CN109563503A - 抗b7-h4抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是制作具有高特异性·亲和性的新型抗B7‑H4抗体，并提供利用了该新型抗B7‑H4抗体的癌症治疗用组合物，新制作了特异性结合于人B7‑H4蛋白质的胞外域蛋白的单克隆抗体，此外，为了增强该单克隆抗体的抗体依赖性细胞毒活性，制作了使该单克隆抗体与效应细胞结合而成的“抗B7‑H4抗体‑效应细胞复合体”、包含该单克隆抗体的抗原识别区域和效应细胞抗原识别区域的双特异性抗体，将它们作为癌症治疗用组合物使用。

Description

抗B7-H4抗体
技术领域
本发明涉及识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体、上述抗体与效应细胞结合而成的连接抗体-细胞复合体、包含上述抗体的重链可变区及轻链可变区的双特异性抗体等。
背景技术
B7-H4为属于B7家族的膜蛋白，作为免疫检查点分子为人所知(非专利文献1)。已明确报道在肺、肝脏、卵巢等各种正常组织中观察到了B7-H4mRNA的低水平表达，但并未确认到B7-H4蛋白质在这些正常组织中的表达。另一方面，已知B7-H4蛋白质在卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌等各种癌组织中均高表达而与阶段无关(非专利文献2)。因此，B7-H4作为新型的癌症分子标志物、癌症治疗的靶分子而受到期待，但关于B7-H4的表达及其作用，仍留有很多尚未明确的问题。
随着近年来抗体工程的发展，能够制作人嵌合抗体、人源化抗体这样的相对于人的抗原性低且可临床应用的基因重组抗体，因此，尤其是以癌症治疗领域为中心逐渐开发·批准了抗体药物。作为药物所开发的抗体基本上为分子量约150kDa的人IgG，是在其Fc区域上结合了2条N-糖苷键复合型糖链的糖蛋白。Fc区域为Fc受体、补体等结合的区域，认为通过该部分可发挥抗体依赖性细胞毒活性(antibody-dependent cellularcytotoxicity；ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)等效应活性。
实际上，由癌症患者Fc受体的多型解析表明，非霍奇金淋巴瘤治疗药抗CD20抗体Rituxan(R)(利妥昔单抗)、乳腺癌治疗药抗Her2抗体Herceptin(R)(曲妥珠单抗)的主要抗肿瘤机制之一为ADCC活性(非专利文献3-7)，在医药开发中可应用的ADCC活性增强技术的开发作为下一代抗体技术而受到关注。
作为特异性识别B7-H4的抗体，已经公开了几种单克隆抗体(例如专利文献1及2)。尤其是，专利文献1公开了在体外相对于表达B7-H4的癌细胞发挥ADCC活性的抗B7-H4抗体，但该抗体在体内发挥ADCC活性的可能性并不明确。另外，专利文献1公开了包含上述抗B7-H4抗体或其片段的双特异性分子，作为具体例，记载了识别B7-H4和Fc受体的双特异性分子、及通过该双特异性分子可使B7-H4表达细胞朝向效应细胞并诱导介由Fc受体的效应细胞活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用等)的可能性，但其效果实际上并未确认。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2011-505372号公报
专利文献2：日本特表2016-509582号公报
非专利文献
非专利文献1：Immunity,18,849(2003)
非专利文献2：Gynecol Oncol.,134,181(2014)
非专利文献3：Blood 99,754(2002)
非专利文献4：Cancer Res.,64,4664(2004)
非专利文献5：Arthritis Rheum.,48,455(2003)
非专利文献6：J.Clin.Oncol.,21,3940(2003)
非专利文献7：Clin.Cancer Res.,10,5650(2004)
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于制作具有高特异性·亲和性的新型抗B7-H4抗体，进而制作使该抗体的ADCC活性增强的“连接抗体-细胞复合体”、“双特异性抗体”等，由此提供有效的癌症治疗用组合物。
用于解决课题的手段
本申请的发明人将人B7-H4蛋白质的胞外域蛋白作为抗原对小鼠进行免疫，制作了可产生具有与B7-H4结合的能力的抗体的多个杂交瘤株。然后，通过ELISA法及夹心ELISA(sandwich ELISA)法，从来自所得到的杂交瘤株的抗体中选出了8种相对于游离型B7-H4具有高特异性和亲和性的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209)，进而，通过使用了使B7-H4蛋白质一过性地过量表达的培养细胞的免疫染色实验，明确了上述抗B7-H4抗体中至少H4.018、H4.025、H4.113、H4.121及H4.209可识别在细胞表面上表达的B7-H4。
接着，本申请的发明人使用上述抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113、H4.209)，进行了表达人B7-H4蛋白质的培养癌细胞的免疫染色。然而，所得到的结果表明实验中使用的任意抗B7-H4抗体均无法保证与癌细胞稳定的结合。因此，本申请的发明人认为，为了治疗癌症而单独使用上述抗B7-H4抗体时，无法发挥充分的ADCC活性。
因此，本申请的发明人深入研究了增强上述抗B7-H4抗体的ADCC活性的方法，想出了若使上述抗B7-H4抗体与效应细胞预先结合来作用于靶细胞则能够诱导间接性的抗体依赖性细胞毒活性(indirect ADCC；iADCC)这样的独创性构思，实际制作了“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”，并确认了其效果。即，本申请的发明人依次使抗CD3抗体、兔抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗体及抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113或H4.209)结合于从人外周血分离的效应细胞，制作了4种抗B7-H4抗体-效应细胞复合体(抗B7-H4抗体-效应细胞复合体、H4.018-效应细胞复合体、H4.025-效应细胞复合体、H4.113-效应细胞复合体及H4.209-效应细胞复合体)，并使用这些抗B7-H4抗体-效应细胞复合体进行了细胞毒性测定，结果表明至少H4.025-效应细胞复合体相对于靶标癌细胞可发挥细胞毒活性。
本申请的发明人还解析了上述抗B7-H4抗体中的7种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140及H4.209)的重链及轻链可变区的氨基酸序列及基因序列，基于所得到的序列信息，制作了2种识别B7-H4和CD3抗原(T细胞抗原)这两者的双特异性抗体(scFv-scFv及Fab-scFv)，在体外及体内对它们的效果进行了确认。结果表明，上述scFv-scFv及Fab-scFv相对于表达B7-H4的癌细胞均显示出浓度依赖性的细胞毒活性，另外，明确了向患癌小鼠施予上述Fab-scFv时可观察到肿瘤尺寸的缩小、Fab-scFv在肿瘤组织内的积聚及CD8阳性杀伤性T细胞的浸润、肿瘤组织中的B7-H4阳性的癌细胞的减少·消亡等优异的抗肿瘤作用，从而完成了本发明。
即，本发明涉及(1)识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体，其包含以下(a)～(g)中的任一个区域：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区，本发明涉及(2)编码识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体的核酸，其包含以下(A’)～(G’)中的任一个核酸序列：(A’)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的核酸序列；(B’)编码包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(C’)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(D’)编码包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(E’)编码包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(F’)编码包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(G’)编码包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列。
另外，本发明涉及(3)包含以下(A)～(G)中的任一个核酸序列的上述(2)所述的核酸：(A)序列号1所示的核酸序列；(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列，本发明涉及(4)含有上述(2)或(3)所述的核酸的载体，本发明涉及(5)将上述(4)所述的载体导入宿主细胞而得到的转化体。
此外，本发明涉及(6)作为单克隆抗体的上述(1)所述的抗体，本发明涉及(7)产生上述(6)所述的抗体的杂交瘤，本发明涉及(8)具备上述(1)或(6)所述的抗体的癌细胞检测用试剂盒，本发明涉及(9)由上述(1)或(6)所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的抗体连接体，本发明涉及(10)第二抗体为识别CD3抗原的抗体的上述(9)所述的抗体连接体，本发明涉及(11)癌症治疗用组合物，其包含上述(9)或(10)所述的抗体连接体，通过所述抗体连接体将效应细胞送达至癌细胞，本发明涉及(12)效应细胞结合于由上述(1)或(6)所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的抗体连接体而得到的连接抗体-细胞复合体，本发明涉及(13)第一抗体和第二抗体介由识别所述第一抗体及所述第二抗体这两方的第三抗体结合的上述(12)所述的连接抗体-细胞复合体，本发明涉及(14)上述(12)或(13)所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体及第二抗体为来自相同动物种类的IgG抗体，且第三抗体为识别所述动物种类的IgG抗体的抗体，本发明涉及(15)上述(12)～(14)中任一项所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体及第二抗体为来自小鼠的IgG抗体，且第三抗体为识别来自小鼠的IgG抗体的抗体，本发明涉及(16)上述(12)～(15)中任一项所述的连接抗体-细胞复合体，其中，效应细胞为从作为治疗对象的癌症患者采集的效应细胞，本发明涉及(17)含有上述(12)～(16)中任一项所述的连接抗体-细胞复合体作为有效成分的癌症治疗用组合物。
