CN105586318A - 一种人可溶性icosl elisa试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人可溶性ICOSL？ELISA试剂盒及其检测方法。具体而言，本发明的ELISA试剂盒包括一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4和20B10，其分别由杂交瘤细胞株2B4（保藏编号为CGMCC？NO:11291）和20B10（保藏编号为CGMCC？NO:11187）产生，并分别用作改良双抗体夹心ELISA方法中的检测抗体和包被抗体。本发明利用该试剂盒成功完成了人可溶性sICOSL的定量检测，不仅具有较高的检测灵敏度，而且具有较好的检测特异性，开发及应用前景良好。

Description

一种人可溶性ICOSL ELISA试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，涉及一种定量检测人可溶性ICOSL的ELISA试剂盒，利用该试剂盒进行定量检测的方法。
背景技术
目前已知的许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应，其中T细胞的活化需要双信号，抗原肽-MHC分子复合物与T细胞受体（TCR）的结合提供了第一信号，而第二信号则来源于抗原呈递细胞（APC）和T细胞表面共刺激分子（costimulatorymolecule）的相互作用，缺乏第二信号将导致T细胞失能或程序性死亡。由此可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。
近年来，随着分子生物学技术被广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。这些共刺激分子按其结构的不同可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体（TNF/TNFR）超家族，包括CD40/CD40L、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等；另一类是免疫球蛋白（Ig）超家族，包括CD28/CTLA4-B7、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-ICOSL、CD2-LFA-3等。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。
可诱导共刺激分子（induciblecostimulator，ICOS）是1999年由Hutloff等人发现的CD28家族的新成员，ICOS是由两个亚单位构成的同源二聚体I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。ICOS的胞浆区含有YMFM基序，能与PI3K激酶结合，胞外区含有一个V样Ig功能区，其中的FDPPF基序是与相应配体ICOSL结合的结构，ICOS主要表达于滤泡辅助性T细胞（Tfollicularhelper，Tfh）、活化T细胞和效应/记忆性T细胞上。ICOS的配体ICOSL（又称为hB7RP-1，B7-H2，hLICOS）是由309个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，约63~72kDa，胞外区包含IgV、IgC区，胞内段则根据不同的生理环境及细胞自身的状态而剪接形成不同的异构体，其中的4个半胱氨酸及IgV区80位的酪氨酸都是保守位点，不仅是B7家族的标志性位点，而且对于免疫球蛋白样结构的形成也十分重要。ICOSL主要表达在B细胞（例如淋巴结的皮质区和淋巴滤泡、脾的边缘带，此外在扁桃体B细胞的表面也有低水平表达）、单核细胞、部分树突状细胞和巨噬细胞上，提示ICOSL在B细胞参与的体液免疫应答中可能发挥着重要作用。除在淋巴组织表达以外，ICOSL在肾、心、膀胱和脑等非淋巴组织也有表达，表明该分子可能具有多方面的功能。多种因素可调控ICOSL的表达，外周血中未经刺激的B细胞、单核细胞表面低水平表达ICOSL，经IFN-γ、TNF-α、LPS刺激后，ICOSL的表达迅速上调。
ICOS的生物学功能与经典共刺激分子CD28不尽相同。CD28是诱导初始T细胞增殖活化的关键性分子，而ICOS则是活化后促进T细胞分化并发挥效应的主要共刺激分子。CD28主要参与机体的初次免疫应答，而ICOS主要是在再次免疫应答以及免疫记忆中发挥重要作用，对维持T细胞效应和记忆细胞活化、免疫球蛋白类型转换、调节Th1/Th2细胞极化等有重要作用。另外，ICOS在体内实验中所扮演的重要角色之一就是维持Tfh的产生，因此无论对于人类还是小鼠而言，ICOS缺陷都会导致Tfh生成缺陷，影响生发中心（germinalcenter，GC）反应，并使抗体产生减少。此外，已有研究证明，抗原呈递细胞上的ICOSL对于Tfh细胞分化和维持都有重要作用。清华大学祁海教授新近在Nature等杂志上发表文章指出，ICOS可以在独立于共刺激信号之外，通过促进T细胞的随机运动能力来直接控制T细胞向淋巴器官滤泡区迁移，进而决定T细胞的分化方向，但旁观者B细胞表达ICOSL是其必要条件。当旁观者B细胞无法表达ICOSL时，活化的辅助T细胞无法正常发育为Tfh，也不能引起最佳的GC反应，这说明旁观者B细胞在促进Tfh发育中起着至关重要的作用。
