CN101010341A - 包含与抗原偶联的ⅱ类mhc配体的疫苗组合物、其制备方法和用途 - Google Patents
包含与抗原偶联的ⅱ类mhc配体的疫苗组合物、其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及由第一种类型的抗原蛋白质与第二种类型的II类MHC配体蛋白质组成的偶联产物，其中所述的两种蛋白质类型由一个或几个在生物学介质中稳定的键偶联在一起。
Description
本发明属于治疗性疫苗领域。本发明涉及通过将抗原与II类MHC配体(如LAG-3或CD4)偶联从而能够增强该抗原的免疫原性作用的疫苗。本发明特别涉及偶联产物，尤其是融合蛋白形式的，所述偶联产物包含至少一种特异于疾病的抗原和至少一种II类MHC配体，其中需要针对所述疾病诱导免疫。
II类MHC蛋白的天然配体，如LAG-3(也称为CD223)或CD4参与免疫识别，尤其是在与多种淋巴样细胞(如淋巴细胞)和抗原呈递细胞相互作用的水平。
PCT申请WO 99/04810中建议将II类MHC配体(如LAG-3)用作生产癌症免疫治疗疫苗的佐剂。
现在，本发明所作的研究使得使用由LAG-3和抗原组成的融合蛋白进行免疫的显著功效得以证明。事实上，与此前现有技术中所使用的、包含抗原和作为佐剂的LAG-3蛋白的疫苗组合物的剂量相比，申请人观察到由极低剂量的LAG-3-抗原偶联产物在体外获得非常显著的CD8应答。
这种功效源于在所述抗原对呈递细胞(树突状细胞)的靶向效应(矢量化)的基础上附加了传统LAG-3Ig佐剂效应，其允许LAG-3结合抗原内在化到II类MHC分子中。因此，所述抗原向I类MHC的呈递途径的重要的“交叉呈递”现象诱导T细胞CD8应答，然而外在抗原如疫苗蛋白预期只诱导CD4应答。
另外，下面报导的实验数据通过共焦显微镜显示出LAG-3Ig/Ag偶联产物在37℃快速内在化(在15分钟内内在化)。
因此，本发明的一个目的是偶联产物，优选基本上为蛋白质属性的产物，其由第一类抗原型蛋白质和II类MHC配体型的第二类蛋白质组成，两类蛋白质由一个或几个在生物学环境中稳定的键偶联。
在生物学环境中稳定的键是指但不限于共价键(例如，酰胺键或二硫键)、离子键、氢键、范德华力、疏水作用及其任意组合，所述键允许本发明的偶联产物在生物学环境中保持完整性。
优选本发明的偶联产物的两类蛋白质通过氢键或共价键结合，在特别优选的方式中以共价键结合。
根据第一个实施方案，本发明的偶联产物的特征在于两类蛋白质通过氢键结合。
根据第二个实施方案，本发明的偶联产物的特征在于两类蛋白质以共价键连接。两类蛋白质可以直接或间接地通过接头(bras deliaison)或连接分子以共价键结合。
直接共价键定义为本发明的第一类蛋白质与第二类蛋白质的原子共用一或几个电子。
接头或连接分子的例子包括多肽或氨基酸、多糖或单糖、多核苷酸或核酸、烷基、环烷基或芳基。
本发明的有益实施方案为融合蛋白形式的偶联产物，其中两类蛋白质都直接或间接地通过一或多个肽键连接。融合蛋白指能使本发明的两类蛋白质在同一个阅读相(phase de lecture)中成熟并表达的偶联产物。在融合蛋白的情况中，抗原和II类MHC配体通过N和/或C末端的共价键相连。
因此，制备了不同组合的重组蛋白，其中hLAG-3以其4-结构域Ig(D1D4)或2-结构域Ig(D1D2)的形式用作MHC配体，而且用作抗原的病毒抗原E7或gag-ne置于hLAG-3Ig的N-末端或C-末端。
作为其中第一和第二类蛋白质由共价键连接的偶联产物的例子，可为下述式(I)的偶联产物：
[(Ag)n(X)m(Y)p]q
其中：
Ag代表第一类蛋白质抗原，而且n代表偶联产物中的抗原分子数目，n为从1到5的整数，
Y代表第二类蛋白质的II类MHC配体，而且p代表偶联产物中II类MHC配体的数目，p为从1到2的整数，
X代表Ag和Y之间的键，而且m代表偶联产物中Ag和Y之间键的数目，m为从1到5的整数，
q为从1到5的整数。
当两类蛋白质直接或间接以共价键相连时，X选自包含如上定义的共价键、接头或连接分子的组中。
因此，在本发明的偶联产物中，第一类蛋白质可以包含单个抗原或几个不同或相同的抗原。优选地，本发明的偶联产物包含单个抗原。
同样，在本发明的偶联产物中，第二类蛋白质可以包含单个II类MHC配体或几个相同或不同的II类MHC配体。优选地，本发明的偶联产物包含单个II类MHC配体。
当本发明的偶联产物包含几个抗原和/或II类MHC配体时：
-每一类蛋白可以以多聚体(例如II类MHC配体二聚体)的形式聚集在一起，以共价键与抗原的单体或多聚体相连，
-抗原和/或II类MHC配体交替出现，可以形成重复单元的多聚体。
可以用本领域技术人员熟知的任何方法以融合蛋白的形式制备上述的蛋白构建体，例如重组DNA技术或化学合成。所述重组DNA技术基于重组DNA的制备，所述重组DNA包含编码本发明的蛋白构建体的核苷酸序列。
在通过化学合成制备本发明的偶联产物的情况中，所述抗原和II类MHC配体也可以一或几个氨基酸侧链通过共价键连接。在通过氨基酸侧链结合的情况中，偶联产物必须保留以高水平的亲和力结合树突状细胞的II类MHC的性质，并内在化所述抗原。
根据本发明的优选实施方案，在本发明的偶联产物中，第二类蛋白质选自包含hLAG-3、其同源物、片段和衍生物及其混合物的组中。
LAG-3的同源物、片段和衍生物是能够确保高亲和力结合树突状细胞的II类MHC并内在化第一类蛋白质抗原的那些同源物、片段和衍生物。
同源物意指来自非人物种的LAG-3蛋白，例如鼠LAG-3(mLAG-3)。有利地，所述蛋白质序列与人LAG-3的蛋白质序列有至少70％的同源性，优选有至少80％更优选有至少90％的同源性。两个蛋白质序列的同源性对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算同源性百分比，该算法可在NCBI网站(National Center forBiotechnology Information；
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。
Lag-3片段定义为能够确保高亲和力结合树突状细胞的II类MHC并内在化第一类蛋白质抗原的LAG-3的蛋白质序列，前述蛋白质序列的长度在50到200个氨基酸之间，优选60到175个氨基酸，更优选75到160个氨基酸。
作为hLAG-3片段的例子，可能特别要提到的是包括至少两个Ig型胞外N-端结构域的可溶性级分。这些结构域特别描述于WO91/10862和WO 95/30750。在偶联产物中，本发明特别包括选自如下一组中的LAG-3片段，所述组包含D1-D2(SEQ ID No.18和SEQ ID No.19)和D1-D4(SEQ ID No.18和SEQ ID No.19，SEQ ID No.20和SEQID No.21)片段的组。因此，在实验部分所报道的实例中，hLAG-3以其4-结构域(D1D4)或2-结构域(D1D2)形式使用，两个结构域D1-D2足以能保证高亲和力结合树突状细胞的II类MHC及随后的内在化。
以下其LAG-3衍生物或片段包括那些其氨基酸序列通过一或几个氨基酸的缺失、添加或取代而被修饰了的衍生物或片段，前述衍生物能够确保高亲和力结合树突状细胞的II类MHC并内在化第一类蛋白质抗原。例如可提及的是在位置73、75和/或76由谷氨酸取代一或几个精氨酸，如国际专利申请WO 95/30750和WO 98/23741所述。其也可以是LAG-3的剪接变体，如国际专利申请WO 98/58059所述。
作为能测定LAG-3的同源物、片段或衍生物是否落入本发明范围的结合测试的例子，可提及：
-间接免疫荧光细胞标记，其使用由EBV转化的表达II类MHC分子的B细胞系。总是使用阳性对照(命名为9.49或I3的pan-class II抗体，接下来为GAM-FITC)。在用GAH-FITC(第二层)显色出30μg/mL或10μg/mL的LAG-3Ig(第一层)时，标记达到饱和。在3或1μg/mL的LAG-3Ig时总是检测到信号。这些结果必须用融合蛋白LAG-3Ig/Ag获得；
-Bioacore型标记，其中II类MHC蛋白结合于载片并测定LAG-3Ig或LAG-Ig/Ag的结合亲和力。两种类型的“结合”必须具有类似的Kd值(解离常数)，在任何情况下都小于5×10-8，优选小于3×10-9。
作为允许测定LAG-3的同源物、片段或衍生物是否落入本发明范围的内在化测试的例子，可提及在载片上标记以及用共焦显微镜分析。依据下述程序纯化从人单核细胞(用IL-4和GM-CSF体外培养)在6天内获得树突状细胞：
-收集细胞并计数；
-1100rpm离心5分钟；
-在PBS 1X(37℃平衡后)中将细胞稀释到1百万个/mL；
-放置300μL细胞悬浮液/载片，于37℃使细胞在以聚赖氨酸包被的载片上粘附30min；
-去除流体，用500μL PBS 1X/0.1％ NaN3/3％奶于37℃下饱和30min；
-将载片置于冰上(4℃)冷却10-15分钟；
-去除流体，用冰冷的PBS 1X轻轻冲洗；
-将在PBS 1X/0.1％ NaN3/3％冰冷奶中稀释的400μL抗体(或者30μg/mL的hLAG-3Ig蛋白)铺板，并在4℃孵育30min；
-去除流体，用冰冷的PBS 1X轻轻冲洗；
-对于每个额外的标记(LAG-3Ig标记的GAH-FITC)重复最后两个步骤；
-将载片置于37℃ 15-20min。(置于孵箱中使之内在化)；
-将用400μL的冰冷PBH 1x/2％冰冷PFA铺板，并在4℃下固定细胞15min；
-去除流体，用冰冷的PBS 1X轻轻冲洗；
-加入20-30μL的Fluoromount G，小心地放上盖片，使之于室温下干燥1-2个小时，之后置于4℃下；
-用共焦显微镜分析载片。