另外，本发明涉及(18)双特异性抗体，其包含识别效应细胞抗原的区域、和以下(a)～(g)中的任一个区域：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区，本发明涉及(19)上述(18)所述的双特异性抗体，其中，识别效应细胞抗原的区域为识别CD3抗原的抗体的重链可变区及轻链可变区，本发明涉及(20)作为单链抗体的上述(18)或(19)所述的双特异性抗体，本发明涉及(21)包含序列号32或37所示的氨基酸序列的上述(18)～(20)中任一项所述的双特异性抗体，本发明涉及(22)作为Fab-scFv融合体的上述(18)或(19)所述的双特异性抗体，本发明涉及(23)由包含序列号39所示的氨基酸序列的长链和包含序列号41所示的氨基酸序列的短链形成的上述(18)、(19)及(22)中任一项所述的双特异性抗体，本发明涉及(24)编码上述(18)～(23)中任一项所述的双特异性抗体的核酸。
此外，本发明涉及(25)上述(24)所述的核酸，其包含以下(A)～(G)中的任一个序列：(A)序列号1所示的核酸序列；(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列，本发明涉及(26)包含序列号31或36所示的核酸序列的上述(24)或(25)所述的核酸，本发明涉及(27)上述(24)或(25)所述的核酸，其含有包含序列号38所示的核酸序列的核酸和包含序列号40所示的核酸序列的核酸，本发明涉及(28)含有上述(24)～(27)中任一项所述的核酸的载体，本发明涉及(29)将上述(28)所述的载体导入宿主细胞而得到的转化体，本发明涉及(30)癌症治疗用组合物，其包含上述(18)～(23)中任一项所述的双特异性抗体，通过所述双特异性抗体将效应细胞送达至癌细胞，本发明涉及(31)上述(18)～(23)中任一项所述的双特异性抗体与效应细胞结合而成的双特异性抗体-细胞复合体，本发明涉及(32)上述(31)所述的双特异性抗体-细胞复合体，其中，效应细胞为从作为治疗对象的癌症患者采集的效应细胞，本发明涉及(33)含有上述(31)或(32)所述的双特异性抗体-细胞复合体作为有效成分的癌症治疗用组合物。
发明的效果
根据本发明，可制造能够特异性且高灵敏度地检测游离型人B7-H4蛋白质及/或存在于细胞表面上的人B7-H4蛋白质的抗B7-H4抗体。另外，就本发明的使抗B7-H4抗体与识别效应细胞的抗体连接而成的“抗体连接体”、使效应细胞进一步与该抗体连接体连接而成的“连接抗体-细胞复合体”而言，可增强本发明的抗B7-H4抗体的ADCC活性，特异性地将表达人B7-H4蛋白质的癌细胞杀死。此外，根据本发明，基于上述抗B7-H4抗体的重链及轻链可变区的序列信息，可制作识别人B7-H4蛋白质和效应细胞抗原这两者的双特异性抗体。该双特异性抗体可将效应细胞特异性地送达至癌细胞而诱导有效的ADCC，有可能能够作为癌症治疗用医药组合物而利用。
附图说明
[图1]为表示调查了本发明的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209)与人B7-H4、人B7-H1及人B7-DC蛋白质的结合能力的结果的图。
[图2]为表示调查了本发明的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.140及H4.209)与不同浓度的人B7-H4的结合能力的结果的图。
[图3]为表示通过本发明的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.121、H4.140、H4.160及H4.209)及市售的抗体(H74克隆体)对人B7-H4表达293F细胞进行了免疫染色的结果的图。
[图4]为表示使用市售的抗B7-H4抗体(H74克隆体)确认了多个癌细胞株中B7-H4的表达的结果的图。
[图5]为表示在4个不同条件下对本发明的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113、H4.209)与MDA-MB-468细胞的结合进行了调查的结果的图。
[图6](a)为表示本发明的连接抗体-细胞复合体的示意图的图。(b)为表示调查了基于本发明的连接抗体-细胞复合体的间接性抗体依赖性细胞毒活性的结果的图。应予说明，图中的“H4.018”、“H4.025”、“H4.113”及“H4.209”分别表示本发明的“H4.018-效应细胞复合体”、“H4.025-效应细胞复合体”、“H4.113-效应细胞复合体”及“H4.209-效应细胞复合体”。
[图7]为表示H4.018的重链可变区的核酸序列(序列号1)及氨基酸序列(序列号2)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图8]为表示H4.025的重链可变区的核酸序列(序列号3)及氨基酸序列(序列号4)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图9]为表示H4.025的轻链可变区(κ链)的核酸序列(序列号5)及氨基酸序列(序列号6)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图10]为表示H4.025的轻链可变区(λ链)的核酸序列(序列号7)及氨基酸序列(序列号8)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图11]为表示H4.051的重链可变区的核酸序列(序列号9)及氨基酸序列(序列号10)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图12]为表示H4.051的轻链可变区的核酸序列(序列号11)及氨基酸序列(序列号12)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图13]为表示H4.113的重链可变区的核酸序列(序列号13)及氨基酸序列(序列号14)图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图14]为表示H4.113的轻链可变区(κ链)的核酸序列(序列号15)及氨基酸序列(序列号16)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图15]为表示H4.113的轻链可变区(λ链)的核酸序列(序列号17)及氨基酸序列(序列号18)的图。
[图16]为表示H4.121的重链可变区的核酸序列(序列号19)及氨基酸序列(序列号20)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图17]为表示H4.121的轻链可变区的核酸序列(序列号21)及氨基酸序列(序列号22)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图18]为表示H4.140的重链可变区的核酸序列(序列号23)及氨基酸序列(序列号24)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图19]为表示H4.140的轻链可变区的核酸序列(序列号25)及氨基酸序列(序列号26)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图20]为表示H4.209的重链可变区的核酸序列(序列号27)及氨基酸序列(序列号28)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图21]为表示H4.209的轻链可变区的核酸序列(序列号29)及氨基酸序列(序列号30)的图。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
[图22]为表示本发明的双特异性抗体(BsAb)的结构的图。
[图23-1]为表示本发明的BsAb的核酸序列(序列号31的第1位～第495位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号32的第1位～第165位的氨基酸序列)的图。
[图23-2]为表示本发明的BsAb的核酸序列(序列号31的第496位～第1035位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号32的第166位～第345位的氨基酸序列)的图。
[图23-3]为表示本发明的BsAb的核酸序列(序列号31的第1036位～第1500位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号32的第346位～第500位的氨基酸序列)的图。
[图24]为表示本发明的scFv-scFv的结构的图。
[图25-1]为表示本发明的scFv-scFv的核酸序列(序列号36的第1位～第540位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号37的第1位～第180位的氨基酸序列)的图。
[图25-2]为表示本发明的scFv-scFv的核酸序列(序列号36的第541位～第1080位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号37的第181位～第360位的氨基酸序列)的图。
[图25-3]为表示本发明的scFv-scFv的核酸序列(序列号36的第1081位～第1602位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号37的第361位～第533位的氨基酸序列)的图。
[图26]为表示本发明的Fab-scFv的结构的图。