ICOS/ICOSL信号通路的异常与多种自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等）的发病密切相关。类风湿性关节炎是一种由多种因素导致的自身免疫性疾病，在类风湿性关节炎患者及小鼠动物模型中均发现多种免疫学功能的异常，其中最突出的就是产生致病性的自身抗体、T细胞/B细胞免疫功能的缺陷、自身抗体及免疫复合物清除障碍等。类风湿性关节炎患者体内T细胞/B细胞相互作用时通过共刺激分子产生的抗凋亡信号促使自身反应性B细胞大量增殖，并产生高滴度的自身抗体，而这些自身抗体的某些亚型及其免疫复合物介导了疾病的组织损伤。在多个独立实验中，采用抗体阻断ICOS与其配体的相互作用，可以减少促炎症因子的产生及抗体的形成，并且显著减弱关节炎的严重程度，还可以减少CIA模型小鼠的引流淋巴结和脾的滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的数量。由此可见，ICOS途径在类风湿性关节炎的免疫病理过程中发挥复杂而重要的作用。
大量研究表明，许多共刺激分子以细胞膜型和可溶性两种形式存在。其中，可溶性分子大多通过膜型分子而形成，但也有某些可溶性分子由专一的缺失跨膜区的基因编码（例如CTLA-4）。机体中可溶性分子和膜表面的分子一样具有相应的生物学功能：一方面，细胞膜上的分子能够通过直接的受体/配体相互作用来介导共刺激信号；另一方面，可溶性蛋白因子能够像细胞因子一样参与血液循环，并且在免疫应答中发挥重要的调节作用，其既能够影响邻近细胞，又能够和远端细胞表面的受体相互结合，从而参与疾病的发生、发展，其发挥作用的广度和深度远远超过细胞膜表面的分子。迄今为止，因缺乏有效的检测方法，国内外尚未有对可溶性ICOSL（sICOSL）的研究报道。
发明内容
要解决的技术问题：针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于改良双抗体夹心ELISA方法研制的人可溶性ICOSLELISA试剂盒，并利用该试剂盒成功完成了人sICOSL的定量检测。
技术方案：
一对用于制备抗人可溶性ICOSL单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株2B4，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO:11291，保藏日为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
杂交瘤细胞株20B10，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO:11187，保藏日为2015年8月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述一对杂交瘤细胞株在制备人可溶性ICOSLELISA试剂盒中的用途，其中杂交瘤细胞株2B4用于产生检测抗体，杂交瘤细胞株20B10用于产生包被抗体。
一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体：
单克隆抗体2B4，其由上述杂交瘤细胞株2B4产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，其编码基因的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
单克隆抗体20B10，其由上述杂交瘤细胞株20B10产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，其编码基因的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。
上述一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体在制备人可溶性ICOSLELISA试剂盒中的用途，其中单克隆抗体2B4用作检测抗体，单克隆抗体20B10用作包被抗体。
一种人可溶性ICOSLELISA试剂盒，其包括如下组分：
（1）固相载体：酶标板，1块；
（2）包被抗体：抗人ICOSL单克隆抗体20B10，30μg/管，1管；
（3）检测抗体：抗人ICOSL单克隆抗体2B4，10μg/管，1管；
（4）抗体稀释液：0.01M碳酸盐缓冲液（CBS），pH9.6，50mL/瓶，1瓶；
（5）封闭液：牛血清白蛋白（BSA）溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶；
