CN116323668A - 治疗性抗体及其用途 - Google Patents

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CN116323668A CN202180060839.2A CN202180060839A CN116323668A CN 116323668 A CN116323668 A CN 116323668A CN 202180060839 A CN202180060839 A CN 202180060839A CN 116323668 A CN116323668 A CN 116323668A
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Abstract

本发明涉及与B7‑H4(B7同源性4，由基因VTCN1编码)特异性结合的抗体及与B7‑H4及CD3(分化簇3)两者特异性结合的双特异性抗体及其多核苷酸、药物组合物和方法及用途。

Description

治疗性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及与B7-H4(B7同源性4)特异性结合的抗体、包含B7-H4抗体的组合物及其方法及用途。本发明还涉及与B7-H4及CD3(分化簇3)特异性结合的双特异性抗体、包含双特异性B7-H4抗体的组合物及使用双特异性B7-H4抗体治疗与表达B7-H4的细胞相关联的病况(例如癌症或自体免疫疾病)的方法。还提供用于产生及纯化此类双特异性抗体的方法及其在诊断及治疗中的用途。
背景技术
B7-H4(B7同源性4，由基因VTCN1编码)还称为B7x、B7S1或VTCN1，其是I型跨膜蛋白及B7家族蛋白的成员。B7-H4最早在超过十五年以前被识别(Sica GL,etal.Immunity.2003；18:849-861)。自那时起，发现B7-H4过表达于乳腺癌及卵巢癌(SalcedaS,et al.,Exp Cell Res.2005；306:128-141)及许多其他癌细胞上。还发现肿瘤内的B7-H4蛋白表达与较短预期寿命及疾病严重性相关(Podojil,J.R.,Miller,S.D.,ImmunologicalReviews 2017；276:40-51)。虽然B7-H4是B7家族分子，但不与任何已知的B7家族受体即CTLA-4、ICOS、PD-1或CD28结合。识别B7-H4特异性受体的研究显示此类受体是在活化T细胞上表达，且发现B7-H4融合蛋白与其在T细胞上的推定受体的结合显著抑制T细胞增生及细胞因子(IL-2、IFN-γ及IL17)产生。(Podojil,J.R.,Miller,S.D.,Immunological Reviews2017；276:40-51)。
仍需要可特异性靶向且特异性结合乳腺癌细胞、卵巢癌细胞及其他类型癌细胞的分子和/或组合物。需要经改善的治疗疑似罹患癌症的个体的方法。
发明内容
提供与B7-H4特异性结合的抗体及与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体(以下称为“B7-H4xCD3双特异性抗体”)。显示一些在本文中公开的抗体(包括双特异性抗体)具有体内预防和/或治疗癌症的疗效。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含(a)重链可变区(VH)的VH互补决定区(CDR)1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3，所述VH具有选自由SEQID NO:23、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175及SEQ ID NO:176所组成的群组的氨基酸序列；及(B)轻链可变区(VL)的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，所述VL具有选自由SEQID NO:27、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169及SEQ ID NO:170所组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体是那些(a)VH具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列；(b)VH具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列；且VL具有SEQ IDNO:139的氨基酸序列；(c)VH具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(d)VH具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(e)VH具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列；(f)VH具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列；(g)VH具有SEQID NO:156的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列；(h)VH具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(i)VH具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(j)VH具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(k)VH具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列；且VL具有SEQID NO:27的氨基酸序列；(l)VH具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列；(m)VH具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列；(n)VH具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列；(o)VH具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(p)VH具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(q)VH具有SEQ IDNO:174的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(r)VH具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；(s)VH具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列；(t)VH具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列；(u)VH具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列；且VL具有SEQID NO:170的氨基酸序列；或(v)VH具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列；且VL具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含(a)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(c)具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(e)具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(f)具有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(g)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(h)具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；或(i)具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3。
在一实施方案中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体包含(a)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；(b)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH；且具有SEQID NO:139的氨基酸序列的VL；(c)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH；且具有SEQ IDNO:139的氨基酸序列的VL；(d)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(e)具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(f)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH；具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(g)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(h)具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(i)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(j)具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(k)具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(l)具有SEQID NO:23的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；(m)具有SEQ IDNO:171的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(n)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(o)具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(p)具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(q)具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(r)具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(s)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VL；(t)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL；(u)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL；或(v)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH；且具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，抗体进一步包含恒定区。在一些实施方案中，恒定区是IgG1或IgG2同种型。在一些实施方案中，抗体是人IgG2，其包含一或多个选自由A330S、P331S、D265A、C223E、P228E、L368E、C223R、E225R、P228R及K409R所组成的群组的取代，其中编号是根据人IgG2野生型及EU编号方案且如图1所示。在一些实施方案中，抗体包含取代C223E、P228E及L368E。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含重链及轻链，所述重链包含由ATCC保藏编号PTA-126779保藏的多核苷酸的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且所述轻链包含由ATCC保藏编号PTA-126781保藏的多核苷酸的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的各者是根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义。
在一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的第一抗体，其与第二抗体竞争与B7-H4的结合，所述第二抗体包含(a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL；(b)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH及具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的VL；(c)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL；(d)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL；(e)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VL；(f)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL；(g)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(h)具有SEQID NO:64的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL；(i)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；(j)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；(k)具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；(l)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL；(m)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(n)具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH及具有SEQ IDNO:96的氨基酸序列的VL；(o)具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；或(p)具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL；其中第一抗体对人B7-H4的KD为介于约1微摩尔与0.1纳摩尔之间。在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体各包含全长IgG1恒定区。在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体皆为F(ab')2片段抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其中抗体与人B7-H4上的表位结合，所述表位包含选自由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的B7-H4胞外结构域的L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含选自由L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50及L51所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基及选自由E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含下列氨基酸残基或由下列氨基酸残基组成：L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、E64、D66、M68、T99及K101。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其中抗体与人B7-H4的表位结合，所述表位包含选自由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的B7-H4胞外结构域的V129、Y131、N132、S134、S135、E136、L138、V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217所组成的群组的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个或至少十三个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含选自由V129、Y131、N132、S134、S135、E136及L138所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸残基及来自由V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含下列氨基酸残基或由下列氨基酸残基组成：V129、Y131、N132、S134、S135、E136、L138、V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217。
在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的B7-H4抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体。
在另一个方面中，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的B7-H4抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码(i)本发明的B7-H4抗体的重链可变区或(ii)本发明的任一B7-H4抗体的轻链可变区。
在另一个方面中，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码(i)本发明的B7-H4抗体的重链或(ii)本发明的任一B7-H4抗体的轻链。
在另一个方面中，本发明提供一种载体，其包含本发明的任一多核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供一种分离的宿主细胞，其重组产生本发明的抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种产生本发明的B7-H4抗体的方法，其包含在导致抗体产生的条件下培养本发明的宿主细胞及自宿主细胞或培养物分离抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗对象的与表达B7-H4的细胞相关联的病况的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物。在一些实施方案中，病况是癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫的癌症或胆管的癌症。
在另一个方面中，本发明提供一种抑制对象的肿瘤生长或进展的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供一种抑制对象的表达B7-H4的恶性细胞转移的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供一种诱导对象的肿瘤消退的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中第一重链及第一轻链形成第一臂，所述第一臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且第二重链及第二轻链形成第二臂，所述第二臂包含与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中(a)第一重链包含具有SEQID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VLCDR3；(b)第一重链包含具有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(c)第一重链包含具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(d)第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(e)第一重链包含具有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(f)第一重链包含具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；(g)第一重链包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；(h)第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；或(i)第一重链包含具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VLCDR3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；(b)第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(c)第一重链包含具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(d)第一重链包含具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(e)第一重链包含具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(f)第一重链包含具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(g)第一重链包含具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ IDNO:141的氨基酸序列的VL；(h)第一重链包含具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(i)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(j)第一重链包含具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；(k)第一重链包含具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ IDNO:27的氨基酸序列的VL；(l)第一重链包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；(m)第一重链包含具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(n)第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；(o)第一重链包含具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ IDNO:139的氨基酸序列的VL；(p)第一重链包含具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(q)第一重链包含具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(r)第一重链包含具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；(s)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ IDNO:168的氨基酸序列的VL；(t)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL；(u)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL；或(v)第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的VL CDR3；(c)第二重链包含具有SEQ ID NO:203的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VHCDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；(d)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL CDR3；(e)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:109的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；或(f)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL；(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL；(c)第二重链包含具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VL；或(d)第二重链包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第一重链包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；且(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3且第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；且(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3且第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；且(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在双特异性抗体的一些实施方案中，(a)第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH且第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；且(b)第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH且第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，双特异性抗体进一步包含恒定区。在一些实施方案中，恒定区是IgG1。在一些实施方案中，恒定区是人IgG2，其包含一或多个选自由A330S、P331S、D265A、C223E、P228E、L368E、C223R、E225R、P228R及K409R所组成的群组的取代，其中编号是根据人IgG2野生型及EU编号方案且如图1所示。
在双特异性抗体的一些实施方案中，第一臂进一步包含具有取代D265A、C223E、P228E及L368E的hIgG2ΔA恒定区的恒定区，第二臂进一步包含具有取代D265A、C223R、E225R、P228R及K409R的人IgG2ΔA恒定区，其中编号是根据人野生型IgG2及EU编号方案且如图1所示。
在一个方面中，本发明提供与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中第一重链及第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且第二重链及第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中(a)第一重链具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列，且第一轻链具有SEQ ID NO:191的氨基酸序列；且(b)第二重链具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列，且第二轻链具有189的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中第一重链及第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且第二重链及第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中(a)第一重链具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列，且第一轻链具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列；且(b)第二重链具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列，且第二轻链具有189的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4及CD3特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中第一重链及第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且第二重链及第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中(a)第一重链包含由ATCC保藏编号PTA-126779保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且第一轻链包含由ATCC保藏编号PTA-126781保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列；且(b)第二重链包含由ATCC保藏编号PTA-126780保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且第二轻链包含由ATCC保藏编号PTA-126782保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其中抗体与人B7-H4上的表位结合，所述表位包含来自由SEQ ID NO:1的B7-H4氨基酸序列的L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、S63、E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个或至少十三个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含来自由L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50及L51所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基及来自由S63、E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含下列氨基酸残基或由下列氨基酸残基组成：L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、S63、E64、D66、M68、T99及K101。
在另一个方面中，本发明提供一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其中抗体与人B7-H4上的表位结合，所述表位包含来自由SEQ ID NO:1的B7-H4氨基酸序列的V129、Y131、N132、S134、S135、E136、L138、V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217所组成的群组的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个或至少十三个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含来自由V129、Y131、N132、S134、S135、E136及L138所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸残基及来自由V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217所组成的群组的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位包含下列氨基酸残基或由下列氨基酸残基组成：V129、Y131、N132、S134、S135、E136、L138、V189、I191、V212、E214、S215、E216及I217。
在另一个方面中，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明的双特异性抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种多核苷酸，其编码(i)本发明的双特异性抗体的重链或(ii)本发明的双特异性抗体的轻链。
在另一个方面中，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供一种宿主细胞，其包含在本文中公开的多核苷酸或在本文中公开的载体。
在另一个方面中，本发明提供一种在本文中公开的双特异性抗体，其用作药物。在一些实施方案中，药物可用于治疗癌症。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗有需要的对象的癌症的方法，其包含向所述对象施用在本文中公开的双特异性抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含在本文中公开的双特异性抗体。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗对象的与表达B7-H4的恶性细胞相关联的病况的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的在本文中公开的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞，其用作药物。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备药物中的用途。
在一些实施方案中，病况是癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、子宫的癌症、膀胱癌或胆管的癌症。在一些实施方案中，方法或用途可进一步包含施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体或帕博西尼(palbociclib)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是RN888。
在另一个方面中，本发明提供一种抑制对象中的肿瘤生长或进展的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的在本文中公开的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞，其用于抑制具有表达B7-H4的恶性细胞的对象中的肿瘤生长或进展。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于抑制具有表达B7-H4的恶性细胞的对象中的肿瘤生长或进展的药物中的用途。
在一些实施方案中，方法或用途可进一步包含施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体或帕博西尼(palbociclib)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是RN888。
在另一个方面中，本发明提供一种诱导对象中的肿瘤消退的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的在本文中公开的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞，其用于诱导具有表达B7-H4的恶性细胞的对象中的肿瘤消退。
在另一个方面中，本发明提供在本文中公开的B7-H4抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于诱导具有表达B7-H4的恶性细胞的对象中的肿瘤消退的药物中的用途。
在一些实施方案中，方法或用途可进一步包含施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体或帕博西尼(palbociclib)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是RN888。
在一些实施方案中，本发明的抗体或双特异性抗体显示在增加的B7-H4受体密度水平存在下较低的EC50值。优选地，EC50值是介于0.0001nM与100nM之间、介于0.0001nM与10nM、0.0001nM与1nm、0.0001nM与0.1nm之间、介于0.0001nM与0.0010nM之间、介于0.001nM与100nM、0.01nM与100nM、0.1nM与100nM之间、介于0.001nM与10nM之间、介于0.001nM与1nM之间、介于0.01nM与1nM之间或介于0.001nM与0.1nM之间。优选地，EC50值是小于10nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM、小于0.01nM或小于0.001nm。
