CN107299085A - 分泌抗人b7‑h4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人b7‑h4单克隆抗体及其应用 - Google Patents

分泌抗人b7‑h4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人b7‑h4单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫应用技术领域，具体涉及分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7‑H4单克隆抗体及其应用，杂交瘤细胞株包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，具有良好的传代能力。抗体为分泌抗人B7‑H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。抗体能够识别人B7‑H4的原核表达产物、真核表达产物，及表达胞外功能区蛋白。该抗体应用于B7‑H4的免疫学检测，包括采用流式细胞术检测细胞表面表达B7‑H4，采用免疫组织化学技术和Western blot技术检测组织或细胞中表达的B7‑H4，采用免疫荧光技术、ELISA和化学发光免疫检测可溶性B7‑H4；也用于抗体药物设计。

Description

分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7-H4单 克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫应用技术领域，具体涉及分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗人B7-H4单克隆抗体及其应用。
背景技术
双信号学说认为T细胞活化需要抗原信号和共刺激信号，前者由T细胞表面TCR识别抗原提呈细胞中MHC结合抗原肽而传递，后者由共刺激/共抑制分子及其配体相互作用而实现，两种信号的整合可有效诱导T细胞活化。共刺激/共抑制分子包括一大群已知的和未知的表达于抗原提呈细胞和T细胞表面的膜分子，主要有免疫球蛋白超家族（Igsuperfamily，IgSF）和TNF超家族（TNF superfamily），这些分子在维持机体免疫平衡、决定T细胞免疫应答方向（应答或耐受）中起十分重要的作用，它们被称为免疫监测分子（immunecheckpoint molecules），包括刺激性免疫监测分子（stimulatory checkpointmolecules，SCPM）和抑制性免疫监测分子（inhibittory checkpoint molecules，ICPM），抑制性免疫监测分子对T细胞活化起负调节作用，如CD80/CD86-CTLA4、PD-L1-PD1、B7-H4及其受体、B7-H3及其受体、HVEM-BTLA等，在维持机体外周免疫平衡中起十分重要作用，其中CTLA-4和PD-1，尤其是后者已经作为肿瘤免疫治疗靶点在肿瘤治疗中得到应用。
B7-H4（ (B7x, B7S1, VTCN1)）是2003年发现的一种抑制性免疫监测分子，属于IgSF，人与小鼠的B7-H4有87%的氨基酸序列同源，成熟的B7-H4是一种50~80kDa的跨膜蛋白，拥有一个IgV区和一个IgC区，其mRNA可表达于淋巴组织和非淋巴组织，正常情况下其蛋白质在免疫细胞和非淋巴组织中不表达，但可诱导性表达于树突状细胞（DC）、单核/巨噬细胞、B细胞和T细胞等细胞表面。膜结合型B7-H4和可溶性B7-H4-Ig融合蛋白均可有效抑制T细胞活化，其效应为：抑制T细胞（包括CD4+和CD8+细胞）增殖和产生IL-2；阻滞T细胞的细胞周期；抑制CTL杀伤活性。在小鼠EAE模型中，采用B7-H4单抗和可溶性B7-H4-Ig融合蛋白阻断B7-H4信号途径可加重疾病的进展，但B7-H4缺陷小鼠仅表现轻度的Th1细胞活性升高，而细胞毒性T细胞功能不变，提示，B7-H4是一种T细胞活化的免疫抑制分子，但其作用较弱，可起到优化微调免疫功能的作用。最近，发现B7-H4与Treg免疫抑制功能发挥及中性粒细胞抗感染活性相关，如发现局部表达B7-H4可抑制受者对移植胰岛的同种移植排斥反应，并与提高Treg活性有关，采用B7-H4-Ig治疗NOD小鼠可抑制自身免疫性糖尿病的发生，其机制与抑制效应T细胞浸润和提高Treg细胞活性有关。还发现人骨髓间充质干细胞和胆管上皮细胞均高表达B7-H4，并且B7-H4的高表达与这些细胞的免疫抑制功能及抗凋亡作用关系密切。上述结果说明B7-H4信号途径对固有免疫细胞和适应性免疫细胞的功能均起负向调节作用，在维持机体内环境平衡中起重要作用。