根据本发明的优选实施方案，在本发明的偶联产物中，第一类抗原型蛋白质选自包含疾病特异性抗原的组，所述疾病的治疗需要T细胞应答。更特别地，所述组可以包含病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原、寄生虫抗原及其混合物。
因此，第一类抗原型蛋白质是病毒抗原，优选选自包含病毒HPV、HBV、HCV、HIV、EBV、CMV以及其混合物的组，非常特别地，所述组包含HPV E7抗原和HIV gag-nef抗原。事实上，以开发新的疫苗蛋白为目标，将LAG-3与病毒抗原融合(来自HPV-16的E7或来自HIV-1的gag-nef)。除了LAG-3的佐剂(免疫刺激)效应之外，所述目标是获得抗原对不成熟树突状细胞的靶向。这些细胞表达II类MHC分子，LAG-3配体，其以极快的速度再次循环到细胞内部，因此与其一起拉动连接于LAG-3的抗原。以此方式构建了包含hLAG-3Ig和病毒抗原的融合分子，表达于哺乳动物细胞中，纯化并进行功能测试。
第一类抗原型蛋白质也可以是选自肺结核、麻风病和李斯特菌属(Listéria)的细胞内细菌组的细菌抗原。另外更有利地也可以是选自包括CEA、Melan A、PSA、MAGE-3、HER2/neu、HPV的E6和E7蛋白(宫颈癌)的组的肿瘤抗原。
本发明提供了基于使用LAG-3的新的疫苗策略，其基于使用天然配体而不是抗体。这提供了使所注射的LAG-3Ig和抗原的剂量非常明显地降低的优势，其反过来又使工业规模的含有LAG-3Ig和抗原的治疗性疫苗组合物的开发更为容易。另外，这些组合物允许在人体中以低剂量的治疗性疫苗诱导高T-细胞CD8应答。必须强调所显示的CD4应答增强的价值，其将在体内支持CD8应答，并使后者极为强烈且时间延长，即有效破坏病毒或肿瘤细胞群(réservoirs)。
因此，本发明还涉及包含至少一种如上定义的偶联产物的疫苗组合物，有利地，偶联产物与药学载体组合，疫苗组合物的形式允许口服、皮肤、皮下、局部、肌肉内、静脉内或动脉内给药，或者与在机体的任何液态小室(compartiments liquidiens)给药。
有利地，本发明的组合物含有0.1μg/mL与1mg/mL之间、优选0.1μg/mL与100μg/mL之间、更优选0.1μg/mL与10μg/mL之间及特别优选0.1μg/mL与1μg/mL之间的偶联产物。用ELISA测定这些组合物。
本发明也涉及为个体接种疫苗的方法，所述方法包括为患有与第一类蛋白质抗原有关的疾病的个体施用足量的如上所定义的组合物。
此外，本发明还涉及如上所定义的偶联产物作为药物的用途。
有利地，本发明涉及如上所定义的偶联产物用于制备免疫原性组合物的用途，所述免疫原性组合物能够诱导免疫，优选能够诱导特异性T-细胞CD4和/或CD8应答。
事实上，以下实验部分所提供的数据显示两种不同蛋白质(E7和gag-nef)在蛋白质LAG-3Ig的C末端位置的偶联对于T CD4应答(由II类MHC分子所呈递)和CD8(由I类MHC分子所呈递)来说，在体外都获得了极高水平的免疫。此体外免疫原性用健康供体的PBMC来定义。
将细胞暴露于蛋白质形式的E7或gag-nef抗原，所述蛋白被PBMC中的树突状细胞摄取，并以11至20个氨基酸的肽的形式由II类MHC分子呈递，48小时后，用Elispot通过定量应答于所述暴露而分泌细胞内γ-干扰素的细胞来研究CD4应答。
用Elispot通过定量对由I类MHC分子呈递的、长9至10个氨基酸的肽刺激48小时作出应答而分泌细胞内γ-干扰素的细胞来研究CD8应答。
两种情况下，在体外用抗原刺激三次后，都获得了前述T CD4或CD8应答的扩大。
当单独加入E7或gag-nef抗原时以及以较低水平加入LAG-3Ig和E7或LAG-3Ig和gag-nef混合物时，用Elispot(由于用健康的HPV-16-和HIV-志愿者启动初生T细胞(cellules T na
ves)或者用健康HPV-16+和HIV+志愿者加强)不能获得这些高CD4和CD8应答。
更为有利地，本发明还涉及本发明的偶联产物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗感染性疾病和/或癌症。作为感染性疾病的例子，可以提到病毒性、细菌性和寄生虫性感染。优选地，所述感染性疾病或癌症的治疗包含经T CD8+细胞的免疫应答。
根据本发明的特定实施方案，使用本发明的偶联产物以生产药物，所述药物用于治疗感染性疾病和/或癌症，其中本发明的II类MHC配体型的第二类蛋白质能够诱导通过T细胞的抗原特异性免疫应答。
由下述的实施例结合附图，本发明的其他优势和特点将是很明显的，其中：
-图1显示定点诱变后(2个点突变)，E7wt的理论序列和测序后获得的E7Rb的序列之间核酸(A)和肽(B)序列的比对。
-图2简述了表达重组蛋白hLAG-3Ig-E7、E7-hLAG-3Ig的表达载体pCDNA3和pSEC和对照E7Rb-Ig的克隆策略。箭头表示所用的寡核苷酸。
-图3显示gag(A部分)和nef(B部分)的祖序列组B、共有组B和LAI的序列比对。为优化gag-nef蛋白而选择的p17、p24和nef的氨基酸以下划线表示。
-图4简述了表达重组蛋白hLAG-3Ig-gagnef、gagnef-hLAG-3Ig的表达载体pCDNA3和pSEC及gagnef-Ig作为对照的克隆策略。箭头表示所用的寡核苷酸。
-图5显示纯化的hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D4)Ig-E7蛋白的SDS-PAGE凝胶图；还放置了纯化的hLAG-3Ig蛋白(0.71mg/mL)作为参照。三种凝胶电泳的分子量标记(Biorad high range marker)是相同的。A：考马斯蓝染色。B：用17B4单克隆抗体进行抗hLAG-3的Western印迹。
-图6显示hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D4)Ig-E7与EBV转化的B细胞的II类MHC的结合(以由阳性细胞百分数加权的平均荧光表示：纵轴)。
-图7显示37℃下hLAG-3(D1D4)Ig-E7在不成熟人树突状细胞中的内在化，用免疫荧光检测(细胞内的点)。
-图8显示纯化的hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef蛋白的SDS-PAGE凝胶图；还放置了hLAG-3Ig蛋白(PDC12.096批)作为参照(Biorad Kaléidoscope分子量标记)。A：考马斯蓝染色。B：用17B4单克隆抗体进行抗hLAG-3的Western印迹分析。
-图9显示hLAG-3Ig(Hénogen S017/LPC/041008批)、hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef在EBV转化的B细胞II类MHC上的结合(以浓度函数的荧光平均强度表示)。
-图10显示CD40、CD80、CD83和CD86激活标记在树突状细胞表面的表达，所述树突状细胞与人IgG1、sCD40L、hLAG-3Ig(HénogenS017/LPC/041008批)、hLAG-3(D1D4)Ig/E7或hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef孵育2天。膜表达与荧光强度成正比。
1)表达载体的构建
构建了能使由哺乳动物细胞表达和分泌不同重组蛋白的载体。
1.1)所用载体
1.1.1)克隆载体
选择了两种表达载体用于在CHO-K1细胞中表达重组蛋白：
-选择了Invitrogen的pCDNA3.1(+)用于表达hLAG-3Ig/抗原融台蛋白。这些重组蛋白质在N末端含有hLAG-3前导序列，因此使其能在培养基中分泌。
-选择了Invitrogen的pSEC-tag2-hygroA和pSEC-tag2-hygroB用于表达病毒抗原/hLAG-3Ig融合蛋白。该载体含有来自启动子上游的IgK前导序列，以使蛋白质分泌。
-选择了Henogen的Dα-LAG3-DID4ΔEK-hIgG1融合物用于表达hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef融合蛋白。该载体含有编码hLAG-3(D1D4)Ig的序列，其中位于″Ig-铰链-Fc″区上游的内含子A由接头序列(编码DDDDKGSGSG，SEQ ID No.17)所取代，以排除剪接不确定性(ambigu
tés d’éissage)。该载体还含有dhfr基因，其能选择其基因组中整合了质粒序列的细胞，同时使该序列在氨甲蝶呤存在下扩增。
1.1.2)hLAG-3Ig的来源
-起始质粒的确认和扩增：
分别从pCDNA3-hLAG3(D1D4)-IgG1和pCDM7-hLAG-3(D1D2)IgG1载体扩增hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D2)Ig。
pDNA3-hLAG-3(D1D4)-IgG1：从pCDM7-hLAG-3Ig上将hLAG-3Ig插入物亚克隆到pCDNA3中的XbaI位置。
由转化的细菌母液重新扩增这些质粒，所述细菌母液于-80℃存储于甘油中。用不同的限制性酶消化以确认质粒的性质。
-hLAG-3(D1D4)IgG1和hLAG-3(D1D2)IgG1的测序：
由于在所述项目开始时hLAG-3(D1D4)IgG1和hLAG-3(D1D2)IgG1的序列仍未完全得知，因此在pCDNA3.1+中亚克隆之后对其完全测序。
因此，余下所有有关IgG1(所有的内含子都存在)中的内含子的数目和hLAG-3(D1D2)与IgG1之间的剪接序列的不明确性都得到了解决。除了IgG1 A内含子的+4位置插入T外，还检测到包括IgG1的CH3区域中包括两个氨基酸改变的三个突变。
