CN1844150A - 可溶性人cd28分子检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5，其制备方法和基于这些单克隆抗体的可溶性人CD28分子检测试剂盒。本发明进一步涉及所说的试剂盒在定性和定量检测生物学样品中可溶性人CD28分子中的应用。

Description

可溶性人CD28分子检测试剂盒及其应用

发明的领域

本发明涉及免疫球蛋白超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5，其制备方法和基于这些单克隆抗体的可溶性人CD28分子检测试剂盒。本发明进一步涉及所说的试剂盒在定性和定量检测生物学样品中可溶性人CD28分子中的的应用。

发明的背景

已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(NoelleRJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：6550，1992；Allen RC et al.，Science.259：990，1993)。

近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(Korthauer U et al.，Nature，361：539，1993)。另一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。

CD28分子又称Tp44，是一种包括202个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。作为免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员，CD28分子与CTLA-4同为协同刺激分子CD80和CD86的天然受体。在接到抗原特异性信号后，T细胞上的CD28抗原与B细胞上的B7抗原间的相互作用，以进一步提供激活T细胞、导致高水平细胞因子分泌的第二信号。该信号还可诱导细胞表面CTLA-4、ICOS、41BB、OX40、PD1及FasL等多种其他协同刺激分子的上调性表达。通过这些分子的协同作用和相互制约，共同调节并维护免疫系统的平衡和稳定。动物实验证实，若缺乏B7/CD28信号，将导致T细胞功能丧失，肿瘤细胞逃脱机体免疫监视，导致肿瘤形成。用B7-1转染肿瘤细胞，不仅可使原发肿瘤清除，同时可以清除肿瘤转移病灶。阻断协同刺激信号的转导，则可改善某些自身免疫性疾病的临床表现。用CTLA4-Ig阻断CD28介导的协同刺激信号途径还可有助予预防慢性排斥反应的发生。另外，膜型CD28分子在降低T细胞活化阈值、诱导抗凋亡基因表达、增加细胞因子分泌、促进免疫突触形成及阻止T细胞失能等方面也具有重要作用。然而，有关可溶性CD28分子在生理和病理过程中的作用，目前尚不清楚。

尽管有关CD28/B7受体配体结合的对T细胞刺激功能、CD28抗体的制备及其他免疫学功能都是已知的，但如本发明的新的抗人CD28单克隆抗体及其相对比较简单的制备方法尚未见报道。而且，文献报道的抗人CD28单克隆抗体基本上都是针对膜型CD28分子的功能性研究和分析的，而对人可溶性CD28抗原目前尚缺乏认识。因此，本领域特别需要提供能够与可溶性CD28分子特异性结合的单克隆抗体以及基于该抗体的可溶性人CD28分子检测试剂盒。

发明目的

本发明的一个目的是提供选自2D5和2F5的抗人CD28分子的单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人CD28单克隆抗体2F5和2D5分别具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所推测的轻链氨基酸序列以及SEQID NO：6和SEQ ID NO：8所推测的重链氨基酸序列。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5是抗可溶性人CD28分子的单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5是分别由保藏登记号为CGMCC No.1160和CGMCC No.1161杂交细胞产生并分泌的。

本发明的另一个目的是提供制备如上限定的抗人CD28单克隆抗体的方法，该方法包括：

(1)用天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞U266作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；

(3)筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5在制备可溶性CD28分子检测试剂盒中的应用。

附图简要说明

图1显示以流式细胞术检测抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5对U266细胞上CD28分子的识别的结果。其中第一抗体(一抗)分别是商品化抗人CD28单抗(Immunotech，克隆号：CD28.2)(阳性对照)及我们制备的2株抗人CD28单抗2D5和2F5，第二抗体(二抗)为荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG。