（6）样品稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液（PBS），含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶；
（7）标准品蛋白：ICOSL-Ig融合蛋白，25ng/管，1管；
（8）酶标二抗：链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（Streptavidin-HRP，1:3000），10μg/管，1管；
（9）底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB），10mL/管，1管；
（10）洗液：0.01M磷酸盐缓冲液，含有0.2%吐温20，100mL/瓶，1瓶；和
（11）终止液：2M硫酸，5mL/管，1管。
上述人可溶性ICOSLELISA试剂盒在定量检测人体血清、血浆或组织液内sICOSL中的用途，并具体公开了一种利用上述ELISA试剂盒进行人sICOSL定量检测的方法，其包括如下步骤：
（1）采用抗体稀释液将包被抗体配制成浓度为2μg/mL的包被抗体工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，于4℃静置，过夜；
（2）弃掉酶标板中的包被抗体工作液，用洗液洗板3次，然后按照200μL/孔的用量加入封闭液，室温封闭1小时；
（3）按照下法配置标准品蛋白标准液：取7个EP管并依次编号，按照100μL/管的用量分别加入样品稀释液并置于EP管架上；采用样品稀释液将标准品蛋白配制成浓度为10ng/mL的液体，并吸取100μL加入到第1个EP管中，混匀后从第1个EP管中吸取100μL液体，并加入到第2个EP管中进行二倍稀释，依此类推至第7个EP管；
（4）弃掉酶标板中的封闭液，用洗液洗板3次，然后按照100μL/孔的用量加入标准品蛋白标准液和待测样品，室温反应2小时；
（5）弃掉酶标板中的标准品蛋白标准液和待测样品，用洗液洗板3次，采用抗体稀释液将检测抗体配制成浓度为0.5μg/mL的检测抗体工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，室温反应2小时；
（6）弃掉酶标板中的检测抗体工作液，用洗液洗板5~6次，采用样品稀释液将酶标二抗配制成浓度为0.5μg/mL的酶标二抗工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，室温反应1小时；
（7）弃掉酶标板中的酶标二抗工作液，用洗液洗板8~10次，然后按照100μL/孔的用量加入底物，室温避光反应10~15分钟；
（8）将终止液加入到酶标板中终止反应，然后应用酶标仪在450nm波长下测定酶标板中各孔的OD值，根据标准品的OD值拟合标准曲线，并将待测样品的OD值代入方程，计算待测样品中人sICOSL的浓度，即可完成定量检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明的人可溶性ICOSLELISA试剂盒不仅具有较高的检测灵敏度，而且具有较好的检测特异性，开发及应用前景良好。检测发现，在健康人以及类风湿性关节炎患者的外周血清中存在sICOSL。与健康人相比，类风湿性关节炎患者的外周血中sICOSL的表达水平显著升高（P<0.01）；与稳定期类风湿性关节炎患者相比，活动期类风湿性关节炎患者体内sICOSL的表达水平也显著升高（P<0.01）；经治疗，同一发作期类风湿性关节炎患者的外周血中sICOSL的表达水平降低（P<0.01）。因此，该试剂盒在自身免疫性疾病（特别是类风湿性关节炎）的诊断和疗效判断中具有一定的应用价值。
附图说明
图1为杂交瘤培养物上清的蛋白鉴定结果示意图；
图2为杂交瘤培养物上清的Ig亚类鉴定结果示意图；
图3为单克隆抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验示意图；
图4为单克隆抗体的Western印迹鉴定结果示意图；
图5为本发明的ELISA试剂盒的标准曲线方程；
图6为本发明的ELISA试剂盒的特异性考察曲线图；
图7为L929/ICOSL基因转染细胞体外培养过程中sICOSL蛋白检测示意图；
图8为sICOSL在正常人外周血清中的表达水平示意图；
图9为sICOSL在类风湿性关节炎患者外周血清中的表达水平示意图；
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明中的技术方案做出进一步的说明。除特殊说明以外，下列实施例中所使用的各种材料、药品、试剂及仪器均可通过商业途径获得。
实施例一：杂交瘤细胞株2B4和20B10的获取。
