CN109988752A - 一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents
一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109988752A CN109988752A CN201910225351.5A CN201910225351A CN109988752A CN 109988752 A CN109988752 A CN 109988752A CN 201910225351 A CN201910225351 A CN 201910225351A CN 109988752 A CN109988752 A CN 109988752A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- human
- cell
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 129
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 3
- 238000005469 granulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000003179 granulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 claims 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 7
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- -1 sulfydryl Chemical group 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101710144268 B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029527 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710201161 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 108700004675 bleomycetin Proteins 0.000 description 1
- QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N bleomycin A5 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCNCCCCN)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QYOAUOAXCQAEMW-UTXKDXHTSA-N 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
本发明涉及一类单克隆抗体，具体涉及一种抗人B7‑H4单克隆抗体及其制备方法，以及所述单克隆抗体在阻断B7‑H4分子抑制T细胞增殖活化中的应用。单抗药物治疗主要是利用其靶向性来干预肿瘤发生发展过程中的各个通路，或是激活宿主对肿瘤的免疫等。目前杂交瘤技术所制备的抗体多用于诊断试剂类产品，而临床应用的抗体类药物则需采用稳定性较好的工程系统进行制备，目前亟待解决的问题是如何降低单抗的异源性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果，因此，对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为本发明单抗研究的新的技术方向。
Description
技术领域
本发明涉及一类单克隆抗体，具体涉及一种抗人B7-H4单克隆抗体及其制备方法，以及所述单克 隆抗体在阻断B7-H4分子抑制T细胞增殖活化中的应用。
背景技术
T细胞的活化调节受其表面受体与刺激性或抑制性配体的相互作用所控制，细胞活化需要双信号: 即由抗原递呈细胞(APC)表面的MHC-Ag肽复合物与TCR特异性结合传递第一信号和来自于APC表面 的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体结合的第二信号。缺乏共刺激信号会导致T细胞无能。B7 家族是免疫球蛋白超家族中一类具有相似结构的协同信号分子的总称，成员包括CD80、CD86与他们 的配体CD28、CTLA-4，在T细胞的活化过程中提供正向或负向的信号。最近，一些B7家族的同源物 被鉴定，包括B7-H1(PD-L1)、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6。B7-H4也称为B7X或B7S1，是 最新发现的新成员之一。
临床研究表明，B7-H4可以作为一种新型的蛋白标记物，同其他标记蛋白结合起来对于一些肿瘤 早期发现具有重要的临床意义，单截止到目前为止，B7-H4的受体尚未被克隆出来，虽然Watanabe 等曽认为B、T淋巴细胞衰减子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)就是B7-H4分子的受体， 但是随后其他研究发现，在分析其结构时发现其与PD-1和CTLA-4相似，分析两受体酪氨酸抑制基序 并比较发现BTLA可能是一个发挥抑制作用的受体，因此BTLA经验证并非是B7-H4的受体，所以B7-H4 在肿瘤抑制的共表达水平难以确定。
肿瘤免疫靶向治疗存在多种机制，理论上，针对互相不重叠的机制进行联合用药可以达到最好的 治疗效果。研究认为B7-H4单抗阻断效应与BTLA及PD-1调节轴均不存在重叠。同时，以往的BTLA 及PD-1抗体的靶向作用机制研究提示，它们分别通过不同的途径来达到抑制肿瘤并杀死肿瘤的目的， 即阻断BTLA与相应配体的结合可减少肿瘤微环境内Tregs数量，和阻断PD-1与PD-L1结合可直接增 强T细胞活化性能，多个研究的数据证明B7-H4单抗阻断效应是独立于前两种途径之外的，多个免疫 检查点的联合用药大大增强了宿主免疫系统的抗肿瘤效应。
