按照制造商建议的实现，随后用白/蓝筛选包含RSV-F或RSV-G或M1的pFastBac的转化。通过利用Bac-to-Bac表达系统(Invitrogen)按照制造商的说明衍生得到rBV。
RSV VLP的产生
通过用表达RSV-F和M1的rBV感染Sf9细胞产生RSV-F VLP。通过用表达RSV-G和M1的rBV感染Sf9细胞产生RSV-G VLP。感染后第2天，在4℃以6000rpm离心20分钟收集细胞培养物上清液。用QuixStand(GE)浓缩VLP并以30000rpm持续1小时经过20%-30%–60%不连续蔗糖梯度纯化。收集30%和60%之间的VLP条带，且然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释并在4℃以28000rpm成团40分钟。在4℃在PBS中重悬VLP过夜。
F或G和M1向VLP中的掺入通过蛋白质印迹利用抗RSV或抗M1多克隆抗体证实(图8D和E)。RSV-F或RSV-G VLP二者显示球形形状，在其表面带有刺突(图9A和C)。RSV F VLP在80–100nm中具有尺寸分布的峰，而G-VLP是类似的，但在尺寸上略微更异质(图9B和D)。总共获得5–7.5mg VLP/升的细胞培养介质，且其抗原特性在-80℃持续1年稳定。热处理的VLP丧失免疫原性和保护能力。
免疫血清中的抗体响应
在用RSV-F或RSV-G VLP免疫的小鼠中确定血清抗体响应，如图10A中所示的。确定初免和加强后血清中对RSV特异性的总IgG、IgG2a和IgG1抗体响应的水平。来自用RSV-F VLP免疫的小鼠的总IgG和IgG2a响应在加强后显示比初免后显著更高的滴度，指示病毒特异性抗体的渐进的成熟(图10B和C)。在初免和加强后都观察到低的IgG1响应(图10D)。相比之下，IgG2a抗体的水平与IgG1相比在初免后和加强后都显著增加。在多种血清稀释下，IgG2a的水平在加强后比初免后高(图10E)。在用RSV-G VLP免疫的小鼠中发现总IgG、IgG2a和IgG1对RSV A2响应的类似模式。IgG和IgG2a抗体响应的水平相对于用RSV-F VLP观察到的低。小鼠中加强后比初次免疫后的抗体响应(IgG、IgG2a)显著更高(图10F和G)。如图10中观察到的，在加强后而非初免后发现主要是IgG2a的响应。这些结果说明，RSV-F和RSV-G VLP二者是高度免疫原性的并诱导主要是IgG2a的响应。
小鼠肺中的抗体响应
肺是RSV复制的重要位置，在那里发生疾病发展。在攻击后第4天，收获小鼠肺并确定总IgG、IgG1和IgG2a抗体响应。如图11A和C中所示的，在用RSV-F VLP或RSV-G VLP免疫的小鼠中发现显著较高水平的RSV A2特异性IgG抗体。有趣的是，免疫的小鼠中对RSV-G或RSV-F特异性的IgG响应显示类似的高水平。如在图11B和D中观察到的，在用RSV-F VLP或RSV-G VLP免疫的小鼠中引发与IgG1相比显著更高的IgG2a响应。来自RSV-G VLP和RSV-F VLP二者的IgG2a与IgG1的比在10、20和40的肺提取物稀释是相似的(图11E)。与血清样品相比，肺提取物样品显示高得多的IgG2a与IgG1的比(图11E和I、图11E)。这些结果说明，RSV-G VLP和RSV-F VLP二者在肺中引发主要是RSV IgG2a的响应。
免疫血清有效地结合RSV感染的细胞
利用单层RSV A2感染的HEp-2细胞或未感染的细胞确定针对细胞表面蛋白的免疫应答。培养12小时后，去除上清液并将免疫血清加到细胞表面以确定IgG、IgG1和IgG2a响应。如图12中所示的，感染后12小时，来自用RSV-F或RSV-G VLP免疫的来自初免和加强的小鼠的血清显示针对表达的细胞表面蛋白的显著高水平的总IgG和IgG2a抗体响应(图12A、B、D和E)。在用RSV-F VLP(图12C)或用RSV-G VLP(图12F)免疫的小鼠中确定针对感染或未感染的细胞表面蛋白的总IgG响应，显示未感染的细胞中的背景响应。有趣地，RSV-G VLP接种显示比RSV-F VLP高的多的针对细胞表面蛋白的总IgG和IgG2a响应。这些结果表示，免疫血清特异性结合HEp-2细胞表面表达的蛋白。
中和抗体响应
中和抗体是通过接种诱导的免疫应答的重要功能组分。为了确定用RSV VLP免疫是否诱导中和抗体，使用了体外空斑减少测定。将加强后第3周时的连续稀释的小鼠血清补体灭活，与活的RSVA2一起培养，并进行空斑测定。如图13中所示的，RSV-F或RSV-G VLP显示类似的空斑减少比例。在1:1000血清稀释时，RSV-G或RSV-F VLP接种减少空斑的数目55%，而未处理的血清减少空斑7%。在1:10000血清稀释时，RSV-G VLP显示38%空斑减少，相比之下RSV-F VLP显示25%减少，且未处理的血清显示未减少(图13)。未处理的血清在1:10或1:100的血清稀释时显示非常高的背景效应，具有中和滴度为.100。来自用RSV-F或RSV-G VLP免疫的病毒中和滴度为.1000，其中显示50%空斑减少的最高血清稀释被采取为中和抗体滴度，与之相比阴性介质对照显示空斑未减少。这些结果说明，RSV-F和RSV-G VLP疫苗可诱导针对RSV的保护性功能抗体。