近年来研究发现，B7-H4在多种肿瘤细胞中，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、肾癌、黑色素瘤等癌细胞表面呈高表达，B7-H4的表达与肿瘤的分型、分期和预后密切相关。而且在肿瘤的血管内皮细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞和树突状细胞表面也高表达。采用免疫组织化学技术检测了肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌等患者肿瘤组织中B7-H4的表达，发现上述肿瘤组织均高表达B7-H4。B7-H4也可以可溶性形式（soluble B7-H4, sB7-H4）存在于人的血液和其他体液中，即缺乏跨膜区和膜内区，有关可溶性B7-H4的产生机制尚不完全清楚。已经发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高，采用多抗-单抗配对建立了检测sB7-H4的ELISA夹心法，通过对600余例不同肿瘤患者外周血的检测，发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高，而且sB7-H4水平与肿瘤的分型、分期和预后均密切相关。因此，B7-H4被认为是一种新型广谱肿瘤标志物。
目前，发现B7-H4与肿瘤的免疫逃逸关系密切。Miyatake等发现乳腺癌组织中B7-H4表达强度与浸润性CD4+和CD8+T细胞的数量呈反比，提示B7-H4可抑制T细胞向肿瘤组织中浸润。而肿瘤微环境中肿瘤相关性巨噬细胞（tumor associated macrophage, TAM）高表达B7-H4，并与Treg构成负向免疫调节环路，有利于肿瘤的免疫逃逸，Salceda等发现表达B7-H4人卵巢癌细胞株在SCID小鼠体内的生长迅速，并增强肿瘤细胞的抗凋亡作用；还发现，表达B7-H4可使上皮细胞发生恶性转化，与肿瘤细胞的增殖、粘附、转移和侵袭性关系密切。值得一提的是，B7-H4对T细胞活化的抑制效应不能被B7-CD28共刺激途径逆转，提示机体正常的免疫系统无法通过自身的作用阻断B7-H4介导的免疫逃逸，因而无法自主产生有效的抗肿瘤免疫反应。
上述结果说明B7-H4参与介导肿瘤免疫逃逸，是一个理想的肿瘤免疫治疗的靶标。已有研究发现采用siRNA下调B7-H4表达能阻断肿瘤免疫逃逸，最近Sun等采用B7-H4特异性shRNA沉默B7-H4在肺癌细胞系A549细胞表达，将该细胞与Jurkat细胞共培养，结果显示沉默B7-H4基因的表达可促进Jurkat细胞增殖、抑制其凋亡、促进细胞周期进程和诱导IFN-γ、IL-10和IL-2的产生。
除肿瘤以外，BTLA在自身免疫性疾病、感染性疾病等免疫相关性疾病中的作用也有报道。发现类风湿关节炎患者外周血和关节液中sB7-H4水平升高，且与疾病严重程度呈正相关，胶原诱导的小鼠关节炎模型中，过度表达sB7-H4和敲除B7-H4基因均导致疾病严重程度增高，提示sB7-H4可以作为诱骗受体竞争剂阻断B7-H4的信号传递。此外，胰岛细胞中高表达B7-H4可以抑制自身反应性T细胞的活化，从而保护胰岛细胞，还发现B7-H4与糖尿病、移植排斥反应等相关。另外，B7-H4基因修饰可使小鼠胰岛细胞在糖尿病小鼠体内的存活时间明显延长；可溶性B7-H4-Ig能通过下调IL-2、IFN-γ、IL-4和上调IL-10的表达来抑制ConA诱导的肝损伤。B7-H4在抗感染免疫中的作用也有报道，国内学者发现慢性乙型肝炎和肝功能衰竭患者肝脏组织中CD3+T细胞、巨噬细胞、胆管细胞和内皮细胞高表达B7-H4，在急性链球菌感染小鼠模型中发现B7-H4缺陷小鼠对急性链球菌导致的肺部感染具有较好的耐受性。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供抗人B7-H4单克隆抗体。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供抗人B7-H4单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：
（1）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株1C1H11，保藏编号：CCTCC NO:C201758；
（2）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株3E5G7， 保藏编号：CCTCC NO:C201759；
（3）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株8H3C4 ，保藏编号：CCTCC NO:C201760；
（4）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12B2E1，保藏编号：CCTCC NO:C201761；
（5）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12H6G1，保藏编号：CCTCC NO:C201762。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供抗人B7-H4单克隆抗体，所述抗人B7-H4单克隆抗体为权利要求1所述的分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
所述抗人B7-H4单克隆抗体是直接用真核表达可溶性人B7-H4单体蛋白作为抗原而制备的单克隆抗体。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