单抗药物治疗主要是利用其靶向性来干预肿瘤发生发展过程中的各个通路，或是激活宿主对肿瘤 的免疫等。目前杂交瘤技术所制备的抗体多用于诊断试剂类产品，而临床应用的抗体类药物则需采用 稳定性较好的工程系统进行制备，目前亟待解决的问题是如何降低单抗的异源性，单抗的异源性所引 起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果，因此，对异源性单抗进行改 造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的新的技术方向。
B7-H4在APC(如DC细胞，单核巨噬细胞，小胶质细胞)上表达也抑制了T细胞的增殖。研究表 明，IL-6能诱导肿瘤相关巨噬细胞表达B7-H4。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素 -4(IL-4)等能下调这些细胞上B7-H4的表达。单克隆抗体生产包括腹水制备和细胞转瓶培养两种方法， 例如专利号201810188948.2的单克隆抗体的制备主要采用体内法，将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内， 杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长，并产生腹水，因而可得到大量的且抗体浓度很高腹水单抗。小鼠体内 杂交瘤细胞培养，腹水中抗体含量浓度高，产量大，可持续抽取，不需要培养基等成本，不需要重复 无菌操作，快速简便，但遗憾的是，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括IgG)和脂类物质等，在很 多情况下必须要提纯后才能使用，还有动物病毒污染的危险，另外由于小鼠个体差异较大，导致产品 批间差较大。
因此在无/低血清条件下的B7-H4的单克隆抗体的体外大量生产成为当前肿瘤领域、抗感染领域， 包括特殊类型感染等领域的主要方向。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种B7-H4单克隆抗体。
本发明的目的之二在于提供一种能产生B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的目的之三在于提供一种包含B7-H4单克隆抗体的化学免疫偶联物。
本发明的目的之四在于提供一种在无/低血清条件下的B7-H4的单克隆抗体的体外生产方法。
本发明的目的之五在于提供一种治疗或预防疾病的方法。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
1)从细菌中纯化出不含有信号肽和跨膜序列的B7-H4分子(亦即胞外蛋白序列)；
2)用纯化的B7-H4蛋白注射Balb/C小鼠进行初次免疫，在初次免疫2～3周后进行再次免疫，在 再次免疫2周后进行加强免疫。
3)获取融合细胞生长克隆：从免疫后小鼠取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B 细胞与骨髓瘤细胞融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克 隆；
4)应用流式细胞学技术筛选和鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株， 所述杂交瘤细胞株已于2019年2月18日由位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCCNo.17298，参据的生物材料为：BLJ 杂交瘤B7-H4，建议的分类命名为杂交瘤细胞株。
上述技术方案中，步骤1)中纯化的人B7-H4分子具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子 的空间构型是暴露于细胞膜表面的自然状态，从而可更有效地激发机体的免疫反应，具体构建步骤：
(a)基因合成与亚克隆：
将不含信号肽和跨膜序列的B7-H4克隆到载体pET30a中，并在大肠杆菌中用组氨酸(His)作为 蛋白表达的标签。
(b)表达量评估：
将重组质粒转染至大肠杆菌BL21Star(DE3)中，将单个菌落接种到含有卡那霉素的LB培养基 中；在37℃以200rpm摇菌培养，然后用IPTG诱导培养。用SDS-PAGE和Westernblot检测其表达。
(c)放大表达量:
将存放于甘油中的BL21Star(DE3)接种到含卡那霉素的TB培养基中，15℃培养，当吸光度OD600 达到1.2时，用IPTG在15℃诱导细胞，培养16小时，离心获取细胞。
(d)纯化和分析：
用裂解缓冲液重悬细胞颗粒，然后超声处理。离心后的沉淀物用尿素溶解。离心后的变性上清液 留存以备进一步纯化。将B7-H4蛋白重新折叠后用0.22μm过滤器进行过滤消毒，然后分装保存。标 准BSA法测定其蛋白含量。标准SDS-PAGE法测定蛋白纯度和分子量，同时进行Western blot以验证 结果，所用的凝胶为15％分离胶和5％浓缩胶；先用60V电压持续25min，再用120V电压持续1.5h； 将靶蛋白胶块小心剥离，并剪出同胶块大小一致的滤纸和PVDF膜，将胶块和滤纸浸泡在转膜缓冲液 中，PVDF膜浸泡在甲醇中，以滤纸-胶块-PVDF膜-滤纸的顺序放置于转膜装置，然后以24V的电压运 行120min；转膜结束后，用1×PBST配制的5％牛奶室温下封闭PVDF膜，摇床孵育2h，用PBST洗膜 4次，每次于摇床上10min，用抗His标签抗体为一抗室温下摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于 摇床上10min，用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温下摇床孵育2h，于曝光间用ECL显色法进行曝光。
在杂交瘤培养液中接种上述技术方案所得杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗 体。对于BLJ杂交瘤B7-H4，我们首先通过Western Blotting技术从24个克隆中挑出13个阳性克隆 株(图1)；免疫荧光结果显示，所述B7-H4单克隆抗体高度识别B7-H4分子(图2)；通过免疫组化 染色发现抗人B7-H4抗体能识别人肠癌、乳腺癌和肝癌多种肿瘤切片上表达的B7-H4分子(图3)；竞 争抑制试验结果进一步显示，所述B7-H4单克隆抗体对同一肿瘤切片的B7-H4的亲和力超过现有商品 化抗体(ABCam的ab209242，图4)；因此，B7-H4单克隆抗体可制备用于识别人B7-H4的检测抗体， 亦可能成为检测肿瘤细胞的重要标志。