图2显示2D5和2F5杂交瘤细胞株染色体数目的分析(×1000倍)。

图3显示Western blot免疫印迹分析。M为分子量标准(KD)；2、4为诱导表达人重组CD28/Fc融合蛋白之工程菌的菌体蛋白，其中2为本发明的抗体2F5，4为2D5；1、3为以未诱导的菌体蛋白(作为阴性对照)，其中1为本发明的抗体2F5，3为2D5。

图4显示以流式细胞术完成的单抗2D5和2F5识别的抗原位点的竞争性抑制实验。灰色峰为阴性对照，其中一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为Streptavidin-PE。虚线透明峰为阳性对照，其中一抗为生物素标记的2D5，二抗为Streptavidin-PE；实线透明峰显示2F5与2D5对抗原结合位点的竞争性抑制。将2F5加入U266细胞反应后再与生物素标记的2D5反应，最后加入Streptavidin-PE。

图5显示生物素标记的单抗的鉴定。经流式细胞术分析结果显示，本发明两株单抗均能良好地标记生物素(Biotin)，并可与可溶性人CD28分子(sCD28)结合。

图6显示sCD28标准工作曲线。以2F5作为包被抗体，2D5作为检测抗体，然后加入不同浓度的标准品rhCD28/Fc重组蛋白作为检测抗原，绘制标准工作曲线。X轴代表抗原浓度，Y轴代表光密度OD₄₅₀值。

图7细胞膜裂解液中sCD28的测定。使用本发明的抗体2D5和2F5，按照已建立的方法检测CD28-T细胞裂解液中的sCD28含量X轴代表抗原浓度，Y轴代表光密度OD₄₅₀值。

图8试剂盒的稳定性分析。结果表明，由如上限的单抗研制的试剂盒稳定性较好。

发明的具体内容

本发明涉及免疫球蛋白超家族成员的结合蛋白质或多肽。具体地说，本发明涉及抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5，其制备方法以及基于这两株单克隆抗体建立的可溶性人CD28分子检测试剂盒，用于检测细胞或组织、正常人或病人血液或其他体液样品中可溶性人CD28分子的存在及其水平，为糖尿病和免疫系统疾病，特别是系统性红斑狼疮病人和类风湿性关节炎等自身免疫病的临床诊断提供重要实验室依据。

本文中使用的术语“CD28”包括完整的CD28、可溶性CD28及包括CD28功能活性部分的融合蛋白。术语“抗人CD28抗体”可以是CD28特异性单克隆或多克隆抗体或它们的免疫学活性部分。本发明中，优选的是单克隆抗体，特别是小鼠抗人CD28抗体。

可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人CD28单克隆抗体2D5、和2F5(参见Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlow andLane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗CD28单克隆抗体。

本发明进一步提供了生产如上限定的抗人CD28单克隆抗体的方法，该方法包括：

(1)用天然高表达CD28分子人多发性骨髓瘤细胞U266作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；

(3)筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

因此，为了制备本发明的抗人CD28单克隆抗体，首先用天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞U266作为免疫原，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于U266细胞是人多发性骨髓瘤细胞，细胞表面CD28分子具有较高的荧光百分率和荧光强度，因此用该细胞作为免疫原将会大大提高阳性检出率。

可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature265：495-497，1975)制备本发明的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5。简单地说，用多发性骨髓瘤细胞U266作为免疫原免疫BALB/C小鼠。当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞。例如，可以将脾细胞悬液加到CD28抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达CD28多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。然后可以收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，并在适当的融合剂例如聚乙二醇的诱导下与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基例如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞。然后，用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。于体外(例如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人CD28抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化所需的抗体。

已按照布达佩斯条约和中国专利法实施细则第25条的规定，于2004年6月2日将产生抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5的杂交瘤细胞株保藏在中国北京中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，其保藏登记号分别为CGMCC No.1160和CGMCC No.1161。

核苷酸序列分析结果显示，本发明的纯化的两株抗人CD28单克隆抗体2F5和2D5轻链的核苷酸编码序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示，重链的核苷酸编码序列分别如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示；根据它们的核苷酸编码序列推测的轻链氨基酸序列分别如序列表中SEQID NO：5和SEQ ID NO：7所示，推测的重链氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8所示。