在一些实施方案中，本发明的抗体或双特异性抗体能够活化溶细胞性T细胞反应。
附图简述
图1描绘本文提供的双特异性抗体的示例性IgG2恒定区的氨基酸序列，所述恒定区的根据人IgG2野生型序列且使用EU编号方案编号的不同位置具有修饰。人IgG1及IgG4野生型序列及编号也提供于图1。
图2A描绘B7-H4抗体0052 scFv及人B7-H4胞外结构域的共晶体结构。
图2B描绘B7-H4抗体0058 Fab及人B7-H4胞外结构域的共晶体结构。
图2C描绘B7-H4抗体1114 Fab及人B7-H4胞外结构域的共晶体结构。
发明详述
本发明公开与B7-H4特异性结合的抗体包括与B7-H4及CD3特异性结合的双特异性抗体(“B7-H4xCD3双特异性抗体”)、制备此类抗体的方法及使用此类抗体以包括抑制肿瘤进展及治疗和/或预防癌症的方法。
通用技术
除非另外说明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。这些技术在文献中充分解释，诸如Molecμlar Cloning:A Laboratory Manual,秒ond edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecμlar Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Cμlture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Cμlture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Cμlture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecμlar Biology(F.M.Ausubelet al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mμllis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；ShortProtocols in Molecμlar Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janewayand P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:alaboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995)。
定义
“抗体”是免疫球蛋白分子，其可经由位于所述免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位置特异性地与靶标诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等结合。此处所使用的术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体(ScFv)、结构域抗体(包括例如鲨鱼及骆驼抗体)、包含抗体的融合蛋白(包括例如但不限于嵌合抗原受体(CAR)或抗体-细胞因子融合蛋白)及任何其他包含抗原识别位置的免疫球蛋白分子的经修饰的构型。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚型)，且抗体不需要是任何特定类型。根据免疫球蛋白的重链的恒定区的抗体氨基酸序列，其可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些类型可进一步分成亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同免疫球蛋白类型的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构及三维构型是众所周知的。
“分离的抗体”是指实质上不含其他蛋白及细胞性材料的抗体。
如本文中所使用的抗体的术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的一或多个保留与给定抗原(例如B7-H4或CD3)特异性结合的能力的片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段实现。抗体的术语“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、单一结构域抗体(dAb)片段(Ward et aI.,Nature 341:544-546,1989)及分离的互补决定区(CDR)。
与靶标(例如B7-H4蛋白或CD3蛋白)“优先结合”或“特异性结合”(在此处可互换使用)的抗体、抗体缀合物或多肽是本领域所熟知的术语，测定这些特异性或优先结合的方法也是本领域所熟知的。若分子与特定细胞或物质反应或缔合相较于其与替代性细胞或物质更频繁、更快速、更长持续时间和/或更高亲和力，则所述分子被称为展现“特异性结合”或“优先结合”。若抗体与靶标的结合相较于其结合其他物质的亲和力更高、亲合力(avidity)更高、更快速和/或持续时间更长，则所述抗体与所述靶标“特异性结合”或“优先结合”。举例来说，与B7-H4表位或CD3表位特异性或优先结合的抗体是相较于其结合其他B7-H4表位、非B7-H4表位、CD3表位或非CD3表位以更高亲和力、亲合力、更快速和/或更长持续时间与此表位结合的抗体。通过阅读此定义还可了解，举例来说，与第一靶标特异性或优先结合的抗体(或部分或表位)可能与第二靶标或不与第二靶标特异性或优先结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然可包括)排他性结合。一般来说(但不必然)，所谓的结合是指优先结合。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(单独或组合)。如本领域已知，重链及轻链的可变区各由四个框架区(FR)及连接所述四个框架区的三个互补决定区(CDR)组成，CDR还称为超变异区。各链中的CDR通过FR被拉近，且与另一链的CDR形成抗体的抗原结合部位。有至少两种用于判定CDR的技术：(1)基于跨种序列变异性的方法(即Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基于抗原-抗体复合体的结晶学研究的方法(Al-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273:927-948)。本文所使用的CDR可以指以任一方法或两种方法的组合所定义的CDR。
可变结构域的“CDR”是在可变区内根据Kabat、Chothia、Kabat及Chothia两者的累积、AbM、接触定义和/或构象定义或本领域广为周知的任何CDR测定方法识别的氨基酸残基。抗体CDR可被识别为最初由Kabat et al.所定义的超变异区。见例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,NIH,Washington D.C.。CDR的位置还可识别为最初由Chothia及其他人所描述的结构性圈环结构。见例如Chothia et al.,Nature 342:877-883,1989。其他CDR识别方法包括“AbM定义”，其是Kabat及Chothia的折衷且是使用Oxford Molecμlar的AbM抗体建模软件(现为
Figure SMS_1
)衍生，或如MacCallum et aI.,J.Mol.BioI.262:732-745,1996所示的基于抗原接触观察的CDR的“接触定义”。在此处称为CDR的“构象定义”的另一方法中，CDR的位置可能被识别为对抗原结合造成焓贡献的残基。见例如Makabe et al.,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166,2008。其他CDR边界定义可能仍不严格遵守上述方法中的一者，但将与至少部分的Kabat CDR重迭，不过鉴于特定残基或残基群或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验结果，可将它们缩短或延长。如本文中所使用的CDR可指由本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文所使用的方法可利用根据这些方法中任一者所定义的CDR。以含有超过一个CDR的任何给定实施方案而言，CDR可根据Kabat、Chothia、延伸、AbM、接触和/或构象定义中任一者定义。
如本文中所使用的“单克隆抗体”是指自实质上同源的抗体群体获得的抗体，即除了可少量存在的可能天然存在的突变以外，包含所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体具高度特异性，其以单一抗原部位为靶标。另外，和通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，各单克隆抗体是以抗原上的单一决定簇为靶标。修饰语“单克隆”表示抗体这样的的特征，其自实质上同源的抗体群体获得，以及不应被视为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。举例来说，本发明所使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler and Milstein,Nature 256:495,1975所描述的杂交瘤方法制造，或可通过诸如美国专利第4,816,567号所述的重组DNA方法制造。单克隆抗体还可自使用例如McCaffertyet al.,Nature 348:552-554,1990所述的技术生成的噬菌体库分离。
如本文中所使用的“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其为含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体是其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基经来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的CDR的残基置换而具有所需特异性、亲和力及能力的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基是经对应的非人残基置换。另外，人源化抗体可包含不见于接受者抗体或不见于经导入的CDR或框架序列中但被包括以进一步改善及优化抗体性能的残基。整体而言，人源化抗体将包含实质上所有至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区且所有或实质上所有FR区是人免疫球蛋白共通序列的FR区。人源化抗体还将理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区或恒定结构域。优选为具有如WO 99/58572所述修饰的Fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有一或多个相对于原始抗体经改变的CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，这些CDR还被称为一或多个“衍生自”原始抗体的一或多个CDR的CDR。
如本文中所使用的“人抗体”是指抗体所具有的氨基酸序列对应由人产生的抗体的氨基酸序列和/或其是使用本领域技术人员已知或本文所公开的用在制备人抗体的任何技术所制备的抗体的氨基酸序列。此定义的人抗体包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个此类示例是包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体库，其中所述噬菌体库表达人抗体(Vaughan et al.,Nature Biotechnology,14:309-314,1996；Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162,1998；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581,1991)。人抗体还可通过免疫接种内源性基因座经转基因导入的人免疫球蛋白基因座所代替的动物来制造，例如其内源性免疫球蛋白基因被部分或完全失活的小鼠。此方法是描述于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016号。替代地，人抗体可通过使产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化来制备(此类B淋巴细胞可自个体收集或自cDNA的单细胞克隆收集或可在体外免疫)。见例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95,1991及美国专利第5,750,373号。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列衍生自一物种且恒定区序列衍生自另一物种的抗体，诸如其中可变区序列衍生自小鼠抗体且恒定区序列衍生自人抗体的抗体。
术语“B7-H4”当作为名词使用且单独存在时，是指由基因VTCN1编码的任何形式的B7同源性4蛋白及其保留B7同源性4蛋白的至少部分活性的变体。一个示例性人B7-H4序列是以UniProt识别符Q7Z7D3-1提供。所展示的Q7Z7D3-1序列进一步加工为成熟形式。
术语“B7-H4抗体”是指与B7-H4特异性结合的抗体。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在此处可交换使用以指称任何长度的氨基酸链，优选地相对短(例如10至100个氨基酸)的氨基酸链。所述链可以是线性或分支，其可能包含经修饰的氨基酸和/或可能被非氨基酸中断。该术语还包含经天然或人为干预修饰的氨基酸链；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义还包括例如包含一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及包含本领域已知的其他修饰的多肽。应了解的是所述多肽可以单链或相连的链存在。
“单价抗体”包含每分子(例如IgG或Fab)一个抗原结合部位。在一些情况下，单价抗体可具有超过一个抗原结合部位，但结合部位来自不同抗原。
“单特异性抗体”包含每分子(例如IgG)两个相同抗原结合部位以使两个结合部位与抗原的相同表位结合。因此，它们彼此竞争与一个抗原分子的结合。大多见于自然界的抗体是单特异性的。在一些情况下，单特异性抗体还可以是单价抗体(例如Fab)。
“双价抗体”包含每分子(例如IgG)两个抗原结合部位。在一些情况下，两个结合部位具有相同抗原特异性。然而，双价抗体可以是双特异性的。
如本文中所使用的术语“双特异性抗体(bispecific antibody或dual-specificantibody)”是指具有两种不同结合特异性的杂交抗体，例如两个不同重/轻链对，导致具有不同抗原特异性的两个抗原结合部位。
如本文中所使用，“铰链区”、“铰链序列”及其变异包括本领域中已知的意义，其说明于例如Janeway et al.,ImmunoBiology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(4th ed.,1999)；Bloom et al.,Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys et al.,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202。
如本文中所使用，“免疫球蛋白样铰链区”、“免疫球蛋白样铰链序列”及其变异是指免疫球蛋白样或抗体样分子(例如免疫粘附素)的铰链区及铰链序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白样铰链区可来自或衍生自任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型或来自IgA、IgE、IgD或IgM，包括其嵌合形式，例如嵌合IgG1/2铰链区。
如本文中所使用，术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指在人免疫系统的细胞天然贮库内的可经活化以影响靶细胞的存活性的细胞。靶细胞的存活性可包括细胞存活、增殖和/或与其他细胞相互作用的能力。
如本领域所知的“多核苷酸”或“核酸”在此处可交换使用，其是指任何长度的核苷酸的链，且包括DNA及RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶被纳入链中的物质。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可在所述链组合之前或之后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸在聚合后可经进一步修饰，诸如与标记组分缀合。其它类型的修饰包括例如“加帽(caps)”、以类似物取代一或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如举例来说那些具有不带电键结(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)及带电键结(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、那些含有侧接部分，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、那些具有嵌入剂(intercalator)(例如吖啶、补骨脂素等)、那些含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、那些含有烷化剂、那些具有经修饰的键结(例如α异位性核酸等)以及未经修饰的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖类中的羟基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被标准保护基保护或被活化以制备与额外的核苷酸的额外键结，或可与固体支持体共轭。所述5’及3’端OH可经磷酸化或经胺类或具有1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基还可被衍生成为标准保护基。多核苷酸还可包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟-核糖或2’-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β异位性糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖、非环类似物及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一或多个磷酸二酯键结可经替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸盐被P(O)S(“硫代盐”)、P(S)S(“二硫代盐”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各R或R’是独立地H或经取代或未经取代的烷基(1至20个碳)，所述烷基任选地含有醚(-O-)键结、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中的所有键结不需要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
本领域中已知的抗体的“恒定区”是指单独或经组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
本文所用的“实质上纯的”是指其为至少50％纯的(即不含污染物)，更优选地至少90％纯的，更优选地至少95％纯的，甚至更优选地至少98％纯的，且最优选地至少99％纯的物质。
“宿主细胞”包括可以或已经接受载体以导入多核苷酸插入物的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且所述后代可能因为天然、意外或蓄意突变而不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因学DNA互补性上)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。
如本领域所知，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基至其羧基端的片段。Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定区CH2及CH3。
本领域所使用的“Fc受体”及“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。另外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚型的受体，包括等位基因变体及替代地这些受体的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)及FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列但主要差异在于其细胞质结构域。FcR于Ravetch and Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92,1991；Capel etal.,Immunomethods,4:25-34,1994及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41,1995中回顾。FcR还包括新生儿受体FcRn，其负责转移母体IgG至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587,1976及Kim et al.,J.Immunol.24:249,1994)。
本文中关于抗体所使用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)与表位结合的方式充份类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合，使得第一抗体与其同源表位在第二抗体存在时的结合结果呈可检测地降低，相较于第二抗体不存在时所述第一抗体与其同源表位的结合。或者，所述情况可以是但不一定是第二抗体与其表位的结合还因第一抗体的存在而可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位结合，但第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位结合。然而，当各种抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合时，这些抗体被称为彼此“交叉竞争”与其各自表位的结合。本发明涵盖竞争抗体及交叉竞争抗体。不论竞争或交叉竞争所发生的机制为何(例如空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合)，本领域技术人员将了解根据本文所提供的教导，本发明涵盖竞争和/或交叉竞争抗体且其可用于本文所公开的方法。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。这些效应子功能通常需要所述Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，且可利用本领域已知的各种用于评估这些抗体效应子功能的测定评估。
“天然序列Fc区”包含与见于自然界的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含与天然序列Fc区有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列，但仍保留所述天然序列Fc区的至少一种效应子功能。在一些实施方案中，所述变体Fc区相较于天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸取代，且优选地约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少约80％的序列相同性，最优选地与其具有至少约90％的序列相同性，更优选地与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列相同性。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的生物活性。抗体效应子功能的实施例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、Fc受体结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q结合及下调细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))。见例如美国专利第6,737,056号。这些效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合且可利用本领域已知的各种用于评估这些抗体效应子功能的测定评估。示范性效应子功能检测是经由Fcγ3和/或C1q结合。
如本文中所使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)识别靶细胞上的结合的抗体，以及后续造成靶细胞裂解。感兴趣的分子的ADCC活性可利用体外ADCC测定评估，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号中所述的。可用于此类测定的效应子细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)及NK细胞。替代地或额外地，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在诸如Clynes et al.,1998,PNAS(USA),95:652-656中所公开的动物模型中。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在时裂解靶标。补体活化途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如抗体)结合所起始。为了评估补体活化，可进行例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods,202:163(1996)所述的CDC测定。
本文所使用的“治疗”是指得到有益或所需临床结果的方法。就本发明的目的而言，有益或所需临床结果包括但不限于下列一或多者：减少(或破坏)赘生或癌细胞的增殖、抑制赘生细胞转移、缓解B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)、降低B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)所致的症状、增加罹患B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)的那些的生活质量、降低治疗B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)所需的其他药物的剂量、推迟B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)的进展、治愈B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)和/或延长具有B7-H4相关疾病(例如癌症或自体免疫性疾病)的患者的存活期。
“改善(ameliorating)”是指相较于未施用B7-H4抗体或B7-H4抗体缀合物减轻或改善一或多种症状。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
如本文中所使用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以实现任一或多种有益或所需结果的量。就预防性用途而言，有益或所需结果包括消除或减少风险、减轻严重性或延迟疾病的开始，包括疾病的生化学、组织学和/或行为学的症状、其并发症及在疾病发展期间所呈现的中间病理学表型。就治疗性用途而言，有益或所需结果包括诸如下列临床结果：减少多种B7-H4相关疾病或病况(诸如癌症)的一或多种症状的发生或改善多种B7-H4相关疾病或病况(诸如癌症)的一或多种症状、降低治疗疾病所需的其他药物的剂量、增强其他药物的效应和/或推迟患者的B7-H4相关疾病的进展。有效剂量可分一或多次施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床上所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能与或可能不与另一药物、化合物或药物组合物组合达成。因此，“有效剂量”可在施用一或多种治疗剂的情况中被考虑，且可考虑给予有效量的单一试剂(配合一或多种其他试剂)，若可能或能达成所需的结果。
“个体”(individual)或“对象(subject)”是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长动物、马、犬、猫、小鼠及大鼠。
如本文中所使用，“载体(vector)”是指构建体，其能在宿主细胞中递送及优选地表达一或多种感兴趣的基因或序列。载体的示例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体及某些真核细胞诸如产生细胞。
本文使用的“表达控制序列(expression control sequence)”是引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，诸如组成性或诱导性启动子或增强子。表达控制序列与所需转录的核酸序列可操作地连接。
本文所使用的“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”或“药学上可接受的赋形剂(pharmaceutical acceptable excipient)”包括任何当与活性成分组合时能使所述成分保留生物活性且不与对象的免疫系统反应的任何物质。示例包括但不限于任何标准药学载体诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液及各种类型的润湿剂。优选的用于气雾剂或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含这些载体的组合物是由众所周知的常规方法配制(见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.MackPublishing,2005)。
如本文中所使用的术语“kon”或“ka”是指抗体与抗原缔合的速率常数。具体而言，速率常数(kon/ka及koff/kd)及平衡解离常数是使用整个抗体(即双价)及单体B7-H4蛋白测量。
如本文中所使用的术语“koff”或“kd”是指抗体自抗体/抗原复合体解离的速率常数。
本文所使用的术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
在本文中指涉“约”某数值或参数时，其包括(且描述)与所述数值或参数本身相关的实施方案。例如，“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包含界定所述范围的数字。
应了解的是，只要此处的实施方案是以术语“包含”描述，其还提供其他以“由...组成”和/或“基本上由...组成”的术语所描述的类似实施方案。
本发明的实施方案或实施方案是以马库什群组或其他选择性形式的群组描述，本发明不仅包含被列为整体的整个群组，但还包含所述群组的个别成员及所述主要群组中所有可能的亚群，且还包含不含其中一或多个群组成员的主要群组。本发明还设想明确排除所述申请专利的发明中任何群组成员的一或多者。
除非另行定义，此处所使用的所有技术及科学术语和本领域技术人员所通常了解的意义相同。若发生冲突，以本说明书(包括定义)为主。在本说明书及申请专利范围中，术语“包含(comprise)”或变化术语诸如“包括(comprises)”或“含有(comprising)”将被理解为意指包括被描述的整数或整数的群，但不排除任何其他整数或整数的群。除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。
示范性方法及材料是于本文描述，不过与本文所述的方法及材料类似或相等者还可被用于实施或检测本发明。这些材料、方法及实施方案仅用来示例而非意图限制。
制造抗体的常规方法
用于产生与靶标抗原(例如本发明的B7-H4)特异性结合的人及小鼠抗体的常规技术是所属技术领域中已知和/或是于本文描述。
噬菌体展示：
在一些实施方案中，抗体可通过噬菌体展示技术制备及筛选。见例如美国专利第5,565,332、5,580,717、5,733,743及6,265,150号及Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994。替代地，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553,1990)可用于自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体及抗体片段。根据此技术，抗体V结构域基因被符合读框地克隆至丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，且作为功能性抗体片段展示于所述噬菌体颗粒的表面。由于所述丝状颗粒包含所述噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于所述抗体的功能性质所进行的筛选还导致选择展现这些性质的编码抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟B细胞的若干性质。噬菌体展示可以各种形式进行；综述文献见例如Johnson,KevinS.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571,1993。不同来源的V基因区段可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628,1991自V基因的小型随机组合库分离出多种抗恶唑酮抗体，这些V基因是衍生自经免疫接种的小鼠的脾脏。可构建来自人供体的V基因库，并遵照Mark et al.,J.Mol.Biol.222:581-597,1991或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734,1993所述的技术基本上分离针对各式各样抗原(包括自体抗原)的抗体。在天然免疫反应中，抗体基因以高比例累积突变(体细胞超突变)。若干经导入的变化将赋予更高的亲和力，且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在后续抗原挑战期间优先复制及分化。此天然过程可通过采用称为“链改组”的技术模拟(Marks et al.,Bio/Technol.10:779-783,1992)。在此方法中，通过噬菌体展示获得的“一级”人抗体的亲和力可通过以获自未经免疫接种的供体的V结构域基因的天然存在变体库(库)依序置换重链及轻链V区基因来改善。此技术允许产生亲和力为pM至nM范围的抗体及抗体片段。制备非常大型噬菌体抗体库(还称为“万众的母库(the mother-of-alllibraries)”)的策略已由Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.21:2265-2266,1993描述。基因改组还可用于自啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿动物抗体类似的亲和力及特异性。根据此方法(又名“表位印记”)，由噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因是经人V结构域基因库置换，从而产生啮齿动物-人嵌合体。选择抗原导致分离能够恢复功能性抗原结合部位的人可变区，即表位掌管(印记)伴的选择。当重复过程以置换剩余的啮齿动物V结构域时，获得人抗体(见PCT公开号WO 93/06213)。和惯用的通过CDR移植人源化啮齿动物抗体不同的是，此技术提供全人抗体，其不具啮齿动物来源的框架或CDR残基。
杂交瘤技术：
在一些实施方案中，抗体可使用杂交瘤技术制造。应考虑任何哺乳动物对象包括人或衍生自所述对象的抗体产生细胞可经操作以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。免疫接种宿主动物的途径及时程通常与已建立及常规的抗体刺激及产生技术一致，如本文进一步描述。通常，宿主动物是经腹膜内、肌肉内、经口、皮下、足底和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文所述。
杂交瘤可自淋巴细胞及永生化骨髓瘤细胞制备，其使用Kohler,B.and Milstein,C.,1975,Nature256:495-497的常规体细胞杂交技术或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381,1982所改良的技术。可用的骨髓瘤细胞系(包括但不限于X63-Ag8.653及那些来自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的细胞)可用于杂交。通常，所述技术涉及使用促融剂诸如聚乙二醇或通过本领域技术人员众所周知的电装置使骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合后，使细胞自融合培养基中分离并于选择性生长培养基诸如次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)培养基中生长以消除未杂交的亲代细胞。任何本文所描述的培养基不论有无添加血清皆可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。在细胞融合技术的另一替代技术中，EBV永生化B细胞可被用于制备本发明的B7-H4单克隆抗体。杂交瘤或其他永生化B细胞系经扩增及次克隆(若需要)，上清液的抗免疫原活性通过常规的免疫测定程序(例如放射性免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定。