因此，本发明同时要求保护上述B7-H4单克隆抗体作为生物学检测指标，在制备用于肿瘤细胞检 测试剂/药物中的应用。
通过Elispot技术，B7-H4单克隆抗体对人B7-H4蛋白引起的T细胞增殖抑制的阻断作用(图5)。
因此，本发明也同时要求保护上述B7-H4单克隆抗体在制备阻断B7-H4信号对T细胞增殖的抑制 性药物中的应用。
在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病的方法，该疾病的特征是会生长且表达B7-H4蛋 白的肿瘤细胞，该方法包括给予患者有效的剂量且包含所述B7-H4单克隆抗体的化学免疫偶联物，以 治疗或预防所述疾病。所述疾病可能为癌症，例如结肠癌、乳腺细胞癌或者卵巢癌等。
因此本发明也同时要求保护一种杂交瘤细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
又在另一方面，本发明提供一种治疗自身免疫失调的方法，该方法包括给予患者有效的剂量且包 含所述B7-H4单克隆抗体的化学免疫偶联物，以治疗或预防所述疾病，例如艾滋病，因此本发明同时 要求保护一种杂交瘤细胞株在研究化疗耐药机制中的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明公开的杂交瘤细胞株的制备方法超越目前的CHO细胞培养方法，该方法可以在无/低血清 条件下的B7-H4的单克隆抗体的体外生产，产生更高的生产力，同时保留与人类免疫系统兼容的糖基 化模式。所产生的B7-H4单克隆抗体能特异性地识别B7-H4分子，与现有的单抗相比，具有更高的亲 和力，灵敏性和人源抗原识别力，具有抑制T细胞增殖的作用，可用于临床抗肿瘤和感染炎症领域。
附图说明
图1为24种B7-H4抗体克隆的Western Blot检测；
图2为B7-H4抗原抗体结合荧光检测；
图3为B7-H4单克隆抗体识别人肠癌、乳腺癌和肝癌的B7-H4分子；
图4为B7-H4单克隆抗体(8.2)对同一肿瘤切片的B7-H4的亲和力超过现有商品化抗体；
图5为B7-H4单克隆抗体对B7-H4蛋白引起的T细胞增殖抑制的阻断作用。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：B7-H4单克隆抗体的制备
本实施例描述本发明的抗人B7-H4单克隆抗体的制备。
(1)B7-H4单克隆抗体的制备
从细菌中纯化出不含有信号肽和跨膜序列的B7-H4蛋白，用纯化的B7-H4蛋白注射Balb/C小鼠 进行初次免疫：称取上述制备好的抗原，用PBS稀释，选取4-6只周龄的雌性Balb/C小鼠，弗氏完 全佐剂乳化以后，加入玻璃注射器中，按照200μL/只的剂量，于小鼠腹部、腹股沟淋巴结、背部等处 皮下多点注射，在首次免疫后第21天，用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，15天 后，再用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，并在免疫结束一周后，采血检测，融合 前2-3天进行最后一次免疫(直接注射，不加佐剂，不乳化)。
具体构建B7-H4蛋白步骤：(a)基因合成与亚克隆：
将不含信号肽和跨膜序列的B7-H4克隆到载体pET30a中，并在大肠杆菌中用组氨酸(His)作为 蛋白表达的标签。
(b)表达量评估：
将重组质粒转染至大肠杆菌BL21Star(DE3)中。将单个菌落接种到含有卡那霉素的LB培养基 中；在37℃以200rpm摇菌培养，然后用IPTG诱导培养。用SDS-PAGE和Westernblot检测其表达。
(c)放大表达量:
将存放于甘油中的BL21Star(DE3)接种到含卡那霉素的TB培养基中，15℃培养。当吸光度OD600 达到1.2时，用IPTG在15℃诱导细胞，培养16小时，离心获取细胞。
(d)纯化和分析：
用裂解缓冲液重悬细胞颗粒，然后超声处理。离心后的沉淀物用尿素溶解。离心后的变性上清液 留存以备进一步纯化。将B7-H4蛋白重新折叠后用0.22μm过滤器进行过滤消毒，然后分装保存。标 准BSA法测定其蛋白含量。标准SDS-PAGE法测定蛋白纯度和分子量，同时进行Western blot以验证 结果，所用的凝胶为15％分离胶和5％浓缩胶；先用60V电压持续25min，再用120V电压持续1.5h； 将靶蛋白胶块小心剥离，并剪出同胶块大小一致的滤纸和PVDF膜，将胶块和滤纸浸泡在转膜缓冲液 中，PVDF膜浸泡在甲醇中，以滤纸-胶块-PVDF膜-滤纸的顺序放置于转膜装置，然后以24V的电压运 行120min；转膜结束后，用1×PBST配制的5％牛奶室温下封闭PVDF膜，摇床孵育2h，用PBST洗膜 4次，每次于摇床上10min，用抗His标签抗体为一抗室温下摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于 摇床上10min，用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温下摇床孵育2h，于曝光间用ECL显色法进行曝光。
(2)B7-H4单克隆抗体的生产与同种性鉴定
为了确定纯化的抗体的同种性，可以使用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。
用1μg/ml的人免疫球蛋白抗体于4℃下过夜涂覆微量滴定孔盘的孔。用1％的BSA遮蔽后，该孔 盘于1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照抗体在温室下反应1-2小时。该孔盘然后 于人IgG1或人IgM-特异的碱性磷酸酶连接探针进行反应。
用化学发光的免疫印迹Westernblot分析的方法鉴定BLJ杂交瘤B7-H4识别特异性。预备B7-H4 蛋白并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％的胎牛 血清遮蔽后，用待检测的B7-H4单克隆抗体进行探测。人IgG的结合作用可用碱性磷酸酶标记的抗人 IgG的抗体来检测并且用BCIP/NBT片剂来显影。