本发明的纯化的两株抗人CD28单克隆抗体多肽分别具有如序列表中SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

流式细胞分析结果显示，本发明提供的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5均能不同程度地识别成熟的U266、XG1细胞以及外周血T细胞表面上表达的CD28分子。竞争抑制试验结果进一步显示，与已知的抗CD28单克隆抗体不同，本发明的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5可同时识别抗原分子上的两个不同或不完全相同的抗原结合位点。因此，本发明的抗CD28抗体对抗原分子更为敏感，同时具有更为稳定的抗原结合特性。特别是，发明的抗CD28抗体能够特异地结合游离状态例如人血清中的CD28蛋白质。

因此，可以利用本发明的2D5和2F5抗体制备用于检测可溶性人CD28蛋白的试剂盒。可使用基于本发明单克隆抗体的试剂盒检测细胞或组织、正常人或病人血液或其他体液样品中CD28分子的存在及其水平。

由于许多疾病特别是免疫系统疾病条件下均存在细胞结合或游离的CD28蛋白水平的异常改变，所以有可能使用本发明的试剂盒作为某些免疫系统疾病特别是自身免疫性疾病的实验室诊断手段。作为一个共同特征，系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等免疫病病人的外周血T细胞表面CD28分子的表达率低于正常健康人，而在血液中以可溶性分子形式存在的CD28含量则明显高于正常人。因此，有可能使用本发明的抗体检测人血清中sCD28蛋白的含量测定，并以其作为判断某些病理状态的指标。特别是，有可能通过测定自身免疫性疾病病人血清中可溶性人CD28蛋白的含量，为自身免疫性疾病的诊断提供实验室依据。

本发明的基于抗人CD28单克隆抗体的检测试剂盒基本上由96孔微量测定板、塑料封盖、包被抗体2F5或2D5、阳性对照标准品、阴性对照标准品、已知浓度的可溶性CD28抗原、抗原样品稀释缓冲液、生物素标记的2D5或2F5抗体、标记抗体稀释液、抗体包被液、酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠二抗、酶的相应底物和洗液组成。

以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1：抗人CD28单克隆抗体的制备

本实施例描述本发明的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5的制备。

(1)抗人CD28单克隆抗体的制备

使用天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞U266作为免疫原，分三次免疫接种Balb/c小鼠(10⁷细胞/500μl/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达CD28分子的小鼠恶性淋巴瘤转人CD28分子的细胞株CD28-T为阳性对照，并以不表达CD28分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi作为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定。阳性克隆经3次有限稀释后，克隆的阳性率达到约100％。经流式细胞术反复筛选，结果表明，我们制备的两株单抗能良好识别人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞表面的CD28分子(参见图1)，反复亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人CD28的杂交瘤细胞株，并分别被命名为2D5和2F5。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株2D5和2F5的染色体数目分析显示，这两株杂交瘤细胞的染色体数目为80-110(参见图2)。

(2)抗人CD28单克隆抗体的生产与特性鉴定

(a)采用本室建立的体内诱生腹水方法大批量生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔内接种如上制备的杂交瘤细胞(1×10⁷细胞/只)，同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。5～10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。

(b)腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为1.4～3.8mg/ml。间接免疫荧光法分析显示纯化后的单克隆抗体的效价为1∶1000以上。

(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定Ig亚类，结果显示和2F5为小鼠IgG1型，2D5为IgG2a型。

(d)CD28抗体对不同细胞株膜型CD28分子的识别。将PBMC、U266、CD28-T、XG1和Jurkat细胞用PBS洗涤后，分装于小试管中(5×10⁵细胞/管)，分别加入5株杂交瘤细胞培养上清(50μl/管)，同时以小鼠IgG为阴性对照，阳性对照抗体为CD28.2。4℃反应45分钟(min)，充分洗涤后加入羊抗鼠FITC荧光二抗，再于4℃反应45min。充分洗涤后，以不表达CD28的Daudi细胞株作为阴性对照细胞株，并用流式细胞仪分析。结果表明，5株单抗均能良好地识别PBMC、CD28-T、U266、XG1和Jurkat细胞表面的CD28分子。

