CN112684185B

CN112684185B - 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112684185B
Application number: CN202011562595.1A
Authority: CN
Inventors: 张学光; 丁思思
Original assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Xuguang Kexing Antibody Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2024-01-12
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112684185A

Abstract

本发明公开了包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人B7‑H4单克隆抗体8D4，其重链如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；其轻链如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；检测抗体，所述检测抗体为鼠抗人B7‑H4单克隆抗体7E1，其重链如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；其轻链如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。可以定量分析人体血清、血浆和组织液中可溶性B7‑H4蛋白的表达水平。

Description

一种可溶性B7-H4定量检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及定量检测领域，具体涉及一种可溶性B7-H4定量检测试剂盒及其应用。

背景技术

1970年由Brestcher和Cohn在T细胞激活双信号学说以及CD28/B7分子功能的基础上首先提出并证实，T淋巴细胞的活化需要双信号，即T细胞通过TCR与MHC-抗原肽结合获得第一信号，尚需获得抗原信号以外的刺激，即第二信号或共刺激信号。介导第二信号的分子统称为协同刺激分子或共刺激分子。研究表明，共刺激分子及其调节网络在免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止过程中起着极其重要的调节作用。随着新的共刺激分子成员不断地被发现、克隆、相关重组细胞蛋白和单克隆抗体等生物制剂的成功研制，以及在转化医学中取得的巨大成就，共刺激分子及其构成的调节网络学说极大地丰富了免疫学基础理论的内涵，并且在肿瘤免疫、自身免疫性疾病、感染性疾病、超敏反应及免疫移植排斥等发病机制研究和防治中起着越来越重要的作用。

B7-H4，又被称作B7S1、B7x及VTCN1，是由Chen等人于2003年利用生物信息学的方法发现的B7家族最新成员，他们以现有的B7家族成员的胞外段可变区(IgV+IgC)为查询序列，对GenBank中的EST序列(表达序列标签)进行搜索时发现B7-H4分子，并在人胎盘cNDA文库中得到了全长序列。人B7-H4的cDNA全长约1.8kb，位于人的染色体1p11.1，在基因组上跨越66kb，含有6个外显子和5个内含子。序列分析表明，B7-H4的开放阅读框(ORF)由849个碱基组成，编码一个含282个氨基酸的多肽，包括信号肽、一对VC免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞质区。B7-H4是一种细胞膜结合配体，其大部分结构延伸到细胞外，属于I型跨膜糖蛋白。此外，在细胞内以及外周血中也发现B7-H4的存在。研究发现，B7-H4 mRNA在外周组织中广泛表达，包括肺、肝、肾、睾丸、胰腺、前列腺等，在正常组织中几乎检测不到B7-H4蛋白的表达。B7-H4可以在活化的人T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC细胞上呈诱导性表达。但至今，B7-H4的受体尚未确认，使得对其功能认识甚少。

B7-H4信号在机体的免疫应答调节中发挥重要的生物学效应。B7-H4可与至今尚未鉴定表达在T细胞表面的受体结合，从而通过抑制T细胞的激活及增殖、细胞因子的产生以及细胞周期的进程来负调控T细胞的免疫应答。业已证实，固相化的B7-H4-Ig融合蛋白或细胞膜表面的B7-H4对由CD3 mAb活化的T细胞增殖有很强的抑制作用，并能显著下调细胞因子的分泌。可溶性B7-H4-Ig融合蛋白不能抑制T细胞的增殖，但却能在体外部分抑制异源性细胞毒性T淋巴细胞的产生。B7-H4的信号途径与CTLA-4信号途径颇为相似。B7-H4在人类肿瘤组织中的表达具有重要的临床意义，许多人类肿瘤组织，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、胃癌及食管癌中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞都异常表达B7-H4分子，并且其表达水平与患者临床病理特征及预后密切相关。B7-H4有望成为免疫治疗靶点和肿瘤诊断的生物标志物。

