CN110981961A - 一种特异结合癌细胞蛋白b7-h4的纳米抗体h6的序列和应用 - Google Patents

一种特异结合癌细胞蛋白b7-h4的纳米抗体h6的序列和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种特异结合癌细胞蛋白B7‑H4的纳米抗体H6的序列和应用，涉及生物医学技术领域，该结合癌细胞B7‑H4的单域抗体能够与多种癌细胞特异性结合并抑制其繁殖，具有如SEQ ID NO.1和2所示序列，具有精确识别、免疫原性低、易体外合成与修饰等优点。缓解了现有技术中存在的缺少一种能够靶向癌细胞的纳米抗体的技术问题。

Description

一种特异结合癌细胞蛋白B7-H4的纳米抗体H6的序列和应用
技术领域
本发明涉及分子生物医学技术领域，尤其是涉及一种特异结合癌细胞蛋白B7-H4的纳米抗体H6的序列和应用。
背景技术
单域抗体(sdAb)是指包含了抗体中单个可变域的片段，是抗体分子的最小抗原结合单元，又称为纳米抗体(Nanobody)。和完整的抗体一样，它可以选择性地和特定抗原结合。与完整抗体的150～160kDa的质量相比，单域抗体则显得小得多，大约只有12～15kDa。此类抗体衍生物包括来源于骆驼科和鲨鱼类动物中天然产生的可变区以及工程化的人源抗体中重链或轻链的可变区结构域。由于其高度的亲和力、特异性以及稳定性，分子量小和拥有多种重新改构(re-formatting)机会的优势，此类分子在生物医学应用领域中前景光明，受到人们的青睐。
B7-H4作为B7家族的一员，是一种负性协同共刺激分子，在多种肿瘤细胞、专职抗原呈递细胞和肿瘤相关巨噬细胞上异常高表达，并通过抑制T细胞介导的免疫应答反应参与肿瘤的免疫逃逸。B7-H4还可通过参与细胞信号转导通路增强肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抗凋亡能力，促进肿瘤的发展。因此，B7-H4蛋白有望成为肿瘤发生的新型分子标志物和肿瘤靶向治疗的分子靶点，抑制B7-H4的活性在转化医学中具有重要意义。
乳腺癌、宫颈癌、胃癌和肾细胞癌(简称肾癌)是临床上常见的恶性肿瘤，在我国的发病率非常高。乳腺癌是城市女性最常见的癌症；我国宫颈癌的发病率更是发达国家的6倍,且呈年轻化趋势；胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤；肾癌是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，占成人恶性肿瘤的2％～3％，男女之比为2：1。
我国癌患者被诊断时多已处于进展期或晚期，其治疗手段非常受限，同时伴随着血行转移和新的癌灶形成，直接导致我国癌术后五年生存率与欧美发达国家相比处于较低的水平。
分子靶向治疗是肿瘤治疗领域发展的新方向，相比传统的治疗手段，分子靶向治疗具有更好的分子靶向性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤，不易产生耐药，安全性和耐受性好。
靶向治疗利用抗原-抗体结合或配体-配基结合等生物特异性相互作用来实现药物的靶向传递。目前可作为主动靶向的配体或“靶向载体”主要是抗体、多肽、叶酸、多糖。普通抗体通常对靶点具有高亲和力，但免疫原性高；多肽分子量小且易于合成，但多肽在体循环中易于酶解，不适合在体内应用；小分子化合物，如叶酸分子量小，稳定性好，但对肿瘤靶向性不高。纳米抗体由于分子量小，对抗原的亲和力和特异性都与普通抗体相同，且免疫原性很低，这些都优于传统的抗肿瘤药物。因此，筛选出一种可以靶向癌细胞特异蛋白B7-H4的纳米抗体并且将其应用在靶向癌细胞的抗癌药物制备、癌细胞检测、肿瘤研究等，是急待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种结合多种癌细胞特异蛋白B7-H4的纳米抗体，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够靶向癌细胞特异蛋白 B7-H4的纳米抗体的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种利用该纳米抗体封闭癌细胞特异蛋白B7-H4，抑制癌细胞增殖的方法，缓解了现有技术中存在的缺少一种利用靶向癌细胞B7-H4的纳米抗体，抑制多种癌细胞增殖的技术问题。