也可由细胞免疫荧光的方法鉴定B7-H4单克隆抗体识别特异性：收集生长良好的293T/mock、 293T/B7-H4-GFP细胞进行离心甩片，1×104细胞/片，丙酮固定后按常规免疫组化步骤进行，阴性对 照组的一抗为鼠IgG，实验组一抗为1：100稀释后纯化的mAb，二抗为罗丹红标记羊抗鼠IgG，封片 观察。细胞免疫组化的结果也显示B7-H4单克隆抗体仅能特异性识别转基因细胞表面B7-H4分子的表 达。
以商品化的抗体为阳性对照组(参照图1)，为24种B7-H4抗体克隆的Western Blot检测，1，2， 3，4，5，6，9，11，13，19，21为Anti-B7-H4阴性克隆，7，8，10，12，14，15，16，17，18，20，22，23，24(图中用倒角矩形框标识)为13种Anti-B7-H4阳性克隆。1-24代表24种不同克隆号的 抗体，A代表商业化抗体。C代表阴性样本，B代表过表达B7-IgG样本。图中直角矩形框内条带为B7H4 抗原抗体结合位置，图中用倒角矩形框标识的为Anti-B7-H4阳性克隆。
图2为B7-H4抗原抗体结合荧光检测，高表达B7-H4-IgG样本组与对照组相比，表现出较强的GFP 和Anti-B7-H4，绿色荧光GFP代表转染B7H4-IgG的阳性细胞，红色荧光为Anti-B7H4。
图3为B7-H4单克隆抗体识别人肠癌、乳腺癌和肝癌的B7-H4分子。
图4为B7-H4单克隆抗体(8.2)对同一肿瘤切片的B7-H4的亲和力超过现有商品化抗体(ABCam 的ab209242)。
实施例二：在无/低血清条件下的B7-H4的单克隆抗体的体外生产方法
(a)采用逐步降低血清的方法驯化中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保 藏编号为CGMCCNo.17298的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株以适应低浓度血清培养。将含10％新生牛血清的 MEM培养液中稳定生长的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的 MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105 cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中。经过数代后，BLJ杂交瘤B7-H4细胞株在含5％ 新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯 化培养。以同样的方法使BLJ杂交瘤B7-H4细胞株逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。
(b)将适应了1％新生牛血清培养条件的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株在细胞三角瓶中进行悬浮培 养驯化适应。细胞培养液为自行研制的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培养基，细胞初始接种密度为 1.0×106cells/ml，转速设置为160r/min，置于5％CO2培养箱中进行悬浮培养。
(c)将血清含量分别为无血清、1％、2％和3％新生牛血清的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培 养基与密度为0.5×106cells/ml细胞悬液在细胞培养瓶进行BLJ杂交瘤B7-H4细胞株的悬浮培养， 培养过程中每隔24小时取样计细胞数。
(d)将BLJ杂交瘤B7-H4细胞株分别以0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml三个初始密度接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，培养基为含1％新生牛血清的 BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培养基，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。
随着血清使用浓度的降低，BLJ杂交瘤B7-H4细胞株贴壁生长的形态逐步发生改变,最终经无血 清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。当血清浓度降低至1％时，BLJ杂交瘤B7-H4细胞株生 长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复。在悬浮培养驯化后 期，悬浮BLJ杂交瘤B7-H4细胞株呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少， 胞体大小基本一致，生长速度正常，说明BLJ杂交瘤B7-H4细胞株已经适应了1％血清悬浮状态生长。
将不同血清浓度的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培养基于细胞培养瓶中悬浮培养BLJ杂交瘤B7-H4细胞株，每隔24小时取样计数，结果表明血清浓度分别为1％、2％和3％的BLJ杂交瘤B7-H4 细胞株无血清培养基在整个生长周期细胞密度相似，细胞培养密度优于无血清培养基组，因此选择 BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培养基中添加1％血清浓度为最适培养基。
将BLJ杂交瘤B7-H4细胞株分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75× 106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml， 培养48小时细胞密度分别为1.1×106、1.8×106和3.1×106，因此选择0.75×106cells/ml为 细胞初始接种密度。
自行研制的BLJ杂交瘤B7-H4细胞株无血清培养基使用浓缩的XerumFreeTM XF205基础上，添加 多种血清和蛋白替代组分，同时补充氨基酸、微量元素和维生素等营养成分(配制在电阻率为18.2M Ωcm,25℃，无热原的超纯水中，并经过0.22μm微孔滤膜过滤除菌)。