机体免疫系统具有区分“自己”和“非己”的能力。正常情况下免疫系统只对非己抗原产生免疫应答，面对自身抗原则无应答或仅产生微弱应答，即免疫系统对自身组织成分处于免疫耐受状态。在免疫耐受状态下，体内仍存在一定量的针对自身抗原的自身抗体和自身反应性T、B细胞，并产生自身免疫。在一定条件下，自身免疫耐受状态被打破，免疫系统会对自身抗原产生病理性免疫应答，造成自身组织细胞损伤或功能异常，导致自身免疫性疾病(AID)。自身免疫性疾病泛指机体免疫效应细胞或免疫效应分子针对自身组织或细胞产生病理性免疫应答反应，导致自身组织损伤的一大类疾病。AID包括器官特异性AID和系统性AID两类。器官特异性AID包括毒性弥漫性甲状腺肿(Graves病)，桥本甲状腺炎和I型糖尿病(T1D)等。系统性AID又称全身性AID，如系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)。自身反应T、B细胞过度活化,自身抗体大量产生,多系统多器官广泛损害是自身免疫性疾病的基本特征。有关自身免疫性的研究表明，B7-H4介导的免疫应答调节对自身免疫和炎症具有重要意义。用特异抗体封阻细胞的B7-H4后可增强CTL的应答，加速EAE疾病的发生。B7-H4表达缺乏会加重系统性红斑狼疮以及自身免疫性糖尿病等多种自身免疫性疾病的病理生理表现，但体外研究表明，B7-H4基因敲除小鼠不会自发产生任何炎性或自身免疫性疾病。

在人血清和血浆中，存在各种可溶性的共刺激分子。到目前为止，通过ELISA和Western等方法证实大部分共刺激分子都存在可溶性形式。这些可溶性分子的产生往往由两种形式：其一、由mRNA的不同拼接形成，由比膜型蛋白少了跨膜区和胞内区的转录本直接翻译成可溶性蛋白。B7/CD28家族许多分子的可溶性形式是通过这种方式形成的，如sCD80、sCD86、sCD28、sCTLA-4、sPD-1和sBTLA等。TNF/TNFR超家族成员WSI-1/DR3、CD95和4-1BB也通过这种方式产生可溶性分子。其二、从膜型蛋白脱落而来，即通过蛋白酶酶切从膜上剪切胞外段形成分子可溶性。TNF/TNFR超家族中许多分子的可溶性形式通过这种方式形成，如sTNFR1、sNGFR、sCD40、sCD30、sCD27、sTNF-α、sTNF-β、sCD40L和sCD95L等，而sWSI-1/sDR3、sCD95和s4-1BB由不同的转录本翻译形成。通过这种方式形成可溶性形式的还有CD28/B7家族中的PD-L1和B7-H3分子。也有些蛋白，虽然已经检测到了其可溶性形式的存在，如B7-H4和OX40L等，但它们的形成方式还有待进一步的研究。

业已表明，可溶性共刺激分子具备重要的免疫调节功能，它们可以与相应的受体或配体结合，直接激发共刺激信号，或者阻断膜型蛋白与相应配体的结合，抑制膜型分子传递的信号，它们也可以与游离的可溶性受体或配体结合，阻止其与膜型分子结合。由此，可溶性分子是共刺激网络的重要组成部分，并参与共刺激分子途径的自我调节。研究发现，在正常人的血清中，这些可溶性共刺激分子的表达水平比较低，而在疾病状态的体液中，可溶性分子水平会有异常的增高，而且具有重要的临床相关性。迄今为止，因缺乏有效的检测方法，国内外尚未有对可溶性B7-H4(sB7-H4)的研究报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可定量检测人可溶性B7-H4的ELISA试剂盒；

本发明的目的之二是提供所述检测人可溶性B7-H4的ELISA试剂盒在自身免疫性疾病诊断中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，包括：

包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人B7-H4单克隆抗体8D4，其重链如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

其轻链如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

检测抗体，所述检测抗体为鼠抗人B7-H4单克隆抗体7E1，其重链如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；

其轻链如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒当中还包括固相载体酶标板、标准品蛋白、抗体稀释液、样品稀释液、封闭液、反应底物四甲基联苯胺、洗液或终止液中的任意一种或多种。

在本发明的一个优选实施例中，所述标准品蛋白为标准品蛋白B7-H4Ig蛋白。

在本发明的一个优选实施例中，所述洗液包括含体积分数0.02％-0.2％的吐温20的0.002M咪唑盐溶液或pH为7.4的PBS溶液中的任意一种或多种。

优选为含体积分数0.02％吐温20的pH为7.4的PBS溶液。

在本发明的一个优选实施例中，所述终止液包括：2M的硫酸或者1％HCl溶液中的任意一种或多种。优选为2M的硫酸。

在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒中还包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液或标准品。