[图27-1]为表示本发明的Fab-scFv的长链的核酸序列(序列号38的第1位～第540位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号39的第1位～第180位的氨基酸序列)的图。
[图27-2]为表示本发明的Fab-scFv的长链的核酸序列(序列号38的第541位～第1080位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号39第181位～第360位的氨基酸序列)的图。
[图27-3]为表示本发明的Fab-scFv的长链的核酸序列(序列号38的第1081位～第1521位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号39的第361位～第506位的氨基酸序列)的图。
[图28-1]为表示本发明的Fab-scFv的短链的核酸序列(序列号40的第1位～第540位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号41的第1位～第180位的氨基酸序列)的图。
[图28-2]为表示本发明的Fab-scFv的短链的核酸序列(序列号40的第541位～第726位的核酸序列)及氨基酸序列(序列号41的第181位～第241位的氨基酸序列)的图。
[图29]为表示使用抗B7-H4抗体(H4.025)及本发明的Fab-scFv进行了4种乳腺癌细胞(MDA-MB-468细胞、MDA-MB-231细胞、SKBR3细胞及ZR75细胞)的免疫染色的结果的图。
[图30]为表示调查了本发明的scFv-scFv及Fab-scFv对乳腺癌细胞(MDA-MB-468细胞)的细胞毒活性的结果的图。图中，“裂解％(％Lysis)”表示测定信号与基于通过表面活性剂裂解的细胞的总信号的比率，“ng/ml”表示本发明的Fab-scFv的添加浓度。
[图31]为表示调查了本发明的scFv-scFv及Fab-scFv对4种癌细胞的细胞毒活性的结果的图。MDA-MB-231细胞、ZR75细胞、及SKBR3细胞为来自乳腺癌的细胞株，NCI-H2170细胞为来自肺扁平上皮癌的细胞株。
[图32]为表示调查了本发明的Fab-scFv对患癌小鼠的肿瘤尺寸所带来的影响的结果的图。患癌小鼠通过将人外周血单核细胞及人癌细胞(MDA-MB-468细胞或NCI-H2170细胞)移植到MHC敲除NOG小鼠来制作。
[图33]为表示通过苏木精伊红染色调查了本发明的Fab-scFv对患癌小鼠的肿瘤组织所带来的影响的结果的图。图中，分别地，“对照”表示来自未处理的患癌小鼠的肿瘤组织，“经抗体处理”表示来自施予了本发明的Fab-scFv的患癌小鼠的肿瘤组织。
[图34]为表示通过使用了抗CD8抗体及抗B7-H4抗体(H4.025)的免疫染色来调查本发明的Fab-scFv对患癌小鼠的肿瘤组织所带来的影响的结果的图。图中，“对照”表示来自未处理的患癌小鼠的肿瘤组织，“经抗体处理”表示来自施予本发明的Fab-scFv的患癌小鼠的肿瘤组织。
[图35]为表示调查了本发明的Fab-scFv在患癌小鼠中的分布的结果的图。
具体实施方式
作为本发明的抗体，只要为识别人B7-H4蛋白质的胞外域、且包含以下(a)～(g)中的任一个区域的抗体即可，没有特别限制，所述(a)～(g)为：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含的序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区，优选包含上述(a)、(b)、(d)、(e)及(g)中的任一个区域的抗体，更优选包含上述(b)区域的抗体。在此，“抗体”是指全长的抗体或其片段，可为来自生物的天然抗体、改型抗体及通过基因重组制作的抗体中任何。另外，作为本发明的抗体的形态，例如可合适地列举单克隆抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗独特型(抗Id)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、scFV(单链抗体)等，特别优选单克隆抗体。
在上述本发明的抗体中，包含上述(b)或(d)区域的抗体可分别包含2种轻链可变区(Kappa(κ)及Lambda(λ))中的一方，或者包含两方的轻链可变区。更具体而言，作为包含上述(b)区域的抗体，可列举下述i)～iii)中的任一个抗体：i)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号6(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；ii)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号8(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；iii)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号6(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区及包含序列号8(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，作为包含上述(d)区域的抗体，可列举下述iv)～vi)中的任一个抗体：iv)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号16(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；v)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号18(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；vi)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号16(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区及包含序列号18(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
另外，作为本发明的核酸，只要为编码识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体、且包含下述任一种核酸序列的核酸即可，没有特别限制，所述核酸序列为：(A’)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的核酸序列；(B’)编码包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(C’)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(D’)编码包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(E’)编码包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(F’)编码包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(G’)编码包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列，上述核酸序列可根据要进行表达的宿主细胞来进行密码子序列的优化。更具体而言，作为上述核酸序列，可合适地列举包含以下任一个核酸序列的核酸：(A)序列号1所示的核酸序列；(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列。
作为本发明的载体，只要包含上述本发明的核酸即可，没有特别限制，可通过将本发明的核酸适当整合于表达载体来构建。作为上述表达载体，优选在宿主细胞中可自主复制的表达载体或可组入到宿主细胞的染色体中的表达载体，在由本发明的核酸所编码的重链或轻链可变区的可表达多肽的位置，可合适地使用含有启动子、增强子、终止子等控制序列的表达载体。作为表达载体，可使用动物细胞用表达载体、酵母用表达载体、细菌用表达载体等，优选使用了动物细胞用表达载体的重组载体。
作为上述动物细胞用表达载体，例如可列举pcDNA3(Stratagene公司制)、pCMV-FLAG6a(Sigma公司制)、pEGFP-C3(Clontech公司制)、pcDM8(由Funakoshi公司销售)、pAGE107〔特开平3-22979；Cytotechnology,3,133,(1990)〕、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8〔Nature,329,840,(1987)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103〔J.Blochem.,101,1307(1987)〕、pAGE210等。作为动物细胞用的启动子，例如可列举巨细胞病毒(人CMV)的IE(immediateearly)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、SRα启动子等。另外，作为上述酵母用表达载体，例如可列举YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作为酵母用的启动子，例如可列举PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白蛋白质启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。此外，作为上述细菌用表达载体，例如可列举pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司销售)、pGEX4T(Amersham Bioscience公司制)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pQE-30(QIAGEN公司制)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem.,48,669(1984)〕、PLSA1〔Agrc.Blo1.Chem.,53,277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)〕、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene公司制)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene,33,103(1985)〕、pUC19〔Gene,33,103(1985)〕、pSTV28(宝酒造公司制)、pSTV29(宝酒造公司制)、pUC118(宝酒造公司制)、pQE-30(QIAGEN公司制)等。作为细菌用的启动子，例如可列举trp启动子(P trp)、lac启动子(P lac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子，SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。