提供抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达B7-H4的流式细胞术检测的药物中的应用。
提供抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于细胞或组织中B7-H4 Western Blot检测的药物中的应用。
提供抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于可溶性B7-H4的ELISA、化学发光免疫检测或荧光免疫检测的药物中的应用。
提供抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于组织中B7-H4表达的免疫组织化学检测的药物中的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）本发明提供的分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株具有良好的传代能力并能大量扩增培养，能稳定在体外分泌抗体，并且分泌抗体的能力随着培养代次增加没有下降，诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变。
（2）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体，该单克隆抗体能够识别人B7-H4的原核表达产物，人IL-37的真核表达产物（包括膜结合型和可溶性蛋白），及天然表达的人B7-H4胞外功能区蛋白。因此，利用该单克隆抗体可以通过IHC、WB、ELISA、FCM等免疫学方法简便、快速、准确地检测出人B7-H4蛋白的表达水平。该单克隆抗体具有特异性高和亲和力高的优点，该单克隆抗体结合人B7-H4的胞外功能区特异性位点，与市面出售的抗体具有不同的结合位点，增加了抗体的种类。另外，该单克隆抗体也可以作为进一步设计抗人B7-H4基因工程抗体的基础，用以作为免疫调节剂阻断B7-H4信号通路，调节机体免疫功能和肿瘤免疫治疗。
（3）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体，能够用于进一步制备基因工程抗体，作为肿瘤免疫治疗的生物制剂，另外也能用于免疫学基础研究。
（4）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体的应用，能够建立ELISA、化学发光、免疫荧光等免疫学方法检测人外周血和其他体液中的可溶性B7-H4蛋白浓度，用于对免疫性疾病（包括肿瘤、自身免疫病、感染性疾病等）的临床诊断、疗效评估和预后判断和发病机理研究。
（5）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达B7-H4的流式细胞术检测的药物中的应用，该药物能够用于流式细胞术检测细胞表面膜结合型B7-H4的表达，以评价机体免疫功能状态和研究疾病的发病机制。
（6）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于组织中B7-H4表达的免疫组织化学检测的药物中的应用，该药物用于建立免疫组织化学方法，检测肿瘤患者肿瘤组织中B7-H4的表达，作为肿瘤的临床辅助诊断、疗效评估和预后判断的指标。
（7）本发明提供的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于人类组织、细胞中表达的B7-H4和体液sB7-H4检测的Western blot技术中的应用。
附图说明
图1为动物免疫后多克隆抗体效价检测结果图。
图2是流式细胞术鉴定稳定转染人B7-H4表达的293T细胞株图。其中，A：阴性对照，B：慢病毒载体感染后，C:阴性对照，D：稳转细胞。
图3是稳转细胞Western blot鉴定结果图。其中，1为阴性对照，2、3为稳转细胞。
图4是流式细胞术检测单抗的特异性图。
图5是Western blot鉴定抗体的特异性图。其中，NC：阴性对照，1.商品蛋白与商品抗体作用，2.商品抗体与稳转细胞作用，3~12分别为8H3C4、1C1H11、2B12B6、6F9D5、12B2E1、10B1A2、3E5G7、12H6G1、14A12G11、4D1C210株抗体与稳转细胞作用。
图6是免疫组化检测抗体的特异性图。
图7是5株杂交瘤细胞产生单抗稳定性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
本实施例的分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：
（1）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株1C1H11，保藏编号：CCTCC NO:C201758；
（2）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株3E5G7， 保藏编号：CCTCC NO:C201759；
（3）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株8H3C4 ，保藏编号：CCTCC NO:C201760；