一种可定量检测人可溶性B7-H4的ELISA试剂盒的应用，其中，所述应用为定量分析人体血清、血浆和组织液中可溶性B7-H4因子的表达水平。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明所述可定量检测可溶性B7-H4分子的试剂盒具有良好的特异性，可以精确地定量分析细胞培养上清、血清、血浆和滑膜液等液体中的可溶性B7-H4蛋白的浓度；可应用在临床自身免疫性疾病的诊断中。

2.本发明所述可定量检测可溶性B7-H4分子的试剂盒具有良好的灵敏度，可在78pg/ml-5000pg/ml的sB7-H4浓度范围内保持良好的线性关系。

附图说明

图1为实施例二中两株抗人B7-H4单克隆抗体的流式鉴定。

图2为实施例二中单克隆抗体识别抗原位点的竞争性抑制实验。

图3为实施例二中单克隆抗体的Western blot鉴定。

图4为本发明的ELISA试剂盒的标曲曲线方程。

图5为本发明的ELISA试剂盒的特异性考察曲线图。

图6为sB7-H4在健康人和自身免疫性疾病患者外周血清中的表达水平示意图。

具体实施方法

本发明人利用自行研制的两株鼠抗人B7-H4单克隆抗体(8D4、7E1)以及B7-H4Ig融合蛋白研制了可以定量分析人可溶性B7-H4的ELISA试剂盒。

利用该检测体系，检测了多种自身免疫病患者外周血中该可溶性因子的含量较健康对照人群具有显著性差异。

因此，该试剂盒在上述临床疾病的鉴别诊断和预后判断中具有应用价值。

以下结合具体实例及附图对本发明作进一步描述。应理解，以下实施例仅适用于说明本发明而非限定本发明的范围。

实施例一：抗人B7-H4单克隆抗体的制备

(1)试剂和材料：含有10％小牛血清(FCS，Hyclone，美国)的RPMI1640培养基(Gibco，美国)；HAT、HT选择培养基(Sigma，美国)；福氏佐剂(Freund’adjuvant，Sigma，美国)；细胞融合剂聚乙二醇(PEG1500)；Protein G亲和层吸柱(Pharmacia，瑞典)；Pristane(Sigma，美国)。细胞培养瓶、板(Nunc，丹麦)；CO₂培养箱、离心机(Jouan，法国)，倒置显微镜(O1ympus，日本)，流式细胞仪(Coulter，美国)；转人B7-H4基因细胞株CHO/B7-H4(本人构建)。所有细胞株经检测，均无支原体污染；6-8周龄的雌性BALB/c小鼠来自上海实验动物中心。

(2)细胞培养：采用含10％FCS的RPMI1640培养基，CHO/B7-H4和CHO/Mock基因转染细胞株定期用抗性筛选药物Zeocin(500μg/ml)加压培养，以保持目的基因产物的稳定高表达。

(3)动物免疫：收集生长良好的CHO/B7-H4细胞，用PBS洗涤3次后，加入丝裂霉素(50μg/100μl/1×10⁷)混匀，置于37℃孵育45min，PBS洗涤3次后，再用0.3-0.4ml的生理盐水重悬，与等量的IFA充分乳化，分别于颈部皮下多点及腹腔注射(1×10⁷/只)；并于初次免疫后每隔21天再行免疫3次，于融合前4-5天，再次腹腔注射5×10⁶/只以加强免疫。

(4)骨髓瘤细胞的准备：融合前10-14天，复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，收集生长良好，细胞活力大于95％且处于对数生长期的细胞用于融合。

(5)饲养细胞的准备：于融合前1天，取BALB/c小鼠，摘除眼球处死后置于75％酒精中5min。无菌取出胸腺，置于200目的钢丝网中，将筛网移入盛有10ml基础培养基的平皿中，研磨胸腺，使其成为单个细胞而悬于培养基中；吸取少许细胞悬液计数，1000rpm离心8min，用完全培养基调整细胞浓度为3-4×10⁵/ml，于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，37℃、5％CO2培养箱中培养。

(6)免疫小鼠脾脏细胞的制备：取加强免疫后的小鼠按上述方法处死，无菌取出小鼠脾脏，置于200目的钢丝网中，研磨获取单个细胞悬液。1000rpm离心8min，洗涤两遍后将沉淀细胞重悬于RPMI1640基础培养基中备用。