基于这些结果，编辑命名为重建的hLAG-3(D1D4)IgG1和重建的hLAG-3(D1D2)IgG1的序列。
1.2)hLAG-3Ig和HPV-16 E7的融合
在上述的表达载体中，将非致癌的突变形式的E7克隆于hLAG-3Ig(D1D4或D1D2)的C-或N-末端。同时融合E7和无LAG-3的IgG1作为对照。
1.2.1)诱变E7
双重突变HPV-16 E7以阻止其与负责E7致癌活性的细胞蛋白Rb形成二聚体(参见Lee at al.Nature 1998 vol 391 p859；Burg et al.Vaccine 2001 vol 19 p3652；Boursnell et al.Vaccine vol.14 p.1485)。
获得含有野生形式的E7(于T/A克隆)的质粒pEF6-E7。
用Stratagen的Quickchange试剂盒定点诱变E7以用G替换氨基酸C24及用G替换E26。用含有所需突变的互补寡核苷酸对通过PCR扩增质粒pEF6-E7：
oligo 1、E7 mut 5’：
CTGATCTCTAC
GGTTATG
GGCAATTAAATGACAGC(SEQ ID NO.1)
Oligo 2、E7 mut 3’：
GCTGTCATTTAATTGC
CCATAAC
CGTAGAGATCAG(SEQ ID No.2)
随后将PCR产物与Dpn1一起孵育，Dpn1是仅针对甲基化位点有活性的酶，因此在PCR产物上消化模板DNA。然后将获得的产物转化到XL1-Blue细菌中。
通过消化并测序E7mutRb-插入物而确认如此获得的质粒。测序结果表明事实上存在所需的突变。相对于图1所示的E7的理论序列，还检测到不影响氨基酸组成的三个其他突变。
1.2.2)hLAG-3Ig-E7和E7-hLAG-3Ig在表达载体中的克隆
用允许在其末端添加限制性位点的寡核苷酸通过PCR扩增E7/Rb-(为简单起见，本文以下将其称为E7)和hLAG-3Ig插入物。
Stratagene的高保真酶Pfu turbo用于PCR程序。
克隆策略概括于图2。
-将hLAG-3Ig-E7克隆至pCDNA3.1：
用以下的寡核苷酸对从pEF6_E7/rb-扩增E7：
Oligo 9(E7 5′-XhoI)：
CCGCTCGAGATGCATGGAGATACACCTAC(SEQ ID No.3)
含有XhoI位点和E7的ATG
Oligo 10(E7 3′-stopXbal)
GCTCTAGATTATGGTTTCTGAGACAG(SEQ ID No.4)
含有具有终止密码子的E7的3′区域和XbaI位点。
纯化前用XhoI和XbaI消化PCR产物。
分别用以下的寡核苷酸对从pCDM7-LAG-3(D1D2)*-IgG1和pCDN3-LAG-3(D1D4)-IgG1中扩增LAG-3(D1D2)IgG1和LAG-3(D1D4)IgG1：
Oligo 7(Lag3 5′-atgEcoRl)
GGAATTCGCCCAGACCATAGGAGAGATG(SEQ ID No.5)
含有EcoRI位点、hLAG-3的ATG，具有分泌信号肽，
Oligo 8(IgG1 3′-XhoI)：
CCGCTCGAGTTTACCCGGGGACAGGGAG(SEQ ID No.6)
含有IgG1的3′区域，没有终止密码子。
纯化前用EcoRI和XhoI消化PCR产物。
将hLAG-3(D1D4)Ig-E7插入到pCDNA3.1+中在两个步骤中完成。首先，将hLAG-3(D1D4)Ig连接到用EcoRI和XhoI消化的pCDNA3.1+中。由此获得克隆中间产物pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig。然后将E7插入到事先用XhoI和XbaI消化的pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig中。
为了将hLAG-3(D1D4)Ig-E7融合产物克隆到pCDNA3.1+中，首先将两种插入物都连接在一起。在凝胶上纯化如此获得的hLAG-3(D1D4)Ig-E7片段，然后直接插入到事先用EcoRI和XbaI消化的pCDNA3.1+中。
同样通过将hLAG-3(D1D2)Ig连接到用EcoRI和XhoI消化的pCDNA3.1+中来制备pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig质粒。
对这些表达载体的插入物测序。测序结果确认插入物是与读框同相(en phase)的正确插入。
-将E7-hLAG-3Ig克隆到pSECtag-hygroA中：
用以下的寡核苷酸对从pEF6-E7/Rb-扩增E7：
Oligo 3(E7 5′-AscI)
GGCGCGCCATGCATGGAGATACACCTAC(SEQ ID No.7)
含有AscI位点和E7的ATG，
Oligo 15(E7 3′-Kpn1)
GGGGTACCTGGTTTCTGAGAACAGATG(SEQ ID No.8)
含有没有终止密码子的E7的3′区域和KpnI位点。
纯化前用AscI和KpnI消化PCR产物。
分别用以下的寡核苷酸对从pCDM7-LAG-(D1D2)-IgG1和pCDNA3-LAG-3(D1D4)-IgG1扩增LAG-3(D1D2)IgG1和LAG-3(D1D4)Ig：
Oligo 16(Lag3 5′(-D1KpnI)
GGGGTACCCTCCAGCCAGGGGCTGAG(SEQ ID No.9)
含有KpnI位点和结构域1的5′区域，没有信号肽，
Oligo 17(IgG1 3′-stopXhoI)
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID No.10)
含有IgG1的3′区域，具有终止密码子和XhoI位点。
纯化前用KpnI和XhoI消化PCR产物。
用以下的寡核苷酸对从pCDNA-LAG-3(D1D4)-IgG1(用于在E7的3’末端克隆到pSEC，其用作无Lag3的对照)扩增IgG1：
Oligo 18(IgG1 5′Kpn1)
GGGGTACCCGAGGGTGAGYACTAAGC(SEQ ID No.11)
含有KpnI位点和IgG1的A内含子的5′区域，
Oligo 19(IgGI 3′-stopXhoI)
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID No.12)
含有IgGI的3′区域，具有终止密码子和XhoI位点。
纯化前用KpnI和XhoI消化PCR产物。
将E7-hLAG-3Ig融合产物插入到pSECtag-hygroA中在两个步骤中进行：
-将消化的E7的PCR产物连接到事先用AscI和KpnI消化的pSECB中。由此获得命名为pSEC-E7的克隆中间产物；
-然后将hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D2)Ig和IgGI的PCR产物连接到事先用KpnI和XhoI消化的pSEC-E7中。
用酶限制方法确认这些表达载体。
-将E7克隆到Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物中：
目的载体是来自Henogen的载体Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物。在此载体中，LAG-3(D1D4)Ig的编码序列插入到两个XhoI限制性位点之间。如上所述，此载体含有LAG-3(D1D4)Ig的编码序列，其中A内含子(来自Ig绞链区5′位置的内含子)被接头序列(编码DDDDKGSGSG：SEQ ID No.17)取代。此没有A内含子的LAG-3(D1D4)Ig的编码序列命名为LAG-3(D1D4)Ig/且通过扩展将同样的命名保留用于由这些构建体编码的蛋白质。
编码E7的片段源于质粒pcDNA3-LAG-3(D1D4)-E7。
E7往Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物中的克隆分两个步骤进行：
第一步，将LAG-3(D1D4)-Ig/片段插入到pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig-E7中。
用XhoI切割Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1载体，并用T4聚合酶将其粘端平端化。相应于不具有XhoI平端/XhoI平端插入物的Dα载体的片段作为最终目的载体而保留。在编码Ig的序列的C内含子水平用酶BsrGI消化XhoI平端/XhoI平端插入物，以删除编码Ig的序列的最后300个碱基对，所述序列包括终止密码子(LAG-3(D1D4)Ig/XhoI平端/BsrGI插入物)。
用酶EcoRI(EcoRI位点包含于克隆位点上游的pCDNA3多克隆位点)消化pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig-E7载体，粘端用T4聚合酶平端化。用酶BsrGI切割如此线性化的质粒以去除编码LAG-3(D1D4)的序列和编码Ig的5’序列，目的是保留编码Ig的最后300个碱基对(EcoRI平端/BsrGIIg-E7 pcDNA)。
将LAG-3(D1D4)Ig/XhoI平端/BsrGI插入物连接到EcoRI平端/BsrGIIg-E7 pCDNA3中。
依据所得克隆的限制性分析，选择了含有pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig/E7的克隆。
第二步，将LAG-3(D1D4)Ig/E7构建体克隆到Dα中。
用酶PmeI(围绕pCDNA3的多克隆位点的2个PmeI位点，平端)切割pCDNA3中所含有的LAG-3(D1D4)Ig/E7插入物，并连接到不具有该插入物的、事先通过切割XhoI平端/XhoI平端并去磷酸化而制备的Dα中。