复苏冻存的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，用TIL初始培养基培养过夜，第二天收集TIL，离心弃上 清，PBS洗后用不完全TIL培养基重悬，以2×104/200ul铺板于已包被IFN-γ抗体的Elispot板， 以CD3(OKT3)为TIL细胞激活阳性对照组，以B7H4蛋白10ug/ml，B7H4抗体浓度为10ug/ml分别加入 实验组，培养24h后，PBS洗涤5次，7-B6-ALP二抗37℃孵育1h，PBS洗涤5次，BCIP/NBT-plus显 色，出现适量大小斑点后流水终止，晾干后Elispot仪读板。每个斑点代表一个IFN-γ+的TIL细胞， 通过记录斑点数目反应出激活的T细胞数目，以此评估B7-H4蛋白对TIL的抑制作用以及B7-H4抗体 对此抑制作用的阻断作用，参见图5。
实施例三：B7-H4单克隆抗体制备的抗肿瘤药物
B7-H4单克隆抗体是药物良好的靶向性载体，通过药物分子上特殊的功能基团如：羟基、巯基、 氨基等，将治疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物，避免了药物对其他正常组织的毒害作用， 选择性地发挥治疗作用。
作为一种选择，与本发明所得B7-H4单克隆抗体进行偶联的可以是阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、 博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。
作为一种选择，与本发明所得B7-H4单克隆抗体进行偶联的可以是标记物，例如放射性标记物、 荧光标记物。
作为一种选择，与本发明所得B7-H4单克隆抗体进行偶联的可以是细胞毒素，例如紫衫醇、细胞 松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、 秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、利多卡因及其类似 物或同系物。
利用本发明所得B7-H4单克隆抗体制备的抗肿瘤药物，结合PD-1抗肿瘤药物(或其他免疫性治 疗药物)进行组合治疗。治疗的组合方式包括：抗B7-H4和抗PD-L1/PD-1顺序给药，如先给患者服 用抗B7-H4抗体，隔一段时间服用抗PD-L1抗体；或者先给患者服用抗PD-L1/PD-1抗体，隔一段时 间服用抗B7-H4抗体；或者第一次同时服用抗B7-H4抗体和抗PD-L1/PD-1抗体，第二次再分开服用， 分开服用的方式多种，可以按照先抗B7-H4抗体后抗PD-L1/PD-1抗体的顺序服用，也可以按照不同 剂量的配比服用，例如80％的高剂量抗B7-H4抗体和20％的低剂量抗PD-L1/PD-1抗体，服用一周后， 再变为80％的高剂量抗PD-L1/PD-1抗体和20％的低剂量抗B7-H4抗体，因为我们发现在胶质瘤样本中 PD-L1和B7-H4之间存在互斥的表达模式，这有助于评估显著和不重叠的免疫逃逸途径。PD-L1和B7-H4 模块之间的差异性免疫微环境表明，有助于指导选择将PD-L1和B7-H4作为肿瘤生物标志物的免疫治 疗策略。未来的研究有必要揭示PD-L1低表达肿瘤(包括B7-H4)替代免疫检查点的生物学机制，这 显示了免疫治疗中临床B7-H4单克隆抗体生物标记物的潜在优势。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容 进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。
Claims (9)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株为分泌抗人B7-H4单克隆抗体的BLJ杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17298，保藏日期为2019年2月18日。
2.一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述抗人B7-H4单克隆抗体为保藏编号CGMCCNo.17298的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述抗人B7-H4单克隆抗体的制备是从细菌中纯化出不含有信号肽和跨膜序列的B7-H4蛋白，用纯化的B7-H4蛋白注射Balb/C小鼠进行初次免疫：称取上述制备好的抗原，用PBS稀释，选取4-6只周龄的雌性Balb/C小鼠，弗氏完全佐剂乳化以后，加入玻璃注射器中，按照200μL/只的剂量，于小鼠腹部、腹股沟淋巴结、背部等处皮下多点注射，在首次免疫后第21天，用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，15天后，再用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，并在免疫结束一周后，采血检测，融合前2-3天进行最后一次免疫。
4.根据权利要求3所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述B7-H4蛋白的构件步骤：
(a)基因合成与亚克隆：
将不含信号肽和跨膜序列的B7-H4克隆到载体pET30a中，并在大肠杆菌中用组氨酸(His)作为蛋白表达的标签；
(b)表达量评估：
将重组质粒转染至大肠杆菌BL21 Star(DE3)中，将单个菌落接种到含有卡那霉素的LB培养基中；在37℃以200rpm摇菌培养，然后用IPTG诱导培养，用SDS-PAGE和Western blot检测其表达；
(c)放大表达量:
将存放于甘油中的BL21 Star(DE3)接种到含卡那霉素的TB培养基中，15℃培养；当吸光度OD600达到1.2时，用IPTG在15℃诱导细胞，培养16小时，离心获取细胞；
(d)纯化和分析：