作为本发明的转化体，只要为将上述本发明的载体导入宿主细胞而得到的转化体即可，没有特别限制，作为在此使用的宿主细胞，例如可列举L细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、BALB/c3T3细胞(包括二氢叶酸还原酶、胸苷激酶等缺失的突变株)、BHK21细胞、HEK293细胞、Bowes恶性黑色素瘤细胞等动物细胞，酵母、曲霉等真菌细胞，大肠杆菌、链霉菌、枯草菌、链球菌、葡萄球菌等细菌原核细胞，果蝇S2、斜纹夜蛾Sf9等昆虫细胞，拟南芥等植物细胞等。另外，就将本发明的重组载体导入宿主细胞的方法而言，可根据宿主细胞的种类来使用适当的方法。作为该导入方法，具体而言，可列举Davis等(BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY,1986)及Sambrook等(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)等在很多标准化实验室指南中记载的方法，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、染色体易位(transvection)、显微注射、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔法、转导、感染等。
作为本发明的单克隆抗体，没有特别限制，例如可合适地列举以下实施例中记载的H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140及H4.209等。更具体而言，作为包含上述(a)区域(包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.018，作为包含上述(b)区域(包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6或8所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.025，作为包含上述(c)区域(包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.051，作为包含上述(d)区域(包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.113，作为包含上述(e)区域(包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.121，作为包含上述(f)区域(包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.140，作为包含上述(g)区域(包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区)的单克隆抗体，可合适地列举H4.209。作为本发明的单克隆抗体，从可识别游离型人B7-H4蛋白质和在细胞表面上存在的人B7-H4蛋白质这两者的观点考虑，优选H4.018、H4.025、H4.113、H4.121及H4.209，其中，特别优选H4.025。
在上述本发明的单克隆抗体中，包含上述(b)或(d)区域的单克隆抗体可分别包含2种轻链可变区(Kappa(κ)及Lambda(λ))中的一方，或者包含两方的轻链可变区。更具体而言，包含上述(b)区域的单克隆抗体可为下述I)～III)中的任一个单克隆抗体：I)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号6(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；II)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号8(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；III)含有包含序列号4所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号6(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区及序列号8(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体，或者，包含上述(b)区域的单克隆抗体也可为上述I)及II)的单克隆抗体混合而成的抗体，另外，包含上述(d)区域的单克隆抗体可为下述IV)～VI)中的任一个单克隆抗体：IV)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号16(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；V)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号18(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；VI)含有包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号16(κ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区及序列号18(λ链)所示的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体，或者，包含上述(d)区域的单克隆抗体还可为上述IV)及V)的单克隆抗体混合而成的抗体。
本发明的单克隆抗体例如可使用杂交瘤法(Nature256,495-497,1975)、三源杂交瘤(trioma)法、人B细胞杂交瘤法(Immunology Today 4,72,1983)及EBV-杂交瘤法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,pp.77-96,Alan R.Liss,Inc.,1985)等任意的方法来制作，特别优选通过杂交瘤法制作。另外，作为本发明的杂交瘤，只要为可产生上述本发明的单克隆抗体的杂交瘤即可，没有特别限制，更具体而言，可合适地列举以下实施例中记载的杂交瘤克隆体#18、#25、#51、#113、#121、#140及#209(分别为产生本发明的单克隆抗体H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140及H4.209的杂交瘤克隆体)。其中，可优选列举杂交瘤克隆体#18、#25、#113、#121及#209，可特别优选列举杂交瘤克隆体#25。
作为本发明的癌细胞检测用试剂盒，只要具备上述本发明的抗体即可，没有特别限制，尤其可合适地列举具备上述本发明的单克隆抗体的癌细胞检测用试剂盒。就本发明的癌细胞检测用试剂盒所包含的抗体而言，可根据检测方法用异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯等荧光物质、125I、32P、14C、35S、3H等放射性同位素、碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、藻红蛋白等酶进行标记，还可为与绿色荧光蛋白质(GFP)等荧光蛋白等融合而成的融合蛋白质。另外，就本发明的癌细胞检测用试剂盒而言，除包含上述本发明的抗体以外，还可包含用于ELISA法、夹心ELISA法、免疫染色法、RIA法等已知的蛋白质检测及/或测定方法的试剂、溶液、稀释剂、清洗用缓冲液、标准物质、对上述本发明的抗体发生特异性免疫学反应的标记抗体(二次抗体)、可显色·发光或产生荧光的底物试剂、记载了步骤及评价方法的操作手册等，优选可进行简便检测的构成。就上述本发明的癌细胞检测用试剂盒而言，只要为表达人B7-H4蛋白质的癌细胞、癌组织，则无论相对于何种癌症均可使用，尤其是可合适地用于已知B7-H4蛋白质高表达的卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌等的检测。
本发明还涉及上述本发明的抗体与识别效应细胞抗原的抗体结合而成的“抗体连接体”、该抗体连接体与效应细胞结合而成的“连接抗体-细胞复合体”。作为上述本发明的抗体连接体，只要为由上述本发明的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的抗体连接体即可，没有特别限制，优选第二抗体为识别CD3抗原的抗体，另外，作为上述本发明的连接抗体-细胞复合体，只要为效应细胞结合于由上述本发明的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的抗体连接体而得到的连接抗体-细胞复合体即可，没有特别限制，优选第一抗体和第二抗体介由识别所述第一抗体及所述第二抗体这两方的第三抗体结合，更优选第一抗体及第二抗体为来自相同动物种类的IgG抗体、且第三抗体为识别所述动物种类的IgG抗体的抗体，特别优选第一抗体及第二抗体为来自小鼠的IgG抗体、且第三抗体为识别来自小鼠的IgG抗体的抗体。在此，“效应细胞”为表达Fc受体的免疫系统的细胞，是指具有与结合于靶细胞的细胞表面上的抗体的Fc区域进行结合从而杀死该靶细胞的活性的细胞，具体而言，可合适地列举T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕细胞、自然杀伤(NK)细胞等，特别优选T细胞。另外，上述效应细胞可来自任何动物种类，可合适地列举来自人、小鼠、大鼠、兔子、猴子等的效应细胞，优选来自人的效应细胞，特别优选来自从作为治疗对象的癌症患者采集的效应细胞。