(e)单克隆抗体的特异性鉴定。采用Western blotting分析：具体实验操作参考(德国Boehringer Mannheim公司)试剂盒说明书进行。简述如下：1μgrhCD28/Fc(R&D公司)重组蛋白经SDS-PAGE电泳，并电转移(0.65mA/cm²)至硝酸纤维膜上，用1％TBS封闭液封闭4℃过夜；翌日分别加入本发明的单克隆抗体(mAb)室温孵育1小时(h)，然后用TBS洗去未结合的抗体并加入HRP标记的二抗孵育30min。洗涤后加入底物显色，曝光，显影并定影。结果显示，5株杂交瘤细胞株分泌的单抗均能特异地识别rhCD28/Fc(参见图3)。

(f)单克隆抗体识别抗原位点的分析。将生长良好的U266细胞用含5％小牛血清的PBS洗涤后分于小塑料管中(5×10⁵/管)，分别加入抗人CD28单克隆抗体2F5(10μg/50μl/管)，4℃反应45min。洗涤后，再加入生物素标记的抗人CD28单克隆抗体2D5(2μg/20μl/管)，4℃反应45min；洗涤后再加入streptavidin-PE。4℃反应45min后，进行流式细胞分析。实验中的阴性对照为小鼠IgG和streptavidin-PE，阳性对照为生物素标记的抗CD28抗体2D5和streptavidin-PE。结果提示，本发明的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5能够识别抗原分子上不相同或不完全相同的结合位点(参见图4)。

基于这一特性，我们有可能利用本发明的单克隆抗体检测体液中可溶性或游离状态的CD28分子的存在及其相对水平。

实施例2：可溶性人CD28分子检测试剂盒的制备

(1)单克隆抗体的生物素(Biotin)标记。用碳酸盐缓冲液(0.01M CBS，pH9.3)将纯化的单抗(2D5和2F5)的浓度调整为200μg/ml，4℃透析过夜。然后，移入Eppendof管，并加入浓度为1mg/ml的生物素40μl，避光震荡4小时。再置于0.01M PBS(pH7.2)中4℃透析72h后，分装并于-20℃保存备用。

(2)生物素标记的单抗的鉴定。将U266细胞用PBS洗涤后，分装于小试管中(5×10⁵/管)。分别加入2株生物素标记的单抗2D5和2F5，4℃反应45min。充分洗涤后加入荧光素标记的链霉亲和素(streptavidin-PE)，再于4℃反应45分钟得到生物素标记的单克隆抗体2D5和2F5，结果表明，单抗2D5和2F5均良好地标记了生物素(参见图5)。

(3)包被抗体的选择检测方法的建立。用碳酸盐缓冲液将本发明的两株单抗浓度的调整为2μg/ml，分别包被0.01％多聚赖氨酸预处理(总剂量：10KGy、剂量率为1Gy/min)的酶标检测板(100μl/孔)，4℃保温过夜。用4％BSA 4℃封闭过夜并洗涤后，分别加入商品化的rhCD28/Fc重组蛋白(1ng/ml、500ng/ml和1μg/ml，100μl/孔)，37℃反应2h。洗涤后，分别加入对应的生物素标记的单抗(100μl/孔)，37℃反应1h。充分洗涤后，再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)(1∶1000；100μl/孔)，37℃反应30min。洗涤后，加入临时配制的底物四甲基联苯胺(TMB，100μl)，37℃反应15min后，用2mol/L H₂SO₄(50μl/孔)终止酶促反应，于酶标仪上测定OD₄₅₀值。