通过限制性分析选择包含在Dα中是正确方向的LAG-3(D1D4)Ig/E7插入物的克隆。
将一个Dα-LAG-3(D1D4)Ig/E7克隆的DNA再次转化到DH5α株中并用maxiprep Endofree(Qiagen)制备，用于瞬时转染CHO-K1细胞，以确认质粒的翻译产物。最初的Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物和pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig载体用作阳性对照，Dα-载体用作阴性对照，其中用XhoI从Dα-载体去除插入物，然后连接。转染二十四小时后，用特异性ELISA定量上清中的LAG-3。平行地，用A-琼脂糖蛋白(Pharmacia)沉淀存在于上清和细胞裂解物中的重组蛋白，用抗LAG-3Western印迹分析以评估其大小。表观分子量是所预期的分子量。
Dα-LAG-3(D1D4)Ig/E7克隆的DNA是用于稳定转染CHO-dhfr-细胞的DNA。
1.3)hLAG-3Ig与HIV-1 gag-nef的融合
该HIV-1抗原结合于hLAG-3Ig(D1D4或D1D2)的C-或N-末端，并克隆至上述的表达载体中。同时将该抗原和无LAG-3的IgG1融合作为对照(图4)。
选择用于制备该疫苗重组蛋白的HIV-1抗原是gag p17、gag p24和nef的一部分的优化融合产物。
1.3.1)所使用的Gag-nef序列
确定gag p17、gag p24和nef嵌合蛋白的序列以使欧洲患者(B株)能够有最大的机会被检测出来。
为此，我们将每种蛋白质的肽序列作了比较，肽序列在网址http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M GROUP 2002- Aug.html获得。
下述序列的比对如图3所示：
-B株的祖序列(la séquence ancestrale)(基于系统发生树产生的理论序列，B组的现代病毒由其衍生)
-B株的共有序列(在所有B组的现代序列中共有，不考虑其表现)
-LAI株的序列(第一个欧洲分离物)
为p24、p17和nef每种蛋白选择的序列相应于祖序列，除了当氨基酸与LAI和共有序列都不同时，这两个序列对于该氨基酸是一致的。在这种情况下，我们认为在现代群体中发现共有序列和LAI序列的机会要大于祖序列(图3)。随后将这三个肽序列末端对末端放置。缺失nef的前60个氨基酸，因为其不含有在患者中所检测到的任何主要T表位，与nef的细胞病原效应无关。
由ATG-Biosynthetics Company优化如此获得的gag-nef嵌合体肽序列所对应的DNA序列，以在仓鼠细胞中表达(CHO-K1细胞)。在gagnef的5′和3′端添加限制性位点，以进行亚克隆。然后由ATG-Biosynthetics Company合成所述基因，提供于pCR4topo载体中。
1.3.2)将hLAG-3Ig-gagnef和gagnef-hLAG-3Ig克隆至表达载体克隆策略概括于图4。
-将hLAG-3Ig-gagnef克隆至pCDNA3.1中：
从pCR4topo-gagnef将Gag-nef亚克隆到pCDNA3.1-hLAG-3(D1D4)Ig和pCDNA3.1-hLAG-3(D1D2)Ig载体中XhoI和XbaI之间。
通过酶消化确认表达载体pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-gagnef和pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-gagnef。
-将gagnef-hLAG-3Ig克隆至pSECtag-hybroB中：
此克隆分三步进行：
*第一步：从pCR4topo-gagnef将gag-nef亚克隆至pSECtag-hygroB中的Hind3和Not1之间。由此获得pSEC-gagnef克隆中间产物。
*第二步：将hLAG-3Ig(D1D4和D1D2)克隆到pSECtaghygroB中的XhoI。此步骤提供了克隆中间产物以获得大量XhoI消化的插入物。事实上，如果用XhoI直接消化PCR产物，则随后将会平端克隆出大量的未消化片段，产生除非通过测序否则不可能去除的假阳性。
分别用下述的寡核苷酸对从pCDNA3-LAG-3(D1D4)-IgGI和pCDNA3-LAG-3(D1D2)-IgGI中通过PCR扩增hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D2)Ig：
Oligo 5(Lag3 5′-D1XhoI)：
CCGCTCGAGTCCAGCCAGGGGCTGAG(SEQ ID No.13)
含有XhoI位点和结构域1的5′区域，不具有信号肽。
Oligo 17(IgGI 3′-stopXhoI)
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID No.14)
含有具有终止密码子的IgGI的3′区域和XhoI位点。
用下述的寡核苷酸对从pCDNA3-LAG-3(D1D4)-IgG1通过PCR扩增IgGI：
Oligo 11(IgG1 5′XhoI)
CCGCTCGAGCGAGGGTGAGTACTAAGC(SEQ ID No.15)
含有XhoI位点和IgGI的A内含子的5′区域。
Oligo 17(IgG1 3′-stopXhoI)
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID No.16)
含有具有终止密码子的IgGI的3′区域和XhoI位点。
纯化前用XhoI消化PCR产物。然后将其连接到事先用XhoI消化的pSECtag-hygroB中。
*第三步：将hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D2)Ig克隆到pSEC-gagnef中。
通过用XhoI消化，从pSECtag-hybroB中去除hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D2)Ig和IgGI插入物，用PNK平端化5′粘末端。用NotI消化pSEC-gagnef载体，同样用PNK平端化粘性末端。连接插入物和纯化的载体。
对这些表达载体插入物之间的接头序列测序以确认读框的完整性。
-将gagnef克隆到Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物中：
目的载体是Henogen所用的用于生产LAG-3(D1D4)Ig、Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物的载体。
gagnef编码片段源于pCDNA3-LAG3(D1D4)Ig-gagnef。
将gagnef克隆至Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物分两步进行：
第一步，将LAG-3(D1D4)-Ig/片段插入到pCDNA-LAG-3(D1D4)Ig-gagnef中。
用XhoI切割Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1载体，用T4聚合酶平端化粘性末端。保留相应于不具有XhoI平端/XhoI平端插入物的Dα载体的片段作为最终目的载体。用BsrGI消化XhoI平端/XhoI平端插入物，切割Ig编码序列的C内含子以去除包括终止密码子的Ig编码序列的最后300个碱基对(LAG-3(D1D4)Ig/XhoI平端/BsrGI插入物)。
用EcoRI(EoRI位点包含于克隆位点上游pCDNA3的多克隆位点中)消化pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig-gagnef载体，用T4聚合酶平端化粘性末端。用BsrGI切割如此线性化的质粒，以去除编码LAG-3(D1D4)的序列和编码Ig的5′序列，保留编码Ig的序列的最后300个碱基对(pCDNAEcoRI平端/BsrGI Ig-gagnef)。将LAG-3(D1D4)Ig/XhoI平端/BsrGI片段连接到pcDNA3 EcoRI平端/B srGI Ig-gagnef中。
根据对所得克隆的限制性分析，选择含有pCDNA3-LAG-3(D1D4)Ig/gagnef的克隆。
第二步，将LAG-3(D1D4)Ig/gagnef克隆到Dα中。
通过用PmeI(围绕pCDNA3的多克隆位点的2个位点，平端)消化去除pCDNA3中所包含的整个LAG-3(D1D4)Ig/gagnef插入物，将其克隆到事先通过切割和去磷酸化而制备的没有XhoI平端/XhoI平端插入物的Dα中。
通过限制性分析选择在Dα中以正确方向包含LAG-3(D1D4)Ig/gagnef插入物的克隆。
将其中一个Dα-LAG-3(D1D4)Ig/gagnef克隆的DNA转化回DH5α株中，用maxiprep Endofree(Qiagen)制备并用于瞬时转染CHO-K1细胞，以检查质粒的翻译产物。原始Dα-LAG3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物和pCDNA-LAG-3(D1D4)Ig载体用作阳性对照，Dα-载体用作阴性对照，Dα-载体的插入物已经用XhoI删除，然后重新连接。转染后二十四小时，用特异性ELISA分析上清的LAG-3。平行地，通过A-琼脂糖蛋白(Pharmacia)沉淀存在于上清和细胞裂解物中的重组蛋白，用抗LAG-3Western印迹分析以评估其大小。表观分子量是所预期的分子量。