上述本发明的“抗体连接体”及“连接抗体-细胞复合体”在维持相对于人B7-H4蛋白质的结合能力的同时，可发挥增强的ADCC活性(应予说明，在本说明书中，有时将由“抗体连接体”及“连接抗体-细胞复合体”诱导的ADCC称作“间接性ADCC(iADCC)”)。即，即使在效应细胞的存在下使本发明的抗体单独作用于靶细胞(表达人B7-H4蛋白质的癌细胞)也未充分观察到或完全未观察到ADCC活性的情况下，通过使用上述本发明的抗体来制作上述“抗体连接体”或“连接抗体-细胞复合体”，也能够将效应细胞有效地送达至靶细胞而引起靶细胞的裂解。因此，上述本发明的“抗体连接体”及“连接抗体-细胞复合体”可作为癌症治疗用组合物的成分利用。作为本发明的“包含抗体连接体的癌症治疗用组合物”，只要包含本发明的抗体连接体且通过该抗体连接体将效应细胞送达至癌细胞即可，没有特别限制，另外，作为本发明的“包含连接抗体-细胞复合体的癌症治疗用组合物”，只要包含本发明的连接抗体-细胞复合体作为有效成分即可，没有特别限制。在此，关于作为治疗对象的“癌症”，只要为表达人B7-H4蛋白质的癌症即可，可为任何种类的癌症，可特别合适地列举高表达B7-H4蛋白质的卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌等。
另外，本发明涉及识别人B7-H4蛋白质和效应细胞抗原的双特异性抗体。作为上述本发明的双特异性抗体，只要包含下述(a)～(g)中的任一个区域和识别效应细胞抗原的区域即可，没有特别限制，所述(a)～(g)为：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区，作为上述“效应细胞抗原”，只要为在T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕细胞、自然杀伤(NK)细胞等效应细胞的细胞表面上特异性或以高水平存在的抗原即可，可为任何抗原，具体而言，可合适地列举CD3、CD2、CD28、CD44、C69、A13、G1等T细胞抗原，3G8、B73.1、LEUL1、VEP13、AT10等自然杀伤(NK)细胞抗原，可特别合适地列举作为T细胞抗原的CD3。
上述本发明的双特异性抗体可通过本技术领域中已知的各种方法制造，具体而言，例如可列举如下方法：通过基因操作将上述本发明的抗体中的抗原结合区域与识别效应细胞抗原的区域融合来制作单链抗体的方法；使用杂交杂交瘤即被称作四源杂交瘤(quadroma)的2种不同的单克隆抗体产生细胞的融合体来产生的方法(美国专利第4、474、893号公报)；使2种单克隆抗体的Fab片段或Fab’片段化学性结合来制作的方法(M.Brennanet al.,Science 1985,229(1708):81-3)；通过使2个完整的单克隆抗体进行共价结合来制作的方法(B.Karpovsky et al.,J.Exp.Med.1984,160(6):1686-701)；等等。其中，作为本发明的双特异性抗体，通过基因操作使包含上述本发明的抗体中的抗原结合区域的scFv与包含识别效应细胞抗原的区域的scFv进行融合而制作的单链抗体(scFv-scFv)、使包含上述本发明的抗体中的抗原结合区域的Fab与包含识别效应细胞抗原的区域的scFv融合的Fab-scFv是优选的。作为本发明的单链抗体(scFv-scFv)，只要为将来自本发明的抗B7-H4的重链及轻链可变区与来自识别效应细胞抗原的抗体的重链及轻链可变区介由可制作成单一的蛋白质链的合成接头(linker)进行组合而得到的二价抗体即可，没有特别限制，具体而言，可合适地列举包含序列号32或37所示的氨基酸序列的单链抗体。另外，作为本发明的Fab-scFv，只要是下述Fab-scFv即可，没有特别限制，所述Fab-scFv为：将包含来自本发明的抗B7-H4的重链及轻链可变区的Fab与包含来自识别效应细胞抗原的抗体的重链及轻链可变区的scFv组合而得到的Fab-scFv；或者相反地，将包含来自本发明的抗B7-H4的重链及轻链可变区的scFv与包含来自识别效应细胞抗原的抗体的重链及轻链可变区的Fab组合而得到的Fab-scFv，具体而言，可合适地列举由包含序列号39所示的氨基酸序列的长链和包含序列号41所示的氨基酸序列的短链形成的Fab-scFv。
另外，本发明涉及编码上述本发明的双特异性抗体的核酸。作为上述“编码本发明的双特异性抗体的核酸”，只要包含下述(A)～(G)中的任一个序列即可，没有特别限制，所述(A)～(G)为：(A)序列号1所示的核酸序列；(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列，可特别合适地列举含有序列号31或36所示的核酸序列的“编码本发明的双特异性抗体的核酸”、或者含有包含序列号38所示的核酸序列的核酸和包含序列号40所示的核酸序列的核酸的“编码本发明的双特异性抗体的核酸”。含有上述“编码本发明的双特异性抗体的核酸”的载体及导入该载体所得到的转化体可通过上述方法来适当地制作。
就上述本发明的双特异性抗体、及使该双特异性抗体与效应细胞结合所制作的双特异性抗体-细胞复合体而言，认为与上述本发明的“抗体连接体”及“连接抗体-细胞复合体”同样地可相对于表达人B7-H4蛋白质的癌细胞发挥iADCC活性，因此，可作为癌症治疗用组合物的成分利用。作为该癌症治疗用组合物，只要为下述癌症治疗用组合物即可，没有特别限制，所述癌症治疗用组合物为：包含本发明的双特异性抗体且通过该双特异性抗体将效应细胞送达至癌细胞的癌症治疗用组合物；包含本发明的双特异性抗体-细胞复合体的癌症治疗用组合物。在此，关于作为治疗对象的“癌”，只要为表达B7-H4蛋白质的癌症即可，可为任何种类的癌症，可特别合适地列举高表达B7-H4蛋白质的卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌等。
以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
实施例1
[人B7-H4抗原蛋白质及其表达细胞的制作]
为了用于单克隆抗体的制作及评价，制作(1)B7-H4可溶性重组蛋白质及(2)B7-H4膜表达型基因导入细胞。
(1)B7-H4可溶性重组蛋白质(游离型抗原)
人B7-H4亚型1蛋白质(NCBI登记号：NP_078902，序列号33)的胞外域由从第25位的亮氨酸(Leu25)到第259位的丝氨酸(Ser259)为止的区域构成。在本研究中，分别地，在编码该胞外域(从Leu25到Ser259为止的区域)的氨基酸序列的核酸序列的N末端相应侧附加编码来自免疫球蛋白的信号肽的核酸序列，在C末端相应侧附加编码六联组氨酸标签的核酸序列及终止密码子，制作核酸片段，将该核酸片段组入至pcDNA3.3表达载体，制作B7-H4可溶性蛋白质表达载体。将该表达载体以基因水平导入至293F细胞(Life Technology公司)并进行培养，回收培养上清液。通过使用了组氨酸标签亲和性柱的常规方法，从所得到的培养上清液对人B7-H4可溶性重组蛋白质进行纯化。
另外，为了作为阴性对照使用，也利用与上述同样的方法对人B7-H1蛋白质(NCBI登记号：AAF25807，序列号34)及人B7-DC蛋白质(NCBI登记号：NP_079515，序列号35)进行与胞外域对应的蛋白质的制作及纯化(应予说明，在人B7-H1中，第19位的苯丙氨酸～第238位的精氨酸的区域为胞外域，在人B7-DC中，第20位的亮氨酸～第220位的苏氨酸的区域为胞外域)。
以下，有时将在此制作的包含人B7-H4、人B7-H1及人B7-DC蛋白质的胞外域区域的重组蛋白质分别称作“游离型B7-H4”、“游离型B7-H1”及“游离型B7-DC”。
(2)B7-H4膜表达型基因导入细胞
将编码人B7-H4亚型1蛋白质的全长(Met1到Lys282；序列号33)的核酸序列组入至pcDNA3.3表达载体，制作B7-H4全长蛋白质表达载体。将该表达载体以基因水平导入至293F细胞，并培养48小时，制作在细胞膜上一过性地表达人B7-H4的人B7-H4膜表达型基因导入细胞(以下，有时将该细胞称作“B7-H4表达293F细胞”)。另外，将未插入B7-H4基因的pcDNA3.3载体导入293F细胞，并培养48小时，制作不表达人B7-H4的“对照293F细胞”。
实施例2
[杂交瘤的制作]
将实施例1中制作的游离型B7-H4与弗氏佐剂混合，接种于BALB/cA小鼠的背部，诱导B7-H4特异性抗体产生细胞。使用常规方法使从抗原(B7-H4)敏化后的小鼠采集的脾脏细胞与骨髓瘤细胞株P3X63ag8.653(从ATCC(美国模式培养物集存库获得)融合，制作杂交瘤并分离。
实施例3
[抗B7-H4抗体产生杂交瘤的筛选]
利用ELISA法调查了通过实施例2所得到的多个杂交瘤株的抗体产生能力。
具体而言，在96孔IMMOBILIZER氨基酶标板(Thermo Fisher Scientific公司)中添加游离型B7-H4，于室温孵育2小时，将游离型B7-H4固定于板表面。同时，设置未将游离型B7-H4固定的孔作为阴性对照。孵育后，除去未固定的抗原，用包含3％的BSA的PBS装满孔，于4℃孵育一晚。通过该工序阻断板表面的非特异性结合能力，制作ELISA用板。
将通过实施例2所得到的多个杂交瘤株的培养上清液分别用包含0.05％的Tween20的PBS稀释成2倍，制备上清液样品。从上述ELISA用板的孔中去除缓冲液后，添加上清液样品，于室温孵育两小时。将板清洗并去除未结合的抗体后，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(GE Healthcare公司)，进行1小时孵育。将孔清洗后，添加过氧化物酶底物(BD BioScience公司)孵育30分钟，进而添加0.1M以上浓度的硫酸溶液使显色反应停止。通过测定各孔内的溶液于450nm波长的吸收，从而调查了上清液样品中是否包含识别B7-H4的抗体。
上述ELISA法的结果如表1所示。在本研究中，作为判断上清液样品中包含抗B7-H4抗体的指标，设定了如下这样的条件：B7-H4固定化孔中的吸光度为1.0以上，且阴性对照孔中的吸光度为0.1以下。实验结果如表1所示。由于来自杂交瘤克隆体#18、#21、#25、#51、#77、#79、#113、#121、#140、#160、#167及#209的上清液样品满足上述条件，因此判断为包含抗B7-H4抗体。即，由以上的结果表明得到了12株具有抗B7-H4抗体产生能力的杂交瘤(表1)。将这些杂交瘤克隆体继续进行二次分离，用同样的方法(ELISA法)再次确认抗体产生能力后，于-150℃环境下保存。