(7)细胞的融合及选择性培养：将RPMI1640基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预热。收集2×107个生长良好的SP2/0细胞，与1×10⁸个脾脏细胞混合于50ml离心管中，用RPMI1640洗涤两遍，1000rpm离心8min后弃尽上清，用手指轻轻弹击管底，使两种沉淀细胞充分混匀成悬浮细胞状。将离心管置于37℃保温水浴杯中，吸取1ml经37℃预温的50％的PEG溶液，将尖头吸管轻轻插入细胞悬液底部，在1min内匀速加完，且边加边轻轻震荡，然后在水浴中静置90s。沿着管壁轻柔加入预温的无血清RPMI1640，室温静止5min，离心(800rpm，10min)后弃上清。将沉淀细胞轻轻重悬置于40ml含2％HAT、15％FCS的RPMI1640培养中。混匀后滴加在含有饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO2培养，3-4天后半量换液，10天后改用HT培养基，2周后转用含10％FCS的RPMI1640培养基。

(8)杂交瘤细胞的筛选：待杂交瘤细胞克隆布满1/3-1/5培养孔时，即可吸取上清用间接免疫荧光标记法进行筛选特异性抗体。将生长良好的CHO/B7-H4细胞用PBS洗涤后，分加于流式管中(5×10⁵/管)，加入杂交瘤细胞的培养上清(50μl/管)于4℃反应30min，用含1％小牛血清的PBS洗涤两遍，加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗4℃反应30min，洗涤后用FACS分析，同时以CHO/Mock细胞作为阴性对照细胞株。将复测为阳性的克隆连续3-5次亚克隆培养，最终获得2株能持续分泌特异性抗人B7-H4分子的杂交瘤细胞株，命名为8D4和7E1，流式细胞仪检测结果显示，该单抗能特异性识别人B7-H4，而不与CHO/Mock基因转染细胞结合(图1)。图中结果显示，单抗8D4和7E1能特异性识别CHO/B7-H4细胞表面的B7-H4蛋白。

(9)杂交瘤细胞的克隆化培养：采用有限稀释法，将抗体反应阳性孔细胞准确计数后，用HAT选择培养基梯度稀释为50个/ml和10个/ml细胞，加100μl/孔于含有饲养细胞的96孔培养板中，37℃、5％CO2培养。适时换液并根据细胞的生长状态及时按已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞继续克隆，直至抗体分泌阳性率大于95％；扩大培养并及时液氮冻存。

(10)单克隆抗体的制备：采用腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注入Pristane 0.5ml/只。一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁷/只，同时另一侧腹腔再次注入Pristane和福氏半佐的等体积混合物0.2ml/只，轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。5-10天后收获腹水，离心取上清分装后-80℃保存。

(11)抗体纯化：将腹水解冻，离心去除凝块，饱和(NH₄)₂SO4溶液沉淀抗体蛋白后用PBS复溶。透析去除(NH₄)₂SO4，样品经Protein G亲和层吸柱再用PH2.8甘氨酸-盐酸洗脱。收集蛋白洗脱峰用PH9.0的Tris-Base调节PH至7.0，PBS透析后用紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白含量(mg/ml)＝OD280×1.55-OD260×0.76。

实施例二：抗人B7-H4单克隆抗体8D4和7E1的生物学特性鉴定

(1)单抗隆抗体的亚型与序列鉴定：取杂交瘤细胞培养上清1:50、腹水1:20000稀释。取0.2ml稀释液加于含有亚类定性试剂的小试管中，室温放置1min，待其自然溶解后轻轻混匀，将亚类定性试纸条轻轻插入管中，5-10min后，试纸的一面出现与mAb重链名称相对应的蓝色蛋白显色条带，此即该抗体所属的小鼠Ig亚类；而另一面出现与mAb轻链名称相对应的蓝色蛋白条带，此即该mAb的轻链类型；对单克隆抗体进行测序，测得鼠抗人B7-H4单克隆抗体8D4的重链如序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；所述单克隆抗体8D4的轻链如序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；所述检测抗体为鼠抗人B7-H4单克隆抗体7E1的重链如序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；所述单克隆抗体7E1的轻链如序列表中SEQ IDNO：4所示氨基酸序列。

(2)单克隆抗体的流式鉴定：将基因转染细胞CHO/Mock、CHO/B7-H4与获得的抗人B7-H4单抗反应30min，PBS洗涤后加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗，继续反应30min，洗涤后用FACS分析细胞标记的荧光强度。用商品化抗人B7-H4单抗作阳性对照。结果显示，获得的单抗8D4和7E1能特异性识别人B7-H4，而不识别CHO/Mock(图1)，图中实线为阴性对照组，点状虚线为B7-H4单抗实验组。