所选择的Dα-LAG-3(D1D4)Ig/gagnef克隆的DNA是用于稳定转染CHO-dhfr-细胞的DNA。
2)建立表达融合蛋白的稳定的CHO细胞系
2.1)由pCDNA3和pSEC载体建立表达融合蛋白的稳定细胞系。
将事先在pCDNA3或pSEC中构建的表达载体转染CHO-K1细胞以获得表达感兴趣重组蛋白的稳定生产细胞系。
2.1.1)转染方法与克隆的分离
2.1.1.1)质粒消化
为了使获得表达感兴趣蛋白的稳定转染体的机会最大化，转染之前将表达载体线性化。所选择的限制性酶是Bg12，其在位置1消化pCDNA和pSEC载体，而不消化hLAG-3Ig、gagnef或E7中的任一插入物。用10μg载体和30U的酶进行消化，然后沉淀DNA，溶于20μL的H2O UP中。
然而，比较研究显示该线性化步骤不是至关重要的，因为所获得的阳性稳定转染体的数目与其是否线性化几乎没什么区别。
2.1.1.2)转染
在具有8至14个传代数的CHO-K1细胞(ECCAC Ref.No.85081005)中独立地进行3至4次转染。
大体上，用5μL的Lipofectamine(GIBCO)，用2μg质粒转染6-孔板上半铺满的CHO-K1细胞。
2.1.1.3)抗性克隆选择
转染24小时后，用胰蛋白酶裂解细胞，接种到150mm圆平皿中，其中存在含有选择抗生素的培养基。选择抗生素对于pCDNA载体为0.5mg/mL的G418，对于pSEC载体为0.4mg/mL的潮霉素B。每2-3天换一次培养基，直至出现分离的细胞克隆(1至2周)。
在显微镜下用P200移液管手工吸取具有抗生素抗性并因此整合质粒的细胞克隆，转移到96孔板。然后检测每个表达感兴趣蛋白的克隆，随后扩增阳性克隆。
2.1.1.4)克隆目的
按照能鉴别所得克隆的转染日期及其所含有的质粒的编码命名克隆。
前两个数字对应于转染的日和月，接下来为对应于所转染的质粒的字母，然后是克隆的数目。例如，1月7日转染得到的具有pCDNA质粒的克隆将被命名为07_01_Ax(x为克隆数)。
按照下述命名法为每种质粒指定字母：
A：pCDNA
B：pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig
C：pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig
D：pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-E7
E：pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-E7
F：pSEC
G：pSEC-E7-hLAG-3(D1D4)Ig
H：pSEC-E7-hLAG-3(D1D2)Ig
I：pSEC-E7-IgG1
J：pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-gagnef
K：pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-gagnef
L：pSEC-gagnef-hLAG-3(D1D4)Ig
M：pSEC-gagnef-hLAG-3(D1D2)Ig
N：pSEC-gagnef-IgG1
2.1.2)最高产hLAG-3Ig-E7重组蛋白克隆的选择
所转染的第一个质粒系列除了作为不带E7的阳性对照的pCDNA-LAG3(D1D4)Ig和pCDNA-LAG-3(D1D2)Ig外，还有pCDNA-LAG-3(D1D4)Ig-E7、pCDNA-LAG-3(D1D2)Ig-E7。
2.1.2.1)瞬时转染效率分析
转染24小时后，用抗LAG3抗体(17B4)在细胞内标记，随后用FACS对细胞的转染效率作初步评估。所显示的瞬时转染效率对质粒pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig、pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig和pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-E7(40％至50％的阳性细胞)来说较好，但对pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-E7来说要少得多。
2.1.2.2)稳定转染克隆的检测
该转染序列重复4次：于07/01/2003、14/01/2003、21/01/2003和27/03/2003。
通过ELISA用抗LAG-3检测每个转染细胞克隆的上清，适合的话不稀释或稀释两次。
扩增每个转染系列中的最佳克隆，每个克隆冷冻两个安瓿瓶。然后用ELISA比较这些克隆的上清，目的是只保留最高产克隆。
冷冻克隆，随后相互比较：
对于pCDNA：7-1-A1、14-1-A2、21-1-A2
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig：7-1-B1、7-1-B3、7-1-B4、14-1-B8、14-1-B14、21-1-B11、27-6-B6
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig：7-1-C1、7-1-C2、14-1-C12、14-1-C16、21-1-C8、27-5-C5
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-E7：7-1-D3、14-1-D4、14-1-D8、21-1-D1、27-5-D3
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-E7：7-1-E1、7-1-E3、7-1-E5、14-1-E9、14-1-E11、21-1-E6、27-5-E8。
还通过其上清的Western印迹分析比较最佳克隆。联合测试允许为每种转染质粒选择克隆，其将被扩增并用作重组蛋白的生产细胞。
选择作为重组蛋白生产系的克隆为：
对于pCDNA：7-1-A1
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig：7-1-B4
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig：21-1-C8
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-E7：7-1-D3
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-E7：14-1-E11
如所预期，hLAG-3(D1D4)Ig-E7迁移稍微高于hLAG-3(D1D4)Ig(图5)。所观测到的两个条带相应于单体和二聚体形式的hLAG-31g，在存在β-巯基乙醇的情况下通过加热来还原并不足够有效。
2.1.2.3)生产细胞库的冷冻
将在有限传代数后冷冻的两个安瓿瓶中的一个解冻并再次扩增，直至铺满175cm2瓶子，由此瓶子中冷冻5个安瓿瓶作为“主细胞库(Master Cell Bank)”，日期03/03/2003。然后依据细胞系，自分离克隆后的传代数为5至7之间。
随后从175cm2瓶子冷冻另五个安瓿瓶作为“工作细胞库(WorkingCell Bank)”，日期为05/03/2003。
2.1.3)最高产E7-hLAG-3Ig重组蛋白克隆的选择
2.1.3.1)瞬时转染效率分析
转染24小时后，用偶联于FITC的抗人IgG抗体在细胞内标记后，通过FACS评估细胞的转染效率。pSEC-E7-hLAG-3(D1D4)Ig的瞬时转染效率高于pSEC-E7-hLAG-3(D1D2)Ig或pSEC-E7-IgG1的效率。尽管DNA制备的质量更好(用midiprep Qiagen试剂盒代替SIGMA genelute试剂盒)，但pSEC质粒的瞬时转染效率低于用pCDNA质粒获得的效率(低于10％对50％)。
2.1.3.2)稳定转染克隆的检测
该转染系列重复四次：于23/04/03、07/05/2003、19/06/2003和27/06/2003。
所有用pSEC-E7-hLAG-3(D1D4)Ig和pSEC-E7-hLAG-3(D1D2)Ig转染的细胞克隆的上清均在未稀释的情况下用抗LAG-3通过ELISA检测。表达E7-LAG3的细胞上清的OD远低于表达LAG3-E7的细胞的OD。
用pSEC-E7-IgG1转染的细胞克隆明显不能通过ELISA分析，所述细胞表达不含有LAG3的融合产物。这些都在用偶联于FITC的人抗-IgG抗体于细胞内标记后通过FACS检测。
扩增每个转染系列的最佳克隆，每个克隆冷冻两个安瓿瓶。以下的冷冻克隆相互比较：
对于pSEC：23-04-F4、07-05-F1
对于pSEC-E7-hLAG-3(D1D4)Ig：23-04-G3、07-05-G27、07-05-G32、19-06-G8、19-06-G40
对于pSEC-E7-hLAG-3(D1D2)Ig：23-04-H10、07-05-H11
对于pSEC-E7-IgG1：23-04-I12、07-05-I13、19-06-I4、19-06I19
然后通过ELISA或通过细胞内标记将这些克隆的上清相互比较，以只保留最高生产系。选择作为重组蛋白生产系的克隆是：
对于pSEC：07-05-F1；
对于pSEC-E7-hLAG-3(D1D4)Ig：19-06-G8
对于pSEC-E7-hLAG-3(D1D2)Ig：没有克隆扩增，因为上清的OD与E7-D1D4克隆相比较低。然而两个安瓿瓶的07-05-H11均保存在液氮中；
对于pSEC-E7-IgG1：07-05-I13。
2.1.3.3)生产细胞库的冷冻