（4）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12B2E1，保藏编号：CCTCC NO:C201761；
（5）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12H6G1，保藏编号：CCTCC NO:C201762。
实施例2。
本实施例的抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于：所述抗人B7-H4单克隆抗体为权利要求1所述的分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
其中，该抗人B7-H4单克隆抗体是直接用真核表达可溶性人B7-H4单体蛋白作为抗原而制备的单克隆抗体。
该抗人B7-H4单克隆抗体能够用于以下几个方面：
（1）建立ELISA、化学发光、免疫荧光等免疫学方法检测人外周血和其他体液中的可溶性B7-H4蛋白浓度，用于对免疫性疾病（包括肿瘤、自身免疫病、感染性疾病等）的临床诊断、疗效评估和预后判断和发病机理研究；
（2）用于流式细胞术检测细胞表面膜结合型B7-H4的检测，以评价机体免疫功能状态和研究疾病的发病机制；
（3）用于建立免疫组织化学方法，检测肿瘤患者肿瘤组织中B7-H4的表达，作为肿瘤的临床辅助诊断、疗效评估和预后判断；
（4）用于建立Western blo方法，检测人类组织、细胞中表达的B7-H4和体液sB7-H4；
（5）用于进一步制备基因工程抗体，作为肿瘤免疫治疗的生物制剂；
（6）用于免疫学基础研究。
实施例3。
本实施例的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达B7-H4的流式细胞术检测的药物中的应用。
实施例4。
本实施例的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于细胞或组织中B7-H4 Western Blot检测的药物中的应用。
实施例5。
本实施例的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于可溶性B7-H4的ELISA、化学发光免疫检测或荧光免疫检测的药物中的应用。
实施例6。
本实施例的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于组织中B7-H4表达的免疫组织化学检测的药物中的应用。
实验：
一、抗体的制备、鉴定及纯化
1．免疫原的制备与动物免疫
采用真核表达的可溶性人B7-H4胞外功能区蛋白单体做为免疫原制备抗人B7-H4胞外功能区单抗。准备5只6周雌性BALB/c小鼠，用真核表达的人B7-H4胞外功能区蛋白免疫接种小鼠，使用弗氏完全佐剂乳化的150μg纯化重组人B7-H4蛋白进行腹腔注射来初次免疫接种小鼠，14天后进行第二次免疫，初次免疫接种后，每只小鼠以周为间隔经腹腔途径再接受三次含弗氏不完全佐剂乳化的150μg纯化蛋白。第四次免疫接种后7天，经尾静脉对所述小鼠采血并从血中分离血清以分析其与免疫原的结合的能力（图1）。
．B7-H4稳定转染293T细胞的建立及鉴定
为了鉴定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，建立一株稳定表达跨模型人B7-H4的293T细胞株，方法为：转染前一天，胰酶消化293-T细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。采用B7-H4慢病毒表达载体感染细胞并筛选稳定转染细胞。将病毒上清液用DMEM完全培养基稀释10倍，再加入聚凝胺，调整浓度为5 μg/ml。取对数生长期的293T细胞(调整MOI=10)，用上述含病毒的培养基培养24h后更换DMEM完全培养基。24h后用1μg/ml的嘌呤霉素筛选细胞，对照为正常293T细胞。更换培养基，每日一次，同时逐渐增加嘌呤霉素浓度至2.5 μg/ml，直至没有细胞死亡。筛选出细胞培养后，采用购置商品B7-H4抗体，通过FCM与WB鉴定稳定转染细胞B7-H4的表达。结果见图2和图3。
．细胞融合及阳性克隆细胞筛选
从5只小鼠中选择效价较高的BALB/c小鼠并采集脾细胞，进行细胞融合，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合比例为4:1。融合生长7天后，用免疫原作为特异性抗体靶标，通过间接ELISA检测产生特异性抗体的杂交瘤细胞上清。
间接ELISA筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株
采用真核表达的人B7-H4蛋白单体包被酶标版，经3%脱脂奶粉封闭后，洗涤，加杂交瘤细胞上清，孵育后洗涤，加酶标记羊抗鼠IgG二抗，孵育洗涤后加底物显色。根据ELISA显色OD值的高低，选择OD值最高的10株细胞做进一步鉴定。表1为10株细胞的OD值。
抗体结合表位和亲和力预测
采用竞争结合法经ELISA预测抗体结合表位，即将每株单抗用HRP标记，采用免疫原（人B7-H4蛋白单体）包被酶标板，分别加入不同的两种抗体，其中一株不标记先加入与抗原反应，经孵育洗涤后加入另一株标记抗体竞争结合，经孵育洗涤后加底物显色，根据是否显色判断两株抗体是否结合同一表位。同样采用ELISA法测定抗体的亲和力大小，结果见表2，10株抗体针对4个表位且亲和力存在差异。