可用来作为抗体来源的杂交瘤涵盖产生对靶标抗原(例如B7-H4)或其部分具特异性的单克隆抗体的亲代杂交瘤的所有衍生物、子细胞。
产生此类抗体的杂交瘤可使用已知程序在体外或体内生长。单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化程序诸如硫酸铵沉淀、胶体电泳、透析、色谱及超过滤(若需要)自培养基或体液分离。非所需的活性(若有的话)可被移除，例如通过使制剂运行通过由免疫原连接固相所制成的吸附物且洗脱或释放所需的抗体离开免疫原。以使用双功能剂或衍生剂(例如顺丁烯二酰亚胺基苄酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基共轭)、N-羟基琥珀酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R及R1是不同烷基)共轭至对免疫接种物种具免疫原性的蛋白(例如钥孔虫戚血兰素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)的抗原(例如B7-H4多肽)或含有靶标氨基酸序列的片段免疫接种宿主动物可产生抗体(例如单克隆抗体)群体。
重组抗体
若有需要，可测序感兴趣的抗体(单克隆或多克隆)，例如以杂交瘤技术生成的抗体，接着可将多核苷酸序列克隆至载体中以表达或增殖。可将编码感兴趣的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，接着可扩增及冷冻宿主细胞以供将来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可通过本领域已知的手段经由克隆B细胞的抗体基因来进行。见例如Tiller et al.,2008,J.Immunol.Methods 329,112；美国专利第7,314,622号。
在一些实施方案中，多核苷酸序列可用于基因操作以“人源化”抗体或改善抗体的亲和力或其他特征。抗体还可经定制调整以用于例如犬、猫、灵长动物、马及牛。
在一些实施方案中，全人抗体可通过使用自商业途径获得的小鼠得到，所述小鼠已经工程改造以表达特定人免疫球蛋白。经设计以产生更为所需(例如全人抗体)或更强健的免疫反应的转基因动物还可被用于生成人源化抗体或人抗体。此类技术的示例是Abgenix,Inc.(Fremont,CA)的XenomouseTM及Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的HuMAb-
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及TC MouseTM。
抗体可经重组制造，首先自宿主动物分离抗体及抗体产生细胞，接着取得基因序列，然后使用基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达所述抗体。另一可被采用的方法是于植物(例如烟草)或转基因奶中表达抗体序列。在植物或奶中重组表达抗体的方法已被公开。见例如Peeters,et al.Vaccine 19:2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar,Int.Rev.Immunol 13:65,1995及Pollock,et al.,J Immunol Methods 231:147,1999。用在制备抗体的衍生物(例如结构域、单链等)的方法是本领域所知。
还可采用免疫测定及流式细胞分选技术诸如荧光激活细胞分选(FACS)以分离对靶标抗原(例如B7-H4)具特异性的抗体。
编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序轻易地分离及测序(例如通过使用能够与编码单克隆抗体的重链及轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一分离后，可将DNA置入表达载体中(诸如PCT公开号WO 87/04462所公开的表达载体)，接着将表达载体转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。见例如PCT公开号WO87/04462。DNA还可被修饰，例如通过以人重链及轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984)，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列与所有或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列。在所述方式中，制备对靶标抗原(例如B7-H4)具有结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
抗体片段可通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过上述重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成产生。抗体的多肽(特别是至多约50个氨基酸的较短多肽)是方便地通过化学合成制造。化学合成的方法是本领域所知且可自商业途径获得。举例来说，抗体可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。见例如美国专利第5,807,715号、第4,816,567号及第6,331,415号。
重组抗体-亲和力成熟
抗体可通过通常称为亲和力成熟的方法修饰。举例来说，亲和力成熟抗体可通过本领域已知的程序产生(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas etal.,1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169:147-155；Yelton et al.,1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896；及PCT公开号WO2004/058184)。
下列方法可用于调整抗体的亲和力及用于表征CDR。一种表征抗体的CDR和/或改变(诸如改善)多肽(诸如抗体)的结合亲和力的方式称为“库扫描突变形成”。通常，库扫描突变形成作用如下。CDR中的一或多个氨基酸位置是使用本领域公认的方法以两个或超过两个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换。这生成小型克隆库(在一些实施方案中，每个经分析的氨基酸位置皆有一个克隆)，每个克隆具有两个或超过两个成员的复杂性(如果每个位置经两个或超过两个氨基酸取代)。通常，库还包括包含天然(未经取代)氨基酸的克隆。筛选各库的少数克隆例如约20至80个克隆(依库的复杂性而定)与靶标多肽(或其他结合靶标)的结合亲和力，并识别具有增加、相同、降低或无结合的候选克隆。测定结合亲和力的方法是本领域所广为周知。结合亲和力可使用例如BiacoreTM表面等离子体共振分析(其检测约2倍或更高的结合亲和力的差异)、
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生物传感器、亲近闪烁测定、ELISA、/>
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免疫测定、荧光淬熄、荧光转移和/或酵母展示测定。结合亲和力还可使用合适生物测定筛选。BiacoreTM特别适用于当起始抗体已经以相对高的亲和力结合时，例如约10nM或小于10nM的KD。
在一些实施方案中，CDR中的每个氨基酸位置(在一些实施方案中一次一个位置)皆使用本领域公认的突变形成方法(某些方法于本文中描述)以所有20个天然氨基酸置换。这生成小型克隆库(在一些实施方案中，每个经分析的氨基酸位置皆有一个克隆)，每个克隆具有20个成员的复杂性(如果每个位置经所有20个氨基酸取代)。
在一些实施方案中，经筛选的库包含两个或超过两个位置的取代，其可位在相同CDR或在两个或超过两个CDR内。因此，库可包含在一个CDR内的两个或超过两个位置的取代。库可包含在两个或超过两个CDR内的两个或超过两个位置的取代。库可包含3、4、5个或超过5个位置的取代，这些位置见于二、三、四、五或六个CDR内。取代可使用低冗余性密码子制备。见例如Balint et al.,1993,Gene 137(1):109-18的表2。
CDR可以是重链可变区(VH)CDR3和/或轻链可变区(VL)CDR3。CDR可以是VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的一或多者。CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、接触CDR或构象CDR。
具有改善结合的候选物可经测序，由此识别导致改善亲和力的CDR取代突变(还称为“改善”取代)。还可测序结合的候选物，由此识别保留结合的CDR取代。
可进行多回合筛选。举例来说，具有改善结合的候选物(各者的一或多个CDR的一或多个位置包含氨基酸取代)还可用于设计各个经改善的CDR位置(即取代突变体显示改善结合的CDR氨基酸位置)含有至少原始及经取代的氨基酸的第二库。此库的制备、筛选及选择另在以下讨论。
库扫描突变形成还提供表征CDR的方法，因为具有改善结合、相同结合、降低结合或无结合的克隆的频率还提供有关各氨基酸位置对抗体-抗原复合体的稳定性的重要性的信息。举例来说，如果CDR的一个位置被改变成所有20个氨基酸仍保留结合，所述位置被认为不可能是抗原结合所必需的位置。相反地，如果CDR的一个位置只有在低比例取代才保留结合，则识别所述位置为对CDR功能具重要性的位置。因此，库扫描突变形成方法产生有关CDR中的位置的信息，有些位置可被改变成许多不同的氨基酸(包括所有20个氨基酸)，有些位置无法被改变或仅能被改变成少数几种氨基酸。
具有改善亲和性的候选物可利用所希望的筛选或选择方法被组合于第二库中，所述库包括在所述位置经改善的氨基酸及原始氨基酸，且可能另外包括所述位置的额外的取代，视所希望或所允许的该库的复杂性而定。此外若有需要的话，邻近的氨基酸位置可被随机化成至少两或更多种氨基酸。邻近氨基酸的随机化可能允许所述突变CDR的额外构象可塑性，这可能进而允许或促进导入更多的改善突变。所述库还可能包含在第一轮筛选时不显示改善亲和性的位置的取代。
第二库是使用本领域已知的任何方法筛选或选择具有改善和/或改变的结合亲和力的库成员，包括使用KinexaTM生物传感器分析筛选，及使用本领域已知的任何用于选择的方法选择，包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示。
为了表达本发明的抗体，可先使用上述的任何方法获得编码VH及VL区的DNA片段。还可使用本领域技术人员已知的标准方法将各种修饰例如突变、缺失和/或添加导入DNA序列中。举例来说，可使用标准方法进行突变形成，诸如PCR介导突变形成，其中经突变的核苷酸被纳入PCR引物以使PCR产物含有所需的突变或定点突变形成。
抗体的氨基酸序列可经修饰以包含不显著影响抗体性质的功能等效可变区和/或CDR以及具有增强或减低活性和/或亲和力的变体。此类修饰的示例包括氨基酸残基的保守性取代、不显著有害改变抗体的功能活性或使抗体对其靶标抗原的亲和力成熟(增强)的一或多个氨基酸缺失或添加。
氨基酸序列插入包括长度范围在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽内的胺基端和/或羧基端融合、以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N端或C端融合酶或多肽以增加抗体于血液循环中的半衰期。
取代变体是指所述抗体分子中的至少一个氨基酸残基被移除且在所述位置插入不同的残基。最受到关注的取代性突变形成的位置包括超变异区，但还可考虑框架的改变。保守取代显示于表1中标题“保守取代”的栏。若这些取代导致生物活性改变，则更实质的改变(表1称为“示例取代”)或如下参照氨基酸分类进一步描述的可被导入，然后筛选所述产物。
表1：氨基酸取代
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抗体的生物性质的实质修饰是通过选择在维持它们对以下的效应上有显著差异的取代加以完成：(a)取代区的多肽骨架结构，例如β-片层或螺旋构象，(b)靶标部位的分子的带电或疏水性，或(c)侧链的主体。天然存在残基基于常见的侧链性质分成下列群组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)不带电极性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5)影响链方向性的残基：Gly、Pro；及
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守性取代是通过以这些分类中的一者的成员交换另一分类而发生。
可发生的一种取代类型举例来说是改变抗体中一或多个半胱氨酸，其可能对另一残基诸如但不限于丙氨酸或丝氨酸具化学反应性。举例来说，可发生非典型半胱氨酸的取代。取代可发生于抗体的可变结构域的CDR或框架区或恒定区中。在一些实施方案中，所述半胱氨酸是典型半胱氨酸。任何与维持抗体的适当构型无关的半胱氨酸残基还可被取代(通常以丝氨酸取代)，以增进所述分子的氧化稳定性及防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可被加入抗体以增进抗体的稳定性，特别是当所述抗体是抗体片段诸如Fv片段时。
还可在抗体的例如重链和/或轻链的可变结构域进行修饰，以例如改变所述抗体的结合性质。可变区的变化可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在一个CDR结构域内发生不超过一至五个保守性氨基酸取代。在其他实施方案中，在一个CDR结构域内发生不超过一至三个保守性氨基酸取代。举例来说，可在一或多个CDR区发生突变以增加或降低抗体对B7-H4的KD、增加或降低koff或改变抗体的结合特异性。定点突变形成的技术是本领域所广为周知的。见例如Sambrook et al.及Ausubel et al.(同上)。
修饰或突变还可于框架区或恒定区发生以增加B7-H4抗体的半衰期。见例如PCT公开号WO00/09560。在框架区或恒定区的突变还可发生以改变抗体的免疫原性、提供与另一分子共价或非共价结合的部位或改变像是补体固定、FcR结合及抗体依赖性细胞介导细胞毒性的性质。在一些实施方案中，在框架区或恒定区内发生不超过一至五个保守性氨基酸取代。在其他实施方案中，在框架区或恒定区内发生不超过一至三个保守性氨基酸取代。根据本发明，单一抗体可能在可变区的任一或多个CDR或框架区或恒定区中具有突变。
重组抗体-糖基化修饰：
本文提供的抗体的修饰还包括糖基化及非糖基化多肽，也包括具有其他翻译后修饰的多肽，诸如举例来说以不同的糖进行糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体在其恒定区的保守性位置是经糖基化的(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright andMorrison,1997,TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白的功能(Boyd etal.,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe and Howard,1990,Biochem.29:4175-4180)及糖蛋白的不同部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构象及所呈现的三维表面(Jefferis and Lund(同上)；Wyss and Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。根据特定识别结构，寡糖还可被用来使给定糖蛋白靶向某些分子。也有报告指出抗体的糖基化会影响抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。特别是，由经四环素调节表达β(1,4)-N-乙酰葡萄氨基转移酶III(GnTIII，一种酶催化形成平分型GlcNAc的糖基转移酶)的CHO细胞所产制的抗体被报告具有增强的ADCC活性(Umana et al.,1999,NatureBiotech.17:176-180)。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰氨酸残基的侧链。三肽序列天冬酰氨酸-X-丝氨酸、天冬酰氨酸-X-苏氨酸及天冬酰氨酸-X-半胱氨酸是供碳水化合物部分与天冬酰氨酸侧链酶催化性连接的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，多肽中有任何这些三肽序列的存在即产生可能的糖基化位点。O-连接糖基化是指连接糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖的一者与羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，不过5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可被使用。
添加糖基化位点至抗体是通过改变氨基酸序列以使其含有一或多个上述的三肽序列而方便地完成(对于N-连接糖基化位点)。所述改变还可通过在原始抗体的序列加入或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基加以完成(对于O-连接糖基化位点)。
抗体的糖基化模式还可在不改变基础核苷酸序列下加以改变。糖基化大多取决于用来表达抗体的宿主细胞。由于用于表达重组糖蛋白(例如抗体)作为潜在治疗剂的细胞类型鲜少为天然细胞，因此可预期抗体的糖基化模式的变化(见例如Hse et al.,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间可影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧化、pH、纯化程序及所述类似因素。各种方法已被提出以改变在特定宿主生物体中达成的糖基化模式，包括导入或过表达与寡糖产生有关的某些酶(美国专利第5,047,335号、第5,510,261号及第5,278,299号)。糖基化(或某些类型的糖基化)可通过酶自糖蛋白移除，举例来说利用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，所述重组宿主细胞可经基因工程改造以无法处理某些种类的多糖。这些及类似的技术是本领域所广为周知的。
其他修饰的方法包括使用本领域已知的偶合技术，包括但不限于酶方法、氧化性取代及螯合。修饰可用于例如连接免疫测定的标签。经修饰的多肽是利用本领域已建立的方法制备，且可利用本领域已知的标准测定筛选，这些方法中有些在以下及实施例中描述。
重组抗体-种系化：
在称为“种系化”的过程中，在VH及VL序列中的某些氨基酸可经突变以符合在种系VH及VL序列中天然发现的氨基酸。特别是在VH及VL序列的框架区中的氨基酸序列可经突变成种系序列以降低抗体在施用时的免疫原性风险。人VH及VL基因的种系DNA序列是本领域所知的(见例如“Vbase”人种系序列数据库；还见Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227:776-798；及Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836)。
重组抗体-移除易感部位：
另一种可能产生的氨基酸取代类型是移除抗体中潜在的蛋白水解位置。该位置可能出现在抗体可变结构域的CDR或框架区中或在抗体恒定区中。取代半胱氨酸残基及移除蛋白水解位置可能降低抗体产物的异质性的风险，因此增加其均质性。另一类型的氨基酸取代是消除天冬酰氨酸-甘氨酸对，其通过改变残基的一或两者，所述氨基酸对形成潜在的脱酰胺位置。在另一实施例中，本发明的抗体的重链的C端赖氨酸可经切割。在本发明的各种实施方案中，抗体的重链及轻链任选地包括信号序列。
重组抗体-各种形式：
当获得编码本发明的VH及VL区段的DNA片段后，可进一步利用标准重组DNA技术操纵这些DNA片段，例如转换所述可变区基因成为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段是与编码另一蛋白的另一DNA片段可操作地连接，诸如抗体恒定区或可弯折的接头。在此上下文所使用的术语“可操作地连接”是意图指两个DNA片段是经连接以使由所述两个DNA片段所编码的氨基酸序列维持在框内。
通过可操作地连接编码所述VH的DNA与另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子可将编码VH区的分离的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域所知(见例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选为IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可以是任何已知在不同对象中存在的各种等位基因或同种异型，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。这些同种异型代表在IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。以Fab片段重链基因而言，编码VH的DNA可与另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子可操作地连接。所述CH1重链恒定区可衍生自任何重链基因。
通过可操作地连接编码VL的DNA与另一编码轻链恒定区(CL)的DNA分子可将编码VL区的分离的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域所知的(见例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。κ恒定区序列可以是任何已知在不同对象中存在的各种等位基因，诸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恒定区可衍生自三个λ基因中的任一基因。
为了产生scFv基因，编码VH及VL的DNA片段是与另一编码可弯折接头的片段可操作地连接，以使得所述VH及VL序列可被表达为连续单链蛋白，且所述VL及VH区通过可弯折的接头连接(见例如Bird et al.,1988,Science 242:423-426；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,1990,Nature 348:552-554)。一种连接肽的示例是(GGGGS)3，其桥接一可变区的羧基端与另一可变区的胺基端之间大约3.5nm。其它序列的接头已被设计及使用(Bird et al.,1988，同上)。接头还反过来可经修饰以得到额外的功能，诸如与药物连接或与固体支持体连接。单链抗体可以是单价(若仅使用单一VH及VL)、双价(若使用二个VH及VL)或多价(若使用超过二个VH及VL)。可产生与靶标抗原(例如B7-H4)及另一分子特异性结合的双特异性或多价抗体。可重组或合成产生单链变体。以scFv的合成产生而言，可使用自动化合成仪。以scFv的重组产生而言，含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒可被导入合适宿主细胞中，不论是真核细胞诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，抑或是原核细胞诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可通过常规操作来制造，诸如连接多核苷酸。形成的scFv可利用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。
还涵盖其他形式的单链抗体诸如双体抗体(diabody)。双体抗体是双价、双特异性的抗体，其中VH及VL表达于单一多肽链上，但使用过短以防止所述同一链上的两个结构域配对的接头，由此强迫这些结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位(见例如Holliger,P.,et al.,1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.,1994,Structure 2:1121-1123)。
包含两个共价连接抗体的异源共轭抗体也属于本发明的范围内。这些抗体被用于靶向免疫系统细胞至非所需的细胞(美国专利第4,676,980号)及用于治疗HIV感染(PCT公开号WO 91/00360及WO 92/200373及EP 03089)。异源共轭抗体可利用任何方便的交联方法制备。合适交联剂及技术是本领域所广为周知的且描述于美国专利第4,676,980号。
嵌合或杂交抗体还可利用已知的合成蛋白质化学方法于体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或通过形成硫醚键加以构建。为达此目的的适当试剂的示例包括亚氨基硫醇盐及甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯。
可制造融合抗体，其包含与另一多肽连接的所有或部分的单克隆抗体。在一些实施方案中，只有抗体的可变结构域与其他多肽连接。在另一个实施方案中，抗体的VH结构域是与第一多肽连接，同时抗体的VL结构域是与第二多肽连接，所述第二多肽与第一多肽是以使所述VH及VL结构域得以彼此相互作用以形成抗原结合部位的方式相连结。在另一优选的实施方案中，VH结构域与VL结构域被接头分开，以使所述VH及VL结构域可彼此相互作用。接着将VH-接头-VL抗体与其他感兴趣的多肽连接。此外，可产生融合抗体，其中二个(或超过二个)单链抗体是彼此相连。这可用于若想在单一多肽链上产生双价或多价抗体或想产生双特异性抗体。
融合多肽可通过本领域已知的方法产生，例如合成或重组。通常，融合抗体是通过使用本文所述的重组方法制备及表达编码其多核苷酸来制造，不过还可通过本领域所知的其他方法制备，包括例如化学合成。
在其他实施方案中，其他经修饰的抗体可使用编码抗体的核酸分子制备。举例来说，“κ抗体”(Ill et al.,1997,Protein Eng.10:949-57)、“迷你抗体”(Martin et al.,1994,EMBO J.13:5303-9)、“双体抗体”(Holliger et al.,同上)或“杰鲁斯抗体(Janusins)”(Traunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655-3659及Traunecker et al.,1992,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52)可依照本说明书的教导使用标准分子生物技术制备。
双特异性抗体
制造双特异性抗体的方法是本领域所知(见例如Suresh et al.,1986,Methodsin Enzymology 121:210)。例如，双特异性抗体或抗原结合片段可通过杂交瘤的融合或连接Fab’片段来产生。见例如Songsivilai&Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321、Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547-1553。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于共表达二个免疫球蛋白重链-轻链对，其中所述二个重链具有不同特异性(Millsteinand Cuello,1983,Nature 305,537-539)。此外，双特异性抗体可形成为“双体抗体”或“杰鲁斯抗体”。
根据一种制造双特异性抗体的方法，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合部位)是与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选地是利用免疫球蛋白重链恒定区，包含至少部分的铰链区、CH2区及CH3区。优选地是使第一重链恒定区(CH1)(其包含轻链结合所需的部位)存在于所述融合物的至少一者中。编码免疫球蛋白重链融合物及若需要的免疫球蛋白轻链的DNA被插入分开的表达载体，并被共转染至合适宿主有机体。在构建中使用不等比例的三个多肽链以提供最佳产量的实施方案中，此提供调整三个多肽片段的相互比例的高度灵活性。然而，当以相等比例表达至少两个多肽链导致高产量，或所述比例不具特别显著性时，有可能在一个表达载体中插入二个或所有三个多肽链的编码序列。
在一方法中，双特异性抗体是由一臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链与另一臂中杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)所组成。这种免疫球蛋白轻链仅位于双特异性分子的一半的不对称结构有利于分离非所要的免疫球蛋白链组合与所需的双特异性化合物。此方法是描述于PCT公开号WO 94/04690。
与剂共轭以偶合固体支持体的抗体
本发明还提供组合物，其包含与有利于偶合至固体撑体的试剂(诸如生物素或抗生物素蛋白)共轭(例如连接)的抗体。为了简单起见大致将以抗体为例，但应了解这些方法适用于本文所述的任何抗体实施方案。共轭一般是指如本文所述的连接这些组分。所述连接(通常是近距离相连固定这些组分以至少用于施用)可以数种方式达成。举例来说，当试剂与抗体各自具有能与彼此反应的取代基时，两者间的直接反应是可能的。例如，一者上的亲核基团(诸如氨基或氢硫基)可能能与另一者上的含有羰基的基团(诸如酐或酸性卤化物)或含有良好离去基(例如卤化物)的烷基反应。
抗体可与许多不同的载体结合。载体可以是活性和/或惰性。广为周知的载体示例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然纤维素、经改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁铁矿。载体的本质就本发明的目的而言可以是可溶或不可溶的。本领域技术人员知道其他用于结合抗体的适当载体，或可利用例行实验加以确认。在一些实施方案中，载体包含靶向肺、心或心瓣膜的部分。
本发明的抗体或多肽可与标记试剂诸如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其他标签连接。本领域已知的标签通常提供(直接或间接)信号。
B7-H4抗体
本发明提供与B7-H4特异性结合的抗体(“B7-H4抗体”)。本发明的B7-H4抗体应展现下列特征中任一项：(a)在ELISA测定中与板结合的B7-H4结合；(b)在基于细胞的测定中与表达B7-H4的肿瘤细胞结合；(c)在T细胞介导的肿瘤细胞杀伤中展现活性，其中肿瘤细胞表达B7-H4；(d)抑制具有表达B7-H4的恶性肿瘤的对象的肿瘤生长或进展；(e)治疗、预防、改善对象的与表达B7-H4的恶性细胞相关联的病况的一或多个症状。
B7-H4抗体可通过本领域中已知的任何方法制造。表2描述本发明的示例性B7-H4抗体。表2所列的VH CDR1(重链可变区CDR1)的各者是根据AbM CDR定义。表2所列的VH CDR2(重链可变区CDR2)、VH CDR3(重链可变区CDR3)、VLCDR1(轻链可变区CDR1)、VL CDR2(轻链可变区CDR2)、VLCDR3(轻链可变区CDR3)序列的各者是根据Kabat CDR定义。
因此，在一些实施方案中，本发明提供表2所述的B7-H4抗体中任一项。
在一些实施方案中，本发明提供B7-H4抗体或与B7-H4结合的其变体或与B7-H4结合的其抗原结合片段，其中B7-H4抗体包含VH及VL，所述VH及VL具有与表2所述的抗体的VH及VL相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供B7-H4抗体或其与B7-H4结合的变体或其与B7-H4结合的抗原结合片段，其中B7-H4抗体包含
(i)VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中六个CDR各具有与表2所述的抗体的VH及VL的对应CDR相同的氨基酸序列，
(ii)表2所述的任一抗体的VH的三个CDR，或
(iii)表2所述的任一抗体的VL的三个CDR，
其中CDR是根据Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或Kabat及Chothia CDR的组合(还称为“组合CDR”或“延伸CDR”)定义。
在一些实施方案中，本发明提供B7-H4抗体或与B7-H4结合的其变体或与B7-H4结合的其抗原结合片段，其中B7-H4抗体包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其各者具有与表2所述的任一抗体的列于表2的对应CDR相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供与表2所述的任一抗体竞争结合B7-H4的B7-H4抗体。
表2.示例性B7-H4抗体的SEQ ID NO
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表3显示本发明的示例性抗体的序列和对应的序列识别符，包括表2所列的B7-H4抗体、表4所列的CD3抗体及表5所列的B7-H4xCD3双特异性抗体，及用于产生或测试本发明的抗体的B7-H4胞外结构域的序列。数个VH及VL序列的Kabat CDR也就是SEQ ID NO 106、108、139、161、167及172是标记为画下划线的氨基酸序列，且Chothia CDR是标记为粗体的氨基酸序列。除了表2、表4及表5所述的序列之外，以下是表3包括的一些额外序列的说明。
SEQ ID NO:1是人B7-H4蛋白的胞外结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是食蟹猕猴B7-H4蛋白的胞外结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是小鼠B7-H4蛋白的胞外结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是大鼠B7-H4蛋白的胞外结构域的氨基酸序列。
抗体1156及抗体1167是B7-H4xCD3双特异性抗体；两者皆描述于表5。
SEQ ID NO:186及187分别是双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的全长重链及全长轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:188及189分别是双特异性抗体1156及双特异性抗体1167的第二臂(CD3臂)的分别全长重链及全长轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:190及191分别是双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的分别全长重链及全长轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:192是编码双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的全长重链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:193是编码双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的全长轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:194是编码双特异性抗体1156及1167的第二臂(CD3臂)的全长重链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:195是编码双特异性抗体1156及1167的第二臂(CD3臂)的全长轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:196是编码双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的全长重链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:197是编码双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的全长轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:198是本文中的制造抗体的常规方法所述的(GGGGS)3肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:199是编码双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的Kabat VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:200是编码双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的Chothia VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:201是编码双特异性抗体1156的第一臂(B7-H4臂)的Chothia VH CDR2的序列。
SEQ ID NO:202是编码双特异性抗体1156及双特异性抗体1167的第二臂(CD3臂)的Kabat VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:203是编码双特异性抗体1156及双特异性抗体1167的第二臂(CD3臂)的Chothia VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:204是编码双特异性抗体1156及双特异性抗体1167的第二臂(CD3臂)的Chothia VH CDR2的序列。
SEQ ID NO:205是编码双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的Kabat VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:206是编码双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的Chothia VH CDR1的序列。