针对活的RSV A2病毒攻击感染的保护
攻击感染后肺中病毒载量和体重变化是评价疫苗保护效力的重要指示。免疫的小鼠在加强后4周用活的RSV-A2病毒(1.5X106PFU/小鼠)攻击感染，并确定攻击后第4天的肺病毒载量。如图14A中所示的，与未处理的小鼠对照相比，用RSV-F(11倍)或RSV-G VLP(600倍)免疫的小鼠中检测到显著减少的肺病毒载量。还比较了用RSV-F VLP和RSV-G VLP免疫的小鼠中肺病毒载量的差异(图14B)。发现在用RSV-G VLP免疫的小鼠中比用RSV-F VLP免疫的小鼠中较低的肺病毒载量(图14B)。这些结果说明，用RSV-F或RSV-G VLP接种小鼠可有效抑制肺中病毒复制。测量了攻击后体重减少的水平，且感染后第6或7天显示最高的体重减少。未处理的对照小鼠显示最高的体重减少(20%)，而用RSV-F VLP或RSV-G VLP免疫的小鼠在攻击后第6天分别显示13%和6.4%的体重减少，和在攻击后第7天分别显示8%和5%的体重减少(图14C)。在第7天，在未处理的对照与RSV-F或RSV-G VLP之间、和在RSV-F与RSV-G VLP之间发现体重减少的显著差异。差异与更好的肺病毒清除相关，与RSV-F VLP相比，观察到用RSV-G VLP的更好的肺病毒清除。这些结果表示，RSV-F和RSV-G VLP二者对小鼠赋予基本的保护以免受RSV引起的疾病。

Claims (21)

1.一种接种受治疗者的方法，所述方法包括在使得产生针对抗原的抗体的条件下，联合包含TLR5激动剂的病毒样载体施用所述抗原，其中所述病毒样载体不包含所述抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原是病毒、细菌、真菌或寄生虫衍生的分子。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原包括SEQ ID NO1的M2e多肽。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗原包括具有SEQ ID NO:1中的四个或多个连续氨基酸的M2e多肽。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原是重复的多肽序列。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述TLR5激动剂是膜锚定形式的鞭毛蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可变区的FliC。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述病毒样载体包括SEQ ID NO:28的多肽。
9.如权利要求1所述的方法，其中鼻内或肌内施用所述抗原和病毒样载体。
10.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含抗原和包含鞭毛蛋白的病毒样载体，其中所述病毒样载体包含TLR5激动剂，其中所述病毒样载体不包含所述抗原。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述抗原是病毒蛋白。
12.如权利要求10所述的组合物，其中所述抗原包括SEQ ID NO 1的M2e多肽。
13.如权利要求10所述的组合物，其中所述抗原包括具有SEQ ID NO:1中的多个连续氨基酸的M2e多肽。
14.如权利要求10所述的组合物，其中所述抗原是重复的多肽序列。
15.如权利要求10所述的组合物，其中所述TLR5激动剂是鞭毛蛋白。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述鞭毛蛋白是FliC或其中不存在可变区的FliC。
17.如权利要求10所述的组合物，其中所述病毒样载体包括SEQ IDNO:28的多肽。
18.一种核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO:28的多肽。
19.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含表面具有流感病毒基质蛋白和RSV蛋白而不存在F蛋白或糖蛋白的病毒样载体，其中所述流感病毒基质蛋白是M1且RSV蛋白是G蛋白或糖蛋白。
20.一种RSV-G病毒样颗粒，所述RSV-G病毒样颗粒通过用编码RSV-G和流感M1而非RSV-F基因的rBV感染昆虫细胞来产生。
21.一种接种受治疗者的方法，所述方法包括施用权利要求19或20所述的免疫原性组合物。
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