本发明的第三目的在于提供一种能够结合癌细胞的B7-H4纳米抗体，制备靶向癌细胞的药物(蛋白或DNA或RNA)，缓解了现有技术中存在的缺少一种包含能够结合癌细胞的纳米抗体的靶向抗癌药物(蛋白或DNA或 RNA)的技术问题。
本发明的第四目的在于提供一种能结合癌细胞的纳米抗体，以便在肿瘤研究或制备检测癌细胞的试剂盒中的应用，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够应用在肿瘤研究或制备检测癌细胞的试剂盒中，靶向癌细胞 B7-H4的纳米抗体的技术问题。
一种结合癌细胞B7-H4的纳米抗体，所述纳米抗体蛋白具有如SEQ ID NO.1所示序列。
进一步的，所述纳米抗体的编码基因DNA和RNA。
进一步的，所述纳米抗体特异结合的癌细胞包括乳腺癌BT-549细胞、宫颈癌HeLa细胞、胃腺癌细胞BGC-823、肾上皮癌细胞293。
进一步的，所述纳米抗体为人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的纳米抗体。
进一步的，所述人工合成包括体外多肽直接合成或分子生物学方法合成；
优选地，所述分子生物学方法合成为体外翻译合成；
优选地，所述体外翻译合成也包括其DNA或mRNA直接导入靶细胞表达。
一种包含上述纳米抗体的靶向抗癌药物研发。
进一步的，所述药物包括：包含所述纳米抗体或对应的基因DNA或 RNA。
利用所述纳米抗体，在肿瘤研究或制备检测癌细胞的试剂盒中的使用。
进一步的，试剂盒包含所述纳米抗体，将样品与之孵育后检测样品中癌细胞的存在；
优选地，所述样品包括血液、细胞或组织切片。
本发明提供的结合癌细胞的纳米抗体，具有精确识别、免疫原性低、易体外合成与修饰等优点。与普通抗体相比，纳米抗体结构简单，易于纯化和表达，亲和力及稳定性高，组织渗透力强，无不良反应。合成成本也比制备普通抗体成本低，周期短。
本纳米抗体可直接作为靶向肿瘤细胞的抗癌药物，因为能够特异识别结合多种肿瘤细胞株，包括乳腺癌BT-549细胞、宫颈癌HeLa细胞、胃腺癌细胞BGC-823、肾上皮癌细胞293等；当本纳米抗体结合靶细胞后，抑制了B7-H4的负性协同刺激，消除其对T细胞介导的免疫应答反应的抑制，使肿瘤细胞不能免疫逃逸。
本发明提供的抑制癌细胞繁殖和侵袭的纳米抗体，经使用多种方法检测证明，如CCK-8试剂盒、划痕实验、Transwell、荷瘤模型体内实验等，抑制多种癌细胞增殖效果良好，具有优良的抗癌药物开发前景。
本纳米抗体也可以进行标记，用于检测癌细胞。
总之，本发明提供的纳米抗体可以结合多种癌细胞，因而可以作为抗癌的靶向药物，可以用蛋白，也可用DNA或RNA；也可以标记后用于免疫检测多种癌细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明纳米抗体H6与人B7-H4结合的ELISA结果统计图。
图2为本发明纳米抗体H6的基因DNA序列。
图3为本发明纳米抗体H6 mRNA在乳腺癌细胞BT549中的表达检测图。
图4为本发明纳米抗体H6抑制乳腺癌细胞BT549迁移能力的结果图。
图5为本发明纳米抗体H6抑制乳腺癌细胞BT549侵袭能力的结果图。
图6为本发明纳米抗体H6对乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制曲线。
图7为本发明纳米抗体H6抑制乳腺癌裸鼠模型肿瘤生长的结果图。
图8为本发明纳米抗体H6抑制4种癌细胞增殖的结果(CCK-8试剂盒检测)。
具体实施方式
下面将结合实施例与附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种结合多种癌细胞的纳米抗体H6，该纳米抗体H6具有如SEQ IDNO.1所示序列。
近年来，以单域抗体(sdAb)或纳米抗体(Nanobody)作为靶向药物的研究已成为主动靶向药物研究领域的新课题。单域抗体包含了抗体中单个可变域的片段，是抗体分子的最小抗原结合单元，又称为纳米抗体，但与完整的抗体一样，可以选择性地和特定抗原结合。