(3)抗体竞争实验：取待标记生物素的抗人B7-H4单抗(7E1)200μg，加入含有1ml的0.01M PH＝9.3碳酸缓冲液透析袋中，于4℃下透析平衡过夜后，加入浓度为1mg/ml的BNHS-DMSO溶液40μl，室温避光反应4h，再于4℃下在PH7.2 PBS中透析72h，分装后-20℃保存。将CHO/B7-H4细胞用PBS洗涤后加入其中一株单克隆抗体(每管2μg)，4℃孵育30min，洗涤后加入生物素标记的另一株单抗，再4℃孵育30min，洗涤后加入streptavidine-PE二抗，4℃孵育30min并洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照组。竞争实验结果显示，不同浓度(0.1μg、1μg、10μg)的8D4或7E1均不能有效阻断生物素标记的7E1或8D4与CHO/B7-H4的结合。因此，8D4识别的抗原表位不同于7E1(图2)。图中黑色实线为阴性对照组，点状虚线为单加生物素标记单抗的阳性对照组，黑色虚线为不同浓度抗体竞争组。

(4)抗体的Western blot鉴定：采用化学显色的Western blot分析，提取表达B7-H4的转基因细胞或肿瘤细胞的膜蛋白，经12％SDS-PAGE电泳，并电转移(0.65mA/cm²)至硝酸纤维膜上，用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；加入纯化的抗体孵育2h，用TBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶(AP)标记的二抗，孵育1h，洗涤后加入底物显色。结果显示，单抗8D4和7E1均能特异性识别B7-H4蛋白(图3)。

(5)单克隆抗体相关序列表：

SEQ ID NO:1：抗人可溶性B7-H4单克隆抗体8D4重链的氨基酸序列

EVQLKESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTFVVHWVKQSPGQGLEWIGYFSPNSDGTYYNEKFKGKATLTLDKSSSTAFMELSSLTSEDSAVYYCARNWFDYWGQGTTLTVSS；

SEQ ID NO:2：抗人可溶性B7-H4单克隆抗体8D4轻链的氨基酸序列

DIVMTHTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLVYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK；

SEQ ID NO:3：抗人可溶性B7-H4单克隆抗体7E1重链的氨基酸序列

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYGMSWARQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCVRDRAYWGQGTQVTVSA；

SEQ ID NO:4：抗人可溶性B7-H4单克隆抗体7E1轻链的氨基酸序列

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSTGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTLLPPTFGGGTKLEIK。

实施例三：一种可定量检测人可溶性B7-H4的试剂盒

(1)试剂盒组成：

1)包被抗体：鼠抗人B7-H4单抗(8D4)，30μg/管，1管；

2)标准品蛋白：B7-H4Ig蛋白(R&D)，25ng/管，1管；

3)检测抗体：鼠抗人B7-H4单抗(Biotin-7E1)，10μg/管，1管；

4)Streptavidin-HRP(Sigma-Aldrich)，1μl//管，1管；

5)TMB(Sigma-Aldrich)，10ml；

6)BSA(上海生工)，2g/100ml，30ml；

7)ELISA板(Costar)，1块；

8)洗液：10×PBS，100ml；Tween-20，0.5ml；

9)终止液：2M H₂SO4，5ml；

(2)贮存条件见表1：

表1

实施例四：利用ELISA试剂盒定量检测人血清中可溶性B7-H4的含量

(1)样品处理：

采集人体血清样本：2500rpm×10min，-20℃保存，避免反复冻融。

(2)操作步骤：

1)包被抗体8D4用0.01M CBS(pH9.6)缓冲液配制成5μg/ml浓度的包被抗体工作液，按100μl/孔加入ELISA板，于4℃静置过夜；

2)弃包被液，用PBS洗板3次；加入3％BSA 200μl/孔，室温封闭1h；

3)弃封闭液，PBS洗板3次；以PBS(含0.5％BSA)为样品稀释液，准备测定样品。标准蛋白：①取7个EP管，每管加入100μl稀释液并置于EP管架上；②将100μl 5ng/ml B7-H4Ig纯品蛋白加到第一个EP管，混匀后再取100μl到第二个EP管进行倍比稀释，依此类推至第7管。细胞培养上清、血清/血浆样品按100μl/孔加入ELISA板；③检测抗体Biotin-7E1用抗体稀释液调整至终浓度为0.5μg/ml；