使用自行建立的ICOSL分子的转基因细胞（L929/ICOSL）作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠（107/500μl/只），每次间隔3周。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合（共20块96孔板）。以高表达ICOSL分子的L929/ICOSL为阳性对照及表达B7H4分子的L929/B7H4和表达空载体的L929/Mock为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定（参见图1）及Ig亚类鉴定（参见图2）。阳性克隆经3次有限稀释后，克隆的阳性率达到约95%。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人ICOSL的杂交瘤细胞株，并分别被命名为2B4（CGMCCNo.11291）、20B10（CGMCCNo.11187）。这些杂交瘤细胞经体外持续传代（40代）后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株2B4和20B10的染色体分析显示，这两株杂交瘤细胞的染色体数目为80~110。
实施例二：抗人ICOSL单克隆抗体2B4和20B10的获取与特性鉴定。
1、采用腹水体内诱生方法获取单克隆抗体：
取6~8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane（0.5ml/只）。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞（1×107/只），同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物（0.2ml/只）。5-10天后收获腹水，并离心取上清，于-80℃保存。
2、腹水型单抗的纯化和定量：
腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液（PBS）透析后，用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8~10mg/ml。间接免疫荧光法分析，纯化后单抗的效价为1:1000以上。
3、Ig亚类鉴定：
采用CBA法（BD公司）鉴定Ig亚类，结果显示2B4和20B10均为小鼠重链IgG2a型，轻链为Kappa（κ）型。
4、抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验：
在L929/ICOSL细胞（5′105/管）悬液分别加入单克隆抗体（每管2g），于4℃孵育45分钟。洗细胞后依次加入生物素标记的单抗和streptavidine-PE，并分别于4℃孵育30分钟。再次洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照。如图3所示，单抗2B4和20B10均不能阻断单抗2D3与L929/ICOSL细胞上ICOSL分子的结合。由此表明，单抗2B4与20B10识别的ICOSL分子抗原位点完全不同。
5、单抗的Western印迹鉴定：
0.1g表达GST-ICOSL工程菌的菌体蛋白经12%SDS-PAGE电泳，并电转移（0.65mA/cm2）至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。翌日加入纯化的抗体室温孵育1小时。用TBST溶液洗去未结合的抗体，加入AP标记的二抗，30分钟。孵育后加入底物显色。如图4所示，2B4，20B10和2D3(商品化ICOSL单抗)均能与ICOSL蛋白特异性结合，形成阳性条带，表明这两株单抗均具有识别ICOSL分子的良好特异性。
6、单克隆抗体相关序列表：
SEQIDNO:1为抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4轻链的氨基酸序列；
SEQIDNO:2为抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4重链的氨基酸序列；
SEQIDNO:3为编码抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4轻链的核苷酸序列；
SEQIDNO:4为编码抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4重链的核苷酸序列；
SEQIDNO:5为抗人可溶性ICOSL单克隆抗体20B10轻链的氨基酸序列；
SEQIDNO:6为抗人可溶性ICOSL单克隆抗体20B10重链的氨基酸序列；
SEQIDNO:7为编码抗人可溶性ICOSL单克隆抗体20B10轻链的核苷酸序列；
SEQIDNO:8为编码抗人可溶性ICOSL单克隆抗体20B10重链的核苷酸序列。
实施例三：sICOSL定量检测试剂盒。
该试剂盒的组成、规格、来源、贮存条件等信息如下表所示。
实施例四：利用ELISA试剂盒进行人血清中sICOSL的定量检测。
1、样品处理：