由铺满的175cm2瓶冷冻五个安瓿瓶的19-06-G8和07-05-I13系作为“主细胞库”，日期为17/05/2003。按照所考虑的细胞系，在这种情况中，自分离克隆开始的传代数为5至8之间。
由175cm2瓶冷冻另外五个安瓿瓶作为“工作细胞库”，日期为21/07/2003。
2.1.4)最高hLAG-3Ig-gagnef重组蛋白生产克隆的选择
2.1.4.1)瞬时转染效率分析
用偶联于FITC的抗人IgG抗体于细胞内标记后，在瞬时转染的细胞上用FACS评估转染效率。瞬时转染效率为大约10％。
2.1.4.2)稳定转染克隆的检测
该转染系列重复3次：于07/05/2003、19/06/2003和27/06/2003。
用抗LAG-3通过ELISA在未稀释的情况下检测每个转染细胞克隆的上清。
扩增每个转染系列的最佳克隆；每个克隆冷冻两个安瓿瓶。然后将以下的冷冻克隆相互比较：
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-gagnef：07-05-J2、07-05-J23、07-05-J53、07-05-J71、19-06-J18、19-06-J32、19-06-J48
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-gagnef：07-05-K19、07-05-K71、19-06-K33、19-06-K43、19-06-K44、17-06-K7
随后通过其上清的ELISA或通过细胞内标记将这些克隆相互比较，以只保留最高生产系。选择作为重组蛋白生产系的克隆为：
对于pCDNA-hLAG-3(D1D4)Ig-gagnef：07-05-J53
对于pCDNA-hLAG-3(D1D2)Ig-gagnef：07-05-K19和27-06-K7。
2.1.4.3)生产细胞库的冷冻
于17/05/2003，除了来自185cm2瓶作为“主细胞库”的27-06-K7的3个安瓿瓶外，还由175cm2瓶冷冻了07-05-J53和07-05-K19系的五个安瓿瓶。依据所考虑的细胞系，自分离克隆开始的传代数为4至8之间。
于21/07/2003，还同样冷冻了五个或三个额外的安瓿瓶作为“工作细胞库”。
2.2)由Dα载体建立表达融合蛋白的稳定细胞系
将所构建的Dα-LAG-3(D1D4)Ig/E7和Dα-LAG-3(D1D4)Ig/gagnef表达载体转染到CHO-dhfr-细胞中，以获得表达感兴趣重组蛋白的稳定生产系。
2.2.1)转染方法与克隆的分离
2.2.1.1)转染
在存在核糖核苷和脱氧核糖核苷(培养基MEMα RN/RdN+，GIBCO 22571-020)的情况下，孵育用于在Dα载体中的构建体转染的CHO-dhfr-细胞(DSMZ ACC126)。在前一天将CHO-dhfr-细胞接种到25cm2瓶子中，并于04年7月25日用2.5μL的lipofectamine 2000(Invitrogen)，用1μg Dα-LAG-3(D1D4)Ig/E7或Dα-LAG-3(D1D4)Ig/gagnef质粒转染。原始Dα-LAG-3-D1D4-ΔEK-hIgG1融合物和pEGFP(Clontech)载体的转染分别用作阳性和阴性对照。转染6小时后用MEMα RN/RdN+培养基替换转染培养基。
2.2.1.2)抗性细胞的选择
转染两天后，用胰蛋白酶裂解细胞，对于每个转染，以5000个细胞/孔接种在具有MEMα RN/RdN-选择培养基(GIBCO 22561-021)的4个96孔板中。约一周后，用抗LAG-3通过ELISA分析各自代表一细胞群的每个孔的上清。扩增最具生产力的细胞群用于冷冻，并在氨甲蝶呤存在下维持，以扩增质粒衍生序列(及因此编码感兴趣蛋白的基因)。
选择并扩展细胞群和克隆的所有步骤均在含有无内毒素的胎牛血清(GIBCO16000-044)的培养基中进行并透析，以避免被来自血清的核苷污染。
2.2.2)最高产hLAG-3Ig/E7重组蛋白克隆的选择
2.2.2.1)最具生产能力的hLAG-3Ig/E7转染体群的选择
在通过ELISA用抗LAG-3检测的400个细胞群中，有6个的生产能力远高于其他细胞群，选择这6个细胞群(群编号3、4、9、11、20、21)。这些细胞群中的每一个均冷冻两个安瓿瓶。
2.2.2.2)用氨甲蝶呤扩增基因
以150000个细胞/孔将这些细胞群接种在6-孔板中，与50nM氨甲蝶呤一起培养。细胞群9和11的上清中hLAG-3Ig/E7的量在氨甲蝶呤存在下增加。因此将氨甲蝶呤的剂量增加到150和250nM。
细胞群9对250nM氨甲蝶呤有抗性，所生产的hLAG-3Ig/E7的量较高。因此，于04年9月11日在这些条件下进行有限稀释实验。选择源于此细胞群的两个克隆(编号9-23和9-26)并于04年10月8日冷冻。
细胞群11对250nM氨甲蝶呤有抗性，所生产的hLAG-3Ig/E7的量较高。因此，于04年9月3日在这些条件下进行有限稀释实验。选择源于此细胞群的五个克隆(编号11-1、11-2、11-5、11-6、11-10)并于04年10月6日冷冻。
根据所生产的hLAG-3Ig/E7蛋白评估这些克隆在化学上确定的并添加了2mM丁酸盐(已知其为增强重组蛋白生产的分化制剂)的培养基(含低水平的外源蛋白)中的适应。基于其在无血清培养基中的生产水平、所生产的蛋白质的质量(用抗LAG-3抗体进行Western印迹并显色)及其生长能力，选择克隆hLAG-3Ig/E7#11-5。于04年11月5日冷冻20个安瓿瓶的该克隆。
2.2.3)最高产hLAG-3Ig/gagnef重组蛋白克隆的选择
2.2.3.1)hLAG-3Ig/gagnef转染体最具生产能力的细胞群的选择
用抗LAG-3通过ELISA检测的400个细胞群中，选择24个(群编号为1至24)冷冻。
2.2.3.2)用氨甲蝶呤扩增基因
以150000个细胞/孔将这些细胞群接种在6-孔板中，与50nM氨甲蝶呤一起培养。与150和250nM氨甲蝶呤一起培养十一个对50nM氨甲蝶呤有抗性的细胞群。
细胞群1对250nM氨甲蝶呤有抗性，所生产的hLAG-3Ig/gagnef的量较高。因此于04年9月6日在这些条件下进行有限稀释测试。选择源于该细胞群的五个克隆(编号1-14、1-21、1-49、1-56、1-100)，并于04年10月6日冷冻。
细胞群6对250nM氨甲蝶呤有抗性，所生产的hLAG-3Ig.gagnef的量较高。因此于04年9月11日在这些条件下进行有限稀释测试。选择五个克隆(编号6-15、6-55、6-57、6-58、6-65)，并于04年10月5日冷冻。
根据所生产的hLAG-3Ig/gagnef蛋白评估这些克隆在化学上确定的并添加了2mM丁酸盐的培养基中的适应。根据在无血清培养基中的生产力、所生产的蛋白质的质量(用抗LAG-3抗体进行Western印迹并显色)及其生长能力，选择克隆hLAG-3Ig/gagnef No.1-21。该克隆的20个安瓿瓶于04年11月29日冷冻。
3)融合蛋白的生产与纯化
生产并纯化hLAG-3Ig-E7、hLAG-3Ig/E7和hLAG-3Ig/gagnef蛋白和作为对照的hLAG-3Ig。
3.1)融合蛋白的生产
3.1.1)来自hLAG-3Ig-E7和hLAG-3Ig生产系的大量上清的生产
大规模培养生产hLAG-3(D1D4)Ig(CHO 7-1-BA)、hLAG-3(D1D4)Ig-E7(CHO 7-1-D3)、hLAG-3(D1D2)Ig(CHO 21-1-C8)和hLAG-3(D1D2)Ig-E7(CHO 14-1-E11)蛋白细胞系以获得含有几毫克蛋白的上清体积(每种蛋白1.3至1.6升上清)。
所有培养均与粘附细胞一起进行，所述粘附细胞接种于含有每瓶80mL培养基的175cm2瓶中。所用的培养基是Ham F12(Invitrogen)，添加了10％FCS(S135批)，无任何选择性抗生素。
以1/10稀释度稀释细胞并培养4天，或者以1/3稀释度稀释培养2天。因此，于培养基变得过黄且细胞脱落之前收获上清。
生产批次中重组蛋白的浓度为：
-hLAG-3(D1D4)Ig(CHO 7-1-B4)：1.4mg/L
-hLAG-3(D1D4)Ig-E7(CHO 7-1-D3)：0.33mg/L
-hLAG-3(D1D2)Ig(CHO 21-1-C8)：4μg/L
-hLAG-3(D1D2)Ig-E7(CHO 14-1-E11)：5μg/L
因此，只含有2个hLAG-3的Ig结构域的重组蛋白的生产比具有4个hLAG-3的Ig结构域的更为有效。
3.1.2)由hLAG-3Ig/E7#11-5和hLAG-3Ig/gagnef#1-21克隆生产大体积上清
在血清存在下，用粘附细胞获得了hLAG-3Ig/E7#11-5和hLAG-3Ig/gagnef#1-21克隆生物量的增加。在铺满时，用PBS冲洗细胞，30℃下将其培养于添加有250nM氨甲蝶呤和2mM丁酸盐的ProCHO4-CDM培养基(Cambrex BE12-029Q)中。每24或36小时回收培养基。如此获得几个生产，通常在该表达系统中，上清中所生产的量对于hLAG-3Ig-E7大于2mg/L，对于hLAG-3Ig-gagnef融合蛋白大于1mg。
3.2)hLAG-3Ig-E7和hLAG-3Ig、hLAG-3Ig/E7和hLAG-3Ig/gagnef的纯化
在蛋白A柱上，从所生产的上清批次中纯化hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D4)Ig-E7、hLAG-3(D1D2)Ig、hLAG3(D1D2)Ig-E7、hLAG-3Ig/E7和hLAG-3Ig/gagnef重组蛋白。
3.2.1)所使用的纯化方案
由培养上清中纯化重组蛋白在用PBS平衡过的蛋白A(Pharmaciaref-17-5079-01)柱上进行。