SEQ ID NO:207是编码双特异性抗体1167的第一臂(B7-H4臂)的Chothia VH CDR2的序列。
SEQ ID NO:208是人IgG2野生型IGHG2*01的恒定区1(CH1)、铰链、CH2及CH3区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:209是人IgG1野生型IGHG1*01的CH1、铰链、CH2及CH3区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:210是人IgG4野生型IGHG4*01的CH1、铰链、CH2及CH3区的氨基酸序列。
IGHG2*01、IGHG1*01及IGHG4*01是根据IMGT/Gene-DB的人IGHC群组(Giudicelli,V.et al.Nucleic Acids Res.,33:D256-D261(2005))。
表3.SEQ ID NO序列
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在一些实施方案中，本发明还提供基于CDR接触区的B7-H4的抗体的CDR部分。CDR接触区是给予抗体对抗原的特异性的抗体的区。通常，CDR接触区包括CDR中的残基位置及游标(Vernier)区，所述游标区是经限制以维持适当环状结构供抗体与特定抗原结合。见例如Makabe et al.,J.Biol.Chem.,283:1156-1166,2007。CDR接触区的确定是本领域所熟知的。
本文所述的B7-H4抗体与B7-H4(诸如hB7-H4的胞外结构域)的结合亲和力(KD)可以是约0.002nM至约6500nM。在一些实施方案中，结合亲和力是约6500nm、6000nm、5986nm、5567nm、5500nm、4500nm、4000nm、3500nm、3000nm、2500nm、2134nm、2000nm、1500nm、1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nM、193nM、100nM、90nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、19nm、18nm、17nm、16nm、15nM、10nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM或0.002nM的任一者。在一些实施方案中，结合亲和力是小于约6500nm、6000nm、5500nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm、1000nm、900nm、800nm、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM的任一者。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体是全长人抗体。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体是单链可变区抗体(scFv)。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体是双体抗体或迷你抗体。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体是融合蛋白，其包含与B7-H4结合的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VLCDR3，其中六个CDR各具有与表2所述的抗体的对应CDR相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性结合B7-H4的胞外结构域、第一跨膜结构域及胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含单链Fv片段(scFv)，其包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中六个CDR各具有与表2所述的抗体的对应CDR相同的氨基酸序列，
本发明还提供制备在本文中公开的任何抗体的方法。本文提供的抗体可通过本领域已知的方法制造。
B7-H4抗体缀合物
本发明还提供一种如本文所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段的缀合物(或免疫缀合物)，其中所述抗体或抗原结合片段是经由接头直接或间接与试剂(例如细胞毒性剂)缀合以用于靶向性免疫疗法(例如抗体-药物缀合物)。举例来说，细胞毒性剂可与如本文所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段连接或缀合以用于靶向性局部递送细胞毒性剂部分至肿瘤(例如表达B7-H4的肿瘤)。
用于将细胞毒性剂或其他治疗剂与抗体缀合的方法已于许多文献中说明。举例来说，抗体的化学修饰可经由赖氨酸侧链胺或通过还原链间双硫键而被活化的半胱氨酸氢硫基进行，以使缀合反应得以发生。见例如Tanaka et al.,FEBS Letters 579:2092-2096,2005及Gentle et al.,Bioconjμgate Chem.15:658-663,2004。还已描述经工程改造于抗体的特定位点的反应性半胱氨酸残基，这些残基用于以经定义的化学计量进行特定药物缀合。见例如Junutμla et al.,Nature Biotechnology,26:925-932,2008。在转谷氨酰胺酶及胺(例如包含或连接至反应性胺的细胞毒性剂)存在时，使用通过多肽工程改造的含有酰基供体谷氨酰胺的标签或使成反应性的内源性谷氨酰胺(即形成共价键以作为酰基供体的能力)的缀合还描述于国际专利申请案WO2012/059882及WO2015015448。
可与本发明的B7-H4抗体或抗原结合片段缀合的试剂包括但不限于细胞毒性剂、免疫调节剂、显影剂、治疗性蛋白、生物聚合物或寡核苷酸。
可与B7-H4抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性剂的实施例包括但不限于蒽环霉素、瑞奥西汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、康普瑞汀(combretastatin)、duocarmycin、吡咯并苯并二氮呯二聚体、吲哚啉并-苯并二氮呯二聚体、烯二炔、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素(puromycin)、紫杉烷、长春花生物碱、喜树碱、tubulysin、半星芒体(hemiasterlin)、司普力西欧他汀(spliceostatin)、pladienolide及其立体异构物、同电子排列体、类似物或衍生物。
可与B7-H4抗体或其抗原结合片段缀合的免疫调节剂的实施例包括但不限于更昔洛韦(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、voclosporin、环孢霉素(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)、甲氨喋呤(methotrexate)、糖皮质素及其类似物、细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白介素(例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ)、命名为“S1因子”的干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素或其组合。
可与B7-H4抗体或其抗原结合片段缀合的显影剂(例如荧光团或螯合剂)的实例，诸如荧光素、玫瑰红、镧系元素磷光体及其衍生物或与螯合剂结合的放射性同位素。荧光团的实例包括但不限于荧光素异硫氰酸酯(FITC)(例如5-FITC)、荧光素类星体(fluoresceinamidite)(FAM)(例如5-FAM)、伊红素、羧基荧光素、赤藓红(erythrosine)、Alexa
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(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基玫瑰红(TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基异硫氰酸罗达明(TMR)及磺酰罗丹明(SR)(例如SR101)。螯合剂的实例包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸(去铁胺)、二乙三胺戊乙酸(DTPA)及1,2-双(邻胺基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸)(BAPTA)。
在一些实施方案中，所述试剂是治疗性蛋白质，包括但不限于毒素、激素、酶及生长因子。
毒素蛋白质(或多肽)的实例包括但不限于白喉毒素(例如白喉毒素A链)、假单胞菌外毒素及内毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)(例如蓖麻毒蛋白A链)、相思豆毒素(abrin)(例如相思豆毒素A链)、莫迪素(modeccin)(例如莫迪素A链)、α-次黄嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素(dianthin)蛋白质、核糖核酸酶(RNase)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、Phytolacaamericana蛋白质(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(Saponaria officianalis)抑制剂、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、单端孢霉烯(tricothecene)、抑制剂胱氨酸结(ICK)肽(例如ceratotoxin)及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
在一些实施方案中，所述试剂是生物相容性聚合物。本文所述的B7-H4抗体或抗原结合片段可与生物相容性聚合物缀合以增加血清半衰期及生物活性和/或延长体内半衰期。生物相容性聚合物的实例包括水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物及含有两性离子的生物相容性聚合物(例如含有磷酰胆碱的聚合物)。
在一些实施方案中，所述试剂是寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。
CD3抗体
本发明进一步提供与CD3(例如人CD3)结合的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供分离的抗体，其与CD3特异性结合，其中所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:178的氨基酸序列的重链恒定区(CH)及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链恒定区(CL)；
b)具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:180的氨基酸序列的CH及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CL；
c)具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:180的氨基酸序列的CH及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CL；
d)具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:182的氨基酸序列的CH及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CL；
e)具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:184的氨基酸序列的CH及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CL；或
f)具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL、SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CH及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CL。
在另一个实施方案中，本发明提供与CD3特异性结合的抗体，其中所述抗体包含VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VLCDR3，各具有表4所列的任一抗体的对应CDR相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供与CD3特异性结合的抗体，其中所述抗体包含VH及VH，各具有表4所列的任一抗体的VH及VL相同的氨基酸序列。
表4描述本发明的示例性CD3抗体。
表4.示例性CD3抗体
Figure SMS_23
B7-H4双特异性抗体
本发明还提供与B7-H4及第二抗原特异性结合的双特异性抗体。
第二抗原
在一些实施方案中，第二抗原是位于人免疫效应子细胞上的效应子抗原。在人效应子细胞上的效应子抗原的概念是所属技术领域中广知的。示例性效应子抗原包括但不限于CD3、CD16、NKG2D、NKp-46、CD2、CD28、CD25、CD64及CD89。
在一些实施方案中，第二抗原是CD3。
在一些实施方案中，第二抗原可以是在靶细胞上的靶抗原(除B7-H4以外)，其中靶细胞可以是对人是天然或外来的细胞。在天然靶细胞中，细胞可被转化为恶性细胞或被病理修饰(例如被病毒、疟原虫属或细菌感染的天然靶细胞)。在外来靶细胞中，细胞是侵入性病原体，诸如细菌、疟原虫属或病毒。
靶抗原表达在疾病病况中(例如炎性疾病、增生性疾病(例如癌症)、免疫病症、神经性疾病、神经退化性疾病、自体免疫疾病、感染性疾病(例如病毒感染或寄生虫感染)、过敏反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病)的靶细胞上。靶抗原不是效应子抗原。靶抗原的实例包括但不限于B7-H4、EpCAM(上皮细胞黏着性分子)、CCR5(趋化因子受体第5型)、CD19、HER(人表皮生长因子受体)-2/neu、HER-3、HER-4、EGFR(表皮生长因子受体)、PSMA、CEA、MUC-1(黏液素)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、CIhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷酯GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、聚SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Shh(音猬因子)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、MCSP(黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙黏素新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标志物、CA-125标志物及MIS(穆勒抑制物质)受体第II型、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS及CD63。
B7-H4xCD3双特异性抗体
下表5提供本发明的与B7-H4及CD3两者特异性结合的示例性双特异性抗体(“B7-H4xCD3双特异性抗体”)的第一臂及第二臂两者的CDR、恒定区及可变区的SEQ ID NO。
表5.示例性B7-H4xCD3双特异性抗体
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表5的双特异性抗体的各者包含两臂：与B7-H4结合的第一臂及与CD3结合的第二臂。第一臂及第二臂两者的重链CDR(VH CDR)、轻链CDR(VL CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)及轻链恒定区(CL)的各者的氨基酸序列的SEQ ID NO是显示于表5。(表5所列的SEQ ID NO各者的氨基酸序列描述于本文先前部分中的表3。)表5中的VHCDR1序列的各者是根据AbM定义，且表5所列的VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2、VLCDR3序列的各者是根据Kabat定义。
在一些实施方案中，本发明提供一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一轻链及第一重链及第二轻链及第二重链，其中所述第一轻链及所述第一重链形成第一臂，所述第一臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二轻链及所述第二重链形成第二臂，所述第二臂包含与CD3结合的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第一重链包含VH及CH，第一轻链包含VL及CL，第二重链包含VH及CH且第二轻链包含VL及CL，其中第一及第二重链VH及CH及第一及第二轻链VL及CL包含与表5所列的双特异性抗体的任一者相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一轻链包含VL，第一重链包含VH，第二轻链包含VL且第二重链包含VH，其中第一及第二重链及及第一及第二轻链的VH及VL的各者具有与表5所列的双特异性抗体的任一者相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一轻链包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，第一重链包含VHCDR1、VH CDR2及VH CDR3，第二轻链包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，且第二重链包含VHCDR1、VH CDR2及VH CDR3，其中本发明的双特异性抗体的第一臂及第二臂的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3的各者具有与表5所述的双特异性抗体的任一者的分别第一臂及第二臂的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或Kabat及Chothia CDR的组合(还称为“组合CDR”或“延伸CDR”)定义。
B7-H4抗体、CD3抗体及B7-H4xCD3双特异性抗体的恒定区
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一或多个恒定区。在一些实施方案中，抗体可以是例如全长人抗体。在一些实施方案中，全长人抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体可包含免疫惰性Fc区。
除非另行指明，人IgG1、IgG2及IgG4的恒定区在本文的所有编号是根据EU编号方案且分别参照野生型人IgG1、IgG2及IgG4。人IgG1、IgG2及IgG4的铰链-CH2区的编号描述及例示于图1。图1使用的IgG2、IgG1及IgG4的序列是来自IMGT/Gene-DB的人IGHC群组的IGHG2*01、IGHG1*01及IGHG4*01的CH1、H、CH2及CH3区(IMGT/GENE-DB:Giudicelli,V.etal.Nucleic Acids Res.,33:D256-D261(2005).PMID:15608191)。
在一些实施方案中，Fc是人IgG4 Fc。在一些实施方案中，本文提供的抗体可包含IgG4的恒定区，其包含下列突变(Armour et al.,2003,Molecμlar Immunology 40 585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4Δc)。在另一个实施方案中，Fc可以是人IgG4E233F234L235至P233V234A235并缺失G236(IgG4Δb)。在一些实施方案中，Fc可以是含有绞链稳定突变S228至P228的任何人IgG4Fc(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc)(Aalberse et al.,2002,Immunology 105,9-19)。
在一些实施方案中，Fc是人IgG2 Fc。在一些实施方案中，Fc是含有突变A330P331至S330S331的人IgG2(IgG2Δa)，其中及在本段其余部分氨基酸残基是参照野生型人IgG2序列编号且遵照EU编号方案。(Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624)。在一些实施方案中，Fc是具有D265A取代的人IgG2Δa Fc。在一些实施方案中，抗体进一步含有人IgG2的铰链区的位置223、225及228的突变(例如(C223E或C223R)、(E225R)及(P228E或P228R))及Fc中CH3区的位置409或368的突变(例如K409R或L368E)。图1显示并入EU编号方案的本文所使用的人IgG2恒定区的特定编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含被修饰的恒定区，其对人Fcγ受体的结合亲和力增加或减少、呈免疫惰性或部分惰性(例如不触发补体介导性裂解、不刺激抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)或不活化小神经胶质细胞)或在下列任一或多项具有减少的活性(相较于未经修饰的抗体)：触发补体介导性裂解、刺激ADCC、或活化小神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可被用于达到效应子功能的最佳水平和/或组合。见例如Morgan et al.,Immunology 86:319-324,1995、Lund et al.,J.Immunology 157:4963-9 157:4963-4969,1996、Idusogie et al.,J.Immunology 164:4178-4184,2000、Tao et al.,J.Immunology143:2595-2601,1989及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163:59-76,1998。在一些实施方案中，恒定区是被如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT公开号WO99/058572所述修饰。
在一些实施方案中，本发明的抗体的恒定区可被修饰以避免与Fcγ受体及补体及免疫系统的相互作用。用于制备具有此类恒定区的抗体的技术是描述于WO 99/58572。举例来说，恒定区可被工程改造以更类似于人恒定区，以在抗体用于人的临床试验及治疗时避免免疫反应。见例如美国专利第5,997,867号及第5,866,692号。
在一些实施方案中，对于N-连接糖基化，将恒定区去糖基化。在一些实施方案中，对于N-连接糖基化，将恒定区通过使寡糖连接残基和/或作为恒定区的N-糖基化识别序列的部分的侧接残基突变而去糖基化。例如，N-糖基化位点N297可被突变为例如A、Q、K或H。见Tao et al.,J.Immunology143:2595-2601,1989；及Jefferis et al.,ImmunologicalReviews 163:59-76,1998。在一些实施方案中，对于N-连接糖基化，将恒定区去糖基化。对于N-连接糖基化，可通过酶(诸如通过酶PNGase移除碳水化合物)或通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达来将恒定区去糖基化。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含如PCT公开号WO 99/58572所述的恒定区修饰。除了针对靶标分子的结合结构域外，这些抗体还包含具有实质上与人免疫球蛋白重链的恒定区的所有或部分同源的氨基酸序列的效应子结构域。这些抗体能够结合靶标分子但不触发显著的补体依赖性裂解或细胞介导靶标破坏。在一些实施方案中，效应子结构域能够与FcRn和/或FcγRIIb特异性结合。这些通常是基于衍生自两个或超过两个人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免传统抗体治疗所引发的炎性反应及其他不良反应。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含具有相较于未经修饰的抗体增加FcRn结合亲和力和/或增加血清半衰期的经修饰的恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链恒定区，其包含选自由SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQID NO:183、SEQ ID NO:184及SEQ ID NO:185所组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链恒定区，其包含SEQ ID NO:12或SEQID NO:121的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4xCD3双特异性抗体包含第一重链及第二重链，且各重链含有铰链区。在一些实施方案中，重链之一的铰链区含有氨基酸修饰，其中取代氨基酸与双特异性抗体的另一重链的铰链区中的对应氨基酸具有相反电荷。此方法是描述于国际专利申请PCT/US2011/036419(WO2011/143545)。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4xCD3双特异性抗体包含第一及第二免疫球蛋白样Fc区，且通过改变或工程改造介于第一与第二免疫球蛋白样Fc区之间的界面(例如铰链区和/或CH3区)来增强双特异性抗体。在此方法中，双特异性抗体可由CH3区构成，其中CH3区包含第一CH3多肽及第二CH3多肽，其一起相互作用以形成CH3界面，其中在CH3界面内的一或多个氨基酸去稳定同型二聚体形成且不是静电不利于同型二聚体形成。此方法是描述于国际专利申请PCT/US2011/036419(WO2011/143545)。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4xCD3双特异性抗体包含被含有谷氨酰胺肽标签工程改造的针对B7-H4的抗体臂及被另一肽标签(例如含有Lys肽标签或反应性内源性Lys)工程改造的针对第二抗原的抗体臂。此方法是描述于国际专利申请PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含全长人抗体，其包含第一轻链及第一重链及第二轻链及第二重链，其中所述第一轻链及所述第一重链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二轻链及所述第二重链形成第二抗体臂，所述第二抗体臂形成与CD3结合的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体是全长人IgG2。在一些实施方案中，双特异性抗体是含有突变A330P331至S330S331的全长IgG2(IgG2Δa)。在一些实施方案中，双特异性抗体是进一步包含D265A的突变的人IgG2Δa。在一些实施方案中，第一重链包含位置223、228和/或368的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一重链的位置223、228及368的氨基酸修饰是C223E、P228E和/或L368E。在一些实施方案中，第二重链包含位置223、225、228和/或409的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第二重链的位置223、225、228及409的氨基酸修饰是C223R、E225R、P228R和/或K409R。
在一些实施方案中，双特异性抗体是全长人IgG2Δa D265A，其中第一重链进一步包含C223E、P228E及L368E的氨基酸修饰，且第二重链进一步包含C223R、E225R、P228R及K409R的氨基酸修饰。本文所有氨基酸编号是根据人IgG2野生型及EU编号方案(Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624)且如图1所示。图1描绘下列氨基酸序列的比对：第一重链恒定区(B7-H4结合臂，上)、第二重链恒定区(CD3结合臂，中)(两者皆如本段所述)及人IgG2野生型恒定区(下)。
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一重链包含恒定区，所述恒定区包含SEQID NO:181或SEQ ID NO:177的氨基酸序列，且双特异性抗体的第二重链包含恒定区，所述恒定区包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一重链及第二重链包含人IgG1的铰链区的位置221及228的氨基酸修饰(例如(D221R或D221E)及(P228R或P228E))及CH3区的位置409或368的氨基酸修饰(例如K409R或L368E(EU编号方案))。
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一重链及第二重链包含人IgG4的铰链区的位置228的氨基酸修饰(例如(P228E或P228R))及CH3区的位置409或368的氨基酸修饰(例如R409或L368E(EU编号方案))。
本发明的抗体(包括B7-H4抗体、B7-H4xCD3双特异性抗体及B7-H4xCD3双特异性抗体)涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、单链可变区片段(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如结构域抗体)、人源化抗体及包含所需特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的任何其他被修饰组态，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变异体及被共价修饰的抗体。所述抗体可以是小鼠、大鼠、人或任何其他来源的(包括嵌合或人源化抗体)。
多核苷酸、载体及宿主细胞
多核苷酸
本发明还提供编码本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)及CD3抗体的多核苷酸及包含多核苷酸的载体及宿主细胞。
本发明还提供组合物，诸如包含本发明的任何多核苷酸的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的任何抗体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO:196及SEQ ID NO:197所示的多核苷酸的任一或两者。在一些实施方案中，所述组合物包含SEQ IDNO:192及SEQ ID NO:193所示的多核苷酸的任一或两者。在仍一些实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:194及SEQ ID NO:195所示的多核苷酸的任一或两者。
与任何这些序列互补的多核苷酸也涵盖于本发明中。多核苷酸可能为单链(编码或反义)或双链，且可能为DNA(基因组、cDNA或合成性)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，所述HnRNA分子包含内含子且以一对一的方式对应DNA分子，所述mRNA分子不包含内含子。额外的编码或非编码序列可能但不是必要存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可能但不是必要与其他分子和/或支持物质连接。
多核苷酸可能包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源性序列)或可能包含所述序列的变体。多核苷酸变体包含一或多个取代、添加、缺失和/或插入，以使所述被编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不被减少。对所述被编码的多肽的免疫反应性的影响通常是如此处所述检测。变体优选地展现与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列具有至少约70％的相同性，更优选地至少约80％的相同性，甚至更优选地至少约90％的相同性及最优选地至少约95％的相同性。
若两个多核苷酸或多肽序列如下所述对齐以得到最高对应性时所述两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则所述两个序列被称为“相同(identical)”。两序列之间的比较通常通过在比较窗中比较序列加以进行，以识别及比较具有序列相似性的局部区域。此处所使用的“比较窗(comparison window)”是指至少约20个、通常30个至约75个、或40个至约50个连续位置的区段，在所述窗中一序列可与具有相同连续位置数量的参考序列在所述两序列经最佳对齐后比较。
供比较的序列的最佳比对可使用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)使用内建参数进行。此程序具体表现了下列文献中描述的数种比对法：Dayhoff,M.O.,1978,Amodel of evolutionary change in proteins-Matricesfor detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of ProteinSequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DCVol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment andPhylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,SanDiego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Mμller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,FreemanPress,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730。
优选地，“序列相同性的百分比(percentage of sequence identity)”是通过在至少20个位置的比较窗中比较两个经最佳对齐的序列加以决定，其中在比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分相较于供两序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)可能包含20％或低于20％、通常5％至15％、或10％至12％的添加或缺失(即缺口)。百分比的计算是通过测定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以得到匹配位置的数目，将所述匹配位置的数目除以参考序列的位置总数(即窗的大小)，并将所述结果乘以100以得到序列相同性的百分比。
变体还可或替代地与天然基因或其部分或互补物实质上同源。这些多核苷酸变体能在中度严谨度条件下与编码天然抗体的天然发生的DNA序列(或互补序列)杂交。
合适“中度严谨度条件”包括在5X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预先洗涤；于50℃至65℃5X SSC中过夜杂交；随后在65℃下各以含有0.1％SDS的2X、0.5X及0.2X SSC洗涤20分钟两次。
如本文中所使用，“高度严谨条件”或“高严谨度条件”是指：(1)采用低离子强度及高温清洗，例如于50℃的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二基硫酸钠；(2)在42℃的杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/含有750毫摩尔浓度(mM)氯化钠、75mM柠檬酸钠的pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺；或(3)于42℃采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声波化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％ SDS及10％硫酸葡聚糖，并于42℃以0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)清洗及于55℃以50％甲酰胺清洗，之后于55℃以含有EDTA的0.1x SSC进行高严谨度清洗。本领域技术人员将知道如何视需要调整温度、离子强度等条件以配合像是探针长度的因素及类似因素。
本领域技术人员将了解的是，由于基因密码简并的结果，有许多核苷酸序列编码本文所描述的多肽。这些多核苷酸中有些与任何天然基因的核苷酸序列具有极低的同源性。然而，本发明特别考虑到因使用不同的密码子而有所差异的多核苷酸。另外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因是属于本发明的范围内。等位基因是因为一或多个突变，诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代而被改变的内源性基因。所述形成的mRNA及蛋白质可能但不一定具有被改变的结构或功能。等位基因可利用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)加以识别。
本发明的多核苷酸可利用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域所广为周知的，不须在本文详细说明。本领域技术人员可利用本文所提供的序列及商用DNA合成仪产生所需的DNA序列。