用裂解缓冲液重悬细胞颗粒，然后超声处理，离心后的沉淀物用尿素溶解，离心后的变性上清液留存以备进一步纯化，将B7-H4蛋白重新折叠后用0.22μm过滤器进行过滤消毒，然后分装保存，标准BSA法测定其蛋白含量，标准SDS-PAGE法测定蛋白纯度和分子量，同时进行Western blot以验证结果，所用的凝胶为15％分离胶和5％浓缩胶；先用60V电压持续25min，再用120V电压持续1.5h；将靶蛋白胶块小心剥离，并剪出同胶块大小一致的滤纸和PVDF膜，将胶块和滤纸浸泡在转膜缓冲液中，PVDF膜浸泡在甲醇中，以滤纸-胶块-PVDF膜-滤纸的顺序放置于转膜装置，然后以24V的电压运行120min；转膜结束后，用1×PBST配制的5％牛奶室温下封闭PVDF膜，摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于摇床上10min，用抗His标签抗体为一抗室温下摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于摇床上10min，用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温下摇床孵育2h，于曝光间用ECL显色法进行曝光。
5.权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于肿瘤细胞检测的药物中应用。
6.一种权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体的生产方法，包括悬浮培养法、微载体培养法、中空纤维细胞培养系统、微囊化细胞培养系统中的任意一种。
7.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株在研究化疗耐药机制中的应用。
8.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体联合PD-L1抗体在抑制肿瘤细胞免疫逃逸中应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910225351.5A CN109988752A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910225351.5A CN109988752A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109988752A true CN109988752A (zh) | 2019-07-09 |
Family
ID=67131006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910225351.5A Pending CN109988752A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109988752A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112684185A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-20 | 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 | 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用 |
| CN114081941A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-25 | 上海奢旭企业管理中心(有限合伙) | B7-h4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用 |
| CN114641504A (zh) * | 2020-06-30 | 2022-06-17 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 抗b7h4抗体及其双抗和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101104639A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 |
| CN103981150A (zh) * | 2014-03-28 | 2014-08-13 | 苏州大学 | 抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 |
| CN107299085A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-10-27 | 广东医科大学 | 分泌抗人b7‑h4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人b7‑h4单克隆抗体及其应用 |
| CN108948204A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-12-07 | 苏州旭光科星生物技术有限公司 | 抗人b7-h4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒 |
-
2019
- 2019-03-25 CN CN201910225351.5A patent/CN109988752A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101104639A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 |
| CN103981150A (zh) * | 2014-03-28 | 2014-08-13 | 苏州大学 | 抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 |
| CN107299085A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-10-27 | 广东医科大学 | 分泌抗人b7‑h4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人b7‑h4单克隆抗体及其应用 |
| CN108948204A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-12-07 | 苏州旭光科星生物技术有限公司 | 抗人b7-h4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114641504A (zh) * | 2020-06-30 | 2022-06-17 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 抗b7h4抗体及其双抗和应用 |