抗体亚型鉴定和效价测定
使用抗体亚型鉴定试剂盒，按照厂商说明书鉴定抗体的亚型。经鉴定，单克隆抗体10株抗体的亚型。同样采用免疫原（人B7-H4蛋白单体）包被酶标板，ELISA法检测抗体的效价。结果见表3，其亚型多为IgG1，轻链均为κ链。细胞培养上清液效价均较高。
使用FCM鉴定单抗
收取稳定转染的293T细胞，放入流式管中，加入3ml PBS洗液，离心500g 5min，去上清。（PBS洗液成分：需加入2％FBS或者2％BSA, 0.01％的叠氮化钠），分别加入制备的抗人B7-H4单克隆抗体，混匀后，4℃孵育 30min。使用3ml PBS洗涤两次，加入带有PE标记二抗，混匀，4℃孵育30min。PBS洗涤两次。加入200ml 1％的甲醛溶液，固定，放入4℃待检测。结果见图3，结果显示4D1C2和6F9D5两株细胞产生的单抗与稳转细胞结合率较低，分别为6.2%和0.3%。
间接ELISA鉴定抗体的特异性
为鉴定获得的10株细胞是否与可溶性真核表达蛋白结合，采用购置的商品B7-H4蛋白作为抗原，包被酶标板，采用间接ELISA法检测B7-H4单克隆抗体的特异性。结果见表4，10株细胞中有4D1C2和6F9D5两株细胞结合力低下，分别为0.193和0.978。
鉴定抗体特异性
收获稳定转染的293T细胞，离心，去上清，加入2×的上样缓冲液，煮沸后上样。电泳于4℃进行。浓缩胶90v 15min，分离胶120v 1h。制备足够的转移缓冲液，取下凝胶，浸入转移缓冲液中15-30min，滤纸在转移缓冲液中浸泡30s。膜在甲醇中润湿15s，在转移缓冲液中平衡5min。转膜装置置于冰水中，220v 1h。转好的膜使用8％的脱脂奶粉，室温封闭2h。去除封闭液，使用PBST洗涤3次，每次10min。使用封闭液分别稀释制备得到的抗人B7-H4抗体，4℃孵育过夜。去除一抗，使用PBST洗涤3次，每次10min。加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育1h后。暗室压片曝光。结果见图5，各株杂交瘤产生的抗体均能与稳转细胞裂解液结合。
鉴定抗体特异性
选择肠癌组织进行切片，烤片60℃，1h；脱蜡及复水：二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；微波修复：将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，加热至沸腾，冷却5-10min，反复两次；将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；封闭：5％BSA，室温20min，甩去多余液体；滴加单抗1C6，37℃，1h；PBS洗涤3次，每次3min；滴加酶标二抗，室温孵育 30 min；PBS洗涤3次；DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温反应时间5min；冲洗干净后苏木素复染2min后冲洗；苏木素复染2min，自来水冲洗；脱水：30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；树胶封片，镜检（图6）。商品抗B7-H4抗体 (cs-3868)作为阳性对照。
抗体制备和纯化
（1）腹水的制备
选取杂交瘤细胞株12H6G1、1C1H11、3E5G7、8H3C4、12B2E1，取8~10周10只BALB/c雌鼠，注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5ml/只。三天后，注射使用0.5ml PBS悬浮的杂交瘤细胞，每一个克隆注射两只小鼠（1×106细胞/只），一周后，每天观察小鼠状态和腹水产生情况。小鼠中度腹胀时第一次收获腹水，实施穿刺抽取术，用18号针头，倾斜呈45°角刺入下腹部腹中线的右侧引流，避开上腹部的脏器和中线附近的血管。每次收集腹水合并在一起。1500g离心腹水10min以沉淀并移除腹水中的细胞。将腹水上清液转移至50ml离心管中并冻存在-20℃。
（2）抗体的纯化
纯化前，解冻腹水，用高速离心机离心使其澄清，纯化前去除脂质。使用蛋白G层析介质纯化，检测腹水前后的效价（表5）。
二、杂交瘤细胞的鉴定及保存
1．杂交瘤细胞克隆不同代次的抗体分泌能力的稳定性分析
首先对12H6G1、1C1H11、3E5G7、8H3C4、12B2E1，五株杂交瘤细胞进行传代，分别取第一代，第二代，第五代，第七代，第十代杂交瘤（初始细胞密度为细胞在培养瓶底部铺满）培养时间满两天后的上清样本，对细胞分泌上清进行ELISA鉴定，分别取每代细胞的上清样本作为一抗，以获得的B7-H4蛋白单体包板，进行ELISA检测，每组别均做4个重复孔，其余步骤如上操作，分析结果以OD450平均值表示不同代次杂交瘤产生抗体的稳定性（图7），其中，图7中，将12H6G1、1C1H11、3E5G7、8H3C4、12B2E1五株杂交瘤细胞进行传代至第十代取不同4细胞上清样本，检测单克隆抗体水平，以OD450表示，以了解杂交瘤产生抗体的稳定性。结果显示五株细胞传代10代后产生单抗的能力不变；说明五株细胞能稳定体外分泌抗体，随着培养代次增加其分泌抗体的能力不下降。