在利用重组方法制备多核苷酸时，包含所需序列的多核苷酸可被插入适当的载体中，以及所述载体接着可被导入适当的宿主细胞以供复制及扩增，在下面进一步讨论。多核苷酸可通过本领域所知的任何方法被插入宿主细胞中。细胞的转化是通过直接摄取、内吞作用、转染、F交配(F-mating)或电穿孔导入外源性多核苷酸。一旦导入后，所述外源性多核苷酸可以非整合性载体(诸如质粒)或整合至所述宿主细胞的基因组中而被维持于所述细胞内。经此放大的多核苷酸可利用本领域所众所周知的方法自所述宿主细胞分离。见例如Sambrook et al.,1989。
替代地，PCR允许复制DNA序列。PCR技术是本领域所广为周知的，且于美国专利第4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202号及PCR:The Polymerase ChainReaction,Mμllis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可通过使用适当载体中经分离的DNA且将其插入合适的宿主细胞中获得。当细胞复制且DNA被转录成为RNA时，接着可使用本领域技术人员所广为周知的方法分离RNA，例如于Sambrook et al.,1989(同上)所述。
载体
合适的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域为数众多的可用克隆载体。虽然所述被选择的克隆载体可能因所意图使用的宿主细胞而异，适用的克隆载体通常具有自我复制的能力、可能具有特定限制内切酶的单一靶标和/或可能带有可用于选择含有所述载体的克隆的标志物基因。适当实例包括质粒及细菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体诸如pSA3及pAT28。这些及许多其他克隆载体可购自商业卖方诸如BioRad、Stratagene及Invitrogen。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。这表示表达载体必需能在宿主细胞中以附加体或染色体DNA的组成部分被复制。合适表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺病毒相关病毒、反转录病毒)、粘粒及PCT公开号WO87/04462中所公开的表达载体。载体组分通常包括但不限于下列一或多项：信号序列、复制起点、一或多种标志物基因、合适转录控制组件(诸如启动子、增强子及终止子)。就表达(即翻译)而言，通常也需要一或多种翻译控制组件，诸如核糖体结合位置、翻译起始位置及终止密码子。
含有感兴趣的多核苷酸的载体可通过任何适当的方法导入宿主细胞，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染、微粒轰击、脂质体(lipofection)转染及感染(例如载体为感染性试剂诸如牛痘病毒)。导入载体或多核苷酸的选择通常将视所述宿主细胞的特征而定。
宿主细胞
本发明还提供包含本文所述的任何多核苷酸的宿主细胞。任何能过表达异源性DNA的宿主细胞可被使用以分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa及CHO细胞。还见PCT公开号WO 87/04462。合适非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌(B.subtillis))及酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，宿主细胞以相较于对应的感兴趣的内源性抗体或蛋白质(若存在于宿主细胞)中高出约5倍、更优选为高出10倍、甚至更优选为高出20倍的水平表达cDNA。筛选与B7-H4或B7-H4结构域(例如结构域1至4)特异性结合的宿主细胞是利用免疫测定或FACS进行。可识别过表达感兴趣的抗体或蛋白的细胞。
蛋白表达和/或递送
表达载体可用于直接表达B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体。本领域技术人员通晓施用表达载体以获得外源性蛋白于体内的表达。见例如美国专利第6,436,908、6,413,942及6,376,471号。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、粒子枪或经导管施用及表面施用。在另一个实施方案中，所述表达载体是直接施用至交感神经干或神经节，或施用至冠状动脉、心房、心室或心包膜中。
还可使用靶向性递送含有表达载体的治疗性组合物或次基因组多核苷酸。受体介导性DNA递送技术是描述于例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11:202；Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct GeneTransfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu et al.,J.Biol.Chem.,263:621,1988；Wu et al.,J.Biol.Chem.,269:542,1994；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3655,1990；及Wu et al.,J.Biol.Chem.,266:338,1991。含有多核苷酸的治疗性组合物是以约100ng至约200mg的DNA范围施用以供基因治疗计划中的局部施用。约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μg的DNA浓度范围还可被用于基因治疗计划。治疗性多核苷酸及多肽可使用基因递送载具递送。基因递送载具可以是病毒性或非病毒性来源(通常见Jolly,Cancer Gene Therapy,1:51,1994；Kimura,Human Gene Therapy,5:845,1994；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1:185；及Kaplitt,Nature Genetics,6:148,1994)。此类编码序列的表达可使用内源性哺乳动物或异源性启动子诱导。编码序列的表达可以是组成性或经调节的。
用于递送所需多核苷酸及在所需细胞中表达的基于病毒的载体是本领域所熟知的。示例性基于病毒的载具包括但不限于重组反转录病毒(见例如PCT公开号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美国专利第5,219,740及4,777,127号、GB专利第2,200,651号及EP专利第0 345 242号)、基于甲病毒属的载体(例如Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532))及腺相关病毒(AAV)载体(见例如PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769、WO93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)。施用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147所述的与死腺病毒连接的DNA也可被采用。
还可采用非病毒性递送载具及方法，包括但不限于不论有无与单独死腺病毒连接的被聚阳离子缩合的DNA(见例如Curiel,Hum.Gene Ther.,3:147,1992)、与配体连接的DNA(见例如Wu,J.Biol.Chem.,264:16985,1989)、真核细胞递送载具细胞(见例如美国专利第5,814,482号、PCT公开号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763及WO 97/42338)及核电荷中和或与细胞膜融合。裸DNA也可被采用。示范性裸DNA导入方法是于PCT公开号WO 90/11092及美国专利第5,580,859号中描述。可用来作为基因递送载具的脂质体描述于美国专利第5,422,120号、PCT公开号WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445及EP 0524968。其他方法描述于Philip,Mol.Cell Biol.,14:2411,1994及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:1581,1994中。
ATCC保藏物
本发明的代表性材料是于2020年6月19日保藏于美国菌种保存中心(ATCC)。ATCC编号PTA-126779的载体含有编码双特异性抗体1167的全长第一重链(B7-H4臂)的多核苷酸。ATCC编号PTA-126781的载体含有编码双特异性抗体1167的全长第一轻链(B7-H4臂)的多核苷酸。ATCC编号PTA-126780的载体含有编码双特异性抗体1167的全长第二重链(CD3臂)的多核苷酸。ATCC编号PTA-126782的载体含有编码双特异性抗体1167的全长第二轻链(CD3臂)的多核苷酸。
这些保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定及其细则(布达佩斯条约)进行。此确保自保藏日开始30年内维持存活的保藏物培养物。所述保藏物将依照布达佩斯条约的规定由ATCC提供，且将受限于辉瑞(Pfizer,Inc.)与ATCC的合约，所述合约确保当授权相关美国专利或公开任何美国或外国专利申请案时(以先到者为主)，所述保藏物的培养子代可永久且不受限制地供公众使用，且确保由美国专利商标局专员依据35U.S.C.122及所述专员据此制定的法则(包括37C.F.R.1.14，特别参照886OG 638)判定有权获得所述子代者的可得性。
本申请案的代理人同意，若所述保藏中的材料的培养物在适当条件培养下死亡或遗失或毁损，一经通知应立即以另一相同材料置换所述材料。不得将所述保藏材料的可得性视为可借以实施本发明而侵犯由任何政府机关依据所述国专利法所授予的权利的许可。
制备本发明的抗体的方法
本发明的抗体可通过所属技术领域中已知及如本文所述的任何方法制备。
例如，本文所述的B7-H4抗体可使用本领域已知的方法识别或表征，由此检测和/或测量与B7-H4的结合。在一些实施方案中，B7-H4抗体是通过进行候选试剂与B7-H4的结合测定来识别。结合测定可使用被纯化的B7-H4多肽或使用天然表达或被转染以表达B7-H4多肽的细胞实施。在一个实施方案中，结合测定是竞争性结合测定，其中评估候选抗体与已知B7-H4抗体竞争B7-H4结合的能力。测定可以各种形式实施，包括ELISA形式。
在初步识别之后，候选B7-H4抗体的活性可通过已知测试靶向性生物活性的生物测定进一步证实及精细化。替代地，生物测定可用于直接筛选候选物。若干用于识别及表征抗体的方法详细描述于实施例中。
B7-H4抗体可使用本领域众所周知的方法表征。举例来说，一种方法是识别其所结合的表位，或称“表位定位”。本领域有许多已知的用于定位及特征化蛋白质上表位的位置的方法，包括解出抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定及合成性基于肽的测定，例如于Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章所述。在额外实例中，表位定位可用于测定与抗体结合的序列。表位定位可自不同的商业来源获得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219PH Lelystad,The Netherlands)。表位可以是线性表位(即包含于单一氨基酸片段中)，或由不一定包含在单一片段中的氨基酸的三维相互作用所形成的构象表位。各种长度的肽(例如至少4至6个氨基酸长)可被分离或合成(例如重组合成)且与B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体用于结合测定。在另一实例中，与B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体结合的表位可于系统性筛选中通过使用衍生自B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原序列的重迭肽并测定与B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体的结合来测定。根据基因片段表达测定，将编码B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原的开放阅读框随机或按特定基因构建物分段，且测定被表达的B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原片段与待测试的抗体的反应性。基因片段举例来说可通过PCR产生，接着于体外在放射性氨基酸存在下被转录及翻译成蛋白质。抗体与被放射性标示的B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原片段的结合接着通过免疫沉淀及胶体电泳测定。某些表位还可通过使用在噬菌体颗粒(噬菌体库)的表面上所展示的随机肽序列的大型库来识别。替代地，可在简单结合测定中测试被定义的重迭肽片段库与测试抗体的结合。在额外实例中，可实施抗原结合结构域的突变形成、结构域交换实验及丙氨酸筛选突变形成以识别表位结合所需、足够和/或必要的残基。举例来说，结构域交换实验可使用突变B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原实施，其中B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原蛋白的各种片段已经来自另一物种(例如小鼠)的B7-H4的序列或密切相关但抗原性不同的蛋白(例如B7-H3)取代(交换)。通过评估抗体与突变B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原的结合，可评估特定B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原片段对抗体结合的重要性。
另一可用于表征B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体的方法是使用已知和相同抗原(即B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原的各种片段)结合的其他抗体的竞争测定，以测定B7-H4、CD3或其他肿瘤抗原抗体是否与和其他抗体相同的表位结合。竞争测定为本领域技术人员所熟知。
药物组合物及制剂
本发明提供包含有效量的本发明的B7-H4抗体或B7-H4xCD3双特异性抗体的药物组合物。药物组合物可以是各种制剂。
可使用本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的各种制剂施用。在一些实施方案中，可仅施用抗体。在一些实施方案中，抗体及药学上可接受的赋形剂可以是各种制剂。药学上可接受的赋形剂为本领域所知。合适赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿及乳化剂、用于改变渗透性的盐类、包封剂、缓冲剂及皮肤穿透增进剂。用于肠胃外及非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Mack Publishing,2005。在一些实施方案中，这些试剂(赋形剂)被配制为供注射施用(例如腹膜内、静脉、皮下、肌肉内等)。因此，这些试剂可与药学上可接受的载具(诸如盐水、Ringer氏液、葡萄糖溶液及类似物)组合。特定给药方案(即剂量、时间及重复性)将依特定对象及所述对象的医学病史而定。
本发明的根据本发明的方法所使用的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的治疗性制剂是通过混合具有所需纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)来制备成供储存的冷冻干燥制剂或水性溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性且可包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子性表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的脂质体是通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688,1985；Hwang,etal.,Proc.Natl Acad.Sci.USA77:4030,1980；及美国专利第4,485,045号及第4,544,545号所述。循环时间延长的脂质体公开于美国专利第5,013,556号。特别有用的脂质体可通过逆相蒸发方法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所需直径的脂质体。
所述活性成分还可被包封于通过例如凝聚技术或通过界面聚合化所制备的微胶囊中，例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、纳米微粒及纳米胶囊)或于巨乳化液中。这些技术公开于Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,MackPublishing,2005。
可制备持续释放性制备物。持续释放制备物的适当实例包括含有所述抗体的固相疏水性聚合物的半透性基体，所述基体是呈成型制品的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(包含乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
欲用于体内施用的制剂必须为无菌。此可轻易地通过例如无菌过滤膜的过滤达成。本发明组合物的治疗性抗体(例如B7-H4抗体，包括B7-H4xCD3双特异性抗体)通常被置放于具有无菌接口的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
本发明的组合物可呈单位剂量形式，诸如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液、或悬浮液，或栓剂，对于供口服、肠胃外或经直肠施用，或通过吸入或喷入施用。
为了制备固体组合物诸如片剂，主要活性成分是与药学载体(例如常用的制锭成分诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶)及其他药学稀释剂(例如水)混合，以形成含有本发明的化合物或其非毒性药学上可接受的盐的均质混合物的固体预配制组合物。当提到这些预配制组合物为均质，表示所述活性成分是均匀分散于所述组合物内，以使所述组合物可被轻易地细分为同样有效的单位剂量形式诸如片剂、丸剂及胶囊。此固体预配制组合物接着被细分为上述类型的单位剂量形式，其含有自0.1至约500mg的本发明的活性成分。所述新颖组合物的片剂或丸剂可被包覆或被其他方式复合以提供具有长效优点的剂型。举例来说，片剂或丸剂可包含内部剂量及外部剂量组分，后者是呈包封前者的形式。两种组分可以肠溶层分开，所述肠溶层用来抵抗胃中的崩解，以使所述内部组分完整通过到达十二指肠或被延迟释放。多种物质可被用于所述肠溶层或包衣，这些物质包括多种聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸腊醇及醋酸纤维素的物质的混合物。
适当的表面活性剂包括特别是非离子性剂，诸如聚氧乙烯失水山梨醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他失水山梨醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。含有表面活性剂的组合物将方便地包含自0.05至5％的表面活性剂，且可介于0.1至2.5％。将了解若需要的话可添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载具。
适当的乳液可利用自商业途径获得的脂质乳液制备，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。活性成分可被溶解于预先混合的乳液组合物中，或替代地可被溶解于油中(例如大豆油、红花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)且在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合时形成乳液。将了解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以调整所述乳液的张力。适当的乳液通常将含有最高20％例如介于5至20％的油。所述脂肪乳液可包含介于0.1至1.0μm，特别是0.1至0.5μm的脂肪液滴，且具有介于5.5至8.0的pH。
乳液组合物可以是所述些通过混合B7-H4抗体(包括本发明的B7-H4xCD3双特异性抗体)与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备者。
用于吸入或喷入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液，以及粉末。所述液体或固体组合物可能包含如前述的适当的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物是以经口或经鼻呼吸途径施用以提供局部或全身效应。在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体来喷雾化。经喷雾化的溶液可从喷雾装置直接吸入，或喷雾装置可与面罩、帐或间歇性正压呼吸器连接。溶液、悬浮液或粉末组合物可自装置优选地经口或经鼻施用，所述装置以适当方式递送制剂。
使用本发明的抗体的方法
本发明的抗体可用于许多应用，包括但不限于治疗性处理方法及诊断性处理方法。
治疗性处理：
在一个方面中，本发明提供一种用于治疗对象的与B7-H4表达相关联的病况的方法。在另一个方面中，本发明提供本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)或包含B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的药物组合物，用于治疗对象的与B7-H4表达相关联的病况。在一些实施方案中，治疗对象的与B7-H4表达相关联的病况的方法包含向有此需要的对象施用有效量的药物组合物，其包含本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)。在一些实施方案中，病况是癌症。如本文中所使用，癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、子宫癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、血癌、甲状腺癌、胸腺癌、眼癌及皮肤癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、膀胱癌、子宫的癌症或卵巢癌。
在一些实施方案中，提供一种方法及B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)或药物组合物，用于(1)抑制具有表达B7-H4的恶性细胞的对象的肿瘤生长或进展、(2)抑制对象的表达B7-H4的细胞转移或(3)诱导对象的恶性细胞肿瘤消退，其包含向有此需要的对象施用有效量的包含如本文所述的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的药物组合物。
在一些实施方案中，提供一种方法及B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)或药物组合物，用于治疗对象的自身免疫疾病的，其包含向有此需要的对象施用有效量的包含如本文所述的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的药物组合物。如本文中所使用，自身免疫病症包括但不限于：全身性红斑性狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病(第一型)、多发性硬化症、Addison氏病、乳糜泻、皮肌炎、Graves氏病、桥本氏甲状腺炎、桥本氏脑病变、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、Sjogren氏综合征、急性播散性脑脊髓炎、低丙种球蛋白血症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特异反应性过敏、过敏性皮肤炎、自身免疫性肠病变、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性黄体酮皮肤炎、自身免疫性血小板减少紫瘢病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、Bechet氏病、Castleman氏病、冷凝集素症、Crohn氏病、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、Goodpasture氏综合征、Guillain-Barré综合征、化脓性汗腺炎、自发性血小板减少紫瘢病、嗜睡症、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、原发性胆道性肝硬化、复发性多软骨炎、风湿热、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织疾病、血管炎及Wegener氏肉芽肿病。
诊断性处理：
在另一个方面中，本发明提供一种检测、诊断和/或监测与B7-H4表达相关联的病况的方法。举例来说，本文所述的B7-H4抗体，包括B7-H4xCD3双特异性抗体，可被可检测的部分(诸如显影剂及酶-底物标签)标记。本文所述的抗体还可被用于体内诊断性试验，诸如体内成像(例如PET或SPECT)或染色试剂。替代地，方法可用于体外或离体诊断测定。
在一个方面中，提供如本文所述的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)，其用于诊断、优选地用于诊断与B7-H4表达相关联的病况。
递送途径：
本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)可经由任何合适途径向个体施用。因此在一些实施方案中，抗体是根据已知方法向个体施用，诸如静脉内施用例如推注(bolus)或在一段时间内连续输注、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内、颅内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经吹入、鞘内、经口、吸入或表面途径。施用可以是全身的例如静脉内施用或局部施用。自商业途径获得的液体制剂喷雾器(包括喷射喷雾器及超声波喷雾器)可用于施用。液体制剂可经直接喷雾，冷冻干燥的粉末可在重建(reconstitution)后经喷雾施用。替代地，抗体可使用碳氟制剂及定量吸入器气雾化或作为经冷冻干燥及磨细的粉末吸入。
在一个实施方案中，抗体是经定点或靶向性局部递送技术施用。定点或靶向性局部递送技术的实例包括各种抗体的可植入式贮剂来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管、或针头导管、合成性移植物、外膜层包覆、分流器及支架或其他可植入式装置、定点载体、直接注射或直接施用。见例如PCT公开号WO 00/53211及美国专利第5,981,568号。
剂量：
本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)可使用任何合适方法施用，包括注射(例如腹腔注射、静脉注射、皮下注射、肌肉注射等)。抗体还可经由本文所述的吸入施用。通常以施用抗体而言，初始候选剂量可以是约2mg/kg。以本发明的目的而言，典型每日剂量的范围可根据上述因素自约任何3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或超过100mg/kg。举例来说，可使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg及约25mg/kg的剂量。视病况而在数天或更久期间内重复施用时，所述治疗是持续进行直到发生所需的症状抑制或达成足够的治疗水平，例如抑制或推迟肿瘤生长/进展或癌细胞转移。示例性给药方案包含施用初始剂量约2mg/kg的抗体，随后每周约1mg/kg的维持剂量，或随后隔一周约1mg/kg的维持剂量。其他示例性给药方案包含施用增加的剂量(例如初始剂量1mg/kg，逐渐增加至每周或更长期间给予一或多个更高的剂量)。其他给药方案还可根据医师所希望达成的药物动力学衰减模式使用。举例来说，在一些实施方案中，考虑每周给药一至四次。在其他实施方案中，考虑每月给药一次或隔月或每三个月给药一次。此治疗的进展可通过常规技术及检测加以轻易地监测。抗体的给药方案可随时间而异。
以本发明的目的而言，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的适当剂量将取决于待治疗的症状的类型及严重性、所述药剂是否以治疗性目的施用、先前疗法、患者的临床病史及对所述药剂的反应、患者清除经施用的药剂的速率及主治医师的考虑。通常医师将施用抗体直到达到可完成所需结果的剂量。剂量和/或频率可依治疗疗程而异。经验性考虑(诸如半衰期)通常将影响剂量的决定。举例来说，可相容于人免疫系统的抗体诸如人源化抗体或全人抗体可被用以延长所述抗体的半衰期及防止所述抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可在疗程当中决定及调整，以及通常但不一定基于症状的治疗和/或压制和/或改善和/或推迟，例如肿瘤生长抑制或推迟等。替代地，抗体的持续性连续释放制剂可以是适当的。各种用于达成持续释放的制剂及装置是本技术领域所知。
在一个实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的剂量在已经给予一或多次抗体施用的个体中可凭经验决定。可给予个体渐增剂量的抗体。为了评估疗效，可追踪疾病的指标。
根据本发明的方法施用本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)可以是连续性或间歇性的，取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性或预防性及本领域技术人员所知的其他因素。抗体的施用可以是基本上连续一段预先选择的时间，或可以是一系列间隔剂量。
在一些实施方案中，可存在超过一种本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多的B7-H4抗体，包括B7-H4xCD3双特异性抗体。通常，所述些抗体可具有不互相不良影响的互补活性。举例来说，可使用下列抗体的一或多者：针对B7-H4或CD3的一种表位的第一B7-H4或CD3抗体及针对B7-H4或CD3的不同表位的第二B7-H4或CD3抗体。
组合
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)可与一或多种额外治疗剂的施用组合施用。额外治疗剂包括但不限于生物治疗剂和/或化学治疗剂，诸如但不限于疫苗、基于CAR-T细胞的疗法、放射疗法、细胞因子疗法、CD3双特异性抗体、其他免疫抑制途径抑制剂、血管生成抑制剂、T细胞活化剂、代谢途径抑制剂、mTOR抑制剂、腺苷途径抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于Inlyta、ALK抑制剂及舒尼替尼(sunitinib)、BRAF抑制剂、表观遗传修饰剂、IDO1抑制剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、生物治疗剂(包括但不限于抗VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生长因子受体、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB、TIGIT及ICOS的抗体)、免疫原性剂(例如减弱的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞诸如以肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNα2、GM-CSF)及被编码免疫刺激细胞因子诸如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞)。
生物治疗剂的实例包括治疗性抗体、免疫调节剂及治疗性免疫细胞。
治疗性抗体可具有针对多种不同抗原的特异性。例如，治疗性抗体可针对肿瘤相关抗原，以使抗体与抗原的结合促进表达抗原的细胞的死亡。在其他实例中，治疗性抗体可针对在免疫细胞上的抗原(例如PD-1)，以使抗体的结合预防表达抗原的细胞的活性下调(且由此促进表达抗原的细胞的活性)。在一些状况中，治疗性抗体可经由多种不同机制作用(例如，其可i)促进表达抗原的细胞的死亡，及ii)预防抗原造成与表达抗原的细胞接触的免疫细胞的活性下调)。
治疗性抗体可针对例如以下列出的抗原。以一些抗原而言，以下还包括针对抗原的示例性抗体(在抗原后的方括号/圆括号中)。以下的抗原在本文中还可称为“靶抗原”或类似物。本文所述的治疗性抗体的靶抗原包括例如：4-1BB(例如utomilumab)；5T4；A33；α-叶酸受体1(例如，mirvetuximab soravtansine)；Alk-1；B7-H4[例如，PF-06863135(见US9969809)]；BTN1A1(例如见WO2018222689)；CA-125(例如，阿巴伏单抗(abagovomab))；碳酸酐酶IX；CCR2、CCR4(例如，mogamulizumab)；CCR5(例如，leronlimab)；CCR8；CD3[例如，博纳吐单抗(blinatumomab)(CD3/CD19双特异性)、PF-06671008(CD3/P-钙粘素双特异性)、PF-06863135(CD3/B7-H4双特异性)]；CD19(例如，博纳吐单抗、MOR208)；CD20(例如，替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、obinutuzumab、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、乌妥昔单抗(ublituximab))；CD22(inotuzumab ozogamicin、moxetumomabpasudotox)；CD25；CD28；CD30(例如，本妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin))；CD33(例如，吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin))；CD38(例如，达雷木单抗(daratumumab)、isatuximab)、CD40；CD-40L；CD44v6；CD47；CD52(例如，阿来组单抗(alemtuzumab))；CD63；CD79(例如，保纳珠单抗维多汀(polatuzumab vedotin))；CD80；CD123；CD276/B7-H3(例如，奥姆单抗(omburtamab))；CDH17；CEA；ClhCG；CTLA-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab))、CXCR4；桥粒芯蛋白4；DLL3(例如，洛伐妥珠单抗特西林(rovalpituzumab tesirine))；DLL4；E-钙粘素；EDA；EDB；EFNA4；EGFR(例如，西妥昔单抗(cetuximab)、德帕妥昔珠单抗莫福汀(depatuxizumab mafodotin)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、帕尼单抗(panitumumab))；EGFRvIII；内皮唾液酸蛋白(Endosialin)；EpCAM(例如，奥普珠单抗莫那毒素(oportuzumab monatox))；FAP；胎儿乙酰胆碱受体；FLT3(例如见WO2018/220584)；GD2(例如，地努图希单抗(dinutuximab)、3F8)；GD3；GITR；GloboH；GM1；GM2；GUCY2C(例如，PF-07062119)；HER2/neu[例如，马格土希单抗(margetuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)；ado-曲妥珠单抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗度卡玛辛(trastuzumabduocarmazine)、PF-06804103(见US8828401)]；HER3；HER4；ICOS；IL-10；ITG-AvB6；LAG-3(例如，瑞拉单抗(relatlimab))；Lewis-Y；LG；Ly-6；M-CSF[例如，PD-0360324(见US7326414)]；MCSP；间皮素(mesothelin)；MUC1；MUC2；MUC3；MUC4；MUC5AC；MUC5B；MUC7；MUC16；Notch1；Notch3；连接蛋白-4(例如，因福土单抗维多汀(enfortumab vedotin))；OX40[例如，PF-04518600(见US7960515)]；P-钙粘素(P-Cadherein)[例如，PF-06671008(见WO2016/001810)]；PCDHB2；PD-1[例如，BCD-100、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、赛米单抗(cemiplimab)、杰诺珠单抗(genolimzumab)(CBT-501)、MEDI0680、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、萨善利单抗(sasanlimab)(见WO2016/092419)、信迪利单抗(sintilimab)、斯巴达利珠单抗(spartalizumab)、STI-A1110、替雷利珠单抗、TSR-042]；PD-L1(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559(MDX-1105)或LY3300054)；PDGFRA(例如，奥拉单抗(olaratumab))；浆细胞抗原；PolySA；PSCA；PSMA；PTK7[例如，PF-06647020(见US9409995)]；Ror1；SAS；SCRx6；SLAMF7(例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab))；SHH；SIRPa(例如，ED9、Effi-DEM)；STEAP；TGF-β；TIGIT；TIM-3；TMPRSS3；TNF-α前体；TROP-2(例如，萨西土珠单抗戈维特坎(sacituzumab govitecan))；TSPAN8；VEGF(例如，贝伐珠单抗(bevacizumab)、布罗卢西珠单抗(brolucizumab))；VEGFR1(例如，兰尼单抗(ranibizumab))；VEGFR2(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰比珠单抗)；Wue-1。