1993年，Hamers-Cazterman等在单峰驼以及双峰的亚洲驼和南美骆驼的血清中发现一种天然缺失轻链的重链抗体(HCAb)，克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm，是最小的功能性抗原结合片段。其分子质量为15KDa，远远小于Fab段(60KDa)和普通抗体(150KDa)。
骆驼重链抗体的VHH和人抗体重链的VH结构非常相似，大概有75％的同源性。由于轻链缺失，纳米抗体仅有3个高可变区(CDRs)。与普通抗体的6个CDRs区相比，缺少了3个CDRs区，但却具备了相当特异的结合能力和亲和力。因为纳米抗体的CDR3含有16～18个氨基酸残基，比人和鼠的VH 分别有12和9个氨基酸残基的CDR3长，这使得纳米抗体能识别罕见的、隐藏的抗原表位，结合蛋白质、酶抗原的凹陷部位和活性位点。纳米抗体的 CDR3区域可形成一个大的暴露的凸环，凸环中的一个半胱氨酸与CDRl或 FR2的45位点的半胱氨酸形成二硫键，从而大大降低纳米抗体与抗原结合所需能量，因此可获得高亲和力的纳米抗体。另外，在纳米抗体的VHH基因序列中，还有4个氨基酸残基突变：V37F(Y)，G44E，L45R，W47G，由疏水性变成了亲水性，大大增加了纳米抗体的溶解性。
此类抗体衍生物还可来自鲨鱼类动物中天然产生的可变区以及工程化的人源抗体中重链或轻链的可变区结构域。与普通抗体相比，纳米抗体具有结构简单，易于体外合成、表达和纯化，组织渗透力强，可人源化改造，无不良反应，还可修饰等优点。合成成本也比制备普通抗体成本低，周期短。因此，在生物医学应用领域中前景光明，受到人们的青睐。尤其是为特异靶向肿瘤细胞开发新型靶向抗癌药物，开辟了新的途径。
噬菌体展示抗体库技术(phage display antibody library)是近年来在抗体工程领域取得的最突出的研究进展之一,该技术主要将抗体分子展示于噬菌体表面后,利用靶标抗原分子将表达特异性抗体分子的噬菌体筛选出来,并通过基因工程的方法对抗体进行表达和后续的功能鉴定,从而获得功能性抗体分子。根据用于噬菌体展示抗体库构建的B细胞是否经过免疫,可以将构建的噬菌体抗体库分为免疫库和非免疫库。如果用于构建免疫库的B细胞主要来源于经主动免疫,或者是病原体体内感染后的记忆性B细胞则是免疫库；如果是未致敏的B细胞所构建的噬菌体抗体库,则被称为非免疫库。由于未致敏的B细胞的多样性取决于用于构建抗体库的B细胞克隆的多样性，所以非免疫库的容量越大，越可以筛选到高亲和力的抗体。本发明采用的是非免疫羊驼噬菌体文库，为采集20只未免疫羊驼淋巴细胞与1个羊驼脾脏所构建，随机挑取48个克隆PCR验证阳性率为100％，测序结果显示序列无重复，多样性良好，库容量为2×109，丰度超过99％。
本发明以人B7-H4为抗原，用上述非免疫库筛选到一株纳米抗体H6。经细胞实验证明对B7-H4具有高特异和高亲和力，对多种肿瘤细胞的增殖具有良好的抑制作用。
在一个可选的实施方式中，上述纳米抗体可以直接用作抗肿瘤药物。
由于纳米抗体可以特异结合B7-H4，而B7-H4蛋白是肿瘤细胞的负调控因子，帮助肿瘤细胞逃逸。所以当H6与B7-H4结合后，即封闭了肿瘤细胞的逃逸能力、繁殖能力。所以H6可开发为靶向抗癌药物。
在一个可选的实施方式中，H6可以体外合成，或任何其他来源的具有同源序列的纳米抗体。
在一个可选的实施方式中，上述人工合成包括体外化学合成或分子生物学方法合成
由于纳米抗体H6是蛋白质，且分子量小。因此可以直接用多肽合成仪合成，并且在体外合成的过程中添加修饰物或标签，然后令其自然折叠后，用做抗癌药物。
在一个优选的实施方式中，上述分子生物学方法合成为体外翻译合成。体外翻译快速、简单，成本较低。
在一个优选的实施方式中，上述分子生物学方法合成为H6可以利用工程菌进行表达。
利用基因工程技术把编码H6的DNA序列导入到载体，建立E.coli、酵母等工程菌进行表达，纯化后作为药物使用。
在一个更优选的实施方式中，H6的编码mRNA可直接导入细胞表达。
根据H6的编码基因DNA序列，可以很容易的推导出mRNA序列。把此mRNA用转染试剂导入肿瘤细胞，利用此肿瘤细胞的翻译系统，可以表达H6，从而能阻止B7-H4发挥功能。这也是基因治疗的一种方式。