| CN114641504B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-10-18 | 和铂医药(上海)有限责任公司 | 抗b7h4抗体及其双抗和应用 |
| CN112684185A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-20 | 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 | 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用 |
| CN112684185B (zh) * | 2020-12-25 | 2024-01-12 | 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 | 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用 |
| CN114081941A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-25 | 上海奢旭企业管理中心(有限合伙) | B7-h4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0014519B1 (en) | Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies | |
| JP7262597B2 (ja) | 二重特異性抗体及びその作製方法と使用 | |
| CN109988752A (zh) | 一种抗人b7-h4单克隆抗体及其制备和应用 | |
| CN108373504A (zh) | Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞 | |
| CN101104639A (zh) | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 | |
| TW202128978A (zh) | 連續收穫由培養的細胞生產的生物物質的設備和方法 | |
| CN110144007B (zh) | 抗h7n9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju79-01及其应用 | |
| CN100509849C (zh) | 可溶性人cd28分子检测试剂盒及其应用 | |
| CN101010341A (zh) | 包含与抗原偶联的ⅱ类mhc配体的疫苗组合物、其制备方法和用途 | |
| CN113817063A (zh) | 抗人异常凝血酶原抗体及其应用 | |
| Shirahata et al. | Cell hybridization, hybridomas, and human hybridomas | |
| CN109082413A (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN113461818A (zh) | 靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法 | |
| CN108840932B (zh) | 一种pd-1特异性抗体及其抗肿瘤应用 | |
| CN110511277A (zh) | 一种抗hsp90单克隆抗体及其应用 | |
| WO1991016061A1 (en) | SYNTHETIC POLY-Ig RECEPTOR, RECEPTOR-ANTIBODY COMPLEXES, PRODUCTION AND USE THEREOF | |
| CN109280644A (zh) | 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN109336975B (zh) | 一种靶向pd-1的肿瘤抑制性抗体及其应用 | |
| CN109970859A (zh) | Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞 | |
| CN110577603B (zh) | 一种抗cd3和抗cd19双特异性抗体 | |
| Hu et al. | Generation of a monoclonal antibody against the glycosylphosphatidylinositol-linked protein Rae-1 using genetically engineered tumor cells | |
| CN101274963B (zh) | 抗cd86人源化单克隆抗体 | |
| CN100369933C (zh) | 抗人gl50单克隆抗体的制备及其应用 | |
| Mao et al. | A monoclonal antibody against human UL16-binding protein 3 | |
| CN100509848C (zh) | 抗人ox40l单克隆抗体制备及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200513 Address after: Room jt3147, floor 1, building 1, No. 1185, Huyi Road, Jiading District, Shanghai Applicant after: Shanghai bairongji Medical Technology Co.,Ltd. Address before: Workplace 11, 1st floor, Building 27, 487 Tianlin Road, Xuhui District, Shanghai 200030 Applicant before: Shanghai Bairongji Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20240419 |