结果表明，2D5和2F5无论作为包被抗体还是作为检测抗体，均适用于制备本发明的试剂盒，但使用2F5作为包被抗体并使用2D5作为检测的标记抗体，将会进一步提高检测的灵敏度。

(4)可溶性CD28(sCD28)线性工作曲线的绘制。用mAb2F5包被酶联免疫吸附检测板，4℃保温过夜。PBS(含0.01％Tween-20)洗涤后，用4％BSA封闭过夜。洗涤后加入标准品rhCD28/Fc重组蛋白的梯度稀释液(1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、66.67ng/ml、22.22ng/ml、7.41ng/ml、2.47ng/ml、0.82ng/ml和0.27ng/ml，100μl/孔)。分析并记录结果后，以sCD28/Fc的浓度为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标，绘制sCD28的线性工作曲线。结果显示，在0.82～600ng/ml抗原浓度区间内，抗原浓度与光密度OD₄₅₀之间具有良好的线性关系(参见图6)。

(5)检测方法的稳定性分析

用mAb2F5包板，并于4℃下保存0、7、14、21天。重复上述检测，分析工作曲线中的部分测定点(66.7ng/ml、22.2ng/ml、7.4ng/ml、2.5ng/ml)数值的变异。结果表明，用上述方法建立的可溶性CD28分子检测试剂盒具有较好的灵敏性和稳定性，完全适合于广泛推广使用(参见表1)。

表1：本发明检测方法的稳定性实验

贮存时间(天)	66.7ng/ml		22.2ng/ml		7.4ng/ml		2.5ng/ml
									x±s	CV％	x±s	CV％	x±s	CV％	x±s	CV％
	0	64.3±2.09	3.25	20.5±0.89	4.34	7.6±0.41	5.39	2.2±0.06									2.73
10									69.4±3.37	4.86	23.6±0.69	2.92	7.1±0.35	4.93	2.4±0.11	4.58
	20	63.2±2.51	3.97	21.7±0.78	3.59	6.9±0.24	3.48	2.4±0.06									2.50
30									65.9±3.79	5.75	22.6±1.31	5.79	8.1±0.49	6.04	2.6±0.09	3.46

实施例3.可溶性人CD28分子检测试剂盒的应用

(1)携带人CD28基因的小鼠恶性T淋巴瘤CD28-T细胞膜裂解液中可溶性人CD28分子的检测。

(a)CD28-T细胞膜裂解液的制备。取1×10⁷的CD28-T细胞，PBS洗涤3次后弃尽上清，重悬于0.5ml预冷的RIPA(1×PBS，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)膜裂解液中，向其中加入蛋白酶抑制剂100μl PMSF(10mg/ml，30μg/ml Aprotinin，100mmol/L Na₃VO₄)并混匀。4℃条件下，用1ml针筒轻轻吸放10次后，4℃冰箱静置30分钟。然后移入Eppendoff管中，再加入PMSF20μl，混匀后于12000rpm离心10分钟。然后收集上清，于-80℃下保存备用。

(b)细胞膜裂解液中可溶性CD28含量的测定。将上述方法制备的细胞膜裂解液倍比稀释后，用已建立的双抗体夹心法分析裂解液中可溶性人CD28分子的含量。结果显示，CD28-T细胞膜裂解液中sCD28含量达22ng/ml。并且细胞膜裂解液中可溶性CD28的浓度，随着膜裂解液稀释倍数的增加而降低(参见图7)。

(2)人血标本和细胞培养上清中sCD28的含量分析

用上述双抗体夹心方法，分别以本发明的基于抗人CD28单克隆抗体的试剂盒检测正常人青年人血浆、老年人血浆、活化的PBTC细胞培养上清及甲亢病人的血清样品中sCD28蛋白的含量。结果显示，随培养时间的延长，活化的PBTC培养物上清中sCD28含量逐渐增加。正常人血浆中sCD28含量低于0.82ng/ml；老年人血浆sCD28含量明显高于青年人对照组；20例甲亢病人血清样品中有8例可检测到可溶性CD28分子，个别患者血清中sCD28含量高达正常对照组的10倍以上(约13.5ng/ml)(参见图8)。