在一个可选的实施方式中，H6可以进行标记。
H6是蛋白质，可以对其进行标记；又因H6可特异性结合B7-H4，所以H6可连接标记物，应用于癌细胞或组织检测与鉴定。
在一个可选的实施方式中，上述纳米抗体H6特异结合的癌细胞包括乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、胃腺癌细胞、肾上皮癌细胞等。
该纳米抗体H6能够特异识别多种肿瘤细胞株，包括乳腺癌BT-549细胞、宫颈癌HeLa细胞、胃腺癌细胞BGC-823、肾上皮癌细胞293等；另外，还能够特异识别受试的临床癌患者的癌组织切片中的癌细胞，对照多肽序列与上述细胞及组织均无结合。
诸多研究证明，B7-H4与多种肿瘤的发生相关，在肿瘤免疫逃避的机制中发挥了重大的作用-----负性协同共刺激分子，在多种肿瘤细胞上异常高表达，并通过抑制T细胞介导的免疫应答反应参与肿瘤的免疫逃逸。B7-H4 还可通过参与细胞信号转导通路增强肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抗凋亡能力，促进肿瘤的发展。因此，B7-H4成为肿瘤发生的新型分子标志物和肿瘤靶向治疗的分子靶点，抑制或封闭B7-H4的活性在临床抗癌应用中有着广泛的前景。所以，本发明利用单域抗体噬菌体文库筛选了抗B7-H4 的纳米抗体，以便开发新的靶向抗癌药物。
下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明
实施例1结合癌细胞特异蛋白B7-H4的纳米抗体的筛选
噬菌体展示抗体库技术(phage display antibody library)主要将抗体分子展示于噬菌体表面后,利用靶标抗原分子将表达特异性抗体分子的噬菌体筛选出来,并通过基因工程的方法对抗体进行表达和后续的功能鉴定,从而获得功能性抗体分子。本发明采用的是非免疫羊驼噬菌体文库(Lama-VHH Phage Display Library，采集20只未免疫羊驼淋巴细胞与1个羊驼脾脏细胞所构建)。提取混合细胞的总RNA，反转录为cDNA。PCR扩增VHH段基因序列。
噬菌体展示抗体库载体构建：文库用pComb3XSS载体构建，通过SfiI 单酶切，将pComb3XSS酶切为1672bp(SS stuffer)与3301bp(载体目的片段)两个大片段，上述PCR片段插入到载体(连接3301片段)，直接转化大肠杆菌ER2738；
将辅助噬菌体M13K07加入到生长至对数生长期的ER2738中进行噬菌粒拯救；培养过夜后，离心收集上清即获得噬菌体VHH抗体库。
B7-H4纳米抗体的富集筛选(亲和筛选):
1)将B7-H4靶蛋白用PBS稀释至终浓度为100μg/mL，按100μ L/孔加入酶标板孔中，4℃包被12h；
2)弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭2h；
3)PBS洗涤3次，取10μL噬菌体文库与90μLPBS混合，然后加入到酶标板孔中，37℃孵育2h；
4)吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤5次；
5)加入100μL0.1M Gly-HCl(pH2.2～2.5,1mg/mL BSA)洗脱液， 37℃孵育8～10min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用50μL1MTris-HCl(pH 8.0)中和缓冲液中和(在中和前，先测试加入多少中和缓冲液)。
6)取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。
7)将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变条件，每一轮淘选条件如下表。
表1亲和淘选条件
Figure RE-GDA0002399792150000101
特异性噬菌体克隆的鉴定
从测定末轮淘选洗脱物滴度的平板上(菌落数30～200个)，用灭菌牙签随机挑取50个单菌落接种于1mL 2×YT-GA中，37℃，220r/min振荡培养12h。