采集人体血液，置于离心管中，待血液凝固后，于2500rpm条件下离心10min，得到待测血清样本，于-20℃保存，避免反复冻融。
2、定量检测操作步骤：
（1）采用0.01MCBS缓冲液（pH=9.6，15mL）将单抗20B10（30μg）配制成浓度为2μg/mL的包被抗体工作液，按照100μL/孔的用量加入到ELISA板中，于4℃静置，过夜；
（2）弃掉包被抗体工作液，用0.01MPBS（含0.2%Tween20）洗板3次，按照200μL/孔的用量加入BSA，室温封闭1h；
（3）按照下法配置标准品蛋白标准液：取7个EP管并依次编号，按照100μL/管的用量分别加入0.01MPBS（含0.5%BSA）并置于EP管架上；采用0.01MPBS（含0.5%BSA）（1mL）将ICOSL-Ig融合蛋白（10ng）配制成浓度为10ng/mL的液体，并吸取100μL加入到第1个EP管中，混匀后从第1个EP管中吸取100μL液体，并加入到第2个EP管中进行二倍稀释，依此类推至第7个EP管；
（4）弃掉封闭液，用0.01MPBS（含0.2%Tween20）洗板3次，然后按照100μL/孔的用量加入ICOSL-Ig融合蛋白标准液和待测血清样品，室温反应2h；
（5）弃掉ICOSL-Ig融合蛋白标准液和待测血清样品，用0.01MPBS（含0.2%Tween20）洗板3次，采用0.01MCBS缓冲液（pH=9.6，20mL）将单抗2B4（10μg）配制成浓度为0.5μg/mL的检测抗体工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到ELISA板中，室温反应2h；
（6）弃掉检测抗体工作液，用0.01MPBS（含0.2%Tween20）洗板5次，采用样本稀释液将Streptavidin-HRP配制成浓度为0.5μg/mL的酶标二抗工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到ELISA板中，室温反应1小时；
（7）弃掉酶标二抗工作液，用0.01MPBS（含0.2%Tween20）洗板8次，然后按照100μL/孔的用量加入TMB，室温避光反应10~15min；
（8）将2MH2SO4加入到ELISA板中终止反应，然后应用酶标仪在450nm波长下测定酶标板中各孔的OD值，根据ICOSL-Ig融合蛋白标准品的OD值，采用GraphPad软件利用最佳的拟合曲线列出最合适的函数方程，并将待测血清样品的OD值代入方程，计算待测样品中人sICOSL的浓度，样品孔取复孔的平均值，即可完成定量检测。
3、检测结果：
（1）ICOSL-Ig融合蛋白的检测数据如下表所示。
（2）曲线方程：y=0.2226x+0.00370，R2=0.99817（参见图5）
（3）血清样品的检测数据如下所示。
4、准确性考察：
（1）板内准确性分析：在同一次实验中，将三个已知浓度的样本（10、5、2.5ng/mL）分别设置20个复孔，进行sICOSL检测，分析该试剂盒的准确性。
（2）板间准确性分析：在不同实验室中，将三个已知浓度的样本（10、5、2.5ng/mL）分别设置10个复孔，进行sICOSL检测，分析该试剂盒的准确性。
（3）结果与讨论：
变异系数CV<10%，证实该检测方法具有良好的准确性。
5、特异性考察：
将不同浓度梯度的ICOSLIg、PD-L1Ig、ICOSLIg和B7-H4Ig的蛋白（40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0ng/ml）加入抗ICOSL单抗（克隆：20B10）预包被的ELISA检测孔，用建立的ELISA检测方法测定每种蛋白不同浓度的吸光值。如图6所示，sICOSL蛋白组OD450吸光值与蛋白浓度之间呈现显著的依赖性，吸光值随着蛋白浓度增加而升高，其他三种蛋白组吸光值都很低（OD450<0.1），且无蛋白浓度相关性。因此，该检测方法具有良好的特异性。
实施例五：L929/ICOSL基因转染细胞体外培养过程中sICOSL蛋白表达。
将5×104L929/ICOSL细胞于24孔培养板中连续培养，每间隔12h收集培养上清，用上述建立的sICOSLELISA检测方法测定上清中sICOSL的表达水平。如图7所示，L929/ICOSL细胞增殖过程中能够逐步产生sICOSL（1~5ng/ml），培养时间越长，该因子含量越高，而L929/B7H4、L929/B7H3和L929/mock对照细胞各组上清均低于检测阈值。
实施例六：正常人外周血清中sICOSL的表达水平考察。
利用上述研制成功的sICOSLELISA检测体系测定健康对照外周血中sICOSL的表达特性，将收集的160例健康对照的外周血清进行sICOSL定量分析。如图8A所示，0~5岁和5~20岁健康对照的血清中该可溶性因子表达水平较高（p<0.05），分别达到245±13.45ng/ml和278.4±8.835ng/ml。而在20~90岁健康人中sICOSL含量在不同组间不存在表达差异（p>0.05）。另外，如图8B所示，在大于20岁的健康对照中，男性外周血清中sICOSL显著高于女性（p<0.001），分别达310.6±6.803ng/ml和261.9±8.396ng/ml。