应予说明，本申请的发明人将从杂交瘤克隆体#18、#21、#25、#51、#77、#79、#113、#121、#140、#160、#167及#209产生的抗B7-H4单克隆抗体分别命名为H4.018、H4.021、H4.025、H4.051、H4.077、H4.079、H4.113、H4.121、H4.140、H4.160、H4.167、H4.209。另外，以下有时将这些抗体称作“本发明的抗B7-H4抗体”。
[表1]
实施例4
[对抗体的结合能力的一次筛选]
针对上述本发明的抗B7-H4抗体中可纯化足够量的8种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209)，通过夹心ELISA法研究特异性及结合能力。
具体而言，将H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209分别用PBS稀释成5μg/ml的浓度，添加于96孔IMMOBILIZER氨基酶标板(Thermo FisherScientific公司)的孔，并于室温孵育1小时来固定。去除未固定的抗体后，通过用包含3％BSA的PBS装满孔并于室温孵育2小时来阻断板表面的非特异性结合能力，制作夹心ELISA用板。
接着，将实施例1中制作的游离型抗原蛋白质(游离型B7-H4、游离型B7-H1或游离型B7-DC)用包含0.05％Tween20的PBS稀释，制作以0.01～10μg/ml的浓度包含各抗原蛋白质的稀释溶液。从夹心ELISA用板去除缓冲液后，将各抗原蛋白质的稀释溶液添加至孔中，于室温孵育1小时。去除未结合的抗原后，在全部的孔中添加生物素化的H4.025(2μg/ml)，于室温孵育30分钟。去除未结合的生物素化H4.025后，将稀释的链霉亲和素结合HRP(Thermo Fisher Scientific公司)添加到孔中，使其与生物素化抗体结合。将孔清洗后，将过氧化物酶底物(BD Bioscience)添加到孔中并孵育30分钟，添加0.1M以上的硫酸用液使显色反应停止后，测定450nm波长的吸收。
上述夹心ELISA法的结果如图1及2所示。调查了本发明的抗体与B7-H4、B7-H1及B7-DC的结合能力，结果表明实验中使用的8种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209)均与B7-H4特异性结合，而不与B7-H1或B7-DC结合(图1)。另外，调查了本发明的抗体与不同浓度的B7-H4的结合能力，结果表明实验中使用的6种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.140及H4.209)的结合均B7-H4浓度依赖性地增加(图2)。
实施例5
[对抗体的结合能力的二次筛选]
实施例4表明，本发明的抗B7-H4抗体可特异性识别游离型B7-H4。因此，在下面的实验中，通过免疫染色来调查本发明的抗B7-H4抗体与在细胞表面上表达的B7-H4的结合能力。
具体而言，将本发明的抗B7-H4抗体中的9种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.121、H4.140、H4.160及H4.209)分别制备成8μg/ml的浓度，制作一次抗体溶液，与实施例1中制作的“B7-H4表达293F细胞”或“对照293F细胞”混合。另外，作为阳性对照，同样地将市售的抗B7-H4抗体(H74克隆体，LifeSpan BioSciences,Inc.)与“B7-H4表达293F细胞”或“对照293F细胞”混合。于4℃孵育30分钟后，添加R-藻红蛋白(PE)标记多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗体(4μg/ml)，进一步于4℃孵育30分钟，使用流式细胞仪FACSTMCanto(BD Biosciences)测定各细胞的染色强度。
如图3的结果所示，明确了B7-H4表达293F细胞通过H4.018、H4.025、H4.113、H4.121及H4.209而被染色。尤其是明确了使用H4.018及H4.025时可得到强信号。
实施例6
[抗体与癌细胞的结合能力]
接着，调查了本发明的抗B7-H4抗体是否具有与表达B7-H4的癌细胞结合的能力。
使用市售的抗B7-H4抗体(H74克隆体)确认了B7-H4在多个癌细胞株中的表达(应予说明，该实验中使用的癌细胞株全部从美国模式培养物集存库(ATCC)或日本国立生物医学创新·健康·营养研究所JCRB细胞库购入)。具体而言，使用包含10％FBS的RPMI1640培养液将MDA-MB-468细胞(乳腺癌细胞株)、NCI-H2170细胞(肺扁平上皮癌细胞株)、CAL27细胞(头颈癌细胞株)、MKN74细胞(胃癌细胞株)及COLO201细胞(大肠癌细胞株)培养36小时以上后，添加市售的藻红蛋白(PE)标记抗B7-H4抗体(H74克隆体，eBioscience Inc.)，于4℃孵育30分钟。细胞的染色强度使用流式细胞仪FACSCantoTM(BD Biosciences)进行测定。
如图4的结果所示，MDA-MB-468细胞被抗B7-H4抗体(H74克隆体)染色，但在NCI-H2170细胞、CAL27细胞、MKN74细胞、及COLO201细胞中未观察到基于抗B7-H4抗体(H74克隆体)的染色。以上结果表明，MDA-MB-468细胞可在细胞表面上表达B7-H4。另外，该结果也与定量PCR的结果一致。
接着，调查了MDA-MB-468细胞与本发明的抗B7-H4抗体的结合。具体而言，将本发明的抗B7-H4抗体中的4种抗体(H4.018、H4.025、H4.113、H4.209)以10μg/ml的浓度添加在MDA-MB-468细胞中，在以下i)～iv)的条件下孵育。
i)于4℃，在添加了0.1％叠氮化钠的条件下孵育30分钟；
ii)于室温，在添加了0.1％叠氮化钠的条件下孵育30分钟；
iii)于室温，在未添加叠氮化钠的条件下孵育30分钟；
iv)于37度，在5％CO2培养条件下孵育18小时。
孵育后，以4μg/ml的浓度添加作为二次抗体的PE标记多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗体，于4℃孵育30分钟，使用流式细胞仪FACSTMCanto(BD Biosciences)测定细胞的染色强度。
结果如图5所示。使用H4.113及H4.209时，在上述i)～iv)中的任意孵育条件下均无法得到染色信号。另一方面，使用H4.018及H4.025时，在上述i)及ii)的孵育条件下观察到染色信号，而在上述iii)及iv)的孵育条下基本上未观察到染色信号。以上的结果表明，本发明的抗B7-H4抗体(H4.018及H4.025)虽然可与在癌细胞的膜表面上表达的B7-H4结合，但该结合并不稳定。尤其是在接近生物体内的条件即孵育条件iv)下，在H4.018及H4.025中的任意抗体中均未观察到结合。
以上实施例3～6的结果表明，在本发明的抗B7-H4抗体中，特别地，H4.025相对于游离型B7-H4具有优异的结合能力，而相对于在癌细胞的膜表面上表达的B7-H4可能难以维持稳定的结合。根据以上结果，认为本发明的抗B7-H4抗体可能单独并不具有充分的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC；Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity)。
实施例7
[抗B7-H4抗体与效应细胞的复合体的制作]
因此，本申请的发明人认为通过使本发明的抗B7-H4抗体与效应细胞预先结合从而有可能能够诱导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)，并制作了缠结有抗B7-H4抗体的效应细胞(以下，有时将该细胞称作“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”)。
具体而言，使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare UK Ltd)，按照常规方法从人外周血对单核细胞组分进行比重分离。接着，进行使用了抗CD14微珠及抗CD19微珠(Miltenyi Biotec K.K.)的负选择，从上述单核细胞组分将T细胞浓缩，制备效应细胞。应予说明，上述负选择按照使用的微珠所附的说明书中记载的方法进行。
使所得到的效应细胞与高浓度(0.2mg/ml)的抗CD3抗体(OKT3克隆体；由ATCC购入)在冰水中反应10分钟后，清洗未结合的抗体，进一步加入0.5mg/ml的兔抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗体(DakoCytomation)并在冰水中反应10分钟。反应后清洗未结合的抗体，添加0.5mg/ml的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113或H4.209)，在冰水中反应10分钟。最后，通过清洗未结合的抗体，从而制作缠结有抗B7-H4抗体的效应细胞。即，如图6(a)所示，在此制作的“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”为介由抗CD3抗体及抗小鼠IgG抗体使效应细胞与抗B7-H4抗体间接结合而得到的细胞。
应予说明，以下有时将使用H4.018、H4.025、H4.113或H4.209制作的“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”分别称作“H4.018-效应细胞复合体”、“H4.025-效应细胞复合体”、“H4.113-效应细胞复合体”、“H4.209-效应细胞复合体”。
实施例8
[细胞毒性测定]
调查了通过实施例7制作的“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”的间接性抗体依赖性细胞毒活性(indirect ADCC：iADCC)。
具体而言，使用DELFIA EuTDA非放射性细胞毒性检测试剂盒(Perkin Elmer公司制，制造型号AD0116)，将MDA-MB-468细胞(表达B7-H4的癌细胞)用荧光螯合剂(TDA)标记(以下，有时将该细胞记载为“TDA标记癌细胞”)。在TDA标记癌细胞的细胞内存在的TDA因细胞裂解而被释放到上清液中。使该上清液中与铕(Eu)溶液反应时，可形成显示强荧光的稳定螯合物(EuTDA)，因此，可通过测定荧光强度来评价细胞毒性的程度。