2)按1％接种量接种于2×YT-GA，37℃，220r/min，培养至对数生长前期。
3)按cell：phage＝1：1的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15min， 220r/min振荡培养30～45min；
4)4℃，10000r/min，离心1min，沉淀以等体积2×YT-AK重悬，30℃，剧烈振荡培养12h；
5)将上述培养物于4℃10000rpm离心10min，收集上清，用于ELISA鉴定。
阳性噬菌体克隆的鉴定
1)用PBS将靶蛋白B7-H4稀释至2μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中， 4℃包被12h；
2)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL3％脱脂牛奶，37℃封闭2h；
3)PBST洗涤3次，加入50μL噬菌体上清与50μLPBS，37℃，孵育1h；
4)PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用3％脱脂牛奶，按1:5000稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；
5)PBST洗板6次。加入反应底物TMB显色液显色，100μL/孔，37℃， 20min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。用 M13K07包被作阳性对照，抗原包被加M13K07作阴性对照，抗原包被加 PBS作空白对照。阳性克隆判断标准：测试样品OD值(S)与阴性对照OD 值(N)的比值(S/N)≥2.1。见图1。
阳性噬菌体克隆的序列分析
将阳性克隆进行序列测定，测序引物gback 5＇-GCC CCC TTA TTA GCG TTT GCCATC-3＇。见图2。
实施例2纳米抗体的细胞表达
1)体外合成B7-H4纳米抗体H6 mRNA
将筛选所得的H6编码DNA序列前添加前导肽序列IL-2，序列后添加 His标签序列，由上海生工合成这2段序列，作为PCR扩增引物，上游引物 TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG(27bp)，下游引物 T120CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA(149bp)。利用PCR将三段合成为一体。体外转录试剂盒体外转录PCR产物，体外转录过程中添加 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)GRNA帽类似物。在反应结束后添加Turbo DNA 酶(来自MEGAscript T7 kit)，37℃热循环仪上孵育15min。加10×antarctic磷酸酶缓冲液和Antarctic磷酸酶，用Monarch RNAclearup kit纯化。
2)细胞培养及免疫荧光检测纳米抗体H6的表达
乳腺癌细胞BT549，宫颈癌HeLa细胞，肝癌HepG2细胞在37℃，5％CO2 的培养箱中培养，选择对数生长期的细胞用于实验。细胞汇合度大于80％时，使用TransIT-mRNA转染试剂转染H6的mRNA到肿瘤细胞；分组为：实验组、转染试剂组、空白对照组。
将生长状态良好的细胞接种到24孔板中(1×105个细胞/孔)，过夜培养，次日转染H6 mRNA 30h后，吸去培养基，1×PBS漂洗3次，每次5min；用4％多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，1％BSA室温封闭1h，吸干封闭液，加足量稀释好的Anti-His标签一抗，4℃孵育过夜；次日PBS漂洗3次，加羊抗小鼠lgG-Cy3荧光二抗孵育1h，PBS漂洗3次后进行DAPI染核定位，用荧光猝灭剂封片，荧光显微镜观察。见图3。
实施例3CCK-8法检测纳米抗体H6对癌细胞增殖的抑制作用