实施例七：活动期与稳定期类风湿性关节炎（RA）患者外周血清中sICOSL的表达水平考察。
收集类风湿性关节炎患者外周血清44例，其中活动期RA24例，稳定期RA20例，ELISA法检测RA患者外周血清中的sICOS的表达。如图9A所示，活动期RA患者外周血清中的sICOSL表达显著高于稳定期RA患者，分别为393.0±21.59ng/ml和287.7±19.17ng/ml，即RA患者sICOSL表达水平与该疾病的临床严重程度相关。随后，对10例接受治疗的RA患者动态检测sICOSL的表达。如图9B所示，与治疗前（422.0±40.07ng/ml）相比，治疗后sICOSL表达明显降低（319.8±22.95ng/ml），具有统计学意义（p=0.04）。
综上所述，使用本发明的人可溶性ICOSLELISA试剂盒不但能够对类风湿性关节炎进行诊断及分期，还可以对类风湿性关节炎患者在临床治疗过程中的效果进行评价。类风湿性关节炎患者血清中存在sICOSL的表达，且该表达水平随着病情的好转而降低，直至达到健康人的水平。

Claims (7)

1.一对用于制备抗人可溶性ICOSL单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株2B4，保藏编号为CGMCCNO.11291；
杂交瘤细胞株20B10，保藏编号为CGMCCNO:11187。
2.根据权利要求1所述的一对杂交瘤细胞株在制备人可溶性ICOSLELISA试剂盒中的用途，其中：
所述杂交瘤细胞株2B4用于产生检测抗体；
所述杂交瘤细胞株20B10用于产生包被抗体。
3.一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体：
单克隆抗体2B4，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株2B4产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，其编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
单克隆抗体20B10，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株20B10产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，其编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。
4.根据权利要求3所述的一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体在制备人可溶性ICOSLELISA试剂盒中的用途，其中：
所述单克隆抗体2B4用作检测抗体；
所述单克隆抗体20B10用作包被抗体。
5.一种人可溶性ICOSLELISA试剂盒，其包括如下组分：
1）固相载体：酶标板，1块；
2）包被抗体：抗人ICOSL单克隆抗体20B10，30μg/管，1管；
3）检测抗体：抗人ICOSL单克隆抗体2B4，10μg/管，1管；
4）抗体稀释液：0.01M碳酸盐缓冲液，pH9.6，50mL/瓶，1瓶；
5）封闭液：牛血清白蛋白溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶；
6）样品稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液，含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶；
7）标准品蛋白：ICOSL-Ig融合蛋白，25ng/管，1管；
8）酶标二抗：链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，10μg/管，1管；
9）底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，10mL/管，1管；
10）洗液：0.01M磷酸盐缓冲液，含有0.2%吐温20，100mL/瓶，1瓶；和
11）终止液：2M硫酸，5mL/管，1管。
6.根据权利要求5所述的人可溶性ICOSLELISA试剂盒在定量检测人体血清、血浆或组织液内sICOSL中的用途。
7.一种利用根据权利要求5所述的人可溶性ICOSLELISA试剂盒进行人可溶性ICOSL定量检测的方法，其包括如下步骤：
1）采用抗体稀释液将包被抗体配制成浓度为2μg/mL的包被抗体工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，于4℃静置，过夜；
2）弃掉酶标板中的包被抗体工作液，用洗液洗板3次，然后按照200μL/孔的用量加入封闭液，室温封闭1小时；