免疫调节剂包括可刺激对象中免疫反应的多种不同分子类型，诸如模式识别受体(PRR)激动剂、免疫刺激细胞因子及癌症疫苗。
模式识别受体(PRR)是由免疫系统的细胞表达的受体，其识别与病原体和/或细胞损害或死亡相关联的多种分子。PRR涉及先天免疫反应及适应性免疫反应两者。PRR激动剂可用于刺激对象的免疫反应。有多种类型的PRR分子，包括toll样受体(TLR)、RIG-I样受体(RLR)、核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NLR)、C型凝集素受体(CLR)及干扰素基因的刺激因子(STING)蛋白。
术语“TLR”及“toll样受体”是指任何toll样受体。toll样受体是涉及活化免疫反应的受体。TLR识别例如在微生物中表达的病原体相关分子模式(PAMP)以及自死亡或死亡中的细胞释放的内源性损害相关分子模式(DAMP)。
活化TLR(且由此活化免疫反应)的分子在本文中称为“TLR激动剂”。TLR激动剂可包括例如小分子(例如分子量小于约1000道尔顿的有机分子)以及大分子(例如寡核苷酸及蛋白)。一些TLR激动剂对单一类型的TLR(例如TLR3或TLR9)具特异性，而一些TLR激动剂活化二种或超过二种类型的TLR(例如TLR7及TLR8两者)。
本文提供的示例性TLR激动剂包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9的激动剂。
示例性小分子TLR激动剂包括例如公开于下者的那些：美国专利号4,689,338；4,929,624；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784；5,389,640；5,446,153；5,482,936；5,756,747；6,110,929；6,194,425；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064；6,541,485；6,545,016；6,545,017；6,573,273；6,656,938；6,660,735；6,660,747；6,664,260；6,664,264；6,664,265；6,667,312；6,670,372；6,677,347；6,677,348；6,677,349；6,683,088；6,756,382；6,797,718；6,818,650；及7,7091,214；美国专利公开号2004/0091491、2004/0176367及2006/0100229；及国际公开号WO 2005/18551、WO 2005/18556、WO2005/20999、WO 2005/032484、WO 2005/048933、WO 2005/048945、WO 2005/051317、WO2005/051324、WO 2005/066169、WO 2005/066170、WO 2005/066172、WO 2005/076783、WO2005/079195、WO 2005/094531、WO 2005/123079、WO 2005/123080、WO 2006/009826、WO2006/009832、WO 2006/026760、WO 2006/028451、WO 2006/028545、WO 2006/028962、WO2006/029115、WO 2006/038923、WO 2006/065280、WO 2006/074003、WO 2006/083440、WO2006/086449、WO 2006/091394、WO 2006/086633、WO 2006/086634、WO 2006/091567、WO2006/091568、WO 2006/091647、WO 2006/093514及WO 2006/098852。
小分子TLR激动剂的额外实例包括某些嘌呤衍生物(诸如描述在美国专利第6,376,501号及第6,028,076号中的那些)、某些咪唑喹啉酰胺衍生物(诸如描述在美国专利第6,069,149号中的那些)、某些咪唑并吡啶衍生物(诸如描述在美国专利第6,518,265号中的那些)、某些苯并咪唑衍生物(诸如描述在美国专利第6,387,938号中的那些)、某些4-氨基嘧啶融合至五员含氮杂环的衍生物(诸如美国专利第6,376,501号；第6,028,076号及第6,329,381号；及WO 02/08905中描述的腺嘌呤衍生物)及某些3-β-D-核呋喃糖基噻唑并[4,5-d]嘧啶衍生物(诸如描述在美国公开号2003/0199461中的那些)及某些小分子免疫增强剂化合物诸如描述于例如美国专利公开号2005/0136065中的那些。
示例性大分子TLR激动剂包括寡核苷酸序列。一些TLR激动剂寡核苷酸序列含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)且描述于例如美国专利第6,194,388号；第6,207,646号；第6,239,116号；第6,339,068号；及第6,406,705号。一些含CpG寡核苷酸可包括合成的免疫调控性结构基序诸如描述于例如美国专利第6,426,334号及第6,476,000号的那些。其他TLR激动剂核苷酸序列缺乏CpG序列且描述于例如国际专利公开号WO 00/75304。还有其他TLR激动剂核苷酸序列包括富含鸟苷及尿苷单链RNA(ssRNA)，诸如描述于例如Heil et ah,Science,vol.303,pp.1526-1529,Mar.5,2004中的那些。
其他TLR激动剂包括生物分子诸如氨基烷基氨基葡萄糖胺磷酸盐(AGP)且描述于例如美国专利第6,113,918号；第6,303,347号；第6,525,028号；及第6,649,172号。
TLR激动剂还包括失活病原体或其部分，其可活化多种不同类型的TLR受体。示例性病原体衍生性TLR激动剂包括BCG、奥布分枝杆菌(mycobacterium obuense)提取物、塔利拉维(Talimogene laherparepvec)(T-Vec)(衍生自HSV-1)及Pexa-Vec(衍生自牛痘病毒)。
在一些实施方案中，TLR激动剂可以是与TLR特异性结合的激动剂抗体。
RLR包括检测例如dsRNA的各种细胞溶质PRR。RLR的实例包括例如视黄酸诱导性基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)及遗传学及生理学实验室蛋白2(LGP2)。
如本文中所使用的“RLR激动剂”是指任何当与RLR结合时，(1)刺激或活化RLR，(2)增强、增加、促进、诱导或延长RLR的活性、功能或存在或(3)增强、增加、促进或诱导RLR表达的分子。可用于本发明的治疗方法、药物及用途中任一者的RLR激动剂包括例如结合RLR的核酸及其衍生物及与RLR特异性结合的激动性单克隆抗体(mAb)。
可用于本发明的治疗方法、药物及用途的RLR激动剂的实例包括例如具有未加帽5’三磷酸盐的短双链RNA(RIG-I激动剂)；聚I:C(MDA-5激动剂)及BO-112(MDA-A激动剂)。
NLR包括检测例如损害相关分子模式(DAMP)分子的各种PRR。NLR包括亚家族NLRA-A、NLRB-B、NLRC-C及NLRP-P。NLR的实例包括例如NOD1、NOD2、NAIP、NLRC4及NLRP3。
如本文中所使用的“NLR激动剂”是指任何当与NLR结合时，(1)刺激或活化NLR，(2)增强、增加、促进、诱导或延长NLR的活性、功能或存在或(3)增强、增加、促进或诱导NLR表达的分子。可用于本发明的治疗方法、药物及用途中任一者的NLR激动剂包括例如结合NLR的DAMP及其衍生物及与NLR特异性结合的激动性单克隆抗体(mAb)。
可用于本发明的治疗方法、药物及用途的NLR激动剂的实例包括例如脂质体胞壁酰三肽/米伐木肽(NOD2激动剂)。
CLR包括检测例如碳水化合物及糖蛋白的各种PRR。CLR包括跨膜CLR及分泌的CLR两者。CLR的实例包括例如DEC-205/CD205、巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、Dectin-1、Dectin-2、mincle、DC-SIGN、DNGR-1及甘露糖结合凝集素(MBL)。
如本文中所使用的“CLR激动剂”是指任何当与CLR结合时，(1)刺激或活化CLR，(2)增强、增加、促进、诱导或延长CLR的活性、功能或存在或(3)增强、增加、促进或诱导CLR表达的分子。可用于本发明的治疗方法、药物及用途中任一者的CLR激动剂包括例如结合CLR的碳水化合物及其衍生物及与CLR特异性结合的激动性单克隆抗体(mAb)。
可用于本发明的治疗方法、药物及用途的CLR激动剂的实例包括例如MD部分(来自多叶奇果菌(Grifola frondosa)的纯化的可溶性β-葡聚糖提取物)及imprime PGG(衍生自酵母的β1,3/1,6-葡聚糖PAMP)。
STING蛋白同时作用为第1型干扰素信号传导中的细胞溶质DNA传感器及衔接蛋白。术语“STING”及“干扰素基因刺激子”是指任何形式的STING蛋白以及保留STING的至少部分活性的变体、异构体及物种同源物。除非不同地指明诸如特别涉及人STING，否则STING包括所有哺乳动物物种的天然序列STING，例如人、猴及小鼠。一个示例性人TLR9是以UniProt登录号Q86WV6提供。STING又名TMEM173。
如本文中所使用的“STING激动剂”是指任何当与TLR9结合时，(1)刺激或活化STING，(2)增强、增加、促进、诱导或延长STING的活性、功能或存在或(3)增强、增加、促进或诱导STING表达的分子。可用于本发明的治疗方法、药物及用途中任一者的STING激动剂包括例如结合STING的核酸配体。
可用于本发明的治疗方法、药物及用途的STING激动剂的实例包括各种免疫刺激核酸，诸如合成双链DNA、环状二-GMP、环状-GMP-AMP(cGAMP)、合成环状二核苷酸(CDN)诸如MK-1454及ADU-S100(MIW815)及小分子诸如P0-424。
其他PRR包括例如DNA依赖性IFN调节因子活化蛋白(DAI)及黑色素瘤不存在蛋白2(AIM2)。
免疫刺激细胞因子包括刺激免疫反应的各种信号传导蛋白，诸如干扰素、白介素及造血生长因子。
示例性免疫刺激细胞因子包括GM-CSF、G-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL-2(例如地尼白介素-毒素连接物(denileukin difitox))、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及TNF-α。
免疫刺激细胞因子可具有任何合适形式。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可以是重组版本的野生型细胞因子。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可以是相较于对应野生型细胞因子具有一或多个氨基酸变化的突变蛋白。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可并入含有细胞因子及至少一个其他功能性蛋白(例如抗体)的嵌合蛋白中。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可共价连接至药物/药剂(例如本文他处所述的作为可能的ADC组分的任何药物/药剂)。
癌症疫苗包括含有肿瘤相关抗原的各种组合物(或其可用于在对象中产生肿瘤相关抗原)且因此可用于引起对象的将针对含有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的免疫反应。
可包括于癌症疫苗中的实例材料包括减毒的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞诸如被肿瘤衍生性抗原或编码肿瘤相关抗原的核酸脉冲的树突细胞。在一些实施方案中，癌症疫苗可使用患者自己的癌细胞制备。在一些实施方案中，癌症疫苗可使用不是来自患者自己的癌细胞的生物材料制备。
癌症疫苗包括例如sipuleucel-T及塔利拉维(talimogene laherparepvec)(T-VEC)。
免疫细胞疗法涉及使用能够靶向癌细胞的免疫细胞治疗患者。免疫细胞疗法包括例如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)及嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。
化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如塞替派(thiotepa)及环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busμlfan)、英丙舒凡(improsμlfan)及哌泊舒凡(piposμlfan)；氮环丙烷，诸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基优瑞多巴(meturedopa)及优瑞多巴(uredopa)；伸乙亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)及三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(特别是布拉他辛(bμllatacin)及布拉他辛酮(bμllatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1及念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；双联霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189及CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；珊瑚素(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogenmustard)诸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、依弗酰胺(ifosfamide)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、霉法兰(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷莫司汀(animustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡利奇霉素(calicheamicin)，特别是卡利奇霉素γ1I及卡利奇霉素phiI1，见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌素(neocarzinostatin)发色团及相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-侧氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括N-吗啉基-多柔比星、氰基N-吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星及脱氧多柔比星)、聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星(epirubicin)、伊索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、鸟苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺蝶呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲喋呤(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄性激素，诸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatrexate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗尼辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基尿素；香菇糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；类美坦素(maytansinoid)，诸如美坦素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(特别是T-2毒素、韦拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及安奎定(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；类紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(doxetaxel)；氯芥苯丁酸；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲胺蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依扥泊苷(etoposide)(VP-16)；依弗酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；截瘤达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；及药学上可接受的盐、酸或上述任一者的衍生物。还包括作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节雌激素在肾上腺中的产生，诸如例如4(5)-咪唑、胺鲁米特、甲地孕酮乙酸酯(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)及阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄性激素诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；KRAS抑制剂；MCT4抑制剂；MAT2a抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂诸如舒尼替尼(sunitinib)、阿西替尼(axitinib)；alk/c-Met/ROS抑制剂诸如克唑替尼(crizotinib)、洛拉替尼(lorlatinib)；mTOR抑制剂诸如坦罗莫司(temsirolimus)、吉达妥里斯(gedatolisib)；src/abl抑制剂诸如伯舒替尼(bosutinib)；周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂诸如帕博西尼(palbociclib)、PF-06873600；erb抑制剂诸如达可替尼(dacomitinib)；PARP抑制剂诸如他拉帕瑞(talazoparib)；SMO抑制剂诸如格拉斯代吉(glasdegib)、PF-5274857；EGFR T790M抑制剂诸如PF-06747775；EZH2抑制剂诸如PF-06821497；PRMT5抑制剂诸如PF-06939999；TGFRβr1抑制剂诸如PF-06952229；及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在具体实施方案中，此类额外治疗剂是贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西罗莫司(sirolimus)、帕尼单抗(panitumumab)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)、替沃扎尼(tivozanib)、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂、曲氟尿苷(trifluridine)、替吡嘧啶(tipiracil)、菊白叶酸(leucovorin)、吉西他滨(gemcitabine)、瑞格非尼(regorafinib)或埃罗替尼(erlotinib)盐酸盐。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)是与一或多种靶向免疫检查点调节剂或共刺激剂的其他治疗剂组合使用，诸如例如但不限于靶向下列的试剂：CTLA-4、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-DC(PD-L2)、B7-H5、B7-H6、B7-H8、B7-H2、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS-L、TIGIT、CD2、CD47、CD80、CD86、CD48、CD58、CD226、CD155、CD112、LAIR1、2B4、BTLA、CD160、TIM1、TIM-3、TIM4、VISTA(PD-H1)、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、4-1BB、4-BBL、DR3、TL1A、CD40、CD40L、CD30、CD30L、LIGHT、HVEM、SLAM(SLAMF1、CD150)、SLAMF2(CD48)、SLAMF3(CD229)、SLAMF4(2B4、CD244)、SLAMF5(CD84)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMCF7(CS1)、SLAMF8(BLAME)、SLAMF9(CD2F)、CD28、CEACAM1(CD66a)、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM1-3AS CEACAM3C2、CEACAM1-15、PSG1-11、CEACAM1-4C1、CEACAM1-4S、CEACAM1-4L、IDO、TDO、CCR2、CD39-CD73-腺苷途径(A2AR)、BTKs、TIKs、CXCR2、CXCR4、CCR4、CCR8、CCR5、CSF-1或先天免疫反应调节剂。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)与以下组合使用：例如抗CTLA-4拮抗剂抗体诸如例如伊匹单抗；抗LAG-3拮抗剂抗体诸如BMS-986016及IMP701；抗TIM-3拮抗剂抗体；抗B7-H3拮抗剂抗体诸如例如MGA271；抗VISTA拮抗剂抗体；抗TIGIT拮抗剂抗体；抗体；抗CD80抗体；抗CD86抗体；抗B7-H4拮抗剂抗体；抗ICOS激动剂抗体；抗CD28激动剂抗体；先天免疫反应调节剂(例如TLR、KIR、NKG2A)及IDO抑制剂。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)是与OX40激动剂(诸如例如抗OX-40促效抗体)组合使用。在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)是与GITR激动剂(诸如例如抗GITR激动抗体，诸如例如但不限于TRX518)组合使用。在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)是与IDO抑制剂组合使用。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体是与细胞因子疗法(诸如例如但不限于IL-15、CSF-1、MCSF-1等)组合使用。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)是与一或多种治疗性抗体(诸如例如但不限于靶向CD19、CD22、CD40、CD52或CCR4的抗体)组合使用。
在某些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的组合物包含至少一种额外的试剂，诸如贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximb)、西罗莫司(sirolimus)、帕尼单抗(panitumumab)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)、替沃扎尼(tivozanib)、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂、曲氟尿苷(trifluridine)、替吡嘧啶(tipiracil)、菊白叶酸(leucovori)、吉西他滨(gemcitabine)及埃罗替尼(erlotinib)盐酸盐。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)可与其他试剂治疗共施用，或依序在其他试剂治疗之前或之后间隔数分钟至数周不等施用。在其中其他试剂和/或蛋白质或多核苷酸分开施用的实施方案中，通常会确保在各次递送之间不会超过显著时间期间，使得本发明的试剂及所述组合物仍然能够对对象发挥有利的组合效应。在这种例子中，所考虑的是可将两种形态在彼此施用的约12至24h内且更优选的是在约6至12h内施用。然而在一些情况下，所需的可能是显著延长施用的时间期间，其中在各自施用之间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些实施方案中，本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的治疗方案是与进一步包含选自由手术、放射疗法、化学疗法、靶向性疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制及姑息疗法所组成的群组的传统疗法的治疗方案组合。
试剂盒
本发明还提供用于本方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一或多个容器，所述一或多个容器包含本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)及根据本文所述的本发明的任一方法的使用说明。通常，这些说明包含施用本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)以用于上述治疗性处理的描述。
有关使用如本文所述的本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)的说明通常包括用于所述意图治疗的剂量、给药计划及施用途径的信息。这些容器可以是单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒所提供的说明通常为在标签或包装插页上的书面说明(例如包含在试剂盒中的纸张)，但机器读取的说明(例如磁性或光学储存磁盘上携有的说明)也可被接受。
本发明的试剂盒被适当包装。合适包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、可弯折的包装(例如密封的密拉(Mylar)或塑料袋)、及类似物。还考虑的是与特殊装置组合使用的包装，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置诸如小型泵。试剂盒可能具有无菌接口(例如所述容器可能为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静注溶液袋或小瓶)。所述容器也可能具有无菌接口(例如所述容器可能为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静注溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的B7-H4抗体(包括B7-H4xCD3双特异性抗体)。所述容器可能另包含第二药学活性剂。
试剂盒可选地提供额外组分诸如缓冲剂及解释信息。通常，所述试剂盒包含容器及在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。
下列实施例仅作为示范提供，无意在任何方面限制本发明的范围。事实上，除了在本文显示及说明的多种改变之外，本发明的许多改变将为本领域技术人员自前述说明所显而易见且属于随附的权利要求的范围内。
实施例
实施例1.B7-H4抗体及B7-H4xCD3双特异性抗体的高通量表达及纯化。
使用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(Life Technologies)，将B7-H4同型二聚体抗体的互补构建体对(12.5μg的重链及轻链各者)共转染至含有1百万个细胞/ml的HEK 293细胞的25mL对数期培养物。在转染后24小时，添加ExpiFectamine转染增强子并允许细胞生长额外4至5天然后收集。接着收集用过的培养，离心以移除细胞残渣接着通过20μm过滤器。
接着使用蛋白A亲和性层析法纯化含有B7-H4同型二聚体的澄清条件培养基。使用液体处理器(Tecan)将样本装载至预先装填MabSelect SuReTM蛋白A树脂(GE Healthcare)的0.45mL微管柱(Repligen)上。经结合的蛋白用PBS pH7.2洗涤，接着用20mM柠檬酸、150mM氯化钠pH 3.5洗脱，并用2M tris,pH 8.0中和。使用分析型尺寸排阻色谱法，以在Aglient1200HPLC上的Mab HTP管柱(Tosoh Bioscience)遵照制造商规程分析蛋白纯度。通过使用微量分光亮度计(Trinean)测量OD280 nm来测定浓度。
CD3同型二聚体抗体是如上类似地制备且自如实施例2所述的2L培养纯化。简言之，根据制造商规程将2L的expi293细胞(Invitrogen)以0.5μg/ml的重链及轻链各者转染。在第5天收集条件培养基并通过MAB Select SuRe LX树脂(GE healthcare)捕获。
双特异性抗体是通过混合等摩尔量的B7-H4同型二聚体及CD3同型二聚体而形成，并将其与1mM GSH在37C下孵育24h。接着根据制造商方法，使用G25 Sephadex drip柱(GEHealthcare)将样本脱盐至PBS pH 7.2中。被控制的Fab臂交换(形成异二聚体)的效率是使用WCX柱(GE Healthcare)以浅层盐梯度(20mM MES pH 5.4,0-1M NaCl)分析。
表2的B7-H4抗体及表5的B7-H4xCD3双特异性抗体是根据本发明的方法制造。
实施例2.产生B7-H4xCD3双特异性抗体1167及1156。
将编码B7-H4xCD3双特异性抗体1167抗B7-H4臂重链(SEQ ID NO:196)、抗B7-H4轻链(SEQ ID NO:197)、B7-H4xCD3双特异性抗体1156抗B7-H4臂重链(SEQ ID NO:192)、抗B7-H4轻链(SEQ ID NO:193)、抗CD3臂重链(SEQ ID NO:194)及抗CD3轻链(SEQ ID NO:195)的cDNA克隆至哺乳动物表达载体中。将具有三个额外取代C223E、P228E及L368E(统称“EEE”)的抗B7-H4 IgG2 dA D265A重链及具有四个额外取代C223R、E225R、P228R、K409R(统称“RRR”)的抗CD3 IgG2 dA D265A与对应轻链一起转染，且整个“EEE”及“RRR”臂使用2L的expi293细胞(Invitrogen)根据制造商规程分开表达。用于转染的重链及轻链的DNA比例依重量计是1:1(1μg/ml的培养物，总DNA)。在第5天收集两种同型二聚体(RRR及EEE)的条件培养基并通过MAB Select SuRe LX树脂(GE healthcare)分开捕获。双特异性分子的异二聚化是使用来自mAb Select SuRe LX树脂的洗脱液在体外进行。简言的，RRR及EEE同型二聚体是分别在20倍及10倍摩尔过剩的半胱氨酸存在下以1:1摩尔比混合用于双特异性抗体1156及1167。将混合物溶液在室温pH 8.0下孵育18小时。将后氧化还原(post-RedOx)用50mM MES缓冲剂pH 5.6分别以1:4及1:9稀释用于双特异性抗体1156及1167，接着在室温下运行经过Mono-S管柱(CEX纯化，GE Healthcare Life Sciences)。将蛋白以阳离子交换洗脱缓冲剂(50mM MES,1000mM NaCl,pH 5.6)梯度洗脱脱离柱。纯化是在AKTAPure及Avant(GE Healthcare Life Sciences)上进行。最终缓冲剂交换成PBS-CMF(磷酸盐缓冲盐水；无钙及镁)是使用Sephadex G-25Fine(GE Healthcare Life Sciences)进行。蛋白定量是通过测量在280nm下的吸光度使用自氨基酸序列计算的摩尔吸收系数达成。
实施例3.测试针对板结合huB7-H4的IC50的竞争型ELISA
下表7中描述的种系化及优化变体的结合强度是通过与亲代B7-H4抗体0052或0058竞争在ELISA中评估。将ELISA板(Thermo Fisher；384孔)用1μg/mL(25μg/孔)的B7-H4胞外结构域(“ECD”)(6xhis F29-A258)于PBS缓冲剂中在4℃下轻柔震荡过夜涂布。将涂布溶液丢弃，且将板在室温下以每孔50μL PBS-1％ BSA阻断1h。将阻断溶液丢弃，且将板以TBST洗涤4次。制备经分析的mAb的一系列2倍稀释液并与对应生物素化B7-H4抗体0052(28D10优化系列)或B7-H4抗体0058(37D4优化系列)的EC80的浓度混合。将25μl被稀释的测试的mAb与生物素化亲代mAb的1:1混合物以两个重复添加至板。将板通过缓慢震荡在室温下孵育2小时。将板以每孔100μL的洗涤缓冲剂(TBST)洗涤4次，且用20μL被1:4000稀释于PBS/BSA缓冲剂中的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物孵育1小时。将板如之前洗涤7次且用20μL的TNB底物孵育10分钟。通过添加0.18M硫酸终止反应。接着遵照制造商规程使用
Figure SMS_27
板读取仪(/>
Figure SMS_28
Mμltilabel Plate Reader,Perkin Elmer)测量在450nm下的吸光度。亲代抗体0052及0058的EC80是通过在室温下以经如上述制备的人B7-H4 ECD涂布的板孵育生物素化的0052及0058来测定。制备抗体的一系列2倍稀释液并添加25μl至孔。在2h培育后，将板洗涤且用被1:4000稀释于PBS/BSA缓冲剂中的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物孵育，随后如上述洗涤并添加TNB底物。以0.18M硫酸终止反应，接着使用/>
Figure SMS_29
板读取仪(
Figure SMS_30
Mμltilabel Plate Reader,Perkin Elmer)测量在450nm下的吸光度。使用四参数非线性回归分析于Graphpad PRISM中计算EC80值。
根据此方法测试表2及表5所选择的抗体且所得数据显示于表7。
实施例4.亲和力捕捉自相互作用纳米粒子光谱学(AC-SINS)
抗体及抗体样蛋白具有与自己相互作用的可能性，特别是在增加浓度下。此自相互作用可导致在药物开发期间与制剂相关联的黏度挑战以及增加清除风险。(Avery etal.MAbs.2018；10(2):244-255)。AC-SINS测定度量自相互作用且是用于帮助预测高黏度及不良药物动力学性质的可能性。
AC-SINS测定在Perkin-Elmer Janus液体操作机器人上被标准化为384孔格式。20nm金纳米粒子(Ted Pella,Inc.,#15705)被80％山羊抗人Fc(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.#109-005-098)及20％非特异性山羊多克隆抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.#005-000-003)的混合物包被，所述混合物被缓冲剂交换成20mM乙酸钠pH 4.3且被稀释至0.4mg/ml。在室温下孵育一小时之后，金纳米粒子上未经占据的位点以硫醇化聚乙二醇(2kD)阻断。接着使用注射筒过滤器将经包被的纳米粒子浓缩10倍并将10μl添加至100μl的于PBS pH 7.2中的0.05mg/ml的mAb。将经包被的纳米粒子与感兴趣的抗体在96孔聚丙烯板中孵育2小时，接着转移至384孔聚苯乙烯板并在Tecan M1000分光光度计上读取。吸光度自450至650nm以2nm增量读取，且使用MicrosoftExcel宏识别最大吸光度、修匀数据及使用二阶多项式拟合数据。将抗体样本的修匀最大吸光度减去平均空白(单独PBS缓冲剂)的修匀最大吸光度以判定抗体AC-SINS分数。
根据此方法测试表2及表5所选择的抗体且所得数据显示于表7。
实施例5.DNA及胰岛素多特异性ELISA
将384孔ELISA板(Nunc Maxisorp)在4℃下以DNA(10μg/ml)及胰岛素(5μg/ml)于PBS pH 7.5中涂布过夜。ELISA(改编自Tiller et al.,J.Immunol.Methods 329,112,2008；美国专利第7,314,622号描述的测定)在PerkinElmer Janus液体操作机器人上进行。将孔用水洗涤，用50μl的多反应性ELISA缓冲剂(PEB；PBS含有0.5％ Tween-20,1mM EDTA)在室温下阻断1小时，且用水洗三次。将25μl经连续稀释的mAb以四个重复添加至孔且在室温下孵育1h。将板用水洗涤3次，且将25μl的与辣根过氧化酶(Jackson ImmunoResearch)缀合的10ng/ml山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)添加至各孔。将板在室温下孵育1h，用80μl的水洗涤3次，且将25μl的TMB底物(Sigma Aldrich)添加至各孔。反应在6分钟50秒之后通过添加25μl的0.18M正磷酸至各孔来停止且在450nm下读取吸光度。DNA及胰岛素结合分数是计算为10μg/ml的抗体的ELISA信号对含有缓冲剂的孔的信号的比例。测试表2及表5所选择的抗体以获得根据本文所述的DNA及胰岛素结合ELISA程序所显示其中的多特异性分数且数据显示于表7。
表7.B7-H4抗体和B7-H4xCD3双特异性抗体的竞争ELISA、AC-INS结果
Figure SMS_31
/>
Figure SMS_32
/>
Figure SMS_33