将转染过H6 mRNA的细胞悬液置于96孔板中(100μL/孔)，预培养 24h，设置空白组和转染试剂对照组；向每孔加入10μL CCK-8溶液，轻轻晃匀，在37℃培养箱中孵育1h；酶标仪测定450nm处的吸光值。计算细胞抑制百分比。见图8。
实施例4划痕实验检测纳米抗体H6对癌细胞迁移能力的抑制作用
在6孔细胞培养板背面按直尺用marker笔均匀划线，横穿过孔，每孔 5条。接种乳腺癌细胞(约3×106个/孔)于培养板中。次日转染H6-mRNA， 24h后用20μL移液器吸头贴着直尺，垂直于背后的横线划痕，用PBS轻柔清洗细胞3次，洗去划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃培养箱，按0h，12h，24h，48h取样拍照。用Image J测定划痕面积：细胞平均迁移距离＝(0h划痕面积-12h、24h或48h划痕面积)/平均划痕长度。见图4。
实施例5Transwell检测纳米抗体H6对癌细胞侵袭能力的抑制作用
接种乳腺癌细胞到6孔板。实验组转染H6mRNA，空白对照组只加相同体积的10％完全培养基，24h后用无血清培养基饥饿处理12h；按基质胶：无血清培养基＝1:8的比例稀释基质胶，将稀释后的基质胶均匀的铺在Transwell小室上室中，每孔35μL。将铺好基质胶的transwell小室放在37℃， 5％CO2培养箱中过夜；水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入70 μL无血清培养基，培养箱培养30min；将饥饿处理后的细胞消化离心，用 PBS清洗2遍，用无血清培养基悬浮；通过细胞计数将每组细胞浓度调整为1×105mL-1；向Transwell小室上室中加入200μL细胞悬液；向下室中加入600μL含10％胎牛血清的DMEM培养基；培养箱中培养48h去除 Transwell小室，弃去小室内培养基，用棉签擦拭上室内细胞，PBS清洗3遍；将Transwell小室下表面用甲醇固定20min，然后用0.1％的结晶紫染色 15min，用PBS轻轻清洗残留结晶紫；在显微镜下观察细胞从上室透过基质胶侵袭到下室膜表面的细胞个数并拍照，随机选取5个低倍镜(100×)下视野进行细胞计数。见图5。
实施例6纳米抗体H6对裸鼠体内肿瘤的抑制作用
乳腺癌BT549肿瘤裸鼠模型的建立将处于对数生长期的BT549细胞消化混匀处理后与基质胶按1：1的比例混合，再使用1mL注射器注射到裸鼠右后肢附近位置，接种肿瘤细胞两个月左右，测量肿瘤体积生长到一定大小(>100mm3)后对荷瘤小鼠进行分组治疗。按其肿瘤体积的大小均匀的分为对照组和实验组，对照组分为转染试剂组、siRNA组(1mg/kg/只)和紫杉醇组(10mg/kg/只)，实验组为H6-mRNA组(1mg/kg/只)，每组7只，并使各组裸鼠的肿瘤体积均值基本保持一致，每三天瘤旁注射一次，持续给药一个月。
荷瘤裸鼠一般生活状况的观察每日观察裸鼠的活动能力、肿瘤体积大小、裸鼠的毛发、摄食和饮水量变化等，并记录下小鼠的生存时间：每隔三天测量一次肿瘤的长径和短径，记录并计算体积的变化，体积计算公式为：V＝1/2ab2(a为长径，b为短径)，再根据裸鼠肿瘤体积的变化绘制成小鼠肿瘤生长曲线，在最后一次给药48h后，将荷瘤小鼠进行脱颈处死，剥取肿瘤进行称重、包埋、拍照等处理。见图6、 7。
由图3-图7可以看出，纳米抗体H6可以有效抑制乳腺癌、宫颈癌、胃癌细胞的增殖、转移和侵袭。
由图1得出结论：与对照噬菌体相比，携带H6抗体基因的噬菌体可以特异性吸附(结合)人B7-H4蛋白。
由图2得出结论：纳米抗体H6的基因DNA序列及氨基酸序列符合羊驼的VHH序列结构。
由图3得出结论：纳米抗体H6 mRNA在乳腺癌BT549细胞中能够有效表达，表现其免疫特性。
由图5得出结论：纳米抗体H6可有效抑制乳腺癌细胞BT549迁移。
由图6得出结论：纳米抗体H6可抑制乳腺癌细胞BT549侵袭。
由图7得出结论：C4、D2裸鼠实验过程中死亡，B2、C7、D6、 D7肿瘤逐渐消失，纳米抗体H6可有效抑制乳腺癌细胞BT549在裸鼠体内的生长。
由图8得出结论：纳米抗体H6可以显著抑制4种癌细胞的增殖。