4)加入标准品和待测样品100μl/孔，室温反应2h；

5)弃样品后用PBS洗板3次；加入Streptavidin-HRP(1:8000)，100μl/孔，室温反应1h；

6)弃反应液用PBS(含0.2％Tween20)洗板8-10次；

7)加入反应底物TMB，100μl/孔，室温避光反应10-15min；加入50μl2M H₂SO4终止；

8)应用酶标仪选择OD450nm波长测定ELISA板各检测孔的OD读数；

(3)检测结果分析：

1)B7-H4Ig融合蛋白的检测数据如下表2所示：

表2

2)曲线方程：y＝0.2231x+0.0871，R2＝0.99815(图4)

3)血清样品的检测数据如下表3所示：

表3

(4)准确性考察：

1)板内准确性分析：在同一次实验中，将三个已知浓度的样本(10、5、2.5ng/mL)分别设置20个复孔，进行sB7-H4检测，分析该试剂盒的准确性。

2)板间准确性分析：在不同批次实验中，将三个已知浓度的样本(10、5、2.5ng/mL)分别设置10个复孔，进行sB7-H4检测，分析该试剂盒的准确性。

3)结果与讨论如下表4所示：

当变异系数CV<10％时，证实该检测方法具有良好的准确性。

(5)特异性考察

将B7-H1Ig、B7-H2Ig、B7-H3Ig、B7-H4Ig、B7-H5Ig和B7-H6Ig连续倍比稀释成不同的浓度。抗人B7-H4单抗(8D4)用碳酸盐缓冲液(0.01M CBS，pH9.3)调整为5μg/ml包被ELISA检测板，4℃过夜。PBS(含0.1％Tween 20)洗涤3次，3％BSA室温封闭1h。PBS洗涤3次后加入上述稀释好的商品化蛋白，室温反应2h，PBS洗涤3次。然后，加入生物素标记的单抗biotin-7E1(0.5μg/ml，100μl/孔)，室温继续反应1h，PBS洗涤3次后，加入Streptavidin-HRP(1:8000，100μl/孔)，室温反应1h，PBS洗涤6-8次，再加入HRP反应底物TMB(100μl/孔)，室温反应10-15min，用2mol/L H₂SO4终止反应，用酶标仪测定OD450nm，每个样品设置3个复孔。特异性分析结果如图5所示。

实施例五：自身免疫性疾病患者外周血清中可溶性B7-H4的表达水平考察

收集正常健康人及不同自身免疫疾病患者外周血清，其中包括健康对照组(HC)70例，系统性红斑狼疮(SLE)患者63例，I型糖尿病(T1D)患者64例，II型糖尿病(T2D)患者60例，Graves病(GD)患者73例，干燥综合症(SS)患者71例和类风湿性关节炎(RA)患者75例。ELISA法检测外周血清中sB7-H4的表达。如图5所示，GD、T1D和SLE患者外周血清中的sB7-H4表达显著高于健康对照组。鉴此，使用本发明的人可溶性B7-H4 ELISA试剂盒能够对自身免疫性疾病患者进行检测，在临床不同自身免疫疾病的鉴别诊断和预后判断中具有应用价值。

序列表

<110> 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司

<120> 一种可溶性B7-H4定量检测试剂盒及其应用

<130> JSP12016054

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe

20 25 30

Val Val His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Ser Pro Asn Ser Asp Gly Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr His Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Val Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Ala Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Arg Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Leu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，包括：

其轻链如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

其轻链如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒当中还包括固相载体酶标板、标准品蛋白、抗体稀释液、样品稀释液、封闭液、反应底物四甲基联苯胺、洗液或终止液中的任意一种或多种。

3.如权利要求2所述的一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，所述标准品蛋白为标准品蛋白B7-H4Ig蛋白。

4.如权利要求2所述的一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，所述洗液包括含体积分数0.02％-0.2％的吐温20的0.002M咪唑盐溶液或含体积分数0.02％-0.2％的吐温20的pH为7.4的PBS溶液中的任意一种或多种。

5.如权利要求2所述的一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，所述终止液包括：2M的硫酸或者1％HCl溶液中的任意一种或多种。

6.如权利要求2所述的一种可定量检测可溶性B7-H4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液或标准品。

7.如权利要求1-6当中任意一项所述的一种可定量检测人可溶性B7-H4的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，所述应用为定量分析人体血清、血浆和组织液中可溶性B7-H4因子的表达水平。