在0.22μm滤器上过滤培养物上清。用Pharmacia的FPLC系统将其上样到事先用PBS平衡过的蛋白A柱上。在hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D4)Ig-E7、hLAG-3(D1D2)Ig、hLAG-3(D1D2)Ig-E7纯化期间，未结合于蛋白A的蛋白质用10ml PBS冲洗，然后用0.1M甘油缓冲液梯度(pH在4和2.7之间)洗脱重组蛋白。收集1ml级分。
当梯度达到pH2.7缓冲液的约20％时，UV探测器表明存在洗脱峰。洗脱图谱对于四种重组蛋白都相同。
收集含有纯化蛋白的级分，随后在脱盐柱(Pharmacia的Hi-trapdesalting 5ml)上于PBS缓冲液中脱盐。在浓缩器(Vivascience ref.V50201 cut-off 10kDa)上将如此得到的蛋白质浓缩(在其用于功能测试之前)，在SpinX柱(ref.Costar 8160)上过滤除菌。均分所述产物并于-80℃冷冻。
对于hLAG-3Ig/E7和hLAG-3Ig/gagnef重组蛋白，在PBS和0.1M甘油缓冲液，pH4中冲洗后，直接在0.1M甘油缓冲液，pH2.7洗脱，并对PBS透析，0.2μm过滤，均分并于-80℃保存。
3.2.2)纯化步骤的产率
每次纯化、脱盐和Centricon浓缩步骤的产物都用抗hLAG-3Ig通过ELISA来分析。
表1概括了hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG3(D1D4)Ig-E7、hLAG-3(D1D2)Ig和hLAG-3(D1D2)Ig-E7重组蛋白由ELISA获得的浓度和每个纯化步骤的产率。
表1
| 上清 | 洗脱液 | 冲洗 | 7-8-9级分 | 10-11-12级分 | 13-14级分 | 产率 | ||
| hLAG-3(D1D4)Ig | 浓度(μg/mL) | 1.45 | 0.02 | 0 | 352 | 191 | 45.2 | 78.3％ |
| 总量(μg) | 2169 | 31.8 | 0 | 1698.6 | ||||
| 脱盐后 | 170μg/mL(对12ml) | 10％ | ||||||
| 浓缩后 | 111μg/mL(对12ml) | |||||||
| hLAG-3(D1D4)Ig-E7 | 0.33 | 0.02 | 0 | 45.2 | 67.2 | 35.2 | 75.8％ | |
| 总量(μg) | 514.6 | 34.8 | 0 | 390 | ||||
| 脱盐后(μg/mL) | 39μg/mL(对12ml) | 25％ | ||||||
| 浓缩后(μg/mL) | 84μg/mL(对12ml) | |||||||
| hLAG-3(D1D2)Ig | 浓度(μg/mL) | 0.004 | 0.003 | 0 | ＜0.25 | ＜0.25 | ＜0.25 | / |
| E7-hLAG-3(D1D2)Ig-E7 | 浓度(μg/mL) | 0.006 | 0.006 | 0 | ＜0.25 | ＜0.25 | ＜0.25 | / |
hLAG-3(D1D4)Ig和hLAG-3(D1D4)Ig-E7在蛋白A柱上纯化期间获得的产率为约77％，相对比较满意。
于脱盐柱上替换缓冲液期间以1.5的系数稀释产物是正常的。
表2概括了在纯化的hLAG-3Ig/E7和hLAG-3Ig/gagnef蛋白中，除由LAL(Cambrex)估计的内毒素的量之外的由BCA蛋白分析(Perbio)获得的量。
表2
| hLAG-3Ig/E7E7 | 纯化日期 | 纯化蛋白的量(mg) | 内毒素水平(EU/mg) |
| 04年11月16日 | 1.8 | 1.3 | |
| 04年12月1日 | 2.8 | 1.5 | |
| 05年1月11日 | 1.08 | 0.5 | |
| 05年1月28日 | 2.40 | 1.4 | |
| hLAG-3Ig/gagnef | 纯化日期 | 纯化蛋白的量(mg) | 内毒素水平(EU/mg) |
| 04年12月10日 | 1.25 | 0.3 | |
| 05年1月10日 | 2.11 | 0.43 | |
| 05年1月21日 | 1.60 | 0.65 |
在体外树突状细胞上和动物中，使用无血清培养基使内毒素水平很好地降至应用本发明需要的限度以下。
3.2.3)纯化产物的SDS-PAGE分析
用SDS-PAGE分析四种重组蛋白hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D4)Ig-E7、hLAG-3(D1D2)Ig和hLAG-3(D1D2)Ig-E7的纯化产物的性质和纯度。含10％丙烯酰胺的凝胶或者用考马斯蓝染色，或者转移到硝化纤维上用抗hLAG3和抗E7进行Western印迹分析(图5的例子)。
在蛋白A柱上纯化的hLAG-3(D1D4)Ig蛋白以与纯化的hLAG-3(D1D4)Ig蛋白相同的方式迁移(图5)。另一方面，较小的两种蛋白也大量存在于我们的纯化产物中。其相应于用于细胞培养的血清中存在的牛免疫球蛋白。
结合于E7的hLAG-3(D1D4)Ig迁移不太快，这是预期的。为了确认E7片段的存在，用抗E7抗体进行Western印迹分析。显示了hLAG-3(D1D4)Ig-E7融合物。
通过用考马斯蓝和抗LAG-3 Western印迹来分析每批hLAG-3(D1D4)Ig/-E7、hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef的纯化产物的性质和纯度(图8的例子)。
正如预期，纯化的hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG3(D1D4)Ig/gagnef蛋白具有明显高于hLAG-3(D1D4)Ig的分子量。gagnef片段大于E7片段，hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef融合蛋白具有最慢的迁移(图8)。使用无血清培养基允许去除污染蛋白质。
4)融合蛋白的功能性测试
测试以此方式纯化的hLAG-3(D1D4)Ig、hLAG-3(D1D4)Ig-E7、hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef蛋白结合II类MHC的能力、诱导树突状细胞成熟、被树突状细胞内在化的能力和诱导特异性CD4和/或CD8 T细胞应答的能力。
4.1)结合II类MHC
通过测定重组蛋白与LAZ-509细胞(由EBV转化的人B细胞，强烈表达II类MHC)的结合来评估其结合II类MHC的能力。以偶联于FITC的人抗Ig抗体的方式揭示结合。通过FACS定量LAZ-509细胞FITC标记的强度，其与重组蛋白与II类MHC的结合成正比(图6和9)。
hLAG-3(D1D4)Ig和E7的融合蛋白以与hLAG-3(D1D4)Ig类似的方式结合II类MHC，所述hLAG-3(D1D4)Ig在相同的条件下生产并纯化(图6)。
同样，hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef蛋白的结合能力与hLAG-3Ig的类似(图9)。
4.2)通过hLAG-3(D1D4)Ig/E7和hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef的人树突状细胞的成熟
由外周血单核细胞(PBMC)分化的不成熟树突状细胞与人IgG1细胞(作为阴性刺激对照)或hLAG3(D1D4)Ig/E7、hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef或hLAG-3Ig(10μg/mL)蛋白一起孵育2天。已知诱导树突状细胞成熟的可溶性CD40配体(sCD40L，3μg/mL)用作阳性刺激对照。随后通过CD40、CD80、CD83、和CD86激活标记的膜表达评估树突状细胞的活化(图10的例子)。LAG-3/E7或LAG-3/gagnef融合蛋白如阳性对照LAG-3Ig和sCD40L一样诱导树突状细胞的成熟。
4.3)hLAG-3Ig-E7在人树突状细胞中的内在化
测试了hLAG-3(D1D4)Ig-E7融合蛋白在树突状细胞中的内在化
4℃下，将由PBMC纯化的不成熟人树突状细胞与30μg/mL的重组蛋白孵育。然后将细胞置于37℃下15分钟。已知在这些条件下，hLAG3-Ig在树突状细胞中内在化并诱导其成熟。
共焦显微镜分析表明hLAG-3(D1D4)Ig-E7蛋白在不成熟人树突状细胞中有效地内在化(图10)。将载片置于37℃下15分钟后，细胞将LAG-3Ig-E7蛋白内在化，使得树突状细胞内具有了特异性标记，这在4℃下未发现(阴性内在化对照)。
4.4)对E7和gag-nef抗原的CD4和CD8 T-细胞应答
用标准Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB)纯化从健康供体新收集的PBMC细胞。
通过用500U/mL的GM-CSF(R&D Systems Inc.MN)和500U/mL的IL-4(R&D Systems Inc.MN)培养PBMC 7天来制备树突状细胞。
然后在2μg/mL抗CD40抗体和100ng/mL的Poly IC(Sigma Aldrich)的存在下，使树突状细胞成熟2天。
纯化的CD4和CD8 T细胞每周与树突状细胞用hLAG-3(D1D4)Ig/E7、hLAG-3(D1D4)Ig/gagnef、E7、gagnef或hLAG-3Ig(10μg/mL)蛋白刺激2小时，在培养基(CM：具有10％人AB血清、10nM L-谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI 1640)中以35Gy、10/1的T细胞/树突状细胞比例照射。在培养的第一周，加入1.103U/mL的IL-6和5U/mL的IL-12(R&DSystems Inc.MN)。在接下来的两周加入20U/mL的IL-2(R&D SystemsInc.MN)和10ng/mL的IL-7(R&D Systems Inc.MN)。