因此，有可能使用本发明的抗体检测人血清中sCD28蛋白的含量测定，并以其作为判断某些病理状态的指标。我们的初步试验结果显示，与正常健康人相比，许多自身免疫性疾病例如系统性红斑性狼疮、多发性硬化症、Graves病、类风湿性关节炎等外周血T细胞膜CD28分子表达率均下降。由此可以推测，人自身免疫性疾病的血液中可溶性CD28分子的浓度有可能异常增高(数据未显示)，并可以以待检者血液样品中可溶性CD28分子的含量高低作为自身免疫性疾病的临床诊断和预后判断的实验室指标之一。

杂交瘤样品保藏

鉴于阳性杂交瘤特别是以高产率产生本发明单克隆抗体的杂交瘤筛选的偶然机遇性，也是作为对本说明书文字描述部分的补充，本申请人在保藏用作免疫原的转基因细胞的同时，还在同一微生物保藏机构(中国普通微生物保藏管理中心，CGMCC)保藏了分别产生本发明的单克隆抗体2D5和2F5的两个杂交瘤细胞株，它们的保藏编号分别为CGMCC No.1160和CGMCC No.1161。

                        序列表

<110>苏州大学生物技术研究所

<120>可溶性人CD28分子检测试剂盒及其应用

<140>

<141>

<160>2

<210>1

<211>344

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人CD28单克隆抗体2F5轻链的核苷酸编码序列。

<400>1

  1  GACATTGAGA TGACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCTAGGGGA

 51  ACGGGTCACC ATGACCTGCA CTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TCCAGTTACT

101  TCCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACT CTGCATTTAT

151  AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCA CCTCGCTTCA GTGGCAGTGG

201  GTCTACCTCT TACTCTCTCA CGATCAGCAG CATGGAGGCT GAAGATGCTG

251  CCACTTATTT CTGCCACCAA TATCATCGTT CCCCGACGTT CGGTGGAGGC

301  ACCAAGCTGG AAACCAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATC

<210>2

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人CD28单克隆抗体2F5重链的核苷酸编码序列。

<400>2

  1  AATAGCCCTT GACCAGGCAT CCCAGGGTCA CCATGGAGTT AGTTTGGGCA

 51  GCAGATCCAG GGGCCAGTGG ATAGACAGAT GGGGGTGTCG TTTTGGCTGA

101  GGAGACTGTG AGAGTGGTGC CTCGGCCCCA ATAGTTTCCG TCCCCCCATC

151  TTGCACAGTA ATAGAGCGCA GAGTCCTCAG AGGTCAGGCT GCTGAACTCC

201  ATGTAGGCTG TGATGGAGGA TTTGTCTGAA GTCAGTGTGG CCTTGCCTTT

251  GAACTTCTCA TTGTACTTAG TATAATCATT GTAAGGATTA ATACTTCCAA

301  TCCACTCAAG GCCCTGCCCA GGCTTCTGCT TCACCCATTG GATAACATAG

351 CTAGTGAATG TGTATCCAGA AGCCTTGCAG GACATCTTCA CTGAAGCCCC

401 AGGCTTTACC AGCTCAGGTC CTGACTGCTG CAGCTGCACC T

<210>3

<211>348

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人CD28单克隆抗体2D5轻链的核苷酸编码序列。

<400>3

  1  ATCGACATTG GAGATGACCC AGTCTCCAGC AATCATGTCT GCATCTCTAG

 51  GGGAACGGGT CACCAGGACC TGCACTGCCA GTTCAAGTGT AAGTTCCAGT

101  TAGTTCCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCACCC AAACTCTGCA

151  TTTATAGCAC ATCCAACCTG GCTTATGGAG TCGCCACCTC GCTTCAGTGG

201  CAGTGGGTCT ACCTCTTACT CTCTCACGAT CAGCAGCATG GAGGCTGAAG