在4℃条件下，将TDA标记癌细胞接种于96孔U底板(10000个细胞/孔)，进一步添加实施例7中制作的抗B7-H4抗体-效应细胞复合体并进行混合。将板于4℃以200G离心1分钟从而使细胞沉淀，其后，在37℃、5％CO2的环境下反应3小时。回收反应后的上清液，使用读板器(Wallac 1420ARVOsx多标签计数器；Perkin Elmer公司制)测定荧光强度。应予说明，测定按照读板器所附的说明书通过常规方法进行。由所得到的信号算出TDA标记癌细胞的损伤程度(发生裂解的细胞的比例)。
结果如图6(b)所示。明确了就用于测定的抗B7-H4抗体-效应细胞复合体中的H4.025-效应细胞复合体而言，随着其相对于靶细胞(TDA标记癌细胞)而言的比例增加，上清液中的荧光发光显著增加。另一方面，就H4.018-效应细胞复合体、H4.113-效应细胞复合体及H4.209-效应细胞复合体而言，即使其相对于靶细胞而言的比例增加，也未观察到荧光发光的显著增加。以上结果表明，至少H4.025-效应细胞复合体相对于靶标癌细胞具有细胞毒活性。
实施例9
[抗体的氨基酸序列及核酸序列]
针对本发明的抗B7-H4抗体中的、根据实施例3～5的结果观察到了优异亲和性及特异性的7种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140、H4.209)，解析了重链可变区及轻链可变区的核酸序列以及氨基酸序列。
(1)H4.018
H4.018的重链可变区的核酸序列(序列号1)及氨基酸序列(序列号2)如图7所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(2)H4.025
H4.025的重链可变区的核酸序列(序列号3)及氨基酸序列(序列号4)如图8所示。另外，就H4.025的轻链而言，存在κ链和λ链这2种。H4.025的轻链可变区(κ链)的核酸序列(序列号5)及氨基酸序列(序列号6)如图9所示，H4.025的轻链可变区(λ链)的核酸序列(序列号7)及氨基酸序列(序列号8)如图10所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(3)H4.051
H4.051的重链可变区的核酸序列(序列号9)及氨基酸序列(序列号10)如图11所示。另外，H4.051的轻链可变区的核酸序列(序列号11)及氨基酸序列(序列号12)如图12所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(4)H4.113
H4.113的重链可变区的核酸序列(序列号13)及氨基酸序列(序列号14)如图13所示。另外，就H4.113的轻链而言，存在κ链及λ链这2种。H4.113的轻链可变区(κ链)的核酸序列(序列号15)及氨基酸序列(序列号16)如图14所示，H4.113的轻链可变区(λ链)的核酸序列(序列号17)及氨基酸序列(序列号18)如图15所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(5)H4.121
H4.121的重链可变区的核酸序列(序列号19)及氨基酸序列(序列号20)如图16所示。另外，H4.121的轻链可变区的核酸序列(序列号21)及氨基酸序列(序列号22)如图17所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(6)H4.140
H4.140的重链可变区的核酸序列(序列号23)及氨基酸序列(序列号24)如图18所示。另外，H4.140的轻链可变区的核酸序列(序列号25)及氨基酸序列(序列号26)如图19所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
(7)H4.209
H4.209的重链可变区的核酸序列(序列号27)及氨基酸序列(序列号28)如图20所示。另外，H4.209的轻链可变区的核酸序列(序列号29)及氨基酸序列(序列号30)如图21所示。应予说明，图中的阴影部分表示CDR3区域。
实施例10
[双特异性抗体的制作]
基于本发明的抗B7-H4抗体的氨基酸序列信息，可制作与B7-H4抗原和T细胞的CD3抗原这两者结合的双特异性抗体(BsAb)(以下，有时将该抗体称作“本发明的BsAb”)。
就本发明的BsAb而言，例如可通过将本发明的抗B7-H4抗体的轻链可变区的氨基酸序列、本发明的抗B7-H4抗体的重链可变区的氨基酸序列、抗CD3抗体的轻链可变区的氨基酸序列及抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列分别隔着接头或使它们直接连接来制作。图22中示出使用了H4.025的轻链λ链可变区及H4.025的重链可变区的BsAb结构。另外，该BsAb的核酸序列(序列号31)及氨基酸序列(序列号32)如图23-1～图23-3所示。关于本申请的发明人制作的2种本发明的BsAb，在以下的实施例12及13中详细叙述。
实施例11
[基于BsAb-效应细胞复合体的细胞毒性测定]
使本发明的BsAb与效应细胞结合，制作BsAb-效应细胞复合体。具体而言，利用与实施例7同样的方法制备效应细胞，使本发明的BsAb在4℃或室温或37℃的环境下结合，从而形成BsAb-效应细胞复合体。进而，使用BsAb-效应细胞复合体尝试ADCC的诱导。
实施例12
[BsAb的制作：scFv-scFv]
本申请的发明人制作了使包含本发明的抗B7-H4抗体的氨基酸序列的单链抗体与包含抗CD3抗体的氨基酸序列的单链抗体连接而成的BsAb(single chain fragmentvariable-single chain fragment variable(单链抗体-单链抗体)抗体；scFv-scFv)(以下，有时将该抗体称作“本发明的scFv-scFv”)。
具体而言，就本发明的scFv-scFv而言，通过将本发明的抗B7-H4抗体的轻链可变区的氨基酸序列、本发明的抗B7-H4抗体的重链可变区的氨基酸序列、抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列及抗CD3抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别隔着接头而连接来制作。图24中示出使用了H4.025的轻链可变区及H4.025的重链可变区的本发明的scFv-scFv的结构。另外，该scFv-scFv的核酸序列(序列号36)及氨基酸序列(序列号37)如图25所示。应予说明，序列号36包含编码H4.025的轻链及重链可变区的碱基序列，但预想该碱基序列使用大肠杆菌表达系统而进行密码子优化，因此与序列号3、5及7不同。在序列号36及37中，对应于H4.025的轻链及重链可变区的区域如下所述(表2)。
＜轻链可变区＞
序列号36的第76位(a)到第378位(t)为止的区域对应于序列号5的第10位(a)到第312位(t)为止的区域。
序列号37的第26位(Met)到第126位(Gly)为止的区域对应于序列号6的第4位(Met)到第104位(Gly)为止的区域。
＜重链可变区＞
序列号36的第448位(g)到第780位(t)为止的区域对应于序列号3的全长。
序列号37的第150位(Glu)到第260位(Gly)为止的区域对应于序列号4的全长。
[表2]
实施例13
[BsAb的制作：Fab-scFv]
此外，本申请的发明人制作了使包含本发明的抗B7-H4抗体的氨基酸序列的Fab抗体与包含抗CD3抗体的氨基酸序列的单链抗体组合而成的BsAb(fraction antigenbinding-single chain fragment variable(抗原结合片段-单链抗体)；Fab-scFv)(以下，有时将该抗体称作“本发明的Fab-scFv”)。
具体而言，就本发明的Fab-scFv而言，通过使包含本发明的抗B7-H4抗体的轻链可变区的氨基酸序列及人免疫球蛋白的恒定区(CL)的氨基酸序列的短链、与包含抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列、人免疫球蛋白的恒定区(CH1)的氨基酸序列、抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列及抗CD3抗体的轻链可变区的氨基酸序列的长链借助二硫键进行结合来制作。图26中示出使用了H4.025的轻链可变区及H4.025的重链可变区的Fab-scFv的结构。另外，图27～28中示出该Fab-scFv的长链的核酸序列及氨基酸序列(分别为序列号38及39)、和短链的核酸序列及氨基酸序列(分别为序列号40及41)。应予说明，序列号38及40包含编码H4.025的轻链及重链可变区的碱基序列，但预想该碱基序列使用大肠杆菌表达系统而进行密码子优化，因此与序列号3、5及7不同。在序列号38～41中，对应于H4.025的轻链及重链可变区的区域如下所述(表3)。
＜轻链可变区＞
序列号40的第76位(a)到第378位(t)为止的区域对应于序列号5的第10位(a)到第312位(t)为止的区域。
序列号41的第26位(Met)到第126位(Gly)为止的区域对应于序列号6的第4位(Met)到第104位(Gly)为止的区域。
＜重链可变区＞
序列号38的第64位(c)到第390位(t)为止的区域对应于序列号3的第7位(c)到第333位(t)为止的区域。
序列号39的第22位(Gln)到第130位(Gly)为止的区域对应于序列号4的第3位(Gln)到第111位(Gly)为止的区域。
[表3]
实施例14
[双特异性抗体与癌细胞的结合能力]
接着，利用与实施例6同样的方法来调查本发明的Fab-scFv是否具有与表达B7-H4的癌细胞结合的能力。
具体而言，使用包含10％FBS的RPMI1640培养液将4种乳腺癌细胞株(MDA-MB-468细胞、MDA-MB-231细胞、SKBR3细胞、ZR75细胞)培养36小时以上。接着，将用荧光色素Cy5.5标记的本发明的Fab-scFv、或未标记抗B7-H4抗体(H4.025)添加于上述培养细胞中，于4℃孵育30分钟。就添加了抗B7-H4抗体(H4.025)的细胞而言，在孵育后清洗，并添加抗R-藻红蛋白(PE)标记多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗体(4μg/ml)，进一步于4℃孵育30分钟。细胞的染色强度使用流式细胞仪FACSCantoTM(BD Biosciences)测定。如图29所示，MDA-MB-468细胞及ZR75细胞被抗B7-H4抗体(H4.025)及本发明的Fab-scFv染色，但MDA-MB-231细胞及SKBR3细胞未被任何抗体染色。以上结果表明，MDA-MB-468细胞及ZR75细胞表达了B7-H4，但MDA-MB-231细胞未表达B7-H4。