3）按照下法配置标准品蛋白标准液：取7个EP管并依次编号，按照100μL/管的用量分别加入样品稀释液并置于EP管架上；采用样品稀释液将标准品蛋白配制成浓度为10ng/mL的液体，并吸取100μL加入到第1个EP管中，混匀后从第1个EP管中吸取100μL液体，并加入到第2个EP管中进行二倍稀释，依此类推至第7个EP管；
4）弃掉酶标板中的封闭液，用洗液洗板3次，然后按照100μL/孔的用量加入标准品蛋白标准液和待测样品，室温反应2小时；
5）弃掉酶标板中的标准品蛋白标准液和待测样品，用洗液洗板3次，采用抗体稀释液将检测抗体配制成浓度为0.5μg/mL的检测抗体工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，室温反应2小时；
6）弃掉酶标板中的检测抗体工作液，用洗液洗板5~6次，采用样品稀释液将酶标二抗配制成浓度为0.5μg/mL的酶标二抗工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶标板中，室温反应1小时；
7）弃掉酶标板中的酶标二抗工作液，用洗液洗板8~10次，然后按照100μL/孔的用量加入底物，室温避光反应10~15分钟；
8）将终止液加入到酶标板中终止反应，然后应用酶标仪在450nm波长下测定酶标板中各孔的OD值，根据标准品的OD值拟合标准曲线，并将待测样品的OD值代入方程，计算待测样品中人sICOSL的浓度，即可完成定量检测。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110007082A (zh) * 2019-03-25 2019-07-12 上海长海医院 Icosl蛋白在制备乳腺癌预后评估试剂盒中的应用
WO2023083298A1 (zh) * 2021-11-11 2023-05-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗icosl抗体融合蛋白及用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844150A (zh) * 2005-04-07 2006-10-11 苏州大学 可溶性人cd28分子检测试剂盒及其应用
CN102250910A (zh) * 2011-05-31 2011-11-23 苏州大学 一种人可溶性b7-dc定量检测试剂盒
CN102250911A (zh) * 2011-05-31 2011-11-23 苏州大学 一种可溶性b7-h1定量检测试剂盒
US20140086923A1 (en) * 2011-03-31 2014-03-27 Institut Jean Paoli & Irene Calmettes Antibodies Directed Against ICOS and Uses Thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844150A (zh) * 2005-04-07 2006-10-11 苏州大学 可溶性人cd28分子检测试剂盒及其应用
US20140086923A1 (en) * 2011-03-31 2014-03-27 Institut Jean Paoli & Irene Calmettes Antibodies Directed Against ICOS and Uses Thereof
CN102250910A (zh) * 2011-05-31 2011-11-23 苏州大学 一种人可溶性b7-dc定量检测试剂盒
CN102250911A (zh) * 2011-05-31 2011-11-23 苏州大学 一种可溶性b7-h1定量检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
严浩: "ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑（电子期刊）》 *
张学光等: "鼠抗人ICOSL单克隆抗体的研制及其生物学特性研究", 《中华医学会2014全国微生物学与免疫学学术年会》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110007082A (zh) * 2019-03-25 2019-07-12 上海长海医院 Icosl蛋白在制备乳腺癌预后评估试剂盒中的应用
CN110007082B (zh) * 2019-03-25 2021-12-21 上海长海医院 Icosl蛋白在制备乳腺癌预后评估试剂盒中的应用
WO2023083298A1 (zh) * 2021-11-11 2023-05-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗icosl抗体融合蛋白及用途

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