251  ATGCTGCCAC TTATATTCTG CCACCAATAT CATCGTTCCT CCGACGTTCG

301  GTGGAGGCAC CAAGCTGGAA ACCAAACGGG CTGATCGCTG CACCAACG

<210>4

<211>451

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人CD28单克隆抗体2D5重链的核苷酸编码序列。

<400>4

  1  GTCAAATAGC CCTTGACCAG GCATCACCAG GGTCACCATG GAGTTAGTTT

 51  GGGCAGCAGA TCCAGGGGCC AGTGGATAGA CAGATGGGGG TGTCGTTTTG

101  GCTGAGGAGA CTGTGAGAGT GGTGCCTCGG CCCCAATAGT TTCCGTCCCC

151  CCATCTTGCA CAGTAATAGA GCGCAGAGTC CTCAGAGGTC AGGCTGCTGA

201  ACTCCATGTA GGCTGTGATG GAGGATTTGT CTGAAGTCAG TGTGGCCTTG

251  CCTTTGAACT TCTCATTGTA CTTAGTATAA TCATTGTAAG GATTAATACT

301  TCCAATCCAC TCAAGGCCCT GCCCAGGCTT CTGCTTCACC CATTGGATAA

351  CATAGCTAGT GAATGTGTAT CCAGAAGCCT TGCAGGACAT CTTCACTGAA

401  GCCCCAGGCT TTACCAGCTC AGGTCGCTGA CATGCCTGCA GGCTGCCACC

451  G

<210>5

<211>114

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人CD28单克隆抗体2F5的轻链核苷酸编码序列推测的轻链氨基酸序列。

<400>5

  1  DIEMTQSPAI MSASLGERVT MTCTASSSVS SSYFHWYQQK PGSSPKLCIY

 51  STSNLASGVP PRFSGSGSTS YSLTISSMEA EDAATYFCHQ YHRSPTFGGG

101  TKLETKRADA APTV

<210>6

<211>146

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人CD28单克隆抗体2F5的重链核苷酸编码序列推测的重链氨基酸序列。

<400>6

  1  VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YVIQWVKQKP GQGLEWIGSI

 51  NPYNDYTKYN EKFKGKATLT SDKSSITAYM EFSSLTSEDS ALYYCARWGD

101  GNYWGRGTTL TVSSAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGY

<210>7

<211>116

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人CD28单克隆抗体2D5的轻链核苷酸编码序列推测的轻链氨基酸序列。

<400>7

  1  IDIGDDPVSS NHVCISRGTG HQDLHCQFKC KFQLLPLVPA EARILHPNSA

 51  FIAHPTWLME SPPRFSGSGS TSYSLTISSM EAEDAATYIL PPISSFLRRS

101  VEAPSWKPNG LIAAPT

<210>8

<211>150

<212>氨基酸

<213>人工序列

<221>8

<223>根据合成的抗人CD28单克隆抗体2D5的重链核苷酸编码序列推测的重链氨基酸序列。

<400>8

  1  GGSLQACQRP ELVKPGASVK MSCKASGYTF TSYVIQWVKQ KPGQGLEWIG

 51  SINPYNDYTK YNEKFKGKAT LTSDKSSITA YMEFSSLTSE DSALYYCARW

101  GDGNYWGRGT TLTVSSAKTT PPSVYPLAPG SAAQTNSMVT LVMPGQGLFD

Claims (3)

1，选自2D5和2F5的抗可溶性人CD28分子的单克隆抗体，特征在于它们分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所限定的氨基酸序列。

2，根据权利1的单克隆抗体是分别由保藏登记号为CGMCC No.1160和保藏登记号为CGMCC No.1161的杂瘤细胞系产生的。

3，基于权利要求1的抗人CD28单克隆抗体2D5和2F5的可溶性CD28分子检测试剂盒。

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