综上所述，纳米抗体H6能够特异性识别人肿瘤细胞的B7-H4蛋白，具有靶向人癌细胞的广泛临床应用和基础应用前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 青岛大学
<120> 一种特异结合癌细胞蛋白B7-H4的纳米抗体H6的序列和应用
<141> 2019-11-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> Vicugna vicugna
<400> 1
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggt ttggtgcagg ttggagggtc tctcagactc 60
nnaryyyana yyrrgtcctg tgctgcctct gggcgcaatt tcgctacgta taatatagtg 120
tggttccggc aggtarysaa ryrgsnhahr yrsnarhrgn accagggaag gaccgtgagg 180
ggatctcatg tataggtacc gctgatggag atacagatta tryyssrgyr ysyhrasysh 240
rsyraaagac gacgtgaagg gccgattcat cgtctcgaga gacaacgcca ggaatatggt 300
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cagccattta tttctgcgca gcccatagtn tsnahrrshr ayrhysaasr ttctactatc 420
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rhrrgrrayr ynyhrngtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaagacah 540
rarrryshrr ysrns 555
<210> 2
<211> 153
<212> DNA
<213> Vicugna vicugna
<400> 2
nnaryyyana yyrrgrysaa ryrgsnhahr yrsnarhrgn aryyssrgyr ysyhrasysh 60
rsyrysssay syrgharrgs snargsntan tsnahrrshr ayrhysaasr hyyrrrgysh 120
rhrrgrrayr ynyhrnahra rrryshrrys rns 153

Claims (7)

1.一种结合癌细胞特异蛋白B7-H4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQID NO.1和2所示序列。
2.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能特异结合癌细胞的B7-H4蛋白，包括乳腺癌BT-549细胞、宫颈癌HeLa细胞、胃腺癌细胞BGC-823、肾上皮癌细胞293。
3.根据权利要求1-2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为细胞或E.coli表达、人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的纳米抗体。
4.根据权利要求3所述的纳米抗体，其特征在于，所述人工合成包括多肽直接合成和分子生物学方法合成；
优选地，所述分子生物学方法合成为体外翻译合成；
优选的，所述体外翻译合成也包括其DNA和mRNA直接导入靶细胞表达。
5.包含权利要求1-4任一项所述的结合癌细胞的纳米抗体，作为用于靶向癌细胞的药物、DNA或RNA。
6.包含权利要求1-4任一项所述的纳米抗体，作为在肿瘤研究或制备检测癌细胞的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：合成所述纳米抗体，将样品与所述纳米抗体孵育后检测样品与所述纳米抗体的结合；
优选地，所述样品包括血液、细胞或组织切片。
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