实施例15
[基于本发明的BsAb的细胞毒性测定]
调查了本发明的BsAb(本发明的scFv-scFv及Fab-scFv)相对于癌细胞株而言的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)。
具体而言，在通过实施例7中记载的方法制备的人外周血单核细胞组分中添加癌细胞(MDA-MB-468细胞)和本发明的BsAb，在37℃、5％CO2的环境下反应16小时。回收培养上清液，使用TAKARA LDH细胞毒性检测试剂盒(Takara Bio株式会社)测定死细胞数，算出对癌细胞的损伤能力(裂解％)及半数有效浓度(EC50)。如图30所示，就相对于MDA-MB-468细胞的半数有效浓度(EC50)而言，在本发明的scFv-scFv中为68ng/ml，在本发明的Fab-scFv中为13ng/ml。另外，如图31所示，对于ZR-75细胞(B7-H4表达阳性；参见图29)，观察到了本发明的BsAb依赖性的细胞毒性，但对于MDA-MB-231细胞(B7-H4表达阴性；参见图29)、SKBR3细胞(B7-H4表达阴性；参见图29)及NCI-H2170细胞(肺扁平上皮癌细胞)，未观察到本发明的BsAb依赖性的细胞毒活性。
实施例16
[本发明的Fab-scFv对患癌小鼠带来的影响]
接着，研究了本发明的Fab-scFv是否能够对移植于小鼠的人肿瘤显示抗肿瘤效果。
具体而言，将人外周血单核细胞移植于MHC敲除NOG小鼠(NOD/Shi-scid，IL-2RγKO，IaβKO，β2mKO，实验动物中央研究所)，次日，移植乳腺癌细胞株(MDA-MB-468细胞株)或肺癌细胞株(NCI-H2170细胞株)。在从癌细胞株的移植起第2周以后，对每1只小鼠以0.2μg～200μg的范围施予本发明的Fab-scFv。具体而言，对于用于肿瘤尺寸的确认实验的小鼠(图32)，每1次按照5μg/20g体重施予本发明的Fab-scFv，对于用于染色实验的小鼠(图33及34)，以3～4天的间隔分4次以逐次加量的方式施予0.2μg、2μg、20μg及200μg的本发明的Fab-scFv。
如图32所示，明确了通过MDA-MB-468细胞的移植所形成的肿瘤尺寸因本发明的Fab-scFv的施予而缩小。另一方面，通过NCI-H2170细胞的移植所形成的肿瘤尺寸并不受本发明的Fab-scFv施予的影响。另外，如图33所示，进行肿瘤组织切片的苏木精伊红染色的结果表明，在施予了本发明的Fab-scFv的患癌小鼠中，肿瘤内的癌细胞消亡。此外，如图34所示，肿瘤组织切片的免疫组织染色的结果为，在施予了本发明的Fab-scFv的患癌小鼠中，可确认CD8阳性杀伤性T细胞在肿瘤内的浸润，同时还可确认B7-H4阳性癌细胞的消亡。
实施例17
[本发明的Fab-scFv在患癌小鼠中的分布]
确认了施予至小鼠的本发明的Fab-scFv是否在小鼠异种移植肿瘤中积聚。
具体而言，向MHC敲除NOG小鼠(实验动物中央研究所)移植癌细胞株(MDA-MB-468)，在第2周以后，对每1只小鼠以0.5微克至200微克的范围施予用荧光色素Cy5.5标记的本发明的Fab-scFv。如图35所示，可确认本发明的Fab-scFv在施予后第28天为止的期间在移植肿瘤组织中积聚。

Claims (33)

1.抗体，其识别人B7-H4蛋白质的胞外域，并包含以下(a)～(g)中的任一个区域，
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.核酸，其编码识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体，并包含以下(A’)～(G’)中的任一个核酸序列，
(A’)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的核酸序列；
(B’)编码包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；
(C’)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；
(D’)编码包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；
(E’)编码包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；
(F’)编码包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；
(G’)编码包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸，其包含以下(A)～(G)中的任一个核酸序列，
(A)序列号1所示的核酸序列；
(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；
(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；
(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；
(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；
(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；
(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列。
4.载体，其含有权利要求2或3所述的核酸。
5.转化体，其是将权利要求4所述的载体导入宿主细胞而得到的。
6.如权利要求1所述的抗体，其为单克隆抗体。
7.杂交瘤，其产生权利要求6所述的抗体。
8.癌细胞检测用试剂盒，其具备权利要求1或6所述的抗体。
9.抗体连接体，其是由权利要求1或6所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的。
10.如权利要求9所述的抗体连接体，其中，第二抗体为识别CD3抗原的抗体。
11.癌症治疗用组合物，其包含权利要求9或10所述的抗体连接体，通过所述抗体连接体将效应细胞送达至癌细胞。
12.连接抗体-细胞复合体，其是效应细胞结合于抗体连接体而成的，所述抗体连接体是由权利要求1或6所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的。
13.如权利要求12所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体和第二抗体介由识别所述第一抗体及所述第二抗体这两方的第三抗体结合。
14.如权利要求12或13所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体及第二抗体为来自相同动物种类的IgG抗体，且第三抗体为识别所述动物种类的IgG抗体的抗体。
15.如权利要求12～14中任一项所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体及第二抗体为来自小鼠的IgG抗体，且第三抗体为识别来自小鼠的IgG抗体的抗体。
16.如权利要求12～15中任一项所述的连接抗体-细胞复合体，其中，效应细胞为从作为治疗对象的癌症患者采集的效应细胞。
17.癌症治疗用组合物，其含有权利要求12～16中任一项所述的连接抗体-细胞复合体作为有效成分。
18.双特异性抗体，其包含识别效应细胞抗原的区域、和以下(a)～(g)中的任一个区域，
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区。
19.如权利要求18所述的双特异性抗体，其中，识别效应细胞抗原的区域为识别CD3抗原的抗体的重链可变区及轻链可变区。
20.如权利要求18或19所述的双特异性抗体，其为单链抗体。
21.如权利要求18～20中任一项所述的双特异性抗体，其包含序列号32或37所示的氨基酸序列。
22.如权利要求18或19所述的双特异性抗体，其为Fab-scFv融合体。
23.如权利要求18、19及22中任一项所述的双特异性抗体，其含有包含序列号39所示的氨基酸序列的长链和包含序列号41所示的氨基酸序列的短链。
24.核酸，其编码权利要求18～23中任一项所述的双特异性抗体。
25.如权利要求24所述的核酸，其包含以下(A)～(G)中的任一个序列，
(A)序列号1所示的核酸序列；
(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；
(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；
(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；
(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；
(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；
(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列。
26.如权利要求24或25所述的核酸，其包含序列号31或36所示的核酸序列。
27.如权利要求24或25所述的核酸，其含有包含序列号38所示的核酸序列的核酸、和包含序列号40所示的核酸序列的核酸。
28.载体，其含有权利要求24～27中任一项所述的核酸。
29.转化体，其是将权利要求28所述的载体导入宿主细胞而得到的。
30.癌症治疗用组合物，其包含权利要求18～23中任一项所述的双特异性抗体，通过所述双特异性抗体将效应细胞送达至癌细胞。
31.双特异性抗体-细胞复合体，其是权利要求18～23中任一项所述的双特异性抗体与效应细胞结合而成的。
32.如权利要求31所述的双特异性抗体-细胞复合体，其中，效应细胞为从作为治疗对象的癌症患者采集的效应细胞。
33.癌症治疗用组合物，其含有权利要求31或32所述的双特异性抗体-细胞复合体作为有效成分。
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