使用Elispot分析来定量对E7或gag-nef抗原应答而分泌γ-干扰素的效应细胞。
具有纤维素酯膜的96孔板(MultiScreen MAHA S4510；Millipore)用抗γ-干扰素抗体(MAB 285)包被过夜。冲洗孔，加入10％人AB血清的培养基，以四种不同的浓度加入细胞。将蛋白质加至每个孔中，将平板孵育过夜。第二天，丢弃培养基，通过加入第二生物素化的抗体(BAF285-生物素)冲洗孔。孵育平板2小时并冲洗，将链霉抗生物素蛋白-酶复合体(Streptavidine-AP；Boehringer Mannheim GmbH)加至每个孔。室温下孵育平板1小时，酶的BCIP-NBT底物(S3771：Proméga France)于碱性磷酸酶缓冲液、pH9.5(100mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM MgCl2)中加至每个孔中，平板于室温孵育10至20分钟。出现暗紫色斑点时就尽快用水冲洗以终止反应。用自动成像分析仪ELISPOT读数器(AID Strasbourg，Germany)计数斑点。
对抗原应答而分泌γ-干扰素的CD4或CD8 T效应细胞的频度可以基于形成斑点的细胞的数目和淋巴细胞群体中CD8或CD4 T细胞的频度通过用抗CD8或抗CD4抗体免疫标记来计算。
序列表
<110>伊缪泰普公司
<120>包含与抗原偶联的II类MHC配体的疫苗组合物，其制备方法和用途
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ccgctcgagt catttacccg gggacag
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Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Ser Gly
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<213>Artificial sequence
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<223>Domaine D1 de hHLAG-3
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Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met
145
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<211>90
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Domaine D2 de hHLAG-3
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Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu
1 5 10 15
Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe
20 25 30
Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His
35 40 45
His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp
50 55 60
Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val
65 70 75 80
Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly
85 90
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<212>PRT
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<220>
<223>Domaine D3 de hHLAG-3
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Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe
20 25 30
Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln
50 55 60
Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
85 90
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<211>82
<212>PRT
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<223>Domaine D4 de hHLAG-3
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Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
1 5 10 15
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
20 25 30
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
50 55 60
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
65 70 75 80
Pro Gly
Claims (19)
1.偶联产物，其特征在于其由抗原型的第一类蛋白质和II类MHC配体型的第二类蛋白质组成，两类蛋白质由一个或几个在生物学环境中稳定的键偶联。
2.根据权利要求1的偶联产物，其特征在于两类蛋白质以共价键相连。
3.根据权利要求2的偶联产物，其特征在于两类蛋白质通过接头或连接分子通过共价键间接地相连。
4.根据权利要求2或3任一项的偶联产物，其特征在于两类蛋白质形成融合蛋白质。
5.根据前述权利要求中任一项的偶联产物，其特征在于第二类蛋白质选自包括hLAG-3、其同源物、片段和衍生物及其混合物的组中。
6.根据权利要求5的偶联产物，其特征在于LAG-3片段是可溶性片段。
7.根据权利要求6的偶联产物，其特征在于LAG-3片段选自包含D1-D2和D1-D4片段的组。
8.根据前述权利要求中任一项的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质选自包括疾病特异性抗原的组，所述疾病的治疗需要T淋巴细胞应答。
9.根据前述权利要求中任一项的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质选自包含病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原、寄生虫抗原及其混合物的组。
10.根据权利要求9的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质是选自包含HPV、HBV、HCV、HIV、EBV、CMV病毒及其混合物的组中的病毒抗原。
11.根据权利要求10的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质选自包含HPV的E7抗原和HIV的gag-nef抗原的组。
12.根据权利要求9的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质是细菌抗原，所述细菌抗原选自结核病、麻风病和李斯特菌属的细胞内细菌的组中。
13.根据权利要求9的偶联产物，其特征在于抗原型第一类蛋白质是肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自包含CEA、Melan A、PSA、MAGE-3、HER2/neu、HPV的E6和E7蛋白质的组。
14.疫苗组合物，其特征在于其包含根据前述权利要求中任一项的至少一种偶联产物，任选地组合药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1至13任一项的偶联产物在制备用于治疗感染性疾病和/或癌症的药物中的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中感染性疾病和/或癌症的治疗包含经CD8+T细胞的免疫应答。
17.根据权利要求15或16任一项的用途，其中II类MHC配体型第二类蛋白质能够诱导经T细胞的抗原特异性免疫应答。
18.根据权利要求1至13任一项的偶联产物在生产用于癌症的免疫治疗和感染性疾病的免疫治疗的药物中的用途。
19.根据权利要求1至13任一项的偶联产物在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物能够诱导特异性CD4和/或CD8 T细胞应答。
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