．单克隆细胞株建株与冻存
通过有限稀释将在间接ELISA方法中产生阳性结果的杂交瘤细胞亚克隆至少两到三次，直至到使用间接ELISA进行筛选，整个96孔板的细胞上清都为阳性为止。筛选过程中的阳性孔都要在10％生长培养基中扩大培养杂交瘤细胞克隆，并在37℃和5~6％CO2的条件下维持在1×105和5×105细胞/ml之间。细胞数足够时。将细胞冷冻在70％血清、20％DMEM、10％DMSO中并存放在液氮中。
三、抗人B7-H4胞外功能区单克隆抗体的应用
1．应用于WB
收集转染48小时的293T细胞，电泳，转膜。根据Abcam商品化B7-H4单克隆抗体说明书，WB的建议浓度为1µg ~5µg/ml，本实验一抗的抗体浓度分别选择0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml。结果显示，纯化后的抗体有良好的特异性，目的条带分子量在45KD左右，可以与真核表达的B7-H4特异性结合，抗体浓度改变时并不影响实验结果，且当抗体浓度为0.5μg/ml时，仍然可用。
．应用于FCM
利用转染B7-H4的293T细胞分别验证抗人B7-H4单抗用于流式细胞术检测的可行性。取B7-H4转染的293T细胞，1×106个细胞/管，洗液。按照1µg/106个细胞的浓度加入不同杂交瘤株产生的单抗，37℃孵育30min后洗涤，加2%甲醛固定细胞并上流式细胞仪分析。结果显示抗体可以用于流式细胞分析。结果见图4。
．应用于IHC
选择肠癌组织进行切片，检测抗体用于免疫组化的可行性。
．应用于ELISA
采用间接ELISA法检测抗人B7-H4单抗验证ELISA中检测人可溶性B7-H4的可行性。
采用购买的商品可溶性真核表达的人B7-H4蛋白包被酶标板，每孔包被5ng，3%脱脂奶粉封闭，洗涤后加入制备的单抗，孵育、洗涤后加酶标记羊抗鼠IgG二抗，孵育、洗涤后加底物显色，并在酶标仪下比色。设立阴性对照和PBS对照孔，每一个样本做复孔。
四、本发明的应用方面如下：
1.本发明得到了特异性高、亲和力高的抗人B7-H4胞外功能区单克隆抗体，能够识别人B7-H4胞外功能区，可结合可溶性人B7-H4和跨膜表达的B7-H4。因此，利用该单克隆抗体通过免疫学方法可以准确地检测出人B7-H4蛋白的表达水平。
2.该单克隆抗体可以应用于间接ELISA方法中，检测可溶性B7-H4。
3.该单克隆抗体可以应用于FCM中，检测跨膜表达B7-H4。
4.该单克隆抗体可以应用于WB中，检测细胞及组织中B7-H4。
该单克隆抗体可以应用于IHC中，检测组织中B7-H4。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：包括五株能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学，保藏日期是2017年4月19日，命名和保藏编号分别为：
（1）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株1C1H11，保藏编号：CCTCC NO:C201758；
（2）培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株3E5G7， 保藏编号：CCTCC NO:C201759；
（3）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株8H3C4 ，保藏编号：CCTCC NO:C201760；
（4）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12B2E1，保藏编号：CCTCC NO:C201761；
（5）培养物名称（分类命名）： 杂交瘤细胞株12H6G1，保藏编号：CCTCC NO:C201762。
2.抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于：所述抗人B7-H4单克隆抗体为权利要求1所述的分泌抗人B7-H4胞外单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于：所述抗人B7-H4单克隆抗体是直接用真核表达可溶性人B7-H4单体蛋白作为抗原而制备的单克隆抗体。
4.权利要求2所述的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达B7-H4的流式细胞术检测的药物中的应用。
5.权利要求2所述的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于细胞或组织中B7-H4 WesternBlot检测的药物中的应用。
6.权利要求2所述的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于可溶性B7-H4的ELISA、化学发光免疫检测或荧光免疫检测的药物中的应用。
7.权利要求2所述的抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于组织中B7-H4表达的免疫组织化学检测的药物中的应用。
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