实施例6.差示扫描量热仪(DSC)分析
将抗体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液稀释成0.6mg/ml于400μl的体积中。PBS是用于参照池作为缓冲剂空白。PBS含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4及1.47mMKH2PO4,pH 7.2。样本利用自动取样器(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)分配至MicroCal VP-Capillary DSC的样本盘。样本是于10℃平衡5分钟，接着以每小时100℃的速率扫描至110℃。选择16秒的过滤期。原始数据是经基准校正，所述蛋白浓度是经标准化。Origin软件7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用于拟合所述数据至具有适当数量的转换(transition)的MN2-State模型。呈IgG1格式的优化抗B7-H4结合结构域的差示扫描热量法的结果显示于表8。
表8.在IgG1 mAb形式下由DSC优化的克隆的热稳定性
Figure SMS_34
Figure SMS_35
实施例7.B7-H4IgG1mAb的表面等离子体共振(SPR)分析
通过使用BIACORETM 8K仪器(GE Healthcare)的表面等离子体共振，评估获自杂交瘤的抗B7-H4克隆株的IgG1 mAb格式在25℃下与人B7-H4 ECD(胞外结构域)的结合。首先遵照制造商规程将抗人Fc(GE BR-1008-39)涂布在CM5传感器芯片上。使人抗B7-H4 IgG1 mAb以0.75μg/mL，50μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片20秒。接下来，允许人B7-H4 ECD的始于900nM(克隆株：7H7、33G4、11F12、33A4、13F4、37D4、19D3、27C12、42E2、28D10、46E10及32F3)及始于100nM(克隆株：29G6及47A1)的3倍稀释在5种不同浓度下通过以50μl/min运行通过芯片60秒来缔合，接着解离300秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GEHealthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。每次运行之间用3X 3M MgCl2再生芯片。结果显示于表9-A。
表9-A.25℃下通过SPR的IgG1形式的杂交瘤克隆与人B7-H4 ECD的结合的动力学
Figure SMS_36
通过使用BIACORETM 8K仪器(GE Healthcare)的表面等离子体共振，测试优化抗B7-H4抗体及对应亲代抗体的IgG1 mAb形式在37℃下与人B7-H4 ECD的结合。首先遵照制造商规程将抗人Fc(GE BR-1008-39)涂布在CM5传感器芯片上。使人抗B7-H4 IgG1 mAb以0.75μg/mL，50μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片30秒。接下来，允许人B7-H4 ECD的始于300nM的3倍稀释在5种不同浓度下通过以50μl/min运行通过芯片65秒来缔合，接着解离600秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。每次运行之间用3X 3M MgCl2以50μl/min再生芯片30秒。结果显示于表9-B。
表9-B.37℃下通过SPR的亲代及IgG1形式的优化抗体与人B7-H4 ECD的结合的动力学
Figure SMS_37
/>
Figure SMS_38
通过使用BIACORETM 8K仪器(GE Healthcare)的表面等离子体共振，测试优化抗B7-H4抗体及对应亲代抗体的IgG1 mAb形式在37℃下与食蟹猕猴及小鼠B7-H4 ECD的交叉反应性。首先遵照制造商规程将抗人Fc(GE BR-1008-39)涂布在CM5传感器芯片上。使人抗B7-H4 IgG1 mAb以0.75μg/mL，50μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片30秒。接下来，允许食蟹猕猴及小鼠B7-H4 ECD的始于900nM的3倍稀释在5种不同浓度下通过以50μl/min运行通过芯片65秒来缔合，接着解离600秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GEHealthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。每次运行之间用3X 3M MgCl2以50μl/min再生芯片30秒。结果显示于表9-C。
表9-C.37℃下通过SPR的亲代及IgG1形式的优化抗体与食蟹猕猴及小鼠B7-H4ECD的结合的动力学
Figure SMS_39
实施例8：B7-H4xCD3双特异性抗体的表面等离子体共振(SPR)分析
亲代杂交瘤克隆株的B7-H4xCD3双特异性抗体与人、食蟹猕猴及小鼠B7-H4 ECD的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在25℃或37℃下以10Hz的收集速率测定。首先遵照制造商规程将抗人Fc(GE BR-1008-39)涂布在CM5传感器芯片上。使B7-H4-CD3 IgG2 EEE/RRR双特异性抗体以0.5μg/mL，50μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片20至25秒。允许人、食蟹猕猴及小鼠B7-H4 ECD通过以50μl/min运行通过芯片65秒来缔合，接着解离300秒。使用5种不同浓度的抗原，以3倍稀释，食蟹猕猴始于400nM且人及小鼠抗原始于900nM。监测解离600秒且用3M MgCl2以50μl/min再生表面30秒共3次。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200Evaluation软件版本3.0(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-A。
表10-A.25℃或37℃下通过SPR的亲代双特异性抗体与人、食蟹猕猴及小鼠B7-H4ECD的结合的动力学
Figure SMS_40
亲代杂交瘤克隆株的B7-H4xCD3双特异性抗体与人及食蟹猕猴CD3的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在25℃下以10Hz的收集速率测定。首先遵照制造商规程将抗His(GE 10260125)涂布在CM5传感器芯片上。使人CD3(δ/ε异二聚体)以0.50μg/mL，10μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片30秒。将浓度范围150nM至5.6nM的B7-H4xCD3双特异性蛋白三倍稀释系列以50μl/min的流速注射至传感器表面72秒。监测解离300秒且用10mM甘氨酸pH 1.5以50μl/min再生表面20秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GEHealthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-B。
表10-B.25℃下通过SPR的亲代杂交瘤克隆的B7-H4xCD3双特异性抗体与人及食蟹猕猴CD3的结合动力学
Figure SMS_41
Figure SMS_42
B7-H4xCD3双特异性抗体与人、食蟹猕猴及鼠B7-H4 ECD的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在37℃下以10Hz的收集速率测定。首先遵照制造商规程将抗人Fc(GE BR-1008-39)涂布在CM5传感器芯片上。使B7-H4xCD3 IgG2 EEE/RRR双特异性抗体以0.75μg/mL，50μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片30秒。允许人、食蟹猕猴、小鼠及大鼠B7-H4 ECD通过以50μl/min运行通过芯片60秒来缔合，接着解离300秒。使用5种不同浓度的抗原，以3倍稀释，人及食蟹猕猴始于270nM且大鼠及小鼠抗原始于2100nM。监测解离600秒且用3M MgCl2以50μl/min再生表面30秒共3次。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-C。
表10-C.37℃下通过SPR的亲代及优化的双特异性抗体与人、食蟹猕猴及小鼠B7-H4 ECD的结合动力学
抗原 Ab名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
cyB7-H4 ECD 0068 6.31E+05 4.15E-03 6.58±0.11
huB7-H4 ECD 0068 8.81E+05 1.53E-03 1.74±0.02
muB7-H4 ECD 0068 NA NA NA
ratB7-H4 ECD 0068 NA NA NA
cyB7-H4 ECD 0074 5.53E+05 4.87E-03 8.81±0.25
huB7-H4 ECD 0074 5.75E+05 5.09E-03 8.86±0.03
muB7-H4 ECD 0074 1.73E+05 1.34E-01 776.5±39.5
ratB7-H4 ECD 0074 1.17E+05 1.31E-01 1125±115
cyB7-H4 ECD 1156 6.17E+05 4.63E-03 7.53±0.29
huB7-H4 ECD 1156 6.15E+05 4.78E-03 7.78±0.1
muB7-H4 ECD 1156 1.77E+05 1.96E-01 1110±70
ratB7-H4 ECD 1156 1.12E+05 2.04E-01 1840±260
cyB7-H4 ECD-1 1167 2.02E+05 1.33E-03 6.6±0.03
huB7-H4 ECD-1 1167 2.86E+05 9.20E-04 3.22±0.11
muB7-H4 ECD 1167 NA NA NA
ratB7-H4 ECD 1167 NA NA NA
B7-H4-CD3双特异性抗体与人及食蟹猕猴CD3的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在37℃下以10Hz的收集速率测定。首先遵照制造商规程将抗His(GE10260125)涂布在CM5传感器芯片上。使人及食蟹猕猴CD3(δ/ε异二聚体)以0.50μg/mL，10μl/min于Hank氏缓冲盐水(HBS)-EP+pH＝7.4中运行通过芯片36秒。将浓度范围300nM至3.7nM的B7-H4-CD3双特异性蛋白三倍稀释系列以50μl/min的流速注射至传感器表面72秒。监测解离200秒且用10mM甘氨酸pH 1.5以50μl/min再生表面20秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GEHealthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-D。
表10-D.37℃下通过SPR的B7-H4-CD3双特异性抗体与人及食蟹猕猴CD3的结合动力学
抗原 Ab名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
cyCD3 0068 5.06E+05 3.49E-02 68.95±0.05
huCD3 0068 5.54E+05 3.49E-02 63±0.3
cyCD3 0074 5.07E+05 2.39E-02 47.15±1.45
huCD3 0074 5.58E+05 2.34E-02 41.85±1.45
cyCD3 1156 4.96E+05 4.87E-03 68.85±0.45
huCD3 1156 5.43E+05 5.09E-03 62.4±1.4
cyCD3 1167 5.06E+05 1.34E-01 66.75±1.35
huCD3 1167 5.31E+05 1.31E-01 63.5±3.2
当CD3-B7-H4xCD3双特异性抗体是由暂时expi293或稳定CHO细胞产生时，这些双特异性抗体与人B7-H4及CD3的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在37℃下以10Hz的收集速率进行比较。为了测试B7-H4的结合，如上述实施类似实验，但使B7-H4-CD3 IgG2EEE/RRR双特异性抗体以0.5μg/mL、50μl/min运行通过芯片36秒，且允许人B7-H4 ECD通过以50μl/min运行通过芯片72秒来缔合，接着解离200秒。使用相同浓度组。为了测试CD3的结合，如上述实施具有相同参数的类似实验。结果显示于表10-E。
表10-E.37℃下通过SPR测试的在expi293中瞬时表达或在CHO中稳定表达而衍生的优化的双特异性抗体的结合动力学
抗原 抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
cyB7-H4 1167-CHO 6.47E+04 1.88E-03 28.95±1.65
cyB7-H4 1167-HEK 6.40E+04 1.86E-03 29.1±1.1
huB7-H4 1167-CHO 1.44E+05 1.38E-03 9.66±0.84
huB7-H4 1167-HEK 1.36E+05 1.24E-03 9.15±0.27
cyCD3 1167-CHO 5.19E+05 3.05E-02 58.8±0.7
cyCD3 1167-HEK 4.49E+05 3.17E-02 70.75±3.15
huCD3 1167-CHO 6.38E+05 3.17E-02 49.75±2.05
huCD3 1167-HEK 4.99E+05 3.09E-02 62.5±5.7
含有各种CD3变体的CD3-B7-H4xCD3双特异性抗体与人B7-H4及CD3的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在37℃下以10Hz的收集速率进行比较。为了测试CD3的结合，如上述进行具有下列变化的类似实验。将浓度范围900nM至3.7nM的B7-H4-CD3双特异性蛋白三倍稀释系列以50μl/min的流速注射至传感器表面60秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-F。
表10-F.37℃下通过SPR测试的具有不同CD3变体的双特异性抗体与人CD3的结合动力学
抗体名称 CD3变体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
0074 2B5v6 5.92E+05±3.20E+04 3.36E-02±7.00E-04 56.90±1.90
0087 2B5v598 2.05E+05±+2.00E+03 2.54E-02±8.00E-04 124.00±3.00
0088 2B5c707 5.11E+05±5.50E+03 6.89E-02±1.55E-03 134.50±1.50
基于IgG2或IgG1 EEE/RRR的CD3-B7-H4xCD3双特异性抗体与人B7-H4及CD3的结合亲和力是使用BIACORETM T200仪器(GE Healthcare)在37℃下以10Hz的收集速率进行比较。为了测试B7-H4的结合，如上述进行类似实验，但使B7-H4-CD3 IgG2 EEE/RRR双特异性抗体以0.75μg/mL、10μl/min运行通过芯片40秒，且允许人B7-H4 ECD通过以50μl/min运行通过芯片65秒来缔合，接着解离600秒。使用范围300nM至11nM的浓度。为了测试CD3的结合，如上述进行具有下列变化的类似实验。将浓度范围900nM至3.7nM的B7-H4-CD3双特异性蛋白三倍稀释系列以50μl/min的流速注射至传感器表面60秒。结合亲和力及速率常数是通过将所得感测曲线图数据拟合至BIACORETM T200 Evaluation软件版本3.0(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来判定。结果显示于表10-G。
表10-G.37℃下通过SPR测试的双特异性抗体的结合动力学
Figure SMS_43
实施例9.抗体与B7-H4及CD3基于细胞的结合。
进行B7-H4xCD3双特异性分子基于细胞的结合。将B7-H4xCD3双特异性分子始于700nM浓度的十二步连续稀释与多个表达人B7-H4的细胞系包括MX1、HCC1954-Luc、T47D及HEK293-huB7-H4、表达食蟹猕猴B7-H4的细胞系CHO-cyB7-H4及表达小鼠B7-H4的细胞系HEK293-msB7-H4孵育。
此外，进行与自健康供体PBMC分离的表达CD3的初代人T细胞及自食蟹猕猴PBMC分离的表达CD3的细胞以及来自大鼠脾脏及C57及BalbC小鼠脾脏的表达CD3的细胞的结合。人泛T细胞系通过使用T细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)的负向选择自PBMC分离。大鼠及小鼠脾脏是经由机械均质化、红细胞裂解(Roche)及过滤步骤处理。
将所有细胞以含有1％ BSA(Fisher Scientific)及0.01％叠氮化钠(RiccaChemical Company)于DPBS(Gibco)中的Flow缓冲剂洗涤二次且以每孔100K个细胞密度接种于Flow缓冲剂中。所有离心步骤以300g进行5分钟。
孵育是在37℃下进行2小时，叠氮化钠作用以抑制抗体内化。将未结合的B7-H4xCD3双特异性分子于两轮37℃Flow缓冲剂洗涤/离心步骤中洗涤去除。经结合的B7-H4xCD3双特异性分子是以经PE标记的山羊抗人Fcγ二级抗体(Jackson Immuno Research)检测。二级抗体孵育是在37℃下以1:200稀释进行30分钟。将未结合的二级抗体于两轮37℃Flow缓冲剂洗涤/离心步骤中洗涤去除。将细胞重悬于含有Flow缓冲剂的7-AAD存活性染色溶液(Bio Legend)中且在流式细胞仪上取得数据。所测量的结合饱和的EC50列示于下表11-A及表11-B。在细胞上，双特异性抗体1167结合人B7-H4的亲和力高于结合人CD3，其结合食蟹猕猴B7-H4的亲和力与结合人B7-H4是可相比的且不结合鼠或大鼠B7-H4。
不具有B7-H4(或CD3)表达的负向细胞系(包括HCC1806-Luc、HEK293及CHO细胞)显示无结合。
表11-A.B7-H4xCD3双特异性抗体与表达B7-H4的细胞系的结合
Figure SMS_44
表11-B.B7-H4xCD3双特异性抗体与表达CD3的细胞系的结合
Figure SMS_45
Figure SMS_46
实施例10.优化CD3-B7-H4xCD3双特异性抗体的T细胞介导的细胞杀伤活性
人PBMC是使用Ficoll Paque(GE Healthcare)自健康供体血液分离。泛T细胞系使用来自Stem Cell Technologies的T细胞富集试剂盒自PBMC分离(负向选择T细胞)。将经荧光素酶表达构建体转染的表达B7-H4的人肿瘤细胞HCC1954-Luc、OVCAR3-Luc或HCT116-Luc重悬于R10培养基(RPMI、10％ FBS、1％ Penn/Strep、3ml的45％葡萄糖)。还将T细胞重悬于R10培养基且以效应子对靶标比例(E:T比例)5:1或2.5:1添加至肿瘤细胞。将细胞以B7-H4xCD3双特异性抗体或阴性对照CD3双特异性分子的连续稀释处理，以250x g离心四分钟以起始接触并在37℃下孵育48小时。
以荧光素酶测定而言，使用neolite试剂(Perkin Elmer)使用Victor(PerkinElmer)测量荧光素酶信号。使用四参数非线性回归分析于Graphpad PRISM中计算EC50值。
以乳酸脱氢酶(LDH)测定而言，自经破坏的靶标细胞释放的LDH使用Cytotox 96非放射性细胞毒性试验试剂盒(Promega,G1780)及Victor微量板读取仪(Perkin Elmer)。使用四参数非线性回归分析于Graphpad PRISM中计算EC50值。
结果显示于表12。这些结果显示B7-H4xCD3双特异性抗体重新导向体外细胞毒性T细胞杀伤表达人B7-H4的各种细胞系。除了卵巢癌细胞系之外，这些细胞系包括HR+HER2-、HER2+及TNBC亚型的乳腺癌细胞系。此外，抗体1156及1167还显示与食蟹猕猴的交叉反应性。
表12.双特异性抗体的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤活性
Figure SMS_47
/>
Figure SMS_48
实施例11.体内评估B7-H4xCD3双特异性抗体介导的活性-过继性转移或PBMC模型
将人PBMC以每mL大约1千万个细胞解冻于含有5％人血清白蛋白(Gemini#100-318)、1％Penn/Strep、0.01mM 2-巯乙醇且补充有无血清PBMC解冻溶液(CTL#AA-005)的培养基X-VIVO 15(Lonza)中。在室温下孵育5分钟之后将细胞离心，且以每ml 5千万个细胞的浓度重悬于Robosep缓冲剂(Stem Cell Technologies)。使用EasySep人T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)分离T细胞。使用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi)活化及扩增T细胞。在第2天，将T细胞转移至G-Rex细胞培养装置以进行扩增，且将IL-2(Stem CellTechnologies)添加至培养基并在3天后补充。在活化/扩增的后1周收集T细胞。在收集时，用磁铁将珠移除，且将细胞以1x107或1.5x107个细胞/mL重悬于DPBS以进行体内接种。
以异种移植研究而言，NSG小鼠是经皮下接种乳腺癌细胞系(MDA-MB468、HCC1954、MX1-Luc、ZR75-1及T47D)或患者衍生性异种移植(PDX-BRX-11380、PDX-BRX-12351、PDX-BRX-24301、PDX-BRX-24305、PDX-BRX-26302、PDX-BRX-26305、PDX-BRX-26360、PDX-OVX-24409)片段于胁部。使用数字Vernier卡尺收集肿瘤测量值，且使用经修饰的椭球体公式1/2×长度×宽度2计算体积。在200至400mm3的肿瘤大小时将小鼠随机分组且分级。
以人PBMC植入实验(“PMBC模型”)而言，在第一剂的前6天静脉注射5百万个人PBMC。
以人T细胞过继性转移实验而言，在第一剂的后一天接种2.5百万个经培养的人T细胞。小鼠是经B7-H4xCD3双特异性分子或对照给药，以0.2mL推注注射每周至多3次。
每周收集两次肿瘤测量值，同时连续监测移植物抗宿主反应的征候。所有B7-H4xCD3双特异性分子在细胞系异种移植及患者衍生性异种移植模型中皆显示剂量依赖性T细胞介导的抗肿瘤活性。以下表格显示本发明进行的各种实验的剂量、肿瘤体积、SEM(平均值标准误差)及肿瘤生长抑制(TGI)百分比。
结果描述于以下表13A至表13N。这些结果显示静脉内及皮下给药的B7-H4xCD3双特异性抗体在体内乳腺癌的人细胞系异种移植及患者衍生性异种移植模型中皆剂量依赖性诱导杀肿瘤活性。这些模型包括HR+HER2-、HER2+及TNBC分子亚型的乳腺癌。
表13-A.体内肿瘤抑制PMBC模型，其具有HCC1954移植物，抗体1167和1156
Figure SMS_49
表13-B.体内肿瘤抑制PMBC模型，其具有HCC1954移植物，抗体0074、0068和0087
Figure SMS_50
表13-C.体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，其具有HCC1954移植物，抗体0074、0068和0077和0080
Figure SMS_51
Figure SMS_52
表13-D.体内肿瘤抑制PMBC模型，其具有MDA-MB-468移植物，抗体0068、0074、0086、1156和1167
Figure SMS_53
表13-E.体内肿瘤抑制PMBC模型，其具有MDA-MB-468移植物，抗体0068、0074、0087和0088
Figure SMS_54
表13-F.体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，其具有MDA-MB-468移植物，抗体0074、0087和0088
Figure SMS_55
表13-G体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，其具有MDA-MB-468移植物，抗体0074和0089
Figure SMS_56
表13-H体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，其具有MX1-Luc移植物，抗体0068和1167
Figure SMS_57
Figure SMS_58
表13-I体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，其具有MX1-Luc移植物，抗体0068和0074
Figure SMS_59
表13-J体内肿瘤抑制过继性T细胞转移模型，T47D移植物，抗体1167
Figure SMS_60
表13-K.体内肿瘤抑制PMBC模型，ZR75-1移植物，抗体0068和0074
Figure SMS_61
表13-L.体内肿瘤抑制PMBC模型，PDX-BRX-11380移植物，抗体0086和1167
Figure SMS_62
Figure SMS_63
表13-M.体内肿瘤抑制PMBC模型，PDX-BRX-24301移植物，抗体0086、1156和1167
Figure SMS_64
表13-N.体内肿瘤抑制PMBC模型，PDX-BRX-26305移植物，抗体0086和1167
Figure SMS_65
/>
实施例12：B7-H4受体密度测定
收集表达B7-H4的人肿瘤细胞且用经抗体-PE 1:1缀合的抗B7-H4抗体的连续稀释及阴性对照抗体染色。使用BD LSRFortessa X-20取得经染色的细胞连同BD QuantibriteTM藻红素(PE)定量试剂盒(BD Biosciences，目录编号340495)。使用来自Quantibrite PE试剂盒的标准曲线计算在抗体饱和浓度下每细胞的平均B7-H4受体密度。
结果显示于表14。结果显示肿瘤细胞上的B7-H4密度与抗体1167在活体外诱导经重新导向的T细胞杀伤肿瘤细胞的活体外效力之间有强烈相关性，也就是B7-H4密度越高，效力越高，如较小EC50值所示。
表14.人肿瘤细胞系的B7-H4表达密度和体外诱导经重新导向的T细胞杀伤中的抗体1167的EC50
Figure SMS_66
Figure SMS_67
实施例13：B7-H4抗体的表位分仓。
使用OctetRED 384(ForteBio)的串联分仓测定评估呈单克隆IgG1形式的B7-H4抗体针对人B7-H4的竞争性及非竞争性结合。Octet测定是在室温下进行。首先，胺反应性第2代传感器(AR2G)经EDC(1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亚胺盐酸盐)及s-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)活化300s。接着将预活化的传感器以经稀释于乙酸钠pH 5.0中的第一组抗B7-H4抗体(mAb 1)涂布300s，接着再用乙醇胺淬熄300s。在动力学缓冲剂中平衡传感器60s之后，允许人B7-H4结合经捕捉的mAb 1达300s。接着将传感器浸蘸至动力学缓冲剂中60s，随后与第二抗体(mAb 2)培育300s。各抗体以此成对组合方式测试。将竞争人B7-H4ECD上的相同结合区的mAb分群至单一仓。抗B7-H4抗体通过Octet的表位分仓显示两个由B7-H4抗体所识别的独特表位群组(表15)。
表15.使用人B7-H4 ECD的杂交瘤克隆的表位分仓。
克隆 抗体 分仓
7H7 0047 2
11F12 0048 1
13F4 0049 1
19D3 0050 2
27C12 0051 1
28D10 0052 2
29G6 0053 1
29H9 0054 NA
32F3 0055 1
33G4 0056 1
34A3 0057 1
37D4 0058 1
47A1 0059 1
42E2 0060 1
46E10 0061 1
实施例14：与B7-H4胞外结构域(ECD)复合的抗B7-H4抗体0052 scFv、抗B7-H4抗体 0058 Fab及抗体1114 Fab的结晶及结构测定
抗体0052 scFv与B7-H4 ECD共晶体结构：以结晶试验而言，B7-H4抗体0052 scFv与B7-H4ECD之间的复合体是以1:1.2摩尔比形成且浓缩为15.2mg/ml的含有TBS的蛋白溶液且pH为7.5。结晶是通过悬滴蒸气扩散方法自含有100mM HEPES pH 7.5、200mM硫酸锂、25％PEG 3350的条件获得。结晶具有与斜方空间群＝P212121一致的对称性，其晶胞参数
Figure SMS_68
Figure SMS_69
且结晶学不对称单位中有二拷贝数的B7-H4抗体0052 scFv与B7-H4 ECD复合体。结晶在液态氮中急速冷冻。于Argonne National Laboratory(APS)以IMCA粒子束17-ID自单一冷冻结晶收集分辨率设为/>
Figure SMS_70
的数据。数据使用autoPROC处理及调整规模，且最终数据集为60.3％完成度。
结构通过PHASER进行分子置换来解出。使用COOT进行数个反复回合的手动调整及模型重建，且使用autoBUSTER的结晶学精细化产生抗体0052 scFv+B7-H4 ECD的最终模型，其结晶学Rwork为22.2％且Rfree为25.0％，其中Rwork＝||Fobs|-|Fcalc||/|Fobs|且Rfree等于Rwork，但计算自精细化过程省略的随机选择的5％反射。
与B7-H4 ECD复合的B7-H4抗体0052 scFV的晶体结构显示于图2A。如图2A所示，B7-H4抗体0052结合B7-H4 ECD的V2结构域，且远离B7-H4 V1结构域的前β片层。
在B7-H4 ECD上的表位氨基酸残基是经识别为与抗体0052氨基酸残基接触3.8埃或小于3.8埃的氨基酸残基。表16-A列出B7-H4 ECD的涉及抗体0052所识别的表位的氨基酸残基。在这些当中，(1)与对应抗体氨基酸残基形成氢键，或(2)在靶标-抗体相互作用时埋住的B7-H4 ECD表位氨基酸残基进一步注释于表中。
表16-AB7-H4的与抗体0052的细胞外结构域表位氨基酸残基
Figure SMS_71
抗体0058 Fab与B7-H4 ECD共晶体结构：类似地，B7-H4抗体0058 Fab与B7-H4 ECD之间的复合体是以1:1.2摩尔比形成且浓缩为9.1mg/ml的含有TBS的蛋白溶液且pH为7.5。结晶是通过悬滴蒸气扩散方法自含有100mM HEPES pH 7.5、100mM氯化钾、15％ PEG 6000的条件获得。结晶具有与单斜空间群＝P21一致的对称性，其晶胞参数
Figure SMS_72
α＝90.00°；β＝103.19°；γ＝90.00°，且结晶学不对称单位中有二拷贝数的B7H4抗体0058 Fab-B7-H4复合体。结晶是使用含有20％乙二醇的贮槽溶液冷冻保护且在液态氮中急速冷冻。于Argonne National Laboratory(APS)以IMCA粒子束17-ID自单一冷冻结晶收集分辨率设为/>
Figure SMS_73
的数据。数据使用autoPROC处理及调整规模，且最终数据集为52.9％完成度。
结构通过PHASER进行分子置换来解出。使用COOT进行数个反复回合的手动调整及模型重建，且使用autoBUSTER的结晶学精细化产生B7H4抗体0058 Fab+B7-H4 ECD的最终模型，其结晶学Rwork为21.6％且Rfree为23.7％，其中Rwork＝||Fobs|-|Fcalc||/|Fobs|且Rfree等于Rwork，但计算自精细化过程省略的随机选择的5％反射。
与B7-H4 ECD复合的B7-H4抗体0058 Fab的晶体结构显示于图2B。如图2B所示，B7-H4抗体0058在B7-H4 ECD的V1结构域的前β片层处及附近结合B7-H4 ECD。
在B7-H4 ECD上的表位氨基酸残基是经识别为与抗体0058氨基酸残基接触3.8埃或小于3.8埃的氨基酸残基。表16-B列出B7-H4 ECD的涉及抗体0058所识别的表位的氨基酸残基。在这些当中，(1)与对应抗体氨基酸残基形成氢键，或(2)在靶标-抗体相互作用时埋住的B7-H4 ECD表位氨基酸残基是进一步注释于表中。
抗体1114 Fab与B7-H4 ECD共晶体结构：B7H4抗体1114 Fab与B7-H4 ECD之间的复合体是以1:1摩尔比形成且浓缩为9.27mg/ml的含有TBS的蛋白溶液且pH为7.5。结晶是通过悬滴蒸气扩散方法自含有100mM HEPES pH 7.5、100mM氯化钾、15％ PEG 6000的条件获得。结晶具有与单斜空间群＝P21一致的对称性，其晶胞参数
Figure SMS_74
c＝116.21,α＝90.00；β＝90.13.19；/>
Figure SMS_75
且结晶学不对称单位中有二拷贝数的B7-H4抗体1114 Fab与B7-H4 EDC复合体。结晶是使用含有20％甘油的贮槽溶液冷冻保护且在液态氮中急速冷冻。于Argonne National Laboratory(APS)以IMCA粒子束17-ID自单一冷冻结晶收集分辨率设为/>
Figure SMS_76
的数据。数据使用autoPROC处理及调整规模，且最终数据集为47.6％完成度。
结构通过PHASER进行分子置换来解出。使用COOT进行数个反复回合的手动调整及模型重建，且使用Phenix的结晶学精细化产生B7-H4抗体1114 Fab+B7-H4 ECD的最终模型，其结晶学Rwork为22.4％且Rfree为27.6％，其中Rwork＝||Fobs|-|Fcalc||/|Fobs|且Rfree等于Rwork，但计算自精细化过程省略的随机选择的5％反射。
与B7-H4 ECD复合的B7-H4抗体1114 Fab的晶体结构显示于图2C。如图2C所示，B7-H4抗体1114在B7-H4 ECD的V1结构域的前β片层处及附近结合B7-H4 ECD。
在B7-H4 ECD上的表位氨基酸残基是经识别为与抗体1114氨基酸残基接触3.8埃或小于3.8埃的氨基酸残基。表16-B列出B7-H4 ECD的涉及抗体1114所识别的表位的氨基酸残基。在这些当中，(1)与对应抗体氨基酸残基形成氢键，或(2)在靶标-抗体相互作用时埋住的B7-H4 ECD表位氨基酸残基进一步注释于表中。
表16-B B7-H4的与抗体0058和抗体1114的细胞外结构域表位氨基酸残基
Figure SMS_77
/>
Figure SMS_78
/>
序列表
<110> 辉瑞公司
<120> 治疗性抗体及其用途
<130> PC072604A
<150> US 63/053,243
<151> 2020-07-17
<160> 210
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 230
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala
225 230
<210> 2
<211> 230
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 2
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Ile Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala
225 230
<210> 3
<211> 230
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Phe Gly Ile Ser Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile
35 40 45
Lys Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln
50 55 60
Gln His Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Val Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Gly Pro
225 230
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 4
Phe Gly Ile Ser Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile
35 40 45
Lys Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln
50 55 60
Gln His Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Val Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Tyr Ile His Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Glu
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Gly
225
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Gly Leu Tyr Asn Trp Asn Val Asp His
1 5
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Tyr Asn Trp Asn Val Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 13
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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1 5 10 15
<210> 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 15
Gly Leu Tyr Asn Trp Asn Val Asp Ser
1 5
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 16
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Leu Tyr Asn Trp Asn Val Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 17
Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 18
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 21
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 22
Asp Ile Gln Trp Phe Gly Glu Ser Thr Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Ala Arg Asp Ile Gln Trp Phe Gly Glu Ser Thr Leu Phe Asp Tyr Trp
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 124
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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195 200 205
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Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
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<223> Synthetic Construct
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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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210
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<223> Synthetic Construct
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ccgtctctca agagtcgagt gaccatctcc gtagacacgg ccaagaactc actgtatctg 240
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ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780
gccgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840
cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 900
gtcctcaccg tcgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960
aacaaaggcc tcccatcctc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1020
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080
ctgacctgcg aggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140
gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1200
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtcc 1320
cccggaaaa 1329
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 193
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gaagattttg caacttacta ctgtctacag cataatgcct accctcgcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 194
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gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
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ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 195
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 195
gacatccaaa tgacccagtc accgtcatcg ctctcggctt ccgtgggcga tagagtgacc 60
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gagtctggtg tcccatcccg gttctccgga tccggctccg ggaccgactt cactctgacc 240
attagcagcc tgcagcccga agatttcgcg acctattact gcaagcaatc ctacgacttg 300
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ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 196
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 196
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtggtg gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagggacata 300
cagtggtacg gggagtcaac cctctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcagcgt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420
tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgta gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc 600
cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt 660
gagcgcaaat gtgaggtcga gtgcccagag tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acgtgcgtgg tggtggccgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 900
ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcgaggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320
agcctctccc tgtcccccgg aaaa 1344
<210> 197
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 197
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcacccgt agccacttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccagtt tggaaggtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tatggcagtt attctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 198
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 198
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 199
Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 200
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
<400> 201
Asn His Ser Gly Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Asp Tyr Tyr Met Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 203
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
1 5
<210> 204
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 204
Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr
1 5
<210> 205
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 205
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 206
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 207
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 207
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 208
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 208
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 209
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 209
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 210
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 210
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Ser Cys Pro Ala Pro Glu
100 105 110
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325

Claims (53)

1.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含
(a)重链可变区(VH)的VH互补决定区(CDR)1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3，所述VH具有选自由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175及SEQ ID NO:176所组成的群组的氨基酸序列；及
(b)轻链可变区(VL)的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，所述VL具有选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:167、SEQ IDNO:168、SEQ IDNO:169及SEQ ID NO:170所组成的群组的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含来自包含以下的抗体的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VLCDR2及VL CDR3：
(a)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(b)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(c)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(d)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(e)具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(f)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(g)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(h)具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(i)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(j)具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(k)具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(l)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(m)具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(n)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(o)具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(p)具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(q)具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(r)具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(s)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VL；
(t)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL；
(u)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL；或
(v)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
3.权利要求1的抗体，其包含
(a)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VLCDR3；
(b)具有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ IDNO:138的氨基酸序列的VLCDR3；
(e)具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VLCDR3；
(f)具有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VLCDR3；
(g)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VLCDR3；
(h)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ IDNO:138的氨基酸序列的VLCDR3；或
(i)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VLCDR3。
4.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3。
5.权利要求1的抗体，其包含
(a)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(b)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(c)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(d)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(e)具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(f)具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH；具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(g)具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(h)具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(i)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(j)具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(k)具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(l)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(m)具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(n)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(o)具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(p)具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(q)具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(r)具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(s)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VL；
(t)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL；
(u)具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL；或
(v)具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
6.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL。
7.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
8.权利要求1至7中任一项的抗体，其进一步包含恒定区。
9.权利要求8的抗体，其中所述恒定区是IgG1或IgG2同种型。
10.权利要求1至9中任一项的抗体，其中所述抗体是人IgG2，其包含一或多个选自由A330S、P331S、D265A、C223E、P228E、L368E、C223R、E225R、P228R及K409R所组成的群组的取代，其中编号是根据人IgG2野生型及EU编号方案且示于图1。
11.权利要求10的抗体，其中所述抗体包含取代C223E、P228E及L368E。
12.权利要求10或11的抗体，其中所述抗体包含取代A330S、P331S及D265A。
13.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链。
14.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链。
15.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其包含重链及轻链，所述重链包含由ATCC保藏编号PTA-126779保藏的多核苷酸的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且所述轻链包含由ATCC保藏编号PTA-126781保藏的多核苷酸的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列。
16.权利要求1或2的抗体，其中所述VH CDR1、所述VH CDR2、所述VH CDR3、所述VLCDR1、所述VL CDR2及所述VL CDR3的各者是根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义。
17.一种与B7-H4特异性结合的分离的第一抗体，其与第二抗体竞争与B7-H4的结合，所述第二抗体包含
(a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL；
(b)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL；
(c)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL；
(d)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL；
(e)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VL；
(f)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL；
(g)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；
(h)具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL；
(i)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；
(j)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；
(k)具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；
(l)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL；
(m)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(n)具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL；
(o)具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；或
(p)具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL；
其中所述第一抗体对人B7-H4的KD为介于约1微摩尔与0.1纳摩尔之间。
18.一种与B7-H4特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体与人B7-H4上的表位结合，所述表位包含选自由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的B7-H4胞外结构域的L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少两个氨基酸残基。
19.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至18中任一项的抗体或抗原结合片段及药学上可接受的载体。
20.一种分离的多核苷酸，其编码：(i)权利要求1至16中任一项的抗体的重链；或(ii)权利要求1至16中任一项的抗体的轻链。
21.一种载体，其包含权利要求20的多核苷酸。
22.一种分离的宿主细胞，其重组产生权利要求1至16中任一项的抗体。
23.一种治疗对象中与表达B7-H4的细胞相关联的病况的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用有效量的权利要求19的药物组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述病况是癌症。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫的癌症或胆管的癌症。
26.一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中所述第一重链及所述第一轻链形成第一臂，所述第一臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二重链及所述第二轻链形成第二臂，所述第二臂包含与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中
(a)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ IDNO:25的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ IDNO:25的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；
(e)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；
(f)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；
(g)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；
(h)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；或
(i)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3。
27.权利要求26的双特异性抗体，其中
(a)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(b)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(c)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(d)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(e)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(f)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(g)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(h)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(i)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(j)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(k)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL；
(l)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；
(m)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(n)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VL；
(o)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(p)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(q)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(r)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；
(s)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VL；
(t)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL；
(u)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL；或
(v)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL。
28.权利要求26或27的双特异性抗体，其中
(a)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:203的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL CDR3；
(e)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:109的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3；或
(f)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:29的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
29.权利要求26或27中任一项的双特异性抗体，其中
(a)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL；
(b)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL；
(c)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VL；或
(d)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
30.权利要求26的双特异性抗体，其中
(a)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的VL CDR3；且
(b)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
31.权利要求26的双特异性抗体，其中
(a)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL CDR3；且
(b)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ IDNO:105的氨基酸序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VLCDR2及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL CDR3。
32.权利要求26的双特异性抗体，其中
(a)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL；且
(b)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
33.权利要求26的双特异性抗体，其中
(c)所述第一重链包含具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VH，且所述第一轻链包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL；且
(d)所述第二重链包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH，且所述第二轻链包含具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
34.权利要求26至33中任一项的双特异性抗体，其进一步包含恒定区。
35.权利要求34的双特异性抗体，其中所述恒定区是IgG1。
36.权利要求34的双特异性抗体，其中所述恒定区是人IgG2，其包含一或多个选自由A330S、P331S、D265A、C223E、P228E、L368E、C223R、E225R、P228R及K409R所组成的群组的取代，其中编号是根据人IgG2野生型及EU编号方案且示于图1。
37.权利要求26至34及36中任一项的双特异性抗体，其中所述第一臂进一步包含具有取代D265A、C223E、P228E及L368E的人IgG2ΔA恒定区，所述第二臂进一步包含具有取代D265A、C223R、E225R、P228R及K409R的人IgG2ΔA恒定区，其中编号是根据人野生型IgG2及EU编号方案且示于图1。
38.一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中所述第一重链及所述第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二重链及所述第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中
(a)所述第一重链具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列，且所述第一轻链具有SEQ IDNO:191的氨基酸序列；且
(b)所述第二重链具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列，且所述第二轻链具有SEQ IDNO:189的氨基酸序列。
39.一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中所述第一重链及所述第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二重链及所述第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中
(a)所述第一重链具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列，且所述第一轻链具有SEQ IDNO:187的氨基酸序列；且
(b)所述第二重链具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列，且所述第二轻链具有SEQ IDNO:189的氨基酸序列。
40.一种与B7-H4及CD3特异性结合的双特异性抗体，其包含第一重链及第一轻链和第二重链及第二轻链，其中所述第一重链及所述第一轻链形成第一抗体臂，所述第一抗体臂包含与B7-H4结合的第一抗原结合结构域，且所述第二重链及所述第二轻链形成与CD3结合的第二抗原结合结构域，其中
(a)所述第一重链包含由ATCC保藏编号PTA-126779保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且所述第一轻链包含由ATCC保藏编号保藏PTA-126781的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列；且
(b)所述第二重链包含由ATCC保藏编号PTA-126780保藏的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列，且所述第二轻链包含由ATCC保藏编号保藏PTA-126782的开放阅读框(ORF)编码的全长多肽的氨基酸序列。
41.一种与B7-H4及CD3两者特异性结合的双特异性抗体，其中所述抗体与人B7-H4上的表位结合，所述表位包含来自由SEQ ID NO:1的B7-H4氨基酸序列的L44、K45、E46、G47、V48、L49、G50、L51、S63、E64、D66、M68、T99及K101所组成的群组的至少两个氨基酸残基。
42.一种分离的多核苷酸分子，其编码(i)权利要求26至40中任一项的抗体的重链；或(ii)权利要求26至40中任一项的抗体的轻链。
43.一种载体，其包含权利要求42的多核苷酸分子。
44.一种宿主细胞，其包含权利要求42的多核苷酸分子或权利要求43的载体。
45.权利要求26至40中任一项的双特异性抗体，其用作药物。
46.权利要求45的双特异性抗体，其中所述药物是用于治疗癌症。
47.一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，其包含向所述对象施用权利要求26至40中任一项的双特异性抗体。
48.一种药物组合物，其包含权利要求26至40中任一项的双特异性抗体。
49.一种治疗对象中的与表达B7-H4的恶性细胞相关联的病况的方法，所述方法包含向所述有此需要的对象施用治疗有效量的如权利要求48的药物组合物。
50.权利要求49的方法，其中所述病况是癌症。
51.权利要求50的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、子宫的癌症、膀胱癌或胆管的癌症。
52.一种抑制对象中肿瘤生长或进展的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向所述有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求48的药物组合物。
53.一种诱导对象中肿瘤消退的方法，所述对象具有表达B7-H4的恶性细胞，所述方法包含向所述有此需要的对象施用有效量的权利要求48的药物组合物。
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